KR20170131671A - 킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포용 배지 - Google Patents
킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포용 배지 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진하는, 킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포용 배지, 및 당해 배지를 사용한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 배양 방법 등을 제공한다.
Description
본 발명은, 킬레이트화철을 포함하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포용 배지, 및 당해 배지를 사용한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 배양 방법 등에 관한 것이다.
신경 줄기세포는, 자기 복제능을 갖고, 다분화능(multipotency)을 갖는 미분화한 세포이고, 신경계의 다양한 세포(신경세포 및 신경 전구세포(neural progenitor) 및 글리아(glia) 세포(아스트로사이트(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 등) 및 글리아 전구세포 등)을 만들어내는 능력을 가진 세포이다. 신경 줄기세포 및 신경 전구세포는, 신경세포 등의 통상 성체에서 증식하기 어려운 세포를 공급할 수 있기 때문에, 재생 의료에서의 생체 재료의 제공원으로서 주목을 모으고 있으며, 근위축성 측색 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 난치성 신경 질환이나 신경 손상에 대한 치료 응용에 대한 기대가 모아지고 있다. 이러한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 사용한 난치성 신경 질환이나 신경 손상에 대한 치료, 및 이들 치료법의 개발 연구 등에는, 다량의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 필요로 하기 때문에, 시험관내(in vitro)에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법의 개발 및 개량은 중요한 과제 중 하나이다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법으로서는, 지금까지 몇가지의 방법이 보고되어 있다.
비특허문헌 1에는, 신경 줄기세포의 시험관내에서의 배양 방법으로서, 뉴로스피어(neurosphere) 배양이 기재되어 있다. 당해 문헌에서는, 상피세포 성장 인자(EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함하는 무혈청 배지 중에서 신경 줄기세포를 부유 배양함으로써, 신경 줄기세포의 미분화 상태를 유지하고 다분화능을 유지한 채로 증식시키는 것이 가능한 것이 나타나 있다.
또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 접착 단층 배양하는 방법으로서는, 라미닌, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 등의 기질로 코팅된 배양기 위에서, EGF 및/또는 bFGF를 포함하는 배지를 사용하여 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 방법 등이 열거된다(비특허문헌 2).
상기의 접착 단층 배양에 있어서는, 신경 줄기세포는 대칭 분열을 행하여, 자기 복제하는 것이 보고되어 있고, 뉴로스피어 배양과 비교하여 균일한 세포 집단을 제공 가능하다는 이점을 갖는다.
이들 배양 방법은 신경 줄기세포 및 신경 전구세포를 시험관내에서 배양할 수 있다는 큰 이점을 갖지만, 세포의 증식이 늦어 배양에 시간이 걸린다는 결점이있다. 따라서, 신경 줄기세포나 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 증식을 촉진시키기 위한, 개량된 배지 및 배양 조건의 개발이 요망된다.
그런데, 철 결합성 단백질을 포함하는 배지에 대하여, 지금까지 몇 가지 기재가 이루어지고 있다. 비특허문헌 3에는, 래트의 신생아 뇌의 한 부위 SVZ 내의 올리고덴드로사이트 전구세포의 증식에 아포-트랜스페린(철과 결합되어 있지 않은 트랜스페린)이 중요하다고 보고되어 있다. 비특허문헌 4에는, 아포-트랜스페린, EGF 및 FGF2(bFGF)가 배아성(胚性) 래트 대뇌 피질에서의 뉴로스피어 형성에 중요한 것이 보고되어 있다. 또한, 인슐린과 아포-트랜스페린을 혼합하면 뉴로스피어의 사이즈가 커지는 것이 보고되어 있다. 또한, 특허문헌 1에는, 동물 세포 배양용의 배지에 트랜스페린의 대체물로서, 헤모글로빈의 재조합체(recombinant)나 단편(fragment)을 사용하는 방법이 개시되어 있다.
하지만, 신경 줄기세포의 미분화성 및 다분화능의 유지나 증식 촉진에 킬레이트화철이 미치는 영향에 대해서는 전혀 밝혀져 있지 않다.
비특허문헌 1: Science, 1992, 255(5052), 1707-10.
비특허문헌 2: PLoS Biology, 2005, 3(9), e283
비특허문헌 3: ASN Neuro, 2013, 5(1), e00107
비특허문헌 4: J Neurosci Res, 2008, 86(8), 1884-94
본 발명의 목적은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 배지를 제공하는 것이며, 또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 다능성 줄기세포 등으로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하는 배지의 제공, 및 다능성 줄기세포 등으로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 킬레이트화철이, 신경 줄기세포의 미분화성 및 다분화능의 유지 및 증식 촉진에 작용하는 것, 다능성 줄기세포로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같은 것이다.
[1] 킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포용 배지.
[2] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진용인, 상기 [1]에 기재된 배지.
[3] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지용인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 배지.
[4] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[5] 킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 유도용 배지.
[6] 다능성 줄기세포로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하기 위한 배지인, 상기 [5]에 기재된 배지.
[7] 킬레이트화철의 함유량이 3 내지 7ppb인, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[8] 킬레이트화철이 철 결합성 단백질과 결합된 철인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[9] 킬레이트화철이 철 킬레이트제와 결합된 철인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[10] 킬레이트화철이, 트랜스페린, 락토페린, 헤모글로빈, 페리틴, 디페록사민, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 피트산, 니트릴로트리아세트산(NTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), L-글루타민산디아세트산(GLDA), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 글리콜에테르디아민테트라아세트산(GEDTA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 하이드록시에틸이미노디아세트산(HIDA), 디하이드록시에틸글리신(DHEG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종과 결합된 철인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[11] 킬레이트화철의 적어도 1종이 트랜스페린과 결합된 철인, 상기 [10]에 기재된 배지.
[12] 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.5μg/ml 이상 6.5μg/ml 이하인, 상기 [11]에 기재된 배지.
[13] 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.1μg/ml 이상 1.8μg/ml 이하인, 상기 [11]에 기재된 배지.
[14] 킬레이트화철의 적어도 1종인, 디페록사민, 시트르산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 결합된 철인, 상기 [10]에 기재된 배지.
[15] 무혈청 배지인, 상기 [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 배지.
[16] 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 포함하는, 상기 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[17] 배지 중의 bFGF량이 10ng/ml 이상 200ng/ml 이하인, 상기 [16]에 기재된 배지.
[18] 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법.
[19] 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식시키는 방법.
[20] 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 방법.
[21] 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 상기 [18] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[22] 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하는 방법.
[23] 다능성 줄기세포로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로 유도하는 방법인, 상기 [22]에 기재된 방법.
[24] 킬레이트화철의 함유량이 3 내지 7ppb인, 상기 [18] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[25] 킬레이트화철이 철 결합성 단백질과 결합된 철인, 상기 [18] 내지 [24] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[26] 킬레이트화철이 철 킬레이트제와 결합된 철인, 상기 [18] 내지 [24] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[27] 킬레이트화철이, 트랜스페린, 락토페린, 헤모글로빈, 페리틴, 디페록사민, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 피트산, 니트릴로트리아세트산(NTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), L-글루타민산디아세트산(GLDA), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 글리콜에테르디아민테트라아세트산(GEDTA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 하이드록시에틸이미노디아세트산(HIDA), 디하이드록시에틸글리신(DHEG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종과 결합된 철인, 상기 [18] 내지 [24] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[28] 킬레이트화철의 적어도 1종이 트랜스페린과 결합된 철인, 상기 [27]에 기재된 방법.
[29] 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.5μg/ml 이상 6.5μg/ml 이하인, 상기 [28]에 기재된 방법.
[30] 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.1μg/ml 이상 1.8μg/ml 이하인, 상기 [28]에 기재된 방법.
[31] 킬레이트화철의 적어도 1종이 디페록사민, 시트르산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 결합된 철인, 상기 [27]에 기재된 방법.
[32] 상기 [1] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하는 배양 조성물.
본 발명에 의하면, 미분화성 다분화능을 유지한 채로 장기간에 효율적으로 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양을 행하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의하면, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 효율적으로 유도하는 것이 가능해진다. 그 결과, 배양에 의해 다량의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 얻는 것이 가능해진다. 또한, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 드는 비용을 삭감하는 것이 가능해진다.
도 1은, 홀로트랜스페린을 첨가한 배지 중에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식을 나타낸다. 세로축은 세포수, 가로축은 배지 중에 포함되는 홀로트랜스페린의 최종 농도(μg/ml)이다. 배지 중의 홀로트랜스페린 농도가 1.0 내지 5.0μg/ml일 때에, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 양호한 증식을 나타내었다.
도 2는, 홀로트랜스페린 함유량이 2.5μg/ml인 배지 중에서 배양한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포에서의 면역 염색의 결과를 나타낸다. 네스틴(녹색) 양성 및 SOX2(적색) 양성의 신경 줄기세포, 및 네스틴 양성 SOX2 음성의 신경 전구세포가 다수 관찰되었다.
도 3은, 홀로트랜스페린 함유량이 2.5μg/ml인 배지 중에서 배양한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화 유도를 행하고, 분화 유도 후의 세포에 대한 면역 염색의 결과를 나타낸다. 분화 유도 후의 배양 접시에는 신경세포 마커 βIII 튜뷸린(녹색) 양성 세포가 관찰되었다.
