KR20170132811A - 신규한 il33 형태, il33의 돌연변이된 형태, 항체, 검정 및 이의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단리 IL-33 단백질, 이의 활성 단편 및 IL-33 단백질에 대한 항체, 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또한, 예를 들어, 면역 및 염증 장애의 치료 목적을 위한, 사이토카인 활성의 조정 방법이 제공된다.

Description

신규한 IL33 형태, IL33의 돌연변이된 형태, 항체, 검정 및 이의 이용 방법
본 개시는 IL-33의 신규한 형태; IL-33의 신규한 돌연변이체; 임의의 하나의 상기 단백질에 특이적인 결합 단백질, 예컨대 항체, 특히 존재하는 상기 형태의 양을 조정할 수 있는 결합 단백질; 본 개시에 따른 단백질 또는 결합 단백질, 예컨대 항체를 포함하는 조성물; 및 특히 치료법에서, 예를 들어 염증성 질환의 예방 치료에서, 임의의 하나의 이의 용도에 관한 것이다. 본원에서의 개시는 또한 상이한 형태의 IL-33을 확인하고/하거나 정량하기 위한 검정까지 연장된다.
IL-1F11로도 불리는 인터류킨-33(IL-33)은 2형 면역 반응의 특징인 세포, 사이토카인 및 면역글로불린의 생성을 자극하는 IL-1 사이토카인 패밀리의 구성원이다. IL-33은 2개 도메인, 호메오도메인 및 사이토카인(IL-1-유사) 도메인으로 구성된 270개 아미노산 단백질이다. 호메오도메인은 핵 편재 신호(NLS)를 함유한다. IL-33은 Th2 세포, 비만 세포 및 광범위한 다른 세포 유형 상에 발현되는 수용체, ST2를 통한 신호 전달을 매개한다.
Schmitz 등은 고아 수용체 ST2(IL-1R4로도 불림)에 대한 리간드로서 IL-33을 최초로 확인하였다(Schmitz et al., Immunity 23(5)479-90 (2005)). IL-33 수용체는 이종이량체 분자로 형성된다. ST2 및 IL-1R 악세사리 단백질(IL-1RAcP)은 이량체화하여 IL-33 수용체(ST2:IL-1RAcP)를 형성한다. IL-1RAcP는 IL-1α, IL-1β, IL-1F6, IL1F8 및 IL1F9에 대한 수용체의 공유 성분이다. IL-1RAcP는 결합을 위해 필요하지는 않지만, 신호전달을 위해 중요하다. IL-33 수용체의 TIR-도메인은 MyD88 및 TRAF6을 모집하며, 수용체 신호는 NFκB 및 MAP 키나제 경로의 활성화를 일으킨다(Oboki et al., Allergology International 59:143-160 (2010)). IL-33 수용체는 다른 수용체와 잠재적으로 연합할 수 있고, 비만 세포 상에서 c-kit와 상호작용하는 것으로 보고되었다(Drube et al., Blood 115:3899-3906 (2010))
최근에, IL-33은 제2 IL-33 수용체 이종이량체 복합체에 결합하는 것으로 나타났다: ST2도 또 다른 IL-1R 패밀리 분자, "단일 Ig IL-1R-관련 분자"(SIGIRR)(Toll IL-1R8(TIR8)로도 불림)와 복합체를 형성하여 ST2:SIGIRR을 형성한다. SIGIRR/TIR8은 IL-1R 및 Toll-유사 수용체(TLR)-매개 면역 반응의 음성적 조절인자로서 작용하는 것으로 여겨진다(Garlanda et al., Trends Immunol . 30:439-46 (2009)). ST2:IL-1RAcP와 대조적으로, ST2:SIGIRR은 IL-33의 음성적 조절인자로서 작용하는 것으로 보인다(Oboki et al. (2010)).
ST2 수용체의 유일하게 공지된 리간드는 IL-33이다(예로, 문헌[Schmitz et al., Immunity 23(5)479-90 (2005); Chackerian et al., J. Immunol . 179(4):2551-5 (2007)]을 참고한다). ST2 수용체는 Th2 세포 및 비만 세포에 의해 기준선으로 발현되며, 두 세포 유형은 모두 알러지성 천식의 중요한 매개인자로 알려져 있다. IL-33의 세포외 형태는 ST2에 결합하여 표적 세포를 자극한 후 NFκB 및 MAP 키나제 경로를 활성화함으로써, 사이토카인 및 케모카인의 생성을 포함하는 범위의 기능적 반응을 야기한다. 가용성 ST2(sST2)는 IL-33 신호전달을 방지하는, 유인 수용체인 것으로 여겨진다.
인간에서, IL-33은 평활근에서 그리고 기관지 상피에서 항상적으로 발현되는 것으로 나타났다. 발현은 폐 및 피부 섬유아세포에서 IL-1β 및 TNF-α에 의해 유도될 수 있다(Schmitz et al. (2005)). 가용성 ST2 단백질 및 IL-33 mRNA/단백질 수준은 천식 환자로부터의 혈청 및 조직에서 증가된다(Oboki et al., Allergology International 59:143-160 (2010)).
생체내에서, IL-33은 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현을 유도하며, 점막 기관에서 중증 병리적 변화를 야기한다. 마우스에 대한 IL-33의 투여는 대량 혈액 호산구증가증, 증가된 IL-5 및 IgE 혈청 수준 및 점막 표면에서 술잔 세포 과다형성을 포함하는 강력한 염증성 효과를 갖는다(Schmitz et al. (2005)). 마우스에 대한 IL-33의 복강내 또는 비내 투여는 IL-13 및 STAT6-의존적 경로를 통해 폐 및 장 점막에서 호산구성 염증의 유도를 야기하였다(Oboki et al. (2010)). 따라서, IL-33은 알러지성 질환, 예컨대 천식 및 다른 염증성 기도 질환에서 역할을 담당할 수 있다.
문헌에서의 일부 보고는 술잔 세포가 CXCL8/IL-8을 분비함을 제시하며, 이는 ST2R-ERK 경로를 통해 IL-33에 의해 증가되어 술잔 세포 화생을 갖는 천식 기도에서의 증강된 기도 염증 기전을 제시한다(Clin Exp Allergy. 2014 Apr;44(4):540-52)
따라서, 치료 표적으로서 IL-33에 대한 관심이 있었다. 그러나, 현재까지 상기 치료 표적을 차단하는 치료적 유익은 아직 완전히 구현되지 않았다. 본 발명자들은 IL-33이 환원 형태(또한 본원에서 redIL-33으로 언급됨) 및 산화 형태로 존재함을 최초로 확립하였다. 본 발명자들은 본원에 기재된 바와 같이 IL-33의 산화 형태를 최초로 특성규명하였다. 본 발명자들의 시험관내 및 생체내 연구는 redIL-33(환원 형태)의 소실이 산화 IL-33의 출현과 연관됨을 나타내었다. 시험관내 생리적 유체에서, redIL-33은 급속히 산화되어 디설파이드 결합 형태를 형성한다. 산화 형태(또한 본원에서 IL-33-DSB로 언급됨)는 Cys208, Cys227, Cys232 및 Cys259 군으로부터 선택된 시스테인 간에, 적어도 하나의(예로, 2개의) 디설파이드 결합을 갖는다(UniProt O97560에 개시된 전장 인간 IL-33에 대해 넘버링되며, 그 중 잔기 112 내지 270이 SEQ ID NO. 632 내에 인용됨). 이전에는 상업적으로 이용 가능한 검정이 상기 산화 형태를 주로 검출하는 것으로 보인다는 것이 인식되지 않았다. 따라서 본 발명자들은 ST2와의 상호작용 및 IL-33 방출에 연관된 생물학적 활성의 유도에 관여하는 redIL-33을 선택적으로 검출하는 검정을 고안할 필요가 있었다.
환원 형태는 신호 캐스케이드를 생성하는 단백질의 활성 형태인 것으로 나타나며, 실제로 생체내에서 ST2를 통한 신호전달을 종결하기 위한 기전으로서 환원 형태가 산화 형태로 전환되는 것으로 나타난다. 본 발명자들은 redIL-33이 ST2에 결합함을 확인하였다(도 24의 A). 대조적으로, IL-33-DSB는 ST2 결합을 나타내지 않았다(도 24의 B). 이는 본 발명자들로 하여금 생체내 산화가 IL-33-ST2 활성을 끄는 기전일 수 있다고 가정하도록 만들었다. 또한, 본 발명자들은 IL-33의 산화 형태(IL-33-DSB)가 RAGE(receptor for advanced glycation end products)에 결합하며, 상기 대안적 경로를 통해 신호를 전달함을 최초로 확립하였다(도 56).
본 발명자들은 상기 이해가 더욱 효과적인 치료제를 생성하기 위해 이용될 수 있다고 믿는다. 하나의 구현예에서, 본 발명자들은 산화 형태에 우선적으로 결합하지만 환원 형태의 산화 형태로의 전환을 본질적으로 촉매함으로써 환원 형태의 활성을 놀랍도록 약화시키는 항체를 확인하였다. 유리하게는, 상기 기전은 ST2를 통한 신호전달을 종결하기 위한 생체내 기전을 간단히 강화한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명자들은 펨토몰 농도 친화도로 IL-33의 환원 형태(redIL-33)에 우선적으로 결합하고, ST2를 통한 IL-33 매개 신호전달을 약화시키고/시키거나 억제하는 항체를 확인하였다. 상기 항체는 IL-33/ST2 매개 염증성 반응의 치료 또는 예방을 위한 기전을 최초로 제공한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 항체는 RAGE를 통한 IL-33-DSB에 대한 이전에 인식되지 않은 신호전달 경로 및 임의의 IL-33/RAGE 매개 효과를 약화시키거나 억제할 수 있다. 본 발명의 항체는 IL-33-DSB의 직접적 결합 및 RAGE와의 리간드/수용체 상호작용의 약화 또는 억제에 의해 작용할 수 있거나 대안적으로 redIL-33에 결합하여 IL-33-DSB로의 그 전환을 방지하거나 감소시킴으로써 RAGE와의 리간드/수용체 상호작용을 간접적으로 약화시키거나 억제할 수 있다.
따라서 제1 양태에서, 환원 형태의 단리된 IL-33(redIL-33) 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
하나의 양태에서, 원상태 시스테인 간 디설파이드 가교의 형성을 방지하는 변형에 의해 환원 형태로 안정화된 단리된 IL-33 단백질이 제공된다. 이러한 변형은 하나 이상의 시스테인 잔기의 결실, 하나 이상의 원상태 시스테인을 대안적 아미노산으로 대체하는 돌연변이 및/또는 화학적 대상체에 대한 접합을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된, 특히 SEQ ID NO: 634 내지 648에 나타낸 바와 같은, IL-33의 돌연변이된 형태가 제공된다.
하나의 구현예에서, 화학적 대상체는 바이오틴으로서, 이는 redIL-33이 IL-33-DSB로 전환되는 능력을 감소시키거나 제거한다.
하나의 양태에서, 하나 이상의 시스테인이 비-시스테인 아미노산으로 대체되는, 예를 들어 Cys-208, Cys-227, Cys-232 및 Cys-259로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 시스테인이, 예를 들어 아미노산, 예컨대 세린으로 대체되는 돌연변이체 IL-33이 제공된다. 하나의 구현예에서, 시스테인 잔기는 독립적으로 Cys-208, Cys-227, Cys-232 및 Cys-259로부터 선택된다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 개시에 따른 돌연변이체는 IL-33-DSB에서 디설파이드 결합 중 하나 또는 둘 다를 형성할 수 없다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 redIL-33의 활성을 약화시키는, 예를 들어 상기 활성을 억제하는 본 개시에 따른 이의 안정화된 형태를 포함하는, 단리된 결합 분자에 대한 것이다. 하나의 구현예에서, 약화는 redIL-33의 특이적 결합을 통한다. 하나의 구현예에서, 약화는 IL-33-DSB의 결합 및 예를 들어 redIL-33의 IL-33-DSB로의 전환 촉매 또는 가속화를 통한다.
하나의 구현예에서, 약화는 ST2-의존적 신호전달을 하향조절하거나 끈다.
특정한 구현예에서, 본 개시의 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 비만 세포에서 IL-33 유도 사이토카인 생성을 억제한다.
하나의 구현예에서, 약화는 ST2 경로로부터의 IL-5 방출을 하향조절하거나 방지한다.
하나의 구현예에서, 약화는 호산구 활성화를 하향조절하거나 방지한다.
하나의 구현예에서, 약화는 NFκB 방출을 하향조절하거나 방지한다. 하나의 구현예에서, 약화는 IL-4 방출을 하향조절하거나 방지한다. 하나의 구현예에서, 약화는 IL-6 방출을 하향조절하거나 방지한다. 하나의 구현예에서, 약화는 IL-8 방출을 하향조절하거나 방지한다. 하나의 구현예에서, 약화는 IL-13 방출을 하향조절하거나 방지한다.
특정한 구현예에서, 본 개시의 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IL-33/RAGE 매개 신호전달을 약화시키거나 억제한다. RAGE-매개 신호전달의 약화 또는 억제는 조정되지 않은 IL-33 유도 염증 반응에서 나타난 것에 비해 상피 이동을 증강시킬 수 있다(도 58 참고). 이러한 증강된 상피 이동은 특히 폐 조직, 예컨대 폐 상피에서, 조직 보수 및 상처 치유에서 역할을 담당할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 redIL-33 또는 redIL-33의 결합 단편에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자에 대한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 redIL-33에 특이적으로 결합하고 이의 ST2에 대한 결합을 억제하는 단리된 결합 분자에 대한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 redIL-33에 특이적으로 결합하고 IL-33과 그 수용체의 상호작용을 물리적으로 차단함으로써 redIL-33의 신호전달을 억제하는 단리된 결합 분자에 대한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 IL-33에 결합하고 redIL-33의 IL-33-DSB로의 전환을 촉매함으로써 ST-2 신호전달을 하향조절하거나 끄는 분자에 대한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 경쟁적 작용 방식을 갖는 결합 분자에 대한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 알로스테리 작용 방식을 갖는 결합 분자에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
하기 식은 1글자 아미노산 코드를 이용한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중, X는 아미노산, 예를 들어 S 또는 N, 예컨대 S이다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2를 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00002
식 중,
X1은 A, G 또는 S, 특히 A 또는 G, 예컨대 A이며;
X2는 A, D, G, N, S, 특히 A, D 또는 S, 예컨대 S이고;
X3은 A, D 또는 G, 특히 A 또는 G, 예컨대 G이고;
X4는 없거나 D, 특히 없고;
X5는 없거나 G, 특히 없고;
X6은 D, I 또는 S, 특히 I 또는 S, 예컨대 S이고;
X7은 D, F, G 또는 S, 특히 D 또는 G, 예컨대 G이고;
X8은 D, G, Q, S, T, 특히 G, Q 또는 T, 예컨대 G이고;
X9는 R 또는 S, 특히 S이고;
X10은 P 또는 T, 특히 P이고;
X11은 H 또는 Y, 특히 Y이고; 및
X12는 P 또는 S, 특히 S이다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 III의 CDRH3을 포함한다:
[화학식 III]
Figure pct00003
식 중,
X13은 A, D, H, L 또는 Q, 특히 D 또는 Q, 예컨대 D이며;
X14는 K 또는 L, 특히 K이고;
X15는 F 또는 W, 특히 F이고;
X16은 I 또는 M, 특히 M이고;
X17은 Q 또는 E, 특히 Q이고;
X18은 L 또는 N, 특히 L이고;
X19는 W 또는 Y, 특히 W이고;
X20은 A, G 또는 V, 특히 G이고; 및
X21은 F 또는 L, 특히 F이다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 CDRH1 및 화학식 II의 CDRH2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 CDRH1 및 화학식 III의 CDRH3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 III의 CDRH3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 I의 CDRH1 및 화학식 II의 CDRH2, 그리고 화학식 III의 CDRH3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다:
[화학식 IV]
Figure pct00004
식 중,
X22는 아미노산, 예를 들어 R 또는 G, 특히 R이며; 및
X23은 아미노산, 예를 들어 M 또는 I, 특히 M이다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 V의 CDRL2를 포함한다:
[화학식 V]
Figure pct00005
식 중,
X24는 아미노산, 예를 들어 Q 또는 R, 특히 R이다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다:
[화학식 VI]
Figure pct00006
식 중,
X25는 E, G 또는 Q, 특히 G 또는 Q, 예컨대 G이며;
X26은 I, K, L 또는 W, 특히 L 또는 W, 예컨대 W이고;
X27은 A, D, K, Q, R 또는 V, 특히 D 또는 K, 예컨대 K이고;
X28은 A, D, K, Q 또는 S, 특히 Q 또는 S, 예컨대 S이고;
X29는 D, N 또는 S, 특히 D 또는 S, 예컨대 D이고;
X30은 D, S 또는 T, 특히 D 또는 S, 예컨대 D이고;
X31은 없거나 T, 특히 없고;
X32는 G 또는 P, 특히 G이고; 및
X33은 I 또는 V, 특히 V이다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 IV의 CDRL1 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 IV의 CDRL1 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 V의 CDRL2 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 상기 정의된 바와 같은 화학식 IV의 CDRL1 및 화학식 V의 CDRL2, 그리고 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH3 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 II의 CDRH2, 화학식 II의 CDRH3 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 IV의 CDRL1을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3, 화학식 IV의 CDRL1 및 화학식 V의 CDRL2를 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 III의 CDRH3, 화학식 IV의 CDRL1 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 II의 CDRH3, 화학식 V의 CDRL2 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 화학식 I의 CDRH1, 화학식 II의 CDRH2, 화학식 II의 CDRH3, 화학식 IV의 CDRL1, 화학식 V의 CDRL2 및 화학식 VI의 CDRL3을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는, 예를 들어 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13, 14, 15, 23, 24, 25, 33, 34, 35, 43, 44, 45, 53, 54, 55, 63, 64, 65, 73, 74, 75, 83, 84, 85, 93, 94, 95, 103, 104, 105, 113, 114, 115, 153, 154, 155, 163, 164, 165, 173, 174, 175, 183, 184, 185, 193, 194, 195, 203, 204, 205, 213, 214, 215, 223, 224, 225, 233, 234, 235, 243, 244, 245, 253, 254, 255, 263, 264, 265, 273, 274, 275, 283, 284, 285, 293, 294, 295, 303, 304, 305, 313, 314, 315, 353, 354, 355, 363, 364, 365, 373, 374, 375, 383, 384, 385, 393, 394, 395, 403, 404, 405, 413, 414, 415, 453, 454, 455, 463, 464, 465, 473, 474, 475, 483, 484, 485, 493, 494, 495, 503, 504, 505, 513, 514, 515, 553, 554, 555, 563, 564, 565, 573, 574, 575, 583, 584 및 585로부터 독립적으로 선택되는 3개의 CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는, 예를 들어 경쇄 가변 영역에, SEQ ID NO: 8, 9, 10, 18, 19, 20, 28, 29, 30, 38, 39, 40, 48, 49, 50, 58, 59, 60, 68, 69, 70, 78, 79, 80, 88, 89, 90, 98, 99, 100, 108, 109, 118, 119, 120, 158, 159, 160, 168, 169, 170, 178, 179, 180, 188, 189, 190, 198, 199, 200, 208, 209, 210, 218, 219, 220, 228, 229, 230, 238, 239, 240, 248, 249, 250, 258, 259, 260, 268, 269, 270, 278, 279, 280, 288, 289, 290, 298, 299, 300 308, 309, 310, 318, 319, 320, 328, 329, 330, 338, 339, 340, 348, 349, 350, 358, 359, 360, 368, 369 370 378, 379, 380, 388, 389, 390, 398, 399, 400, 408, 409, 410, 418, 419, 420, 428, 429, 430, 438, 439, 440, 448, 449, 450, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 478, 479, 480, 488, 489, 490, 498, 499, 500 508, 509, 510, 518, 519, 520, 528, 529, 530, 538, 539, 540, 548, 549, 550, 558, 559, 560, 568, 569, 570, 578, 579, 580, 588, 589 및 590으로부터 독립적으로 선택되는 3개의 CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는, 예를 들어 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13, 14, 15, 23, 24, 25, 33, 34, 35, 43, 44, 45, 53, 54, 55, 63, 64, 65, 73, 74, 75, 83, 84, 85, 93, 94, 95, 103, 104, 105, 113, 114, 115, 153, 154, 155, 163, 164, 165, 173, 174, 175, 183, 184, 185, 193, 194, 195, 203, 204, 205, 213, 214, 215, 223, 224, 225, 233, 234, 235, 243, 244, 245, 253, 254, 255, 263, 264, 265, 273, 274, 275, 283, 284, 285, 293, 294, 295, 303, 304, 305, 313, 314, 315, 353, 354, 355, 363, 364, 365, 373, 374, 375, 383, 384, 385, 393, 394, 395, 403, 404, 405, 413, 414, 415, 453, 454, 455, 463, 464, 465, 473, 474, 475, 483, 484, 485, 493, 494, 495, 503, 504, 505, 513, 514, 515, 553, 554, 555, 563, 564, 565, 573, 574, 575, 583, 584 및 585로부터 독립적으로 선택되는 3개의 CDR 및 예를 들어 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 8, 9, 10, 18, 19, 20, 28, 29, 30, 38, 39, 40, 48, 49, 50, 58, 59, 60, 68, 69, 70, 78, 79, 80, 88, 89, 90, 98, 99, 100, 108, 109, 118, 119, 120, 158, 159, 160, 168, 169, 170, 178, 179, 180, 188, 189, 190, 198, 199, 200, 208, 209, 210, 218, 219, 220, 228, 229, 230, 238, 239, 240, 248, 249, 250, 258, 259, 260, 268, 269, 270, 278, 279, 280, 288, 289, 290, 298, 299, 300 308, 309, 310, 318, 319, 320, 328, 329, 330, 338, 339, 340, 348, 349, 350, 358, 359, 360, 368, 369 370 378, 379, 380, 388, 389, 390, 398, 399, 400, 408, 409, 410, 418, 419, 420, 428, 429, 430, 438, 439, 440, 448, 449, 450, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 478, 479, 480, 488, 489, 490, 498, 499, 500 508, 509, 510, 518, 519, 520, 528, 529, 530, 538, 539, 540, 548, 549, 550, 558, 559, 560, 568, 569, 570, 578, 579, 580, 588, 589 및 590으로부터 독립적으로 선택되는 3개의 CDR을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 3, 4 및 5, 예를 들어 SEQ ID NO: 3 및 4, SEQ ID NO: 3 및 5, 또는 SEQ ID NO: 4 및 5로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 3, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 4 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 13, 14 및 15, 예를 들어 SEQ ID NO: 13 및 14, SEQ ID NO: 13 및 15, 또는 SEQ ID NO: 14 및 15로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 13, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 14 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 15를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 23, 24 및 25, 예를 들어 SEQ ID NO: 23 및 24, SEQ ID NO: 23 및 25, 또는 SEQ ID NO: 24 및 25로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 23, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 24 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 25를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 33, 34 및 35, 예를 들어 SEQ ID NO: 33 및 34, SEQ ID NO: 33 및 35, 또는 SEQ ID NO: 34 및 35로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 33, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 34 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 35를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 43, 44 및 45, 예를 들어 SEQ ID NO: 43 및 44, SEQ ID NO: 43 및 45, 또는 SEQ ID NO: 44 및 45로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 43, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 44 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 45를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 53, 54 및 55, 예를 들어 SEQ ID NO: 53 및 54, SEQ ID NO: 53 및 55, 또는 SEQ ID NO: 54 및 55로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 53, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 54 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 55를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 63, 64 및 65, 예를 들어 SEQ ID NO: 63 및 64, SEQ ID NO: 63 및 65, 또는 SEQ ID NO: 64 및 65로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 63, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 64 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 65를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 73, 74 및 75, 예를 들어 SEQ ID NO: 73 및 74, SEQ ID NO: 73 및 75, 또는 SEQ ID NO: 74 및 75로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 73, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 74 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 75를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 83, 84 및 85, 예를 들어 SEQ ID NO: 83 및 84, SEQ ID NO: 83 및 85, 또는 SEQ ID NO: 84 및 85로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 83, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 84 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 85를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 93, 94 및 95, 예를 들어 SEQ ID NO: 93 및 94, SEQ ID NO: 93 및 95, 또는 SEQ ID NO: 94 및 95로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 93, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 94 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 95를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 103, 104 및 105, 예를 들어 SEQ ID NO: 103 및 104, SEQ ID NO: 103 및 105, 또는 SEQ ID NO: 104 및 105로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 103, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 104 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 113, 114 및 115, 예를 들어 SEQ ID NO: 113 및 114, SEQ ID NO: 113 및 115, 또는 SEQ ID NO: 114 및 115로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 113, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 114 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 115를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 123, 124 및 125, 예를 들어 SEQ ID NO: 123 및 124, SEQ ID NO: 123 및 125, 또는 SEQ ID NO: 124 및 25로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 123, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 124 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 125를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 133, 134 및 135, 예를 들어 SEQ ID NO: 133 및 134, SEQ ID NO: 133 및 135, 또는 SEQ ID NO: 134 및 135로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 133, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 134 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 135를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 143, 144 및 145, 예를 들어 SEQ ID NO: 143 및 144, SEQ ID NO: 143 및 145, 또는 SEQ ID NO: 144 및 145로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 143, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 144 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 145를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 153, 154 및 155, 예를 들어 SEQ ID NO: 153 및 154, SEQ ID NO: 153 및 155, 또는 SEQ ID NO: 154 및 155로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 153, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 154 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 155를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 163, 164 및 165, 예를 들어 SEQ ID NO: 163 및 164, SEQ ID NO: 163 및 165, 또는 SEQ ID NO: 164 및 165로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 163, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 164 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 165를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 173, 174 및 175, 예를 들어 SEQ ID NO: 173 및 174, SEQ ID NO: 173 및 175, 또는 SEQ ID NO: 174 및 175로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 173, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 174 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 175를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 183, 184 및 185, 예를 들어 SEQ ID NO: 183 및 184, SEQ ID NO: 183 및 185, 또는 SEQ ID NO: 184 및 185로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 183, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 184 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 185를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 193, 194 및 195, 예를 들어 SEQ ID NO: 193 및 194, SEQ ID NO: 193 및 95, 또는 SEQ ID NO: 194 및 195로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 193, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 194 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 195를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 203, 204 및 205, 예를 들어 SEQ ID NO: 203 및 204, SEQ ID NO: 203 및 205, 또는 SEQ ID NO: 204 및 205로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 203, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 204 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 205를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 213, 214 및 215, 예를 들어 SEQ ID NO: 213 및 214, SEQ ID NO: 213 및 215, 또는 SEQ ID NO: 214 및 215로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 213, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 214 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 215를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 223, 224 및 225, 예를 들어 SEQ ID NO: 223 및 224, SEQ ID NO: 223 및 225, 또는 SEQ ID NO: 224 및 225로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 223, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 224 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 225를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 233, 234 및 235, 예를 들어 SEQ ID NO: 233 및 234, SEQ ID NO: 233 및 235, 또는 SEQ ID NO: 234 및 235로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 233, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 234 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 235를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 243, 244 및 245, 예를 들어 SEQ ID NO: 243 및 244, SEQ ID NO: 243 및 245, 또는 SEQ ID NO: 244 및 245로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 243, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 244 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 245를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 253, 254 및 255, 예를 들어 SEQ ID NO: 253 및 254, SEQ ID NO: 253 및 255, 또는 SEQ ID NO: 254 및 255로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 253, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 254 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 255를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 263, 264 및 265, 예를 들어 SEQ ID NO: 263 및 264, SEQ ID NO: 263 및 265, 또는 SEQ ID NO: 264 및 265로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 263, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 264 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 265를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 273, 274 및 275, 예를 들어 SEQ ID NO: 273 및 274, SEQ ID NO: 273 및 275, 또는 SEQ ID NO: 274 및 275로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 273, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 274 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 275를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 283, 284 및 285, 예를 들어 SEQ ID NO: 283 및 284, SEQ ID NO: 283 및 285, 또는 SEQ ID NO: 284 및 285로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 283, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 284 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 285를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 293, 294 및 295, 예를 들어 SEQ ID NO: 293 및 294, SEQ ID NO: 293 및 295, 또는 SEQ ID NO: 294 및 295로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 293, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 294 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 295를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 303, 304 및 305, 예를 들어 SEQ ID NO: 303 및 304, SEQ ID NO: 303 및 305, 또는 SEQ ID NO: 304 및 305로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 303, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 304 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 305를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 313, 314 및 315, 예를 들어 SEQ ID NO: 313 및 314, SEQ ID NO: 313 및 315, 또는 SEQ ID NO: 314 및 315로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 313, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 314 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 315를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 323, 324 및 325, 예를 들어 SEQ ID NO: 323 및 324, SEQ ID NO: 323 및 325, 또는 SEQ ID NO: 324 및 325로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 323, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 324 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 325를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 333, 334 및 335, 예를 들어 SEQ ID NO: 333 및 334, SEQ ID NO: 333 및 335, 또는 SEQ ID NO: 334 및 335로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 333, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 334 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 335를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 343, 344 및 345, 예를 들어 SEQ ID NO: 343 및 344, SEQ ID NO: 343 및 345, 또는 SEQ ID NO: 344 및 345로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 343, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 344 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 345를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 353, 354 및 355, 예를 들어 SEQ ID NO: 353 및 354, SEQ ID NO: 353 및 355, 또는 SEQ ID NO: 354 및 355로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 353, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 354 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 355를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 363, 364 및 365, 예를 들어 SEQ ID NO: 363 및 364, SEQ ID NO: 363 및 365, 또는 SEQ ID NO: 364 및 365로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 363, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 364 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 365를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 373, 374 및 375, 예를 들어 SEQ ID NO: 373 및 374, SEQ ID NO: 373 및 375, 또는 SEQ ID NO: 374 및 375로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 373, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 374 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 375를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 383, 384 및 385, 예를 들어 SEQ ID NO: 383 및 384, SEQ ID NO: 383 및 385, 또는 SEQ ID NO: 384 및 385로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 383, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 384 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 385를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 393, 394 및 395, 예를 들어 SEQ ID NO: 393 및 394, SEQ ID NO: 393 및 395, 또는 SEQ ID NO: 394 및 395로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 393, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 394 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 395를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 403, 404 및 405, 예를 들어 SEQ ID NO: 403 및 404, SEQ ID NO: 403 및 405, 또는 SEQ ID NO: 404 및 405로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 403, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 404 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 405를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 413, 414 및 415, 예를 들어 SEQ ID NO: 413 및 414, SEQ ID NO: 413 및 415, 또는 SEQ ID NO: 414 및 415로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 413, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 414 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 415를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 423, 424 및 425, 예를 들어 SEQ ID NO: 423 및 424, SEQ ID NO: 423 및 425, 또는 SEQ ID NO: 424 및 425로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 423, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 424 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 425를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 433, 434 및 435, 예를 들어 SEQ ID NO: 433 및 434, SEQ ID NO: 433 및 435, 또는 SEQ ID NO: 434 및 435로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 433, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 434 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 435를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 443, 444 및 445, 예를 들어 SEQ ID NO: 443 및 444, SEQ ID NO: 443 및 445, 또는 SEQ ID NO: 444 및 445로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 443, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 444 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 445를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 453, 454 및 455, 예를 들어 SEQ ID NO: 453 및 454, SEQ ID NO: 453 및 455, 또는 SEQ ID NO: 454 및 455로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 453, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 454 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 455를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 463, 464 및 465, 예를 들어 SEQ ID NO: 463 및 464, SEQ ID NO: 463 및 465, 또는 SEQ ID NO: 464 및 465로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 463, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 464 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 465를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 473, 474 및 475, 예를 들어 SEQ ID NO: 473 및 474, SEQ ID NO: 473 및 475, 또는 SEQ ID NO: 474 및 475로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 473, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 474 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 475를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 483, 484 및 485, 예를 들어 SEQ ID NO: 483 및 484, SEQ ID NO: 483 및 485, 또는 SEQ ID NO: 484 및 485로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 483, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 484 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 485를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 493, 494 및 495, 예를 들어 SEQ ID NO: 493 및 494, SEQ ID NO: 493 및 495, 또는 SEQ ID NO: 494 및 495로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 493, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 494 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 495를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 503, 504 및 505, 예를 들어 SEQ ID NO: 503 및 504, SEQ ID NO: 503 및 505, 또는 SEQ ID NO: 504 및 505로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 503, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 504 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 505를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 513, 514 및 515, 예를 들어 SEQ ID NO: 513 및 514, SEQ ID NO: 513 및 515, 또는 SEQ ID NO: 514 및 515로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 513, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 514 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 515를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 523, 524 및 525, 예를 들어 SEQ ID NO: 523 및 524, SEQ ID NO: 523 및 525, 또는 SEQ ID NO: 524 및 525로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 523, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 524 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 525를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 533, 534 및 535, 예를 들어 SEQ ID NO: 533 및 534, SEQ ID NO: 533 및 535, 또는 SEQ ID NO: 534 및 535로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 533, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 534 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 535를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 543, 544 및 545, 예를 들어 SEQ ID NO: 543 및 544, SEQ ID NO: 543 및 545, 또는 SEQ ID NO: 544 및 545로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 543, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 544 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 545를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 553, 554 및 555, 예를 들어 SEQ ID NO: 553 및 554, SEQ ID NO: 553 및 555, 또는 SEQ ID NO: 554 및 555로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 553, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 554 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 555를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 563, 564 및 565, 예를 들어 SEQ ID NO: 563 및 564, SEQ ID NO: 563 및 565, 또는 SEQ ID NO: 564 및 565로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 563, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 564 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 565를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 573, 574 및 575, 예를 들어 SEQ ID NO: 573 및 574, SEQ ID NO: 573 및 575, 또는 SEQ ID NO: 574 및 575로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 573, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 574 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 575를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 583, 584 및 585, 예를 들어 SEQ ID NO: 583 및 584, SEQ ID NO: 583 및 585, 또는 SEQ ID NO: 584 및 585로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 583, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 584 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 585를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 8, 9 및 10, 예를 들어 SEQ ID NO: 8 및 9, SEQ ID NO: 8 및 10, 또는 SEQ ID NO: 9 및 10으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 8, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 9 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 10을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 18, 19 및 20, 예를 들어 SEQ ID NO: 18 및 19, SEQ ID NO: 18 및 20, 또는 SEQ ID NO: 19 및 20으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 18, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 19 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 20을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 28, 29 및 30, 예를 들어 SEQ ID NO: 28 및 29, SEQ ID NO: 28 및 30, 또는 SEQ ID NO: 29 및 30으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 28, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 29 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 30을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 38, 39 및 40, 예를 들어 SEQ ID NO: 38 및 39, SEQ ID NO: 38 및 40, 또는 SEQ ID NO: 39 및 40으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 38, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 39 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 40을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 48, 49 및 50, 예를 들어 SEQ ID NO: 48 및 49, SEQ ID NO: 48 및 50, 또는 SEQ ID NO: 49 및 50으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 48, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 49 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 50을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 58, 59 및 60, 예를 들어 SEQ ID NO: 58 및 59, SEQ ID NO: 58 및 60, 또는 SEQ ID NO: 59 및 60으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 58, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 59 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 60을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 68, 69 및 70, 예를 들어 SEQ ID NO: 68 및 69, SEQ ID NO: 68 및 70, 또는 SEQ ID NO: 69 및 70으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 68, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 69 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 70을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 78, 79 및 80, 예를 들어 SEQ ID NO: 78 및 79, SEQ ID NO: 78 및 80, 또는 SEQ ID NO: 79 및 80으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 78, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 79 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 80을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 88, 89 및 90, 예를 들어 SEQ ID NO: 88 및 89, SEQ ID NO: 88 및 90, 또는 SEQ ID NO: 89 및 90으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 88, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 89 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 90을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 98, 99 및 100, 예를 들어 SEQ ID NO: 98 및 99, SEQ ID NO: 98 및 100, 또는 SEQ ID NO: 99 및 100으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 98, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 99 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 100을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 108, 109 및 110, 예를 들어 SEQ ID NO: 108 및 109, SEQ ID NO: 108 및 110, 또는 SEQ ID NO: 109 및 110으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 108, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 109 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 110을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 118, 119 및 120, 예를 들어 SEQ ID NO: 118 및 119, SEQ ID NO: 118 및 120, 또는 SEQ ID NO: 119 및 120으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 118, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 119 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 128, 129 및 130, 예를 들어 SEQ ID NO: 128 및 129, SEQ ID NO: 128 및 130, 또는 SEQ ID NO: 129 및 130으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 128, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 129 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 130을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 138, 139 및 140, 예를 들어 SEQ ID NO: 138 및 139, SEQ ID NO: 138 및 140, 또는 SEQ ID NO: 139 및 140으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 138, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 139 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 140을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 148, 149 및 150, 예를 들어 SEQ ID NO: 148 및 149, SEQ ID NO: 148 및 150, 또는 SEQ ID NO: 149 및 150으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 148, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 149 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 158, 159 및 160, 예를 들어 SEQ ID NO: 158 및 159, SEQ ID NO: 158 및 160, 또는 SEQ ID NO: 159 및 160으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 158, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 159 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 160을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 168, 169 및 170, 예를 들어 SEQ ID NO: 168 및 169, SEQ ID NO: 168 및 170, 또는 SEQ ID NO: 169 및 170으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 168, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 169 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 170을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 178, 179 및 180, 예를 들어 SEQ ID NO: 178 및 179, SEQ ID NO: 178 및 180, 또는 SEQ ID NO: 179 및 180으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 178, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 179 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 180을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 188, 189 및 190, 예를 들어 SEQ ID NO: 188 및 189, SEQ ID NO: 188 및 190, 또는 SEQ ID NO: 189 및 190으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 188, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 189 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 190을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 198, 199 및 200, 예를 들어 SEQ ID NO: 198 및 199, SEQ ID NO: 198 및 200, 또는 SEQ ID NO: 199 및 200으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 198, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 199 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 200을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 208, 209 및 210, 예를 들어 SEQ ID NO: 208 및 209, SEQ ID NO: 208 및 210, 또는 SEQ ID NO: 209 및 210으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 208, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 209 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 210을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 218, 219 및 220, 예를 들어 SEQ ID NO: 218 및 219, SEQ ID NO: 218 및 220, 또는 SEQ ID NO: 219 및 220으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 218, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 219 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 220을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 228, 229 및 230, 예를 들어 SEQ ID NO: 228 및 229, SEQ ID NO: 228 및 230, 또는 SEQ ID NO: 229 및 230으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 228, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 229 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 230을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 238, 239 및 240, 예를 들어 SEQ ID NO: 238 및 239, SEQ ID NO: 238 및 240, 또는 SEQ ID NO: 239 및 240으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 238, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 239 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 240을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 248, 249 및 250, 예를 들어 SEQ ID NO: 248 및 249, SEQ ID NO: 248 및 250, 또는 SEQ ID NO: 249 및 250으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 248, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 249 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 220을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 258, 259 및 260, 예를 들어 SEQ ID NO: 258 및 259, SEQ ID NO: 258 및 260, 또는 SEQ ID NO: 259 및 260으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 258, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 259 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 260을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 268, 269 및 270, 예를 들어 SEQ ID NO: 268 및 269, SEQ ID NO: 268 및 270, 또는 SEQ ID NO: 269 및 270으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 268, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 269 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 270을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 278, 279 및 280, 예를 들어 SEQ ID NO: 278 및 279, SEQ ID NO: 278 및 280, 또는 SEQ ID NO: 279 및 280으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 278, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 279 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 280을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 288, 289 및 290, 예를 들어 SEQ ID NO: 288 및 289, SEQ ID NO: 288 및 290, 또는 SEQ ID NO: 289 및 290으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 288, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 289 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 290을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 298, 299 및 300, 예를 들어 SEQ ID NO: 298 및 299, SEQ ID NO: 298 및 300, 또는 SEQ ID NO: 299 및 300으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 298, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 299 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 300을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 308, 309 및 310, 예를 들어 SEQ ID NO: 308 및 309, SEQ ID NO: 308 및 310, 또는 SEQ ID NO: 309 및 310으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 308, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 309 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 310을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 318, 319 및 320, 예를 들어 SEQ ID NO: 318 및 319, SEQ ID NO: 318 및 320, 또는 SEQ ID NO: 319 및 320으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 318, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 319 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 320을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 328, 329 및 330, 예를 들어 SEQ ID NO: 328 및 329, SEQ ID NO: 328 및 330, 또는 SEQ ID NO: 329 및 330으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 328, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 329 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 330을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 338, 339 및 340, 예를 들어 SEQ ID NO: 338 및 339, SEQ ID NO: 338 및 340, 또는 SEQ ID NO: 339 및 340으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 338, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 339 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 340을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 348, 349 및 350, 예를 들어 SEQ ID NO: 348 및 349, SEQ ID NO: 348 및 350, 또는 SEQ ID NO: 349 및 350으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 348, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 349 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 320을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 358, 359 및 360, 예를 들어 SEQ ID NO: 358 및 359, SEQ ID NO: 358 및 360, 또는 SEQ ID NO: 359 및 360으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 358, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 359 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 360을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 368, 369 및 370, 예를 들어 SEQ ID NO: 368 및 369, SEQ ID NO: 368 및 370, 또는 SEQ ID NO: 369 및 370으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 368, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 369 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 370을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 378, 379 및 380, 예를 들어 SEQ ID NO: 378 및 379, SEQ ID NO: 378 및 380, 또는 SEQ ID NO: 379 및 380으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 378, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 379 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 380을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 388, 389 및 390, 예를 들어 SEQ ID NO: 388 및 389, SEQ ID NO: 388 및 390, 또는 SEQ ID NO: 389 및 390으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 388, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 389 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 390을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 398, 399 및 400, 예를 들어 SEQ ID NO: 398 및 399, SEQ ID NO: 398 및 400, 또는 SEQ ID NO: 399 및 400으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 398, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 399 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 400을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 408, 409 및 410, 예를 들어 SEQ ID NO: 408 및 409, SEQ ID NO: 408 및 410, 또는 SEQ ID NO: 409 및 410으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 408, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 409 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 410을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 418, 419 및 420, 예를 들어 SEQ ID NO: 418 및 419, SEQ ID NO: 418 및 420, 또는 SEQ ID NO: 419 및 420으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 418, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 419 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 420을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 428, 429 및 430, 예를 들어 SEQ ID NO: 428 및 429, SEQ ID NO: 428 및 430, 또는 SEQ ID NO: 429 및 430으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 428, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 429 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 430을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 438, 439 및 440, 예를 들어 SEQ ID NO: 438 및 439, SEQ ID NO: 438 및 440, 또는 SEQ ID NO: 439 및 440으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 438, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 439 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 440을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 448, 449 및 450, 예를 들어 SEQ ID NO: 448 및 449, SEQ ID NO: 448 및 450, 또는 SEQ ID NO: 449 및 450으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 448, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 449 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 420을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 458, 459 및 460, 예를 들어 SEQ ID NO: 458 및 459, SEQ ID NO: 458 및 460, 또는 SEQ ID NO: 459 및 