KR20170125877A - 전위효소 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

전위효소 폴리펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20170125877A
KR20170125877A KR1020177027114A KR20177027114A KR20170125877A KR 20170125877 A KR20170125877 A KR 20170125877A KR 1020177027114 A KR1020177027114 A KR 1020177027114A KR 20177027114 A KR20177027114 A KR 20177027114A KR 20170125877 A KR20170125877 A KR 20170125877A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
polypeptide
cells
lys
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020177027114A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102615825B1 (ko
Inventor
로렌스 제이. 쿠퍼
나탈리아 벨루소바
Original Assignee
보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 filed Critical 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Publication of KR20170125877A publication Critical patent/KR20170125877A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102615825B1 publication Critical patent/KR102615825B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

전위효소 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드가 제공되고 이는 포유동물 세포에서 높은 활성을 갖는다. 트랜스포즈와 함께 키메라 항원 T-세포와 같은 세포를 가공하기 위한 방법이 또한 제공된다.

Description

전위효소 폴리펩타이드 및 이의 용도
본원은 하기의 우선권을 주장한다: 미국 가출원 제62/131,827호(2016년 3월 11일자로 출원됨), 이의 전체 내용은 본원에 참조로 인용됨.
서열 목록의 도입
서열 목록은 “UTFCP1256WO_ST25.txt”의 파일명으로 포함되고, 이는 18 KB (Microsoft Windows®로 측정시)이고 2016년 3월 3일자로 작성되었고 본원과 함께 전자 파일로 제출되었고 본원에 참조로 인용된다.
1. 기술분야
본 발명은 일반적으로 의약, 면역학, 세포 생물학 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명의 분야는 전위효소 폴리펩타이드 및 유전학적 가공에서 이의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 업계의 설명
기능성 게놈 시대에 세포 게놈에서 암호화 서열을 변화시키기 위해 효율적인 수단이 요구된다. 상기 게놈 가공을 사용하여 전이유전자를 안정하게 발현하는 세포를 제조하기 위해 그리고 세포 재프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 게놈 가공에 사용되는 하나의 적합한 도구는 트랜스포존/전위효소 시스템이다. 트랜스포존 또는 전이가능한 요소는 이의 업스트림 및 다운스트림에 말단 반복 서열을 갖는 (짧은) 핵산 서열을 포함하고 핵산의 절단 및 상기 핵산의 표적 DNA 서열로의 삽입을 촉진시키는 효소를 암호화하고 있다. 여러 트랜스포존/전위효소 시스템은 이종성 DNA 서열의 유전학적 삽입을 위해 채택되어 왔고 상기 서열은 잠자는 미녀(Sleeping Beauty ( SB )), 다양한 척추동물 배양된 세포주에서 전이 활성을 나타내는 물고기로부터의 Tc1/마리너형 요소, 배아 줄기 세포 및 생체내 (Ivics 등 을 포함한다: 1997). 그러나, 상기 시스템의 어느 것도 인간/포유동물 세포 가공을 위해 채택되지 않았다. 따라서, 포유동물 세포 및 유기체에서 고수준의 활성을 갖는 트랜스포존/전위효소 시스템이 필요하다.
발명의 요약
제1 양태에서, 포유동물 세포에서 증진된 전위효소 활성을 포함하거나 이것으로 이루어진 재조합 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 서열번호: 1 (hSB110) 또는 서열번호: 3 (hSB81)와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 특정 측면에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3를 포함하거나 이것으로 이루어거나 서열번호: 1 또는 서열번호: 3의 전장과 적어도 90% 동일한 서열이고 포유동물 세포에서 전위효소 활성을 나타낸다. 추가의 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 1 또는 서열번호 3와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 포유동물 세포에서 전위효소 활성을 나타내고, 하기의 특징들 중 하나 이상을 포함한다: 136번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 253번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 255번 위치 (SB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg 및/또는 314번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Thr.추가의 측면에서, 이전의 적어도 90% 동일한 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 전위효소 효소의 서열을 포함하지 않거나 서열번호: 5 (SB11), 서열번호: 6 (SB10) 또는 서열번호: 7 (SB100x)의 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 서열번호: 1 (hSB110) 또는 서열번호: 3 (hSB81)와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 서열번호: 1 (hSB110) 또는 서열번호: 3 (hSB81)와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고 포유동물에서 전위효소 활성을 나타낸다. 일부 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 서열번호: 1 (hSB110) 또는 서열번호: 3 (hSB81)와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 포유동물 세포에서 전위효소 활성을 나타내고 하기 특징들 중 하나 이상을 포함하거나 이들로 이루어진다: 136번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 253번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 255번 위치 (SB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg 및/또는 314번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Thr. 일부 측면에서, 이전에 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 동일한 폴리펩타이드는 천연에 존재하는 전위효소 효소의 서열을 포함하지 않거나 서열번호: 5 (SB11), 서열번호: 6 (SB10) 또는 서열번호: 7 (SB100x)의 서열을 포함하지 않는다. 여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드는 전위효소 서열의 N- 또는 C-말단에 융합된 이종성 폴리펩타이드 서열을 추가로 포함하거나 이것으로 이루어진다. 예를 들어, 상기 이종성 폴리펩타이드 서열은 리포터, 정제 태그 또는 세포 침투 폴리펩타이드 (CPP)를 포함할 수 있거나 이것으로 이루어질 수 있다. 추가의 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드가 전위효소 활성을 나타내는 포유동물 세포는 인간 세포이다. 추가의 측면에서, 인간 세포는 면역 세포이다. 추가의 측면에서 인간 면역 세포는 T 세포이다. 추가의 측면에서, T 세포는 T 헬퍼 세포 (TH 세포), 세포독성 T 세포 (Tc 세포 또는 CTL), 기억 T 세포 (TCM 세포), 이펙터 T 세포 (TEM 세포), 조절 T 세포 (Treg 세포; 또한 억제제 T 세포로서 공지된), 천연 킬러 T 세포 (NKT 세포), 점막 관련 불변 T 세포, 알파-베타 T 세포 (Tαβ 세포), 및/또는 감마-델타 T 세포 (Tγδ 세포)이다.
여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 서열번호: 1 (hSB110) 또는 서열번호: 3 (hSB81)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고 하기의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 136번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 253번 위치(hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 255번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg 및/또는 314번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Thr을 포함하고 추가로 하기의 추가의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 14번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 33번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Ala, 115번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 214번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Asp, 215번 위치(hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Ala, 216번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Val, 217번 위치(hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Gln, 및/또는 243번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His. 일부 측면에서, 이전의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 전위효소 효소의 서열을 포함하지 않거나 서열번호: 5 (SB11), 서열번호: 6 (SB10) 또는 서열번호: 7 (SB100x)의 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 서열 특징들을 포함한다: 14번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 33번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Ala, 115번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 214번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Asp, 215번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Ala, 216번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Val, 217번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Gln, 및 243번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His.추가의 측면에서, 이전의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩타이드는 214번 내지 217번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 서열 DAVQ를 포함한다.
일부 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 서열번호: 1 (hSB110)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고 314번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Asn을 포함하고 하기의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 136번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 253번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 및/또는 255번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg. 일부 측면에서, 이전의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 전위효소 효소의 서열을 포함하지 않거나 서열번호: 5 (SB11), 서열번호: 6 (SB10) 또는 서열번호: 7 (SB100x)의 서열을 포함하지 않는다. 특정 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 1을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
다른 측면에서, 상기 양태의 폴리펩타이드는 하기 서열번호와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다: 3 (hSB81), 314번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Thr을 포함하고 하기의 특징 중 하나 이상을 포함한다: 136번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg, 253번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 His, 및/또는 255번 위치 (hSB110에서)에 상응하는 위치에서 Arg. 일부 측면에서, 이전의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 전위효소 효소의 서열을 포함하지 않거나 서열번호: 5 (SB11), 서열번호: 6 (SB10) 또는 서열번호: 7 (SB100x)의 서열을 포함하지 않는다. 특정 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 하기 서열번호: 3을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
추가의 양태에서, 상기 양태에 따라 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자가 제공된다. 상기 분자는 일부 측면에서 DNA 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어, DNA 발현 벡터는 폴리펩타이드의 시험관내 발현을 위한 프로모터 (예를 들어, T7 또는 SP6 프로모터) 또는 포유동물 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된 전위효소 암호화 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 RNA 또는 mRNA일 수 있다. 추가의 측면에서, RNA는 5’-캡, IRES 모티프, (이종성) 5’ UTR, (이종성) 3’ UTR 및/또는 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다. RNA는 일부 측면에서 20개 내지 300개 폴리뉴클레오타이드의 폴리(A) 서열을 추가로 포함할 수 있다.
여전히 추가의 양태에서 본 발명은 상기된 바와 같은 전위효소 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질감염시키고 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 상기 폴리펩타이드를 발현함을 포함한다. 여전히 추가의 양태에서, 본 발명은 상기 양태의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오터이드 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 경우에, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포이다. 특정 측면에서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포이다. 추가의 측면에서, 상기 세포는 천연 킬러 (NK) 세포, NK 세포의 전구체, T-세포, T-세포의 전구체, 또는 면역 세포이다. 일부 경우에, 상기 세포는 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는RNA를 포함할 수 있다. 여전히 추가의 양태에서, 세포 집단이 제공되고 상기 세포는 상기 양태의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
또 다른 양태에서, 방법은 다음을 포함하는 세포를 유전학적으로 가공하기 위해 제공된다: 상기 세포를 상기된 바와 같이 전위효소 폴리펩타이드 또는 상기 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 선택된 유전학적 요소를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 벡터로 형질감염시키고, 이어서 상기 세포를 (일시적이거나 안정한) 전위효소 활성에 대해 적당한 조건하에서 항온처리함으로써 세포의 게놈 내 선택된 유전학적 요소를 통합시키고 가공된 세포를 제조함을 포함한다. 특정 측면에서, 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 선택된 유전학적 요소를 암호화하는 DNA 벡터는 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 특정 측면에서, 상기 양태의 방법은 세포를, 프로모터 서열의 제어하에 있는 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 선택된 유전학적 요소를 암호화하는 서열 및 상기 양태의 전위효소를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 벡터로 형질감염시키고 이어서 전위효소 발현 및 활성에 대해 적당한 조건하에서 세포를 항온처리함으로써 세포의 게놈내 선택된 유전학적 요소를 통합시키고 상기 가공된 세포를 제조함을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 가공된 세포를 단리하거나 배양하는 제3 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 선택된 유전학적 요소는 스크리닝할 수 있거나 선택 가능한 마커이다. 추가의 측면에서, 선택된 유전학적 요소는 항체, 억제성 핵산 (예를 들어, 작은 간섭 RNA (siRNA)), 치료학적 폴리펩타이드, T-세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 면역 세포 기능의 증진제를 암호화할 수 있다. 특정 측면에서, 선택된 유전학적 요소는 CAR 또는 TCR을 암호화한다. 여전히 추가의 측면에서, 상기 선택된 유전학적 요소는 세포로부터 상응하는 유전자를 대체하거나 변형시키기 위해 (예를 들어, 유전자의 서열 또는 발현을 변화시키기 위해 또는 세포에서 유전자 발현 “녹-아웃”시키기 위해) 사용되는 유전자 또는 이의 일부일 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 형질감염된 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다. 일부 측면에서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 iPS 세포일 수 있다. 특정 측면에서, 상기 세포는 면역계 세포 또는 이의 전구체, 예를 들어, NK 세포, T-세포 또는 NK 세포의 전구체, 또는 T-세포의 전구체일 수 있다.
몇몇 측면에서, 세포의 형질감염은 화학적 기반 형질감염 시약, 세포의 전기천공 또는 핵산 및/또는 단백질의 세포의 세포질 및 핵으로의 전달을 제공하는 다른 기술의 용도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 염 침전물을 사용하여 형질감염시킬 수 있다 (예를 들어, CaPO4 침전물), 지질 (예를 들어, 하전된 또는 비-극성 지질), 양이온성 중합체, PEG-복합체 및/또는 단백질 복합체 (예를 들어, 양이온성 폴리펩타이드). 일부 측면에서, 형질감염은 리포좀, 예를 들어, 인지질 리포좀 (예를 들어, 글리세로인지질 또는 스핑고지질을 혼입하는 리포좀)의 용도를 포함할 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 세포에는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스) 또는 백시니아 바이러스 벡터)를 사용하여 형질도입할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 양태에 따라 사용하기 위한 바이러스 벡터는 비-통합 바이러스 벡터이다. 당업자는 특정 측면에서, 상기 양태의 전위효소가 트랜스포존 반복체를 암호화하는 핵산과 함께 또는 이와는 별도로 세포에게 전달될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 특정 측면에서, 전위효소는 단백질 형질감염 시약을 사용하여 재조합 폴리펩타이드로서 세포에 전달될 수 있고 상기 트랜스포존 반복체를 포함하는 핵산 분자는 핵산 형질감염 시스템 또는 바이러스 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 추가의 측면에서, 전위효소를 암호화하는 RNA는 트랜스포존 반복체 및 선택된 유전학적 요소를 포함하는 DNA와 동시 형질감염시킨다.
