KR20170128577A - 조직 시료 분석 기술 - Google Patents

Abstract

조직 시료의 정량 분석은 시료의 복수의 핵에 대해 배수성 측정을 수행하여 시료의 배수성 유형을 결정하는 단계 및 단편에 대해 기질 측정을 수행하여 시료의 기질 유형을 결정하는 단계를 포함한다. 배수성 유형, 예컨대 이배체 또는 비-이배체, 및 기질 유형, 높은 또는 낮은 기질은 배수성 유형 단독에 비하여 개선된 환자 생존율 측정을 가져온다.

Description

조직 시료 분석 기술

많은 암 유형에 있어 진단시 의사가 종양의 성장과 행동을 예측하기 어렵다. 이 시기에 생성된 예측은 환자에 대한 치료 유형에 영향을 미치고 향후 결과 및 그 또는 그녀의 삶의 질에 커다란 영향을 미칠 수 있다. 암 치료는 힘든 스트레스가 될 수 있으며, 환자의 종양의 진행이 느리면 적극적인 치료가 실제로 암 자체보다 더 많은 고통과 불편함을 유발할 수 있다. 진단 당시 진행이 느린 것으로부터 퇴행성 종양을 분리하는 것, 또한 올바른 치료법을 선택하는 것은 암 치료에서 있어서 주요 도전 과제이다.

세포 핵 및 기타 구조의 디지털 이미지 분석은 조직으로부터 정량적 정보를 얻기 위한 유용한 방법이다. 방법은 분리된 세포 핵 및 그 주변 조직의 것 모두의 완벽한 분석을 사용할 수 있다. 이처럼 원래의 배지에서 이러한 세포 핵을 수집하고, 핵의 중요한 집단을 모으고 그들을 특성화할 수 있는 자동화 시스템의 개발에 대한 동기가 있다.

세포 핵의 특성화를 가능하게 하는 방법은 약물 발견, 임상 및 기타 의학적 적용을 갖는다는 것을 이해할 수 있다.

본 발명에 따르면,

시료의 복수의 핵에 대해 배수성(ploidy) 측정을 수행하여 시료의 배수성 유형을 결정하는 단계;

조직 시료의 단편(section)에 대해 기질 측정을 수행하여 시료가 미리결정된 기질 백분율 이상인 기질의 백분율을 갖는 높은 기질 유형(high stroma type) 또는 최대로 잡아야 미리결정된 기질 백분율인 기질의 백분율을 갖는 낮은 기질 유형(low stroma type)인지 여부를 결정함으로써 시료의 기질 유형을 결정하는 단계; 및

기질 유형 및 배수성 유형에 기초하여 분류를 출력하는 단계를 포함하는 조직 시료의 정량적 분석 방법을 제공한다.

분류는 "고", "중간", 또는 "저" 위험일 수 있고 또는 대안적으로 분류는 단순하게 기질 유형 및 배수성 유형의 조합, 예를 들어 "이배체, 낮은 기질"일 수 있다. 어느 쪽이든, 배수성 유형 단독을 사용하는 것보다 더 나은 예후를 얻는 것을 기대할 수 있다.

배수성 측정은

핵이 유리되고 DNA 특이적 염색으로 염색되도록 조직의 시료를 준비하는 단계;

핵 표본의 현미경 이미지를 캡쳐하는 단계,

캡쳐된 이미지에서 이미지를 분할하여 핵을 확인하는 단계;

복수의 핵 각각에 대하여, 통합된 광학 밀도를 얻는 단계; 및

시료에 대해 DNA 배수성 분류를 결정하는 단계에 의해서 수행될 수 있다.

기질 측정은

조직 단편을 얻는 단계;

상기 조직 단편을 염색하는 단계;

상기 염색된 조직 단편의 현미경 이미지를 캡쳐하는 단계;

클러스터링 알고리즘(clustering algorithm)을 사용하여 현미경 이미지의 이미지 픽셀을 기질 및 비-기질 픽셀로 분할하는 단계; 및

이미지 내의 기질 픽셀의 분율을 계산하는 단계; 및

상기 기질 픽셀의 분율이 미리결정된 기질 백분율을 초과하는지 여부를 결정하는 단계에 의해서 수행될 수 있다.

상기 단계 방법은 클러스터링 알고리즘을 사용하는 단계를 수행하기 전에 캡쳐된 현미경 이미지를 색상-채도-명도 컬러 좌표로 변환하는 단계를 더 포함할 수 있다.

클러스터링 알고리즘을 사용하는 단계는 이미지 픽셀을 2개의 가우스 곡선에 맞추는 단계를 포함할 수 있고, 하나의 가우스 곡선은 기질에 대응하고 하나는 이미지의 비-기질 영역에 대응한다.