460으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 458, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 459 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 460을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 468, 469 및 470, 예를 들어 SEQ ID NO: 468 및 469, SEQ ID NO: 468 및 470, 또는 SEQ ID NO: 469 및 470으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 468, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 469 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 470을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 478, 479 및 480, 예를 들어 SEQ ID NO: 478 및 479, SEQ ID NO: 478 및 480, 또는 SEQ ID NO: 479 및 480으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 478, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 479 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 480을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 488, 489 및 490, 예를 들어 SEQ ID NO: 488 및 489, SEQ ID NO: 488 및 490, 또는 SEQ ID NO: 489 및 490으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 488, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 489 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 490을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 498, 499 및 500, 예를 들어 SEQ ID NO: 498 및 499, SEQ ID NO: 498 및 500, 또는 SEQ ID NO: 499 및 500으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 498, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 499 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 500을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 508, 509 및 510, 예를 들어 SEQ ID NO: 508 및 509, SEQ ID NO: 508 및 510, 또는 SEQ ID NO: 509 및 510으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 508, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 509 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 510을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 518, 519 및 520, 예를 들어 SEQ ID NO: 518 및 519, SEQ ID NO: 518 및 520, 또는 SEQ ID NO: 519 및 520으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 518, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 519 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 520을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 528, 529 및 530, 예를 들어 SEQ ID NO: 528 및 529, SEQ ID NO: 528 및 530, 또는 SEQ ID NO: 529 및 530으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 528, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 529 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 530을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 538, 539 및 540, 예를 들어 SEQ ID NO: 538 및 539, SEQ ID NO: 538 및 540, 또는 SEQ ID NO: 539 및 540으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 538, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 539 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 540을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 548, 549 및 550, 예를 들어 SEQ ID NO: 548 및 549, SEQ ID NO: 548 및 550, 또는 SEQ ID NO: 549 및 550으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 548, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 549 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 520을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 558, 559 및 560, 예를 들어 SEQ ID NO: 558 및 559, SEQ ID NO: 558 및 560, 또는 SEQ ID NO: 559 및 560으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 558, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 559 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 560을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 568, 569 및 570, 예를 들어 SEQ ID NO: 568 및 569, SEQ ID NO: 568 및 570, 또는 SEQ ID NO: 569 및 570으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 568, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 569 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 570을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 578, 579 및 580, 예를 들어 SEQ ID NO: 578 및 579, SEQ ID NO: 578 및 580, 또는 SEQ ID NO: 579 및 580으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 578, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 579 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 580을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 588, 589 및 590, 예를 들어 SEQ ID NO: 588 및 589, SEQ ID NO: 588 및 590, 또는 SEQ ID NO: 589 및 590으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR, 예컨대 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 588, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 589 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 590을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 103, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 104 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 108, 109 및 120으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 108, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 109 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 113, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 114 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 115를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 118, 119 및 120으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 118, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 119 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 123, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 124 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 125를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 128, 129 및 130으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 128, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 129 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 130을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 133, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 134 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 135를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 138, 139 및 140으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 138, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 139 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 140을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 143, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 144 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 145를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 148, 149 및 150으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 148, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 149 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 150을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 153, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 154 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 155를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 158, 159 및 160으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 158, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 159 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 160을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 163, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 164 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 165를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 168, 169 및 170으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 168, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 169 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 170을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 173, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 174 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 175를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 178, 179 및 180으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 178, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 179 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 180을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 183, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 184 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 185를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 188, 189 및 190으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 188, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 189 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 190을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 193, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 194 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 195를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 198, 199 및 200으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 198, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 199 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 200을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 203, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 204 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 205를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 208, 209 및 220으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 208, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 209 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 220을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 213, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 214 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 215를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 218, 219 및 220으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 218, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 219 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 220을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 223, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 224 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 225를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 228, 229 및 230으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 228, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 229 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 230을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 233, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 234 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 235를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 238, 239 및 240으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 238, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 239 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 240을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 243, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 244 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 245를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 248, 249 및 250으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 248, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 249 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 250을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 253, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 254 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 255를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 258, 259 및 260으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 258, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 259 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 260을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 263, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 264 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 265를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 268, 269 및 270으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 268, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 269 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 270을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 273, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 274 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 275를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 278, 279 및 280으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 278, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 279 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 280을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 283, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 284 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 285를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 288, 289 및 290으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 288, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 289 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 290을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 293, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 294 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 295를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 298, 299 및 300으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 298, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 299 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 300을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 303, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 304 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 305를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 308, 309 및 320으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 308, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 309 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 320을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 313, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 314 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 315를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 318, 319 및 320으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 318, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 319 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 320을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 323, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 324 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 325를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 328, 329 및 330으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 328, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 329 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 330을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 333, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 334 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 335를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 338, 339 및 340으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 338, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 339 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 340을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 343, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 344 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 345를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 348, 349 및 350으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 348, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 349 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 350을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 353, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 354 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 355를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 358, 359 및 360으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 358, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 359 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 360을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 363, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 364 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 365를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 368, 369 및 370으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 368, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 369 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 370을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 373, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 374 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 375를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 378, 379 및 380으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 378, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 379 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 380을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 383, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 384 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 385를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 388, 389 및 390으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 388, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 389 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 390을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 393, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 394 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 395를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 398, 399 및 400으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 398, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 399 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 400을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 403, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 404 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 405를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 408, 409 및 420으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 408, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 409 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 420을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 413, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 414 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 415를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 418, 419 및 420으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 418, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 419 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 420을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 423, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 424 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 425를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 428, 429 및 430으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 428, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 429 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 430을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 433, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 434 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 435를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 438, 439 및 440으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 438, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 439 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 440을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 443, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 444 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 445를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 448, 449 및 450으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 448, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 449 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 450을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 453, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 454 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 455를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 458, 459 및 460으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 458, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 459 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 460을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 463, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 464 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 465를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 468, 469 및 470으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 468, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 469 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 470을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 473, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 474 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 475를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 478, 479 및 480으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 478, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 479 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 480을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 483, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 484 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 485를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 488, 489 및 490으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 488, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 489 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 490을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 493, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 494 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 495를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 498, 499 및 500으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 498, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 499 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 500을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 503, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 504 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 505를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 508, 509 및 520으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 508, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 509 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 520을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 513, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 514 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 515를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 518, 519 및 520으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 518, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 519 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 520을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 523, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 524 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 525를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 528, 529 및 530으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 528, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 529 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 530을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 533, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 534 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 535를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 538, 539 및 540으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 538, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 539 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 540을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 543, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 544 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 545를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 548, 549 및 550으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 548, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 549 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 550을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 553, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 554 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 555를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 558, 559 및 560으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 558, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 559 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 560을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 563, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 564 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 565를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 568, 569 및 570으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL:1에 대해 SEQ ID NO: 568, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 569 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 570을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 573, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 574 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 575를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 578, 579 및 580으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 578, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 579 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 580을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 CDRH1에 대해 SEQ ID NO: 583, CDRH2에 대해 SEQ ID NO: 584 및 CDRH3에 대해 SEQ ID NO: 585를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 독립적으로 SEQ ID NO: 588, 589 및 590으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 내 적어도 하나의 CDR, 특히 CDRL1에 대해 SEQ ID NO: 588, CDRL2에 대해 SEQ ID NO: 589 및 CDRL3에 대해 SEQ ID NO: 590을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 2의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 7의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 2의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 7의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 12의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 17의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 12의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 17의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 22의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 27의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 22의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 27의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 32의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 37의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 32의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 37의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 52의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 57의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 52의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 57의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 62의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 67의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 62의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 67의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 72의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 77의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 72의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 77의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 82의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 87의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 82의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 87의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 92의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 97의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 92의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 97의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 102의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 107의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 102의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 107의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 112의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 117의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 112의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 117의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 122의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 127의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 122의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 127의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 132의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 137의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 132의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 137의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 152의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 157의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 152의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 157의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 162의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 167의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 162의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 167의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 172의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 177의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 172의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 177의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 182의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 187의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 182의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 187의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 192의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 197의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 192의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 197의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 202의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 207의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 202의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 207의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 212의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 217의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 212의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 217의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 222의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 227의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 222의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 227의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 232의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 237의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 232의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 237의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 242의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 247의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 242의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 247의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 252의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 257의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 252의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 257의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 262의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 267의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 262의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 267의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 272의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 277의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 272의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 277의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 282의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 287의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 282의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 287의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 292의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 297의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 292의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 297의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 302의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 307의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 302의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 307의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 312의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 317의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 312의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 317의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 322의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 327의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 322의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 327의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 332의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 337의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 332의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 337의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 352의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 357의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 352의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 357의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 362의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 367의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 362의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 367의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 372의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 377의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 372의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 377의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 382의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 387의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 382의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 387의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 392의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 397의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 392의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 397의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 402의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 407의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 402의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 407의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 412의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 417의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 412의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 417의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 422의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 427의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 422의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 427의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 432의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 437의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 432의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 437의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 452의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 457의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 452의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 457의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 462의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 467의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 462의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 467의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 472의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 477의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 472의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 477의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 482의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 487의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 482의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 487의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 492의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 497의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 492의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 497의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 502의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 507의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 502의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 507의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 512의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 517의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 512의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 517의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 522의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 527의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 522의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 527의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 532의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 537의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 532의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 537의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 552의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 557의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 552의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 557의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 562의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 567의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 562의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 567의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 572의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 577의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 572의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 577의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 582의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 587의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 582의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 587의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 592의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 594의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 592의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 59의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 596의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 598의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 596의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 598의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 600의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 602의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 600의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 602의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 604의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 606의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 604의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 606의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 608의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 610의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 608의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 610의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 612의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 614의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 612의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 614의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 616의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 618의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 616의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 618의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 620의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 622의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 620의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 622의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 624의 가변 영역을, 예를 들어 중쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 626의 가변 영역을, 예를 들어 경쇄 내의 가변 영역으로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 SEQ ID NO: 624의 가변 중쇄 영역 및 SEQ ID NO: 626의 가변 경쇄 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는, IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이며, 여기서 VH는 상기 개시된 VH, 예로 SEQ ID NO: 182 또는 SEQ ID NO 616과 적어도 90%, 예를 들어 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는, IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이며, 여기서 상기, 예로 SEQ ID NO: 182 또는 SEQ ID NO 616에 개시된 VH는 독립적으로 프레임워크 내의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체되거나 결실된 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는, IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이며, 여기서 VL은 상기, 예로 SEQ ID NO: 187 또는 SEQ ID NO 618에 개시된 VL과 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는, IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이며, 여기서 상기, 예로 SEQ ID NO: 187 또는 SEQ ID NO 618에 개시된 VL은 독립적으로 프레임워크 내의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체되거나 결실된 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는, IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이며, 여기서 VH는 상기, 예로 SEQ ID NO: 182 또는 SEQ ID NO. 616에 개시된 VH와 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가지며, VL은 상기, 예로 SEQ ID NO: 187 또는 또는 SEQ ID NO 618에 개시된 VL과 적어도 90%, 예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 VH 및 VL을 포함하는, IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이며, 여기서 상기, 예로 SEQ ID NO: 182 또는 SEQ ID NO 616에 개시된 VH VH는 독립적으로 프레임워크 내의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체되거나 결실된 서열을 가지며, 상기, 예로 SEQ ID NO: 187 또는 SEQ ID NO 618에 개시된 VL은 독립적으로 프레임워크 내의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체되거나 결실된 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서, 결합 분자를 교차-차단하는 항체 또는 이의 결합 단편, 예를 들어 본 개시에 따른 항체 또는 결합 단편이 제공되며, 특히 상기 항체 또는 결합 단편은 본원에 개시된 분자와 동일한 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 자연 발생 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 단일쇄 항체이다. 일부 구현예에서, 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본 개시의, 특히 본원에 기재된 바와 같은, 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 것이다. 특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH를 인코딩한다. 특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 조성물에 대한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본원에서의 개시는 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 본 개시의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 방법에 의해 제조되는 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 담체를 포함하는 약학 조성물에 대한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 염증성 질병을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 대상체에 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제하는 본 개시에 따른 유효량의 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 대한 것이다.
또 다른 구현예에서, 염증성 질병을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 본 개시의 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
하나의 양태에서, 예를 들어 특히 본원에 기재된 바와 같은, 염증성 질병의 치료에서 이용하기 위한 본 개시의 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물이 제공된다.
하나의 구현예에서, 염증성 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 본 개시의 결합 분자 또는 이를 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
하나의 구현예에서, 염증성 질병은 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 만성 코굴염, 섬유증식성 질환(예를 들어 폐 섬유증), 폐 호산구증가증, 가슴막 종양, 류마티스성 관절염, 콜라겐 혈관 질환, 죽상경화성 혈관 질환, 두드러기, 염증성 장 질환(예를 들어 크론병 또는 셀리악병), 전신 홍반성 루푸스, 진행성 전신 경화증, 베게너 육아종, 패혈성 쇼크 및 베체트병으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 염증성 질병은 알러지성 장애, 예를 들어 천식, 만성 코굴염, 식품 알러지, 습진 또는 피부염, 특히 천식, 예컨대 난치성 천식(중증 천식으로도 불림)이다.
일부 구현예에서, 염증성 반응 또는 질병은 상기 대상체의 기도에 있다.
하나의 구현예에서, 염증성 반응 또는 질병은 평활근에 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 염증성 반응의 예방 방법으로서, 상기 대상체에 IL-33에 결합하고 IL-33을 ST2에 대한 결합으로부터 차단하지 않는 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하며, ST2 신호전달이 감소되는 방법에 대한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 염증성 반응의 예방 방법으로서, 상기 대상체에 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제하는 본 개시에 따른 유효량의 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 대한 것이다.
또 다른 구현에에서, 본 개시는 대상체에서 염증성 반응의 예방 방법으로서, 상기 대상체에 본 개시의 유효량의 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 대한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 확인 방법으로서, IL-33에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 IL-33의 ST2에 대한 결합을 차단하지 않고 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제하는 방법에 대한 것이다.
하나의 구현예에서, 디설파이드 결합을 형성하는 능력이 감소된, 특히 Cys-208, Cys-227, Cys-232 및 Cys-259로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 위치에서 디설파이드 결합을 형성하는 능력이 감소된 redIL-33, 예를 들어 안정화된 환원 형태, 또는 이의 돌연변이체를 이용한 숙주의 면역화가 제공된다. 하나의 구현예에서, 방법은 숙주로부터 항체를 스크리닝하는 단계, 예를 들어 기능적 검정을 이용하는 단계 및 적어도 하나의 상기 항체로부터 적어도 가변 영역을 단리하고/하거나 복제하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예에서, ST2 신호전달의 억제제, 특히 redIL-33에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편을 확인하기 위한, 디설파이드 결합을 형성하는 능력이 감소된, 특히 Cys-208, Cys-227, Cys-232 및 Cys-259로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 위치에서 디설파이드 결합을 형성하는 능력이 감소된 redIL-33, 예를 들어 안정화된 환원 형태, 또는 이의 돌연변이체의 용도가 제공된다. 하나의 구현예에서, 용도는 상기 단백질 또는 이의 활성 단편을 이용하여 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 조사하는 것을 이용한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 NFκB 신호전달을 억제하지 않는다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 redIL-33 또는 돌연변이체를 이용하여 본 개시의 결합 분자(본원에서 본 개시의 단백질로 총칭됨)를 확인하거나 생성하는 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 방법은 결합 분자를 확인하기 위해 본 개시의 단백질을 이용해서 라이브러리를 조사하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 방법은 본 개시의 단백질을 이용해서 숙주를 면역화하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 결합되는 IL-33으로부터의 에피토프, 특히 촉매성 에피토프, 즉 환원 형태로부터 산화 형태로의 IL-33의 전환속도를 강화하는 결합 에피토프가 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 샘플에서 redIL-33 발현의 검출 방법에 대한 것이다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원에서 이용되는 "단리된"이란 비-자연적 환경의, 특히 자연에서 단리된 단백질을 나타내며, 예를 들어 용어에는 생체내 단백질이나 인간 또는 동물 신체에서 채취한 샘플 내 단백질은 포함되지 않는다. 일반적으로 단백질은 담체, 예컨대 액체 또는 배지 중에 있을 것이거나 제형화, 냉동 또는 동결 건조될 수 있고, 이들 형태가 모두 "단리된" 것으로 적절하게 포괄될 수 있다. 하나의 구현예에서, 단리된이란 겔, 예를 들어 웨스턴 블롯 분석에서 이용되는 겔 또는 유사물 내의 단백질을 나타내지 않는다.
본원에서 이용되는 IL-33 단백질은 인터류킨 33, 특히 포유류 인터류킨 33 단백질, 예를 들어 UniProt 번호 O95760으로 기탁된 인간 단백질을 나타낸다. 그러나, 본 발명자들의 발견에 따르면, 상기 대상체는 단일 종이 아니며, 대신에 환원 및 산화 형태로 존재함이 명확하다. 생체내 그리고 시험관내 환원 형태의 빠른, 예를 들어 5분 내지 40분 기간 내의 산화에 기반하여, 일반적으로 IL-33에 대한 선행 기술에서의 언급은 실제로 산화 형태에 대한 언급이다. 또한, 상업적 검정은 상기 산화 형태를 정량하는 것으로 나타난다.
산화 IL-33, IL-33-DSB(디설파이드 결합형) 및 DSB IL-33은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.
본원에서 이용되는 산화 IL-33은, 예를 들어 비환원성 조건 하에 웨스턴 블롯 분석에 의해 구별되는, 특히 대응하는 환원 형태보다 4 Da 적은 질량을 갖는 밴드로 가시적인 단백질을 나타낸다. 특히, 이는 독립적으로 시스테인 208. 227, 232 및 259로부터 선택된 시스테인 간 1개 또는 2개의 디설파이드 결합을 갖는 단백질을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 산화 IL-33은 ST2에 대한 결합을 나타내지 않는다.
환원 IL-33 및 redIL-33은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.
본원에서 이용되는 환원 IL-33은 ST2에 결합하고 ST2 의존적 신호전달을 유발하는 IL-33의 형태를 나타낸다. 특히, 환원 형태의 시스테인 208, 227, 232 및 259는 디설파이드 결합되지 않는다. 본원에서 이용되는 redIL-33의 활성 단편은 redIL-33과 필적하는 활성, 예를 들어 유사한 정도의 ST2-의존적 신호전달을 갖는 단편을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 활성 단편은 전장 redIL-33의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 활성이다.
