KR20170124683A - 담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 융합 단백질 - Google Patents

담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 이에 의하여 암호화된 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 마커는 담도암 조직 또는 담도암 세포로부터 발굴된 마커로서, 본 발명의 마커를 이용하면 담도암을 정확하게 진단할 수 있다.

Description

담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 융합 단백질{Fusion genes and proteins as a novel biomarker for diagnosis of biliary trat cancer}
본 발명은 담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 이에 의하여 암호화된 융합 단백질에 관한 것이다.
담관은 간에서 만들어지는 담즙을 십이지장으로 보내는 관으로서, 간 속에서 나뭇가지가 하나의 가지를 향해 모이듯이 서서히 합류하면서 굵어지며, 간에서 나올 때에 좌우의 담관이 대부분 하나로 합류하게 된다. 담관은 간 속을 지나는 간 내 담관과 간을 벗어나 십이지장까지 이어지는 간 외 담관으로 나뉜다. 간 외 담관 중 담즙을 일시적으로 저장하여 농축하는 주머니를 담낭이라 부르며, 이들 간 내외 담관과 담낭을 통틀어 담도라고 부른다.
담도암은 담관암이라고도 하며, 담관의 상피에서 발생하는 악성종양이다. 담도암은 진단 당시 70-80%가 진행암으로, 수술은 30-40%에만 가능하고, 5년 생존율은 7% 내외에 불과한 치료가 어려운 난치암 중의 하나이다. 이와 같이, 담도암은 암의 진행이 상당히 이루어진 뒤에 발견되어 예후가 불량하고 치료가 어려운바, 담도암에 대한 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허 제10-2013-0010831호 (2013.01.29 공개) 대한민국 공개특허 제10-2011-0100046호 (2011.09.09 공개)
본 발명자들은 담도암을 조기에 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 담도암에서 특이적으로 발현되는 융합 유전자를 발굴하고, 이를 담도암의 진단에 활용할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 담도암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 담도암 진단용 마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 담도암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 담도암 진단용 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer); 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단용 키트를 제공한다:
(ⅰ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열의 5' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
(ⅱ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열의 3' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
(ⅲ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질; 또는
(ⅳ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단되고, 엑손14가 결실된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 담도암 진단용 마커인 상기 (ⅰ) 내지 (ⅳ) 중 어느 하나의 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머; 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단용 마커 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 담도암을 조기에 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 담도암에서 특이적으로 발현되는 융합 유전자를 발굴하고, 이를 담도암의 진단에 활용할 수 있음을 규명하였다.
본 명세서에서 사용된 표현, "담도암 진단용 키트"는 "담도암 진단용 조성물"이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "담도암 진단용 키트"는 "담도암 진단용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 의 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 진단 마커를 사용하면, 담도암의 발병 여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 담도암 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에서는 발현되지 않으면서 담도암 세포 또는 조직에서 발현되는 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 담도암 진단 마커는 상기 (ⅰ)(ⅱ) ASH1L-DOCK7 융합 단백질, (ⅲ)(ⅳ) PUM1-TRAF3 융합 단백질, 및 이들을 암호화하는 핵산분자(DNA 또는 mRNA)를 포함한다.
상기 (ⅰ) 내지 (ⅳ)의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 대하여 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 ASH1L-DOCK7 융합 단백질은 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 ASH1L-DOCK7 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 서열목록 제3서열, 제4서열 또는 제5서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여기서, 상기 서열목록 제3서열은 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 전체(full length) 뉴클레오티드 서열이며, 서열목록 제4서열 또는 제5서열은 각각 서열목록 제3서열 중 융합 단백질로 발현되는 부분의 서열이다. 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오티드 서열은 서열목록 제1서열의 융합 단백질을 암호화하며, 서열목록 제5서열의 뉴클레오티드 서열은 서열목록 제2서열의 융합 단백질을 암호화한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 PUM1-TRAF3 융합 단백질은 서열목록 제6서열 또는 제7서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 서열목록 제6서열의 PUM1-TRAF3 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 서열목록 제8서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 서열목록 제7서열의 PUM1-TRAF3 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 서열목록 제9서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
상기 서열목록 제8서열은 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 전체(full length) 뉴클레오티드 서열이자 융합 단백질로 발현되는 부분의 서열이며, 서열목록 제9서열은 상기 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열에서 273 nt가 결실된 형태의 뉴클레오티드 서열이자 융합 단백질로 발현되는 부분의 서열이다.
본 발명의 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 융합 유전자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트, 즉 면역분석 방식(항원-항체 반응)으로 융합 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인할 수 있는 키트이이며, 예를 들어, 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.
하나의 특정예에서, 본 발명의 키트는 융합 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 측정하기 위한 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명에서 항체란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 새로운 담도암 진단용 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 키트는 통상적인 면역분석 방법을 통하여 담도암을 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.