일 접근에서, 기질 분율을 얻는 방법은

캡쳐된 이미지를 헤모톡실린으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 이미지 및 헤모톡실린 또는 에오신으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지로 변환하는 단계;

제1 미리결정된 수준 이하의 채도 및 이미지의 배경에 대응하는 제2 미리결정된 수준 이하의 명도를 갖는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지에서 픽셀의 배경 마스크(mask)를 계산하는 단계; 및

표준화된 헤모톡실린 이미지를 회색으로 변환하여 회색-변환된 이미지를 얻음으로써 결합 조직 마스크를 계산하는 단계를 포함하고, 여기서 클러스터링 알고리즘을 사용하는 단계는 클러스터링 알고리즘을 사용하고 및 회색 변환된 이미지에 대한 임계처리를 하여 결합 조직의 픽셀을 확인한다.

상기 미리결정된 기질 백분율은 30% 내지 70%, 예를 들어 40% 내지 60%일 수 있다.

상기 방법은 또한 기질 유형 및 배수성 유형으로부터 환자 생존 군(patient survival group)을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.

기질 유형 높은 기질 및 비-이배체의 배수성 유형의 시료가 고위험을 나타낼 수 있고, 기질 유형 낮은 기질 및 배수성 유형 이배체의 시료가 저위험을 나타낼 수 있으며, 낮은 기질의 기질 유형 및 비-이배체 유형의 배수성 유형 또는 높은 기질의 기질 유형 및 이배체의 배수성 유형을 갖는 시료가 중간수준의 위험을 나타낼 수 있다.

본 발명에 의해 수행되는 분석은 조직 단편이 전형적으로 많은 상이한 유형의 조직, 상피, 기질, 근육, 내강 및 점액 영역 및 다른 곳으로부터 얻어진 경우, 핵 집단의 정량적 평가 및 조직 단편 내의 기질 조직의 양을 조합함으로써 시료의 특성화를 가능하게 한다.

본 발명은 개별적으로 분리된 세포 핵에서 얻어진 정량적 정보 및 조직 단편으로부터의 정량적 정보를 조합함으로써 정량적 정보를 얻을 수 있게 한다.

상기 시료는 암 조직일 수 있다. 특정 실시예에서, 암 조직은 대장 조직, 직장 조직 또는 전립선 조직일 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 컴퓨터가 상기와 같은 방법을 수행하도록 배열된 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이다.

또다른 양상에서, 본 발명은

조직 단편을 얻는 단계;

상기 조직 단편을 염색하는 단계;

상기 염색된 조직 단편의 현미경 이미지를 캡쳐하는 단계;

상기 캡쳐된 현미경 이미지를 색상-채도-명도 컬러 좌표로 변환하는 단계;

상기 이미지 픽셀의 색상 값을 2개의 가우스 곡선에 맞추어 현미경 이미지의 이미지 픽셀을 기질 및 비-기질 픽셀로 분할하는 단계를 포함하고, 하나의 가우스 곡선은 기질에 대응하고 하나는 이미지의 비-기질 영역에 대응하는 것인 단계; 및

이미지에서 기질 픽셀의 비율을 계산하는 단계에 의해서 조직에서 기질의 백분율을 측정하는 방법에 관한 것이다.

이러한 방법으로, 의사를 요구하지 않고 자동적으로 정확하게 기질의 백분율을 얻을 수 있다.

상기 방법은 시료가 미리결정된 기질 백분율 이상인 기질의 백분율을 갖는 높은 기질 유형 또는 최대로 잡아야 미리결정된 기질 백분율인 기질의 백분율을 갖는 낮은 기질 유형인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

추가적인 양상은

캡쳐된 이미지를 헤모톡실린으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 이미지 및 헤모톡실린 또는 에오신으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지로 변환하는 단계;

제1 미리결정된 수준 이하의 채도 및 이미지의 배경에 대응하는 제2 미리결정된 수준 이하의 명도를 갖는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지에서 픽셀의 배경 마스크를 계산하는 단계;

표준화된 헤모톡실린 이미지를 회색으로 변환하여 회색-변환된 이미지를 얻는 단계;