본원에서 이용되는 ST-2 의존적 신호전달은 ST2에 의한 IL-33 인식이 세포 표면 상 IL1-RAcP와의 이량체화 및 세포 내 수용체 복합체 성분 MyD88, TRAF6 및 IRAK1-4의 세포내 TIR 도메인으로의 모집을 촉진하는 IL-33/ST2 시스템을 나타낸다. 따라서 ST-2 의존적 신호전달은 IL-33의 ST2와의 상호작용 교란에 의해 또는 대안적으로 IL-1RAcP와의 상호작용 방해에 의해 방해를 받을 수 있다.
본원에서 이용되는 "안정화된 환원 형태"는 단백질이 환원 형태를 채택하거나 유지하도록 또는 산화 IL-33의 형성을 방지하도록 조장하는 변형을 나타낸다.
하나의 구현예에서 안정화는 화학적 대상체에 대한 접합, 예를 들어 바이오틴화에 의한다. redIL-33은 중성 pH에서 -SH 반응성 시약 바이오틴-BMCC(Thermo scientific에서 이용 가능함)에 노출되는 경우 단일-바이오틴화되는 경향이 있다. 본 발명자들에 의해 수행된 분석은 바이오틴화가 Cys208에서 일어남을 제시한다. 상기 위치에서의 바이오틴화는 단백질의 산화를 차단하고/하거나 감소시키는 것으로 나타난다. 이론에 구애받고자 하지 않고, 본 발명자들에 의해 수행된 컴퓨터내 분석은 Cys208이 단백질의 입체형태 변화 및 산화를 위해 필요한 활성의 잠재적 개시자임을 제시한다.
하나의 구현예에서, 안정화는 Cys208에서의 바이오틴화이다.
하나의 구현예에서, Cys208은 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys227은 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys232는 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys259는 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208 및 227은 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208 및 232는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208 및 259는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208, 227 및 232는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208, 227 및 259는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208, 232 및 259는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys227, 232 및 259는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다. 하나의 구현예에서, Cys208, 227, 232 및 259는 독립적으로 아미노산, 예컨대 세린에 의해 대체된다.
본원에서 이용되는 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 아미노산이 상이하거나 일부 다른 유형적, 예를 들어 기능적 차이가 달성되도록 하는 아미노산 서열에서의 변화 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변화를 나타낸다. 특히, 변화는 아미노 잔기의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 코돈 최적화 또는 유전 코드의 중복성은 본 출원의 맥락에서 돌연변이가 아니다.
돌연변이는 본원에서 일반적으로 이용될 것이며, 원상태 또는 야생형 단백질에 대한 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 변화가 존재하지만, 신규 서열에 대한 변화를 논의할 때에는 변이체가 이용될 것이다.
본원에서 이용되는 원상태란 대상체, 예컨대 야생형 서열에서 확인되거나 다르게는 자연 발생하는 아미노산을 나타낸다.
본원에서 이용되는 접합된이란 2개의 대상체 또는 단편을 연합하는 연결, 예를 들어 결합, 예컨대 공유 결합을 나타낸다.
본원에서 이용되는 대상체는 "요소", 분자, 단편, 원자, 성분 등을 나타낸다.
화학적 대상체는 합성 화학 공정에 의해 제조되는 유형의 분자 또는 단편이다.
하나의 구현예에서, 안정화는 IL-33 단백질의 돌연변이, 예를 들어 특히 하나 이상의 시스테인 아미노산을 대안적 아미노산, 예를 들어 세린으로 대체하는 점 돌연변이에 의한다. 본 맥락에서 이용되는 대안적 아미노산은 비-시스테인 아미노산을 나타난다. 하나의 구현예에서, 아미노산은 비-자연 발생 아미노산이다. 하나의 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 하나의 구현예에서, 아미노산은 단백질성이다. 하나의 구현예에서, 아미노산은 세린이며, 이는 보존적 치환이고 일반적으로 상기 치환 후 단백질의 활성이 보유되므로 유리하다.
redIL-33의 안정화는 이것이 IL-33의 형태를 활성 입체형태로 고정하며, 다시 단백질의 활성을 약화시키는 결합 분자를 찾기 위한 도구로서 이용될 수 있으므로 중요하다. 하나의 구현예에서, 안정화된 단백질은 분자 라이브러리, 예컨대 항체의 파지 라이브러리 또는 항체의 합성 라이브러리를 조사하기 위해 이용된다. 하나의 구현예에서, 안정화된 단백질은 숙주를 면역화하기 위해 이용됨으로써 최초로 환원 형태에 특이적인 항체를 생성할 기회를 제공한다.
본원에서 이용되는 "의 활성을 약화시킨다"란 관련 활성의 감소 또는 관련 활성의 정지를 나타낸다. 일반적으로 약화 및 억제는 맥락 상 달리 나타내지 않는 한 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.
하나의 구현예에서, 약화는 redIL-33의 결합에 의한다. 하나의 구현예에서, 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편은 redIL-33에 특이적이다, 즉 이는 산화 형태에 비해 redIL-33에 대해 더 큰 친화도를, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5배 이상 더 큰 친화도를 갖는다. 이는 본원에서 redIL-33 특이적 항체로 불린다.
하나의 구현예에서, redIL-33 특이적 항체는 수용체 ST2에 대한 결합을 입체적으로 차단하도록 결합한다.
하나의 구현예에서, redIL-33 특이적 항체는 수용체 IL-1RAcP에 대한 결합을 입체적으로 차단하도록 결합한다.
하나의 구현예에서, redIL-33 특이적 항체는 수용체 ST2에 대한 결합을 알로스테리 차단하도록 결합한다.
하나의 구현예에서, redIL-33 특이적 항체는 수용체 IL-1RAcP에 대한 결합을 알로스테리 차단하도록 결합한다.
하나의 구현예에서, redIL-33 특이적 항체는 수용체 ST2를 통한 신호전달을 알로스테리 차단하지만, ST2 및/또는 IL-1RAcP에 결합할 수 있도록 결합한다.
하나의 구현예에서, 항체는 IL-33의 산화 형태에 결합하고 환원 형태의 산화 형태로의 전환을 촉매한다. 이론에 구애받고자 하지 않고, 산화 형태의 결합에 의해, 공정의 평형이 산화 형태로의 전환을 선호하며 변화될 수 있다.
단수 대상체에 대한 용어는 하나 이상의 그 대상체를 나타냄이 주지된다; 예를 들어 "항-IL-33 항체"는 하나 이상의 항-IL-33 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, "하나의"(또는 "1개의"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
본원에서 이용되는 "폴리펩타이드"라는 용어는 단수 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수 "폴리펩타이드들"을 포괄하려는 것이며, 아마이드 결합(펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 나타낸다. "폴리펩타이드"라는 용어는 2개 이상의 아미노산의 임의 사슬 또는 사슬들을 나타내며, 특정 길이의 산물을 나타내지는 않는다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "아미노산쇄", 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내기 위해 이용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며, "폴리펩타이드"라는 용어는 임의의 이러한 용어 대신, 또는 이와 상호 교환적으로 이용될 수 있다. "폴리펩타이드"라는 용어는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 또는 비-자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩타이드의 발현-후 변형 산물을 나타내려는 것이다. 폴리펩타이드는 자연적인 생물학적 원천에서 유도되거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학적 합성에 의한 것을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩타이드는 폴딩된 것으로 언급되며, 정의된 3차원 구조를 보유하지 않고 다수의 상이한 입체형태를 채택할 수 있는 폴리펩타이드는 비-폴딩된 것으로 언급된다. 본원에서 이용되는 당단백질이라는 용어는 아미노산 잔기, 예로 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그 자연 환경에 있지 않는 폴리펩타이드를 나타내려는 것이다. 특정한 정제 수준이 요구되는 것은 아니다. 예를 들어, 단리된 폴리펩타이드는 그 원상태 또는 자연 환경에서 제거될 수 있다. 재조합적으로 제조된 폴리펩타이드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은, 분리되거나, 분획화되거나, 또는 임의의 적합한 기법에 의해 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 원상태 또는 재조합 폴리펩타이드와 마찬가지로, 본 개시의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
본원에서 이용되는 단백질은 2차 및 3차 구조를 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다.
또한 본 개시의 폴리펩타이드로서 상기 폴리펩타이드의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체 및 이의 임의의 조합이 포함된다.
예를 들어 본 개시의 단백질 또는 폴리펩타이드, 예컨대 본 개시의 항-IL-33 항체 또는 항체 폴리펩타이드를 언급하는 경우, "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"라는 용어에는 본 개시의 해당 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 적어도 일부 항원-결합 특성을 보유하는 임의의 폴리펩타이드가 포함된다. 본 개시의 폴리펩타이드의 단편에는 본원에서 다른 곳에 논의된 특정 항체 단편에 부가하여, 단백분해 단편뿐만 아니라 결실 단편이 포함된다. 본 개시의 항-IL-33 항체 및 항체 폴리펩타이드의 변이체에는 상술된 단편 및 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 포함된다. 변이체는 자연 발생하거나 비-자연 발생할 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 당분야에 공지된 돌연변이화 기법을 이용해서 제조될 수 있다.
변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 포함할 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 또한 본원에서 "폴리펩타이드 유사체"로 언급될 수 있다. 본원에서 이용되는, 예를 들어 항-IL-33 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 "유도체"는 기능적 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상 폴리펩타이드를 나타낸다. 또한, 20개 표준 아미노산의 하나 이상의 자연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩타이드가 "유도체"로서 포함된다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 프롤린에 대해 대체될 수 있으며; 5-하이드록시라이신은 라이신에 대해 대체될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 대해 대체될 수 있고; 호모세린은 세린에 대해 대체될 수 있고; 오르니틴은 라이신에 대해 대체될 수 있다. 본 개시의 항-IL-33 항체 및 항체 폴리펩타이드의 유도체에는 참조 항체 또는 본 개시의 항체 폴리펩타이드에서 확인되지 않는 추가 특색을 나타내기 위해 변경된 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포괄하려는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예로, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적 결합(예로, 펩타이드 핵산(PNA)에서 확인되는 것과 같은 아마이드 결합)을 포함할 수 있다. "핵산"이라는 용어는 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예로, 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드란 그 원상태 환경에서 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA에 대한 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유되는 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 개시의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가 예에는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 단리된 RNA 분자에는 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체가 포함된다. 본 개시의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산에는 합성적으로 제조된 이러한 분자가 추가로 포함된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결인자일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈으로 구성되는 핵산 부분이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있고, 그러나 임의의 인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 개시의 2개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 구축물에, 예로, 단일 벡터 상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 구축물에, 예로, 별도의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다, 예로, 단일 벡터가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 별도로 인코딩할 수 있다. 또한, 본 개시의 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 항-IL-33 항체 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은, 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역에는 비제한적으로 특화된 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩타이드 또는 이종성 기능적 도메인이 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에는 보통 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소가 포함될 수 있다. 작동 가능한 연관은 유전자 산물, 예로, 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역이 유전자 산물의 발현을 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 놓는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예컨대 폴리펩타이드 코딩 영역 및 이와 연관된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 일으키는 경우 그리고 두 DNA 단편 간 결합의 성질이 유전자 산물의 발현을 유도하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동 가능하게 연관된다". 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 핵산의 전사를 시행할 수 있는 경우 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 소정 세포에서만 DNA의 실질적 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자 및 전사 종결 신호가 세포 특이적 전사를 유도하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역은 본원에 개시된다.
다양한 전사 제어 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께, 최조기 프로모터), 시미안 바이러스 40(조기 프로모터) 및 레트로바이러스(예컨대 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편이 포함된다. 다른 전사 제어 영역에는 척추동물 유전자로부터 유도된 것들, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 추가적인 적합한 전사 제어 영역에는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예로, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)가 포함된다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈 및 피코나바이러스로부터 유도된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 CITE 서열로도 불리는 IRES)가 포함된다.
다른 구현예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 형태의, RNA이다.
본 개시의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 코딩 영역은 본 개시의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드의 분비를 유도하는, 분비 또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 추가적인 코딩 영역과 연관될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비된 단백질은 조면 소포체를 통해 성장하는 단백질쇄의 외수송이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가지며, 이는 완전 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성함을 인지한다. 특정한 구현예에서, 원상태 신호 펩타이드, 예로, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는 이와 작동 가능하게 연관되는 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 능력을 보유하는 그 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩타이드, 또는 이의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
본 개시의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 그 가장 광의의 개념에서 항원성 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 결합 분자는 IL-33, 특히 redIL-33 또는 IL-33-DSB에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 참조 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 하나 이상의 참조 항체 분자로부터의 적어도 6개 CDR을 포함한다.
본 개시는 특정한 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에 대한 것이다.
본원에서 이용되는 항체는 보다 상세히 아래에서 논의되는 면역글로불린 분자, 특히 전장 항체 또는 전장 항체를 포함하는 분자, 예를 들어 DVD-Ig mole 등을 나타낸다.
결합 단편은, 예를 들어 특히 6개 CDR, 예컨대 중쇄 가변 영역 내의 3개 CDR 및 경쇄 가변 영역 내의 3개 CDR을 포함하는 결합을 포함하는, 항체 단편의 에피토프/항원 결합 단편이다.
전장 항체, 예컨대 자연 발생 항체를 특이적으로 언급하지 않는 한, "항-IL-33 항체"라는 용어는 전장 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예로, 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 조작 항체 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 단편을 포괄한다.
본원에서 이용되는 "인간" 또는 "완전 인간" 항체에는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함되며 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉이고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 단리된 항체가 포함된다. 완전 인간 항체가 인간 환자의 치료적 처치를 위해 특히 바람직하다. 인간 항체는 문헌[Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996), Sheets et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci . 95:6157-6162 (1998), Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol . 227:381 (1992) 및 Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581 (1991)]에 기재된 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 이용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하여 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 기법 및 용도는 또한, 예로, U.S. 특허 번호 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963; 및 문헌[Rothe et al., J. Mol . Biol., 376:1382 (2008)]에 기재되어 있다(그 각각의 전문이 참조로 포함됨). 또한, 당분야에 공지된 바와 같이, 인간 항체는 기능적인 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 제조될 수 있다. 상기 기술의 개론에 대해서는, 문헌[Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]를 참고한다. "인간" 또는 "완전 인간" 항체에는 또한 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체가 포함되며, 여기서 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 갖는다.
"인간" 또는 "완전 인간" 항체에는 또한 본원에 기재된 항체 분자(예로, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 상술된 바와 같은 "인간" 또는 "완전 인간" 항체가 포함되며, 여기서 항체 또는 이의 단편은 본 개시에 따른 IL-33 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다.
비제한적으로 아미노산 치환을 일으키는 부위-지정 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화를 포함하여, 당업자에게 공지된 표준 기법이 인간 항-IL-33 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 변이체(유도체 포함)는 참조 VH 영역, CDRH1, CDRH2, CDRH3, VL 영역, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3에 대해 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 아미노산 치환은 아래에서 추가로 논의되는, 보존적 아미노산 치환이다. 대안적으로, 돌연변이는 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라, 예컨대 포화 돌연변이화에 의해 무작위 도입될 수 있고, 생성되는 돌연변이체는 활성(예로, IL-33 폴리펩타이드, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의의 조합에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. "인간" 또는 "완전 인간" 항체의 이러한 변이체(또는 이의 유도체)는 "최적화된" 또는 "항원 결합을 위해 최적화된" 인간 또는 완전 인간 항체로도 언급될 수 있으며, 비제한적으로 항원에 대해 개선된 친화도를 갖는 항체, 변경된 항원 특이성을 갖는 항체, 또는 잠재적인 구조적 책임이 감소된 항체가 포함된다.
척추동물 시스템에서의 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다. 예로, 문헌[Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]을 참고한다.
아래에서 보다 상세히 논의될 바와 같이, "면역글로불린"이라는 용어는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 클래스의 폴리펩타이드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로, 이들의 일부 하위클래스(예로, γ1~γ4)를 포함하여 분류됨을 이해할 것이다. 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 결정하는 것은 상기 쇄의 성질이다. 면역글로불린 하위클래스(이소형), 예로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특성규명되어 있으며, 기능적 특화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 각각의 이러한 클래스 및 이소형의 변형된 버전은 본 개시의 측면에서 당업자에게 쉽게 식별 가능하며, 따라서 본 개시의 범위 내이다. 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대한 것이겠지만, 모든 면역글로불린 클래스가 명확히 본 개시의 범위 내이다. IgG에 있어서, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 대략 23,000달톤의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드 및 분자량 53,000~70,000의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개 사슬은 전형적으로 "Y" 배치로 디설파이드 결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속 중쇄를 둘러싼다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스에는 카파 또는 람다 경쇄가 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 공유 디설파이드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배치의 포크형 말단에서의 N-말단으로부터 각 쇄의 하부에서의 C-말단까지 진행된다.
항체의 기부 "Y"는 Fc(단편, 결정형) 영역으로 불리며, 항체의 클래스에 따라 2개 또는 3개의 불변 도메인에 기여하는 2개의 중쇄로 이루어진다. 따라서, Fc 영역은 특정한 클래스의 Fc 수용체 및 다른 면역 분자, 예컨대 보체 단백질에 결합한다. 경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 구분된다. "불변" 및 "가변"이라는 용어는 기능적으로 이용된다. 이에 관해, 경쇄(Vλ 또는 Vκ) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정함이 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반통과 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례 상, 불변 영역 도메인의 넘버링은 이들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이며, C-말단 부분은 불변 영역이고; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시-말단을 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하도록 허용한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내 상보성 결정 영역(CDR)의 하위세트가 조합되어 3차원 항원 결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 상기 4원 항체 구조는 Y의 각 팔의 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 각각의 VH쇄 및 VL쇄 상에서 3개의 CDR에 의해 정의된다. 일부 경우, 예로, 카멜리드 종으로부터 유도된 또는 카멜리드 면역글로불린에 기반하여 조작된 특정한 면역글로불린 분자에서, 완전 면역글로불린 분자는 경쇄 없이 중쇄만으로 구성될 수 있다. 예로, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]을 참고한다.
자연 발생 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 그 3차원 입체 배치를 이룸에 따라 특이적으로 배치되어 항원 결합 도메인을 형성하는 짧은, 비-인접 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역으로 불리는, 항원 결합 도메인에서의 나머지 아미노산은 더 적은 분자 간 가변성을 나타낸다. 프레임워크 영역은 대략 β-시트 입체형태를 채택하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄-간, 비-공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR 배치를 제공하는 골격을 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 형성한다. 상기 상보적 표면은 그 인지체 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 이루는 아미노산은 이들이 정확히 정의되었으므로(아래 참고), 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 쉽게 확인될 수 있다.
당분야 내에서 이용되고/되거나 허용되는 용어의 정의가 2개 이상 존재하는 경우, 본원에서 이용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는 한, 이러한 모든 의미를 포함하려는 것이다. 구체적 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역 내에서 확인되는 비-인접 항원 조합 부위를 설명하기 위한 "상보성 결정 영역"("CDR")이라는 용어의 이용이다. 상기 특정 영역은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)]에 기재되었으며, 여기서 정의에는 서로 비교되는 경우 중첩 또는 하위세트의 아미노산 잔기가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 언급하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 이용되는 용어의 범위 내인 것으로 의도된다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에 의해 정의되는 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 표 1에서 아래에 나타낸다. 특정한 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열에 기반하여 어느 잔기가 특정한 CDR을 이루는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
[표 1]
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1표 1에서의 모든 CDR 정의의 넘버링은 문헌[Kabat et al.](아래 참고)에 나타낸 넘버링 관례를 따른다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 그 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고, 상기 "Kabat 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열로 모호하지 않게 지정할 수 있다. 본원에서 이용되는 "Kabat 넘버링"은 문헌[Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"]에 나타낸 넘버링 시스템을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본 개시의 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 따른다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에는 비제한적으로 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 마우스, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예로 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 디설파이드-결합 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편, 항-개별특이형(항-Id) 항체(예로, 본원에 개시된 항-IL-33 항체에 대한 항-Id 항체 포함)가 포함된다. ScFv 분자는 당분야에 공지되어 있으며, 예로, U.S. 특허 번호 5,892,019에 기재되어 있다. 본 개시의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 유형(예로, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 등) 또는 하위클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다.
본원에서 이용되는 "중쇄 부분"이라는 용어에는 면역글로불린 중쇄로부터 유도된 아미노산 서열이 포함된다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지(예로, 상부, 중앙, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 개시에서 이용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄; CH1 도메인, 적어도 일부 힌지 도메인 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄; CH1 도메인, 적어도 일부 힌지 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄, 또는 CH1 도메인, 적어도 일부 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄를 포함한다. 추가로, 본 개시에서 이용하기 위한 결합 폴리펩타이드에는 적어도 일부 CH2 도메인(예로, CH2 도메인의 전부 또는 일부)이 없을 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 이들 도메인(예로, 중쇄 부분)은 이들이 자연 발생 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열에서 변화하도록 변형될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
본원에 개시된 특정한 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩타이드쇄의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩타이드쇄 상의 부분과 동일하다. 대안적으로, 본 개시의 중쇄 부분-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는, 예를 들어, 이중특이적 항체를 형성하는, 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유도된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터, 그리고 부분적으로 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터, 그리고 부분적으로 IgG4 분자로부터 유도된 키메라성 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 "경쇄 부분"이라는 용어에는 면역글로불린 경쇄, 예로, 카파 또는 람다 경쇄로부터 유도된 아미노산 서열이 포함된다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
본원에 개시되는 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 항원, 예로, 본원에 개시되는 표적 폴리펩타이드(예로, 전장 또는 성숙 IL-33)의 에피토프(들) 또는 부분(들)의 관점에서 기재되거나 명시될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩타이드 부분은 "에피토프", 또는 "항원 결정기"이다. 표적 폴리펩타이드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2개의 에피토프를 포함하며, 항원의 크기, 입체형태 및 유형에 따라 임의 수의 에피토프가 포함될 수 있다. 또한, 표적 폴리펩타이드 상의 "에피토프"는 비-폴리펩타이드 요소일 수도 있고 또는 이를 포함할 수도 있음이, 예로 에피토프에 탄수화물 측쇄가 포함될 수 있음이 주지되어야 한다.
항체에 대한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4개 내지 5개 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 바람직하게는 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 9개 및 가장 바람직하게는 적어도 약 15개 내지 약 30개 아미노산을 함유한다. CDR은 그 3차 형태로 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있으므로, 에피토프를 이루는 아미노산이 반드시 인접할 필요는 없고, 일부 경우에는 심지어 동일한 펩타이드쇄 상에 없을 수도 있다. 본 개시의 항-IL-33 항체에 의해 인식되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 IL-33의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 인접하거나 인접하지 않는 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
"특이적으로 결합하는"이란 일반적으로 항체가 그 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합에 항원 결합 도메인 및 에피토프 간 일부 상보성이 수반됨을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 무작위, 비관련 에피토프에 결합할 것보다 더 쉽게 그 항원 결합 도메인을 통해 해당 에피토프에 결합하는 경우, 이 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. "특이성"이라는 용어는 특정한 항체가 특정한 에피토프에 결합하는 상대 친화도를 정량하기 위해 본원에서 이용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"에 비해 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수도 있고, 또는 항체 "A"는 이것이 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것보다 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 언급될 수도 있다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-33에 우선적으로 결합한다. "우선적으로 결합한다"란, 항체가 관련되거나, 유사하거나, 동종성이거나, 비슷한 에피토프에 결합할 것보다 더 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합함을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련된 에피토프와 교차-반응할 수 있는 경우에도, 관련된 에피토프에 비해 해당 에피토프에 더 쉽게 결합할 수 있을 것이다.
비제한적 예로서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(KD) 미만인 KD로 상기 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 1 단위 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 적어도 2 단위 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off) 보다 작은 오프율(k(off))로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 1 단위 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 2 단위 작은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 5 X 10-1 sec-1, 10-1 sec-1, 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 또는 l0-3 sec-1 이하의 오프율(k(off))로 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예로, IL-33, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프율(k(off))로 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예로, IL-33, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1 이상의 온률(k(on))로 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예로, IL-33, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1 이상의 온률(k(on))로 본원에 개시된 표적 폴리펩타이드(예로, IL-33, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 이용되는 교차-반응성은 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 결합 단편이 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 경우를 나타내려는 것이다. 본원에서 이용되는 경쟁적 억제 결합은 교차-반응성의 한 형태이다.
항체는 이것이 어느 정도로 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 차단하는 정도까지 해당 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 언급된다. 경쟁적 억제는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 고상 검정, 예컨대 경쟁 ELISA 검정, 해리-증강 란탄족 원소 형광 면역검정(DELFIA®, Perkin Elmer) 및 방사성리간드 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 경쟁적으로 억제하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 이용되는 "친화도"라는 용어는 개별 에피토프와 면역글로불린 분자의 CDR의 결합 강도의 척도를 나타낸다. 예로, 문헌[Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28]을 참고한다. 본원에서 이용되는 "결합력"이라는 용어는 면역글로불린 집단 및 항원 간 복합체의 전반적 안정성, 즉, 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 조합 강도를 나타낸다. 예로, 문헌[Harlow at pages 29-34]를 참고한다. 결합력은 집단 내 개별 면역글로불린 분자와 특정 에피토프의 친화도 및 또한 면역글로불린 및 항원의 공유가 모두에 관한 것이다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체 및 고도 반복 에피토프 구조를 갖는 항원, 예컨대 중합체 간 상호작용은 높은 결합력을 가질 것이다.
본 개시의 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 이의 교차-반응성의 관점에서 기재되거나 명시될 수 있다. 본원에서 이용되는 "교차-반응성"이라는 용어는 하나의 항원에 대해 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력; 2개의 상이한 항원성 물질 간 관련성의 척도를 나타낸다. 따라서, 항체는 이것이 그 형태를 유도하는 것과 다른 에피토프에 결합하는 경우 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 여러 상보적 구조 특색을 함유하며, 일부 경우에는 원래 것보다 실제로 더 잘 피팅될 수 있다.
예를 들어, 특정한 항체는 이들이 관련되지만 동일하지 않은 에피토프, 예로, 참조 에피토프와 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 및 적어도 50% 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서, 어느 정도의 교차-반응성을 갖는다. 항체는 이것이 참조 에피토프에 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만 및 50% 미만의 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않는 경우 교차-반응성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 언급될 수 있다. 항체는 이것이 해당 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르소로그, 또는 동족체에 결합하지 않는 경우, 특정한 에피토프에 대해 "고도 특이적인" 것으로 간주될 수 있다.
항-IL-33 결합 분자, 예로 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 본 개시의 폴리펩타이드, 예로, IL-33, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합에 대한 이의 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 명시될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, , 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
본 개시의 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 "다중특이적", 예로, 이중특이적, 삼중특이적이거나 더 큰 다중특이성을 가질 수 있다, 즉 하나 이상의 상이한 항원(예로, 단백질) 상에 존재하는 2개 이상의 상이한 에피토프를 동시에 인식하고 이에 결합함을 의미한다. 따라서, 항-IL-33 항체가 "단일특이적"인지 "다중특이적"인지, 예로 "이중특이적"인지는 결합 폴리펩타이드가 반응하는 상이한 에피토프의 수를 나타낸다. 다중특이적 항체는 본원에 기재된 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수도 있고 또는 표적 폴리펩타이드뿐만 아니라 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 폴리펩타이드 또는 고상 지지체 물질에 대해 특이적일 수도 있다.
본원에서 이용되는 "공유가"라는 용어는 잠재적 결합 도메인, 예로 결합 폴리펩타이드 또는 IL-33 결합 분자, 예로 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 존재하는 항원 결합 도메인의 수를 나타낸다. 각각의 결합 도메인은 하나의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 결합 폴리펩타이드 또는 IL-33 결합 분자가 하나를 초과하는 결합 도메인을 포함하는 경우, 각각의 결합 도메인은 "2가 단일특이적"으로 명명된, 2개의 결합 도메인을 갖는 항체에 있어서 동일한 에피토프에, 또는 "2가 이중특이적"으로 명명된 2개의 결합 도메인을 갖는 항체에 있어서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 각각의 특이성에 대해 이중특이적이고 또한 2가일 수 있다("이중특이적 4가 항체"로 명명됨). 또 다른 구현예에서, 4가 미니바디 또는 도메인 결실 항체가 제조될 수 있다.
이중특이적 2가 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 2003/020734 및 2002/0155537에 기재된다. 이중특이적 4가 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 둘 다의 개시가 본원에 참조로 포함되는 WO 02/096948 및 WO 00/44788에 기재된다. 일반적으로, PCT 공개 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; [Tutt et al., J. Immunol . 147:60-69 (1991); U.S. 특허 번호 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]를 참고한다.
이전에 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 널리 공지되어 있다. 본원에서 이용되는 "VH 도메인"이라는 용어에는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함되며, "CH1 도메인"이라는 용어에는 면역글로불린 중쇄의 제1(가장 아미노 말단의) 불변 영역 도메인이 포함된다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본원에서 이용되는 "CH2 도메인"이라는 용어에는, 예로, 통상적 넘버링 방식을 이용해서 항체의 대략 잔기 244 내지 잔기 360(잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231~340, EU 넘버링 시스템; [Kabat EA et al.]을 참고한다)으로부터 연장되는 중쇄 분자 부분이 포함된다. CH2 도메인은 이것이 또 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-결합 분기형 탄수화물쇄가 온전한 원상태 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 개입된다. 또한 CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인에서 C-말단으로 연장되며 대략 108개 잔기를 포함함이 잘 보고되어 있다.
본원에서 이용되는 "힌지 영역"이라는 용어에는 CH1 도메인을 CH2 도메인으로 연결하는 중쇄 분자 부분이 포함된다. 상기 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하며, 가요성이므로 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있도록 한다. 힌지 영역은 3개의 구별되는 도메인: 상부, 중앙 및 하부 힌지 도메인으로 세분될 수 있다(Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
본원에서 이용되는 "디설파이드 결합"이라는 용어에는 2개의 황 원자 간에 형성되는 공유 결합이 포함된다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 디설파이드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디설파이드 결합에 의해 연결되며, 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 이용해서 239 및 242에 대응하는 위치(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
본원에서 이용되는 "키메라 항체"라는 용어는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1종으로부터 수득되거나 유도되고, 불변 영역(본 개시에 따라 온전하거나, 부분적이거나, 변형될 수 있음)이 제2 종으로부터 수득되는 임의의 항체를 의미하기 위해 이용될 것이다. 특정 구현예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 원천(예로, 마우스 또는 영장류) 유래일 것이며 불변 영역은 인간 유래이다.