추가의 측면에서, 상기 방법은 추가로 세포 집단을 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드 폴리펩타이드 또는 상기 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 선택된 유전학적 요소를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 벡터로 형질감염시키고 이어서 상기 집단을 전위효소 활성을 위해 적당한 조건하에서 항온처리함으로써 세포의 게놈 내에서 선택된 유전학적 요소를 통합시키고 가공된 세포 집단을 제조함을 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 T-세포 또는 T-세포 전구체를 전위효소 폴리펩타이드 또는 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 벡터로 형질감염시키고 상기 집단을 전위효소 활성을 위해 적당한 조건하에서 항온처리함으로써 상기 CAR을 세포의 게놈에 통합시키고 가공된 T-세포 또는 T-세포 전구체의 집단을 제조함을 포함한다. 추가의 측면에서, 상기 방법은 T-세포 또는 T-세포 전구체 집단을 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 CAR을 암호화하는 서열 및 상기 양태 (프로모터에 작동적으로 연결된)의 전위효소를 암호화하는 서열을 포함하는 DNA 벡터로 형질감염시키고 상기 집단을 전위효소 활성을 위해 적당한 조건하에서 항온처리함으로써 상기 CAR을 세포의 게놈에 통합시키고 가공된 T-세포 또는 T-세포 전구체의 집단을 제조함을 포함한다. 가공된 세포를 CAR-발현 T-세포의 집단을 선택적으로 증진시키는 배지에서 배양하는 것은 일부 측면에서 추가로 수행될 수 있다.
여전히 추가의 양태에서, 질환을 갖는 인간 대상체에서 T-세포 반응을 제공하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 먼저 상기 양태에 따라 가공된 T-세포 또는 T-세포 전구체 집단을 수득하고, 임의로 상기 세포를 CAR-발현 T-세포의 증식을 선택적으로 증진시키는 배지에서 배양하고 이어서 유효량의 CAR-발현 T-세포를 대상체에게 투여하여 T-세포 반응을 제공함을 포함한다.
따라서, 일부 측면에서, 상기 양태의 방법은 다음을 포함한다: (a) T-세포 또는 T-세포 선조체를 포함하는 세포의 샘플을 상기 대상체로부터 수득하고; (b) 상기 세포를 트랜스포존-플랭킹된 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 상기 CAR을 암호화하는 DNA를 세포의 게놈 내로 통합시키는데 효과적인 양태의 전위효소를 암호화하는 DNA로 형질감염시켜 유전자전이 CAR-발현 세포 집단을 제공하고, (c) 임의로 유전자전이 CAR 세포를 생체외에서 CAR-발현 T-세포의 증식을 선택적으로 증진시키는 배지에서 배양하고; (d) 유효량의 상기 유전자전이 CAR 세포를 대상체에 투여하여 T-세포 반응을 제공함을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 유전자전이 CAR 세포는 21일 미만 동안, 예를 들어, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 미만 또는 그 이하 동안 생체외에서 배양된다. 특정 측면에서, 상기 CAR 세포는 3 내지 5일 이하 동안 생체외에서 배양된다. 여전히 추가의 측면에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)-(d) (즉, 세포 샘플을 수득하여 CAR T 세포를 투여하는 단계)는 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5일 이하에 완료시킨다. 추가의 측면에서, 대상체로부터의 세포의 샘플은 약 200 ml 미만의 말초 혈액 또는 제대혈 샘플일 수 있다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 성분채집술에 의해 수거될 수 있다. 특정 측면에서, 상기 샘플은 성분채집술을 포함하지 않는 방법 ((예를 들어, 정맥 천자에 의해)에 의해 수거된다. 여전히 추가의 측면에서, 세포의 샘플은 175 ml 미만, 약 175 ml 미만, 150 ml 미만, 약 150 ml 미만, 125 ml 미만, 약 125 ml 미만, 100 ml 미만, 약 100 ml 미만, 75 ml 미만, 약 75 ml 미만, 50 ml 미만, 약 50 ml 미만, 25 ml 미만, 또는 약 25 ml 미만의 초기 용적을 갖는다(예를 들어, 세포 샘플은 대상체로부터 수득되는 경우 약 50 내지 약 200 ml, 약 50 내지 약 100 ml, 또는 약 100 내지 약 200 ml의 초기 용적을 갖는다).
일부 측면에서, 상기 양태의 방법은 세포를 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 전위효소를 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것에 관한 것이다. 세포의 형질감염 방법은 당업계에 널리 공지되어 있지만 특정 측면에서, 전기천공과 같은 고도로 효율적인 형질감염 방법이 사용된다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오펙션 장치를 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 특정 양태에서, 형질감염 단계 는 세포를 유전자독소를 유발하고/유발하거나 처리된 대상체에서 바이러스 서열을 함유하는 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스로 감염시키거나 형질도입함을 포함하지 않는다.
상기 양태의 추가의 측면은 세포를 CAR을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시키는 것에 관한 것이다. 광범위한 CAR 작제물 및 이에 대한 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR 발현 벡터는 플라스미드, 선형 발현 벡터 또는 에피좀과 같은 DNA 발현 벡터이다. 일부 측면에서, 상기 벡터는 프로모터, 인핸서, 폴리-A-신호 및/또는 하나 이상의 인트론과 같은, CAR의 발현을 촉진시키는 서열과 같은 추가의 서열을 포함한다. 특정 측면에서, CAR 암호화 서열은 트랜스포존 서열에 의해 플랭킹되도록 하여 트랜스포존의 존재는 암호화 서열이 형질감염된 세포의 게놈으로 통합되도록 한다.
상기 상세히 기재된 바와 같이, 특정 측면에서, 세포는 CAR 암호화 서열의 형질감염된 세포의 게놈으로의 통합을 촉진시키는 양태의 전위효소로 추가로 형질감염시킨다. 몇몇 측면에서, 상기 전위효소는 DNA 발현 벡터로서 제공된다. 특정 측면에서, 상기 전위효소는 상기 전위효소의 장기 발현이 유전자전이된 세포에서 일어나지 않도록 발현가능한 RNA 또는 단백질로서 제공된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 상기 전위효소는 mRNA (예를 들어, 캡 및 폴리-A 테일을 포함하는 mRNA)에 의해 암호화된 것으로서 제공된다.
여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 유전자전이된 CAR 세포는 T-세포의 증식 및/또는 생존을 자극하는 막-결합된 사이토킨의 발현을 위한 발현 벡터를 추가로 포함한다. 특히, 상기 사이토킨을 포함하는 CAR 세포는 사이토킨 발현에 의해 제공된 자극으로 인해 활성화 및 증식 세포 (AaPC) 또는 인공 항원 제공 세포 (aAPC)와 함께 거의 생체외 배양으로 증식시키고/시키거나 지속할 수 있다. 또한, 상기 CAR 세포는 심지어 CAR에 의해 인지되는 대량의 항원이 존재하지 않는 경우에도 (예를 들어, 차도가 있는 암 환자의 경우 또는 최소 잔여 질환을 갖는 환자의 경우에서와 같이) 생체내에서 증식할 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 CAR 세포는 Cγ 사이토킨 및 요소 (예를 들어, 막관통 도메인)의 발현을 위한 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하여 사이토킨의 표면 발현을 제공한다. 예를 들어, 상기 CAR 세포는 IL-7, IL-15 또는 IL-21의 막-결합된 버젼을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 사이토킨은 사이토킨 암호화 서열과 상기 사이토킨에 대한수용체의 융합에 의해 막으로 부착시킨다. 예를 들어, 세포는 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질의 발현을 위한 벡터를 포함할 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 막-결합된 Cγ 사이토킨을 암호화하는 벡터는 CAR 세포의 게놈으로 통합된 벡터 또는 염색체외 벡터 (예를 들어, 및 에피좀 벡터)와 같은 DNA 발현 벡터이다. 여전히 추가의 측면에서, 막-결합된 Cγ 사이토킨의 발현은 유도성 프로모터 (예를 들어, 약물 유도성 프로모터)의 제어하게 있어서 CAR 세포내 사이토킨의 발현 (및 이에 의해 CAR 세포의 증식)이 프로모터 활성을 유도하거나 억제함에 의해 제어될 수 있도록 한다.
상기 양태 의 측면은 NK 세포, NKT 세포, T-세포 또는 T-세포 선조체 세포를 포함하는 환자로부터 샘플을 수득하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 샘플은 제대혈 샘플, 말초 혈액 샘플 (예를 들어, 단핵구 세포 분획) 또는 만능 줄기 세포를 포함하는 대상체로부터의 샘플이다. 일부 측면에서, 대상체로부터의 샘플을 배양하여 유도된 만능 줄기 (iPS) 세포를 제조할 수 있고 이들 세포는 NK 세포, NKT 세포 또는 T-세포를 제조하기 위해 사용된다. 세포 샘플은 대상체로부터 직접 배양될 수 있거나 사용 전에 동결 보존될 수 있다. 몇몇 측면에서, 세포 샘플을 수득하는 것은 세포 샘플을 수거함을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 샘플은 제3 자에 의해 수득된다. 여전히 추가의 측면에서, 대상체로부터의 샘플은 샘플에서 T-세포 또는 T-세포 선조체를 정제하거나 집적시키기 위해 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 샘플은 농도 구배 정제, 세포 배양 선택 및/또는 세포 분류 (예를 들어, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS))에 적용될 수 있다.
몇몇 측면에서, 상기 양태의 방법은 항원 제공 세포 (예를 들어, 가공된 세포의 증식을 위해)를 사용하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 항원 제공 세포는 수지상 세포, 활성화 및 증식 세포 (AaPC), 또는 불활성화된 (예를 들어, 조사된) 인공 항원 제공 세포 (aAPC)일 수 있다. 상기 항원 제공 세포를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고 추가로 본원에 상세히 기재되어 있다. 따라서, 일부 측면에서, 유전자전이된 CAR 세포는 CAR 세포 집단을 확대하기 위해 제한된 시간 동안 생체외에서 항원 제공 세포(예를 들어, 불활성화된 aAPC)와 동시 배양한다. CAR 세포를 동시 배양하는 단계는 예를 들어, 인터류킨-21 (IL-21) 및/또는 인터류킨-2 (IL-2)를 포함하는 배지에서 수행될 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 동시 배양은 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 또는 약 1:1 내지 약 1:3의 CAR 세포 대 항원 제공 세포의 비율로 수행된다. 예를 들어, CAR 세포 및 항원 제공 세포의 동시 배양은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비율로 수행될 수 있다.
몇몇 측면에서, AaPC 또는 aAPC와 같은 CAR 세포의 배양을 위한 세포는 CAR 세포의 증식을 증진시키기 위해 특정 폴리펩타이드를 발현하도록 가공된다. 예를 들어, 상기 세포는 (i) CAR에 의해 표적화된 항원 (즉, 유전자전이 CAR 세포 상에서 발현되는)); (ii) CD64; (ii) CD86; (iii) CD137L; 및/또는 (v) aAPC의 표면 상에서 발현되는 막-결합된 IL-15를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 AaPC 또는 aAPCS는 AaPC 또는 aAPC의 표면 상에 발현되는 CAR-결합 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 AaPC 또는 aAPC는 감염성 물질에 대해 시험되고 이것이 부재인 것으로 확인되고/되거나 시험되어 불활성화되고 비-증식화된 것으로 확인된다.
AaPC 또는 aAPC 상의 확대는 배양 중 CAR 세포의 수 또는 농도를 증가시킬 수 있지만, 상기 과정은 노동 집약적이고 고가이다. 더욱이, 일부 측면에서, 치료요법을 필요로 하는 대상체는 가능한 한 짧은 시간 내에 유전자전이 CAR 세포가 재주입되어야 한다. 따라서, 일부 측면에서, 생체외 유전자전이 CAR 세포의 배양은 14일 이하, 7일 이하 또는 3일 이하 동안이다. 예를 들어, 생체외 배양 (예를 들어, AaPC 또는 aAPC의 존재하에 배양)은 유전자전이 CAR 세포의 하나 미만의 집단 배가 동안 수행될 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 상기 유전자전이 세포는 AaPC 또는 aAPC의 존재하에 생체외 배양되지 않는다.