상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물 또는 세포 배양물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물 또는 세포 배양물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
ELISA 방법을 포함한 면역분석 방법에서, 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
다른 한편으로, 본 발명의 키트는 마커 단백질(융합 단백질)에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 이용될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동 하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여 담도암을 진단할 수 있다.
또 다른 한편으로, 본 발명의 키트는 상기 마커 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색에 이용될 수 있다.
본 발명의 키트에는, 항체 대신에 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩티드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트이다. 본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상 표면에 프로브가 고정화 되어 있으며, 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 진단용 키트에 포함된 프로브 또는 프라이머는 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어, "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "상보적"은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만, 전형적으로 15-30 뉴클레오티드이다. 이러한 프라이머의 디자인은 TAGLN2의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열은 GenBank 혹은 서열목록에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다.
본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA 또는 mRNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 예를 들어, 조직, 세포 또는 이의 배양액, 혈액, 혈청 및 혈장이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
상기 "유전자 증폭 키트"를 언급하면서 사용한 용어,"증폭"은 핵산분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)와 같은 다양한 증폭 반응들이 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 담도암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 시료 내에 있는 상기 (ⅰ) 내지 (ⅳ) 중 어느 하나의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자를 검출하는 단계를 통하여 담도암 진단용 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 담도암 진단용 마커를 검출하는 방법과 상기 담도암 진단용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 방법은 상술한 항원-항체 반응 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시된다. 상기 검출 방법들을 통하여 분석대상 생물학적 시료에서의 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산분자의 발현 여부 또는 발현수준을 분석할 수 있고, 이를 통하여 담도암을 진단할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 담도암을 분자진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 정상 조직에는 존재하지 않으며, 담도암이 발병한 개체의 생물학적 시료에 특이적으로 존재하는 생체 분자이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포 또는 이의 배양액, 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 이에 의하여 암호화된 융합 단백질에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 마커는 담도암 조직 또는 담도암 세포로부터 발굴된 마커로서, 본 발명의 마커를 이용하면 담도암을 정확하게 진단할 수 있다.
도 1은 담도암 조직에서의 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 발현을 보여준다. NL: 정상 조직; CA: 암조직.
도 2a는 융합이 확인된 환자 조직 이외의 다른 환자 조직에서의 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 발현을 보여준다.
도 2b는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 담도암 세포주에서의 발현결과를 보여준다.
도 3은 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 융합 형태에 관한 모식도이다.
도 4는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의하여 암호화된 융합 단백질의 아미노산 서열을 보여준다. 도 4a-b는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열이며, 도 4c는 이중 단백질로 발현되는 부분의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의하여 암호화된 아미노산 서열이고, 도 4d는 도 4c와는 다른 형태의, ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열에서 단백질로 발현되는 뉴클레오티드 서열 및 이에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 보여준다.
도 5는 담도암 조직에서의 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 발현을 보여준다. NL: 정상 조직; CA: 암조직.
도 6a는 융합이 확인된 환자 조직 이외의 다른 환자 조직에서의 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 발현을 보여준다.
도 6b는 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 담도암 세포주에서의 발현결과를 보여준다.
도 6c는 PUM1 유전자 부분이 결실된 형태와 그렇지 않은 형태의 PUM1-TRAF3 융합 유전자가 존재함을 보여준다.
도 7a-b는 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 융합 형태에 관한 모식도이다.
도 8a는 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열, 이중 단백질로 발현되는 부분의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 보여준다.
도 8b는 237 nt가 결실된 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
담도암 특이적 융합 유전자 분석
5명의 담도암 환자의 정상 담도 조직 및 담도암 조직과, 1명의 담도암 환자의 암조직을 이용하여 RNA 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다. 조직에서 RNA를 추출하기 위하여, TRIzol 시약에 분쇄된 조직을 섞어서 클로로포름을 넣어 원심분리(12,000xg, 4℃, 15분)한 후 상층액을 분리하여 동일량의 이소프로판올을 첨가하여 침전시킨 후, 70% 에탄올로 세척하고 건조(air-dry)시킨 다음 Rnase-free water 또는 DEPC water(30 ㎕ 또는 50 ㎕)를 넣어주었다.