본원에서 이용되는 "조작 항체"라는 용어는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다에서의 가변 도메인이 적어도 하나의 아미노산 대체에 의해 변경되는 인간 항체를 나타낼 것이다. 하나의 구현예에서, 프레임워크 잔기의 아미노산 대체는 프레임워크 잔기를 생식계열로 변화시킴으로써 잠재적 면역원성을 감소시킬 것이다. 또 다른 구현예에서, 프레임워크 또는 CDR 잔기의 아미노산 대체는 산물의 불안정성, 응집 또는 불균일성을 일으킬 수 있는 잠재적인 구조적 책임을 제거할 수 있다. 바람직하지 못한 책임의 예에는 페어링되지 않은 시스테인(디설파이드 결합 스크램블화, 또는 가변적 설프하이드릴 부가물 형성으로 이어질 수 있음), N-결합 글리코실화 부위(구조 및 활성의 불균일성을 일으킴)뿐만 아니라 탈아마이드화(예로 NG, NS), 이성화(DG), 산화(노출 메티오닌) 및 가수분해(DS) 부위가 포함된다. 또 다른 구현예에서, 표적화된 또는 무작위 돌연변이화 접근에 의한 CDR 및 프레임워크 잔기의 아미노산 대체는 증강된 결합, 역가 또는 특이성 특징을 갖는 항체를 생성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, "조작 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다에서의 가변 도메인이 공지된 특이성을 갖는 항체로부터의 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적 대체에 의해, 그리고 필요한 경우 부분적 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변경되는 항체를 나타낸다. CDR은 프레임워크 영역이 유도되는 항체와 동일한 클래스 또는 심지어 동일한 서브클래스의 항체로부터 유도될 수 있지만, CDR은 상이한 클래스의 항체로부터 그리고 바람직하게는 상이한 종으로부터의 항체로부터 유도될 것임이 고려된다.
본원에서 이용되는 "인간화 항체"라는 용어는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자(또한 본원에서 수신체 항체로 불림)로부터의 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체(또한 본원에서 공여체 항체로 불림)로부터 유도되는 항체 분자를 나타낼 것이다. 하나의 가변 도메인의 항원 결합능을 또 다른 것으로 전달하기 위해 전체 CDR을 공여체 가변 도메인으로부터의 전체 CDR로 대체하는 것이 필요하지는 않을 수 있다. 오히려, 표적 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 잔기를 전달하는 것만 필요할 수 있다.
인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다에서의 가변 도메인 내의 프레임워크 영역은 인간 유래 잔기만을 포함할 수 있고, 이 경우 인간화 항체의 이들 프레임워크 영역은 "완전 인간 프레임워크 영역"으로 불리는 것이 추가로 인식된다. 대안적으로, 공여체 가변 도메인의 프레임워크 영역(들)의 하나 이상의 잔기는 IL-33 항원에 대한 적절한 결합을 유지하거나 이를 증강시키기 위해 필요한 경우, 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 다에서의 가변 도메인의 인간 프레임워크 영역(들)의 대응하는 위치 내에서 조작될 수 있다. 따라서 상기 방식으로 조작된 인간 프레임워크 영역은 인간 및 공여체 프레임워크 잔기의 혼합물을 포함할 것이며, 본원에서 "부분적 인간 프레임워크 영역"으로 불린다.
예를 들어, 항-IL-33 항체의 인간화는 본질적으로 당분야에 공지된 방법에 의해(예로, Winter 및 동료의 방법(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항-IL-33 항체의 대응 서열에 대해 대체함으로써 수행될 수 있다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참고한다. 생성되는 인간화 항-IL-33 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 완전 인간 프레임워크 영역 내에 적어도 하나의 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR을 포함할 것이다. 일부 경우에 있어서, 인간화 항-IL-33 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 내의 잔기는 대응하는 비-인간(예를 들어, 설치류) 잔기에 의해 대체되며(예를 들어, U.S. 특허 번호 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370 참고), 이 경우 생성되는 인간화 항-IL-33 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내에 부분적 인간 프레임워크 영역을 포함할 것이다.
또한, 인간화 항체는 수신체 항체에서 또는 공여제 항체에서 확인되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가 제련하기 위해(예로, 원하는 친화도를 수득하기 위해) 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-인간 면역글로불린의 것에 대응하며 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 영역을 포함할 것이다. 추가 상세사항에 대해서는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]를 참고한다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체에는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 해당 서열에 의해 치환된 항체가 포함될 수 있다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참고한다. 또한, 소정 항원에 대해 개선된 친화도를 갖는 인간화 항체 및 인간화 항체의 제조 기법이 개시되는 U.S. 특허 번호 6,180,370 및 국제 공개 번호 WO 01/27160을 참고한다.
본원에서 이용되는 "연결된", "융합된" 또는 "융합"이라는 용어는 상호 교환적으로 이용된다. 이들 용어는 화학접 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 어느 수단에 의해서든, 2개 이상의 요소 또는 성분을 함께 연결하는 것을 나타낸다. "프레임-내 융합"은 원래 ORF의 정확한 번역 해독틀을 유지하는 방식으로, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 개방 해독틀(ORF)을 연결하여 연속적인 더 긴 ORF를 형성하는 것을 나타낸다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에 대응하는 2개 이상의 절편(이 절편은 보통 자연에서는 이렇게 연결되지 않음)을 함유하는 단일 단백질이다. 따라서 해독틀이 융합된 절편에 걸쳐 연속적으로 제조되지만, 절편은, 예를 들어, 프레임-내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프레임-내로 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속 폴리펩타이드의 일부로서 공동-번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로불린 프레임워크 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
폴리펩타이드의 맥락에서, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열에서 서로 인근에 있는 잔기가 폴리펩타이드의 일차 구조에서 인접하는 아미노에서 카복실 말단 방향으로의 폴리펩타이드 내 아미노산의 순서이다.
본원에서 이용되는 "발현"이라는 용어는 유전자가 생화학적 물질, 예를 들어, 폴리펩타이드를 생성하는 공정을 나타낸다. 공정에는 비제한적으로 유전자 녹다운뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현을 모두 포함하는, 세포 내 유전자의 기능적 존재의 임의 표명이 포함된다. 여기에는 비제한적으로 유전자의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 번역이 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학적 물질인 경우, 발현에는 생화학적 물질 및 임의의 전구체의 생성이 포함된다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생성한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예로, 유전자의 전사에 의해 생성되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 기재되는 유전자 산물에는 전사 후 변형, 예로, 폴리아데닐화를 포함하는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예로 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 연합, 단백분해 절단 등을 포함하는 폴리펩타이드가 추가로 포함된다.
본원에서 이용되는 "치료하다" 또는 "치료"와 같은 용어는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 원치 않는 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 염증성 질병의 진행을 예방하거나 지연하는(경감하는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 비제한적으로 검출 가능하건 검출 불가능하건, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 느려짐, 질환 상태의 개량 또는 경감 및 차도(부분적이건 전체적이건)가 포함된다. "치료"는 또한 치료를 수여받지 않는 경우 예상되는 생존 대비 생존 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들에는 이미 질병 또는 장애를 갖는 자들뿐만 아니라 질병 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 질병 또는 장애가 예방되어야 하는 자들이 포함된다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"란 그에 대한 진단, 예후, 또는 치료법이 바람직한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체에는 인간; 가축 동물; 농장 동물; 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아 픽, 토끼, 래트, 마우스, 말, 양, 소 등이 포함된다.
본원에서 이용되는 "항-IL-33 항체의 투여로부터 이익을 얻을 대상체" 및 "치료를 필요로 하는 동물"과 같은 어구에는, 예로, 항-IL-33 폴리펩타이드의 검출을 위해(예로, 진단 절차를 위해) 이용되는 항-IL-33 항체의 투여로부터 및/또는 항-IL-33 항체를 이용한 치료, 즉 질환의 경감 또는 예방으로부터 이익을 얻을 대상체, 예컨대 포유류 대상체가 포함된다.
II. 표적 폴리펩타이드 설명
본원에서 이용되는 "IL-33" 및 "IL-33 폴리펩타이드"라는 용어는 상호 교환적으로 이용된다. 특정한 구현예에서, IL-33은 전장이다. 또 다른 구현예에서, IL-33은 성숙, 절단 IL-33(아미노산 112~270)이다. 최근 연구는 전장 IL-33이 활성임을 제시한다(Cayrol and Girard, Proc Natl Acad Sci U S A 106(22):9021-6 (2009); Hayakawa et al., Biochem Biophys Res Commun 387(1):218-22 (2009); Talabot-Ayer et al., J Biol Chem. 284(29):19420-6 (2009)). 그러나, 비제한적으로 aa 72~270, 79~270, 95~270, 99~270, 107~270, 109~270, 111~270, 112~270을 포함하는 N-말단 가공되거나 절단된 IL-33이 증강된 활성을 가질 수 있다(Lefrancais 2012, 2014). 또 다른 구현예에서, IL-33에는 전장 IL-33, 이의 단편, 또는 IL-33 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩타이드가 포함될 수 있으며, 여기서 IL-33의 단편 또는 IL-33 변이체 폴리펩타이드는 활성 IL-33의 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유한다.
인간 IL-33은 2개 도메인, 호메오도메인 및 사이토카인(IL-1-유사) 도메인으로 구성된 270 아미노산 단백질이다(접근 번호 O95760). 호메오도메인은 핵 편재 신호(NLS)를 함유한다. IL-33은 원래 지주막하 출혈 후 혈관경련성 뇌 동맥에서 상향조절되는 "DVS27" 유전자로서(Onda et al., J. Cereb . Blood Flow Metab . 19:1279-88 (1999)), 그리고 내피 세포 핵에서 발현되는 "다-내피 세정맥으로부터의 핵 인자(NF-HEV)"로서 확인되었다(Baekkevold et al., Am. J. Pathol 163:69-79 (2003)). IL-33(또한 IL-1F11로 불림)은 현재 IL-α, IL1β 및 IL-18이 또한 포함되는 사이토카인 IL-1 패밀리에서 11번째 구성원으로 간주된다. 문헌[Oboki et al., Allergology International 59:143-160 (2010)]을 참고한다.
Schmitz 등은 고아 수용체 ST2(IL-1R4로도 불림)에 대한 리간드로서 IL-33을 최초로 확인하였다(Schmitz et al., Immunity 23(5)479-90 (2005)). ST2 수용체의 유일하게 공지된 리간드는 IL-33이다(Schmitz et al. (2005)). IL-33 수용체는 ST2 및 IL-1R 악세사리 단백질(IL-1RAcP)로 구성되는, 이종이량체성 분자로부터 형성된다. IL-1RAcP는 IL-1α, IL-1β, IL-1F6, IL1F8 및 IL1F9에 대한 수용체의 공유 성분이다. IL-33은 ST2 및 IL-1RAcP의 이량체인, IL-33 수용체에 결합한다. IL-1RAcP는 결합을 위해 필요하지는 않지만, 신호전달을 위해 중요하다. IL-33 수용체의 TIR-도메인은 MyD88 및 TRAF6을 모집하며, 수용체 신호는 NFκB 및 MAP 키나제 경로의 활성화를 일으킨다(Oboki et al. (2010)). IL-33 수용체는 다른 수용체와 잠재적으로 연합할 수 있고, 인간 및 마우스 비만 세포에서 수용체 티로신 키나제 c-Kit를 교차 활성화하는 것으로 보고되었다(Drube et al., Blood 115:3899-906 (2010)). 상기 교차-활성화의 구조적 기반은 c-Kit, ST2 및 IL-1RAcP 간 복합체 형성이다. C-Kit 및 IL-1RAcP는 항상적으로 상호작용하며 ST2는 리간드 결합 시 상기 복합체에 참여한다.
최근에, IL-33은 제2 IL-33 수용체 이종이량체 복합체에 결합하는 것으로 나타났다. ST2는 또 다른 IL1R 패밀리 분자, "단일 Ig IL-1R-관련 분자"(SIGIRR)(Toll IL-1R8(TIR8)로도 불림)와 복합체를 형성한다. SIGIRR/TIR8은 IL-1R 및 Toll-유사 수용체(TLR)-매개 면역 반응의 음성적 조절인자로서 작용하는 것으로 여겨진다(Garlanda et al., Trends Immunol . 30:439-46 (2009)). ST2:IL-1RAcP와 대조적으로, ST2:SIGIRR은 IL-33의 음성적 조절인자로서 작용하는 것으로 보인다.
ST2는 Th2 세포 및 비만 세포에 의해 기준선에서 발현되며, 두 세포 유형은 모두 알러지성 천식의 중요한 매개인자로 알려져 있다. IL-33은 이들(및 다양한 다른 세포)을 자극하여 사이토카인 및 케모카인을 포함하는 일정 범위의 기능적 반응을 생성할 수 있다.
항-IL-33 항체
특정 구현예에서, 본 개시의 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 예로 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180 및 33_640076-4B, 33_640081-AB; 33_640082-6B, 33_640082-7B, 33_640084-2B, 33_640086-6B, 33_640087-7B, 33_640201-2B 및 33_640237-2B는 IL-33에 결합하고 비만 세포, 내피 세포로부터의 IL-33-유도 사이토카인 방출 및 TF-1 세포의 증식을 억제한다.
특정한 구현예에서, 본 개시의 항체는 IL-33에 결합하는 항-IL-33 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 예로, 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180 및 33_640076-4B, 33_640081-AB; 33_640082-6B, 33_640082-7B, 33_640084-2B, 33_640086-6B, 33_640087-7B, 33_640201-2B 및 33_640237-2B를 포함한다. 특정한 구현예에서, 항-IL-33 항체는 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합에 결합한다. 특정한 구현예에서, 항-IL-33 항체는 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 단리된 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이는 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149, 또는 IL330180 및 33_640076-4B, 33_640081-AB; 33_640082-6B, 33_640082-7B, 33_640084-2B, 33_640086-6B, 33_640087-7B, 33_640201-2B 및 33_640237-2B와 동일한 IL-33 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시는 단리된 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이는 IL-33에 특이적으로 결합하고, 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149, 또는 IL330180 및 33_640076-4B, 33_640081-AB; 33_640082-6B, 33_640082-7B, 33_640084-2B, 33_640086-6B, 33_640087-7B, 33_640201-2B 및 33_640237-2B가 IL-33, 예로, 인간, 영장류, 쥐과, 또는 인간, 영장류 및 쥐과 IL-33의 임의 조합에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다.
특정한 구현예에서, 본 개시의 결합 분자는 참조 항-IL-33 항체 분자에 대한 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 결합 분자는 참조 항체와 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유한다. 특정한 구현예에서, 참조 항체는 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149, 또는 IL330180 및 33_640076-4B, 33_640081-AB; 33_640082-6B, 33_640082-7B, 33_640084-2B, 33_640086-6B, 33_640087-7B, 33_640201-2B 및 33_640237-2B이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 적어도 하나의 CDR은 상기 개시된 VH CDR로부터의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 가지며, 인코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 적어도 하나의 CDR은 상기 개시된 VH CDR과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 가지며, 인코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 단리 항체는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VH 도메인의 적어도 하나의 CDR은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 상기 개시된 VH CDR과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 인코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 단리 항체는 VL 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 42, 또는 52의 VH 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 인코딩된 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 단리 항체는 VL 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 적어도 하나의 CDR은 상기 개시된 VH 아미노산 서열 SEQ로부터의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 여기서, 인코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현에에서, 단리 항체는 VH 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 적어도 하나의 CDR은 상기 개시된 VH CDR과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 가지고, 인코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 단리 항체는 VH 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL 도메인의 적어도 하나의 CDR은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 상기 개시된 VL CDR과 동일한 아미노산 서열을 가지며, 인코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 단리 항체는 VH 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
추가 구현예에서, 본 개시에는 상기 개시된 VL 아미노산 서열과 적어도 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 포함되며, 여기서 인코딩된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 단리 항체는 VH 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
본 개시의 항-IL-33 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체는 본 개시의 방법에서 이용될 수 있다. 적합한 변이체는 모체 항-IL-33 항체의 원하는 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체의 제조 방법은 일반적으로 당분야에서 이용 가능하다.
돌연변이화 및 뉴클레오타이드 서열 변경 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); U.S. 특허 번호 4,873,192] 및 여기에서 인용된 참고문헌을 참고한다. 관심 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 문헌[Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352]의 모델에서 확인될 수 있다. Dayhoff 등의 모델은 적합한 보존적 아미노산 치환을 결정하기 위해 지점 허용 돌연변이(PAM) 아미노산 유사성 매트릭스(PAM 250 매트릭스)를 이용한다. 보존적 치환, 예컨대 하나의 아미노산의 유사한 특성을 가지는 또 다른 아미노산을 이용한 교환이 바람직할 수 있다. Dayhoff 등의 모델의 PAM 250 매트릭스에서 교시되는 바와 같은 보존적 아미노산 치환의 예에는 비제한적으로 Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln 및 Phe↔Trp↔Tyr이 포함된다.
항-IL-33 결합 분자, 예로 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 관심 폴리펩타이드의 변이체 구축에 있어서, 변이체가 계속 원하는 특성을 보유하도록, 예로 IL-33에 대해 특이적으로 결합할 수 있고, 특정한 구현예에서 IL-33의 ST2에 대한 결합을 차단하지 않도록 하는 변형이 수행된다. 명백하게, 변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA에서 수행된 임의의 돌연변이는 서열을 해독틀 밖에 배치해서는 안되며, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 생성하지 않을 것이다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 특이성의 측정 방법에는 비제한적으로 표준 경쟁적 결합 검정, ELISA 검정, BIACORE 검정, 기능적 검정, 예컨대 증식 또는 인자 방출 등이 포함된다. 예를 들어, 모두 본원에 참조로 포함되는 문헌[WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1375-1381 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); 및 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)]에 개시된 바와 같은 검정을 참고한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 불변 영역, CDR, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하는 임의의 특정한 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 100% 동일한 경우, 동일성%는 당분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대 비제한적으로 BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53713)을 이용해서 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 간 최적 상동성 절편을 찾기 위해, 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]의 국소 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정한 서열이, 예를 들어 본 개시에 따른 참조 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하는 경우, 파라미터는 당연히, 동일성 백분율이 참조 폴리펩타이드 서열의 전장에 걸쳐 계산되도록, 그리고 참조 서열 내 아미노산 총 수의 최대 5%까지의 상동성 내 갭이 허용되도록 설정된다.
본 개시의 목적을 위해, 서열 동일성 백분율은 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62를 갖는 아핀(affine) 갭 검색을 이용하는 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]에서 교시된다. 변이체는, 예를 들어, 1 내지 30개 아미노산 잔기만큼 적게, 1 내지 15개 아미노산 잔기만큼 적게, 1 내지 10개, 예컨대 6~10개 아미노산 잔기만큼 적게, 5개만큼 적게, 4, 3, 2, 또는 심지어 1개 아미노산 잔기만큼 적게, 참조 항-IL-33 항체(예로, IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149, 또는 IL330180)와 상이할 수 있다.
IL-33에 특이적으로 결합하고 원하는 활성을 보유할 수 있는 폴리펩타이드의 정확한 화학적 구조는 여러 요인에 의존한다. 이온화 가능한 아미노 및 카복실기가 분자에 존재하므로, 특정한 폴리펩타이드는 산성 또는 염기성 염으로서, 또는 중성 형태로 수득될 수 있다. 적합한 환경 조건에 배치되는 경우 이의 생물학적 활성을 보유하는 모든 이러한 조제물이 본원에서 이용되는 항-IL-33 항체의 정의에 포함된다. 또한, 폴리펩타이드의 일차 아미노산 서열은 당 모이어티를 이용한 유도체화(글리코실화)에 의해 또는 다른 보충 분자, 예컨대 지질, 포스페이트, 아세틸기 등에 의해 강화될 수 있다. 이는 또한 당류의 접합에 의해 강화될 수 있다. 이러한 강화의 특정 양태는 생산 숙주의 번역-후 가공 시스템을 통해 달성된다; 다른 이러한 변형이 시험관내에서 도입될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 이러한 변형은 항-IL-33 항체의 원하는 특성이 파괴되지 않는 한, 본원에서 이용되는 항-IL-33 항체의 정의에 포함된다. 이러한 변형은 다양한 검정에서 폴리펩타이드의 활성을 증강시키거나 감소시킴으로써, 활성에 정량적으로 또는 정성적으로 영향을 미칠 수 있음이 예상된다. 또한, 사슬 내의 개별 아미노산 잔기는 산화, 환원, 또는 다른 유도체화에 의해 변형될 수 있고, 폴리펩타이드는 활성을 보유하는 단편을 수득하기 위해 절단될 수 있다. 원하는 특성(예로, IL-33에 대한 결합 특이성, 결합 친화도 및 연관된 활성, 예로, 비만 세포, 내피 세포로부터의 IL-33-유도된 사이토카인 방출 및 TF-1 세포의 증식을 억제하는 능력)을 파괴하지 않는 이러한 변경은 본원에서 이용되는 관심 항-IL-33 항체의 정의에서 폴리펩타이드 서열을 배제하지 않는다.
당 분야에서는 폴리펩타이드 변이체의 제조 및 이용에 관한 실질적 지침을 제공한다. 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체의 제조에서, 당업자는 원상태 단백질의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대한 어느 변형이 본 개시의 방법에서 이용되는 약학 조성물의 치료 활성 성분으로서 이용하기에 적합한 변이체를 생성할지를 쉽게 결정할 수 있다.
Fc 영역의 변이체(예로, 아미노산 치환 및/또는 부가 및/또는 결실)는 항체의 효과기 기능을 증강시키거나 감소시킬 수 있고 항체의 약동학적 특성(예로, 반감기)을 변경할 수 있음이 알려져 있다. 예를 들어, Fc 수용체에 대한 항체 결합을 최적화하는 Fc 돌연변이를 개시하는 U.S. 특허 번호 6,737,056B1 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 2004/0132101A1을 참고한다.
특정한 항-IL-33 항체에서, Fc 부분은 당분야에 공지된 기법을 이용하여 효과기 기능을 감소시키도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 점 돌연변이 또는 아미노산 치환에 의한 불변 영역 도메인의 변경은 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써 효과기 세포 또는 표적을 발현하거나 제시하는 세포에 대한 보체-매개 제거 또는 손상을 최소화할 수 있다. 예를 들어, 하나의 특정한 치환 세트, 3중 돌연변이 L234F/L235E/P331S('TM')는 인간 C1q, CD64, CD32A 및 CD16에 대한 인간 IgG1 분자의 결합 활성에서 철저한 감소를 유도한다. 예로, 문헌[Oganesyan et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . 64:700-704 (2008)]을 참고한다.
다른 경우, 본 개시와 일치하는 불변 영역 변형은 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn의 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에서 이용되는 "항체 반감기"라는 용어는 이의 투여 후 항체 분자의 평균 생존 시간의 척도인 항체의 약동학적 특성을 의미한다. 항체 반감기는 환자의 신체(또는 다른 포유류) 또는 이의 특정한 구획으로부터 공지된 양의 면역글로불린의 50%를 제거하기 위해 필요한 시간으로, 예를 들어, 혈청 중 측정되는, 즉, 순환 반감기로서, 또는 다른 조직 내에서 표현될 수 있다. 하나의 면역글로불린 또는 면역글로불린 클래스에서 또 다른 것 간의 반감기는 다를 수 있다. 일반적으로, 항체 반감기의 증가는 투여되는 항체에 있어서 순환 내 평균 체류 시간의 증가를 일으킨다.
반감기의 증가는 환자에게 제공된 약물의 양 감소뿐만 아니라 투여 빈도의 감소를 허용한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 당분야에 공지된 바와 같이 항체(특히 항체 단편) 내로 재이용 수용체 결합 에피토프를 도입할 수 있다. 본원에서 이용되는 "재이용 수용체 결합 에피토프"라는 용어는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기 증가에 관여하는 IgG 분자(예로, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다. 증가된 반감기를 갖는 항체는 또한 Fc 및 FcRn 수용체 간 상호작용에 관여되는 것으로 확인되는 아미노산 잔기의 변형에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 G(IgG) 분자의 CH2 도메인 내로의 삼중 돌연변이 M252Y/S254T/T256E('YTE')의 도입은 인간 신생 Fc 수용체(FcRn) 로의 이의 결합 증가를 유도한다. 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는, U.S. 특허 번호 7,083,784를 참고한다.
또한, 일부 구현예에서, Fc 영역은 Kabat에 나타낸 EU 지수에 의해 넘버링되는 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 변형(예로, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함한다. 선택적으로, Fc 영역은 당분야에 공지된 추가적인 및/또는 대안적인 위치에서 비 자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 Kabat 에 나타낸 EU 지수에 의해 넘버링되는 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y 및 434W로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 선택적으로, Fc 영역은 당분야에 공지된 추가적인 및/또는 대안적인 비 자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, Fc 영역은 234, 235 및 331로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 변형(예로, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 아미노산은 234F, 235F, 235Y 및 331S로 구성되는 군으로부터 선택된다. Fc 변이체가 본원에서 제공되며, 여기서 Fc 영역은 239, 330 및 332로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 비-자연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 아미노산은 239D, 330L 및 332E로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, Fc 영역은 252, 254 및 256으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 비-자연 발생 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-자연 발생 아미노산은 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는, U.S. 특허 번호 7,083,784에 기재된 252Y, 254T 및 256E로 구성되는 군으로부터 선택된다.
불변 영역의 또 다른 변형이 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성으로 인해 증강된 편재를 허용하는 디설파이드 결합 또는 올리고당류 모이어티를 변형하기 위해 이용될 수 있다. 생성되는 변형의 생리적 프로필, 생체이용률 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 생체분포 및 혈청 반감기는 과도한 실험 없이 널리 공지된 면역학적 기법을 이용해서 쉽게 측정되고 정량될 수 있다.
본 개시의 항-IL-33 항체에는 또한, 예로, 공유 부착이 항체의 그 인지체 에피토프에 대한 특이적 결합을 방지하지 않도록 항체에 대한 임의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형되는 유도체가 포함된다. 예를 들어, 비제한적으로, 항체 유도체에는, 예로, 글리코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합 등에 의해 변형된 항체가 포함된다. 임의의 여러 화학적 변형이 비제한적으로 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-전통적 아미노산을 함유할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예로, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예로, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예로, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예로, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분기형 측쇄를 갖는 아미노산(예로, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예로, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 대안적으로, 돌연변이가 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라, 예컨대 포화 돌연변이화에 의해 무작위 도입될 수 있고, 생성되는 돌연변이체가 생물학적 활성에 대해 스크리닝되어 활성(예로, 항-IL-33 폴리펩타이드에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 확인할 수 있다.
예를 들어, 항체 분자의 프레임워크 영역에만 또는 CDR 영역에만 돌연변이를 도입할 수 있다. 도입된 돌연변이는 침묵성이거나 중성 미스센스 돌연변이일 수 있다, 즉 항원에 결합하는 항체의 능력에 대한 효과를 전혀 또는 거의 갖지 않을 수 있다. 이들 유형의 돌연변이는 코돈 이용을 최적화하거나 하이브리도마의 항체 생산을 개선하기 위해 유용할 수 있다. 대안적으로, 비-중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변경할 수 있다. 대부분의 침묵성 및 중성 미스센스 돌연변이의 위치는 프레임워크 영역에 있을 수 있지만, 대부분의 비-중성 미스센스 돌연변이의 위치는 이것이 절대적 요건은 아니라도, CDR에 있을 수 있다. 당업자는 원하는 특성을 갖는, 예컨대 항원 결합 활성의 변경 또는 결합 활성의 변경이 없는(예로, 최종 분자의 항원 결합 활성의 개선 또는 항체 특이성의 변화 또는 증강된 안정성/균일성) 돌연변이체 분자를 설계하고 평가할 수 있을 것이다. 돌연변이화 이후, 인코딩된 단백질은 일상적으로 발현될 수 있고, 인코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예로, IL-33 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)이 본원에 기재된 기법을 이용하여 또는 당분야에 공지된 기법을 일상적으로 변형하여 결정될 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 개시의 항체는 베니어 영역/구역에 위치하는 프레임워크 잔기 또는 CDR 영역의 구조를 뒷받침하는 것으로 제안된 잔기의 변형에 의해 최적화될 수 있다(예로, 문헌[Foote, J. and G. Winter, J Mol . Biol . 224. 2: 487-99 (1992); Padlan, E. A., Mol . Immunol 31. 3: 169-217 (1994)]을 참고한다). 일부 구현예에서, 이들 변형은 표준 분자 생물학 방법을 이용해서 PCR 매개된 부위-지정 돌연변이화를 이용하여 구축될 수 있다. 변형된 항체는 본원에 개시된 바와 같이 결합 친화도에 대해 평가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 추가 최적화, 예로, CDR 영역 내 아미노산 치환의 도입에 의한 또는 부위 지정 돌연변이화에 의한 역 돌연변이 또는 친화도 성숙이 또한 수행될 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 개시의 항-IL-33 항체는 적어도 하나의 최적화된 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화된 CDR"이란 CDR이 최적화된 CDR을 포함하는 항-IL-33 항체에 부여되는 지속되거나 개선된 결합 친화도 및/또는 항-IL-33 활성에 기반하여 선택되는 변형되고 최적화된 서열이었음을 의도한다. "항-IL-33 활성"에는, 예를 들어 IL-33과 연관된 하나 이상의 하기 활성, 예로, 비만 세포, 내피 세포로부터의 IL-33-유도된 사이토카인 방출 및 TF-1 세포의 증식; 호염기구, 호산구, Th2 세포, NK, NKT 세포, 대식구, 또는 수지상 세포로부터의 매개인자(예로, 사이토카인 또는 케모카인) 방출; 세포 표면 수용체의 조정; 항원 제시의 조정; 또는 IL-33과 연관된 임의의 다른 활성을 조정하는 활성이 포함될 수 있다. 항-IL-33 활성은 또한 비제한적으로 특정한 유형의 염증성 질병, 예로, 알러지성 장애, 예컨대 천식 또는 대상체의 기도 내 다른 염증성 반응을 포함하는, IL-33 발현 및/또는 방출과 연관된 질환의 발생률 또는 중증도 감소에 기인할 수 있다. 변형에는 항-IL-33 항체가 IL-33 항원에 대한 특이성을 보유하고 개선된 결합 친화도 및/또는 개선된 항-IL-33 활성을 갖도록 하는 CDR 내의 아미노산 잔기의 대체가 관여될 수 있다.