클러스터링 알고리즘을 사용하고 및 회색 변환된 이미지에 대한 임계처리를 하여 결합 조직의 픽셀을 확인하는 결합 조직 마스크를 얻는 단계 및

배경 마스크에 의해 확인된 배경을 제외한 이미지에서 결합 조직 마스크에 의해 확인된 결합 조직의 백분율로부터 기질의 백분율을 얻는 단계에 의해 염색된 조직 단편의 캡쳐된 현미경 이미지로부터 조직에서 기질의 백분율을 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 더 나은 이해를 위해서, 첨부된 도면을 참조하여, 구현예를 단순히 예시적 방법으로 기술한다:
도 1은 배수성 측정의 수행을 도시하는 흐름도를 나타낸다;
도 2는 도 1의 배수성 측정 수행을 위한 장치를 나타낸다;
도 3은 정상 시료의 배수성 측정 예를 나타낸다;
도 4는 비정상 시료의 배수성 측정 예를 나타낸다;
도 5는 단편화 및 염색 이후의 기질 이미지를 도시한다;
도 6은 기질 측정의 수행을 도시하는 흐름도를 나타낸다;
도 7은 조합된 방법을 도시하는 흐름도를 나타낸다;
도 8은 배수성 및 기질 분류를 사용한 실시예에서 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 9는 배수성 분류 단독을 사용한 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 10은 배수성 및 기질 분류 모두를 사용한 실시예에서 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 11은 배수성 분류 단독을 사용한 실시예에서 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 12는 기질 분류 단독을 사용한 실시예에서 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 13은 배수성 및 기질 분류 모두를 사용한 실시예에서 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 14는 배수성 분류 단독을 사용한 실시예에서 환자 생존 결과를 나타낸다;
도 15는 대안적인 실시예에 따른 방법에서 중간 단계를 나타낸다; 및
도 16은 도 15에 도시된 방법에서 추가적인 단계를 나타낸다.

일 구현예에서, 이전에 생검을 위해 암 영역으로부터 제거된 시료 조직을 사용하여 기질 측정에 사용되는 조직 단편을 준비하고, 배수성 측정을 위하여 시료로부터 추가적 세포를 사용하였다. 이는 하기에서 더 자세히 설명한다.

배수성 측정( Ploidy Measurement)

도 1 및 도 2를 참조하면, 현미경 장비 및 디지털 이미지 수집 장비를 세포 핵 내에서 염색질 구조에 대한 정량적 정보를 얻기 위해서 세포 핵, 구체적으로 핵 내의 염색질의 분석에 사용하였다. 본 구현예는 준비된 핵으로부터 그레이(grey) 스케일 강도 데이터를 사용하여 분석을 완료하였다.

우선 Feulgen 방법을 사용하여 슬라이드(76) 상에서 단층 염색된 층을 만들기 위해 표준 실험실 공정을 사용하여 조직 시료로부터 세포 표본을 준비하였다. 방법은 잘 공지되어 있고 예를 들어 Ris 및 Mirsky, "Quantitative Cytochemical determination of desoxyribonucleic acid with the Feulgen nucleal reaction.", The Journal of General Physiology, (1949) 페이지 125 내지 146에 기술되어 있다. 이 기술은 균질화 또는 유리 단계를 포함하므로 결과인 염색된 시료는 세포 단편이 아니라 균질화된 세포의 세트임을 주의한다.

준비된 슬라이드(76)를 현미경(74) 위, 특히 컴퓨터 제어 스테이지(78)에 두었다. 현미경(74)은 이미징 장치(70)를 사용한다. 구현예에 따른 컴퓨터 소프트웨어에 의해 프로그램된 퍼스널 컴퓨터(72)는 스테이지 및 표본, 따라서 현미경 하에서 슬라이드의 위치를 이동시키도록 스테이지(78)를 제어하는 전자기기(80)를 제어한다. 퍼스널 컴퓨터(72)는 스테이지(78)를 필요한 위치로 유도하고 디지털 카메라를 사용하여 표본이 필요한 위치에 있으면 이미지를 캡쳐한다.

상기 컴퓨터는 디지털 카메라를 제어하고 후속 분석을 완료하는데 사용된다. 상기 컴퓨터는 도 1에 도시된 단계의 세트를 수행한다.

우선, 핵 및 다른 아티팩트(artifact)로부터 명확한 기준 영역을 취함으로써, 전체로 이미지에 대한 배경 수준을 계산한다(단계 10).

다음, 스테이지(78)를 제1 프레임 위치로 이동시키고(단계 12), 이미지를 캡쳐한다(단계 14).

이후 상기 이미지를 음영에 대하여 보정(단계 16) 및 핵을 분할(단계 18)함으로써 처리한다. 사용된 분할 알고리즘의 더욱 자세한 내용은 GB 1019429.8에 제공된다.

이후 각각의 핵의 통합된 광학 밀도를 얻는다(단계 20). 충분한 핵이 캡쳐된 경우, 즉 통합된 광학 강도가 미리결정된 수를 초과하는 핵의 수가 있다면, 방법은 단계 24로 진행한다. 그러나, 측정된 핵의 수가 불충분한 경우, 방법은 단계가 추가적 핵의 이미지를 캡쳐하기 위한 새로운 위치로 이동하는, 단계 12로 되돌아간다. 이러한 단계는 전체 시료가 측정되거나 핵의 수가 미리결정된 수를 초과할 때까지 반복된다.