도 2는, 홀로트랜스페린 함유량이 2.5μg/ml인 배지 중에서 배양한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포에서의 면역 염색의 결과를 나타낸다. 네스틴(녹색) 양성 및 SOX2(적색) 양성의 신경 줄기세포, 및 네스틴 양성 SOX2 음성의 신경 전구세포가 다수 관찰되었다.
도 3은, 홀로트랜스페린 함유량이 2.5μg/ml인 배지 중에서 배양한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화 유도를 행하고, 분화 유도 후의 세포에 대한 면역 염색의 결과를 나타낸다. 분화 유도 후의 배양 접시에는 신경세포 마커 βIII 튜뷸린(녹색) 양성 세포가 관찰되었다.
본 발명은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진하는 배지, 및 다능성 줄기세포 등으로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 효율화시키는 배지(이하, 이들을 통칭하여 본 발명의 배지라고도 함)를 제공한다. 또한 본 발명은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 미분화성, 다분화능을 유지하고, 분화를 억제시킨 채로 장기간에 효율적으로 배양하는 방법, 및 다능성 줄기세포 등으로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 효율적으로 유도하는 방법(이하, 이들을 통칭하여 본 발명의 방법이라고도 함)을 제공한다.
(1) 킬레이트화철
본 명세서 중, 킬레이트화철이란, 철 킬레이트제와 결합된 철, 또는 철 결합성 단백질과 결합된 철을 가리킨다.
킬레이트(chelate)란, 복수의 배위좌를 갖는 배위자(다좌 배위자)에 의한 금속 이온으로의 결합(배위)을 말한다. 킬레이트화란, 배위자가 갖는 2개 이상의 배위 원자가, 동시에 하나의 이온 또는 원자에 배위하여 환상 화합물을 형성하는 것을 가리킨다. 배위란, 전자쌍 공여체로부터 전자쌍 수용체로의 전자의 공여를 말하며, 배위에 의해 생긴 결합을 배위 결합이라고 한다. 배위자(ligand)란 금속에 배위하는 화합물을 가리킨다. 배위자는 고립 전자쌍을 갖는 기를 갖고 있고, 이 기가 금속과 배위 결합한다. 배위자 중, 복수의 배위기를 갖는 배위자를 다좌 배위자라고 한다. 배위 원자란, 배위자를 구성하는 원소 중에서 금속과 직접 결합하는 원자를 가리킨다.
킬레이트 착체란, 다좌 배위자와 금속이 결합하여 형성된 환상의 화합물을 가리킨다. 킬레이트 착체는 배위자가 복수의 배위기를 갖고 있고, 배위하고 있는 물질로부터 분리하기 어렵다.
또한, 철과 착체을 형성할 수 있는 물질로서, 단백질 이외의 물질을 철 킬레이트제라고 부르고, 철과 착체를 형성할 수 있는 단백질을 철 결합성 단백질이라고 부른다.
본 명세서 중, 철 킬레이트제와 결합된 철, 또는 철 결합성 단백질과 결합된 철은, 각각, 철 킬레이트제와 철 킬레이트 착체를 형성하고 있는 철, 또는 철 결합성 단백질과 철 킬레이트 착체를 형성하고 있는 철을 의미한다.
본 발명에 사용되는 킬레이트화철은, 철 킬레이트제와 결합된 철이라도 좋고, 철 결합성 단백질과 결합된 철이라도 좋고, 철 킬레이트제와 결합된 철과 철 결합성 단백질과 결합된 철의 조합이라도 좋다. 본 발명에 사용되는 킬레이트화철은, 1종류의 킬레이트화 철로 이루어져도 좋고, 복수 종류의 킬레이트화철로 이루어져도 좋다.
본 발명의 일 실시형태로서, 킬레이트화철은, 철 킬레이트 착체를 배지에 첨가함으로써 배지 중에 제공된다. 또 다른 실시형태로서는, 킬레이트화철은, 철과 착체를 형성하고 있지 않은 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과, 철 공급원을 각각 배지에 첨가함으로써, 배지 중에 제공된다. 본 명세서 중, 철 공급원이란, 착체를 형성하고 있지 않은 철로서, 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과 착체를 형성할 수 있는 철을 가리킨다. 철 공급원은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 제1 철(ferrous, Fe2+)이라도 좋고, 제2 철(ferric, F33+)이라도 좋다. 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과 철 공급원을 따로따로 배지에 첨가할 경우, 철 공급원은 수용성인 것이 바람직하다. 철 공급원의 예로서는, 황산철, 염화철, 헥사시아노철 칼륨이 열거되지만 이들에 한정되지 않는다. 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과 철 공급원은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한, 동시에 첨가해도 좋고, 각각 따로 첨가해도 좋다. 또한, 킬레이트화철은, 배지에 원래 포함되는 철 공급원과, 첨가한 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 실시형태로서는, 킬레이트화철은, 미리 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과 철 공급원으로부터 착체를 형성시키고, 당해 착체를 배지 중에 첨가함으로써, 배지 중에 제공된다.
철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과 철 공급원을 따로따로 배지에 첨가할 경우, 본 발명의 배지에 첨가되는 철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질의 양, 및 철 공급원의 양은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 배지 중의 킬레이트화철량이 3 내지 7ppb, 바람직하게는 4 내지 6ppb가 되도록 조절할 수 있다.
철 킬레이트제 또는 철 결합성 단백질과 철 공급원으로부터 미리 착체를 형성시키고, 당해 착체 배지에 첨가하는 경우, 본 발명의 배지에 포함되는 킬레이트화철의 양은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 3 내지 7ppb, 바람직하게는 4 내지 6ppb이다. 배지 중의 킬레이트화철의 양은, 예를 들어 질량 분석 등의 자체 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다. 배지 중의 킬레이트화철의 양은, 예를 들어, 실시예에 기재된 방법에 준하여, 유도 결합 플라즈마 질량 분석 장치를 사용하여 고분자체의 철량을 측정함으로써 측정할 수 있다.
배지 중의 킬레이트화철의 양이 너무 적으면, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식이 촉진되지 않는다. 또한, 배지 중의 킬레이트화철의 양이 너무 많아도, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식이 촉진되지 않는다.
철 킬레이트제의 예로서는, 디페록사민(deferoxamine), 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid), 피트산(phytic acid), 니트릴로트리아세트산(NTA; Nitrilotriacetic acid), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA; Diethylene Triamine Pentaacetic Acid), L-글루타민산디아세트산(GLDA; glutamate diacetate), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA; Hydroxyethyl Ethylene Diamine Triacetic Acid), 글리콜에테르디아민테트라아세트산(GEDTA; Glycol Ether Diamine Tetraacetic Acid), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA; Triethylenetetramine-N,N,N',N'',N''',N'''-hexaacetic acid), 하이드록시에틸이미노디아세트산(HIDA; Hydroxyethyl Imino Diacetic Acid), 디하이드록시에틸글리신(DHEG; Dihydroxyethyl Glycine) 등이 열거된다.
철 킬레이트제로서, 디페록사민(N-(5-aminopentyl)-N-hydroxy-N'-[5-(N-hydroxy-3-{[5-(N-hydroxyacetamido)pentyl]carbamoyl}propanamido)pentyl]butane
diamide)를 사용하는 경우, 디페록사민은 디페록사민 및 이의 염, 및 디페록사민 유도체 및 이들의 염을 포함한다.
디페록사민의 입수법의 예로서는, 스트렙토마이세스속에 속하는 디페록사민 B 생산 균주, 예를 들어, 스트렙토마이세스 필로수스(Streptomyces pilosus; JCM4403, ATCC19797 등)을 배양함으로써 얻을 수 있는 것 외에, Proleg 등의 방법 (Helv Chim Acta, 45, 31, 1962)에 의해 합성하는 것도 가능하다.
디페록사민의 유도체의 예로서는, 포름알데히드디페록사민, 아세트아미도디페록사민, 프로필아미드디페록사민, 부틸아미드디페록사민, 벤조일아미드디페록사민, 석신아미드디페록사민, 메틸설포아미드디페록사민(Ihnat 등, J. Pharm Sci. 91: 1733-1741(2002)), 하이드록시에틸스타치디페록사민(Pedchenko 등, J. Neuroimmunol. 84: 188-197(1998)), 아미노옥시아세틸페리옥사민(Pochon 등, Int. J. Cancer. 43: 1188-1194(1989)) 등이 열거된다.
디페록사민의 염의 예로서는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 디페록사민메실산염(CAS No. 138-14-7), 디페록사민염산염(CAS No. 1950-39-6)이 열거된다. 디페록사민메실산염은, 노바르티스 파마(Novartis Pharma)등에서 시판되고 있는 것을 입수할 수도 있다.
철 킬레이트제로서, 디페록사민을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 디페록사민의 농도는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 너무 많으면 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 세포 주기를 저해하고 분화를 촉진시키기 때문에, 통상 약 25μg/ml 이하, 바람직하게는 약 10μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 10μg/ml 이하이고, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.1μg/ml 이상, 바람직하게는 약 1μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 1μg/ml 이상이다. 배지 중의 디페록사민 농도 범위는 약 0.1 내지 25μg/ml, 바람직하게는 약 1 내지 10μg/ml, 보다 바람직하게는 1 내지 10μg/ml이다. 본 명세서 중, 「약」이란 ±10%를 허용하는 의미로 사용한다.