IV. 항-IL-33 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
본 개시는 또한 본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 VH 도메인의 적어도 하나의 CDR은 SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 201, 211, 221, 231, 241, 251, 261, 271, 281, 291, 301, 311, 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 441, 451, 461, 471, 481, 491, 501, 511, 5421, 531, 541, 551, 561, 571 및 581로 구성된 군으로부터 선택되는 VH-인코딩 서열의 CDRH 1, 2, 또는 3 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 VH 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 VH 도메인의 적어도 하나의 CDR 서열은 (a) SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 203, 213, 223, 233, 243, 253, 263, 273, 283, 293, 303, 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, 383, 393, 403, 413, 423, 433, 443, 453, 463, 473, 483, 493, 503, 513, 5423, 533, 543, 553, 563, 573 및 583에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 서열; (b) SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 204, 214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 404, 414, 424, 434, 444, 454, 464, 474, 484, 494, 504, 514, 5424, 534, 544, 554, 564, 574 및 584에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 서열; 및 (c) SEQ ID NO: 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175, 185, 195, 205, 215, 225, 235, 245, 255, 265, 275, 285, 295, 305, 315, 325, 335, 345, 355, 365, 375, 385, 395, 405, 415, 425, 435, 445, 455, 465, 475, 485, 495, 505, 515, 5425, 535, 545, 555, 565, 575 및 585에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
추가 구현예에서, 본 개시에는 SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 202, 212, 222, 232, 242, 252, 262, 272, 282, 292, 302, 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 442, 452, 462, 472, 482, 492, 502, 512, 5422, 532, 542, 552, 562, 572 및 582를 포함하는 참조 VH 도메인 폴리펩타이드 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 포함되며, 여기서 인코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-IL-33 항체는 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 VL 도메인의 적어도 하나의 CDR은 SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236, 246, 256, 266, 276, 286, 296, 306, 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, 386, 396, 406, 416, 426, 436, 446, 456, 466, 476, 486, 496, 506, 516, 5426, 536, 546, 556, 566, 576 및 586으로 구성된 군으로부터 선택되는 VL-인코딩 서열의 CDRL 1, 2, 또는 3 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
다른 구현예에서, 본 개시는 면역글로불린 VL 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 여기서 VL 도메인의 적어도 하나의 CDR 서열은 (a) SEQ ID NO: 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 178, 188, 198, 208, 218, 228, 238, 248, 258, 268, 278, 288, 298, 308, 318, 328, 338, 348, 358, 368, 378, 388, 398, 408, 418, 428, 438, 448, 458, 468, 478, 488, 498, 508, 518, 5428, 538, 548, 558, 568, 578 및 588에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 서열; (b) SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 179, 189, 199, 209, 219, 229, 239, 249, 259, 269, 279, 289, 299, 309, 319, 329, 339, 349, 359, 369, 379, 389, 399, 409, 419, 429, 439, 449, 459, 469, 479, 489, 499, 509, 519, 5429, 539, 549, 559, 569, 579 및 589에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 서열; 및 (c) SEQ ID NO: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 5420, 530, 540, 550, 560, 570, 580 및 590에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
추가 구현예에서, 본 개시에는 SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187, 197, 207, 217, 227, 237, 247, 257, 267, 277, 287, 297, 307, 317, 327, 337, 347, 357, 367, 377, 387, 397, 407, 417, 427, 437, 447, 457, 467, 477, 487, 497, 507, 517, 5427, 537, 547, 557, 567, 577 및 587을 포함하는 참조 VH 도메인 폴리펩타이드 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 포함되며, 여기서 인코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-IL-33 항체는 IL-33에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33 유도된 사이토카인 생성을 억제한다.
상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드에는 추가로, 예로, 본원에 기재된 인코딩된 폴리펩타이드, 항체 불변 영역, 또는 본원에 기재된 다른 이종성 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 신호 펩타이드를 인코딩하는, 추가적인 핵산이 포함될 수 있다. 또한, 본원에서 다른 곳에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시에는 상술된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 개시에는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 포함되며, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 VH 도메인을 인코딩하며, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 VL 도메인을 인코딩한다. 구체적으로, SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 201, 211, 221, 231, 241, 251, 261, 271, 281, 291, 301, 311, 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 441, 451, 461, 471, 481, 491, 501, 511, 5421, 531, 541, 551, 561, 571, 또는 581에 나타낸 바와 같은 VH 도메인-인코딩 폴리뉴클레오타이드 및 VL 도메인 인코딩 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, SEQ ID NO: 66, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226, 236, 246, 256, 266, 276, 286, 296, 306, 316, 326, 336, 346, 356, 366, 376, 386, 396, 406, 416, 426, 436, 446, 456, 466, 476, 486, 496, 506, 516, 5426, 536, 546, 556, 566, 576, 또는 586에 나타낸 바와 같은 VL 도메인-인코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 조성물.
본 개시에는 또한 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같은, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 단편이 포함된다. 추가적으로 본원에 기재된 바와 같이, 융합 폴리폴리펩타이드, Fab 단편 및 다른 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 개시에 의해 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지된 경우, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있고(예로, 문헌[Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242 (1994)]에 기재된 바와 같이), 이는 간략하게는 항체를 인코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오타이드의 합성, 이들 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 결찰, 이어서 PCR에 의해 결찰된 올리고뉴클레오타이드의 증폭이 관여된다.
대안적으로, 본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 원천으로부터의 핵산에서 생성될 수 있다. 특정한 항체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 이용 가능하지 않지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우, 항체를 인코딩하는 핵산은 화학적으로 합성되거나 서열의 3'및 5'말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 또는, 예로, 항체 또는 다른 항-IL-33 항체를 인코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정한 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 탐침을 이용한 클로닝에 의해 적합한 원천(예로, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체 또는 다른 항-IL-33 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A+RNA)으로부터 수득될 수 있다. 이어서 PCR에 의해 생성된 증폭 핵산은 당분야에 널리 공지된 임의의 방법을 이용해서 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 뉴클레오타이드 서열 및 대응하는 아미노산 서열이 결정되면, 그 뉴클레오타이드 서열은 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하기 위해, 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성하기 위해, 뉴클레오타이드 서열의 조작을 위해 당분야에 널리 공지된 방법, 예로, 재조합 DNA 기법, 부위 지정 돌연변이화, PCR 등(예를 들어, 둘 다 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)]에 기재된 기법 참고)을 이용해서 조작될 수 있다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 이루어질 수 있고, 이는 미변형 RNA 또는 DNA 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어, 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 단일쇄 및 이중쇄 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 DNA, 단일쇄 및 이중쇄 RNA 및 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물인 RNA, 단일쇄 또는, 보다 전형적으로는 이중쇄 또는 단일쇄 및 이중쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA를 둘 다 포함하는 삼중쇄 영역으로 이루어질 수 있다. 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 염기 또는 안정성을 위해 또는 다른 이유를 위해 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 또한 함유할 수 있다. "변형된" 염기에는, 예를 들어, 트리틸화 염기 및 비일반 염기, 예컨대 이노신이 포함된다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 수행될 수 있다; 따라서, "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다.
면역글로불린으로부터 유도되는 폴리펩타이드(예로, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)의 비-천연 변이체를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 인코딩되는 단백질 내로 도입되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실을 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열 내로 도입하여 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 비-필수 아미노산 잔기에서 수행된다.
V. 융합 단백질 및 항체 접합체
본원에서 다른 곳에 보다 상세히 논의된 바와 같이, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 추가로 N- 또는 C-말단에서 이종성 폴리펩타이드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩타이드 또는 다른 조성물로 화학적으로 접합(공유 및 비-공유 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 항-IL-33 항체는 검출 검정에서의 표지로 유용한 분자 및 효과기 분자, 예컨대 이종성 폴리펩타이드, 약물, 방사선핵종, 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 접합될 수 있다. 예로, PCT 공개 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. 특허 번호 5,314,995; 및 EP 396,387을 참고한다.
본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에는 변형된, 즉 항체가 IL-33에 결합하는 것을 공유 부착이 방지하지 않도록 항체에 대한 임의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체가 포함될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 항체 유도체에는 변형된, 예로, 글리코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합 등에 의해 변형된 항체가 포함된다. 임의의 여러 화학적 변형이 비제한적으로 특이적인 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함하는 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-전통적 아미노산을 함유할 수 있다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산, 즉, 펩타이드 이소스테어로 이루어질 수 있으며, 20개 유전자-인코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-IL-33 항체는 자연적 공정, 예컨대 번역-후 가공에 의해, 또는 당분야에 널리 공지된 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본 교과서 및 보다 상세한 전공논문뿐만 아니라 수 많은 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 변형은 펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는 항-IL-33 결합 분자에서 어느 부분에서든, 또는 탄수화물과 같은 모이어티 상에서 일어날 수 있다. 동일 유형의 변형이 주어진 항-IL-33 결합 분자 내의 몇몇 부위에서 동일하거나 상이한 정도로 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 주어진 항-IL-33 결합 분자는 여러 유형의 변형을 함유할 수 있다. 항-IL-33 결합 분자는, 예를 들어, 유비퀴틴화 결과 분기화될 수 있고, 이들은 분기화를 포함하거나 포함하지 않는, 고리형일 수 있다. 고리형, 분기화 및 분기화 고리형 항-IL-33 결합 분자는 번역 후 자연 공정으로 생성될 수 있거나 합성 방법에 의해 수행될 수 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아마이드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, peg화, 단백분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화가 포함된다. (예를 들어, 문헌[Proteins--Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins (Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al., Meth . Enzymol . 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62 (1992)]을 참고한다).
본 개시는 또한 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체 및 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 항체가 융합되는 이종성 폴리펩타이드가 기능을 위해 유용할 수 있거나 항-IL-33 폴리펩타이드 발현 세포를 표적화하기 위해 유용하다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 융합 단백질은 본 개시의 항체의 임의의 하나 이상의 VH 도메인의 아미노산 서열 또는 본 개시의 항체의 임의의 하나 이상의 VL 도메인의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 융합 단백질은 항-IL-33 항체의 VH 도메인의 임의의 1, 2, 3개의 CDR의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체, 또는 항-IL-33 항체의 VL 도메인의 임의의 1, 2, 3개의 CDR의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
하나의 구현예에서, 융합 단백질은 본 개시의 항-IL-33 항체의 적어도 하나의 VH 도메인의 아미노산 서열 및 본 개시의 항-IL-33 항체의 적어도 하나의 VL 도메인의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 VH 및 VL 도메인은 IL-33의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 융합 단백질은 항-IL-33 항체의 VH 도메인의 임의의 1, 2, 3개 이상의 CDR의 아미노산 서열 및 항-IL-33 항체의 VL 도메인의 임의의 1, 2, 3개 이상의 CDR의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체 및 이종성 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, VH 도메인 또는 VL 도메인의 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 CDR(들)은 본 개시의 단일 원천 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응한다. 이들 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 본 개시에 의해 포괄된다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질에는 T 세포 수용체(Gascoigne et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 84:2936-2940 (1987)); CD4(Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol . USA 9:347-353 (1990); 및 Byrn et al., Nature 344:667-670(1990)); L-셀렉틴(귀소 수용체)(Watson et al., J. Cell. Biol . 130:2221-2229 (1990); 및 Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44(Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 및 B7(Linsley et al., J. Exp . Med . 173:721-730 (1991)); CTLA-4(Lisley et al., J. Exp . Med . 174:561-569 (1991)); CD22(Stamenkovic et al., Cell 66:1333-1344 (1991)); TNF 수용체(Ashkenazi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur . J. Immunol . 27:2883-2886 (1991); 및 Peppel et al., J. Exp . Med . 174:1483-1489 (1991)); 및 IgE 수용체 a(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 135, Abstract No. 1448 (1991))의 융합이 포함된다.
본원에서 다른 곳에 논의된 바와 같이, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 또는 당분야에 공지된 방법을 이용해서 면역검정에서 이용하기 위해 이종성 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, PEG는 이의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 본 개시의 항-IL-33 항체에 접합될 수 있다. 문헌[Leong et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); 또는 Weir et al., Biochem . Soc . Transactions 30:512 (2002)]를 참고한다.
또한, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이의 정제 또는 검출을 촉진하기 위해 마커 서열, 예컨대 펩타이드에 융합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 다수가 상업적으로 이용 가능한 것들 중에서, 헥사-히스티딘 펩타이드, 예컨대 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91313)에서 제공되는 태그이다. 예를 들어, 문헌[Gentz et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:821-824 (1989)]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그에는 비제한적으로 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 대응하는 "HA" 태그(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) 및 "플래그" 태그가 포함된다.
융합 단백질은 당분야에 널리 공지된 방법을 이용해서 제조될 수 있다(예를 들어, U.S. 특허 번호 5,136,964 및 5,225,538을 참고한다). 융합이 수행되는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 실험적으로 선택될 수 있다. 이어서 융합 단백질을 인코딩하는 DNA가 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질감염된다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는, 예로, 분자의 치료 특성을 개선하기 위해, 표적 검출을 촉진하기 위해, 또는 환자의 조영 또는 치료법을 위해, 접합되지 않은 형태로 이용될 수도 있고 또는 다양한 분자의 적어도 하나에 접합될 수도 있다. 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 정제 이전 또는 이후, 또는 정제가 수행될 때 표지되거나 접합될 수 있다.
특히, 본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약학 제제, 또는 PEG에 접합될 수 있다.
당업자는 접합체가 또한 선택된 접합될 제제에 따라, 다양한 기법을 이용하여 조립될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 바이오틴과의 접합체는, 예로, 결합 폴리펩타이드를 바이오틴의 활성화 에스테르, 예컨대 바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스테르와 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커와의 접합체는 커플링제, 예로, 본원에 기재된 것들의 존재 하에, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레신-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 접합체는 유사한 방식으로 제조된다.
본 개시는 진단제 또는 치료제에 접합된, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 추가로 포괄한다. 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 항-IL-33 항체는, 예를 들어, 주어진 치료 및/또는 예방 방식의 효능을 결정하기 위해, 임상 평가 절차의 일환으로, 질환의 발생 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 검출은 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 검출 가능한 성분에 커플링함으로써 촉진될 수 있다. 검출 가능한 성분의 예에는 다양한 효소, 보철기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사활성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용하는 양전자 방출 금속 및 비방사활성 상자성 금속 이온이 포함된다. 예를 들어, 본 개시에 따라 진단제로서의 이용을 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 U.S. 특허 번호 4,741,900을 참고한다. 적합한 효소의 예에는 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제가 포함되며; 적합한 보철기 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되고; 적합한 방사활성 물질의 예에는 125I, 131I, 131In, 90Y, 또는 99Tc가 포함된다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 이를 화학발광 화합물에 커플링함으로써 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이어서 화학발광제-태그화 항-IL-33 결합 분자의 존재는 화학 반응 과정 동안 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지화 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체가 검출 가능하게 표지될 수 있는 하나의 방식은 이를 효소에 연결하고 효소 면역검정(EIA)에서 연결된 산물을 이용하여 수행된다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978); Voller et al., J. Clin . Pathol . 31:507-520 (1978); Butler, Meth . Enzymol . 73:482-523 (1981); Maggio, ed. (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishikawa et al., eds. (1981) Enzyme Immunoassay (Kgaku Shoin, Tokyo). 항-IL-33 항체에 결합되는 효소는, 예를 들어, 분광측정, 형광측정에 의해 또는 가시적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 생성하기 위한 방식으로 적절한 기질, 바람직하게는 발색 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출 가능하게 표지하기 위해 이용될 수 있는 효소에는 비제한적으로 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트, 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제가 포함된다. 추가적으로, 검출은 효소에 대한 발색 기질을 이용하는 비색측정 방법에 의해 달성될 수 있다. 추가적으로, 검출은 형광 방법에 의해 달성될 수 있고, 이에 의해 형광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 다른 란탄족 원소 계열이 항-IL-33 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준 대비 기질의 효소적 반응 정도의 가시적 비교에 의해 달성될 수 있다.
검출은 또한 임의의 다양한 다른 면역검정을 이용해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 방사활성으로 표지함으로써, 방사면역검정(RIA)의 이용을 통해 결합 분자를 검출할 수 있다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Weintraub (March, 1986) Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques (The Endocrine Society)] 참고). 방사활성 동위원소는 비제한적으로 감마 카운터, 신틸레이션 카운터, 또는 자기 방사촬영법을 포함하는 수단에 의해 검출될 수 있다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 형광 방출 금속, 예컨대 152Eu, 또는 다른 란탄족 원소 계열을 이용해서 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트화기를 이용해서 결합 분자에 부착될 수 있다.
항체(예로, 항-IL-33 항체), 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에 대해 다양한 모이어티를 접합하기 위한 기법은 널리 공지되어 있으며, 예로, 문헌[Amon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al., pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Academic Press, pp. 303-16 (1985); 및 Thorpe et al. (1982) "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62:139-58]을 참고한다.
VI. 항체 폴리펩타이드의 발현
항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 서열은 널리 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 이용해서 동시에 또는 별도로 제조될 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반하여 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 보다 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 이용될 수 있다. 이 경우, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 탐침, 예컨대 마우스 불변 영역 탐침에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당분야에 공지된 기법을 이용하여 세포로부터 단리되고, 예로, 재조합 DNA 기법에 관한 상기 참고문헌에서, 상세히 나타낸 널리 공지된 표준 기법에 따라 제한 맵핑되고, 서열분석될 수 있다. 당연히, DNA는 단리 공정 또는 후속 분석 동안의 임의 시점에 본 개시에 따른 합성물일 수 있다.
본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제공하기 위한 단리된 유전 물질의 조작 이후, 항-IL-33 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 원하는 양의 항-IL-33 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있는 숙주 세포 내로의 도입을 위해 발현 벡터 내에 삽입된다.
항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체, 예로 본원에 기재된 표적 분자, 예로, IL-33에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현은 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 필요로 한다. 일단 본 개시의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터는 당분야에 널리 공지된 기법을 이용해서 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법에는, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전적 재조합이 포함된다. 따라서, 본 개시는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터에는 항체 분자의 불변 영역을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함될 수 있고(예로, PCT 공개 WO 86/05807; PCT 공개 WO 89/01036; 및 U.S. 특허 번호 5,122,464) 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는 숙주 세포 내로 원하는 유전자를 도입하고 이를 발현하기 위한 비히클로서 본 개시에 따라 이용되는 벡터를 의미하기 위해 본원에서 이용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 쉽게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 개시와 양립되는 벡터는 선택 마커, 원하는 유전자의 클로닝 및 진핵생물 또는 원핵생물 세포에 들어가고/가거나 여기에서 복제하는 능력을 촉진하기 위한 적절한 제한 부위를 포함할 것이다.
본 개시의 목적을 위해, 여러 발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 클래스의 벡터는 동물 바이러스, 예컨대 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스에서 유도되는 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들에는 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 다중시스트론 시스템의 이용이 관여된다. 추가적으로 이의 염색체 내로 통합된 DNA를 갖는 세포는 형질감염 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구 숙주에 대한 기본영양성, 살생물제 내성(예로, 항생제) 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결될 수도 있고, 또는 공동 형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수도 있다. 추가 요소가 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 요구될 수 있다. 이들 요소에는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호가 포함될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게는 인간)와 함께 발현 벡터 내로 삽입된다. 당연히, 진핵생물 세포에서 발현을 유발할 수 있는 임의의 발현 벡터가 본 개시에서 이용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 비제한적으로 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF 1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 및 pZeoSV2(Invitrogen, San Diego, Calif.에서 이용 가능함) 및 플라스미드 pCI(Promega, Madison, Wis.에서 이용 가능함)가 포함된다. 일반적으로, 적합하게 높은 수준의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현하는 것들에 대한 다수의 형질전환된 세포의 스크리닝은, 예를 들어, 로보트 시스템에 의해 수행될 수 있는 일상적 실험이다.
보다 일반적으로, 항-IL-33 항체의 단량체 서브유닛을 인코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터가 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드 도입은 당업자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 이들에는 비제한적으로 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 외피보유 DNA와의 세포 융합, 마이크로주입 및 온전한 바이러스를 이용한 감염이 포함된다. 문헌[Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vectors" in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt (Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472]를 참고한다. 전형적으로, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 전기천공을 통한다. 발현 구축물을 보유하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 생산에 적절한 조건 하에 성장되며, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 검정된다. 예시적인 검정 기법에는 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 또는 형광-활성화 세포 정렬장치 분석(FACS), 면역조직화학 등이 포함된다.
발현 벡터는 통상적 기법에 의해 숙주 세포로 전달된 후, 형질감염 세포가 통상적 기법에 의해 배양되어 본원에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체를 생산한다. 따라서, 본 개시에는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본 개시의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 함유하는 숙주 세포가 포함된다. 이중쇄 항체의 발현을 위해 바람직한 구현예에서, 중쇄 및 경쇄를 모두 인코딩하는 벡터는 아래에 상세히 나타낸 바와 같이, 완전 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다.
본원에서 이용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법을 이용해서 구축되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 인코딩하는 벡터를 보유하는 세포를 나타낸다. 재조합 숙주로부터의 항체 단리 방법의 설명에서, "세포" 및 "세포 배양"이라는 용어는 명확히 달리 명시되지 않는 한, 항체의 원천을 표시하기 위해 상호 교환적으로 이용된다. 달리 말하면, "세포"로부터 폴리펩타이드의 회수는 전체 세포의 회전 침강으로부터, 또는 배지 및 현탁 세포를 모두 함유하는 세포 배양으로부터를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본원에 기재된 방법에서 이용하기 위한 항체 분자를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산된 후 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염되는 경우, 원 위치에서 본 개시의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들에는 비제한적으로 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아(예로, 이. 콜라이(E. coli), 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예로, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예로, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예로, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유도된 프로모터(예로, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유도된 프로모터(예로, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예로, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)이 포함된다. 바람직하게는, 박테리아 세포, 예컨대 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 보다 바람직하게는, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한, 진핵생물 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 이용된다. 예를 들어, 포유류 세포, 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)가 항체를 위해 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
단백질 발현을 위해 이용되는 숙주 세포주는 종종 포유류 기원의 것이다; 당업자에게는 내부에서 발현될 원하는 유전자 산물에 대해 가장 적합한 특정한 숙주 세포주를 우선적으로 결정할 능력이 인정된다. 예시적인 숙주 세포주에는 비제한적으로 CHO(차이니즈 햄스터 난소), DG44 및 DUXB13(차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA(인간 경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 포함하는 CVI 유도체), VERY, BHK(베이비 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 포함된다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업 서비스, 미국 조직 배양 수집처(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용 가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형하고 가공하는 숙주 세포 계통이 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예로, 글리코실화) 및 가공(예로, 절단)은 단백질의 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역-후 가공 및 변형을 위해 특징적이고 구체적인 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 발현될 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 상기 목적을 위해, 유전자 산물의 일차 전사체의 적절한 가공, 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵생물 숙주 세포가 이용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예로, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 이후, 조작 세포가 농축된 배지 중에서 1~2일 동안 성장하도록 둔 후, 선택 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드에서의 선택 마커는 선택에 대한 내성을 부여하며, 세포가 이의 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합하고 성장하도록 하여, 다시 클로닝되어 세포주로 증식될 수 있는 초점부위를 형성한다. 상기 방법은 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작하기 위해 유리하게 이용될 수 있다.
비제한적으로 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., Cell 13:223 (1977)), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실전달효소(Szybalska and Szybalski, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 48:202 (1992)) 및 아데닌 포스포리보실전달효소(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하는 여러 선택 시스템이 이용될 수 있고, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 이용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 다음 유전자에 대한 선택의 기준으로 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Natl . Acad . Sci . USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527 (1981)); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan and Berg, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem . 62:191-217 (1993); TIB TECH 13(5):155-215 (May, 1993)); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984). 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당분야에 일반적으로 공지된 방법은 본원에 이의 전문이 참조로 포함되는 문헌[Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds) (1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1]에 기재된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(리뷰를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press, NY) Vol. 3]을 참고한다). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포 배양에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 연관되므로, 항체의 생산도 증가할 것이다(Crouse et al., Mol . Cell. Biol . 3:257 (1983)).
시험관내 생산은 다량의 원하는 폴리펩타이드를 제공하기 위한 스케일-업을 허용한다. 조직 배양 조건 하의 포유류 세포 배양 기법은 당분야에 공지되어 있으며, 예로, 에어리프트 반응기 내 또는 연속 교반장치 반응기 내 균일한 현탁 배양, 또는 예로, 중공 섬유, 마이크로캡슐 내, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상의 고정되거나 포획된 세포 배양이 포함된다. 필요하고/하거나 바람직한 경우, 폴리펩타이드 용액은 통상적 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스에 걸친 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피에 의해, 예로 합성 힌지 영역 폴리펩타이드의 우선적 생합성 이후 또는 본원에 기재된 HIC 크로마토그래피 이전 또는 이후 정제될 수 있다.
본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 유전자는 또한 비-포유류 세포, 예컨대 곤충, 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 쉽게 흡수하는 박테리아에는 엔테로박테리아세애의 구성원, 예컨대 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella); 바실라세애(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 해모필러스 인플루엔재(Haemophilus influenzae) 균주가 포함된다. 박테리아에서 발현되는 경우, 이종성 폴리펩타이드는 전형적으로 봉입체의 일부가 된다는 것이 추가로 이해될 것이다. 이종성 폴리펩타이드는 단리되고, 정제된 후 기능적 분자로 조립되어야 한다. 항체의 4가 형태가 바람직한 경우, 서브유닛이 4가 항체로 자가-조립될 것이다(WO 02/096948A2).
박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자에 대해 의도되는 용도에 따라 여러 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우, 항체 분자의 약학 조성물의 생성을 위해, 쉽게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 비제한적으로 항체 코딩 서열이 융합 단백질이 생산되도록 lacZ 코딩 영역과 인 프레임으로 벡터 내에 개별 결찰될 수 있는 이. 콜라이(E. coli) 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)); pIN 벡터(Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol . Chem. 24:5503-5509 (1989)) 등이 포함된다. pGEX 벡터가 또한 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타치온-아가로스 비드에 대한 흡착 및 결합에 이어 자유 글루타치온의 존재 하 용출에 의해 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하게 설계된다.
원핵생물에 부가하여, 진핵생물 미생물도 이용될 수 있다. 여러 다른 균주, 예로, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 일반적으로 이용 가능하지만, 진핵생물 미생물 중에는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 가장 일반적으로 이용된다.
사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현을 위해, 예를 들어, 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980))이 일반적으로 이용된다. 상기 플라스미드는 이미 TRP1 유전자를 함유하며, 이는 트립토판 중 성장하는 능력이 없는 돌연변이체 효모 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다(Jones, Genetics 85:12 (1977)). 이어서 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서의 trp1 병소의 존재는 트립토판의 부재 하 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위해 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 핵 다면체형성 바이러스(AcNPV)가 전형적으로 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 이용된다. 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어 다면체형성 유전자) 내로 개별 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어 다면체형성 프로모터)의 제어 하에 배치될 수 있다.
본 개시의 결합 분자가 재조합적으로 발현되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예로, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 이후 특이적 항원에 대한 친화도 및 크기분류 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로는, 본 개시의 항체의 친화도를 증가시키기 위한 바람직한 방법은 U.S. 특허 출원 공개 번호 2002 0123057 A1에 개시된다.
VII. 치료용 항-IL-33 항체를 이용하는 치료 방법
본 개시의 방법은 IL-33 발현 또는 IL-33 발현 세포와 연관되는 질환을 갖는 환자를 치료하기 위한, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 이의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체를 포함하는 항체의 용도에 대한 것이다. "IL-33-발현 세포"란 IL-33 항원을 발현하는 세포에 대한 것이다. 세포 내 IL-33 발현의 검출 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 PCR 기법, 면역조직화학, 유세포 측정, 웨스턴 블롯, ELISA 등이 포함된다.
하기 논의가 본 개시의 항-IL-33 항체를 이용한 다양한 질환 및 장애의 진단 방법 및 치료를 나타내지만, 본원에 기재된 방법은 본 개시의 항-IL-33 항체의 원하는 특성을 보유하는, 예로, IL-33에 특이적으로 결합하고 IL-33 병리 활성을 중화할 수 있는 이들 항-IL-33 항체의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체에도 적용 가능하다.
하나의 구현예에서, 치료에는 대상체 또는 환자에 대한 본 개시의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적용 또는 투여, 또는 대상체 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 대한 항-IL-33 결합 분자의 적용 또는 투여가 포함되며, 여기서 대상체 또는 환자는 질환, 질환 증상, 또는 질환에 대한 소인을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 치료는 또한 대상체 또는 환자에 대한 본 개시의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여, 또는 질환, 질환 증상, 또는 질환에 대한 소인을 갖는 대상체 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 대한 항-IL-33 결합 분자를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여를 포함하려는 것이다.
본 개시의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 결합 단편은 다양한 염증성 질병의 치료에 유용하다. "항-염증성 활성"이란 IL-33-발현 세포에서 염증성 반응률의 감소, 그리고 이에 따라 치료법 동안 일어나는 조직 내 염증의 감소에 대한 것이다. 예를 들어, 적어도 하나의 항-IL-33 항체를 이용한 치료법은 인간에서의 IL-33-발현 세포와 연관된 질환 상태의 치료에 관해 유익한 생리적 반응, 예를 들어, 염증성 반응의 감소를 유도한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 약제로서 이용하기 위한, 특히 염증성 반응의 치료 또는 예방에서 이용하기 위한 또는 염증성 질병, 예로, 천식 또는 COPD의 치료에서 이용하기 위한 본 개시에 따른 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 결합 단편에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 결합 단편은 알러지성 장애의 치료를 위해 이용된다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 결합 단편은 대상체 또는 환자의 기도에서 염증성 반응의 치료를 위해 이용된다.
본 개시의 방법에 따르면, 본원에서 다른 곳에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 염증성 반응에 대한 긍정적 치료 반응을 촉진하기 위해 이용된다. 염증성 치료에 대한 "긍정적 치료 반응"이란 이들 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 단편의 항-염증성 활성과 연관된 질환에서의 개선, 및/또는 질환과 연관된 증상에서의 개선에 대한 것이다. 즉, 항-염증성 효과, 추가 염증의 예방 및/또는 기존 염증의 감소, 및/또는 질환과 연관된 하나 이상의 증상에서의 감소가 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 질환에서의 개선은 완전 반응으로 특성규명될 수 있다. "완전 반응"이란 임의의 이전 평가 결과의 정상화를 포함하는 임상적으로 검출 가능한 질환의 부재에 대한 것이다. 이러한 반응은 본 개시의 방법에 따라 치료 후 적어도 1개월 동안 지속되어야 한다. 대안적으로, 질환에서의 개시는 부분 반응인 것으로 분류될 수 있다.
본원에 기재된 항-IL-33 결합 분자, 예로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 염증성 질환 및 IL-33 발현 세포와 연관되는 면역계의 결핍증 또는 장애의 치료에서의 용도를 찾을 수 있다. 염증성 질환은 염증 및 조직 파괴, 또는 이의 조합을 특징으로 한다. "항-염증성 활성"이란 염증의 감소 또는 예방에 대한 것이다. "염증성 질환"에는 면역 반응의 개시 이벤트 또는 표적에, 예를 들어 자가항원, 이종항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 미공지 항원, 또는 알러지원을 포함하는 비-자가 항원(들)이 관여되는 임의의 염증성 면역-매개 공정이 포함된다. 하나의 구현예에서, 염증성 질환은 기도의 염증성 장애, 예로, 천식 또는 COPD이다.