RNA 시퀀싱은 다음과 같이 실시하였다. RNA 품질을 Agilent RNA 6000 Nano 키트(Agilent Technologies, CA) 상의 rRNA 밴드 강도를 통하여 평가하였다. cDNA 라이브러리 구축에 앞서 2 ㎍의 전체 RNA와 Oligo (dT)를 갖는 마그네틱 비드를 사용하여 poly (A) mRNA를 증폭하였다. 이후, 정제된 mRNA를 짧은 절편으로 분해시키고, 이중가닥 cDNA를 즉시 합성하였다. cDNA는 말단 교정(end-repair)과 poly (A) 첨가 후, TruSeq RNA sample prep 키트(Illumina, CA)를 사용하여 시퀀싱 어댑터(sequencing adapter)에 연결되었다. BluePippin 2% 아가로스 겔 카세트(Sage Science, MA)에 의하여 자동적으로 정제된 적절한 절편을 PCR 증폭을 위한 주형으로 선택하였다. 최종 라이브러리의 크기와 품질을 Agilent High Sensitivity DNA 키트(Agilent Technologies, CA)로 평가하였고, 절편은 350-450 bp의 크기를 가지고 있었다. 이후, Illumina HiSeq2500 서열분석기(Illumina, CA)를 사용하여 라이브러리의 시퀀싱을 실시하였다.
전사체(Transcriptome) 데이터 분석은 다음과 같이 실시하였다. 낮은 품질의 리드를 다음의 기준에 따라 제거(filtering)하였다: 10% 이상의 건너뛴 염기(skipped bases)를 포함하는 리드('N'으로 표기), 품질 스코어가 20 미만인 염기를 40% 이상 포함하는 리드, 및 각 리드의 평균 품질 스코어가 20미만인 리드. 서열 정렬(sequence alignment)을 위하여, 필터링된 리드를 aligner STAR v.2.3.0e(Dobin et al. 2013)를 사용하여 인간 레퍼런스 게놈(Ensembl release 72, Flicek P. et al., 2013)에 대하여 맵핑하였다. 유전자 발현 평가를 위하여, Ensembl release 72의 유전자 주석 데이터베이스(gene annotation database)를 이용하는 Cufflinks v2.1.1(Trapnell C. et al, 2010)을 사용하여 유전자 발현수준을 측정하였다. 비-코딩 유전자 영역(non-coding gene region)을 제거하였다. 측정의 정확성을 향상시키기 위하여, 멀티-리드-교정(multi-read-correction)과 fragbias-교정 옵션을 적용하였다. 모든 다른 옵션들을 디폴트값에 대하여 세팅하였다.
RNA 시퀀싱 분석결과를 통해 암의 체세포 융합 유전자(somatic fusion gene)를 검출하기 위하여 다음의 방법을 통해 추가 분석을 진행하였다. 종양과 정상 샘플의 RNA-seq fastq 파일을 ChimeraScan, JAFFA 및 FusionCatcher 분석 tool을 사용하여 각 샘플의 융합 유전자를 검출하였다. 체세포성 암 융합 유전자(cancer somatic fusion gene)를 찾기 위하여, 각각의 종양 샘플의 융합 유전자 리스트에서 정상 샘플에서 검출된 융합 유전자를 제거하였다. 기능적으로 의미가 있는 후보 융합 유전자를 찾기 위하여, 코딩 유전자에서 융합이 일어난 융합 리스트를 선별하였다. 이후, 찾은 후보들 중에서 위양성 오류(false positive)를 줄이기 위하여, spanning read (융합되는 부위에 해당하는 리드)가 1개 이상인 융합 유전자를 선별하였다. 알려진 암 융합 유전자가 있는지 확인하기 위하여, 암 융합 데이터베이스(cancer fusion database)인 ChimeraDB2.0 및 cosmic DB를 확인하였다. 이후, Cancer gene census와 인산화효소(kinase)에 융합 유전자가 있는지 확인하였다. 정상에서 발견되었다고 알려진 논문의 리스트에 존재하는 융합 유전자(Greger L et al. 2014. PlosOne)를 제거하였다. 이상과 같은 과정을 통하여 담도암 조직에서 특이적으로 발현되는 융합 유전자를 최종 선별하였다.
선별된 융합 유전자의 발현 여부 검증
선별된 유전자(융합 유전자)의 발현 유무를 확인하기 위하여, 해당 조직의 mRNA를 추출하여 역전사를 통해 cDNA를 합성하고, 접합부위를 포함하도록 프라이머를 제작하여 PCR을 통해 접합부위를 확인하고, 해당 부위를 아가로스 겔을 이용한 전기영동을 통해 해당 크기의 PCR 부위를 절제하여 TA 벡터에 클로닝하여 시퀀싱을 진행하였다.