여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 방법은 세포의 형질 감염 후 또는 세포의 생체외 확대 후 CAR-발현 T-세포에 대해 세포 집단을 집적시키기 위한 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 집적 단계는 예를 들어, CAR 또는 CAR-결합 항체에 의해 결합된 항원을 사용함에 의한 세포의 분류 (예를 들어, FACS를 통해)를 포함할 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 상기 집적 단계는 비-T 세포의 고갈 또는 CAR 발현이부재인 세포의 고갈을 포함한다. 예를 들어, CD56+ 세포는 배양 집단으로부터 고갈될 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, CAR 세포의 샘플은 세포가 대상체로 투여되는 경우 보존된다 (또는 배양 중에 유지된다). 예를 들어, 샘플은 이후 확대 또는 분석에 의해 동결보존될 수 있다.
특정 측면에서, 유전자전이 CAR 세포는 내인성 T-세포 수용체 및/또는 내인성HLA의 발현을 위해 불활성화된다. 예를 들어, T 세포는 내인성 알파/베타 T-세포 수용체 (TCR)의 발현을 제거하기 위해 가공될 수 있다. 특정 양태에서, CAR+ T 세포는 유전학적으로 변형시켜 TCR의 발현을 제거한다. 몇몇 측면에서, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 사용한 CAR-발현 T 세포에서 T-세포 수용체 α/β가 붕괴되어 있다. 특정 측면에서, CAR-발현 T 세포에서 상기 T-세포 수용체 αβ-쇄는 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 녹-아웃시킨다.
본원에 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 상기 양태의 CAR 세포는 광범위한 질환 및 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 필수적으로, 특정 항원의 특이적 또는 증진된 발현을 포함하는 임의의 질환은 CAR 세포를 항원으로 표적화함에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환, 감염 및 암은 본 발명의 방법 및/또는 조성물로 치료될 수 있다. 이들은 1차, 전이성, 재발, 민감성 대 치료요법, 난치성 대 치료요법 암 (예를 들어, 화학-난치성 암)과 같은 암을 포함한다. 상기 암은 혈액, 폐, 뇌, 결장, 전립선, 유방, 간, 신장, 위, 자궁, 난소, 고환, 뇌하수체, 식도, 비장, 피부, 골 등 의 암일 수 있다 (예를 들어, B-세포 림프종 또는 흑색종). 암 치료의 경우에, CAR 세포는 전형적으로 암 세포 항원 (또한 종양-관련 항원(TAA)으로서 공지됨)을 표적화한다.
여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 유전자전이 CAR 세포를 사용하여 명백한 차도가 있는 암 환자와 같은 최소 잔여 질환을 갖는 대상체(예를 들어, 존재하는 매우 소량의 CAR-표적화된 항원을 갖는 대상체)를 치료할 수 있다. 새로운 고도의 민감성 진단학적 기술을 사용하여, 암-관련된 항원 (또는 암 세포)은 명시적 암 증상을 나타내지 않는 환자에서 검출될 수 있다. 상기 환자는 항원-표적화된 CAR 세포를 사용하여 잔여 질환을 제거하기 위한 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 특정양태에서, 잔여 질환의 표적화를 위한 유전자전이 CAR 세포는 이들 세포가 소량의 표적 항원에도 불구하고 생체내 확대시키는 능력을 보유하여 막-결합된 증식 사이토킨의 발현을 추가로 포함한다.
상기 양태의 과정은 다양한 종양 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 CAR+ T 세포를 제조(예를 들어, 임상적 시험을 위해)하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, CD19, ROR1, CD56, EGFR, CD33, CD123, c-met, GD2). 상기 기술을 사용하여 제조된 CAR+ T 세포를 사용하여 백혈병을 갖는 환자를 치료할 수 있다 (예를 들어, AML, ALL, CML), 감염 및/또는 고형 종양. 예를 들어, 상기 양태의 방법을 사용하여 세포 증식 질환, 진균류, 바이러스, 세균 또는 기생충 감염을 치료할 수 있다. 표적화될 수 있는 병원체는 제한 없이 플라스모듐 (Plasmodium), 트리파노솜(trypanosome), 아스퍼질러스 ( Aspergillus ), 캔디다( Candida ), HSV, RSV, EBV, CMV, JC 바이러스, BK 바이러스, 또는 에볼라 병원체를 포함한다. 상기 양태의 CAR 세포에 의해 표적화될 수 있는 항원의 추가의 예는 제한 없이 CD19, CD20, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메오텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 또는 VEGFR2를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 양태의 방법은 CD19 또는 HERV-K-발현 세포의 표적화에 관한 것이다. 예를 들어, HERV-K 표적화된 CAR 세포는 면역글로불린 항체 6H5의 scFv 서열을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 CAR은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이의 조합물과 같은 사이토킨과 접합되거나 융합될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 의학적 병태를 갖는 개체를 치료하기 위해 제공되고, 상기 방법은 본원에 기재된 세포 집단으로부터 유효량의 세포를 제공하는 단계를 포함하고, 몇몇 측면에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일 이상의 간격과 같은 1회 초과를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 암은 방광암, 혈액암, 골암, 골수암, 뇌암, 유방암, 결장암, 식도암, 위장암, 치은암, 두부암, 신장암, 간암, 폐암, 인두암, 경부암, 난소암, 전립선암, 피부암, 위암, 고환암, 설암 또는 자궁암이다. 특정 측면에서, 상기 암은 림프종, 백혈병, 비-호지킨 림프종, 급성 림프구아성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia) 또는 B 세포-관련 자가면역 질환이다.
본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 청구항에서 단수는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 청구항에서 용어 “포함하는”과 연계하여 사용되는 경우, 용어 단수는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 청구항에서 “또 다른” 또는 “추가로”는 적어도 2번째 이상을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 명세서 및 청구항에서, 용어 “약”은 값이 장치에 대한 고유 오차 변화를 포함함을 지적하기 위해 사용되고 상기 방법은 연구 대상체 중에 존재하는 값 또는 변화를 결정하기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 발명의 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명할 것이기 때문에 본 발명의 특정 양태를 지적하면서 단지 설명을 위해 제공되는 것이다.
도면의 간단한 설명
다음의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 구체적 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 하여 더 양호하게 이해될 수 있다.
도1 : 세포의 전위효소-기반 가공을 위한 예시적 전략.본 실시예에서, CAR을 발현하는 가공된 T-세포가 제조된다. T 세포는 전위효소를 암호화하는 mRNA와 함께 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 CAR을 암호화하는 트랜스포존 DNA 작제물로 동시 형질감염시킨다. 상기 경우에, 4D-NUCLEOFECTORTM 전기천공 시스템 (Lonza Group Ltd., Switzerland)이 형질감염을 위해 사용된다. 일단 세포내로 도입되면, 상기 전위효소는 일시적으로 발현되고 CAR 작제물의 게놈 DNA로의 통합을 매개한다. 전위효소를 암호화하는 mRNA는 세포 내에서 분해되어 세포 내에서 어떠한 장기적 발현이 없도록 보장한다.
도2 : 히스토그램은 도 1에 명시된 바와 같이 CAR로 형질감염된 인간 T-세포의 유동 세포측정 데이터를 보여준다. 결과들은 SB100x과 대비하여 상기 양태의 2개의 재조합 전위효소인 hSB110과 hSB81 간에 비교된다. 상부 패널은 형질감염 후 8일째, 7AAD (7-아미노액티노마이신 D) 염색 (x-축)에 의해 평가된 바와 같이, 비-생존성이 된 세포와 대비하여 CAR (y-축)에 대해 양성인 세포의 수를 보여준다. 하부 패널은 형질감염 후 15일째에 CD3 (x-축)을 발현하는 CAR 발현 (y-축)에 대해 양성인 세포의 수를 보여준다. 상기 연구 결과는 상기 양태의 재조합 전위효소가 유의적으로 SB100x 보다 가공 세포에서 유의적으로 보다 효율적임을 보여준다. 형질감염 후 8일까지, hSB110 및 hSB81 암호화 mRNA로 전기천공된 22% 초과의 세포는 SB100x의 사용으로부터 비롯되는 단지 15%의 세포와 비교하여 CAR을 발현한다. 또한, 15일까지, hSB100 및 hSB81로 전기천공된 80% 초과의 세포 집단은 SB100x의 사용으로부터 비롯되는 단지 73.4%의 세포와 비교하여 CAR 및 CD3을 동시 발현하였다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
I. 세포의 유전학적 가공
세포의 유전학적 가공은 광범위한 세포에서 목적하는 유전자의 안정한 발현을 제공하기 위한 강력한 기술로서 나타났다. 최근에, 상기 기술은 심지어 광범위한 질환 병태에서 치료학적 중재를 위해 사용되는 세포에 적용되었다. 예를 들어, 질환-관련 항원으로 표적화된 수용체를 발현하는 유전학적으로 가공된 T-세포는 현재 항암 치료요법으로서 임상 시험 중에 있다. 전위효소 시스템은 특히 이들이 바이러스-기반 가공 시스템의 통상의 특징인 세포에 유지되는 이종성 유전학적 요소를 도입하지 않기 때문에 치료제로서 사용되는 세포의 경우에 가공에 사용하기 위해 바람직할 수 있는 시스템이다. 그러나, 고효율은 치료학적 중재를 위해 요구되는 유의적인 수의 가공된 T-세포를 제공하기 위해 요구된다.
본원에서의 연구는 인간 세포의 가공에서 유의적으로 개선된 효율을 나타내는hSB110 및 hSB81로 호칭되는 새로운 재조합 전위효소 효소를 입증한다. 예를 들어, CAR 발현 작제물의 1차 인간 T-세포로의 통합을 위해 사용되는 경우, 새로운 전위효소는 세포 집단을 생성시킬 수 있었고, 여기서, 20%를 훨씬 초과하는 세포가 형질감염 후 8일까지 CAR 발현을 나타냈다(도 2). 더욱이, 15일까지, 형질감염된 집단에서 80% 초과의 세포는 CAR 발현에 대해 양성이었다(도2). 인간 세포의 상기 고효율의 유전학적 가공은 이전의 전위효소-기반 가공 시스템 보다 유의적 개선을 나타낸다.
상기 양태의 전위효소 암호화 서열은 포유동물 세포의 고효율 유전학적 가공을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 전위효소는 CAR-발현 T-세포 집단의 신속한 제조를 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 전위효소를 암호화하는 mRNA는 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 목적하는 CAR 발현 카세트를 암호화하는 DNA 벡터와 함께 T-세포(또는 T-세포 전구체)로 동시 형질감염된다. CAR-발현 T-세포는 이어서 정제될 수 있고/있거나 선택적으로 확장될 수 있다. 치료요법을 위해 사용되는 T-세포의 경우에, 세포 제조 시간 및 비용을 줄이기 위해 가능한한 적은 확장이 요구되는 것이 바람직할 수 있다. 중요하게, 본원에 제공된 전위효소는 CAR의 안정한 발현을 나타내고 따라서 추가의 확장을 위해 가용한 세포의 비율을 증가시킴에 의해 상기 가공 과정을 유의적으로 개선시킨다.
II. 전위효소 폴리펩타이드 및 암호화 서열
이전의 요약에서 기재된 바와 같이, 상기 양태의 특정 측면은 재조합 전위효소 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 특정 측면에서, 상기 양태에 따라 사용하기 위한 전위효소는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 특정 측면에서, 전위효소 양태는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3의 서열과 상대적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드는 이들의 효소적 활성을 유지하면서 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 위치는 상이한 전위효소 서열의 상응하는 위치에서 아미노산으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 추가의 전위효소의 서열은 하기 미국 특허에 제공된다: 특허 번호 6,489,458; 7,148,203; 8,227,432; 미국 특허 공보 번호 2011/0117072; Mates 등 2009 및 Ivics 등 1997, 이의 각각은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 측면에서, 아미노산 치환은 하나 이상의 위치에서 수행될 수 있고, 여기서, 상기 치환은 유사한 친수성을 갖는 아미노산에 대한 것이다. 단백질 상에 상호작용 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 하이드로퍼틱(hydropathic) 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계 (Kyte 및 Doolittle, 1982)에서 이해되고 있다. 아미노산의 상대적 하이드로퍼틱 특징은 수득한 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 나타나고, 이것은 이어서 단백질과, 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등 의 상호작용을 정의한다. 따라서, 상기 보존적 치환은 전위효소 내에서 수행될 수 있고 이들의 활성에 대해 최소 효과를 가질 가능성이 있다. 하기 미국 특허 문헌에 상세히 기재된 바와 같이,특허 제4,554,101호, 이후 친수성 값은 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 ( 0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오틴 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 이들 값은 지침으로서 사용될 수 있고 따라서 이의 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산, ±1 이내에 있는 아미노산, 및 ±0.5 이내에 있는 아미노산의 치환은 고려된 양태를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 전위효소 폴리펩타이드는 아미노산의 치환, 상이하지만 유사한 친수성 값을 갖는 동종성 아미노산의 치환에 의해 변형될 수 있다. +/- 1.0, 또는 +/- 0.5 포인트 이내의 친수성을 갖는 아미노산은 동종성인 것으로 고려된다.