천식은, 예로, 가변적이고 반복적인 증상, 가역적 기도 폐색 및 기관지경련을 특징으로 하는 기도의 일반적 염증성 질환으로 간주된다. 천식 증상에는 쌕쌕거림, 기침, 가슴 조임 및 호흡 곤란이 포함될 수 있다. 증상은 알러지원 또는 자극인자에 대한 노출에 의해 유발될 수 있다. 천식은 증상이 알러지원(아토피성) 또는 비-알러지원(비-아토피성)에 의해 재촉되는지 여부에 기반하여, 아토피성(외인성) 또는 비-아토피성(내인성)으로 분류될 수 있다. 급성 천식 악화는 일반적으로 "천식 발작"으로 불린다. 천식 발작 동안 일어날 수 있는 추가 징후에는 호흡 부근육(목의 흉쇄유돌근 및 사각근)의 이용이 포함되며, 모순 맥박(흡기 동안 더 약하고 배기 동안 더 강한 맥박) 및 흉부의 과-팽창이 있을 수 있다. 청색 피부 및 손발톱도 산소 부족으로 일어날 수 있다.
본 개시의 방법에 따르면, 본원에서 다른 곳에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 대한 긍정적 치료 반응을 촉진하기 위해 이용된다. 염증성 질환에 대한 "긍정적 치료 반응"이란 이들 항체의 항-염증성 활성과 연관된 질환에서의 개선 등, 및/또는 질환과 연관된 증상에서의 개선에 대한 것이다. 즉, 비제한적으로 염증성 사이토카인, 접착 분자, 프로테아제, 면역글로불린, 이의 조합 등의 감소된 분비, 항-염증성 단백질의 증가된 생성, 자가반응성 세포수의 감소, 면역 관용성의 증가, 자가반응성 세포 생존의 억제, 아폽토시스의 감소, 내피 세포 이동의 감소, 자발적 단핵구 이동의 증가, IL-33-발현 세포의 자극에 의해 매개되는 하나 이상의 증상의 감소 및/또는 저하를 포함하는 염증성 반응의 감소가 관찰될 수 있다. 이러한 긍정적 치료 반응은 투여 경로에 제한되지 않는다.
임상 반응은 스크리닝 기법, 예컨대 자기 공명 조영(MRI) 스캐닝, x-방사측정 조영, 컴퓨터 연산 단층촬영(CT) 스캐닝, 유세포 측정 또는 형광-활성화 세포 정렬장치(FACS) 분석, 조직학, 거시 병리학 및 비제한적으로 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출 가능한 변화를 포함하는 혈액 화학을 이용해서 평가될 수 있다. 이러한 긍정적 치료 반응에 부가하여, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료법을 거치고 있는 대상체는 질환과 연관된 증상에서 유익한 개선 효과를 경험할 수 있다.
항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체 또는 이의 결합 단편은 염증성 질환, 예로, 천식 또는 COPD의 치료를 위해 유용한 것으로 공지되어 있거나 이용되었거나 현재 이용 중인 임의의 제제 또는 제제 조합을 포함하는, 염증성 질환의 임의의 공지된 치료법과 조합되어 이용될 수 있다. 천식을 치료하기 위해 이용되는 제제는 2개의 일반 클래스로 구분된다: 급성 증상을 치료하기 위해 이용되는 신속-완화 약제; 및 추가 악화를 예방하기 위해 이용되는 장기 제어 약제. 신속 작용 치료에는, 예로, 단기-작용 베타-2-아드레날린성 수용체 작용제(SABA)(예로, 살부타몰); 항콜린성 약제(예로, 이프라트로피움 브로마이드), 아드레날린성 작용제(예로, 에피네프린)가 포함된다. 장기 제어 치료에는, 예로, 글루코코르티코이드(예로, 플루티카손 프로피오네이트); 장기 작용 베타-2 아드레날린성 수용체 작용제(LABA); 류코트리엔 길항제(예로, 자피르루카스트); 및 비만 세포 안정화제(예로, 크로몰린 나트륨)가 포함된다. 신속 작용 및 장기 제어 치료는 종종 흡인에 의해 투여된다.
따라서, 조합 치료법이 또 다른 치료제의 투여와 조합된 항-IL-33 결합 분자의 투여를 포함하는 경우, 본 개시의 방법은 별도 제형물 또는 단일 약학 제형물을 이용한 공동투여 및 어느 순서로든 연속 투여를 포괄한다. 본 개시의 일부 구현예에서, 본원에 기재되는 항-IL-33 항체는 항-염증성 약물과 조합되어 투여되며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제(들)는 어느 순서로든 순차적으로, 또는 동시적으로(즉, 동시발생으로 또는 동일한 시간 프레임 내에서) 투여될 수 있다.
본 개시의 추가 구현예는, 예로, 주어진 치료 방식의 유효성을 결정하기 위해, 임상 평가 절차의 일환으로서 조직 내 단백질 수준의 진단적 모니터링을 위한, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도이다. 예를 들어, 검출은 검출 가능한 물질에 대한 항체의 커플링에 의해 촉진될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보철기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질 및 방사활성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예에는 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제가 포함되며; 적합한 보철기 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린이 포함되고; 적합한 방사활성 물질의 예에는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 포함된다.
VIII. 약학 조성물 및 투여 방법
이를 필요로 하는 대상체에 대한 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 제조 및 투여 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있거나 이에 의해 쉽게 결정된다. 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비경구, 흡인 또는 국소일 수 있다. 본원에서 이용되는 비경구라는 용어에는, 예로, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여가 포함된다. 이러한 모든 투여 형태가 본 개시의 범위 내인 것으로 명확히 고려되지만, 또 다른 투여 형태의 예는 주사를 위한, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 드립을 위한 용액일 것이다. 보통, 본 개시의 적합한 약학 조성물은 완충액(예로, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예로, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예로, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나 본원에 교시된 것과 양립되는 다른 방법에서, 항-IL-33 결합 분자, 예로 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 유해한 세포 집단 부위로 직접 전달됨으로써 치료제에 대한 이환 조직의 노출을 증가시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여는 기도로 직접, 예로, 흡인 또는 비내 투여에 의한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 IL-33-발현 세포-매개 질환, 예컨대 특정 유형의 염증성 질환의 생체내 치료를 위한 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이에 관해, 개시된 본 개시의 결합 분자가 활성 제제의 투여를 촉진하고 안정성을 도모하기 위해 제형화될 것임이 이해될 것이다. 바람직하게는, 본 개시에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한, 무독성, 멸균 담체, 예컨대 생리 식염수, 무독성 완충액, 보존제 등을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, 접합되거나 접합되지 않은, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 약학적 유효량은 표적에 대해 효과적인 결합을 달성하고, 유익을 달성하기 위한, 예로, 질환 또는 질병의 증상을 개량하기 위해 또는 물질 또는 세포를 검출하기 위해 충분한 양을 의미하기 위해 이용된다.
본 개시에서 이용되는 약학 조성물은, 예로, 물, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 2나트륨 하이드로겐 포스페이트, 칼륨 하이드로겐 포스페이트, 나트륨 클로라이드, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방을 포함하는, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
투여용 조제물에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브유 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체에는, 예로, 식염수 및 완충 배지를 포함하는, 물, 알코올계/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 본 개시에서, 약학적으로 허용 가능한 담체에는 비제한적으로 0.01~0.1 M 및 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 식염수가 포함된다. 다른 일반적인 비경구 비히클에는 나트륨 포스페이트 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 나트륨 클로라이드, 락테이트화 링거, 또는 신전유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것들 등이 포함된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.
보다 구체적으로, 주사 용도에 적합한 약학 조성물에는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 생체외 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 이러한 경우, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도까지 유체여야 한다. 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 바람직하게는 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예로, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에서의 이용을 위해 적합한 제형물은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기재되어 있다.
미생물의 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 여러 경우에 있어서, 조성물 중에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 일으킬 수 있다.
모든 경우, 멸균 주사 용액은 요구되는 바에 따라, 적절한 용매 중 요구되는 양의 활성 화합물(예로, 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체 자체 또는 다른 활성 제제와의 조합)을 본원에서 열거된 성분의 하나 또는 조합과 혼입한 뒤 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조이며, 이는 전에 이의 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출한다. 주사용 조제물은 가공되고, 용기, 예컨대 앰플, 가방, 병, 주사기 또는 바이알 내로 충전되고, 당분야에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에 밀봉된다. 추가로, 조제물은 키트 형태로 패키지화되고 판매될 수 있다. 이러한 제조 물품은 바람직하게는 연관된 조성물이 질환 또는 장애를 겪거나, 그러한 소인이 있는 대상체의 치료에 유용함을 시사하는 표지 또는 패키지 삽입물을 가질 것이다.
비경구 제형물은 관리 용량이 뒤따르는 단일 볼루스 용량, 주입 또는 로딩 볼루스 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특정한 고정 또는 가변 간격으로, 예로, 1일 1회, 또는 "필요에 따른" 단위로 투여될 수 있다.
본 개시에서 이용되는 특정한 약학 조성물은, 예로, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는 허용 가능한 투여량 형태로 경구 투여될 수 있다. 특정한 약학 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡인에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 생체이용률을 증강시키기 위해 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 흡수 촉진제를 및/또는 다른 통상적 가용화제 또는 분산제를 이용하여, 식염수 중 용액으로 제조될 수 있다.
단일 투여량 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 치료받는 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 변할 것이다. 조성물은 단일 용량, 다중 용량으로서 또는 주입에 확립된 시기에 걸쳐 투여될 수 있다. 투여량 방식은 또한 최적의 원하는 반응(예로, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 개시의 범위를 유지하며, 본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료 효과를 생성하기 충분한 양으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 공지된 기법에 따라 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 통상적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조되는 통상적 투여량 형태로 이러한 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 당업자는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 이것이 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 지정됨을 인식할 것이다. 당업자는 하나 이상의 종의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
"치료적 유효 용량 또는 유효량" 또는 "유효량"이란 투여되는 경우 치료받을 질환 또는 질병을 갖는 환자의 치료에 대해 긍정적 치료 반응을 일으키는, 항-IL-33 결합 분자, 예로 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양에 대한 것이다.
본 개시는 또한, 예로, 천식 또는 COPD를 포함하는 염증성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의, 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도를 제공한다.
본 개시는 또한 염증성 질환의 치료를 위해 대상체의 치료를 위한 약제의 제조에서의 항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도를 제공하며, 여기서 약제는 적어도 하나의 다른 치료법으로 사전 치료받은 대상체에서 이용된다. "사전 치료받은" 또는 "사전 치료"란 항-IL-33 결합 분자, 예로, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약제를 수여받기 전에, 대상체가 하나 이상의 다른 치료법을 수여받았음(예로, 적어도 하나의 다른 항-염증성 치료법으로 치료받았음)에 대한 것이다. "사전 치료받은" 또는 "사전 치료"에는 항-IL-33 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약제로의 치료 개시 전 2년 내에, 18개월 내에, 1년 내에, 6개월 내에, 2개월 내에, 6주 내에, 1개월 내에, 4주 내에, 3주 내에, 2주 내에, 1주 내에, 6일 내에, 5일 내에, 4일 내에, 3일 내에, 2일 내에, 또는 심지어 1일 내에 적어도 하나의 다른 치료법으로 치료받은 대상체가 포함된다. 대상체가 이전 치료법 또는 치료법들로의 사전 치료에 대한 반응체였을 필요는 없다. 따라서, 항-IL-33 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약제를 수여받는 대상체는 이전 치료법을 이용한 사전 치료, 또는 사전 치료가 여러 치료법으로 이루어지는 경우 하나 이상의 이전 치료법에 반응했을 수도 있고, 또는 반응하지 못했을 수도 있다.
IX. 진단
본 개시는 IL-33-발현 세포-매개 질환, 예로, 천식을 포함하는 특정한 유형의 염증성 질환의 진단 동안 유용한 진단 방법으로서, 개체로부터의 조직 또는 다른 세포 또는 체액 중 IL-33 단백질 또는 전사체의 발현 수준을 측정하는 단계 및 측정된 발현 수준을 정상 조직 또는 체액 중 표준 IL-33 발현 수준과 비교하는 단계가 관여되며, 이에 의해 표준 대비 발현 수준의 증가는 장애를 시사하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시의 항-IL-33 항체 및 이의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체는 당업자에게 공지된 전통적 면역조직학 방법을 이용해서 생물학적 샘플 중 IL-33 단백질 수준을 검정하기 위해 이용될 수 있다(예로, 문헌[Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참고). IL-33 단백질 발현을 검출하기 위해 유용한 다른 항체-기반 방법에는 면역검정, 예컨대 효소 연관 면역흡착 검정(ELISA), 면역침전, 또는 웨스턴 블로팅이 포함된다. 적합한 검정은 본원에서 다른 곳에 보다 상세히 기재되어 있다.
"IL-33 폴리펩타이드의 발현 수준 검정"이란 직접적으로(예로, 절대적 단백질 수준의 결정 또는 산정에 의해) 또는 상대적으로(예로, 제2 생물학적 샘플 중 질환 연관된 폴리펩타이드 수준과의 비교에 의해) 제1 생물학적 샘플 중 IL-33 폴리펩타이드 수준의 정성적 또는 정량적 측정 또는 산정에 대한 것이다. 바람직하게는, 제1 생물학적 샘플 중 IL-33 폴리펩타이드 발현 수준이 측정되거나 산정되고 표준 IL-33 폴리펩타이드 수준과 비교되며, 표준은 장애를 갖지 않는 개체로부터 수득되는 제2 생물학적 샘플로부터 취해지거나 장애를 갖지 않는 개체 집단으로부터의 수준을 평균내어 결정된다. 당분야에서 이해될 바와 같이, 일단 "표준" IL-33 폴리펩타이드 수준이 공지되면, 비교용 표준으로서 반복적으로 이용될 수 있다.
"생물학적 샘플"이란 IL-33을 잠재적으로 발현하는 개체, 세포주, 조직 배양, 또는 다른 세포 원천으로부터 수득되는 임의의 생물학적 샘플에 대한 것이다. 포유류로부터의 조직 생검 및 체액의 수득 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.
X. 면역검정
항-IL-33 결합 분자, 예로, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합에 대해 검정될 수 있다. 결합 검정은 직접적 결합 검정으로 또는 경쟁-결합 검정으로 수행될 수 있다. 이용될 수 있는 면역검정에는, 예를 들어, 비제한적으로 ELISA(효소 연관 면역흡착 검정), 웨스턴 블로팅, 면역세포화학, 면역침전, 친화도 크로마토그래피, Bio-Layer Interferometry , Octet, ForteBio) 및 생화학적 검정, 예컨대 해리-증강 란탄족 원소 형광 면역검정(DELFIA®, Perkin Elmer), Foerster 공명 에너지 전달(FRET) 검정(예로, 균일한 시간차 형광(HTRF®, Cis Biointernational) 및 방사리간드 결합 검정이 포함된다. 결합은 또한 세포 검정에서, 예를 들어, 유세포 측정 및 형광 미세부피측정 검정 기술(FMAT®, Applied Biosystems)에 의해 검출될 수 있다. 직접적 결합 검정에서, 후보 항체가 IL-33 항원으로의 결합에 대해 평가된다. 다른 한 편으로, 경쟁 결합 검정은 후보 항체가 IL-33에 결합하는 공지된 항-IL-33 또는 단편 또는 다른 화합물, 예컨대 ST2와 경쟁하는 능력을 평가한다. 이러한 검정은 일상적이고 당분야에서 널리 공지되어 있다(예로, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 문헌[Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1]을 참고한다). 예시적인 면역검정이 아래에 간략히 기재된다(그러나 제한으로서가 아님).
면역침전 프로토콜은 일반적으로 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제(예로, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 나트륨 바나데이트)가 보충된 용해 완충액, 예컨대 RIPA 완충액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 나트륨 포스페이트, pH 7.2, 1% Trasylol) 중 세포 집단을 용해시키는 단계, 관심 항체를 세포 용해물로 첨가하는 단계, 4℃에서 일정 시기(예로, 1~4시간) 동안 인큐베이션하는 단계, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로스 비드를 세포 용해물에 첨가하는 단계, 4℃에서 약 1시간 이상 동안 인큐베이션하는 단계, 용해 완충액 중 비드를 세척하는 단계 및 비드를 SDS/샘플 완충액 중 재현탁하는 단계를 포함한다. 관심 항체가 특정 항원을 면역침전시키는 능력은, 예로, 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 항체의 항원에 대한 결합을 증가시키고 배경을 감소시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터에 대해 지식을 가질 것이다(예로, 세파로스 비드를 이용한 세포 용해물의 사전-세정). 면역침전 프로토콜에 관한 추가 논의에 대해서는, 예로 문헌[Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10.16.1]을 참고한다.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 샘플을 제조하는 단계, 폴리아크릴아마이드 겔에서 단백질 샘플을 전기영동(예로, 항원 분자량에 따라 8%~20% SDS-PAGE)하는 단계, 단백질 샘플을 폴리아크릴아마이드 겔로부터 막, 예컨대 니트로셀룰로스, PVDF 또는 나일론으로 전달하는 단계, 막을 차단 용액(예로, 3% BSA 또는 무지방 우유 함유 PBS) 중에 차단하는 단계, 막을 세척 용액(예로, PBS-Tween 20) 중에 세척하는 단계, 막을 차단 완충액 중에 희석된 일차 항체(관심 항체)로 차단하는 단계, 막을 세척 용액 중에 세척하는 단계, 막을 차단 완충액 중 희석된 효소 기질(예로, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 방사활성 분자(예로, 32P 또는 125I)에 접합된 이차 항체(일차 항체, 예로, 항-인간 항체를 인식함)로 차단하는 단계, 막을 세척 완충액 중에 세척하는 단계 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키고 배경 노이즈를 감소시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터에 대해 지식을 가질 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 관한 추가 논의에 대해서는, 예로 문헌[Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10.8.1]을 참고한다.
ELISA는 항원을 제조하는 단계, 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하는 단계, 검출 가능한 화합물, 예컨대 효소 기질(예로, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합된 관심 항체를 웰에 첨가하는 단계 및 일정 시기 동안 인큐베이션하는 단계 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. ELISA에서, 관심 항체가 검출 가능한 화합물에 접합될 필요는 없다; 대신에, 검출 가능한 화합물에 접합된 제2 항체(관심 항체를 인식함)가 웰에 첨가될 수 있다. 또한, 웰을 항원으로 코팅하는 대신, 항체가 웰에 코팅될 수 있다. 이러한 경우, 검출 가능한 화합물에 접합된 제2 항체는 코팅된 웰에 대한 관심 항원의 첨가 후 첨가될 수 있다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터뿐만 아니라 당분야에 공지된 ELISA의 다른 변이에 대해 지식을 가질 것이다. ELISA에 관한 추가 논의에 대해서는, 예로, 문헌[Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 13.2.1]을 참고한다.
본 개시의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 추가적으로, IL-33 단백질 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편의 원 위치 검출을 위해, 면역형광, 면역전자 현미경 또는 비-면역학적 검정에서와 같이, 조직학적으로 이용될 수 있다. 원 위치 검출은 환자로부터 조직학적 시편을 제거하고, 여기에 바람직하게는 생물학적 샘플 상에 표지된 항체(또는 단편)의 오버레이에 의해 적용되는, 표지된 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 적용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 절차의 이용을 통해, IL-33 단백질 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편의 존재뿐만 아니라 검사되는 조직 내에서 그 분포를 결정할 수 있다. 본 개시를 이용하여, 당업자는 임의의 매우 다양한 조직학적 방법(예컨대 염색 절차)이 이러한 원 위치 검출을 달성하기 위해 변형될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
IL-33 유전자 산물 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편에 대한 면역검정 및 비-면역검정은 전형적으로 IL-33 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편에 결합할 수 있는 검출 가능하게 표지된 항체의 존재 하에 샘플, 예컨대 생물학적 유체, 조직 추출물, 신선 수확된 세포, 또는 세포 배양에서 인큐베이션된 세포의 용해물을 인큐베이션하는 단계 및 당분야에 널리 공지된 임의의 여러 기법에 의해 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함할 것이다.
생물학적 샘플은 고상 지지체 또는 담체, 예컨대 니트로셀룰로스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정화할 수 있는 다른 고상 지지체와 접촉되고 여기에 고정화될 수 있다. 이어서 지지체가 적합한 완충액으로 세척된 후, 검출 가능하게 표지된 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체로 처리될 수 있다. 그 뒤, 고상 지지체는 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 두 번째로 완충액으로 세척될 수 있다. 선택적으로, 항체는 이후 표지된다. 이어서 고상 지지체 상의 결합된 표지의 양이 통상적 수단에 의해 검출될 수 있다.
"고상 지지체 또는 담체"란 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체에 대한 것이다. 널리 공지된 지지체 또는 담체에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 반려암 및 자철광이 포함된다. 담체의 성질은 어느 정도까지 가용성이거나 본 개시의 목적을 위해 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 실질적으로 모든 가능한 구조적 배치를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 배치는 비드에서와 같이 구형, 또는 시험관 내부 표면, 또는 막대 외부 표면에서와 같은 실린더형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 시트, 평가 스트립 등과 같이 평탄할 수 있다. 바람직한 지지체에는 폴리스티렌 비드가 포함된다. 당업자는 항체 또는 항원에 결합하기 위한 여러 다른 적합한 담체를 알거나, 일상적 실험의 이용에 의해 이를 확인할 수 있을 것이다.
용액상 결합 검정이 또한 예로서, 그러나 비제한적으로 Foerster 공명 에너지 전달(FRET) 검정(예로, 균일한 시간차 형광(HTRF®, Cis Biointernational)에 의해, 당분야에 공지된 적합한 방법을 이용해서 수행될 수 있다. HTRF® 검정은 가까이 인접해 있는 공여체 및 수신체 형광단 간 형광 공명 에너지 전달을 이용하는 균일한 검정 기술이다(Mathis, G., Clin Chem 41(9):1391-7 (1995)). 검정은 관심 분자 중 하나를 공여체 형광단, 예로, 유로퓸(Eu3+) 크립테이트에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링하고, 다른 관심 분자를 수신체 형광단, 예로 XL665(안정 가교된 알로피코시아닌)에 커플링하여 거대분자 상호작용을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 공여체 분자의 여기는 형광 방출을 일으킨다. 상기 방출로부터의 에너지가 수신체 형광단으로 전달될 수 있고, 공여체 형광단에 가까이 인접한 경우, 특이적인 장기 지속 형광의 방출을 일으킨다.
주어진 로트의 항-IL-33 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 결합 활성은 널리 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 당업자는 일상적 실험을 이용함으로써 각각의 결정을 위해 작동하는 최적 검정 조건을 결정할 수 있을 것이다.
항체-항원 상호작용의 친화도를 측정하기 위해 이용 가능한 다양한 방법이 존재하지만, 속도 상수를 결정하기 위한 방법은 비교적 적다. 대부분의 방법은 항체 또는 항원 중 하나의 표지에 의존하며, 이는 필연적으로 일상적 측정을 복잡하게 만들고 측정된 양에 불확실성을 도입한다.
항체의 항원에 대한 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프-율은 경쟁적 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 하나의 예는 증가하는 양의 표지되지 않은 항원의 존재 하에 표지된 항원(예로, 3H 또는 125I)과 관심 항체의 인큐베이션 및 표지된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사면역검정이다. 특정 항원에 대한 관심 항체의 친화도 및 결합 오프-율은 scatchard 그래프 분석에 의해 데이터로부터 결정될 수 있다. 제2 항체와의 경쟁도 방사면역검정을 이용해서 결정될 수 있다. 이 경우, 항원은 증가하는 양의 표지되지 않은 제2 항체의 존재 하에 표지된 화합물(예로, 3H 또는 125I)에 접합된 관심 항체와 인큐베이션된다.
BIACORE® 상에서 수행되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 항체-항원 상호작용의 친화도를 측정하는 통상적 방법에 비해 여러 장점을 제공한다: (i) 항체 또는 항원 중 하나를 표지할 필요가 없고; (ii) 항체가 미리 정제될 필요 없이, 세포 배양 상청액이 직접 이용될 수 있으며; (iii) 상이한 모노클로날 항체 상호작용의 신속한 반정량적 비교를 허용하는 실시간 측정이 가능해지며, 여러 평가 목적을 위해 충분하고; (iv) 생체특이적 표면이 재생되어 일련의 상이한 모노클로날 항체가 동일한 조건 하에 쉽게 비교될 수 있고; (v) 분석 절차가 완전 자동화되고, 광범위한 시리즈의 측정이 사용자 개입 없이 수행될 수 있다. [BIAapplications Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-84]. SPR 기반 결합 연구는 결합 페어의 하나의 구성원이 센서 표면 상에 고정화될 것을 필요로 한다. 고정화된 결합 파트너는 리간드로 불린다. 용액 중 결합 파트너는 분석물질로 불린다. 일부 경우에 있어서, 리간드는 또 다른 고정화된 분자에 대한 결합을 통해 표면에 간접적으로 부착되며, 이는 포획 분자로 불린다. SPR 반응은 분석물질이 결합하거나 해리할 때 검출장치 표면에서의 질량 농도 변화를 반영한다.
SPR에 기반하여, 실시간 BIACORE® 측정은 일어나는 상호작용을 직접 모니터링한다. 기법은 동역학 파라미터의 결정에 매우 적합하다. 상대 친화도 순위산정은 수행하기가 간단하며, 동역학 및 친화도 상수가 모두 센소그램 데이터로부터 유도될 수 있다.
분석물질이 리간드 표면에 걸쳐 별개 펄스로 주입되는 경우, 생성되는 센소그램은 3개의 필수 상으로 구분될 수 있다: (i) 샘플 주입 동안 분석물질과 리간드의 연합; (ii) 분석물질 결합 속도가 복합체로부터의 해리에 의해 균형이 잡히는, 샘플 주입 동안의 평형 또는 일정 상태; (iii) 완충액을 흘리는 동안 표면으로부터의 분석물질의 해리.
연합상 및 해리상은 분석물질-리간드 상호작용의 동역학에 대한 정보를 제공한다(ka 및 kd, 복합체 형성 및 해리 속도, kd/ka=KD). 평형상은 분석물질-리간드 상호작용(KD)의 친화도에 대한 정보를 제공한다.
BIAevaluation 소프트웨어는 수치 적분 및 전반적 피팅 알고리즘을 모두 이용하여 곡선 피팅을 위한 통합 설비를 제공한다. 데이터의 적합한 분석으로, 상호작용에 대한 별도의 속도 및 친화도 상수가 간단한 BIACORE® 연구로부터 수득될 수 있다. 상기 기법에 의해 측정 가능한 친화도 범위는 mM부터 pM까지 매우 광범위하다.
이러한 방법의 또 다른 예에는, 예를 들어, KinExa 기기(Sapidyne Instruments)를 이용해서 수행될 수 있는, 동역학 배제 검정을 이용하여 평형 해리 상수 "KD"를 측정하는 단계가 포함된다. 간략하게, 항-IL33 항체의 용액상 평형 해리 상수 KD는 평형에 도달할 때까지 가변 농도의 항체와 IL-33의 사전-혼합에 의해 결정될 수 있다. 이어서 자유 항체의 양은 자유 항체를 IL-33 코팅된 비드를 이용하여 포획하고, 결합되지 않은 물질을 세척 제거하고, 형광 표지된 종 특이적 항체를 이용하여 결합된 항체를 검출함으로써 KinExa를 이용하여 측정된다. 각각의 IL-33 농도에서 검출되는 자유 항체의 양이 IL-33의 농도에 대해 도식화되고 KinExa 소프트웨어가 평형 해리 상수(KD)를 계산하기 위해 이용된다.
단리 항체 또는 제시된 이의 항원-결합 단편, 또는 이의 변경/돌연변이체 유도체(아래에서 논의됨)의 결합 특징을 결정하기 적합한 방법 및 시약은 당분야에 공지되어 있고/있거나 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 동역학 분석을 위해 설계된 설비 및 소프트웨어는 상업적으로 이용 가능하다(예로, BIAcore, BIAevaluation 소프트웨어, GE Healthcare; KinExa 소프트웨어, Sapidyne Instruments).
에피토프 특이성은 모노클로날 항체의 중요한 특징이다. 방사면역검정, ELISA 또는 다른 표면 흡착 방법을 이용하는 통상적 기법과 대비되어, BIACORE®의 에피토프 맵핑은 표지 또는 정제된 항체를 필요로 하지 않으며, 몇몇 모노클로날 항체의 서열을 이용하는 다중-부위 특이성 평가를 허용한다. 추가적으로, 다수의 분석이 자동 가공될 수 있다.
페어식 결합 실험은 2개의 MAb가 동일한 항원에 동시적으로 결합하는 능력을 평가한다. 별도의 에피토프에 대해 유도된 MAb는 독립적으로 결합할 것인 반면, 동일하거나 가깝게 관련된 에피토프에 대해 유도된 MAb는 서로 결합을 방해할 것이다. BIACORE®를 이용한 이러한 결합 실험은 실행하기 간단하다.
예를 들어, 제1 Mab에 결합하는 포획 분자를 이용한 뒤, 항원 및 제2 MAb를 순차적으로 첨가할 수 있다. 센소그림은 다음을 드러낼 것이다: (1) 얼마나 많은 항원이 제1 Mab에 결합하는지, (2) 어느 정도로 제2 MAb가 표면-부착 항원에 결합하는지, (3) 제2 MAb가 결합하지 않는 경우, 페어식 평가의 순서 역전이 결과를 변경하는지 여부.
펩타이드 억제는 에피토프 맵핑을 위해 이용되는 또 다른 기법이다. 상기 방법은 페어식 항체 결합 연구를 보충할 수 있으며, 항원의 일차 서열이 공지된 경우 기능적 에피토프를 구조적 특색과 관련시킬 수 있다. 펩타이드 또는 항원 단편은 고정화된 항원에 대한 상이한 MAb의 결합 억제에 대해 평가된다. 주어진 MAb의 결합을 방해하는 펩타이드는 해당 MAb에 의해 정의되는 에피토프와 구조적으로 관련된 것으로 가정된다.
본 개시의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 범위 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에서 자세히 설명되어 있다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
하기 실시예는 제한으로서가 아니라 예시로서 제공된다.
도 1 정제되지 않은 scFv 원형질막 주위공간 조제물의 존재 하에 인간 IL33-ST2 결합에 대한 HTRF 검정을 나타낸다. 항체 IL330004를 함유하는 웰이 강조된다.
도 2 IL33-ST2 HTRF 검정에서 정제 scFv 조제물에 의한 인간 및 게잡이원숭이 IL33의 중화를 나타낸다.