조직의 RNA는 Qiagen사의 RNeasy 미니 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였고, 나노드롭ND-1000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)을 이용하여 정량한 후 역전사 반응을 Invitrogen사의 SuperscriptII, RNaseOUT, oligo(dT) 프라이머와 NTPs(Carlsbad, CA)를 이용하여 진행하였다. 합성된 cDNA는 각 유전자의 해당 융합 유전자 프라이머와 적정 온도를 이용하여 PCR을 수행하였고, 이때 Ex Taq HS DNA 폴리머레이즈(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 진행하였다. PCR 반응을 마친 후 아가로스 겔을 이용한 전기영동을 통해 해당 유전자의 발현 유무를 UV 램프를 통하여 확인하고, 해당 PCR 생산물을 절제하여 Qiagen사의 겔 추출 키트를 이용해 추출한 후 Clonetech사의 TA 클로닝 키트를 이용하여 TA 벡터에 넣은 후 해당 벡터에서 제공하는 시퀀싱용 프라이머를 이용하여 서열을 확인하였다. 각 융합 유전자의 개별 유전자 및 융합 부위 확인용 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
실험결과
접합부위에 해당하는 서열을 확인한 융합 유전자의 경우, 타 환자의 담도암 조직에서의 발현 유무를 확인하였다. 선별된 담도암 특이적 융합 유전자는 담도암 조직 특이적으로 발생한 것으로, 해당 환자의 정상 조직에는 존재하지 않는 유전자로 선별되었다.
구체적인 결과는 다음과 같았다.
1. ASH1L-DOCK7
Gene-front Gene-back
유전자 이름 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7)
도 1에 나타난 바와 같이, 환자의 암조직에서 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 발현을 확인하였다(NL: 정상 조직; CA: 암조직). 또한, 도 2a에 나타난 바와 같이, 융합이 확인된 환자 조직 이외의 다른 환자 조직에서도 ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 발현이 확인되었다. ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 담도암 세포주에서의 발현결과는 도 2b와 같았다.
ASH1L-DOCK7 융합 유전자의 융합 형태에 관한 모식도, 및 이의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열을 각각 도 3 내지 4a-d에 나타내었다.
2.PUM1-TRAF3
Gene-front Gene-back
유전자 이름 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) TRAF3(TNF receptor associated factor 3)
도 5에 나타난 바와 같이, 환자의 암조직에서 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 발현을 확인하였다(NL: 정상 조직; CA: 암조직). 또한, 도 6a에 나타난 바와 같이, 융합이 확인된 환자 조직 이외의 다른 환자 조직에서도 PUM1-TRAF3 융합 유전자의 발현이 확인되었다. PUM1-TRAF3 융합 유전자의 담도암 세포주에서의 발현결과는 도 6b와 같았다.
도 6c에 나타난 바와 같이, 담도암 조직에서 PUM1-TRAF3 융합유전자가 PUM1의 길이에 따라 두 가지 형태가 있으며, 짧은 길이의 PUM1-TRAF3 융합 유전자는 PUM1-TRAF3 융합 유전자 중 PUM1의 유전자 중에서 79개의 아미노산이 잘려져 나간 형태로 두 형태 모두 동일 환자에서 확인되었다.
PUM1-TRAF3 융합 유전자의 융합 형태에 관한 모식도, 및 이의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열을 각각 도 7a-b 및 8a-b에 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> Fusion genes and proteins as a novel biomarker for diagnosis of biliary trat cancer <130> PN150595 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2044 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASH1L-DOCK7 fusion protein of Homo sapiens <400> 1 Met Asp Pro Arg Asn Thr Ala Met Leu Gly Leu Gly Ser Asp Ser Glu 1 5 10 15 Gly Phe Ser Arg Lys Ser Pro Ser Ala Ile Ser Thr Gly Thr Leu Val 20 25 30 Ser Lys Arg Glu Val Glu Leu Glu Lys Asn Thr Lys Glu Glu Glu Asp 35 40 45 Leu Arg Lys Arg Asn Arg Glu Arg Asn Ile Glu Ala Gly Lys Asp Asp 50 55 60 Gly Leu Thr Asp Ala Gln Gln Gln Phe Ser Val Lys Glu Thr Asn Phe 65 70 75 80 Ser Glu Gly Asn Leu Lys Leu Lys Ile Gly Leu Gln Ala Lys Arg Thr 85 90 95 Lys Lys Pro Pro Lys Asn Leu Glu Asn Tyr Val Cys Arg Pro Ala Ile 100 105 110 Lys Thr Thr Ile Lys His Pro Arg Lys Ala Leu Lys Ser Gly Lys Met 115 120 125 Thr Asp Glu Lys Asn Glu His Cys Pro Ser Lys Arg Asp Pro Ser Lys 130 135 140 Leu Tyr Lys Lys Ala Asp Asp Val Ala Ala Ile Glu Cys Gln Ser Glu 145 150 155 160 Glu Val Ile Arg Leu His Ser Gln Gly Glu Asn Asn Pro Leu Ser Lys 165 170 175 Lys Leu Ser Pro Val His Ser Glu Met Ala Asp Tyr Ile Asn Ala Thr 180 185 190 Pro Ser Thr Leu Leu Gly Ser Arg Asp Pro Asp Leu Lys Asp Arg Ala 195 200 205 Leu Leu Asn Gly Gly Thr Ser Val Thr Glu Lys Leu Ala Gln Leu Ile 210 215 220 Ala Thr Cys Pro Pro Ser Lys Ser Ser Lys Thr Lys Pro Lys Lys Leu 225 230 235 240 Gly Thr Gly Thr Thr Ala Gly Leu Val Ser Lys Asp Leu Ile Arg Lys 245 250 255 Ala Gly Val Gly Ser Val Ala Gly Ile