여전히 추가의 측면에서, 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드는 정제 태그 (예를 들어, T7, 폴리-His 또는 GST 태그), 리포터 또는 CPP와 같은 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합된다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 이미지화제와 같은 리포터에 융합 (또는 접합)될 수 있다. 특정 경우에, 융합 단백질은 전위효소와 이종성 폴리펩타이드 사이에 위치된 추가의 아미노산을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 이들 서열은 상호교환적으로 “링커 서열” 또는 “링커 영역”으로 호칭된다. 당업자는 링커 영역이 하나 이상의 길이의 아미노산일 수 있고 흔히 유연성을 링커에 부여하는 하나 이상의 글라이신 잔기(들)을 포함함을 인지할 것이다. 상기 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6회 이상 반복될 수 있거나 하나 이상의 상이한 링커와 조합되어 일련의 링커 서열을 형성할 수 있다. 예를 들어, 일부 응용에서, 링커 영역은 프로테아제 절단 부위 (예를 들어 정제 태그 또는 CPP를 제거하기 위해)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 CPP 및 막 전위 펩타이드 (MTP)는 상호교환적으로 세포에 의해 내재화되는 폴리펩타이드의 능력을 증진시키는 펩타이드 서열을 언급하기 위해 사용된다. 상기 양태에 따라 사용하기 위한 CPP에 대한 예는 제한 없이 HIV 태트로부터 유래된 펩타이드 절편, 헤르페스 바이러스 VP22, 드로소필라 안테나페디아 홈박스 유전자 생성물, 프로테그린 I, T1 CPP, T2 CPP, 또는 INF7 CPP를 포함한다 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20140140976, 본원에 참조로 인용됨).
III. 세포 공학기술
상기 양태의 측면은 상기 양태의 전위효소를 사용하는 포유동물 세포의 유전학적 가공에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 방법은 세포로 (i) 전위효소 (또는 전위효소 폴리펩타이드)를 암호화하는 제1 벡터 및 (ii) 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 목적하는 유전학적 요소를 암호화하는 제2 벡터를 도입함을 포함한다. 임의의 유형의 포유동물 세포는 유전학적으로 상기 방법에 의해 가공될 수 있다. 그러나, 특정 측면에서, 세포 (세포 집단)은 줄기 세포, iPS 세포, 면역 세포 또는 이들 세포의 전구체이다. 하기된 방법은 CAR 발현을 위한 T-세포 (또는 다른 면역 세포) 가공의 특정 예를 제공한다. 그러나, 당업자는 상기 방법이 임의의 소정의 세포 유형 또는 가공 작제물에 균등하게 적용될 수 있는 것으로 인지할 것이다.
따라서, 특정 양태에서, CAR을 암호화하는 DNA 작제물을 함유하는 발현 벡터로 T 세포를 표적화함을 포함하는 항원-특이적 재지시된 T 세포을 제조하고/하거나 확장시키기 위한 방법이 제공된다. 임의로, 상기 세포는 항원 양성 세포, 재조합 항원 또는 수용체에 대한 항체로 자극하여 세포가 증식하도록 한다.
또 다른 측면에서, T 세포를 안정하게 형질감염시키고 재지시하는 방법이 제공된다. 상기 양태에 따른 상기 형질감염은 당업계에 널리 공지된 임의의 다양한 형질감염 기술에 의한 것일 수 있다. 몇몇 측면에서, 핵산은 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 실 제로, 대부분의 연구자는 이종성 유전자를 T 세포로 운반하기 위해 바이러스 벡터를 사용하였다. 그러나, 일부 측면에서, 상기 양태의 형질감염은 바이러스 벡터의 용도를 포함하지 않는다. 예를 들어, 형질감염은 전기천공, 하전된 또는 비하전된 지질의 사용, 양이온성 중합체 또는 폴리펩타이드, 염 침전 또는 다른 비-바이러스 핵산 전달 (예를 들어, 이에 제한되지 않는 초음파천공)에 의한 것일 수 있다. 특정 측면에서, 상기 형질감염은 누출된 DNA (또는 전위효소의 경우에 RNA 또는 단백질)를 사용한다. 누출된 DNA를 사용함에 의해, 재지시된 T 세포를 제조하기 위해 요구되는 시간이 감소될 수 있다. “누출된 DNA”는 CAR을 암호화하는 DNA가 발현을 위해 적당한 배향으로 발현 카세트 또는 벡터에 함유됨을 의미한다. 상기 양태의 전기천공 방법은 이들의 표면 상에 CAR을 발현하고 운반하는 안정한 형질감염체를 생성한다.
일부 측면에서, 상기 양태의 CAR은 “키메라 TCR”이 T 세포에 의해 발현되고 세포내 신호 전달, 막관통 및 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 의미하는 것으로 추가로 정의될 수 있고, 여기서, 상기 세포외 도메인은 MHC 비제한적 방식으로, 상기 방식으로 T-세포 수용체에 의해 정상적으로 결합되지 않는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 적당한 조건하에서 항원에 의한 T 세포의 자극은 세포를 증식 (확장)시키고/시키거나 IL-2를 생성시킨다. 상기 방법은 HER2/Neu에 대해 특이적인 키메라 TCR과 같은 임의의 소정의 표적 항원에 특이적인 키메라 TCR을 사용한 형질감염에 적용될 수 있다(Stancovski 등, 1993), ERBB2 (Moritz 등, 1994), 폴레이트 결합 단백질 (Hwu 등, 1995), 신장 세포 암종 (Weitjens 등, 1996), 및 HIV-1 외피 당단백질 gp120 및 gp41 (Roberts 등, 1994). 다른 세포-표면 표적 항원은 CD20, 암배아 항원, 메소텔린, ROR1, c-Met, CD56, GD2, GD3, 알파페토단백질, CD23, CD30, CD123, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CD70, CA-125, MUC-1, EGFR 및 변이체, 상피 종양 항원 등 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 측면에서, 상기 양태에 따라 사용하기 위한 T 세포는 1차 인간 T 세포, 예를 들어, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), G-CSF로 자극 후 수거된 PBMC, 골수, 또는 제대혈로부터 유래된 T 세포이다. 조건은 mRNA 및 DNA 및 전기천공의 용도를 포함한다. 형질감염 후, 상기 세포는 즉시 주입될 수 있거나 보관될 수 있다. 특정 측면에서, 형질감염 후, 상기 세포는 수일, 수주 또는 수개월 동안 생체외에서 세포로의 유전자 전달 후 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상 이내 벌크 집단으로서 증식시킬 수 있다. 추가의 측면에서, 형질감염 후, 형질감염체를 클로닝하고 단일 통합되거나 에피좀적으로 유지된 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재 및 키메라 수용체의 발현의 존재를 입증하는 클론을 생체외에서 확대시킨다. 상기 확대를 위해 선택된 클론은 항원-발현 표적 세포를 특이적으로 인지하고 용해시키는 능력을 입증한다. 재조합 T 세포는 IL-2, 또는 다른 사이토킨으로 자극함에 의해 확대시킬 수 있다(예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 및 기타). 재조합 T 세포는 인공 항원 제공 세포로 자극함에 의해 확대시킬 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제공 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에 CD3에 가교결합하는 OKT3과 같은 항체와 함께 확대시킬 수 있다. 재조합 T 세포의 서브세트는 인공 항원 제공 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD52에 결합하는 알렘투주맙과 같은 항체와 함께 제거될 수 있다. 추가의 측면에서, 유전학적으로 변형된 세포는 냉동보존될 수 있다.
주입 후 T-세포 증식 (생존)은 다음에 의해 평가될 수 있다: (i) q-PCR 및/또는 디지탈 PCR (예를 들어, 트랜스포존 및/또는 CAR에 특이적인 프라이머를 사용하는 소적 Digital™ PCR (Bio-Rad, Hercules, California); (ii) CAR에 특이적인 항체를 사용한 유동 세포측정; 및/또는 (iii) 가용성 TAA를 사용하는 유동 세포측정.
본 발명의 특정 양태에서, CAR 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암 또는 감염을 갖는 개체에 전달된다. 상기 세포는 이어서 개체의 면역계를 증진시켜 각각의 암 또는 병원성 세포를 공격한다. 일부 경우에, 상기 개체에는 1회 이상 용량의 항원-특이적 CAR T-세포가 제공된다. 상기 개체에 2회 이상의 용량의 항원-특이적 CAR T-세포가 제공되는 경우에, 투여 간의 지속기간은 개체에서 증식시키기 위한 시간을 허용하기에 충분해야만 하고, 특정 양태에서 용량 간의 상기 지속기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다.
키메라 항원 수용체 둘다 (및 일부 경우에 기능성 TCR이 부재인 수용체)를 포함하도록 변형된 동종이계 또는 자가 T 세포의 공급원은 임의의 유형일 수 있지만 특정 양태에서 상기 세포는 예를 들어, 제대혈, 말초 혈액, 인간 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포로부터 수득된다. 치료학적 효과를 위해 적합한 용량은 예를 들어, 바람직하게는 일련의 용량 투여 사이클에서 용량 당 적어도 105 또는 약 105 내지 약 1010 세포이다. 예시적 용량 투여 용법은 0일째 적어도 약 105 세포로 개시하여, 예를 들어, 환자내 용량 상승 계획을 개시하는 몇주 이내에 약 1010 세포의 표적 용량까지 증가분으로 증가하는, 상승하는 용량의 4회 1주 용량 투여 사이클로 이루어진다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 강내(예를 들어, 병원보유체-접근 장치에 의해), 복강내, 및 종양 덩어리 내로의 직접 주사를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암을 치료하기 위해 유용한 다른 잘 확립된 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 단독으로 전달되든 다른 제제와 조합하여 전달되든, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해 그리고 특정 효과를 달성하기 위해 포유류, 특히 인간, 신체의 다양한 부위에 전달될 수 있다. 당업자는 하나 이상의 경로가 투여를 위해 사용될 수 있다고 해도, 특정 경로가 다른 경로보다 더 즉시의 그리고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 피내 전달은 흑색종 치료를 위해 흡입 보다 유리하게 사용될 수 있다. 국소 또는 전신 전달은 제형의 체강으로의 적용 또는 적하, 에어로졸의 흡입 또는 통기를 포함하는 투여에 의해 또는 근육내, 정맥내, 포탈내, 간내, 복강, 피하 또는 근육내 투여를 포함하는 비경구 도입에 의해 성취될 수 있다.
상기 양태의 조성물은 유닛 용량 형태로 제공될 수 있고, 여기서, 각각의 투여 용량 단위, 예를 들어 주사는 단독으로 또는 다른 활성제와 적당히 조합된 소정량의 조성물을 함유한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 단위 제형은 인간 및 동물 대상체에 대해 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별도의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 사전결정된 양의 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 목적으로 하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 다른 활성제와 조합하여, 적절하다면 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 함유한다. 본 발명의 단위 용량투여 형태를 위한 세부사항은 특정 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 특정 약리동력학에 의존한다.
바람직하게, 유효량 또는 충분한 수의 단리된 형질도입된 T-세포는 상기 조성물에 존재하고 대상체에 도입되어 장기 특이적 항-종양 반응은 상기 치료의 부재를 유도하는 것 보다 종양의 크기를 감소시키거나 종양 성장 또는 재성장을 제거하기 위해 확립된다. 바람직하게, 대상체로 재도입된 형질도입된 T 세포의 양은 하기의 본래의 또는 초기와 비교하는 경우 종양 크기의 약 또는 적어도 약 10%, 약 또는 적어도 약 20%, 약 또는 적어도 약 30%, 약 또는 적어도 약 40%, 약 또는 적어도 약 50%, 약 또는 적어도 약 60%, 약 또는 적어도 약 70%, 약 또는 적어도 약 80%, 약 또는 적어도 약 90%, 약 또는 적어도 약 95%, 약 또는 적어도 약 98%, 또는 약 또는 100%의 감소를 유발한다 (예를 들어, “치료요법 0일”) 종양의 크기.