철 킬레이트제로서 시트르산을 사용하는 경우, 시트르산은 시트르산 및 이의 염을 포함한다. 시트르산은 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다. 철 킬레이트제로서 시트르산을 사용하는 경우, 철 킬레이트 착체로서는, 예를 들어, 시트르산철(III)(Ferric citrate), 시트르산철(III)암모늄(Ammonium ferric citrate), 시트르산제1철나트륨(Sodium Ferrous Citrate) 등이 열거된다. 시트르산철암모늄은 공지의 화합물이며, 예를 들어, 수산화철(III)을 시트르산과 암모니아의 수용액에 첨가함으로써 제조할 수 있다. 또한, 시트르산철(III), 시트르산철(III)암모늄, 시트르산제1철나트륨은, Sigma-Aldrich Co. LLC 등에서 시판되고 있는 것을 입수할 수도 있다.
철 킬레이트제로서 시트르산을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 시트르산의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 30μg/ml 이하, 바람직하게는 약 3μg/ml 이하이고, 보다 바람직하게는 3μg/ml 이하이고, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.03μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0.3μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.3μg/ml 이상이다. 배지 중의 시트르산의 농도 범위는 약 0.03 내지 30μg/ml, 바람직하게는 약 0.3 내지 3μg/ml, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3μg/ml이다.
철 킬레이트제로서, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 사용하는 경우, EDTA는 EDTA 및 이의 염을 포함한다. EDTA는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
EDTA의 염으로서는, EDTA 2Na, EDTA 3Na, EDTA 4Na 등의 나트륨염, EDTA 2K, EDTA 3K 등의 칼륨염, 마그네슘염, 크롬산염, 나트륨칼슘염 등이 열거된다. 본 발명에 사용되는 EDTA의 염은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 나트륨염 또는 칼륨염이다.
철 킬레이트제로서 EDTA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 EDTA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 50μg/ml 이하, 바람직하게는 약 5μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이하이고, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.05μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0. 5μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5μg/ml 이상이다. 배지 중의 EDTA의 농도 범위는 약 0.05 내지 50μg/ml, 바람직하게는 약 0.5 내지 5μg/ml, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 피트산(phytic acid; myo-이노시톨-1,2,3,4,5,6-6인산) (CAS No. 83-86-3)를 사용하는 경우, 피트산 및 이의 염을 포함한다. 피트산은 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
철 킬레이트제로서 피트산을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 피트산의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 120μg/ml 이하, 바람직하게는 약 12μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 12μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.12μg/ml 이상, 바람직하게는 약 1.2μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 1.2μg/ml 이상이다. 배지 중의 피트산의 농도 범위는, 약 0.12 내지 120μg/ml, 바람직하게는 약 1.2 내지 12μg/ml, 바람직하게는 1.2 내지 12μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 니트릴로트리아세트산(NTA)을 사용하는 경우, 예를 들어, 니토릴로트리아세트산 및 이의 염을 포함한다. 니트릴로트리아세트산은 공지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다. 또한, CHELEST Corporation에서 판매되고 있는 NTA·3H(CAS No. 139-13-9) 등의 시판의 니트릴로트리아세트산을 사용할 수도 있다.
니트릴로트리아세트산의 염으로서는, 예를 들어, NTA·H·2Na(CAS No. 15467-20-6), NTA·3Na·H2O(CAS No. 5064-31-3), NTA·H·2(NH4 )가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. CHELEST Corporation에서 판매되고 있는, 킬레스트 3NTB(NTA·H·2Na), 킬레스트 NTA(NTA·3Na·H2O), 킬레스트 2NTA(NTA·3Na·H2O), 킬레스트 2NX-40(NTA·H·2(NH4)) 등을 사용할 수도 있다.
철 킬레이트제로서 NTA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 NTA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 30μg/ml 이하, 바람직하게는 약 3μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 3μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.03μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0.3μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.3μg/ml 이상이다. 배지 중의 NTA의 농도 범위는 약 0.03 내지 30μg/ml, 바람직하게는 약 0.3 내지 3μg/ml, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3μg/ml이다.
철 킬레이트제로서, DTPA를 사용하는 경우, DTPA는 DTPA 및 이의 염, 및 DTPA 유도체 및 이들의 염을 포함한다. DTPA는 공지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
DTPA의 유도체의 예로서는, 비에스테르 결합성 DTPA 유도체(일본 공개특허공보 특개평9-031037호), 테트라-알킬기-DTPA(일본 공개특허공보 특개2006-342105호) 등이 열거된다.
DTPA의 염의 예로서는 나트륨염이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용되는 DTPA의 염은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 나트륨염이다.
철 킬레이트제로서 DTPA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 DTPA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 40μg/ml 이하, 바람직하게는 약 4μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 4μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.04μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0. 4μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.4μg/ml 이상이다. 배지 중의 DTPA의 농도 범위는 약 0.04 내지 40μg/ml, 바람직하게는 약 0.4 내지 4μg/ml, 보다 바람직하게는 0.4 내지 4μg/ml이다.
철 킬레이트제로서, GLDA를 사용하는 경우, GLDA는 GLDA 및 이의 염, 및 GLDA 유도체 및 이들의 염을 포함한다. GLDA는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, GLDA는, 일본 공개특허공보 특개평6-59422호, 미국 특허 제2500019호 등에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있다.
GLDA의 염으로서는, 나트륨염 등의 알칼리 금속염, 암모늄염, 아민염 등이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는, GLDA의 염은 나트륨염이다.
철 킬레이트제로서 GLDA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 GLDA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 50μg/ml 이하, 바람직하게는 약 5μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.05μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0. 5μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5μg/ml 이상이다. 배지 중의 GLDA의 농도 범위는 약 0.05 내지 50μg/ml, 바람직하게는 약 0.5 내지 5μg/ml, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 HEDTA를 사용하는 경우, HEDTA는 HEDTA 및 이의 염, 및 HEDTA 유도체 및 이들의 염을 포함한다. HEDTA는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
HEDTA의 염으로서는, 나트륨염 등이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 HEDTA의 염은 3나트륨염(CAS No. 139-89-9)이다.
철 킬레이트제로서 HEDTA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 HEDTA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 50μg/ml 이하, 바람직하게는 약 5μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.05μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0.5μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5μg/ml 이상이다. 배지 중의 HEDTA의 농도 범위는 약 0.05 내지 50μg/ml, 바람직하게는 약 0.5 내지 5μg/ml, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 GEDTA를 사용하는 경우, GEDTA는 GEDTA 및 이의 염, 및 GEDTA 유도체 및 이들의 염을 포함한다. GEDTA는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
GEDTA의 염으로서는, 칼륨염, 나트륨염 등이 열거된다. GEDTA의 유도체의 예로서는, 8-아미노-2-[(2-아미노-5-메틸페녹시)메틸]-6-메톡시퀴놀린-N,N,N',N'-테트라아세트산(Org Biomol Chem. 2008 Jul 7; 6(13): 2361-8)이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 GEDTA의 염은 나트륨염이다.
철 킬레이트제로서 GEDTA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 GEDTA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 50μg/ml 이하, 바람직하게는 약 5μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.05μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0.5μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5μg/ml 이상이다. 배지 중의 GEDTA의 농도 범위는 약 0.05 내지 50μg/ml, 바람직하게는 약 0.5 내지 5μg/ml, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 TTHA를 사용하는 경우, TTHA는 TTHA 및 이의 염, 및 TTHA 유도체 및 이들의 염을 포함한다. TTHA는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
TTHA의 염으로서는 나트륨염 등이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 TTHA의 염은 나트륨염이다.
철 킬레이트제로서 TTHA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 TTHA의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 110μg/ml 이하, 바람직하게는 약 11μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 11μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.11μg/ml 이상, 바람직하게는 약 1.1μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 1.1μg/ml 이상이다. 배지 중의 TTHA의 농도 범위는 약 0.11 내지 110μg/ml, 바람직하게는 약 1.1 내지 11μg/ml, 보다 바람직하게는 1.1 내지 11μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 HIDA를 사용하는 경우, HIDA는 HIDA 및 이의 염, 및 HIDA 유도체 및 이들의 염을 포함한다. HIDA는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
HIDA의 염으로서는 나트륨염 등이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는 HIDA의 염은 2나트륨염이다.
철 킬레이트제로서 HIDA를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 HIDA의 농도는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 30μg/ml 이하, 바람직하게는 약 3μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 3μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.03μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0.3μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.3μg/ml 이상이다. 배지 중의 HIDA의 농도 범위는 약 0.03 내지 30μg/ml, 바람직하게는 약 0.3 내지 3μg/ml, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3μg/ml이다.
철 킬레이트제로서 DHEG를 사용하는 경우, DHEG는 DHEG 및 이의 염, 및 DHEG 유도체 및 이들의 염을 포함한다. DHEG는 주지의 화합물이며, 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
DHEG의 염으로서는 나트륨염 등이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 입수의 용이성 등의 관점에서 바람직하게는, DHEG의 염은 나트륨염이다.
철 킬레이트제로서 DHEG를 사용하는 경우, 배지에 포함되는 DHEG의 농도는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 30μg/ml 이하, 바람직하게는 약 3μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 3μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.03μg/ml 이상, 바람직하게는 약 0.3μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.3μg/ml 이상이다. 배지 중의 DHEG의 농도 범위는 약 0.03 내지 30μg/ml, 바람직하게는 약 0.3 내지 3μg/ml, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3μg/ml이다.