Ile His Lys Asp Leu Ile Lys 260 265 270 Lys Pro Thr Ile Ser Thr Ala Val Gly Leu Val Thr Lys Asp Pro Gly 275 280 285 Lys Lys Pro Val Phe Asn Ala Ala Val Gly Leu Val Asn Lys Asp Ser 290 295 300 Val Lys Lys Leu Gly Thr Gly Thr Thr Ala Val Phe Ile Asn Lys Asn 305 310 315 320 Leu Gly Lys Lys Pro Gly Thr Ile Thr Thr Val Gly Leu Leu Ser Lys 325 330 335 Asp Ser Gly Lys Lys Leu Gly Ile Gly Ile Val Pro Gly Leu Val His 340 345 350 Lys Glu Ser 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tatgttagga ttgggttctg attccgaagg tttttcaaga 60 aagagtcctt ctgccatcag tactggcaca ttggtcagta agagagaagt agagctagaa 120 aaaaacacaa aggaggaaga ggaccttcgc aaacggaatc gagaaagaaa catcgaagct 180 gggaaagatg atggtttgac tgatgcacag caacagtttt cagtgaaaga aacaaacttt 240 tcagagggaa atttaaaatt gaaaattggc ctccaggcta agagaactaa aaaacctcca 300 aagaacttgg agaactatgt atgtcgacct gccataaaaa caactattaa gcacccaagg 360 aaagcactta aaagtggaaa gatgacggat gaaaagaatg aacactgtcc ttcaaaacga 420 gacccttcaa agttgtacaa gaaagcagat gatgttgcag ccattgaatg ccagtctgaa 480 gaagtcatcc gtcttcattc acagggagaa aacaatcctt tgtctaagaa gctgtctcca 540 gtacactcag aaatggcaga ttatattaat gcaacgccat ctactcttct tggtagccgg 600 gatcctgatt taaaggacag agcattactt aatggaggaa ctagtgtaac agaaaagttg 660 gcacagctga ttgctacctg tcctccttcc aagtcttcca agacaaaacc gaagaagtta 720 ggaactggca ctacagcagg attggttagc aaggatttga tcaggaaagc aggtgttggc 780 tctgtagctg gaataataca taaggactta ataaaaaagc caaccatcag cacagcagtt 840 ggattggtaa ctaaagatcc tgggaaaaag ccagtgttta atgcagcagt aggattggtc 900 aataaggact ctgtgaaaaa actgggaact ggcactacag cggtattcat taataaaaac 960 ttaggcaaaa agccaggaac tatcactaca gtaggactgc taagcaaaga ttcaggaaag 1020 aagctaggaa ttggtattgt tccaggttta gtgcataaag agtctggcaa gaagttagga 1080 cttggcactg tggttggact ggttaataaa gatttgggaa agaaattggg ttctactgtt 1140 ggcctagtgg ccaaggactg tgcaaagaag attgtagcaa gttcagcaat gggattggtt 1200 aataaggaca ttggaaagaa actaatgagt tgtcctttgg caggtctgat cagtaaagat 1260 gccataaacc ttaaagccga agcactgctc cccactcagg aaccgcttaa ggcttcttgt 1320 agtacaaaca tcaataatca ggaaagtcag gaactttctg aatccctgaa agatagtgcc 1380 accagcaaaa cttttgaaaa gaatgttgta cggcagaata aagaaagcat attggaaaag 1440 ttctcagtac gaaaagaaat cattaatttg gagaaagaaa tgtttaatga aggaacatgc 1500 attcagcaag acagtttctc atccagtgaa aagggatctt atgaaacctc aaagcatgaa 1560 aagcagcctc ctgtatattg cacttctccg gactttaaaa tgggaggtgc ttctgatgta 1620 tctaccgcta aatccccatt cagtgcagta ggagaaagca atctcccttc cccatcacct 1680 actgtatctg ttaatccttt aaccagaagt ccccctgaaa 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gaaggaacac caggaggatc ctgaaatgtt gattgatcta 1980 atgtacagaa ttgccaaggg ttaccagacc tctccagatc tgcgattgac ctggttgcag 2040 aacatggcag gcaagcactc agaacgaagc aatcatgctg aagctgcaca gtgtctagtc 2100 cactcagcag cacttgttgc tgaatatttg agcatgctgg aggaccggaa atatcttcct 2160 gtgggatgtg taacatttca gaatatttca tctaatgttt tagaagaatc tgcggtctca 2220 gatgatgtgg tatctccaga tgaagaaggt atctgctctg gaaaatactt tactgagtca 2280 ggacttgtgg gattactgga acaagcagct gcttccttct ctatggctgg catgtatgaa 2340 gcagttaatg aagtttacaa agtacttatt cctattcatg aagctaatcg ggatgcaaag 2400 aaactatcca caattcatgg taaacttcaa gaagcattca gcaaaattgt tcatcaggat 2460 ggtaagcgga tgtttggcac ctattttcgt gttggttttt atggaaccaa gttcggggat 2520 ttggatgaac aagaatttgt ttacaaggag cctgcaataa ccaaacttgc agagatatct 2580 cacagattgg agggatttta cggagaaaga tttggagagg atgtggttga agtaatcaaa 2640 gactctaatc ctgtagacaa gtgtaaatta gatcctaaca aggcatatat tcagattacc 2700 tatgtggagc catactttga cacatatgag atgaaggaca gaatcaccta tttcgacaaa 2760 aattacaatc ttcgtcgatt 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actttttgac 