따라서, 투여된 형질도입된 T 세포의 양은 투여 경로를 고려해야만 하고 충분한수의 형질도입된 T 세포가 목적하는 치료학적 반응을 성취하기 위해 도입되도록 하는 양이어야 한다. 추가로, 본원에 기재된 조성물에 포함된 각각의 활성제의 양(예를 들어, 접촉될 각각의 세포 당 양 또는 특정 체중 당 양)은 상이한 적용에서 다양할 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농도는 바람직하게 적어도 약 1 × 106 내지 약 1 × 109 형질도입된 T 세포, 심지어 보다 바람직하게 약 1 × 107 내지 약 5 × 108 형질도입된 T 세포로 치료받는 대상체에서 제공하기 위해 충분해야 하지만, 임의의 적합한 양은 상기 예를 들어, 5 × 108 초과의 세포, 또는 미만, 예를 들어, 1 × 107 미만의 세포로 사용될 수 있다. 용량 투여 스케줄은 잘 확립된 세포-기반 치료요법을 기반으로 할 수 있다(문헌참조, 예를 들어 Topalian 및 Rosenberg, 1987; U.S. 특허번호 4,690,915), 또는 대안적 연속 주입 치료요법이 사용될 수 있다.
이들 값은 본 발명의 수행을 위해 본 발명의 방법을 최적화하는 즉시 수행자에 의해 사용될 형질도입된 T 세포 범위의 일반 지침을 제공한다. 특정 적용에서 보장될 바와 같이 본 명세서에서 이러한 범위의 인용은 결코 더 높은 양의 또는 더 적은 양의 구성성분의 사용을 불가능하게 하지 않는다. 예를 들어, 실제 용량 및 스케줄은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 조합하여 투여되는지 여부에 따라서, 또는 약동학의 개체내 차이, 약물 배치(drug disposition) 및 대사에서 개체간 차이에 따라서 다를 수 있다. 당업자는 특정 상황의 존재에 따라 임의의 필수적 조절을 용이하게 만들 수 있다.
IV. 가공 작제물
특정의 특이적 측면에서, 상기 양태의 전위효소 시스템은 선택된 유전학적 요소를 암호화하는 발현 작제물로 세포를 가공하기 위해 사용된다. 상기 측면에서, 상기 선택된 유전학적 요소는 IR/DR 서열과 같은, 상기 양태의 전위효소와 기능성인 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된다. 상기 선택된 유전학적 요소는 세포로 형질감염 되도록 목적하는 임의의 서열을 포함할 수 있지만, 특정 측면에서 상기 요소는 포유동물 발현을 위해 폴리펩타이드 암호화 서열 및 적당한 발현 제어 서열을 암호화한다. 일부 특이적 측면에서, 상기 선택된 유전학적 요소는 항체, T-세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 항원 결합 잔기를 암호화한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “항원”은 항체 또는 T-세포 수용체 또는 CAR에 의해 결합될 수 있는 분자이다.
따라서, 본 발명의 양태는 세포내 신호 전달 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포하하는 면역원성 (hCAR)을 감소시키기 위해 인간화된 CAR을 포함하는, 항원-특이적 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산을 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 패턴 인식 수용체 예를 들어, 덱틴(Dectin)-1은 탄수화물 항원에 대한 특이성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 결합 영역은 단클론성 항체의 상보성 결정 영역, 단클론성 항체의 가변 영역, 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토킨)로부터 유래된다. 상보적 결정 영역 (CDR)은 항원을 보완하고 따라서 특정 항원에 대한 이의 특이성을 갖는 수용체를 제공하는 항원 수용체 (예를 들어, 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩타이드 쇄는 3개의 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체는 전형적으로 2개의 폴리펩타이드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉될 수 있는 각각의 항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 있다-각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린 및 T-세포 수용체와 관련된 대부분의 서열 변이가 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 때때로 초가변 도메인으로서 지칭된다. 이들 중에서, CDR3은 그것이 VJ (중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우에 VDJ)의 재조합에 의해 암호화됨에 따라 가장 큰 가변성을 나타낸다.
인간 CAR 핵산은 인간 환자에 대해 세포 면역요법을 증강시키는 인간 유전자라는 것이 상정된다. 구체적 양태에서, 본 발명은 전장 CAR cDNA 또는 암호 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 하기 미국 특허 문헌에 기재된 것들과 같은 특정인간 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다: 본원에 참조로 인용된 특허 7,109,304 또는 이것은 임의의 다른 항원-결합 잔기를 포함할 수 있다. 단편은 또한 인간 항원-특이적 항체의 다수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 구체적인 양태에서, 단편은 인간 세포에서 발현을 위해 인간 코돈 선호도에 최적화된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적 scFv이다.
배열은 다량체 예를 들어, 디아바디(diabody) 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 대부분 디아바디로서 윈터(Winter)에 의해 언급된 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 가교 결합쌍에 의해 형성될 가능성이 있다. 작제물의 힌지 부분은 전체적으로 결실되는 것으로부터 제1 시스테인이 유지되고, 세린 치환보다는 프롤린으로 치환되며, 제1 시스테인까지 절단되는 것까지의 다수의 대안을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화되는 임의의 단백질은 이 목적을 위한 작용을 할 수 있다. 인간 면역글로불린으로터의 Fc 도메인, 예를 들어 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있었다. 또한 면역글로불린의 힌지 부분만을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파 부분을 사용할 수 있었다.
상기 양태의 키메라 항원 수용체의 세포내 신호 전달 도메인은 키메라 수용체가 위치된 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능들 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 용어 "효과기 기능"은 분화된 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토킨의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 순수, 기억 또는 기억형 T 세포에서 이펙터 기능은 항원-의존성 증식을 포함한다. 따라서, 용어 "세포내 신호 전달전달 도메인"은 효과기 기능 신호 전달을 도입하고 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 보통 전체 세포내 신호 전달전달 도메인이 사용될 것이지만, 다수의 경우에, 전체 세포내 폴리펩타이드를 사용하는 것은 필수적이지 않을 것이다. 세포내 신호 전달전달 도메인의 절단 부분이 용도를 발견할 수 있는 정도로, 이러한 절단 부분은 그것이 효과기 기능 신호 전달을 도입하는 한 무결함 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서 용어 세포내 신호 전달전달 도메인은 효과기 기능 신호 전달을 도입하는데 충분한 세포 내 신호 전달전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 실 시예는 T-세포 수용체의 제타 쇄 또는 임의의 이의 동족체(예를 들어, 에타, 델타, 감마, 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호 전달 분자, 예를 들어 CD3ξ 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40의 조합, 및 이들의 조합, 및 다른 유사한 분자 및 단편을 포함한다. 활성화 단백질 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호 전달 부분이 사용될 수 있고, 예를 들어 FcγRIII 및 FcRI이 있다. 다음을 참조하며: Gross 등 (1992), Stancovski 등 (1993), Moritz 등 (1994), Hwu 등 (1995), Weijtens 등 (1996), 및 Hekele 등 (1996) 이는 이들 대안적인 막관통 및 세포내 도메인을 사용하는 키메라 T 세포 수용체의 개시를 위해서이다. 특정 양태에서, 인간 CD3ξ 세포내 도메인은 활성화를 위해 사용된다.
항원-특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호 전달전달-도메인은 막관통 도메인 예를 들어, 인간 IgG4Fc 힌지 및 Fc 영역에 의해 연결될 수 있다. 대안물은 인간 CD4 막관통 도메인, 인간 CD28 막관통 도메인, 막관통 인간 CD3ξ 도메인, 또는 시스테인 돌연변이된 인간 CD3ξ 도메인, 또는 CD16 및 CD8 및 에리트로포이에틴 수용체와 같은 다른 인간 막관통 신호 전달 단백질로부터의 다른 막관통 도메인을 포함한다. 추가의 변형은 막관통 아미노산 서열에 첨가될 수 있다.
일부 양태에서, CAR 핵산은 다른 동시 자극 수용체 예를 들어, 막관통 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호 전달전달 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 동시 자극 수용체는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 및 4-1BB(CD137) 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CD3ξ에 의해 개시된 1차 신호에 추가로, 인간 CAR에 삽입된 인간 동시 자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 중요하고 후천성 면역치료요법의 생체내 지속성 및 치료학적 성공의 개선을 도와줄 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 단리된 핵산 세그먼트, 및 CAR을 암호화하는 DNA 서열을 혼입시키는 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 주로 조절된 진핵생물 프로모터, 예를 들어, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터의 제어 하에서 면역 세포, 바람직하게는 T 세포에 목적으로 하는 유전자를 전달하기 위해 설계된다. 또한, 벡터는 어떠한 다른 이유가 없더라도 이들의 시험관내 조작을 촉진시키기 위해 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, CAR은 DNA 주형으로부터 시험관내 전사된 mRNA로부터 발현될 수 있다.
키메라 항원 수용체 분자는 재조합체이고 항원에 결합하고 이들의 세포질 테일에존재하는 면역수용체 활성화 모티프(ITAM)를 통한 활성화 신호를 형질도입하는 이들의 능력 둘다에 의해 구별된다. 항원-결합 모이어티(예를 들어, 단일쇄 항체(scFv)로부터 생성됨)를 이용하는 수용체 작제물은 "보편적"이 되는 추가적인 이점을 얻으며, 즉, 이들은 HLA-독립적 방식으로 표적 세포 표면 상에서 천연 항원과 결합한다. 예를 들어, 여러 연구는 CD3 복합체의 제타 쇄 (ξ), Fc 수용체 감마 쇄, 및 스카이 티로신 키나제의 세포내 부분을 암호화하는 서열에 융합된 scFv 작제물에 대해 보고하였다(Eshhar 등, 1993; Fitzer-Attas 등, 1998). CTL에 의한 종양 인지 및 용해를 포함하는 재지시된 T 세포 이펙터 기작은 여러쥐 및 인간 항원-scFv:ξ 시스템에서 보고되었다 (Eshhar, 1997; Altenschmidt 등, 1997; Brocker 등, 1998).
지금까지 비-인간 항원 결합 영역은 전형적으로 키메라 항원 수용체를 구성하는데 사용되고 있다. 비-인간 항원 결합 영역, 예를 들어, 뮤린 단클론성 항체를 이용하는 것에 의한 잠재적 문제는 인간 효과기 기능성의 결여 및 종양 덩어리 내로 침투하는 것의 불능이다. 다시 말해서, 이러한 항체는 보체-의존적 용해를 매개할 수 없거나 또는 항체-의존적 세포 독성 또는 CAR을 매개하는 세포를 파괴하기 위한 Fc-수용체 매개 식세포작용을 통해 인간 표적 세포를 용해할 수 없을 수도 있다. 더 나아가, 비-인간 단클론성 항체는 외래 단백질로서 인간 숙주에 의해 인식될 수 있고, 따라서, 이러한 외래 항체의 반복된 주사는 유해한 과민감 반응을 야기하는 면역 반응의 유도를 야기할 수 있다. 뮤린-기반 단클론성 항체에 대해, 이는 종종 인간 항-마웃스 항체(HAMA) 반응으로서 지칭된다. 따라서, 인간 항체의 사용은 이들이 뮤린 항체만큼 강한 HAMA 반응을 유발하지 않기 때문에 더 바람직하다. 유사하게, CAR에서 인간 서열의 사용은 면역-매개 인식을 회피하며, 따라서 수용자에 의해 야기되고 HLA와 관련하여 가공된 항원을 인식하는 내인성 T 세포에 의한 제거를 회피할 수 있다.
일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 다음을 포함한다: a) 세포내 신호 전달 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인.
구체적 양태에서, CAR 내 세포내 수용체 신호 전달전달 도메인은, 예를 들어, 단독으로 또는 CD3제타와 연속해서 T 세포 항원 수용체 복합체, 예를 들어, CD3의 제타쇄, 또한 Fcγ RIII 동시 자극 신호 전달전달 도메인, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2의 신호 전달전달 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 세포내 도메인 (세포질 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 TCR 제타쇄, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R베타/CD122, IL-2R알파/CD132, DAP10, DAP12 및 CD40 중 하나 이상의 부분 또는 모두를 포함한다. 일부 양태에서, 세포내 도메인 내에서 내인성 T 세포 수용체 복합체의 임의의 부분을 사용한다. 하나 또는 다중 세포질 도메인이 사용될 수 있는데, 소위 제3 세대 CAR은, 예를 들어, 추가적 또는 상승적 효과를 위해 함께 융합된 적어도 2 또는 3개의 신호 전달전달 도메인을 갖기 때문이다.