도 3 IL33-ST2 HTRF 검정에서 정제된 IgG 조제물에 의한 인간 및 게잡이원숭이 IL33의 중화를 나타낸다.
도 4 NFkB 신호전달 검정에서 정제된 IgG 조제물에 의한 인간 IL33의 중화를 나타낸다.
도 5 CAT-002 음성 대조군(왼쪽 패널) 대비 IL-33 항체 IL330004(오른쪽 패널)에 의한 면역형광 염색에 의해 기관지 평할근 세포에서의 내인성 IL-33의 검출을 나타낸다.
도 6 인간 IL-33, 게잡이원숭이 IL-33 및 인슐린에 대해 스크리닝된 단일 플레이트로부터의 결합 데이터를 나타낸다. 하나의 특이적인 인간/게잡이원숭이 교차-반응 IL-33 결합물질이 웰 C4에 나타나며, 웰 A12 및 B12는 대조군 IL-33 결합 클론을 함유한다.
도 7의 A TF-1 증식 검정에서 항체의 중화 활성을 나타낸다.
도 7의 B HUVEC IL-6 생성 검정에서 항체의 중화 활성을 나타낸다.
도 8 비만 세포 사이토카인 생성 검정에서 항체의 중화 활성을 나타낸다.
도 9 웨스턴 블롯에 의한 전장 인간 IL-33으로의 IL-33 항체(IL330065, IL330101, IL330107 및 IL330149)의 결합을 나타낸다.
도 10 전장 IL-33 세포 용해물에 의해 자극된 비만 세포 IL-6 및 IL-13 생성에 대한 항-IL-33 항체 IL330065 및 IL330101의 중화 활성을 나타낸다.
도 11의 A 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180 존재 하의 HTRF® 수용체-리간드 경쟁 검정을 나타낸다.
도 11의 B 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107 및 IL330149 존재 하의 Huvec NFkB(p65/RelA) 전위 검정을 나타낸다.
도 12의 A 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 정제 scFv 조제물과 mAb IL330101의 경쟁적 결합을 나타낸다.
도 12의 B 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 정제 scFv 조제물과 mAb IL330180의 경쟁적 결합을 나타낸다.
도 13 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 IL330259 scFv와 mAb IL330101의 경쟁적 결합을 나타낸다.
도 14의 A 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 IL330259 IgG와 mAb IL330101의 경쟁적 결합을 나타낸다.
도 14의 B 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 항체와 mAb H338L293의 경쟁적 결합을 나타낸다.
도 15 HUVEC 또는 비만 세포 IL-6 생성 검정에서 항체의 중화 활성을 나타낸다.
도 16 비만 세포 IL-6 생성 검정에서 IL330388 및 H338L293의 Schild 분석을 나타낸다.
도 17 HUVEC 신호전달 검정(30분) 및 IL-6 생성 검정(18~24시간)에서 측정된, 인간 IL-33, 시스테인-바이오틴화 IL-33 또는 세포 배양 배지-사전 처리 IL-33의 활성을 나타낸다.
도 18 Iscoves Modified Dulbeccos 배지(IMDM)를 이용한 처리 이전 또는 이후, 환원성 또는 비-환원성 조건 하에 인간, 바이오틴화된-인간 또는 마우스 IL-33의 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 19 SEC에 의한 세포 배양 배지-처리된 인간 IL-33의 정제를 나타낸다.
도 20 LC-MS에 의해 결정된 PBS 대비 배지-처리된 IL-33의 온전한 질량을 나타낸다. IMDM-처리된 IL-33은 2개의 디설파이드 결합 형성과 양립되는 PBS-처리 대비 4 Da 손실을 나타내었다.
도 21 배지-처리된 인간 IL-33의 디설파이드 맵핑을 나타낸다. 데이터는 2개의 디설파이드 가교의 형성과 일치하였다.
도 22의 A NMR 분석을 위한 고농도 redIL-33 및 DSB IL-33의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 22의 B redIL-33 및 DSB IL-33에 대해 15N-표지된 인간 IL-33에 대한 1H-15N HMQC 스펙트럼이 오버레이된 NMR 이종핵 다중 퀀텀 정합(HMQC) 분석을 나타낸다.
도 22의 C 근-UV 원형 이색성(CD) 스펙트럼
도 22의 D 해석된 IL-33 구조 내에 시사된 IL-33의 중요 특색(Trp193, 시스테인 및 ST2 결합 부위)을 나타낸다.
도 22의 E 원-UV 원형 이색성(CD) 스펙트럼을 나타낸다.
도 23 redIL-33 및 DSB IL-33의 수소-중수소 교환 분석을 나타낸다. 중수소 혼입의 차이가 공개된 IL-33 구조 상으로 맵핑된다.
도 24 ST2에 대한 redIL-33 또는 DSB IL-33 결합을 나타낸다.
도 25 redIL-33 및 DSB IL-33 형태의 검출을 위한 3개의 상업적 IL-33 ELISA 검정의 분석을 나타낸다.
도 26 redIL-33의 검출에 특이적인 ELISA 검정을 나타낸다.
도 27 세포 배양 배지(IMDM) 또는 인간 혈청 중에 인큐베이션된 인간 IL-33의 시간 경과를 나타낸다. redIL-33 또는 DSB IL-33 형태는 ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 측정된다.
도 28 다중 ELISA 검정의 조합을 이용하여, 알테나리아(Alternaria) 비내 유발접종 후 다양한 시점에 수집된 인간화 IL-33 마우스로부터의 BALF 분석을 나타낸다. (A) Millipore, (B) R&D systems 및 (C) IL330425/sST2-바이오틴 검정이 sST2의 존재 또는 부재 하에 IL-33을 측정하기 위해 이용되었다(왼쪽 그래프). sST2 존재 하의 신호(환원 IL-33 분획으로부터의 신호가 제거됨)가 디설파이드 결합된 IL-33 수준을 정량하기 위해 디설파이드 결합된 IL-33 표준과 비교되었다. 환원 IL-33 신호는 ST2의 존재 및 부재 하 IL-33 측정 간 신호의 차이로서 계산되었으며, 환원 IL-33 표준에 대비하여 정량되었다. 환원 IL-33에 대한 산정은 오른쪽 그래프에 나타낸다.
도 29 알터나리아(Alternaria) 비내 유발접종 후 다양한 시점에 수집된 야생형 BALB/c 마우스로부터의 BALF 분석을 나타낸다. 마우스 IL-33 ELISA(R&D systems)가 sST2의 존재 또는 부재 하에 IL-33을 측정하기 위해 이용되었다(배지-처리된 마우스 IL-33이 표준 곡선으로 이용됨). sST2 존재 하의 신호(환원 IL-33 분획으로부터의 신호가 제거됨)가 산화 IL-33 수준을 정량하기 위해 배지-처리된 마우스 IL-33 표준과 비교되었다. 환원 IL-33 신호는 ST2의 존재 및 부재 하 IL-33 측정 간 신호의 차이로서 계산되었으며, 환원 마우스 IL-33 표준에 대비하여 정량되었다.
도 30의 A 8xSYPRO 오렌지 염료의 존재 하에 25℃에서 20 uM IL33과 함께 5 uM 항체의 인큐베이션 100분 후의 상대 형광 단위를 나타낸다. IL330004 또는 대조군 mAb가 아닌 IL-33 H338L293의 존재 하에, 단백질 비-폴딩을 시사하는 형광 신호가 증가한다.
도 30의 B 8xSYPRO 오렌지 염료의 존재 하에 25℃에서 20 uM IL33과 함께 다양한 농도의 H338L293의 인큐베이션 후 경시적인 상대 형광 단위를 나타낸다. 형광 신호는 항체 농도 증가와 함께 증가하였다.
도 30의 C IL-33의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 대조군 mAb 또는 mAb 비함유가 아닌 H338L293과의 IL-33의 사전인큐베이션은 비-환원성 조건 하에 더 빠르게 이동하는, 디설파이드 결합된 형태의 IL-33의 존재를 증가시켰다.
도 31 mAb H338L293을 이용한 HUVEC에서의 IL-33 자극된 NFkB 신호전달 중화의 시간경과를 나타낸다.
도 32 직접 경쟁 조건 하에 또는 IL-33과의 사전 인큐베이션 후 증가하는 농도의 H338L293과 함께 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성되는, FRET 신호의 억제를 나타낸다.
도 33 H338L293의 에피토프 맵핑을 나타낸다. 상부 패널은 트립신으로의 소화 이전 및 이후 H338L293을 이용한 IL33:IgG 복합체의 SEC 분석을 나타낸다. 하부 패널은 문헌[Lingel et al 2009]에 기재된 IL-33 구조 내에서 검은색으로 나타낸 H338L293에 강하게 결합하는 것으로 결정된 절단 펩타이드를 나타낸다.
도 34 IMDM 세포 배양 배지를 이용한 18시간 처리 이전 및 이후 야생형 IL-33(IL33-01) 및 IL-33 시스테인에서 세린으로의 돌연변이체의 NFkB 신호전달 활성을 나타낸다.
도 35 IL33-11이 시험관내 및 생체내 IL33-01(WT)에 비해 더 큰 역가를 가짐을 나타낸다.
도 36 각각 검은색 및 빨간색으로 도식화된 0.1 mM 15N-표지된 IL33-01 및 IL33-11에 대한 1H-15N HMQC 스펙트럼의 오버레이를 나타낸다. 관련 잔기에 대한 지정이 시사된다. 데이터는 예상된 바와 같이 C208 및 C259 근처의 피크 이동을 나타낸다. 그러나, 입체형태 변화를 시사할 수 있는 T185에서 A196으로의 예상보다 더욱 더 큰 피크 이동이 존재한다.
도 37 IL33-ST2 HTRF 결합 검정에서 33v20064 scFv의 IL-33 중화 활성의 시간경과를 나타낸다.
도 38 IL33-ST2 HTRF 결합 검정에서 33v20064 IgG의 IL-33 중화 활성의 시간경과를 나타낸다.
도 39 야생형 또는 돌연변이체 IL-33에 의해 자극된 HUVEC에서 IL-6 생성의 항체 중화를 나타낸다.
도 40 증가하는 농도의 평가 단백질로, DyLight 표지 33v20064로의 바이오틴화 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성되는 FRET 신호의 억제를 나타낸다. 신호 억제는 평가 단백질에 대한 33v20064의 상대 결합 친화도에 대응한다.
도 41 모체 33v20064 scFv 대비 생식계열 변이체 33_640001의 IL33-ST2 HTRF 결합 검정에서 IL-33 중화 활성의 시간경과를 나타낸다.
도 42 절단형(112~270) 또는 전장(1~270) IL-33에 의해 자극된 HUVEC에서 IL-8 생성의 항체 중화를 나타낸다.
도 43 redIL-33으로부터 DSB IL-33으로의 전환에 대한 IL-33 결합 단백질의 효과를 나타낸다.
도 44 증가하는 농도의 평가 단백질로, 33_640117 mAb로의 바이오틴화 인간 또는 게잡이원숭이 IL-33 결합에 의해 생성되는, 상이한 시점에서의 FRET 신호의 억제를 나타낸다. 신호 억제는 평가 단백질에 대한 33v20064의 상대 결합 친화도에 대응한다.
도 45 절단형(112~270) 또는 전장(1~270) IL-33에 의해 자극된 HUVEC에서 IL-8 생성의 항체 중화를 나타낸다.
도 46 H338L293이 야생형 BALB/c 마우스에서 알터나리아(ALT)-유도된 BAL IL-5 및 호산구증가증을 용량-의존적으로 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 ALT를 이용한 유발접종 전 -2시간에 비내 투여하였다(괄호 내에 나타낸 바와 같이 10, 30 또는 100 mg/kg). BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고, IL-5(도 46의 A) 및 호산구(도 46의 B)의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. 대조군 mAb 대비 *** p<0.001, ~~ p<0.01(n=4~8). 마우스 IL-33 Trap이 양성 대조군으로 이용되었다.
도 47 IL330004(30 mg/kg)가 아닌 H338L293(30 mg/kg) 및 마우스 IL-33 Trap(10 mg/kg)이 인간화 IL-33 마우스에서 ALT-유도 BAL IL-5를 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 ALT를 이용한 유발접종 전 -2시간에 비내 투여하였다. BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고 IL-5의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. *** p<0.001, ** p<0.01(n=4).
도 48 33_640050이 인간화 IL-33 마우스에서 알터나리아-유도 BAL IL-5를 용량 의존적으로 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 알터나리아를 이용한 유발접종 전 -24시간에 복강내 투여하였다(괄호 내에 나타낸 바와 같이 0.3, 3 또는 30 mg/kg). BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고 IL-5의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. *** p<0.001, ** p<0.01(n=4~5).
도 49의 A IL33-ST2 FRET 결합 검정에서 항체의 효과를 나타낸다.
도 49의 B Huvec으로부터의 IL-33 자극 IL-8 방출에 대한 항체의 효과를 나타낸다.
도 50 (A) IL33/33_640087-7B 또는 (B) 33_640237-2B에 기반한 FRET 검정을 이용하여 다양한 종 또는 다른 IL-1 패밀리 구성원으로부터의 IL-33에 대한 mAb 특이성을 나타낸다.
도 51 인간 폐 용해물에 의해 자극된 Huvec으로부터의 IL-8 방출에 대한 항체의 효과를 나타낸다.
도 52 33_640087-7B가 인간화 IL-33 마우스에서 알터나리아-유도 BAL IL-5를 용량 의존적으로 억제함을 나타낸다.
도 53의 A ST2에 독립적인 활성 IL-33에 대한 가능성을 조사하기 위핸 파일롯 생체내 연구의 실험 설계.
도 53의 B BALB/c 마우스에 대한 인간 IL-33의 반복 투여 후 BAL 유체 중 인간 IL-33 노출 분석.
도 53의 C 인간 IL-33(10 ug)의 단회 복강내 투여 후 혈장 중 IL-33 노출 분석.
도 53의 D BALB/c 마우스에 대한 인간 IL-33의 반복 투여 후 혈장 중 인간 IL-33 노출 분석.
도 54 6주 동안 비내 (A) PBS 또는 (B) IL-33이 투여된 마우스로부터의 폐 조직의 대표적 H&E 염색된 파라핀 섹션을 나타낸다.
도 55 환원 IL-33 또는 DSB IL-33에 반응하는 Huvec에서의 (A) p-p38 MAPK 또는 (B) p-STAT5 핵 전위 활성을 나타낸다.
도 55의 C 환원 IL-33 또는 DSB IL-33으로 15분 동안 자극된 Huvec에서의 p-p38 MAPK, p-JAK2 및 p-STAT5에 대한 웨스턴 블롯 분석.
도 56의 A ELISA에 의한 환원 또는 DSB IL-33에 대한 RAGE-Fc의 결합을 나타낸다.
도 56의 B RAGE-Fc 또는 항-RAGE mAb를 이용한 DSB IL-33에 대한 Huvec pSTAT5 반응의 억제를 나타낸다.
도 56의 C 항-RAGE mAb를 이용한 DSB IL-33에 대한 Huvec pSTAT5 반응의 억제를 나타낸다.
도 57 Huvec에서 pSTAT5 반응에 대한 항-IL-33 대 항-ST2의 효과를 나타낸다.
도 58 (A) 환원 IL-33 (B) DSB IL-33 대비 A549 세포 이동의 IL-33 유도된 억제에 대한 항-IL-33, 항-ST2 또는 항-RAGE mAb의 효과를 나타낸다.
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실시예 1 IL-33에 대한 항체의 단리
인간, 마우스 및 게잡이 원숭이로부터 성숙 IL-33의 클로닝, 발현 및 정제
IL-1RAcP 및 ST2에 대한 단백질 서열을 Swiss Prot에서 입수하였다. 항-IL-33 scFv 항체의 단리 및 동정 IL-33의 성숙 성분을 인코딩하는 cDNA 분자를 프라이머 연장 PCR에 의해 합성하고 pJexpress404(DNA 2.0) 내로 클로닝하였다. 인간 및 마우스 IL-33에 대한 데이터베이스 서열 정보에 대응하는 접근 번호를 표 2에 나타낸다. 이용 가능한 게잡이 원숭이 서열이 없었으므로, 게잡이 원숭이 및 붉은털 원숭이 간 높은 상동성에 기반하여, 붉은털원숭이의 서열(접근 번호 ENSMMUT00000030043)을 게잡이 원숭이에서 IL-33 유전자의 코딩 서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 설계하기 위해 이용하였다. 붉은털 원숭이 유전자 서열을 인간 IL-33 cDNA 서열(접근 번호 NM_033439)과 정렬하였고, 이는 붉은털 원숭이 서열이 잘못-조립되었으며 엑손 1이 소실되어 있음을 나타내었다. BLAST 검색을 인간 엑손 1을 이용하여 붉은털원숭이 게놈 서열에 대해 수행하였으며, 붉은털원숭이 서열 매칭 엑손 1을 확인하였다. 추가 프라이머를 설계하여 엑손 1을 증폭하였다.
단백질의 C-말단에 FLAG® 10xhis 에피토프 태그(DYKDDDDKAAHHHHHHHHHH; SEQ ID NO. 627)를 함유하도록 성숙 IL-33 코딩 서열을 변형하였다. 성숙 Flag®His-태그화 인간, 게잡이원숭이 및 마우스 IL-33에 대응하는 SEQ ID NO를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00024
벡터를 BL21(DE3) 적격 세포(Merck Biosciences, 69450) 내로 형질전환하고 1 mM IPTG로 발현을 유도하였다. 수확 세포를 Bugbuster(Merck Biosciences, 70584)로 용해시키고 발현 단백질을 Ni-NTA 친화도 크로마토그래피(Histrap HP 컬럼: GE Healthcare, 17-5248-02)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 75 컬럼: GE Healthcare, 17-1068-01)을 이용해서 정제하였다.
단백질 변형
본원에서 이용되는 IgG 및 변형된 수용체 단백질을 EZ 링크 설포-NHS-LC-바이오틴(Thermo/Pierce, 21335)을 이용해서 자유 아민을 통해 바이오틴화하였다. 바이오틴 시약을 무수 디메틸포름아마이드 중에 용해시키고, PBS 기반 단백질 용액을 D-PBS(Dulbecco의 포스페이트 완충 식염수) 중 1 M NaHCO3로 pH 약 8로 조정하였다. 본원에서 이용되는 IL-33 단백질을 EZ 링크 바이오틴-BMCC(Perbio/Pierce, product no. 21900)를 이용해서 자유 시스테인을 통해 바이오틴화하였다. 바이오틴 시약을 무수 디메틸포름아마이드 중에 용해시키고 PBS 단백질 용액을 혼합하였다. 모든 경우에 표지 혼입을 MALDI-TOF 질량 분광측정에 의해 평가하고, 미반응 시약을 PBS 평형화 일회용 Sephadex G25 컬럼을 이용한 완충액 교환에 의해 제거하였다. 바이오틴화를 위해, 최종 단백질 농도를 아미노산 서열로부터 계산된 소멸 계수를 이용해서 280 nm 흡광도에 의해 결정하였다.
선택
성체 나이브(naive) 공여체로부터의 인간 B-세포로부터 단리되고 필라멘트성 파지 M13에 기반한 파지미드 벡터 내로 클로닝된 가변(V) 유전자에 기반한 대규모 단일쇄 Fv(scFv) 인간 항체 라이브러리를 선택을 위해 이용하였다(Hutchings , C., "Generation of Naive Human Antibody Libraries" in Antibody Engineering, Dubel. Berlin, Springer Laboratory Manuals : p. 93 (2001); Lloyd et al., Protein Eng . Des. Sel . 22(3):159-68 (2009)). IL-33-특이적 scFv 항체를 본질적으로 문헌[Vaughan et al. (Nat. Biotechnol . 14(3):309-14 (1996))]에 기재된 바와 같이, 재조합 인간 및/또는 마우스 IL-33 상에서의 일련의 반복된 선택 사이클로 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하였다. 본원에서 이용되는 IL-33 시약의 목록을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00025
간략하게, scFv-파지 입자를 용액 중 바이오틴화 재조합 IL-33과 인큐베이션하였다(EZ 링크 바이오틴-BMCC(Perbio/Pierce, 제품 번호 21900)를 이용하여 자유 시스테인을 통해 바이오틴화). 입자를 2시간 동안 100 nM 바이오틴화 재조합 IL-33과 인큐베이션하였다. 이어서 항원에 결합된 ScFv를 제조업체의 권장사항에 따라 스트렙타비딘-코팅 상자성 비드(Dynabeads®, M-280) 상에 포획하였다. 미결합 파지를 PBS-Tween을 이용하여 일련의 세척 사이클로 세척 제거하였다. 항원 상에 보유된 파지 입자를 용출하고, 박테리아 내로 감염시키고, 다음 회 선택을 위해 구제하였다. 전형적으로 2 또는 3회 선택을 상기 방식으로 수행하였다.
파지 ELISA에 의한 IL-33 특이적 결합인자의 확인
상술된 2 또는 3회 선택 후 선택 산출물로부터 대표적 수의 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 단일쇄 Fv 단편을 파지 입자 상에 디스플레이시키고 결합 검정에서 평가하여 재조합 인간, 마우스 및 게잡이원숭이 IL-33 항원 패널에 대한 교차-반응성 및 특이성을 결정하였다. 파지-디스플레이된 scFv 상청액 샘플을 다음과 같이 96-웰 깊은형 웰 플레이트에서 생성하였다. 96-웰 마스터 플레이트의 각 웰로부터의 5 ㎕ 배양을 500 ㎕의 2TYAG(2TY + 100 ㎍/ml 앰피실린 + 2% 글루코스) 배지를 함유하는 Greiner 깊은형 웰 배양 플레이트 내로 옮기고 37℃, 280 rpm에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 K07 M13 헬퍼 파지(2TYAG 중 1.5 x 1011 pfu/ml로 희석)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 플레이트를 37℃, 150 rpm에서 인큐베이션하여 감염을 허용하였다. 플레이트를 10분 동안 3200 rpm에서 침강시키고 상청액을 제거하였다. 박테리아 펠렛을 500 ㎕/웰 2TYAK(2TY + 100 ㎍/ml 앰피실린 + 50 ㎍/ml 카나마이신) 중에 재현탁하고 플레이트를 25℃, 280 rpm에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 오전에, 500 ㎕의 2xPBS 중 6%(w/v) 탈지유 분말을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 10분 동안 3200 rpm에서 원심분리하고 차단된 파지-디스플레이 scFv 상청액을 ELISA 실험에서 직접 이용하였다.
EC50 결정을 위해, 전형적으로 정제된 IgG를 PBS 중 3%(w/v) 건조-우유 분말(PBS-M)에서 3배 희석하여 11개의 농도 지점을 얻었다. 96-웰 Greiner 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201)를 희석 제조를 위해 이용하였다. 일반적으로, 각각의 희석은 2개씩 제조하였다. IgG 희석이 실온에서 1시간 동안 PBS-M 중에 차단되도록 둔 후, ELISA 실험에서 직접 이용하였다.
IL-33 결합 검정은 본질적으로 다음과 같이 수행된 플레이트-기반 ELISA였다. 상기 표 3은 이들 실험을 위해 이용된 항원을 나타낸다. 모든 항원을 모든 실험에서 이용한 것은 아니지만, 모든 경우에 인간, 마우스 및 게잡이원숭이 IL-33 항원을 평가하였다. 관련 대조군 항원(적절한 경우, 소 인슐린 + IL-4Rα FLAG®His)을 또한 비-특이적 결합에 대해 평가하기 위해 이용하였다. 소 인슐린을 제외하고, 모든 항원을 바이오틴화하고(상기 하위섹션 1.1. 참고) 모두를 박테리아 발현을 이용하여 생성하였다. 대조군 항원으로 이용한 IL-4Rα FLAG®His의 생성 방법은 WO/2010/070346에 기재되어 있다.
스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific, AB-1226)를 PBS 중 0.5 ㎍/ml의 바이오틴화 항원으로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를3xPBS로 세척하고 1시간 동안 300 ㎕/웰 차단 완충액(PBS-M)으로 차단하였다. 플레이트를 1xPBS로 세척하고 차단된 샘플을 실온에서 1시간 동안 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 3xPBS-T(PBS + 1%(v/v) Tween-20)로 세척하고 1:5000 희석으로 검출 시약[각각 IgG 또는 파지-디스플레이 scFv의 검출을 위한 항-인간 IgG HRP(Sigma, A0170) 또는 항-M13-HRP 항체(Amersham, 27-9421-01)]을 실온에서 1시간 동안 PBS-M 중50 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 3xPBS-T로 세척하고, TMB, 50 ㎕/웰(Sigma, T0440)로 발색시켰다. 반응을 50 ㎕/웰 0.1 M H2SO4로 켄칭한 뒤 450 nm에서 EnVision™ 플레이트 판독장치, 또는 유사한 설비 상에서 판독하였다.
Prism(Graphpad) 곡선-피팅 소프트웨어를 이용해서 IgG 적정을 위해 용량 반응 곡선을 도식화하였다. 파지-디스플레이 scFv는 흡광도 450 nm가 0.5 초과이고 대조군(인슐린 및 IL-4Rα Flag®His) 상의 동일한 샘플에 대해서는 0.2 미만인 경우, IL-33 항원에 결합하는 것으로 간주하였다.
인간 및 마우스로부터의 ST2 ECD의 클로닝, 발현 및 정제
인간 및 마우스로부터의 ST2의 세포외 도메인(ECD)을 인코딩하는 cDNA 분자를 프라이머 연장 PCR 클로닝에 의해 합성하고 pDONR221(Invitrogen, 12536-017) 내로 클로닝하였다. 인간 및 마우스 ST2에 대한 데이터베이스 서열을 이용하였다(표 4 참고). pDONR221 내 ST2 ECD cDNA 클론을 제조업체의 지침에 따라 LR Gateway Clonase II 효소를 이용해서 포유류 발현 벡터 pDEST12.2로 옮겼다. pDEST12.2 벡터를 인간 IgG1 Fc 코딩 영역, 삽입된 관심 유전자와 인-프레임인 폴리히스티딘(His6) 태그를 함유하도록 변형하였고, 또한 pCEP4 벡터로부터의 oriP 복제 기원의 삽입에 의해 EBNA-1 유전자 산물을 발현하는 세포주(예컨대 HEK293-EBNA 세포) 내로의 형질감염 시 에피좀 플라스미드 복제를 허용하였다.
[표 4]
Figure pct00026
HEK293-EBNA 상청액 중 발현 ST2.Fc 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피(HiTrap 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, 17-0402-01))에 이어 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 컬럼(GE Healthcare, 17-1069-01))를 이용해서 정제하였다.
미정제 scFv에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
상술된 2 또는 3회 선택 후 선택 산출물로부터 대표적 수의 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 박테리아 원형질막 주위공간에서 발현시켰고(Kipriyanov, et al. J Immunol Methods 200(1-2): 69-77 (1997)) 균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:ST2-결합 검정에서 이의 억제 활성에 대해 스크리닝하였다. 본 검정에서, 샘플은 FLAG®His-태그화 인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33으로의 결합에 대해 인간 또는 마우스 ST2.Fc와 경쟁하였다.
HTRF® 검정은 가까이 인접해 있는 공여체 및 수신체 형광단 간 형광 공명 에너지 전달을 이용하는 균일한 검정 기술이다(Mathis, et al. Clin Chem 41(9):1391-7 (1995)). 본 검정을 관심 분자 중 하나를 공여체 형광단, 유로퓸(Eu3+) 크립테이트에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링하고, 다른 관심 분자를 수신체 형광단 XL665(안정 가교 알로피코시아닌)에 커플링함으로써 거대분자 상호작용을 측정하기 위해 이용하였다. 크립테이트 분자의 여기(337 nm에서)는 620 nm에서 형광 방출을 일으켰다. 상기 방출로부터의 에너지는 크립테이트에 가까이 인접한 XL665로 전달되어 XL665로부터 특이적인 장기-지속 형광의 방출(665 nm에서)을 일으켰다. 공여체(620 nm) 및 수신체(665 nm) 모두의 특이적 신호를 측정하여, 검정에서 유색 화합물의 존재를 보상하는 665/620 nm 비의 계산을 허용하였다.
10㎕의 각각의 항체 평가 샘플의 희석물을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3676)에 첨가함으로써 미정제 항-IL-33 scFv 샘플을 FLAG®-His 태그화 IL-33 결합 ST2-Fc의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 2 nM 인간 또는 마우스 ST2-Fc 및 3 nM 항-인간 Fc 크립테이트 검출 함유 용액(Cisbio International, 61HFCKLB)을 제조하고 5㎕의 혼합물을 검정 플레이트에 첨가하였다. 여기에 20 nM 항-FLAG® XL665 검출(Cisbio International, 61FG2XLB)과 조합된 1.2 nM FLAG®-His 태그화 인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33 함유 5㎕ 용액의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(BDH 103444T) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma A9576)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 1시간에 이어 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 후 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.
각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%를 계산하여 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다:
Figure pct00027
이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다:
Figure pct00028
음성 대조군(비-특이적 결합)은 평가 샘플을 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma A9576)을 함유하는 Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185)로 이루어진 희석 완충액 중 제조된 150 nM 비-태그화 인간 또는 마우스 IL-33(Axxora, 인간 ALX522-098, 마우스 ALX-522-101)으로 대체하여 정의되었다.
이후 델타 F값%를 이용하여 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다:
Figure pct00029
4-파라미터 로지스틱 공식(식 4)을 이용한 곡선 피팅에 의해 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해서 IC50값을 결정하였다.
식 4:
Y=하부 + (상부-하부)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))
X는 농도의 로그이다.
Y는 특이적 결합이다.
Y는 하부에서 시작하여 S자 형태로 상부로 진행한다.
도 1은 단일 지점 스크리닝에서 미정제 scFv 원형질막 주위공간 추출물에 의해 인간 ST2로의 인간 IL-33 결합에 의해 생성되는, FRET 신호의 억제를 나타낸다. 원형질막 주위공간 추출물의 최종 농도는 50% v/v였다. 웰 B04(미정제 IL330004 scFv)는 '히트'의 예를 나타내며, 나타낸 바와 같이 컬럼 12는 대조군 웰을 포함한다.