1140 tacaattctc aacaacagct gttccaaaga cctaatgcgc ttgctgtcca gcagttgaca 1200 gctgctcagc agcagcagta tgcactggca gctgctcatc agccgcacat cggtttagct 1260 cccgctgcgt ttgtccccaa tccatacatc atcagcgctg ctcccccagg gacggacccc 1320 tacacagctg gattggctgc agcagcgaca ctaggcccag ctgtggtccc tcaccagtat 1380 tatggagtta ctccctgggg agtctaccct gccagtcttt tccagcagca agctgccgct 1440 gccgctgcag caactaattc agctaatcaa cagaccaccc cacaggctca gcaaggacag 1500 cagcaggttc tccgtggagg agccagccaa cgtcctttga ccccaaacca gaaccagcag 1560 ggacagcaaa cggatcccct tgtggcagct gcagcagtga attctgccct tgcatttgga 1620 caaggtctgg cagcaggcat gccaggttat ccggtgttgg ctcctgctgc ttactatgac 1680 caaactggtg cccttgtagt gaatgcaggc gcgagaaatg gtcttggagc tcctgttcga 1740 cttgtagctc ctgccccagt catcattagt tcctcagctg cacaagcagc tgttgcagca 1800 gccgcagctt cagcaaatgg agcagctggt ggtcttgctg gaacaacaaa tggaccattt 1860 cgccctttag gaacacagca gcctcagccc cagccccagc agcagcccaa taacaacctg 1920 gcatccagtt ctttctacgg caacaactct ctgaacagca attcacagag 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tatccagaaa 2820 gctcttgagt ttattccttc agaccagcag aatgagatgg ttcgggaact agatggccat 2880 gtcttgaagt gtgtgaaaga tcagaatggc aatcacgtgg ttcagaaatg cattgaatgt 2940 gtacagcccc agtctttgca atttatcatc gatgcgttta agggacagcg agtgatagac 3000 agccaagcag agaaactgaa ggagcttgac aaggagatcc ggcccttccg gcagaactgg 3060 gaggaagcag acagcatgaa gagcagcgtg gagtccctcc agaaccgcgt gaccgagctg 3120 gagagcgtgg acaagagcgc ggggcaagtg gctcggaaca caggcctgct ggagtcccag 3180 ctgagccggc atgaccagat gctgagtgtg cacgacatcc gcctagccga catggacctg 3240 cgcttccagg tcctggagac cgccagctac aatggagtgc tcatctggaa gattcgcgac 3300 tacaagcggc ggaagcagga ggccgtcatg gggaagaccc tgtcccttta cagccagcct 3360 ttctacactg gttactttgg ctataagatg tgtgccaggg tctacctgaa cggggacggg 3420 atggggaagg ggacgcactt gtcgctgttt tttgtcatca tgcgtggaga atatgatgcc 3480 ctgcttcctt ggccgtttaa gcagaaagtg acactcatgc tgatggatca ggggtcctct 3540 cgacgtcatt tgggagatgc attcaagccc gaccccaaca gcagcagctt caagaagccc 3600 actggagaga tgaatatcgc ctctggctgc ccagtctttg tggcccaaac tgttctagaa 3660 aatgggacat atattaaaga tgatacaatt tttattaaag tcatagtgga tacttcggat 3720 ctgcccgatc cc 3732 <210> 9 <211> 3495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PUM1-TRAF3 fusion gene of Homo sapiens <400> 9 atgagcgttg catgtgtctt gaagagaaaa gcagtgcttt ggcaggactc tttcagcccc 60 cacctgaaac atcaccctca agaaccagct aatcccaaca tgcctgttgt tttgacatct 120 ggaacagggt cgcaagcgca gccacaacca gctgcaaatc aggctcttgc agctgggact 180 cactccagcc ctgtcccagg atctatagga gttgcaggcc gttcccagga cgacgctatg 240 gtggactact tctttcagag gcagcatggt gagcagcttg ggggaggagg aagtggagga 300 ggcggctata ataatagcaa acatcgatgg cctactgggg ataacattca tgcagaacat 360 caggtgcgtt ccatggatga actgaatcat gattttcaag cacttgctct ggagggaaga 420 gcgatgggag agcagctctt gccaggtaaa aagttttggg aaacagatga atccagcaaa 480 gatggaccaa aaggaatatt cctgggtgat caatggcgag acagtgcctg gggaacatca 540 gatcattcag tttcccagcc aatcatggtg cagagaagac ctggtcagag tttccatgtg 600 aacagtgagg tcaattctgt actgtcccca cgatcggaga gtgggggact aggcgttagc 660 atggtggagt atgtgttgag ctcatccccg ggcgattcct gtctaagaaa aggaggattt 720 ggcccaaggg atgcagacag tgatgaaaac gacaaaggtg aaaagaagaa caagggtacg 780 tttgatggag ataagctagg agatttgaag gaggagggtg atgtgatgga caagaccaat 840 ggtttaccag tgcagaatgg gattgatgca gacgtcaaag attttagccg tacccctggt 900 aattgccaga actctgctaa tgaagtggat cttctgggtc caaaccagaa tggttctgag 960 ggcttagccc agctgaccag caccaatggt gccaagcctg tggaggattt ctccaacatg 1020 gagtcccaga gtgtcccctt ggaccccatg gaacatgtgg gcatggagcc tcttcagttt 1080 gattattcag gcacgcaggt acctgtggac tcagcagcag caactgtggg