철 결합성 단백질의 예로서는, 트랜스페린, 락토페린, 헤모글로빈, 페리틴 등이 열거되지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 철 결합성 단백질은 트랜스페린, 락토페린, 헤모글로빈, 페리틴이다. 철 결합성 단백질은 철 결합 부위를 포함하는 단편이라도 좋다. 철 결합성 단백질은 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다.
본 발명에 사용되는 철 결합성 단백질은, 예를 들어, 마우스(mouse), 래트(rat), 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목(carnivora), 사람, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등 유래의 철 결합성 단백질이며, 바람직하게는, 배양하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포와 동종의 동물 유래의 철 결합성 단백질이다.
본 발명에 사용되는 철 결합성 단백질은, 천연의 철 결합성 단백질이라도 좋고, 비천연이라도 좋다. 철 결합성 단백질은, 생체, 생세포 등이 천연에서 갖는 유전자로부터 발현된 철 결합성 단백질을 단리 정제한 철 결합성 단백질이라도 좋고, 유전자 재조합 기술에 의해 미생물, 세포 또는 동식물 등에 의해 생산시킨 것으로부터 단리 정제한 재조합체(recombinant)의 철 결합성 단백질이라도 좋다.
철 결합성 단백질로서, 트랜스페린을 사용하는 경우, 킬레이트화철은, 바람직하게는, 트랜스페린과 철이 결합된 철 킬레이트 착체인 홀로트랜스페린으로서 배지 중에 제공된다. 철과 결합된 트랜스페린은 홀로트랜스페린, 철과 결합되어 있지 않은 트랜스페린은 아포트랜스페린이라고 불린다.
본 명세서 중, 홀로트랜스페린은, 아포트랜스페린 1분자와 철 이온 하나가 결합된 분자, 및 아포트랜스페린 1분자와 철 이온 2개가 결합된 분자를 포함한다.
본 명세서 중, 아포트랜스페린 1분자와 철 이온 하나가 결합된 분자, 및 아포트랜스페린 1분자와 철 이온 2개가 결합된 분자를 총칭하여 철 적재형 트랜스페린(iron-laden transferrin)이라고 칭한다. 배지 등의 용액 중에서 철 적재형 트랜스페린과, 철과 결합되어 있지 않은 아포트랜스페린을 엄밀하게 구별하는 것은 곤란하기 때문에, 당해 기술 분야의 관례에 따라, 본 명세서 중에서도, 상기의 철 적재형 트랜스페린 및 철 이온이 결합되어 있지 않은 아포트랜스페린의 혼합물에 대해서도 홀로트랜스페린이라고 칭한다.
본 발명에 있어서, 홀로트랜스페린의 철 함유량은 200μg/g 내지 1400μg/g이다. 홀로트랜스페린의 철 함유량은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상, 입수의 용이성 등의 관점에서, 200μg/g 내지 500μg/g인 것이 바람직하다. 혈청 중의 트랜스페린과 철 함유량이 가깝다는 관점에서, 철 함유량이 200μg/g 내지 500μg/g인 것이 보다 바람직하다.
사람 트랜스페린을 코드하는 핵산 배열로서는 NM_001063(NCBI Accession No.)이 사람 트랜스페린의 아미노산 배열로서는 NP_001054가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
철 킬레이트 착체로서, 홀로트랜스페린을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 홀로트랜스페린의 농도는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 배지 중의 킬레이트화철량이 3 내지 7ppb, 바람직하게는 4 내지 6ppb가 되는 홀로트랜스페린의 농도인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 배지 중의 홀로트랜스페린의 농도는 하기와 같다.
철 킬레이트 착체로서, 홀로트랜스페린을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 트랜스페린의 농도는, 사용되는 홀로트랜스페린의 철 함유량에 의해서도 적절히 증감할 수 있고, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 0.1 내지 6.5μg/ml, 보다 바람직하게는 0.3 내지 6.5μg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 6.5μg/ml, 더욱 바람직하게는 1 내지 5μg/ml, 보다 더 바람직하게는 2.5 내지 5μg/ml이다. 또한, 「배지에 포함되는 트랜스페린의 농도」(또는 「트랜스페린의 배지 중의 함유량」)란, 배지 중의 철 적재형 트랜스페린의 농도와 철 이온이 결합되어 있지 않은 아포트랜스페린의 농도의 합계를 가리킨다.
보다 상세하게는, 철 함유량이 높은 홀로트랜스페린(예를 들어 철 함유량이 1100 내지 1400μg/g)을 사용하는 경우, 상기의 값보다 더 저농도인 트랜스페린을 사용해도 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있고, 통상 2.0μg/ml 이하, 바람직하게는 1.8μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 1.4μg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 1.3μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 0.1μg/ml 이상, 바람직하게는 0.2μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.3μg/ml 이상이다. 철 함유량이 높은 트랜스페린(예를 들어 철 함유량이 1100 내지 1600μg/g)을 사용하는 경우, 배지 중의 트랜스페린의 농도 범위는 0.1 내지 2.0μg/ml, 바람직하게는 0.1 내지 1.8μg/ml, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 1.4μg/ml, 보다 더 바람직하게는 0.3 내지 1.3μg/ml이다.
한편, 혈청으로부터 분리된 홀로트랜스페린 등의, 철 함유량이 낮은 홀로트랜스페린(예를 들어 철 함유량이 200 내지 500μg/g)을 사용하는 경우, 배지 중의 트랜스페린량은 통상 약 6.5μg/ml 이하, 바람직하게는 약 5μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이하, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.5μg/ml 이상, 바람직하게는 약 1μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 1μg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 약 2.5μg/ml 이상, 보다 더 바람직하게는 2.5μg/ml 이상이다. 예를 들어 철 함유량이 낮은 홀로트랜스페린(예를 들어 철 함유량이 200 내지 500μg/g)을 사용하는 경우, 배지 중의 트랜스페린의 농도 범위는 0.5 내지 6.5μg/ml, 바람직하게는 약 1 내지 5μg/ml, 바람직하게는 1 내지 5μg/ml, 더욱 바람직하게는 약 2.5 내지 5μg/ml, 보다 더 바람직하게는 2.5 내지 5μg/ml이다.
상기 조건을 달성함으로써, 원하는 배지 중의 킬레이트화철량을 가져올 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
홀로트랜스페린의 철 함유량은, 예를 들어 홀로트랜스페린을 적당한 용매에 현탁시키고, SEC-ICP-MS에 의해 용매 중의 고분자체의 철량을 측정하고, 트랜스페린 단백질 1g당의 철량을 계산함으로써 측정할 수 있다.
예를 들어, 상기 철 킬레이트 착체로서 홀로트랜스페린을 사용하는 경우, 시판의 시약(Sigma Aldrich)을 사용할 수 있다.
철 결합성 단백질로서 락토페린을 사용하는 경우, 사람 락토페린을 코드하는 핵산 배열로서는 M83202, M93150, U07643이, 사람 락토페린의 아미노산 배열로서는 AAA59511이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
철 결합성 단백질로서 락토페린을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 락토페린의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 10μg/ml 이하, 바람직하게는 약 5μg/ml 이하이고, 보다 바람직하게는 5μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 1μg/ml 이상, 바람직하게는 약 2.5μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 2.5μg/ml 이상이다. 배지 중의 락토페린의 농도 범위는 약 1 내지 10μg/ml, 바람직하게는 약 2.5 내지 5μg/ml, 바람직하게는 2.5 내지 5μg/ml이다.
철 결합성 단백질로서 헤모글로빈을 사용하는 경우, 헤모글로빈은 α 서브유닛, β 서브유닛, ε 서브유닛, γ 서브유닛(γ-G 서브유닛 또는 γ-A 서브유닛), 또는 δ 서브유닛의 단량체라도 좋고, 2개의 α 서브유닛과 2개의 β 서브유닛으로 구성되는 4량체, 2개의 α 서브유닛과 2개의 δ 서브유닛으로 구성되는 4량체 등이라도 좋다. 또한, 헤모글로빈은 산소와 결합된 옥시헤모글로빈(산소화 헤모글로빈)(oxyhemoglobin)이라도 좋고, 산소와 결합되어 있지 않은 디옥시헤모글로빈(환원 헤모글로빈)(deoxyhemoglobin)이라도 좋다.
헤모글로빈 α 서브유닛을 코드하는 핵산 배열로서는 NM_000558, NM_000517이, 사람 헤모글로빈 α 서브유닛의 아미노산 배열로서는 NP_000549, NP_000508이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
헤모글로빈 β 서브유닛을 코드하는 핵산 배열로서는 NM_000518이, 사람 헤모글로빈 β 서브유닛의 아미노산 배열로서는 NP_000509가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
헤모글로빈 δ 서브유닛을 코드하는 핵산 배열로서는 NM_000519이, 사람 헤모글로빈 δ 서브유닛의 아미노산 배열로서는 NP_000510이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
헤모글로빈 γ 서브유닛을 코드하는 핵산 배열로서는 NM_000184가, 사람 헤모글로빈 γ 서브유닛의 아미노산 배열로서는 NP_000175가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
철 결합성 단백질로서 헤모글로빈을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 헤모글로빈의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 8μg/ml 이하, 바람직하게는 약 4.8μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 4.8μg/ml 이하이고, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 0.8μg/ml 이상, 바람직하게는 약 3.2μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 3.2μg/ml 이상이다. 배지 중의 헤모글로빈의 농도 범위는 약 0.8 내지 8μg/ml, 바람직하게는 약 3.2 내지 4.8μg/ml, 바람직하게는 3.2 내지 4.8μg/ml이다.