이후 통합된 광학 밀도의 범위를 결정하기 위해 히스토그램을 얻을 수 있다(단계 24). 이는 시료가 도 2에 도시한 바와 같이 2C 위치에서 단일 큰 피크를 갖는 이배체 시료인지 또는 도 3에 도시한 바와 같은 비-이배체인지 DNA 배수성 분류를 결정하기 위해 사용된다. 실제로 히스토그램이 계산되거나 플로팅될 필요가 없음에 주의 - 핵으로부터 데이터가 저장되고 퍼스널 컴퓨터(72)가 하기와 같이 데이터를 분류할 수 있는 것이 필요한 전부이다.

도 3 및 4는 두 시료로부터의 히스토그램을 도시한다.

도 3은 시료의 배수성에 대응하는, 다양한 통합된 광학 밀도를 갖는 핵의 수의 히스토그램을 나타낸다. 눈금은 1c, 2c, 4c 및 5c의 반수체(Haploid) 수에 대응하는 광학 밀도를 나타낸다. 이러한 광학 밀도는 세포 내의 염색체의 카피 수에 대응한다. 2c는 이배체 세포이고, 4c는 분열 과정에 있는 세포이다.

도 4는 이수체(aneuploid) 시료에 대하여 대응하는 히스토그램을 나타낸다. 이 경우, 2c에서의 중요한 피크뿐만 아니라 2c 및 4c 피크 사이의 중간 이수체 값에서의 중요한 피크 또한 존재한다. 이는 비-이배체 시료에 해당한다.

DNA 배수성 분류의 특정 실시예에서, 하나의 G0/G1 피크(2c)가 존재하는 경우 종양은 이배체로 분류되고, G2 피크(4c)에서 핵의 수가 전체 핵의 수의 10%를 초과하지 않고 5c보다 많은 DNA 함량을 갖는 핵의 수는 1%를 초과하지 않는다.

종양은 4c 피크(DI 1.9-2.1)가 존재하는 경우 (4c 피크에서 핵의 수가 S기 분율 이상 및 전체 핵의 10% 이상임) 사배체로 정의되고, G2 피크(8c)에서 핵의 수가 전체 핵의 수의 10%를 초과하지 않고 9c 이상의 DNA 함량을 갖는 핵의 수는 1%를 초과하지 않는다.

종양은 전체 핵의 수의 10% 이상이 8c 피크에 존재하는 경우 및/또는 9c 이상의 DNA 함량을 갖는 핵의 수가 1%를 초과하는 경우 배수체(polyploid)로 정의된다.

종양은 비 이수체 피크(들)이 존재하거나 정배수체(euploid) 집단을 나타내지 않는 5c를 초과하는 DNA 함량을 갖는 핵의 수가 1% 초과인 경우 이수체로 정의된다. 종양은 이수체 피크가 DNA index 1.06-1.10으로 증명되는 경우 고이배체(hyperdiploid)로 분류된다.

기질 측정( Stroma Measurement)

조직 시료를 얻고, 단편을 만들고 염색하여 도 5에 도시한 것과 같은 이미지를 얻는다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 단편을 준비한다.

이후, 도 6을 참조하면, 단편의 컬러 이미지를 슬라이드 스캐너를 이용하여 캡쳐하고(단계 40) 컴퓨터에 업로드한다. 이후 이미지를 색상-채도-명도 컬러 좌표로 변환한다(단계 42).

다음, 배경을 제거한다(단계 46). 이는 조직을 갖지 않는 이미지의 영역을 확인함으로써 수행한다.

2개의 가우스 곡선에 대한 맞춤(fitting)을 수행하였다. 초기 조건을 설정한 후(단계 48) 클러스터링 알고리즘을 사용하여(단계 50) 상이한 가우스에 의해 각각 나타내어지는 두 개의 상이한 컬러를 데이터에 맞춘다. 이는 이미지를 기질과 비-기질로 효과적으로 나눈다. 이 클러스터링 알고리즘은 컬러 이미지의 색상 값만을 사용한다.

다음, 특정 수의 픽셀 이하의 작은 영역을 제거하고(단계 52), 이미지를 미디언 필터(Median Filter)에 통과시켜(단계 54) 이미지에서의 노이즈를 제거한다.

이후 기질 분율을 계산한다(단계 56). 시료는 기질 분율이 미리결정된 값, 예를 들어 50%의 범위 이상인 경우 높은 기질로 확인된다. 다른 시료를 낮은 기질로 분류한다.

조합(Combination)

도 7은 조직 시료에서 출발하는, 조합된 방법을 도시한다.

도 1에 도시된 방법으로 얻은 히스토그램 결과는 이배체 또는 비-이배체의 배수성 유형을 갖는 것으로 분류된다(단계 62). 이 경우, 사배체, 배수체 또는 이수체인 임의의 결과는 비-이배체로 분류된다. 당업자는 히스토그램을 요구하지 않고 시료를 이배체 또는 비-이배체로 분류할 수 있는 다른 계산이 있음을 인식할 것이며, 그러한 방법도 동등하게 가능하다.