actttttgac 1140 tacaattctc aacaacagct gttccaaaga cctaatgcgc ttgctgtcca gcagttgaca 1200 gctgctcagc agcagcagta tgcactggca gctgctcatc agccgcacat cggtttagct 1260 cccgctgcgt ttgtccccaa tccatacatc atcagcgctg ctcccccagg gacggacccc 1320 tacacagctg gattggctgc agcagcgaca ctaggcccag ctgtggtccc tcaccagtat 1380 tatggagtta ctccctgggg agtctaccct gccagtcttt tccagcagca agctgccgct 1440 gccgctgcag caactaattc agctaatcaa cagaccaccc cacaggctca gcaaggacag 1500 cagcaggttc tccgtggagg agccagccaa cgtcctttga ccccaaacca gaaccagcag 1560 ggacagcaaa cggatcccct tgtggcagct gcagcagtga attctgccct tgcatttgga 1620 caaggtctgg cagcaggcat gccaggttat ccggtgttgg ctcctgctgc ttactatgac 1680 caaactggtg cccttgtagt gaatgcaggc gcgagaaatg gtcttggagc tcctgttcga 1740 cttgtagctc ctgccccagt catcattagt tcctcagctg cacaagcagc tgttgcagca 1800 gccgcagctt cagcaaatgg agcagctggt ggtcttgctg gaacaacaaa tggaccattt 1860 cgccctttag gaacacagca gcctcagccc cagccccagc agcagcccaa taacaacctg 1920 gcatccagtt ctttctacgg caacaactct ctgaacagca attcacagag cagctccctc 1980 ttctcccagg gctctgccca gcctgccaac acatccttgg gattcggaag tagcagttct 2040 ctcggcgcca ccctgggatc cgcccttgga gggtttggaa cagcaggagg actcacgaat 2100 ggcagtggaa gatacatctc tgctgctcca ggcgctgaag ccaagtaccg cagtgcaagc 2160 agcgcctcca gcctcttcag cccgagcagc actcttttct cttcctctcg tttgcgatat 2220 ggaatgtctg atgtcatgcc ttctggcagg agcaggcttt tggaagattt tcgaaacaac 2280 cggtacccca atttacaact gcgggagatt gctggacata taatggaatt ttcccaagac 2340 cagcatgggt ccagattcat tcagctgaaa ctggagcgtg ccacaccagc tgagcgccag 2400 cttgtcttca atgaaatcct ccaggctgcc taccaactca tggtggatgt gtttggtaat 2460 tacgtcattc agaagttctt tgaatttggc agtcttgaac agaagctggc tttggcagaa 2520 cggattcgag gccacgtcct gtcattggca ctacagatgt atggctgccg tgttatccag 2580 aaagctcttg agtttattcc ttcagaccag cagaatgaga tggttcggga actagatggc 2640 catgtcttga agtgtgtgaa agatcagaat ggcaatcacg tggttcagaa atgcattgaa 2700 tgtgtacagc cccagtcttt gcaatttatc atcgatgcgt ttaagggaca gcgagtgata 2760 gacagccaag cagagaaact gaaggagctt gacaaggaga tccggccctt ccggcagaac 2820 tgggaggaag cagacagcat gaagagcagc gtggagtccc tccagaaccg cgtgaccgag 2880 ctggagagcg tggacaagag cgcggggcaa gtggctcgga acacaggcct gctggagtcc 2940 cagctgagcc ggcatgacca gatgctgagt gtgcacgaca tccgcctagc cgacatggac 3000 ctgcgcttcc aggtcctgga gaccgccagc tacaatggag tgctcatctg gaagattcgc 3060 gactacaagc ggcggaagca ggaggccgtc atggggaaga ccctgtccct ttacagccag 3120 cctttctaca ctggttactt tggctataag atgtgtgcca gggtctacct gaacggggac 3180 gggatgggga aggggacgca cttgtcgctg ttttttgtca tcatgcgtgg agaatatgat 3240 gccctgcttc cttggccgtt taagcagaaa gtgacactca tgctgatgga tcaggggtcc 3300 tctcgacgtc atttgggaga tgcattcaag cccgacccca acagcagcag cttcaagaag 3360 cccactggag agatgaatat cgcctctggc tgcccagtct ttgtggccca aactgttcta 3420 gaaaatggga catatattaa agatgataca atttttatta aagtcatagt ggatacttcg 3480 gatctgcccg atccc 3495 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ASH1L <400> 10 cgagctgagg aaaaaggttg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ASH1L <400> 11 ctccgatgat tcctcgacat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DOCK7 <400> 12 ctgtggattc tgggccttta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DOCK7 <400> 13 ggaagcaaag catcaggaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ASH1L-DOCK7 <400> 14 ccttctgaaa ccccagctaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ASH1L-DOCK7 <400> 15 agcaatcgtg ctgacaagag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PUM1 <400> 16 cggtcgtcct gaggataaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PUM1 <400> 17 tacgaagagt tgcgatgtgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for deletion form of PUM1 <400> 18 cggcaacaac tctctgaaca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for deletion form of PUM1 <400> 19 atcgcaaacg agaggaagag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TRAF3 <400> 20 tgctgagctc ttcaagtcca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TRAF3 <400> 21 tcggtgtctt cgtgtttctg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PUM1-TRAF3 <400> 22 tgtatggctg ccgtgttatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PUM1-TRAF3 <400> 23 atgtcgtgca cactcagcat 20