철 결합성 단백질로서 페리틴을 사용하는 경우, 사람 페리틴을 코드하는 핵산 배열로서는 NM_000146(경쇄), NM_002032(중쇄), NM_177478(미토콘드리아)가, 사람 페리틴의 아미노산 배열로서는 NP_000137(경쇄), NP_002023(중쇄), NP_803431 (미토콘드리아)가 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
철 결합성 단백질로서 페리틴을 사용하는 경우, 배지에 포함되는 페리틴의 농도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 통상 약 50μg/ml 이하, 바람직하게는 약 30μg/ml 이하, 보다 바람직하게는 30μg/ml 이하이며, 너무 적으면 원하는 효과를 얻을 수 없기 때문에 통상 약 5μg/ml 이상, 바람직하게는 약 20μg/ml 이상, 보다 바람직하게는 20μg/ml 이상이다. 배지 중의 페리틴의 농도 범위는 약 5 내지 50μg/ml, 바람직하게는 약 20 내지 30μg/ml, 보다 바람직하게는 20 내지 30μg/ml이다.
(2) 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포
본 명세서 중, 신경 줄기세포란, 신경계 세포(신경세포 및 글리아 세포(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등), 및 이들의 전구세포)로의 다분화능(multipotency)을 유지하고, 자기 복제능을 갖는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로는, 신경 줄기세포란, 신경세포 및 글리아 세포(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등)을 최종적으로 산출하는 능력을 가지며, 또한, 초기화 등의 특별한 조작을 가하지 않는 한에서, 표피계 세포, 혈구계 세포, 근육 세포 등의 신경계 이외의 세포를 실질적으로 산출하지 않는 세포이다. 실질적으로 산출하지 않는다란, 신경 줄기세포가 산출하는 세포 중, 90% 이상이, 신경세포 및 글리아 세포(아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등), 및 이들의 전구세포 중 어느 하나인 상태를 가리킨다.
본 명세서 중, 신경 전구세포(neural progenitor)란, 분열능을 갖는 미분화된 세포로서, 1종 이상의 신경세포로 최종적으로 분화하는 능력을 갖는 세포를 가리킨다. 신경 전구세포는, 신경세포를 최종적으로 산출하도록 운명이 결정되고, 또한 신경세포 및 그 전구세포 이외를 실질적으로 산출하지 않는 세포를 가리킨다. 글리아 전구세포(glial progenitor)란, 신경 줄기세포에 유래하고, 분열능을 갖는 미분화된 세포로서, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아(microglia), 상의 세포(ependymal cell), 슈반 세포(Schwann cell) 중 어느 하나 또는 이들의 전구세포로 분화하는 능력을 갖고, 또한 신경세포로 실질적으로 분화하지 않는 세포를 가리킨다.
신경 줄기세포 및 신경 전구세포는 엄밀하게 구별하는 것이 곤란하기 때문에, 본 명세서 중 「신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포」로서 구별 없이 사용되는 경우가 있다.
본 발명에서는, 통상, 포유 동물 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 사용된다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목(carnivora), 사람, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 바람직하게는 마우스 등의 설치류 또는 사람 등의 영장류의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이며, 보다 바람직하게는 사람 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이다.
본 발명에 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 다능성 줄기세포 유래의 것, 생체 조직으로부터 분리한 것, 섬유아세포 등으로부터 다능성 줄기세포를 경유하지 않고 직접 분화 유도한 것(Stem Cells. 2012 Jun; 30(6): 1109-19) 등이 열거되고, 상기에 기재된 미분화성을 유지하고 다분화능을 유지하는 세포로서 신경세포를 산출하는 능력을 유지하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서 중, 다능성 줄기세포란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖는 미숙한 세포로서, 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 다능성 줄기세포의 예로서는, 배아성 줄기세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포)(Takahashi K 등, Cell. 2007 Nov 30; 131(5): 861-72), 정자 줄기세포(Kanatsu-Shinohara M 등, Biol Reprod. 2007 Jan; 76(1): 55-62), 배아성 생식세포(Matsui Y 등, Cell. 1992 Sep 4; 70(5): 841-7), 핵 이식에 의해 얻어진 클론 배아 유래의 ES 세포(Wakayama T 등, Science. 2001 Apr 27; 292(5517): 740-3) 등이 열거된다.
다능성 줄기세포 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 자체 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다. 다능성 줄기세포 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 제작하는 방법으로서는, 다능성 줄기세포의 부유 배양을 행하여 배엽체 형성을 경유하여 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 형성시키는 방법(Bain G 등, Dev Biol. 1995 Apr; 168(2): 342-57 등), 스토로마 세포(stromal cell) 등을 피더 세포(feeder cell)로서 사용하여 다능성 줄기세포를 배양하는 방법, bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 다능성 줄기세포의 부유 배양을 행하는 방법(Watanabe K 등, Nat Neurosci. 2005 Mar; 8(3): 288-96 등), SMAD 시그널 저해제 Noggin 및 SB431542의 존재 하에서 다능성 줄기세포(ES 세포 등)를 접착 배양하는 방법(Chambers SM 등, Nat Biotechnol. 2009 Mar; 27(3): 275-80), 단층 배양된 다능성 줄기세포(ES 세포 등)를 글리코겐 합성 키나제 3(GSK3: glycogen synthase kinase 3) 저해제, transforming growth factor β(TGF-β) 저해제, Notch 시그널 저해제 존재 하에 배양하는 방법(Li W 등, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 May 17; 108(20): 8299-304) 등이 열거된다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 ES 세포 또는 인공 다능성 줄기세포 유래이고, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기세포 유래이다.
세포가 신경 줄기세포인 것은, 예를 들어, 세포를 EGF 및 bFGF를 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 배양된 세포괴를 분산 처리 후에, 접착 배양을 행함으로써, 신경세포 및 글리아 세포로 분화 유도시킴으로써 확인할 수 있다.
또한, 신경 줄기세포는, 신경 줄기세포에서 발현하는 것이 알려져 있는 유전자, 이의 전사 산물, 단백질 등(신경 줄기세포 마커)에 의해 확인할 수도 있다.
신경 줄기세포 마커로서는, 세포 골격 단백질인 네스틴(Nestin; Science, 276, 66(1997)), SOX1(SRY(sex determining region Y)-box1), SOX2(SRY(sex determining region Y)-box2), Pax6(paired box 6), Ki67, 증식 세포핵 항원 (PCNA), 지방산 결합 단백질 7(Fabp7, BLBP라고도 함) 등이 알려져 있고, 당업자는, 이들 마커를 적절히 조합하여 원하는 신경 줄기세포인 것을 확인할 수 있다. 본 발명에 적합한 신경 줄기세포로서는, 예를 들어, SOX2 양성 및 네스틴 양성인 세포가 열거되지만, 이에 한정되지 않는다.
세포가 신경 전구세포인 것은, 예를 들어, 세포를 배양하여, 신경세포로 분화 유도시킴으로써 확인할 수 있다.
신경 전구세포에서 발현되는 유전자로서는, Tbr2(T-box brain protein 2), MASH1(Mammalian achaete-scute homolog 1), 네스틴 등이 열거된다. 본 발명에 적합한 신경 전구세포로서는, SOX2 음성 및 네스틴 양성인 세포가 열거되지만, 이에 한정되지 않는다.
분화된 신경세포의 마커의 예로서는, βIII 튜뷸린, MAP2(microtubule-associated protein) 등이 열거된다.
본 명세서 중, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 미분화 유지한다란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 분열 후에 형성하는 세포 중 1개 이상의 세포가 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 계속 유지하는 것, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화가 억제되어 있는 것, 또는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 분열하지 않고 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 계속 유지하는 것을 말한다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 분열 후에 형성하는 세포가, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서의 성질을 유지하고 있는지 여부는, 예를 들어, 상술한 마커에 의해 확인할 수 있다. 본 명세서 중, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화가 억제된다란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 산출하는 전체 세포 중, 분화된 세포(예를 들어 신경세포)가 차지하는 비율이 감소하는 것을 말한다. 분화의 억제는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로부터 신경세포 등으로의 분화 억제라도 좋다. 분화 억제되어 있는지 여부는, 예를 들어, 상술한 분화 마커(예를 들어 βIII 튜뷸린 등의 신경세포 마커)에 의해 확인할 수 있다.
일 형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 단리되어 있다. 「단리」란, 목적으로 하는 성분이나 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져서, 천연으로 존재하는 상태를 벗어나 있는 것을 의미한다. 「단리된 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포」의 순도(전체 세포수에서 차지하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 수의 백분율)는 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
(3) 본 발명의 배지
본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양용의 배지를 제공한다. 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지시켜, 증식을 촉진시키는 효과를 갖는다. 다른 실시형태로서, 본 발명의 배지는, 다능성 줄기세포로부터의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 효율화하는 작용을 갖는다. 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지시켜 증식을 촉진시키므로, 유도된 소수의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 효과적으로 증식시킬 수 있고, 그 결과, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 효율화할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지용이며, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진용이다. 다른 실시형태로서, 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도용이며, 다능성 줄기세포로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도용이다.