도 6에 도시된 방법으로부터 얻은 기질 분율 결과 또한 높은 기질 또는 낮은 기질로 분류된다(단계 64).

이후, 조합된 분류를 사용하여 특정 시간 후에 예상되는 재발률을 계산하였다. 동일하게, 데이터를 사용하여 재발없는 생존기간을 캡쳐할 수 있다. 대안적으로, 환자 생존에 관한 데이터를 대신 캡쳐할 수 있다. 이 데이터는 기대 수명이 다른 경우보다 낮은 경우 보다 적극적인 개입을 선택할 수 있는 의사에게 유용한 정보를 제공할 수 있다.

실험에 의해 환자 재발률 판단을 얻을 수 있다. 본 발명자들은 2가지 방법의 조합이 예상하기 어려운 좋은 결과를 제공하는 것을 발견하였다.

옥스포드에서 임상 시험에 등록된 대장암 2기 또는 3기인 850 환자의 시리즈인 첫번째 시리즈 "V" 및 오슬로 대학교 병원에서의 대장암 1, 2 또는 3기인 587 환자의 시리즈인 두번째 시리즈 "A"인, 두 개의 환자 시리즈에 대하여 실험을 수행하였다. 모든 환자는 종양을 수술적으로 제거하였다. 75세 이하의 3기인 환자는 추가적인 (보조제) 화학요법을 받았다. 모든 환자는 최소 5년 또는 사망할 때까지 추적 조사를 받았다.

시료를 이배체 또는 비-이배체와 같이 상기 기술된 DNA 방법, 및 낮은 기질 또는 높은 기질과 같이 분류되고 상기 기술된 기질 측정 모두에 대하여 분류하였다.

재발률을 다른 방법으로 플롯팅하였다. 제시된 그래프는 이배체에 대하여 D, 또는 비-이배체에 대하여 N, 높은 기질에 대하여 H 및 낮은 기질에 대하여 L로 표지한다.

도 8은 시리즈 A에 대한 측정 후 몇년 동안의 재발률을 플롯팅한다.

기질 유형 및 배수성 유형 모두를 사용한 측정의 조합은 50%의 5년 재발없는 생존율을 갖는 비-이배체 높은 기질 및 훨씬 더 높은 5년 재발없는 생존율을 갖는 이배체 낮은 기질을 우수하게 분리함에 주목한다.

이러한 그래프의 분리는 이배체 또는 비-이배체(배수성)의 배수성 유형에 의하여만 분리된 결과를 나타내는 도 9에 훨씬 더 잘 도시된다.

따라서, 두 방법의 조합이 배수성에 기초한 단순한 분류보다 훨씬 더 좋은 결과를 제공하는 것이 분명하다. 따라서, 이배체 유형 및 기질 유형 출력 데이터와 관련된 정보 모두를 출력함으로써 의사가 더욱 정확한 예후, 즉 재발없는 생존율의 예측, 이에 따라 적절한 치료를 선택하는 것이 가능하도록 한다.

도 10은 V 시리즈에 대하여 대응하는 데이터를 제공한다. 반복하여, 이 그래프는 배수성 유형에 의한 분류에 기초한 결과만을 나타내는 도 11에 비하여 기대 수명의 훨씬 더 나은 분리, 이에 따른 진단력을 나타낸다.

도 12는 기질 유형에 의해서만 분리된 도 10에 대응하는 데이터를 나타낸다. 도 10의 결과 또는 기질 유형 단독을 사용한 도 12의 결과보다 더 우수함에 주목한다.

즉, 기질 및 배수성의 조합은 단독에 비해서 더 잘 작동한다.

상기 결과는 대장암에 관한 것이다. 그러나, 동일한 시도가 다른 유형의 암에 대해서도 작동한다.

도 13은 기질 유형 및 배수성 유형 모두에 기초한 분류를 사용하는 동일한 방법으로 전립선암에 계산한 재발없는 생존기간 결과를 나타낸다.

도 14는 배수성 유형만을 사용한 실시예를 나타낸다. 배수성만을 사용한 것에 비하여 조합된 시도를 사용한 결과가 얼마나 더 우수한지 주목한다.

따라서, 상기 증거는 상기 방법이 대장암만을 위한 것이 아니라, 일반적으로 적용되는 것임을 제시한다.