키메라 항원 수용체의 특정 양태에서, 수용체의 항원-특이적 부분(항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 종양 관련된 항원, 또는 덱틴-1과 같은 패턴-인식 수용체에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함하는 병원균-특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 종양 관련된 항원은 이것이 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현된다면, 임의의 종류를 가질 수 있다. 종양 관련된 항원의 예시적 양태는 CD19, CD20, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras 등을 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 소량의 종양-관련 항원이 있을 때 지속성을 개선시키기 위해 막-결합 사이토카인과 함께 동시 발현될 수 있다. 예를 들어, CAR은 막-결합 IL-15와 함께 동시 발현될 수 있다.
특정 양태에서, 세포내 종양 관련된 항원, HA-1, 서바이빈, WT1 및 p53은 표적화될 수 있다. 이는 HLA와 관련하여 세포내 종양 관련된 항원으로부터 기재된 가공된 펩타이드를 인식하는 보편적 T 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 보편적 T 세포는 HLA와 관련하여 세포내 가공 종양 관련된 항원을 인식하는 T-세포 수용체 쌍을 발현시키도록 유전자 변형될 수 있다.
병원균은 임의의 종류를 가질 수 있지만, 구체적 양태에서, 병원균은, 예를 들어, 진균, 세균 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원균은 아데노바이러스과, 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 거대세포바이러스(CMV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, 바이러스의 HHV 패밀리, 피코르나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 플라비바이러스과, 레트로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파포바바이러스과, 폴리오마바이러스, 랍도바이러스과, 및 토가바이러스과의 패밀리의 바이러스 병원균을 포함한다. 예시적인 병원균 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 볼거리, 홍역, 수두, 에볼라 및 풍진을 야기한다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다(Candida), 아스퍼질러스(Aspergillus), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 및 스타키보트리스(Stachybotrys)를 포함한다. 예시적인 병원성 세균은 스트렙토코커스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter), 스타필로코커스(Staphylococcus), 헬레코박터(Helicobacter), 이콜라이, 리케챠(Rickettsia), 바실러스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 클라미디아(Chlamydia), 스피로체테스(Spirochetes) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한다. 하나의 양태에서, 병원성 수용체 덱틴-1은 진균의 세포벽 상에서 탄수화물 구조를 인식하는 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 덱틴-1의 특이성에 기반하여 CAR을 발현시키도록 유전자 변형된 T 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus)를 인식하고, 균사 성장을 표적화할 수 있다. 또 다른 양태에서, CAR은 바이러스 감염 및 병리를 중단시키기 위해 바이러스 결정인자를 인지하는 항체 (예를 들어, CMV 및 에볼라로부터 당단백질)를 기반으로 제조될 수 있다.
일부 양태에서, 병원성 항원은 CAR 내 세포외 도메인이, 예를 들어, 덱틴-1을 통해 진균 세포벽의 탄수화물 패턴을 인식하는 아스퍼질러스 탄수화물 항원이다.
본 발명에 따른 키메라 면역수용체는 바람직하게는 이것이 재조합 DNA 기법을 이용하여 생성된다고 해도 임의의 공지된 수단에 의해 생성될 수 있다. 키메라 수용체의 몇몇 영역을 암호화하는 핵산 서열이 준비되며, 분자 클로닝의 표준 기법 (게놈 라이브러리 선별, PCR, 프라이머-보조 결찰, 효모 및 세균으로부터의 scFv 라이브러리, 부위-지정 돌연변이유발 등 )에 의해 완전한 암호화 서열 내로 조립될 수 있다. 얻어진 암호화 영역은 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 발현 숙주 동종이계 T-세포주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 핵산 작제물 또는 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드는 T 세포로 형질전환되거나 도입될 수 있고 전사되고 해독되어 생성물 (예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 생성하는 DNA 분자를 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 양태에서 사용된 예시적 핵산 작제물(폴리뉴클레오타이드)에서, 프로모터는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열에 작동적적으로 연결되고, 즉, 이들은 키메라 수용체를 암호화하는 DNA로부터 전령 RNA의 전사를 촉진시키기 위해 위치된다. 프로모터는 게놈 유래이거나 또는 합성적으로 생성될 수 있다. T 세포에 사용하기 위한 다양한 프로모터는 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 하기 문헌에 의해 기재된 CD4 프로모터: Marodon 등 (2003)). 프로모터는, 유도가, 예를 들어 특이적 세포 유형 또는 특이적 수준의 성숙과 관련될 때, 구성적 또는 유도성일 수 있다. 대안적으로, 다수의 잘 공지된 프로모터가 또한 적합하다. 관심 대상의 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 거대세포바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 및 프렌드 비장 병소 형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 관련될 수도 있고 또는 관련되지 않을 수도 있되, 인핸서는 특정 프로모터와 자연적으로 관련될 수도 있고 또는 상이한 프로모터와 관련될 수도 있다.
키메라 수용체를 암호화하는 개방 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나 합성될 수 있거나(예를 들어, PCR을 통해), 또는 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론 수에 의존하여, 인트론이 mRNA를 안정화시키거나 T 세포-특이적 발현을 제공하는 것으로 밝혀졌기 때문에 cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다 (Barthel 및 Goldfeld, 2003). 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하는 것이 더 유리할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 발현을 위해, 키메라 수용체의 N-말단 구성성분을 암호화하는 핵산 서열의 천연 유래 또는 내인성 전사 개시 영역은 표적 숙주에서 키메라 수용체를 생성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 구성적 또는 유도성 발현을 허용하는 외인성 전사 개시 영역이 사용될 수 있되, 발현은 표적 숙주, 목적으로 하는 발현 수준, 표적 숙주 등 의 특성에 따라서 제어될 수 있다.
마찬가지로, 키메라 수용체를 표면 막으로 보내는 신호 전달 서열은 키메라 수용체의 N-말단 구성성분의 내인성 신호 전달 서열일 수 있다. 선택적으로, 일부 예에서, 이 서열을 상이한 신호 전달 서열로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 선택된 신호 전달 서열은 T 세포의 분비 경로와 양립가능하여야 하며, 따라서 키메라 수용체는 T 세포의 표면 상에서 제시된다.
유사하게, 종결 영역은 키메라 수용체의 C-말단을 암호화하는 핵산 서열의 천연 유래 또는 내인성 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 종결 영역은 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 대부분에 대해, 종결 영역의 공급원은 일반적으로 재조합 단백질의 발현에 중요한 것으로 고려되지 않으며, 매우 다양한 종결 영역이 발현에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 작제물은 이들 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양의 성장 또는 재성장을 방지함으로써 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에서의 적용을 발견한다. 따라서, 본 발명은 추가로 대상체의 단리된 T 세포 내로 본 발명의 키메라 작제물을 도입하고 형질전환된 T 세포를 대상체 내로 재도입함으로써 대상체 내 종양을 감소 또는 제거하는 항-종양 반응을 달성하는 것에 의해 대상체에서의 성장을 감소시키거나 또는 종양 형성을 방지하는 방법에 관한 것이다. 사용될 수 있는 적합한 T 세포는 세포독성 림프구(CTL) 또는 붕괴가 필요한 T 세포 수용체를 갖는 임의의 세포를 포함한다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 대상체로부터 이들 세포를 단리시키기 위한 다양한 방법을 용이하게 이용가능하다. 예를 들어, 세포 표면 마커 발현을 사용하거나 시판된 키트를 사용하여 (예를 들어, ISOCELL™ (제조원: Pierce, Rockford, Ill.).
키메라 작제물은 다른 시약 (지질, 양이온성 중합체, PEG-복합체, 단백질 복합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는)과 조합된, 누출된 DNA로서 대상체 자신의 T 세포로 또는 적합한 벡터로 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 누출된 DNA를 이용하는 전기천공법에 의해 T 세포를 안정하게 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌참조, 예를 들어, 미국 특허번호 6,410,319, 본원에 참조로 인용됨. 누출된 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터 내에 함유된 본 발명의 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 지칭한다. 유리하게는, 누출된 DNA의 사용은 본 발명의 키메라 수용체를 발현시키는 T 세포를 생성하는데 필요한 시간을 감소시킨다.
일단 형질감염 또는 형질도입된 T 세포가 목적으로 하는 조절로 그리고 목적으로 하는 수준에서 표면 막 단백질로서의 키메라 수용체를 발현시킬 수 있다는 것이 확립되면, 키메라 수용체가 목적으로 하는 신호 유도를 제공하기 위해 숙주 세포 내에서 기능성인지의 여부를 결정할 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 T 세포는 대상체 내에서 항-종양 반응을 활성화시키기 위해 대상체에게 재도입 또는 투여된다. 투여를 촉진시키기 위해, 본 발명에 따라 형질도입된 T 세포는 약제학적 조성물로 제조될 수 있거나 추가로 약제학적으로 허용될 수 있는 적당한 담체 또는 희석제와 함께 생체내 투여를 위해 적당한 이식체로 제조될 수 있다. 상기 조성물 또는 이식체를 제조하는 수단은 당업계에 보고 되었다 (문헌참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed.(1980)). 적절하다면, 형질도입된 T 세포는 그들의 각각의 투여 경로에 대해 보통의 방법으로 반고체 또는 액체 형태의 제제, 예컨대 캡슐, 용액, 주사, 흡입제 또는 에어로졸로 제형화될 수 있다. 당업계에 공지된 수단은 이것이 표적 조직 또는 기관에 도달될 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지 또는 최소화하기 위해 또는 조성물의 점진적 방출을 보장하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 키메라 수용체를 발현시키는 세포를 유발하지 않는 약제학적으로 허용가능한 형태가 사용된다. 따라서, 바람직하게는 형질도입된 T 세포는 평형염류용액, 바람직하게는 행크스 평형염류용액, 또는 정상 식염수를 함유하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
V. 상기 양태의 키트
본 명세서에 기재된 임의의 조성물이 키트에 포함될 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드는 키트에 제공된다. 상기 키트는 다양한 추가의 요소, 예를 들어, 트랜스포존 반복체를 암호화하는 DNA 벡터, 형질감염 시약, 세포, CAR 발현 작제물, 배지, aAPC, 성장 인자, 항체 (예를 들어, CAR-T-세포를 분류하거나 특징 분석하기 위해) 및/또는 CAR 또는 전위효소를 암호화하는 플라스미드를 포함한다.
비제한적인 예에서, 키트는 상기 양태의 전위효소 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산, CAR 발현 작제물 (플랭킹 트랜스포존 반복체를 갖는)을 제조하기 위한 시약, 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포 및/또는 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포를 수득하기 위한 하나 이상의 기구(이러한 기구는 시린지, 피펫, 포셉 및/또는 임의의 상기 의학적으로 승인된 장치일 수 있다)를 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 전기천공 장치와 같은 형질감염 장치가 포함된다.
몇몇 양태에서, 내인성 TCR αβ 발현을 제거하기 위한 발현 작제물, 작제물을 제조하기 위한 하나 이상의 시약 및/또는 CAR+ T 세포가 키트에 제공된다. 몇몇 양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)을 암호화하는 발현 작제물을 포함한다.
상기 키트는 하나 이상의 적합하게 분취된 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 구성성분은 수성 매질로 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 구성성분이 위치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 적어도 하나의 바이러스, 시험관, 플라스크, 보틀, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트 내에 하나 이상의 구성성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가적인 구성성분이 별도로 위치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가적인 용기를 함유할 것이다. 그러나, 구성성분의 다양한 조합이 바이알 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 키메라 수용체 작제물을 함유하기 위한 수단 및 상업적 규모를 위한 세밀한 밀폐 내 임의의 다른 시약 컨테이너를 포함한다. 이러한 용기는, 예를 들어 목적으로 하는 바이알이 보유되는 사출성형 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VI. 실시예
하기의 실시예는 본 발명의 특정 양태를 입증하기 위해 포함된다. 다음의 실시예에 개시되는 기법은 본 발명의 실행에서 제대로 작용한다는 것이 본 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 그의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 다수의 변화가 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 비슷하거나 또는 유사한 결과를 개시하고 여전히 얻는 구체적 양태에서 이루어질 수 있다는 것을 인식하여야 한다.
실시예 1 - 인간 세포에서 높은 활성을 갖는 재조합 전위효소
살모 살라( Salmo salar ) (대서양 연어)로부터 본래 유래된 전위효소를 암호화하는 DNA 서열은 인간 세포에서 증가된 효율을 갖는 효소를 제조하기 위한 시도에서 가공되고 인간화되었다. 제조된 2개의 전위효소 (및 이들의 핵산 암호화 서열)는 하기에 나타내고 hSB110 및 hSB81로 명명하였다.
hSB110 (서열번호 1):
Figure pct00001
hSB110 (서열번호 2):
Figure pct00002
hSB81 (서열번호 3):
Figure pct00003
hSB81 (서열번호 4):
Figure pct00004
Figure pct00005
상기 hSB110 및 hSB81 전위효소, 및 대조군 전위효소는 이어서 유전학적으로 통합된 CAR을 갖는 가공된 인간 T-세포를 제조하는 능력에 대해 시험되었다. 이들 연구를 위한 프로토콜은 도 1에 나타낸다. 인간 T-세포는 전위효소 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA와 함께 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 CAR을 암호화하는 트랜스포존 DNA 작제물로 동시 형질감염시켰다. 형질감염을 위해 4D-NUCLEOFECTORTM 전기천공 시스템(Lonza)을 사용하였다. 전기천공 후, 세포를 배양하고 유동 세포측정에 의해 CAR 발현에 대해 평가하였다.