본 발명의 배지는, 킬레이트화철을 포함한다. 첨가하는 킬레이트화철에 대해서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 배지에 포함되는 킬레이트화철 이외의 성분에 대해서는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 통상의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용되는 조성을 적절히 채용할 수 있다.
본 발명의 배지는, 미분화성 및 다분화능을 갖는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식을 촉진하는 효과를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 배지는, SOX2 양성 네스틴 양성 및/또는 SOX2 음성 네스틴 양성인, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의, 증식을 촉진하는 효과를 갖는다.
본 명세서 중, 「본 발명의 배지가 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식을 촉진한다」란, 당해 배지 중에서 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 일정 기간(바람직하게는 4일 이상(예, 4 일간)) 배양했을 때에, 킬레이트화철을 함유하지 않은 것 이외에는 조성이 동일한 대조 배지 중에서 배양했을 때와 비교하여, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 수가 많은 것을 의미한다.
본 발명의 배지는, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제해도 좋다. 기초 배지로서는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다. 본 발명의 배지는, 줄기세포 배양용으로서 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제해도 좋다. 시판의 줄기세포 배양용의 기초 배지로서는, RHB 배지(StemCells, Inc), hESF-GRO 배지(니프로 가부시키가이샤), HESF-DIF 배지(니프로 가부시키가이샤), CSTI-7(가부시키가이샤 사이보 카가쿠 켄큐죠) 등이 열거된다.
본 발명에 사용되는 배지는, 화학적으로 미결정의 성분의 혼입을 회피하는 관점에서, 바람직하게는, 함유 성분이 화학적으로 결정된 배지(Chemically defined medium; CDM)이다.
혈청 중에는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화를 촉진하는 성분이 포함되므로, 본 발명의 배지는, 혈청 배지인 것이 바람직하다. 본 발명에서의 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않은 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, EGF, bFGF 등의 증식 인자)가 혼입되어 있는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 좋다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 혈청 알부민, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용해도 좋다. 이러한 시판의 혈청 대체물로서는, 예를 들어, KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies사 제조: 이하, KSR로 기재하는 경우도 있음.), Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies사 제조), GlutamaxTM(Life Technologies사 제조), B27(Life Technologies사)이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 배지는, 추가로 배지 첨가물을 함유해도 좋다. 배지 첨가물로서는, 비타민류, 글루타민 등의 비필수 아미노산, 사이토카인 및 성장 인자 등의 단백질, L-아스코르브산, 인산L-아스코르빌마그네슘, 피루브산나트륨, 2-아미노에탄올, 글루코오스, 탄산수소나트륨, HEPES, 인슐린, 프로게스테론, 셀렌산나트륨, 푸트레신 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 첨가물은 자체 공지의 농도 범위 내에서 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지는, 필수 아미노산(L-라이신, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-발린, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-트립토판)을 포함한다. 본 발명의 배지는 바람직하게는 L-세린, L-시스틴, 글리신, L-시스테인, L-프롤린, L-메티오닌, L-글루타민산, L-아스파라긴산 및 L-알라닌, L-글루타민, L-아르기닌, L-티로신, L-아스파라긴을 포함한다.
본 발명의 배지는, 이노시톨, 염화콜린, 엽산, D-판토텐산칼슘, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 나이아신아미드, 비타민 B12, 리보플라빈(비타민 B2), D-비오틴, D-글루코오스, 피루브산나트륨, 히포크산틴, 티미딘, 리포산, 푸트레신염산염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 배지 첨가물을 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상 포함한다.
본 발명의 배지를 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용하는 경우, 본 발명의 배지는, 바람직하게는 상피세포 성장 인자(EGF) 및/또는 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 포함하고, 보다 바람직하게는 bFGF를 포함한다.
본 발명에 있어서 배지 중의 bFGF의 양의 상한치는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 1000ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 500ng/ml 이하, 더욱 바람직하게는 200ng/ml 이하이다.
본 발명에 있어서 배지 중의 bFGF의 양의 하한치는, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1ng/ml 이상, 보다 바람직하게는 1ng/ml 이상, 더욱 바람직하게는 10ng/ml 이상이다.
본 발명에 있어서 배지 중의 bFGF의 양은, 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1ng/ml 내지 1000ng/ml, 보다 바람직하게는 1ng/ml 내지 500ng/ml, 더욱 바람직하게는 10ng/ml 내지 200ng/ml이다.
일 형태로서, 본 발명의 배지는, bFGF(최종 농도 10ng/ml 내지 200ng/ml)를 포함한다. 또한, 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화를 촉진시키는 효과를 갖는 물질(본 명세서 중, 신경 분화 촉진 물질이라고도 함)을 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다.
신경 분화 촉진 물질의 예로서는, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor), cAMP(Cyclic adenosine monophosphate), dbcAMP(dibutyryl cAMP), DAPT(tert-butyl(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]propanoyl]amino]-2-phenylacetate), compound E(N-[(1S)-2-[[(3S)-2,3-Dihydro-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-1H-1,4-b nzodiazepin-3-yl]amino]-1-methyl-2-oxoethyl]-3,5-difluorobenzeneacetamide), SU5402(2-[(1,2-Dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-4-methyl-1H-pyrrole-3-propanoic acid), SU6668(3-[2,4-dimethyl-5-[(E)-(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-1H-pyrrol-3-yl]propanoic acid; Orantinib; 3-[2,4-dimethyl-5-[(E)-(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl] -1H- pyrrol-3-yl]propanoic acid)가 열거된다.
신경 분화 촉진 물질을 실질적으로 포함하지 않는다란, 신경 분화 촉진 물질이 포함되어 있어도 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 분화를 촉진할 수 없는 양이고, 사용되는 신경 분화 촉진 물질의 종류에 따라 적절하게 설정된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 배지에 포함되는 신경 분화 촉진 물질의 농도는 0μM이다.
본 발명의 배지를 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도에 사용하는 경우, 본 발명의 배지는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 촉진하는 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 촉진하는 물질은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 유도 방법에 준하여 적절하게 선택된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 유도 방법은, 상기 다능성 줄기세포 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도 방법, 섬유아세포 등으로부터 직접 분화 유도하는 방법(Stem Cells. 2012 Jun; 30(6): 1109-19) 등이 열거된다.
본 발명의 배지는 지방산을 포함해도 좋다. 본 발명의 배지에 포함되는 지방산으로서는, 올레산, 리놀레산, α-리놀렌산, γ-리놀렌산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키돈산, 이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 부티르산, 아세트산, 팔미톨레산, 길초산(발레르산), 카프로산, 에난트산(헵틸산), 카프릴산, 펠라르곤산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 펜타데실산, 마르가르산, 쿠센산, 엘레오스테아르산, 아라키드산, 8,11-에이코사디엔산, 5,8,11-에이코사트리엔산, 베헨산, 리그노세르산, 네르본산, 세로트산, 몬탄산, 멜리신산 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지에 포함되는 지방산은 포화 지방산이라도 좋고, 불포화 지방산이라도 좋다.
본 발명의 배지는, 접착 배양, 부유 배양, 포매 배양, 조직 배양 등의 어느 배양 방법에도 사용할 수 있다.
본 발명의 배지는, 어느 동물 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에도 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 사용하여 배양될 수 있는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목, 사람, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이며, 바람직하게는, 사람 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포이다.
본 발명의 배지는 바람직하게는 킬레이트화철 외에, 인슐린, NaHCO3, 셀레늄, 에탄올아민, bFGF를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 배지는 DMEM/F-12 배지를 기초 배지로 하고, 킬레이트화철 외에, 인슐린, NaHCO3, 셀레늄, 에탄올아민, bFGF를 포함한다.
일 형태로서, 본 발명의 배지는, DMEM/F-12 배지를 기초 배지로 하고, 킬레이트화철 외에, 알부민(0.5mg 내지 5mg/ml), 인슐린(5μg/ml 내지 1mg/ml), NaHCO3(100μg/ml 내지 5mg/ml), 셀레늄산나트륨(2ng/ml 내지 1μg/ml), 에탄올아민(100ng/ml 내지 100μg/ml), bFGF(10ng/ml 내지 200ng/ml)를 포함한다.
일 형태로서, 본 발명의 배지는, 홀로트랜스페린(0.5 내지 6.5μg/ml) 및 bFGF(10ng/ml 내지 200ng/ml)를 포함하는 배지로서, 배지 중의 철 고분자체량이 3ppb 내지 7ppb이다. 바람직하게는, 본 발명의 배지는, 철 함유량 200μg/g 내지 500μg/g의 홀로트랜스페린(0.5 내지 6.5μg/ml) 및 bFGF(10ng/ml 내지 200ng/ml)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 배지는, 철 함유량 380μg/g의 홀로트랜스페린(0.5 내지 6.5μg/ml) 및 bFGF(10ng/ml 내지 200ng/ml)를 포함한다.