동일한 시료에 대해 상이한 측정을 수행한 대부분의 경우, 단순히 상이한 측정을 사용하는 대신에 예측을 결합하여 얻은 재발없는 생존기간의 예측에서 개선이 거의 이루어지지 않음에 유의한다. 그러나, 본원에 기술된 배수성 측정 및 기질 측정의 경우에, 상이한 측정이 시료를 유의적으로 상이한 결과를 갖는 집단으로 구분하고 예측되지 않도록 분리하였고 따라서 이 방법은 측정 중 하나만을 사용하는 것에 비하여 후속 의료의 의사를 결정하는데 훨씬 더 유용하다. 특히, 기질 측정을 포함하면 배수성 단독 측정과 비교하여 결과가 크게 향상된다.

기질을 확인하는 추가적인 방법이 하기에 기술된다. 상기 기술된 방법은 HSV 좌표로 변환된 이미지를 사용하고, 자동적으로 두 범위의 색상을 추출하고 색상 값에 대하여 자동화 클러스터링 알고리즘을 사용한다. 대신, 기질을 확인하기 위한 대안적인 배열에서, 변환된 이미지의 색상 및 채도 값 모두가 사용된다. 각각에 동일한 가중치가 부여된다.

구체적으로, 대안에 따른 방법은 하기와 같다:

우선, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 이미지의 슬라이드를 스캔하고 Huo J, et al "Robust Automatic White Balance Algorithm using Gray Color Points in Images", IEEE transactions on Consumer Electronics, 2006, volume 52, number 2, 페이지 541 내지 546에 교시된 바와 같은 Huo 방법의 버전을 사용하여 화이트밸런스를 보정한다.

이후 이미지를 추출하고 다시 샘플링한다. 일 실시예에서, 다시 샘플링하는 것은 1/8의 비율로 수행되어 약 2μm의 선형 해상도를 갖는 이미지를 생성한다.

이후 컬러 채널을 추출하고 Macenko M, et al, "A method for normalising histology slides for quantitative analysis", Biomedical Imaging: From Nano to Macro 2009, IEEE international symposium on biomedical imaging ISBI 2009, 페이지 1107 내지 1110에 의해 교시되는 방법을 사용하여 표준화한다. 이 과정은 사실 헤마톡실린 이미지 및 H 및 E 이미지로 지칭되는 두 개의 이미지를 야기한다. 헤모톡실린 이미지는 에오신 염색이 아닌 헤마톡실린 염색에 관한 표준화된 이미지이고 H 및 E 이미지는 헤마톡실린 및 에오신 염색 모두에 대응하는 표준화된 이미지이다. 결과인 표준화된 H&E 이미지를 도 15에 도시하였다.

이러한 이미지는 색상, 채도 및 명도의 HSV 컬러 공간에서 컬러 데이터를 사용하여 처리된다.

이후 배경 마스크 및 결합 조직 마스크로 지칭된, 두 개의 마스크(mask)가 생성된다.

배경 마스크를 얻기 위해서, 표준화된 H&E 이미지에 크기 7×7의 평균 필터를 적용한다. 이후, 채도 V<0.2 및 평균 채도 S<0.4를 갖는 픽셀을 제거하여 배경 마스크를 생성한다.

결합 조직 마스크를 얻기 위해서, 표준화된 헤모톡실린 이미지를 9×9 윈도우(window)를 갖는 회색 및 미디언 필터링하여 미디언 이미지를 얻는다. 이후 이 이미지를 17 커널 크기를 갖는 표준 편자 필터로 처리하여 표준 편차 필터링된 이미지를 얻는다.

이 두개의 이미지, 미디언 이미지 및 표준 편차 필터링된 이미지가 추가로 조합된다 - 모든 이미지가 표준화됨에 주의한다. 이후 히스토그램 조정을 수행하여 낮은 값과 높은 값의 1%가 포화되도록 이미지를 조정한다. 이 결과는 조합된 이미지이다.

Otsu 방법을 사용하여 임계 수준을 계산하면, 조합된 이미지가 이 Otsu 계산된 임계값의 1.15배에 적용된다. 이후 이 이미지를 필터링하여 영역 내 200 픽셀 이하의 작은 개체를 제거하고 폐쇄(closing) 필터를 크기 3의 디스크 커널과 적용하여 결합 조직 마스크를 얻는다.

이후 결합 조직 마스크 및 배경 마스크를 AND 연산을 이용해서 조합하여 도 16에 나타낸 바와 같은 최종 마스크를 얻는다. 기질 분율을 관심 있는 영역 내의 결합 조직 분율(즉 기질), 즉 결합 조직(배경이 아님)의 픽셀 수를 총 픽셀 수(배경이 아님)로 나눈 값으로부터 계산한다.

따라서, 이 경우에 상기 방법은 하나는 결합 조직을 배제하고 하나는 배경을 제외하는 두 개의 구별되는 마스크에 기초하여 마스크를 효과적으로 계산하고, 상기 방법과 비교하여 방법을 개선한다.