이들 연구 결과는 도 2에 나타낸다. 상부 패널의 히스토그램은 형질감염 8일 후, 7AAD 염색(x-축)에 의해 평가된 바와 같이 비-생존성이도록 하는 세포에 비해 CAR에 대해 양성인 세포의 수(y-축)를 보여준다. 하부 패널은 형질감염 15일 후 CD3 (x-축)을 발현하는, CAR에 대해 양성인 세포의 수(y-축)를 보여준다. 이들 결과는 명백하게 상기 hSB110 및 hSB81 전위효소가 SB100x 보다 세포를 가공하는데 상당히 보다 효율적임을 입증한다. 형질감염 후 8일까지, 22% 초과의 hSB110 및 hSB81 전기천공된 세포는 CAR을 발현한다. SB100x 전기천공으로부터 15%의 세포만이 상기 시점에서 CAR을 발현하였다. 어떠한 유의적인 차이가 임의의 시험 작제물 (7AAD 염색에 의해 평가된 바와 같이)을 갖는 비-생존 세포의 수에서 나타나지 않았다. 더욱이, 15일까지, hSB110 및 hSB81로 전기천공된 80% 초과의 세포 집단은 CAR 및 CD3을 동시 발현하였다.
* * *
본 명세서에 개시 및 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 특정 양태 측면에서 기재되었지만 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이, 변형이 상기 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 적용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 물리적으로 둘다 관련된 특정 제제는 본원에 기재된 제제로 대체될 수 있고 동일하거나 유사한 결과가 성취될 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 분명한 모든 이러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
참고문헌
다음의 참고문헌은 이들이 본 명세서에 제시되는 것에 보충적인 예시적 절차 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 정도로 본 명세서에 참고로서 구체적으로 포함된다.
미국 특허 4,554,101
미국 특허 4,690,915
미국 특허 6,410,319
미국 특허 6,489,458
미국 특허 7,148,203
미국 특허 8,227,432
미국 Publn. 2011/0117072
미국 Publn. 2014/0140976
Altenschmidt 등, Adoptive transfer of in vitro-targeted, activated T lymphocytes results in total tumor regression, J Immunol. 1997 Dec 1;159(11):5509-15.
Barthel 및 Goldfeld, J. Immunol., 171:3612-3619, 2003
Brocker 등, Adv. Immunol., 68:257, 1998
Eshhar 등, Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A.;90(2):720-4, 1993.
Eshhar, Tumor-specific T-bodies: towards clinical application. Cancer Immunol Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4):131-6. 1997
Fitzer-Attas 등, Harnessing Syk family tyrosine kinases as signaling domains for chimeric single chain of the variable domain receptors: optimal design for T cell activation. J Immunol. 1998 Jan 1;160(1):145-54. 1998
Gross 등, Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 86:10024-10028, 1989.
Gross 등 (1992) Endowing T cells with antibody specificity using chimeric T cell receptors. FASEB J. 1992 Dec;6(15):3370-8.
Hekele 등 Growth retardation of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocytes reprogrammed by CD44v6-specific scFv:zeta-chimera. Int J Cancer. 1996 Oct 9;68(2):232-8, 1996.
Hwu 등 (1995) In vivo antitumor activity of T cells redirected with chimeric antibody/T-cell receptor genes. Cancer Res. 1995 Aug 1;55(15):3369-73.
Ivics 등, Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells., Cell, 91(4):501-510, 1997.
Kyte 및 Doolittle, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J. Mol. Biol., 157(1):105-32, 1982.
Mates 등, Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat. Genetics. 41(6):753-61, 2009.
Marodon 등, Blood, 101:3416-3423, 2003
Moritz 등 (1994) Cytotoxic T lymphocytes with a grafted recognition specificity for ERBB2-expressing tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 May 10;91(10):4318-22.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed., 1980
Roberts 등, Blood, 84:2878, 1994
Stancovski 등, J. Immunol., 151:6577, 1993
Topalian 및 Rosenberg, 1987
Weijtens 등 (1996) Single chain Ig/gamma gene-redirected human T lymphocytes produce cytokines, specifically lyse tumor cells, and recycle lytic capacity. J Immunol. 1996 Jul 15;157(2):836-43.
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> TRANSPOSASE POLYPEPTIDES AND USES THEREOF <130> UTFC.P1256WO <150> US 62/131,827 <151> 2015-03-11 <160> 7 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Arg Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys His Val Arg Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340 <210> 2 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 atgggcaaga gcaaagagat cagccaggac ctgcggaagc ggatcgtgga cctgcacaag 60 agcggctcta gcctgggcgc catcagcaag agactggccg tgcctagaag cagcgtgcag 120 accatcgtgc ggaagtacaa gcaccacggc accacccagc ccagctacag atctggaagg 180 cggagagtgc tgagccccag ggacgagaga acactcgtgc gcaaggtgca gatcaacccc 240 cggaccaccg ccaaggacct cgtgaagatg ctggaagaga caggcaccaa ggtgtccatc 300 agcaccgtga agcgggtgct gtaccggcac aacctgaagg gccacagcgc cagaaagaag 360 cccctgctgc agaacagaca caagaaggcc cggctgagat tcgccagagc ccacggcgac 420 aaggacagaa ccttctggcg gaacgtgctg tggagcgacg agacaaagat cgagctgttc 480 ggccacaacg accacagata cgtgtggcgg aagaagggcg aggcctgcaa gcccaagaac 540 accatcccca cagtgaagca cggcggaggc agcatcatgc tgtggggctg ttttgccgct 600 ggcggcacag gcgccctgca caaaatcgac ggcatcatgg acgccgtgca gtacgtggac 660 atcctgaagc agcacctgaa aacctctgtg cggaagctga agctgggccg gaaatgggtg 720 ttccagcacg acaacgaccc caagcacacc agcaagcacg tgcggaaatg gctgaaggac 780 aacaaagtga aagtgctgga atggcccagc cagtcccccg acctgaaccc catcgaaaac 840 ctgtgggccg agctgaagaa aagagtgcgg gccagacggc ccaccaacct gacacagctg 900 caccagctgt gccaggaaga gtgggccaag atccacccca actactgcgg caagctggtg 960 gaaggctacc ccaagaggct gacccaagtg aaacagttca agggcaacgc caccaagtac 1020 tga 1023 <210> 3 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Arg Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys His Val Arg Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340 <210> 4 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 atgggcaaga gcaaagagat cagccaggac ctgcggaagc ggatcgtgga cctgcacaag 60 agcggctcta gcctgggcgc catcagcaag agactggccg tgcctagaag cagcgtgcag 120 accatcgtgc ggaagtacaa gcaccacggc accacccagc ccagctacag atctggaagg 180 cggagagtgc tgagccccag ggacgagaga acactcgtgc gcaaggtgca gatcaacccc 240 cggaccaccg ccaaggacct cgtgaagatg ctggaagaga caggcaccaa ggtgtccatc 300 agcaccgtga agcgggtgct gtaccggcac aacctgaagg gccacagcgc cagaaagaag 360 cccctgctgc agaacagaca caagaaggcc cggctgagat tcgccagagc ccacggcgac 420 aaggacagaa ccttctggcg gaacgtgctg tggagcgacg agacaaagat cgagctgttc 480 ggccacaacg accacagata cgtgtggcgg aagaagggcg aggcctgcaa gcccaagaac 540 accatcccca cagtgaagca cggcggaggc agcatcatgc tgtggggctg ttttgccgct 600 ggcggcacag gcgccctgca caaaatcgac ggcatcatgg acgccgtgca gtacgtggac 660 atcctgaagc agcacctgaa aacctctgtg cggaagctga agctgggccg gaaatgggtg 720 ttccagcacg acaacgaccc caagcacacc agcaagcacg tgcggaaatg gctgaaggac 780 aacaaagtga aagtgctgga atggcccagc cagtcccccg acctgaaccc catcgaaaac 840 ctgtgggccg agctgaagaa aagagtgcgg gccagacggc ccaccaacct gacacagctg 900 caccagctgt gccaggaaga gtgggccaag atccacccca cctactgcgg caagctggtg 960 gaaggctacc ccaagaggct gacccaagtg aaacagttca agggcaacgc caccaagtac 1020 tga 1023 <210> 5 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly Arg Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Arg Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln Gln Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys His Val Arg Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340 <210> 6 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly Arg Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln Met Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340 <210> 7 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val 1 5 10 15 Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu 20 25 30 Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His 35 40 45 His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu 50 55 60 Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro 65 70 75 80 Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr 85 90 95 Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu 100 105 110 Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys 115 120 125 Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr 130 135 140 Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe 145 150 155 160 Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys 165 170 175 Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile 180 185 190 Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys 195 200 205 Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln 210 215 220 His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val 225 230 235 240 Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys 245 250 255 Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser 260 265 270 Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg 275 280 285 Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys 290 295 300 Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val 305 310 315 320 Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn 325 330 335 Ala Thr Lys Tyr 340

Claims (43)

  1. 서열번호: 1과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 136번 위치에 상응하는 위치에서 Arg, 253번 위치에 상응하는 위치에서 His 및/또는 255번 위치에 상응하는 위치에서 Arg를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 5의 서열을 포함하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 하기의 특징 중 하나 이상을 포함하는, 폴리펩타이드:
    (a) 14번 위치에 상응하는 위치에서 Arg;
    (b) 33번 위치에 상응하는 위치에서 Ala;
    (c) 115번 위치에 상응하는 위치에서 His;
    (d) 214번 위치에 상응하는 위치에서 Asp;
    (e) 215번 위치에 상응하는 위치에서 Ala;
    (f) 216번 위치에 상응하는 위치에서 Val;
    (g) 217번 위치에 상응하는 위치에서 Gln; 및/또는
    (h) 243번 위치에 상응하는 위치에서 His.
  3. 청구항 2에 있어서 특징 (a)-(h) 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개를 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 청구항 2에 있어서, 214 내지 217번 위치에 상응하는 위치에서 서열 DAVQ를 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. 청구항 1에 있어서, 314번 위치에 상응하는 위치에서 Asn을 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호: 1의 서열과 적어도 95% 동일성인, 폴리펩타이드.
  7. 청구항 5에 있어서, 서열번호: 1의 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  8. 청구항 1에 있어서, 314번 위치에 상응하는 위치에서 Thr을 포함하는, 폴리펩타이드.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호: 3의 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한, 폴리펩타이드.
  10. 청구항 9에 있어서, 서열번호: 3의 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 분자가 DNA인, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 DNA가 폴리펩타이드의 발현을 위해 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 DNA가 포유동물 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 위해 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 분자가 mRNA인, 폴리뉴클로타이드 분자.
  16. 청구항 15에 있어서, 5’-캡, IRES 모티프 및/또는 폴리(A) 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  17. 청구항 16에 있어서, 20개 내지 300개 뉴클레오타이드의 폴리(A) 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  18. 청구항 11에 있어서, 상기 분자가 서열번호: 2 또는 서열번호: 4와 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  19. 청구항 11에 있어서, 상기 분자가 서열번호: 2 또는 서열번호: 4의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  20. 세포를, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시키고 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 폴리펩타이드를 발현함을 포함하는, 청구항 1에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  21. 청구항 1의 폴리펩타이드 또는 청구항 11의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 숙주 세포.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인, 세포.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포인, 세포.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 세포가 면역계 세포인, 세포.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 세포가 천연 킬러(NK) 세포, T-세포 또는 NK 세포 또는 T-세포의 전구체인, 세포.
  26. 청구항 21에 있어서, 상기 세포가 청구항 1의 폴리펩타이드를 포함하는, 세포.
  27. 청구항 21에 있어서, 상기 세포가 청구항 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 세포.
  28. 하기 단계를 포함하는 세포를 유전학적으로 가공하는 방법:
    (a) 상기 세포를 (i) 청구항 1의 전위효소 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 (ii) 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 선택된 유전학적 요소를 암호화하는 DNA로 형질전환시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 일시적 또는 안정한 전위효소 활성을 위해 적당한 조건하에서 항온처리함으로써 세포의 게놈 내에 상기 선택된 유전학적 요소를 통합하고 가공된 세포를 제조하는 단계.