(4) 본 발명의 방법
본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명은, 킬레이트화철을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법을 제공한다. 당해 방법은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식시키고, 미분화를 유지하는 방법이기도 하다. 다른 실시형태로서, 다능성 줄기세포 등으로부터의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 효율화하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지시켜 증식을 촉진시키므로, 유도된 소수의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 효과적으로 증식시킬 수 있고, 그 결과, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 효율화할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명의 방법은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 본 발명의 배지에서 배양하는 공정을 포함한다. 또한 본 발명의 일 실시형태로서, 본 발명의 방법은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도할 수 있는 세포를 본 발명의 배지에서 배양하는 공정을 포함한다. 또 다른 본 발명의 실시형태로서는, 본 발명의 방법은, 킬레이트화철을 포함하지 않는 배지에 킬레이트화철을 첨가하여, 킬레이트화철 존재 하에서 일정 기간 배양하는 공정을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로서는 SOX2 양성 네스틴 양성 및/또는 SOX2 음성 네스틴 양성인 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 바람직하다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 배양 방법에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 기간은, 통상 2일간 이상, 바람직하게는 4일간 이상, 더욱 바람직하게는 8일 이상이다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 4일 이상 계속해서 배양할 경우, 3 일에 1회, 바람직하게는 2일에 1회 배지를 교환하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지 중에서 배양한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 회수하고, 이의 일부 또는 전부를 신선한 본 발명의 배지 중에 계대(繼代)하고, 이어서 배양을 계속함으로써, 신경 전구세포는 미분화성을 유지하고, 증식이 촉진된 채로, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 계대 배양할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 시간은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 길이의 시간인 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 배양 기간 중의 전 기간에서 킬레이트화철을 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 배지의 조성은 전술한 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도를 효율화시키는 경우, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도는, 사용되는 배지에 킬레이트화철이 포함되어 있는 것을 제외하고는, 공지의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 유도 방법(예를 들어, 상기 다능성 줄기세포 유래의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 유도 방법, 섬유아세포로부터 직접 분화 유도하는 방법 등이 열거되지만 이들에 한정되지 않음)에 준하여 행해진다.
본 발명의 방법에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 경우, 사용되는 배지에 킬레이트화철을 포함하는 것을 제외하고는, 접착 배양, 부유 배양, 조직 배양 등의 자체 공지의 방법에 의해 배양 가능하다. 배양 방법은 목적에 따라 적절하게 선택 가능하다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 접착 배양 방법의 예로서는, Flanagan LA 등, J Neurosci Res. 2006 Apr; 83(5): 845-56, Conti L 등, PLoS Biology. 2005 Sep; 3(9): e283 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 부유 배양이란, 배지 중에서, 배양기 또는 피더 세포(사용되는 경우)에 대하여 비접착성의 조건 하에서 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 것을 말한다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 부유 배양 방법의 예로서는, 뉴로스피어법(Reynolds BA and Weiss S., Science, USA 1992 Mar 27; 255(5052): 1707-10), 무혈청 응집 부유 배양법(SFEB 법, SFEBq 법; Watanabe 등, Nature Neuroscience 8, 288-296(2005)) 등이 열거된다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 조직 배양이란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하는 조직을 슬라이스 등의 조직편 또는 조직 전체로서 배양하는 방법이다. 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 조직 배양으로서는, O'Rourke NA 등, Science. 1992 Oct 9; 258(5080): 299-302. , Komuro H 등, Science. 1992 Aug 7; 257(5071): 806-9에 기재된 슬라이스 배양법 등이 열거된다.
본 발명에 있어서 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식의 유무, 정도는 트립판 블루(Trypan Blue) 등의 세포 염색 시약을 사용하여 생세포수를 계측함으로써 평가할 수 있다. 또한, 부유 배양을 행하여 뉴로스피어를 형성시키는 경우에는, 형성되는 뉴로스피어의 크기, 또는 뉴로스피어를 구성하는 세포의 수를 측정함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용되는 배양기는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬(dish), 페트리 디쉬(petri dish), 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬(multidish), 마이크로플레이트(microplate), 마이크로웰 플레이트(microwell plate), 멀티플레이트(multiplate), 멀티웰 플레이트(multiwell plate), 마이크로슬라이드(microslide), 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 및 롤러 보틀이 열거된다.
신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양에 사용되는 배양기는, 세포 접착성이라도 세포 비접착성이라도 좋고, 목적에 따라 적절하게 선택된다. 부유 배양에 의해 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 경우, 배양기는 세포 비접착성인 것이 바람직하다.
접착 배양에 의해 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 배양하는 경우, 배양기는 세포 접착성인 것이 바람직하다. 세포 접착성의 배양기는, 배양기의 표면의 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로, 세포외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지용 기판 또는 이의 기능을 모방하는 인공물로 코팅된 것일 수 있다. 세포 지지용 기질은, 줄기세포 또는 피더 세포(사용되는 경우)의 접착을 목적으로 하는 임의의 물질일 수 있다.
그 밖의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진 및 미분화성의 유지 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 2 내지 5%이다. 산소 농도는 통상 1 내지 40%이지만, 배양 조건 등에 따라 적절히 선택된다.
(5) 킬레이트화철을 포함하는 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하는 배양 조성물
본 발명은 또한 상기 본 발명의 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함해서 이루어진 배양 조성물(본 명세서 중, 본 발명의 배양 조성물이라고도 함)을 제공한다. 당해 배양 조성물은, 세포를 배양함으로써 수득되는 결과물을 포함한다. 본 발명의 배양 조성물에 관련된 각 용어의 정의 및 형태는, 상기에 기재한 것과 동일하다.
본 발명의 배양 조성물에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는, 생존하여, 증식하고 있는 세포이다.
본 발명의 배양 조성물에서의 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 순도(전체 세포 수에서 차지하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 수의 백분율)는 통상 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.
본 발명의 배양 조성물에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포는 본 발명의 배지 중에 존재한다. 일 형태에 있어서, 본 발명의 배양 조성물은, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 본 발명의 배지 중의 현탁액이다. 본 발명의 배양 조성물은 적절한 용기 중에 봉입되어 있어도 좋다.
일 실시형태로서, 본 발명의 배양 조성물은 동결 보존시킨 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 배양 조성물은 동결 보존하는 것이 가능하며, 필요에 따라 융해·기면하여 사용할 수 있다. 동결 보존은 자체 공지의 세포 동결 보존 방법을 사용할 수 있다. 동결 보존의 예로서는 본 발명의 배양 조성물에 디메틸설폭사이드를 첨가하고, -80 내지 -200℃, 바람직하게는 -196℃(액체 질소 중)의 조건으로 본 발명의 배양 조성물을 보존한다.
이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 보다 상세하게 설명하겠지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 홀로트랜스페린 기능 평가
(1) Long-term self-renewing neuro epithelial-like stem cells(이하 LtNES 세포) 유도법
iPS 세포로부터 EB를 형성하고, 4일간 E6 배지(Life Technologies 또는 STEMCELL Technologies)에서 아스코르브산 및 트랜스페린을 제외한 조성에 상당하는 배지에 홀로트랜스페린(최종 농도 0.5 내지 10μg/ml), 에탄올아민(최종 농도 5 내지 50μM), bFGF(최종 농도 5 내지 100ng/ml)을 첨가한 배지 중에서 4일간 배양 하였다. 폴리-L-오르니틴(PO) 코트한 dish에 EB를 파종하고, 상기 배지 중에서 10 일 정도 배양하여, Rosette와 같은 구조가 형성되는 것을 확인하였다. Rosette 부분을 도려내어 뉴로스피어로서 상기 배지 중에서 부유 배양을 7일 정도 행하였다. 뉴로스피어를 트립신/EDTA로 분산하고, PO/라미닌 코트한 dish 위에서 RHB-A 배지 중에서 배양하여, LtNES 세포를 작성하였다. LtNES 세포는 신경 줄기세포 및 신경 전구세포가 혼재한 것이다.
또한, 상기 E6 배지(Essential 6 배지)에 대해서는, Life Technologies사 홈페이지<URL: http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A1516401>에서, E8 배지를 베이스로 한 제법으로 만들어지고, bFGF와 TGFβ를 포함하지 않는 것이 기재되어 있다. 또한, E8 배지(Essential 8 배지)에 대해서는, Nat Methods 2011 May; 8(5): 424-429)에 기재되어 있다.
또한, 상기 E6 배지의 성분은, Stem Cells. 2014 Apr; 32(4), 1032-42의 요약 중에도 기재되어 있다.
(2) LtNES 세포의 배양법
사람 다능성 줄기세포로부터 유도된 LtNES 세포는, RHB-A 배지, 20ng/ml bFGF 중에서 37℃, 5% CO2 환경 하에서 배양을 행하였다. LtNES 세포의 계대에는, TrypLE Select 내에서 37℃, 1분간 인큐베이팅을 행하고, 배지로 희석하고, 그 후 피펫팅(pipetting)을 행하여 단일의 세포로 하였다. 1.5×105세포/웰(6웰 플레이트)에서 상기 배지 중에 분산시킨 세포를 파종하여 37℃, 5% CO 2 환경 하에서 배양을 행하였다. 세포수 측정은 트립판 블루(Life Technologies사)에 의한 사멸 세포 염색을 행한 다음, 혈구계산반(hemocytometer)으로 행하였다.
(3) 홀로트랜스페린 기능 평가
E6 배지(Life Technologies 또는 STEMCELL Technologies)에서 아스코르브산 및 트랜스페린을 제외한 조성에 상당하는 배지에, 알부민(최종 농도 0.5 내지 5mg/ml), 에탄올아민(최종 농도 5 내지 50μM), bFGF(최종 농도 5 내지 100ng/ml)을 첨가하여, 피검 기초 배지를 작성하였다.