방법의 결과를 시험하기 위해서, 이 방법을 분류된 다수의 종양에 적용하였다 - 50% 이하의 간질 분율을 갖는 종양을 낮은 간질로 분류하고 50% 이상의 간질 분율을 갖는 종양을 높은 간질로 분류하였다.

다변량분석은 방법이 3기 종양에서 특별한 값을 가짐을 나타내었고 시료에서 관련 예후 인자가 기질, 배수성 및 돌연변이, 및 T-단계(stage)임을 나타내었다. 따라서, 배수성 뿐만 아니라 본원에 교시된 방법을 사용한 기질 분율을 사용하여 정량적 분석을 수행하는 도구의 제공은 기질 분율을 사용하지 않고 배수성을 사용하는 방법과 비교하여 진단 신뢰도를 유의적으로 향상시킨다.

특히, 시험된 시료에 대해, 하기 다변량 인자를 얻었다. 위험(hazard) 비율은 두 조건에 의해 기술된 위험 비율의 비율이고, 따라서 위험 비율 2는 양성(positive) 값과 비교해서 불리한(adverse) 값에 대한 위험이 배가되었음을 나타낸다. 이 결과에서, 사용된 메트릭은 5년 재발 없는 생존이다.

기질: 위험 비율 2.0 (신뢰구간 1.4 내지 2.9) 및 p 값<0001

배수성: 위험 비율 1.4 (신뢰구간 0.9 내지 2.2) 및 p 값 0.14.

T 단계: 위험 비율 1.6 (신뢰구간 1.1 내지 2.4) 및 p 값 0.019.

T-단계 T3을 갖는 3기 종양만을 선택한 것은 더 나은 값을 제공한다:

기질: 위험 비율 2.1 (신뢰구간 1.3 내지 3.4) 및 p 값 0.003.

배수성: 위험 비율 2.0 (신뢰구간 1.1 내지 3.3) 및 p 값 0.013.

따라서 기질을 포함하는 것은 높은 기질 카운트를 갖는 환자가 낮은 기질을 갖는 환자의 두배의 위험을 갖기 때문에 명백히 향상된 결과를 제공한다.

처음에는 방법이 이미지의 색상을 포함하지 않지만, 방법은 색상을 사용하는 헤모톡실린 이미지 및 H&E 이미지를 분리하는데 사용된다.

본 발명자는 본 두번째 구현예에 따른 방법이 더 많은 재현가능한 결과를 제공하는 것을 발견했다, 즉 이러한 이미지 처리에 있어 당연히 중요한 이슈인 이미지 염색 및 이미지 캡쳐에 있어 변화에 더 강하다. 이론에 구속되지 않고, 헤모톡실린 이미지 및 H&E 이미지를 생성하기 위해 발생하는 표준화가 시료의 염색 및 이미지 캡쳐에서 이러한 변화의 효과를 감소시키기 위해 이미지를 표준화하는데 효과적인 것으로 고려된다.

예시적인 설명에 제공된 것은 청구범위를 제한하려는 의도가 아니다.

Claims (16)