  29. 청구항 28에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (c) 상기 가공된 세포를 분리하는 단계.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 선택된 유전학적 요소가 스크리닝 가능하거나 선택가능한 마커인, 방법.
  31. 28에 있어서, 상기 선택된 유전학적 요소가 치료학적 폴리펩타이드 또는억제성 핵산을 암호화하는, 방법.
  32. 청구항 28에 있어서, 상기 선택된 유전학적 요소가 항체, T-세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 선택된 유전학적 요소가 CAR을 암호화하는, 방법.
  34. 28에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인, 방법.
  35. 청구항 28에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포인, 방법.
  36. 청구항 28에 있어서, 상기 세포가 면역계 세포 또는 이의 전구체인, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 세포가 천연 킬러(NK) 세포, T-세포 또는 NK 세포 또는 T-세포의 전구체인, 방법.
  38. 청구항 28에 있어서, 상기 세포를 형질감염시키는 것이 중합체, 폴리펩타이드 또는 지질-기반 형질감염 시약의 사용을 포함하는, 방법.
  39. 청구항 28에 있어서, 상기 세포를 형질감염시키는 것이 세포를 전기천공함을 포함하는, 방법.
  40. 청구항 28에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (a) 세포 집단을 (i) 청구항 1의 전위효소 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및 (ii) 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 선택된 유전학적 요소를 암호하하는 DNA 로 형질감염시키는 단계; 및
    (b) 상기 집단을 전위효소 활성을 위해 적당한 조건하에서 항온처리하여 상기 세포의 게놈에 상기 선택된 유전학적 요소를 통합시키고 가공된 세포 집단을 제조하는 단계.
  41. 청구항 40에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (a) T-세포 집단 또는 T-세포 전구체를 (i) 청구항 1의 틀내스포사제 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및 (ii) 트랜스포존 반복체에 의해 플랭킹된 CAR 또는 TCR을 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 단계; 및
    (b) 상기 집단을 전위효소 활성에 대해 적당한 조건하에서 항온처리하여 상기세포의 게놈에서 CAR을 통합시키고 가공된 T-세포, 또는 T-세포 전구체의 집단을 제조하는 단계.
  42. 청구항 41에 있어서, 하기의 추가의 단계를 포함하는 방법:
    (c) 상기 가공된 세포를 CAR 또는 TCR 발현 T-세포의 증식을 선택적으로 증진시키는 배지에서 배양하는 단계.
  43. 하기의 단계를 포함하는 질환을 갖는 인간 대상체에서 T-세포 반응을 제공하는 방법:
    (a) 청구항 41에 따라 가공된 T-세포 또는 T-세포 전구체 집단을 수득하는 단계;
    (b) 임의로 상기 세포를 CAR-발현 T-세포의 증식을 선택적으로 증진시키는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (d) 유효량의 CAR-발현 또는 TCR-발현 또는 유전학적으로 변형된 T-세포 또는NK 세포 또는 면역 세포를 대상체에게 투여하여 면역 반응을 제공하는 단계.


KR1020177027114A 2015-03-11 2016-03-10 전위효소 폴리펩타이드 및 이의 용도 Active KR102615825B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562131827P 2015-03-11 2015-03-11
US62/131,827 2015-03-11
PCT/US2016/021693 WO2016145146A1 (en) 2015-03-11 2016-03-10 Transposase polypeptides and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170125877A true KR20170125877A (ko) 2017-11-15
KR102615825B1 KR102615825B1 (ko) 2023-12-21

Family

ID=55587385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177027114A Active KR102615825B1 (ko) 2015-03-11 2016-03-10 전위효소 폴리펩타이드 및 이의 용도

Country Status (17)

Country Link
US (4) US10570382B2 (ko)
EP (2) EP3268470B1 (ko)
JP (3) JP6775515B2 (ko)
KR (1) KR102615825B1 (ko)
CN (1) CN107532174A (ko)
AU (2) AU2016229094B2 (ko)
CA (1) CA2977818A1 (ko)
DK (1) DK3268470T3 (ko)
ES (1) ES2854675T3 (ko)
HU (1) HUE053368T2 (ko)
IL (2) IL285286B2 (ko)
MX (2) MX388517B (ko)
PL (1) PL3268470T3 (ko)
RU (2) RU2735700C2 (ko)
SG (1) SG11201707111RA (ko)
WO (1) WO2016145146A1 (ko)
ZA (1) ZA201706420B (ko)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
EP3974520A1 (en) 2013-05-14 2022-03-30 Board of Regents, The University of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
CA3190002A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors and methods of making
WO2016073629A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) to selectively target protein complexes
EP3804741A3 (en) 2015-02-24 2021-07-14 Board of Regents, The University of Texas System Selection methods for genetically-modified t cells
CA2977818A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Transposase polypeptides and uses thereof
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
KR20180042449A (ko) 2015-09-15 2018-04-25 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 T 세포 수용체(tcr) 결합 항체 및 이의 용도
EP3368075B1 (en) 2015-10-27 2020-01-29 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
EP3468994A1 (en) 2016-06-08 2019-04-17 Intrexon Corporation Cd33 specific chimeric antigen receptors
CN110494543A (zh) 2016-10-19 2019-11-22 弗洛设计声能学公司 通过声学的亲和细胞提取
CA3049652A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Intrexon Corporation Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
AU2018321105B2 (en) * 2017-08-21 2025-01-30 European Molecular Biology Laboratory Improved transposase polypeptide and uses thereof
SG11202003907WA (en) 2017-12-14 2020-05-28 Flodesign Sonics Inc Acoustic transducer drive and controller
IL277128B2 (en) 2018-03-06 2025-11-01 Precigen Inc Hepatitis b vaccines and uses of the same
US12404306B2 (en) 2018-03-06 2025-09-02 Precigen, Inc. Human papillomavirus vaccines and uses of the same
WO2020168086A1 (en) * 2019-02-13 2020-08-20 Geerlings Maurits W Nanocarriers for the delivery of nucleic acids and uses thereof
JP7769325B2 (ja) * 2019-07-23 2025-11-13 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
MX2022002747A (es) 2019-09-10 2022-04-06 Obsidian Therapeutics Inc Proteinas de fusion de ca2-il15 para regulacion ajustable.
US20230144097A1 (en) * 2020-03-30 2023-05-11 Institute Of Zoology, Chinese Academy Of Sciences Active dna transposon systems and methods for use thereof
WO2022147444A2 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Alaunos Therapeutics, Inc. Recombinant vectors comprising polycistronic expression cassettes and methods of use thereof
IL305393A (en) 2021-02-25 2023-10-01 Alaunos Therapeutics Inc Recombinant vectors comprising polycistronic expression cassettes and methods of use thereof
US20250145950A1 (en) 2022-02-01 2025-05-08 Alaunos Therapeutics, Inc. Methods for Activation and Expansion of T Cells
CN118638859A (zh) * 2024-05-10 2024-09-13 中国科学院动物研究所 活性dna转座子系统及其使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060026699A1 (en) * 2004-06-04 2006-02-02 Largaespada David A Methods and compositions for identification of genomic sequences
JP2010531650A (ja) * 2007-07-04 2010-09-30 マックス−デルブリュック−ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン トランスポゾンシステム−スリーピングビューティーのトランスポザーゼタンパク質の機能亢進性バリアント

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5925545A (en) 1996-09-09 1999-07-20 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
EP0973928B1 (en) 1997-03-11 2010-05-05 Regents Of The University Of Minnesota Dna-based transposon system for the introduction of nucleic acid into dna of a cell
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
EP1234780A1 (de) * 1999-06-02 2002-08-28 Alcan Technology & Management AG Kindersichere Verpackung für Tabletten
US8227432B2 (en) 2002-04-22 2012-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
US7109304B2 (en) 2003-07-31 2006-09-19 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD19 antibodies
US20100105140A1 (en) * 2008-07-16 2010-04-29 Fahrenkrug Scott C Plaice dna transposon system
EP2389435B1 (en) * 2009-01-23 2015-11-04 NsGene A/S Improved cell lines and their use in encapsulated cell biodelivery
WO2012140127A2 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Immunicum Ab Method for priming of t cells
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
CA3247166A1 (en) 2012-10-04 2026-03-02 Research Development Foundation Serine protease molecules and therapies
EP3974520A1 (en) 2013-05-14 2022-03-30 Board of Regents, The University of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2014190273A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
CN105848484A (zh) 2013-10-25 2016-08-10 得克萨斯州大学系统董事会 用于免疫治疗的多克隆γδ T细胞
CA3190002A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors and methods of making
US20170158749A1 (en) 2014-04-23 2017-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) and methods for making and using the same
WO2015164740A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products
WO2016073629A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) to selectively target protein complexes
KR20170075785A (ko) 2014-11-05 2017-07-03 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 유전자 변형된 면역 효과기 세포 및 면역 효과기 세포의 증식용 가공된 세포
EP3804741A3 (en) 2015-02-24 2021-07-14 Board of Regents, The University of Texas System Selection methods for genetically-modified t cells
CA2977818A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Transposase polypeptides and uses thereof
KR20180042449A (ko) 2015-09-15 2018-04-25 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 T 세포 수용체(tcr) 결합 항체 및 이의 용도
EP3368075B1 (en) 2015-10-27 2020-01-29 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060026699A1 (en) * 2004-06-04 2006-02-02 Largaespada David A Methods and compositions for identification of genomic sequences
JP2010531650A (ja) * 2007-07-04 2010-09-30 マックス−デルブリュック−ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン トランスポゾンシステム−スリーピングビューティーのトランスポザーゼタンパク質の機能亢進性バリアント

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI ACCESSION : AFR53956.1(2012.09.16.)* *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE053368T2 (hu) 2021-06-28
ZA201706420B (en) 2019-06-26
KR102615825B1 (ko) 2023-12-21
JP6970991B2 (ja) 2021-11-24
JP2018509151A (ja) 2018-04-05
US10570382B2 (en) 2020-02-25
US11492604B2 (en) 2022-11-08
US12116604B2 (en) 2024-10-15
MX388517B (es) 2025-03-19
EP3268470A1 (en) 2018-01-17
MX2017011679A (es) 2018-02-09
EP3268470B1 (en) 2020-11-18
RU2020127887A (ru) 2020-10-02
US10883094B2 (en) 2021-01-05
IL254394B (en) 2021-08-31
DK3268470T3 (da) 2021-02-22
JP2022025097A (ja) 2022-02-09
HK1248757A1 (zh) 2018-10-19
RU2735700C2 (ru) 2020-11-06
AU2020202653A1 (en) 2020-05-14
US20180051265A1 (en) 2018-02-22
EP3851523A1 (en) 2021-07-21
CA2977818A1 (en) 2016-09-15
SG11201707111RA (en) 2017-09-28
ES2854675T3 (es) 2021-09-22
WO2016145146A1 (en) 2016-09-15
US20210171924A1 (en) 2021-06-10
IL254394A0 (en) 2017-11-30
AU2020202653B2 (en) 2022-03-10
IL285286B2 (en) 2023-11-01
AU2016229094B2 (en) 2020-02-06
RU2017134741A3 (ko) 2019-09-30
JP6775515B2 (ja) 2020-10-28
US20200216826A1 (en) 2020-07-09
CN107532174A (zh) 2018-01-02
JP2021035363A (ja) 2021-03-04
US20230151344A1 (en) 2023-05-18
IL285286B1 (en) 2023-07-01
MX2021014712A (es) 2022-01-18
PL3268470T3 (pl) 2021-06-14
AU2016229094A1 (en) 2017-10-05
RU2017134741A (ru) 2019-04-04
IL285286A (en) 2021-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12116604B2 (en) Transposase polypeptides and uses thereof
AU2015343013B2 (en) Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells
EP3215534B1 (en) Chimeric antigen receptors (car) to selectively target protein complexes
JP2022500011A (ja) 固形腫瘍を治療するためのキメラ抗原受容体細胞
KR20170093248A (ko) 탄산무수화효소 ix 특이적 키메라 항원 수용체 및 이의 사용 방법
CN111019905A (zh) Car修饰细胞及其在制备自身免疫性疾病药物中的应用
CN113454115A (zh) 靶向唾液酸化路易斯a的嵌合抗原受体及其用途
CN110511912A (zh) 免疫细胞的功能调节
US20250345429A1 (en) Compositions and methods comprising chimeric adaptor polypeptides
HK40056224A (en) Transposase polypeptides and uses thereof
HK1248757B (en) Transposase polypeptides and uses thereof
HK1243442B (en) Chimeric antigen receptors (car) to selectively target protein complexes

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E90F Notification of reason for final refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U12-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000