Claims (11)

  1. 하기의 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer); 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단용 키트:
    (ⅰ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열의 5' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
    (ⅱ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열의 3' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
    (ⅲ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질; 또는
    (ⅳ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단되고, 엑손14가 결실된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질.
  2. 담도암 진단용 마커인 하기의 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer); 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 담도암 진단용 마커 검출용 키트:
    (ⅰ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열의 5' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
    (ⅱ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열의 3' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
    (ⅲ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질; 또는
    (ⅳ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단되고, 엑손14가 결실된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 ASH1L-DOCK7 융합 단백질은 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 ASH1L-DOCK7 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 서열목록 제3서열, 제4서열 또는 제5서열의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 PUM1-TRAF3 융합 단백질은 서열목록 제6서열 또는 제7서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 서열목록 제6서열의 PUM1-TRAF3 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 서열목록 제8서열의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 서열목록 제7서열의 PUM1-TRAF3 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자는 서열목록 제9서열의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 담도암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 시료 내에 있는 하기의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자를 검출하는 단계를 통하여 담도암 진단용 마커를 검출하는 방법:
    (ⅰ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열의 5' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
    (ⅱ) 5' 쪽에 ASH1L(Histone-lysine N-methyltransferase ASH1L) 유전자의 5' 쪽 단편 서열의 3' 쪽 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 DOCK7(Dedicator of cytokinesis protein 7) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 ASH1L-DOCK7 융합 유전자에 의하여 암호화된 ASH1L-DOCK7 융합 단백질;
    (ⅲ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질; 또는
    (ⅳ) 5' 쪽에 3'-말단이 절단되고, 엑손14가 결실된 PUM1(pumilio RNA binding family member 1) 유전자의 단편 서열을 가지며, 3' 쪽에는 TRAF3(TNF receptor associated factor 3) 유전자의 3' 쪽 단편 서열을 갖는 PUM1-TRAF3 융합 유전자에 의하여 암호화된 PUM1-TRAF3 융합 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포 또는 이의 배양액, 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR20200117914A (ko) * 2019-04-05 2020-10-14 주식회사 제놉시 Cfdna를 이용한 담도암 진단방법
WO2023101457A1 (ko) * 2021-12-01 2023-06-08 연세대학교 산학협력단 담도암의 예방 또는 치료용 조성물
KR20240063787A (ko) 2022-11-03 2024-05-10 부산대학교 산학협력단 담도암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 담도암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법

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