1. 시료의 복수의 핵에 대해 배수성(ploidy) 측정을 수행하여 시료의 배수성 유형을 결정하는 단계;
   조직 시료의 단편에 대해 기질 측정을 수행하여 시료가 미리결정된 기질 백분율 이상인 기질의 백분율을 갖는 높은 기질 유형(high stroma type) 또는 최대로 잡아야 미리결정된 기질 백분율인 기질의 백분율을 갖는 낮은 기질 유형(low stroma type)인지 여부를 결정함으로써 시료의 기질 유형을 결정하는 단계; 및
   상기 기질 유형 및 상기 배수성 유형에 기초하여 분류를 출력하는 단계를 포함하는 조직 시료의 정량적 분석 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 기질 측정이
   조직 단편을 얻는 단계;
   상기 조직 단편을 염색하는 단계;
   상기 염색된 조직 단편의 현미경 이미지를 캡쳐하는 단계;
   클러스터링 알고리즘(clustering algorithm)을 사용하여 상기 현미경 이미지의 이미지 픽셀을 기질 및 비-기질 픽셀로 분할하는 단계; 및
   상기 이미지 내의 기질 픽셀의 분율을 계산하는 단계; 및
   상기 기질 픽셀의 분율이 미리결정된 기질 백분율을 초과하는지 여부를 결정하는 단계에 의해서 수행되는 것인 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 클러스터링 알고리즘의 사용이 상기 이미지 픽셀을 2개의 가우스 곡선에 맞추는 단계를 포함하고, 하나의 가우스 곡선은 기질에 대응하고 하나는 상기 이미지의 비-기질 영역에 대응하는 것인 방법.
4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 클러스터링 알고리즘을 사용하는 단계를 수행하기 전에 상기 캡쳐된 현미경 이미지를 색상-채도-명도 컬러 좌표로 변환하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 클러스터링 알고리즘을 사용하는 단계가 상기 이미지 픽셀의 색상 값을 2개의 가우스 곡선에 맞추는 단계를 포함하고, 하나의 가우스 곡선은 기질에 대응하고 하나는 상기 이미지의 비-기질 영역에 대응하는 것인 방법.
6. 청구항 4에 있어서, 상기 캡쳐된 이미지는 헤모톡실린(Haemotoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 가지는 것이고, 하기를 더 포함하는 것인 방법;
   상기 캡쳐된 이미지를 헤모톡실린으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 이미지 및 헤모톡실린 또는 에오신으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지로 변환하는 단계;
   제1 미리결정된 수준 이하의 채도 및 상기 이미지의 배경에 대응하는 제2 미리결정된 명도 이하의 명도를 갖는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지에서 픽셀의 배경 마스크(mask)를 계산하는 단계; 및
   상기 표준화된 헤모톡실린 이미지를 회색으로 변환하여 회색-변환된 이미지를 얻음으로써 결합 조직 마스크를 계산하는 단계;
   여기서 클러스터링 알고리즘을 사용하는 단계는 클러스터링 알고리즘 을 사용하여 및 상기 회색 변환된 이미지에 대한 임계처리를 하여 결합 조직의 픽셀을 확인한다.
7. 청구항 2 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 미리결정된 기질 백분율은 30% 내지 70%인 방법.
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 배수성 측정은
   핵이 유리되고 DNA 특이적 염색으로 염색되도록 조직의 시료를 준비하는 단계;
   핵 표본의 현미경 이미지를 캡쳐하는 단계,
   상기 캡쳐된 이미지에서 이미지를 분할하여 핵을 확인하는 단계;
   복수의 핵 각각에 대하여, 통합된 광학 밀도를 얻는 단계; 및
   시료에 대해 DNA 배수성 분류를 결정하는 단계에 의해서 수행되는 것인 방법.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 기질 유형 및 배수성 유형으로부터 재발없는 생존기간(relapse-free survival) 군을 계산하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 기질 유형 높은 기질 및 비-이배체의 배수성 유형의 시료를 고위험으로 분류하고, 기질 유형 낮은 기질 및 배수성 유형 이배체의 시료가 저위험을 나타내는 것이며, 낮은 기질의 기질 유형 및 비-이배체 유형의 배수성 유형 또는 높은 기질의 기질 유형 및 이배체의 배수성 유형을 갖는 시료가 중간수준의 위험을 나타내는 것인 방법.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 조직 시료가 암 조직 유래인 것인 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 암 조직이 전립선 조직, 대장 조직 또는 직장 조직인 것인 방법.
13. 컴퓨터가 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하도록 적용된 컴퓨터 프로그램 제품.
14. 캡쳐된 현미경 이미지를 색상-채도-명도 컬러 좌표로 변환하는 단계;
    이미지 픽셀의 색상 값을 하나의 가우스 곡선은 기질에 대응하고 하나는 상기 이미지의 비-기질 영역에 대응하는 2개의 가우스 곡선에 맞추어 현미경 이미지의 이미지 픽셀을 기질 및 비-기질 픽셀로 분할하는 단계; 및
    상기 이미지에서 기질 픽셀의 분율을 계산하는 단계에 의해 염색된 조직 단편의 캡쳐된 현미경 이미지로부터 조직에서 기질의 백분율을 측정하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 시료가 미리결정된 기질 백분율 이상인 기질의 백분율을 갖는 높은 기질 유형 또는 최대로 잡아야 미리결정된 기질 백분율인 기질의 백분율을 갖는 낮은 기질 유형인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
16. 캡쳐된 이미지를 헤모톡실린으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 이미지 및 헤모톡실린 또는 에오신으로 염색된 이미지의 영역을 나타내는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지로 변환하는 단계;
    제1 미리결정된 수준 이하의 채도 및 상기 이미지의 배경에 대응하는 제2 미리결정된 수준 이하의 명도를 갖는 표준화된 헤모톡실린 및 에오신 이미지에서 픽셀의 배경 마스크를 계산하는 단계;
    표준화된 헤모톡실린 이미지를 회색으로 변환하여 회색-변환된 이미지를 얻는 단계;
    클러스터링 알고리즘을 사용하여 및 상기 회색 변환된 이미지에 대한 임계처리를 하여 결합 조직의 픽셀을 확인하는 결합 조직 마스크를 얻는 단계 및
    배경 마스크에 의해 확인된 배경을 제외한 이미지에서 결합 조직 마스크에 의해 확인된 결합 조직의 백분율로부터 기질의 백분율을 얻는 단계에 의해 염색된 조직 단편의 캡쳐된 현미경 이미지로부터 조직에서 기질의 백분율을 측정하는 방법.
    
    
    
    

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