피검 기초 배지에, 홀로트랜스페린(Sigma Aldrich)를 최종 농도 0, 1.0, 2.5, 5, 7.5μg/ml가 되도록 첨가한 피검 배지를 작성하였다.
각 피검 배지를 사용하여, 사람 다능성 줄기세포로부터 유도한 LtNES 세포를 배양하였다. 세포의 배양은 37℃, 5% CO2 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다. 2일에 한 번 배지 교환을 행하고, 4 내지 5일간 배양하였다. 배양 후, 피검 배지 대신에 TrypLE Select를 첨가하여, 37℃, 1분간 인큐베이팅하여 세포 분산 처리를 행하였다. TrypLE Select를 배지로 희석 후, 피펫팅을 행하여, 단일의 세포로 하고, 세포수를 세어 평가하였다. 세포수 측정은, 트립판 블루(Life Technologies사)에 의한 사멸 세포 염색을 행한 다음, 혈구계산반으로 행하였다.
결과를 도 1에 나타낸다. 2.5μg/ml 홀로트랜스페린 첨가 배지, 5μg/ml 홀로트랜스페린 첨가 배지에서 세포수가 가장 증가하고, 1μg/ml 홀로트랜스페린 첨가 배지에서도 세포는 양호한 성장을 나타내었다.
또한, 본 실시예에서 사용한 홀로트랜스페린의 철 함유량을 측정한 바, 트랜스페린 샘플(1mg/ml 트랜스페린) 중의 고분자체의 철량은 380ppb였다. 트랜스페린 1mg/ml에 대하여 결합할 수 있는 철량(포화)은, 계산값으로는 1400ppb이다. 따라서, 본 실시예에서 사용한 홀로트랜스페린은, 트랜스페린에 대한 철 결합률이 약 27%인 것을 알 수 있었다.
(4) 배지 중 총 철량 분석
홀로트랜스페린(Tf)의 첨가에 의한 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진이, 철량의 증가에 의존하는지 검토하기 위해, 각 피검 배지에 포함되는 철량의 측정을 행하였다. 또한, 철 이외의 Mn, Ni, Co, Cu, Zn, Se의 양에 대해서도 측정하였다.
각 피검 배지를 희석하고, 유도 결합 플라즈마 질량 분석 장치(이하, ICP-MS, Thermo Fisher Scientific Inc.)에 도입하여, 각 원소를 검출하고, 외부 검량선법으로 정량을 실시하였다.
결과를 표 1에 나타낸다.
배지 중에 첨가한 홀로트랜스페린의 양에 의존하지 않고, 배지 중의 철량은 거의 일정하였다. 철 이외의 금속에 대해서도, 배지 중에 첨가한 홀로트랜스페린의 양에 의존하지 않고, 배지 중의 금속 함유량은 거의 일정하였다.
(5) 형태별 철량 분석
다음으로 배지에 함유되는 철량을 철의 형태별로 측정하였다.
배지 중의 형태별 철량 분석을 행하기 위해, SEC-ICP-MS(사이즈 배제 크로마토그래피(SEC, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 접속한 ICP-MS 애질런트 테크놀로지사)를 행하였다. 배지를 사이즈 배제 크로마토그래피에 도입하고, 용리액을 온라인으로 결합된 ICP-MS로 분석하였다. ICP-MS에서 각 원소를 검출하고, 외부 검량선법으로 정량을 실시하였다.
결과를 표 2에 나타낸다.
그 결과, 홀로트랜스페린 첨가량에 따라 고분자체의 철이 증가하는 것이 판명되었다.
실시예 2: 신경 줄기세포 및 신경 전구세포의 면역 조직 화학 염색
홀로트랜스페린 첨가 배지에서 양호한 성장을 나타낸 세포가 신경 줄기세포임을 면역 조직 화학 염색을 행하여 실증하였다.
실시예 1과 마찬가지로, 최종 농도 2.5μg/ml가 되도록 홀로트랜스페린을 첨가한 배지를 작성하고, 실시예 1과 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후, 세포를 고정하고, 신경 줄기/전구세포 마커인 네스틴에 대한 항체 및 신경 줄기세포 마커 인 SOX2에 대한 항체를 사용하여 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
배양 접시 위의 세포는, 거의 모든 세포가 신경 줄기세포 및 신경 전구세포 마커인 네스틴 양성이었다. 이 중의 대부분의 세포가 신경 줄기세포 마커인 SOX2 양성이었다. 따라서, 실시예 2에서 양호한 증식을 나타낸 세포는, 네스틴 양성 SOX2 양성인 신경 줄기세포임이 시사되었다.
실시예
3: 신경계 세포 유도
홀로트랜스페린 첨가 배지에서 배양한 세포가 실제로 분화할 수 있음을 실증하기 위해, 분화 유도 실험을 행하였다.
실시예 1과 동일하게, 최종 농도 2.5μg/ml가 되도록 홀로트랜스페린을 첨가한 배지를 작성하고, 실시예 1과 동일한 조건으로 배양을 행하였다. 배양 후, 배지 대신에 TrypLE Select를 첨가하여, 37℃, 1분간 인큐베이팅하여 세포 분산 처리를 행하였다. TrypLE Select를 배지로 희석 후, 피펫팅을 행하여, 폴리-L-오르니틴/피브로넥틴으로 코트한 48웰 플레이트에 1.5x105세포/웰로 파종하였다. Media hormone mix 배지에 1xB27 서플리먼트를 첨가한 배지 중에서 20일간 배양하였다. 세포의 배양은 37℃, 5% CO2 분위기 하의 인큐베이터 내에서 행하였다. 배지 교환은 2일에 한 번 행하였다.
배양 후, 세포를 고정하고, 신경세포 마커인 βIII 튜뷸린에 대한 항체를 사용한 형광 항체법에 의해 면역 염색을 행하였다.
분화 유도 후의 세포는, βIII 튜뷸린 양성인 분화된 신경세포가 포함되어 있는 것이 나타났다.
본 발명에 의하면, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화성 및 다분화능을 유지한 채로 세포 증식을 촉진시키는 것이 가능해져, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 배양에 드는 인적 비용 및 금전적 비용을 삭감할 수 있다.
여기에서 기술된 특허, 특허출원 명세서, 과학 문헌을 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용됨으로써, 그 전부가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 편입되는 것이다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특원2015-069978(출원일: 2015년 3월 30일)을 기초로 하고 있고, 이의 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.
Claims (32)
- 킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포용 배지.
- 제1항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 증식 촉진용인, 배지.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지용인, 배지.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 배지.
- 킬레이트화철을 포함하는 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포 유도용 배지.
- 제5항에 있어서, 다능성 줄기세포로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하기 위한 배지인, 배지.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철의 함유량이 3 내지 7ppb인, 배지.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철이 철 결합성 단백질과 결합된 철인, 배지.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철이 철 킬레이트제와 결합된 철인, 배지.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철이, 트랜스페린, 락토페린, 헤모글로빈, 페리틴, 디페록사민, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 피트산, 니트릴로트리아세트산(NTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), L-글루타민산디아세트산(GLDA) 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 글리콜에테르디아민테트라아세트산(GEDTA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 하이드록시에틸이미노디아세트산(HIDA), 디하이드록시에틸글리신(DHEG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종과 결합된 철인, 배지.
- 제10항에 있어서, 킬레이트화철의 적어도 1종이 트랜스페린과 결합된 철인, 배지.
- 제11항에 있어서, 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.5μg/ml 이상 6.5μg/ml 이하인, 배지.
- 제11항에 있어서, 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.1μg/ml 이상 1.8μg/ml 이하인, 배지.
- 제10항에 있어서, 킬레이트화철의 적어도 1종이 디페록사민, 시트르산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 결합된 철인, 배지.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배지인, 배지.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 포함하는, 배지.
- 제16항에 있어서, 배지 중의 bFGF량이 10ng/ml 이상 200ng/ml 이하인, 배지.
- 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 배양 방법.
- 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 증식시키는 방법.
- 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포의 미분화 유지 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포가 다능성 줄기세포 유래인, 방법.
- 배지에 킬레이트화철을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 유도하는 방법.
- 제22항에 있어서, 다능성 줄기세포로부터 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포로 유도하는 방법인, 방법.
- 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철의 함유량이 3 내지 7ppb인, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철이 철 결합성 단백질과 결합된 철인, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철이 철 킬레이트제와 결합된 철인, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화철이, 트랜스페린, 락토페린, 헤모글로빈, 페리틴, 디페록사민, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 피트산, 니트릴로트리아세트산(NTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), L-글루타민산디아세트산(GLDA), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 글리콜에테르디아민테트라아세트산(GEDTA), 트리에틸렌테트라민헥사아세트산(TTHA), 하이드록시에틸이미노디아세트산(HIDA), 디하이드록시에틸글리신(DHEG)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종과 결합된 철인, 방법.
- 제27항에 있어서, 킬레이트화철의 적어도 1종이 트랜스페린과 결합된 철인, 방법.
- 제28항에 있어서, 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.5μg/ml 이상 6.5μg/ml 이하인, 방법.
- 제28항에 있어서, 트랜스페린의 배지 중의 함유량이 0.1μg/ml 이상 1.8μg/ml 이하인, 방법.
- 제27항에 있어서, 킬레이트화철의 적어도 1종이 디페록사민, 시트르산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 결합된 철인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 배지 및 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 포함하여 이루어진 배양 조성물.
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