정제 scFv에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
미정제 원형질막 주위공간 추출물로서 IL-33:ST2 상호작용에 대한 억제 효과를 나타내거나 상기 파지 결합 실험에 의해 원하는 종 교차-특이성 및 특이성 프로필을 나타낸 단일쇄 Fv 클론으로 DNA 서열분석을 거쳤다(Osbourn, et al. Immunotechnology 2(3):181-96 (1996); Vaughan, et al. Nat Biotechnol 14(3):309-14 (1996)). 고유한 scFv를 다시 박테리아에서 발현시키고 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다(WO01/66754에 기재된 바와 같음). 인간 또는 마우스 ST2.Fc에 대한 연속 시리즈의 정제 조제물을 상술된 바와 같이 FLAG®His-태그화 인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33으로의 결합에 대해 경쟁시킴으로써 이들 샘플의 역가를 결정하였다. 음성 대조군에 비해 더 큰 정도로 IL-33:ST2 상호작용을 억제할 수 있는 정제 scFv 조제물을 IgG 포맷으로의 전환을 위해 선택하였다(예로, scFv 항체 IL330002, IL330004, IL330020 및 IL330071
도 2의 A: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 IL330002, IL330004, IL330020 및 IL330071로 인간 ST2로의 인간 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 2의 B: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 IL330002, IL330004, IL330020 및 IL330071로 인간 ST2로의 게잡이 원숭이 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
IL330004에 대한 파트너 항체의 확인
파지 ELISA에 의해 인간 IL-33으로 양성 결합을 나타낸 클론의 scFv 원형질막 주위공간 추출물을 Octet 검정(Octet RED 384 시스템)에 의해 스크리닝하여 IL330004와 동시에 IL-33에 결합한 항체를 확인하였다. 미희석 페리프렙(periprep) 샘플을 Nickel NTA 바이오센서 상에 포획하고 IL-33(200 nM)에 이어 IL330004(200 nM)의 순차적 결합을 수행하였다. 바이오센서를 재생시켜 이용을 최소화하였다. 센서를 글리신(10 mM, pH 1.7) 중에 재생하고, 완충액(PBS + 1 mg/ml(0.1%) BSA + 0.02% Tween20) 중에 중화하고, NiSO4(10 mM)와 함께 재로딩하여 바이오센서 표면 상에 니켈을 보충하였다. IL330425 및 IL330428을 확인하였고 완전 면역글로불린 G1(IgG1) 항체 포맷으로 전환시켰다.
scFv의 IgG1로의 재포맷설정
IL-33:ST2 결합 검정으로부터 원하는 특성을 갖는 단일쇄 Fv 클론 + 결합 실험에 의해 원하는 특이성을 갖는 파지-디스플레이 scFv 패널을 하기 변형을 포함하여, 본질적으로 문헌[Persic et al. Gene 187(1):9-18 (1997)]에 의해 기재된 바와 같은 완전 면역글로불린 G1(IgG1) 항체 포맷으로 전환시켰다. CHO-일시적 세포의 이용을 촉진하고 에피좀 복제를 허용하기 위해 OriP 단편을 발현 벡터 내에 포함시켰다. 가변 중쇄(VH) 도메인을 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 벡터(pEU1.3) 내로 클로닝하여 전체 IgG1 중쇄를 포유류 세포에서 발현시켰다. 유사하게, 인간 경쇄(람다) 불변 도메인 및 조절 요소의 발현을 위해 가변 경쇄(VL) 도메인을 벡터(pEU4.4) 내로 클로닝하여 전체 IgG 경쇄를 포유류 세포에서 발현시켰다. IgG를 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 CHO-일시적 포유류 세포 내로 형질감염시켰다(Daramola et al. Biotechnol Prog 30(1):132-41 (2014)). IgG를 발현시키고 배지 내로 분비하였다. 수확물을 정제 전에 여과한 뒤, IgG를 단백질 A 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 배양 상청액을 적절한 크기의 세라믹 단백질 A 컬럼(BioSepra) 상에 로딩하고 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM NaCl로 세척하였다. 결합 IgG를 0.1 M 나트륨 시트레이트(pH 3.0)를 이용해서 컬럼에서 용출시키고 Tris-HCl(pH 9.0)의 첨가에 의해 중화하였다. 용출 물질을 Nap10 컬럼(Amersham, #17-0854-02)을 이용해서 PBS 내로 완충액 교환하고, IgG의 농도를 IgG의 아미노산 서열에 기반한 소멸 계수를 이용해서 분광측정학적으로 결정하였다(Mach et al., Anal. Biochem . 200(1):74-80 (1992)). 정제 IgG를 SEC-HPLC를 이용해서 그리고 SDS-PAGE에 의해 응집 및 분해 순도에 대해 분석하였다. 항체 IL330002, IL330004, IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126의 다양한 영역에 대응하는 SEQ ID NO를 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00030
정제 IgG에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
항-IL-33 항체가 ST2 수용체에 대한 FLAG®-His 태그화 IL-33의 결합을 억제하는 능력을 그 원리가 상술된 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다.
바이오틴화 인간 또는 마우스 ST2.Fc에 대한 희석 시리즈의 정제 IgG를 FLAG®His-태그화 인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33으로의 결합에 대해 경쟁시킴으로써 정제 IgG 조제물의 활성을 결정하였다.
10㎕의 각각의 항체 평가 샘플의 희석물을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3676)에 첨가함으로써 정제 또는 미정제 항-IL-33 항체 샘플을 FLAG®-His 태그화 IL-33 결합 ST2-Fc의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 4 nM 바이오틴화 인간 또는 마우스 ST2-Fc 및 20 nM 스트렙타비딘 XL665 검출 함유 용액(Cisbio International, 611SAXLB)을 제조하고 5㎕의 혼합물을 검정 플레이트에 첨가하였다. 여기에 1.72 nM 항-FLAG® 크립테이트 검출(Cisbio International, 61FG2KLB)과 조합된 1.2 nM FLAG®-His 태그화 인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33 함유 5㎕ 용액의 첨가가 뒤따랐다. 0.8 M 칼륨 플루오라이드(BDH 103444T) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma A9576)을 함유하는 Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185)로 이루어진 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 2시간에 이어 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 후 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시간차 형광을 판독하였다.
데이터를 식 1 내지 3을 이용해서 상술된 바와 같이 분석하였다.
음성 대조군(비-특이적 결합)은 평가 샘플을 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma A9576) 함유 Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185)로 이루어진 희석 용액 중에 제조된 100 nM 비-바이오틴화 ST2로 대체함으로써 정의되었다.
정제 IgG 항체 IL330002, IL330004, IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126에 대한 대표 역가(IC50)를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00031
모든 정제 IgG 조제물(즉, IL330002, IL330004, IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126)은 인간 IL-33:인간 ST2 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다. 도 3의 A: 증가하는 농도의 IL-33 IgG1 항체 IL330002, IL330004, IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126으로 인간 ST2로의 인간 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
IL330002, IL330004 및 IL330071 IgG 조제물은 또한 게잡이원숭이 IL-33:인간 ST2 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다. 도 3의 B: 증가하는 농도의 IL-33 IgG1 항체 IL330002, IL330004, IL330020 및 IL330071, IL330125 및 IL330126으로 인간 ST2에 대한 게잡이 원숭이 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다. 마우스 IL-33 FLAG®-His + 마우스 ST2-Fc 경쟁 검정에서 어떠한 상기 평가된 항체에 의해서도 억제가 검출되지 않았다.
IgG에 의한 Hela-ST2 리포터 세포에서 NFκB 신호전달의 억제
ST2 및 NFκB 반응성 루시퍼라제 리포터 구축물로 공동-형질감염 Hela 세포를 이용해서, 항-IL-33 항체 IL330002, IL330004, IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126에 의한 IL-33 유도 NFκB 신호전달의 억제를 평가하기 위해 리포터 검정을 이용하였다. 세포를 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 IL-33에 노출시키고, 이후 생성되는 루시퍼라제의 활성을 측정함으로써 NFκB 신호전달을 검출하였다. 루시퍼라제 리포터 구축물을 함유하는 Hela 세포는 Panomics에서 입수하였다. 인간 ST2 서열을 System Biosciences로부터의 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 렌티바이러스 입자를 Ad293 세포(Stratagene)에서 생성하고, Hela-루시퍼라제 리포터 세포를 형질도입하기 위해 이용하였다.
리포터 검정에서, IL-33을 이용한 ST2 수용체의 자극은 NFκB 신호전달 경로의 활성화를 일으켰으며, NFκB 프로모터를 통해 효소 루시퍼라제의 발현을 개시하였다. 세포의 용해 이후, 루시퍼라제 기질을 첨가하였고, 이는 루시퍼라제의 존재 하에 화학적 반응을 거쳐서 발광 산물을 생성하였다. 세포 용해물로부터 검출된 광량을 Envision 플레이트 판독장치(PerkinElmer)를 이용해서 정량하고, IL-33 매개 NFκB 신호전달의 직접적 척도로 이용하였다.
Hela 형질감염 세포를 하이그로마이신 B 함유 배지 중에 유지하여 안정한 수용체 발현을 유지하였다. 세포를 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 IL-33에 노출시키고, 이후 생성되는 루시퍼라제의 활성을 측정함으로써 NFκB 신호전달을 검출하였다.
형질감염 Hela 세포를 384웰 검은색-벽, 폴리-D-라이신 코팅 플레이트(Greiner, 781946) 내로 10% v/v 우태 혈청(열 불활성화) 및 100 마이크로그램/mL 하이그로마이신 B(Invitrogen 10687-010)를 함유하는 DMEM 배양 배지(Invitrogen, 41966) 중 1x104 세포/웰(50 ㎕/웰)로 접종하였다. 플레이트를 18~24시간 동안 섭씨 37도, 5% CO2에서 인큐베이션한 뒤, 세포 배지를 웰로부터 온화하게 흡인하고 이어서 평가 샘플을 첨가하였다.
10% v/v FBS(열 불활성화) 및 100마이크로그램/mL 하이그로마이신 B(Invitrogen, 10687-010)를 함유하는 DMEM 배양 배지(Invitrogen 41966) 중 희석에 의해 연속 희석 샘플을 제조하였다. 15 ㎕의 평가 샘플을 2개씩 세포에 첨가하였다. IL-33 FLAG®-His을 10% v/v FBS(열 불활성화) 및 100마이크로그램/mL 하이그로마이신 B(Invitrogen, 10687-010)를 함유하는 DMEM 배양 배지(Invitrogen 41966) 중 0.6 nM까지 희석하고, 15 ㎕를 세포 및 평가 샘플에 첨가하였다. 상기 농도는 IL-33 FLAG®-His(기하평균 0.32 nM, 95% 신뢰도 간격 0.25~0.40 nM, n=5)에 대한 리포터 세포 반응의 EC50값을 나타내었다. 10% v/v FBS(열 불활성화) 및 100마이크로그램/mL 하이그로마이신 B(Invitrogen, 10687-010)를 함유하는 30 ㎕ DMEM 배양 배지(Invitrogen 41966)의 첨가에 의해 배경 반응을 정의하였다. 플레이트를 4시간 동안 섭씨 37도, 5% CO2에서, 그리고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
NFκB 신호전달에 반응한 루시퍼라제의 생성을 측정하기 위해, 루시퍼라제 기질(Promega, E2620)과 조합된 30 ㎕의 Bright Glo® 용해 완충액을 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제에 의한 기질 산화 결과로 생성되는 발광을 EnVision 플레이트 판독장치(PerkinElmer)를 이용해서 판독한다.
이후 상대 광 단위(RLU)값을 이용하여 식 5에 기재된 바와 같이 특이적 반응%를 계산하였다:
Figure pct00032
4-파라미터 로지스틱 공식(식 4)을 이용한 곡선 피팅에 의해 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해서 IC50값을 결정하였다:
항체 IL330002, IL330004, IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126의 정제 IgG 조제물은 NFκB-유도 루시퍼라제 활성을 억제하는 것으로 나타났으며, 대표적 역가(IC50)를 표 7에 나타낸다.
[표 7]
Figure pct00033
도 4의 A는 음성 대조군 IgG 대비 IL-33 항체 IL330002, IL330004 IL330020, IL330071, IL330125 및 IL330126에 의한 루시퍼라제 NFκB 리포터 검정에서 NFκB 활성의 억제를 나타낸다.
IgG에 의한 Huvec에서의 NFκB 신호전달의 억제
IL-33에 반응하여 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Huvec)에서의 NFκB 신호전달을 면역형광 염색에 의해 검출되는 p65/RelA NFkB 서브유닛의 핵 전위에 의해 평가하였다. 핵 염색 세기의 조영 및 정량을 ArrayScan VTi HCS 판독장치(Cellomics) 상에서 수행하였다.
Huvec을 Cambrex에서 입수하고 권장 프로토콜에 따라 완전 EBM-2 배지(Lonza)에서 유지하였다. Huvec을 아큐타제(accutase, PAA, #L11-007)로 플라스크로부터 수확하고 96-웰 검은색 벽의 투명 평탄-바닥 콜라겐 I 코팅 플레이트(Greiner) 내로 배양 배지[EGM-2 SingleQuot 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, #CC-4176) 함유 EBM-2(Lonza, #CC-3156)] 중에 1x104/100 ㎕/웰로 접종하고 18~24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 상기 시점 후, 배지를 흡인하여 세포 단층을 온전히 놔두고, 아래에 제조된 바와 같이 검정 평가 샘플로 대체하였다.
정제 IgG의 평가 샘플(2개씩)을 96웰 U-형 바닥 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201) 내의 완전 배양 배지 중에서 원하는 농도까지 희석하였다. IL-33(Adipogen)을 적절한 평가 항체와 혼합된 완전 배양 배지 중에 제조하여 총 부피 120 ㎕/웰로 1 ng/mL의 최종 IL-33 농도를 얻었다. 모든 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 뒤 검정 플레이트로 100 ㎕의 IL-33/항체 혼합물을 옮겼다. 37℃에서 30분 인큐베이션 후, 배지를 흡인하여 세포 단층을 온전히 놔두고 세포를 37℃까지 사전-가온된 3.7% 포름알데하이드 용액으로 15분 동안 고정하였다. 고정제를 흡인하고 세포를 100 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하였다.
세포를 제조업체의 지침에 따라 Cellomics NFκB 검정 키트(Thermo Scientific, #8400492)를 이용해서 NFκB에 대해 염색하였다. 간략하게, 세포를 실온에서 15분 동안 투과화하고, 15분 동안 차단하고, 50 ㎕ 부피의 일차 항체 용액으로 1시간 동안 염색하였다. 플레이트를 차단 완충액 중에 2회 세척하고, Hoechst 핵 염색뿐만 아니라 이차 항체를 포함하는 이차 항체 용액과 함께 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 플레이트를 PBS 중에 2회 세척하였다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS의 최종 부피 중에 보관하고, 검은색 차광 밀봉(Perkin Elmer, #6005189)으로 덮은 뒤 ArrayScan VTi HCS 판독장치 상에서 판독하였다. 핵 염색 세기를 적합한 알고리즘을 이용해서 계산하였다. 데이터를 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 4-파라미터 로지스틱 공식(식 4)을 이용한 곡선 피팅에 의해 IC50값을 결정하였다.
도 4의 B는 항-NIP IgG1 음성 대조군 항체, NIP228 대비 IL-33 항체 IL330004에 의한 Huvec NFκB 전위 검정에서의 NFκB 활성 억제를 나타낸다. p65/RelA NFκB의 핵 전위는 항체 IL330004에 의해 억제되었다. 정제 IgG로 평가된 경우, 항체 IL330004에 대한 IC50은 12 nM인 것으로 계산되었다.
BIAcore를 이용한 IL-33 항체에 대한 결합 친화도 계산
인간 및 게잡이원숭이 IL-33에 대한 예시적 결합 구성원의 정제 IgG 샘플의 결합 친화도를 본질적으로 문헌[Karlsson et al., J Immunol Methods 145(1-2):229-40 (1991)]에 기재된 바와 같이 BIAcore 2000 바이오센서(BIAcore AB)를 이용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. 간략하게, 단백질 G'(Sigma Aldrich, P4689)을 제조업체의 지침(BIAcore)에 따라 표준 아민 커플링 시약을 이용해서 CM5 센서 칩 표면으로 공유 커플링하였다. 단백질 G'표면을 Fc 도메인을 통해 정제 항-IL-33 항체를 포획하기 위해 이용하여 사이클 당 약 290 RU의 표면 밀도를 제공하였다. 600 nM 내지 18.75 nM의 농도 범위에서, HBS-EP 완충액(BIAcore AB) 중 제조된 인간 또는 게잡이원숭이 IL-33을 센서 칩 표면에 걸쳐 통과시켰다. 항체의 각각의 주입 간에 pH 1.7 및 pH 1.5의 2회의 10 mM 글리신 세척을 이용해서 표면을 재생시켰다. BIA evaluation 3.1 소프트웨어를 이용해서 생성 센소그램을 평가하고 1:1 Langmuir 결합 모델로 피팅시켜, 상대 결합 데이터를 제공하였다. 인간 또는 게잡이원숭이 IL-33으로의 항체 IL330002 및 IL330004 결합에 대한 결합 결과(KD, Ka 및 Kd)를 표 8에 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00034
세포내 IL-33에 대한 IL-33 항체의 결합
상술된 선택 및 활성 연구는 재조합 또는 상업적 원천의 성숙 IL-33(아미노산 112~270)을 이용하였다. 연구들은 전장 IL-33이 또한 활성일 수 있음을 제시한다(Cayrol et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106(22):9021-6 (2009); Hayakawa et al., Biochem Biophys Res Commun 387(1):218-22 (2009); Talabot-Ayer et al., J Biol Chem. 284(29):19420-6 (2009)). 전장("원상태") IL-33에 대한 항체의 결합을 일차 기관지 평활근 세포(BSMC)의 면역형광 염색에 의해 결정하였다.
BSMC를 Cambrex로부터 입수하고 제조업체의 지침에 따라 완전 평활근 성장 배지(SmBM®, Lonza) 중에 유지하였다. 세포를 아큐타제(PAA, #L11-007)로 플라스크로부터 수확하고 96-웰 검은색 벽의 투명 평탄-바닥 콜라겐 I 코팅 플레이트(Greiner) 내로 배양 배지[SMGM SingleQuot 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, #CC-4149) 함유 SMBM(Lonza, #CC-3181)] 중에 2x104/100 ㎕/웰로 접종하고 18~24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 상기 시점 이후, 배지를 흡인하여 세포 단층을 온전히 놔두고 세포를 37℃까지 사전-가온된 3.7% 포름알데하이드 용액으로 15분 동안 고정하였다. 고정제를 흡인하고 세포를 100 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 투과화 완충액(Thermo Scientific, #8400492)을 이용해서 실온에서 15분 동안 투과화하고, PBS 중에 2회 세척하고, 실온에서 30~60분 동안 100 ㎕/웰의 PBS/1% BSA(Sigma, #A9576)로 차단하였다. 차단 완충액을 튕겨내고, 실온에서 1시간 동안 차단 완충액 중에 희석된 적정 항-IL-33 또는 적합한 이소형 대조군 항체로 대체하였다.
플레이트를 PBS 중에 2회 세척하고 1:10000으로 희석된 Hoechst 염료(10 mg/mL; Thermo Scientific)뿐만 아니라 1:1000으로 희석된 이차 항체(항-인간 IgG(H+L), Alexa Fluor® 488 콘주게이트 2 mg/mL; Invitrogen, #A11013)를 포함하는 이차 항체 용액으로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 플레이트를 PBS 중에 3회 세척하였다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS의 최종 부피 중에 보관하고, 검은색 차광 밀봉(Perkin Elmer, #6005189)으로 덮은 뒤 ArrayScan VTi HCS 판독장치 상에서 조영하였다.
배양 BSMC에 의한 IL-33 발현을 상업적 폴리클로날 항체(R&D Systems, #AF3625)로 확인하고, 항-염소 IgG(H+L), Alexa Fluor® 488 콘주게이트 2 mg/mL; Invitrogen, #A11055)로 검출하였다. 도 5는 CAT-002 음성 대조군(왼쪽 패널) 대비 IL-33 항체 IL330004(오른쪽 패널)에 의한 면역형광 염색에 의해 기관지 평할근 세포에서 내인성 IL-33의 검출을 나타낸다. 항체 IL330004는 전장 IL-33의 예상된 편재에 대응하며 상업적 pAb로 검출되는 BSMC의 뚜렷한 핵 염색을 나타내었다.
실시예 2 항-IL-33 scFv 항체의 단리 및 확인
파지 ELISA에 의한 IL-33 특이적 결합인자의 확인
시약 및 선택은 실시예 1에 기재된 바와 같았다. 단일쇄 Fv 단편을 파지 입자 상에서 디스플레이하고, 단일 지점 ELISA 스크리닝에서 미정제 조제물로 평가하였다. 파지-디스플레이 scFv는 흡광도 450 nm가 0.5 초과이고 대조군(인슐린 및 IL-4Rα Flag®His) 상에서 동일한 샘플에 대해 0.1~0.2 미만인 경우, IL-33 항원에 결합하는 것으로 간주하였다.
도 6은 인간 IL-33, 게잡이원숭이 IL-33 및 인슐린에 대해 스크리닝된 단일 플레이트로부터의 데이터를 나타낸다. 하나의 특이적인 인간/게잡이원숭이 교차-반응성 IL-33 결합인자가 웰 C4에 나타나며, 웰 A12 및 B12는 대조군 IL-33 결합 클론을 함유한다.
Axxora IL33305B 경쟁에 의한 IL-33 결합인자의 확인
Axxora IL33305B 경쟁 검정은 형광 마이크로부피 검정 기술(FMAT)을 이용하는 균일한 검정이다. 검정은 384-웰 포맷으로 조정제 scFv 상청액 샘플 또는 정제 scFv 및 IgG의 존재 하에 재조합 바이오틴화 인간 IL-33 Flag®His에 대한 Axxora IL33305B mAb(Axxora/Adipogen, #AG-20A-0041-C050) 결합의 억제를 평가하였다.
ScFv를 박테리아 원형질막 주위공간에서 발현시키고 공지된 생물학적 활성 IL33305B mAb에 대한 FMAT 에피토프 경쟁 검정에서 이의 억제 활성에 대해 스크리닝하였다. 바이오틴화 IL-33을 스트렙타비딘 코팅 비드(Spherotec, #SVP-60-5) 상에 고정화하고 Axxora IL33305B Ab와의 상호작용을 염소 항-마우스 Alexafluor®-647 표지 항체(Molecular Probes A21236)를 이용해서 검출하였다. FMAT 시스템은 비드와 연관된 빨간색 형광을 측정하는 거시-공초점-조영장치(microconfocalimager)이다.
플레이트를 Applied Biosystems Cellular Detection 시스템 8200 판독장치 상에서 판독하였다. 헬륨 네온 여기 레이저는 1 mm2 면적을 스캐닝하는 웰 하부의 100 ㎛ 깊이 내를 포커싱한다. 비드는 웰 하부에 침강되며, 633 nm에서의 레이저 여기 시 형광단이 결합된 이들 비드(형광단의 국소 농도가 미결합 형광단에 비해 상대적으로 높음)는 PMT1을 이용해서 측정되는 650~685 nm에서 신호를 방출한다. 용액 중 미결합 형광단은 여기 깊이 외부에 있거나 상대적으로 낮은 국소 농도여서, 유의미한 신호를 방출하지 않는다. 따라서 IL-33에 대한 IL33305B 결합을 효과적으로 차단하는 ScFv 또는 IgG 샘플은 웰 하부에서 비드:IL-33:IL33305B:항-마우스 Alexafluor®-647 표지 항체 복합체의 양 감소를 유도하여, 측정 형광에서 감소를 일으킨다.
검정 설정을 위해, 다음을 제조하였다:
(1) IL33305B 및 항-마우스 AF647 혼합물, IL33305B를 검정 완충액[0.1% BSA(Sigma, #A9576) 및 0.1% Tween-20(Sigma, P2287) 함유 PBS(Gibco, 14190-094)] 중에 2.25 nM까지 희석하고, 검정 완충액 중에 2 ㎍/ml(최종 400 ng/ml)까지 희석된 항-마우스 AF647과 혼합하였다.
(2) IL-33 및 비드 혼합물, 2.5 nM 바이오틴화 인간 IL-33 FLAG®His를 검정 완충액 중 0.0095% w/v 스트렙타비딘 비드로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 회전시키며 인큐베이션하였다 - 사용 전에, 이들 입자를 15분 동안 2000 rpm에서 회전 침강시키고, 원래 부피의 검정 완충액 중에 재현탁하였다.
(3) 샘플 조제물, 조정제 scFv 상청액 샘플을 96 깊은형 웰 플레이트에서 생성하였다. 96-웰 마스터 플레이트의 각 웰로부터의 5 ㎕ 배양을 900 ㎕의 2TY + 100 ㎍/ml 앰피실린 + 0.1% 글루코스 배지를 함유하는 Greiner 깊은형 웰 배양 플레이트 내로 옮기고 37℃, 280 rpm에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. TY 중 10 mM IPTG를 100 ul/웰로 첨가하고, 플레이트를 30℃, 280 rpm에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날 아침에, 플레이트를 15분 동안 3200 rpm에서 회전 침강시켰다. 고처리량 스크리닝을 위해, 깊은형 웰 플레이트로부터의 scFv 상청액을 직접 검정 플레이트로 옮겨서 최종 농도 20%를 달성하였다.
IC50 결정을 위해, 전형적으로 정제 scFv 또는 IgG를 2개씩, 검정 완충액에서 3-배 희석하여 11개의 농도 지점을 얻었다. 96-웰 Greiner 폴리프로필렌(Greiner, 650201) 플레이트를 희석물 제조를 위해 이용하였다.
384-웰의 투명 바닥 비-결합 표면 검은색 플레이트(Costar, #3655)의 컬럼 1~22 내로, 다음을 첨가하였다: 10 ㎕ 샘플, 20 ㎕ IL33305B/항-마우스 AF647 혼합물 및 20 ㎕ IL-33/비드 혼합물. 모든 경우에 있어서, 총 웰 부피는 40 ㎕였다. 이들 실험에서 전형적으로 이용된 대조군에는 다음이 포함되었다: IL-33/비드 혼합물 + 항-마우스 AF647을 첨가하였다(비-특이적 결합); IL330305B/항-마우스 AF647 혼합물 + IL-33/비드 혼합물(총 결합). 플레이트를 밀봉하고 암소에서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한 뒤 Applied Biosystems Cellular Detection 시스템 8200 판독장치 상에서 판독하였다. 데이터를 Velocity 알고리즘으로 분석하고, 관문화는 컬러 비 0.4 미만, 크기 15 미만 및 분 카운트 20으로 설정하였다. 조정제 scFv 상청액 샘플로부터의 히트는 총 결합 대조군 웰 대비 50% 이상 신호 억제를 나타내는 것으로 정의하였다. Prism(Graphpad) 곡선-피팅 소프트웨어를 이용해서 정제 scFv 및 IgG 적정에 대해 용량 반응 곡선을 도식화하였다.
scFv의 IgG1로의 재포맷설정
파지-디스플레이 scFv 결합 실험에 의해 결정된 바와 같은 원하는 종 교차-반응성 및 특이성 프로필을 나타내거나 Axxora Il33305B에 대한 에피토프 경쟁 검정(상술된 바와 같음)에서 억제 효과를 나타낸 scFv로 DNA 서열분석을 거쳤다(Osbourn et al., Immunotechnology 2(3):181-96 (1996); Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14(3):309-14 (1996)). 먼저, 원하는 특성을 갖는 scFv를 실시예 1에 기재된 바와 같이 완전 면역글로불린 G1(IgG1), 또는 효과기-부재 이소형 IgG1 TM(IgG1 Fc 서열 혼입 돌연변이 L234F, L235E 및 P331S), 항체 포맷으로 전환하였다. 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180의 다양한 영역에 대응하는 SEQ ID NO를 표 9에 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00035
IgG에 대한 결합 검정
항-IL-33 항체의 종 교차-반응성을 플레이트-기반 ELISA를 이용해서 결정하였다. 스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific, AB-1226)를 PBS 중 0.5 ㎍/ml로 바이오틴화 항원으로 코팅하였다. 정제 IgG 조제물의 결합을 항-인간 IgG HRP(Sigma, A0170)로 검출하였다. 결합 곡선에 대한 EC50 데이터를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00036
IL330180은 파지-디스플레이 scFv 포맷에서 인간 IL-33에 결합하는 것으로 결정되었으나, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33에는 결합하지 않았다.
항-IL-33 항체에 의한 IL-33 기능적 반응의 억제
IgG에 의한 TF-1 세포 증식의 억제
세포 생활성 검정을 이용해서 항-IL-33 항체에 의한 TF-1 세포로부터의 IL-33 유도 증식/생존의 억제를 평가하였다. CellTiter-Glo® 발광 세포 생활성 검정(Promega)은 존재하는 ATP의 정량에 기반하여 배양 중 생활성 세포의 수를 결정하는 균일한 방법으로, 이는 대사 활성 세포의 존재를 신호로 나타낸다. 세포를 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 IL-33에 노출시켰다. 세포 생활성을 IL-33을 이용한 자극 72시간 후 CellTiter-Glo에 의해 측정하였다.
특히, 증식 검정을 이용해서 항-IL-33 항체에 의한 TF-1 세포로부터의 IL-33 유도 증식의 억제를 평가하였다. TF-1 세포는 R&D Systems에서 선물받았으며, 제조업체의 지침에 따라 유지하였다. 검정 배지는 5% 우태 혈청(열 불활성화, 감마선-조사), 1% 나트륨 피루베이트(Sigma, S8636), 1~2% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, 15140-122)을 함유하는 GLUTAMAX I(Invitrogen, 61870)을 포함하는 RPMI-1640으로 이루어졌다. 각각의 검정 전에, TF-1 세포를 5분 동안 300xg에서의 원심분리에 의해 펠렛화하고, 배지를 흡인에 의해 제거한 뒤, 세포를 검정 배지 중에 재현탁하였다. 상기 공정을 2회 반복하고, 세포를 검정 배지 중에서 2x105 세포/ml의 최종 농도로 재현탁하였다. IgG의 평가 용액(2개씩)을 96웰 U형-바닥 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201) 내의 검정 배지 중에 원하는 농도 범위까지 적정하고, 50 ㎕를 96웰 평탄-바닥 조직 배양-처리 플레이트(Costar, #3598)로 옮겼다. 재조합 인간 IL-33(Alexis, ALX-522-098-3010)을 적절한 평가 항체 적정물에 첨가하여 총 부피 100 ㎕/웰을 얻었다. 이어서 100 ㎕의 세포 현탁액을 100 ㎕의 IL-33 또는 IL-33 및 항체 혼합물에 첨가하여 총 검정 부피 200 ㎕/웰 및 총 세포수 20,000/웰을 얻었다. 최종 검정 농도 100 ng/mL의 IL-33을 검정에서 이용하였고, 이는 최대 증식 반응의 약 80%를 제공하는 용량으로 선택되었다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 상청액을 검정 플레이트에서 조심스럽게 제거하였다. 제조업체의 지침에 따라 재구성된 100 ㎕의 CellTiter-Glo(Promega, G7571)를 웰 당 첨가하였다. 플레이트를 5분 동안 500 rpm에서 플레이트 진탕장치 상에서 진탕하고, 발광을 EnVision 플레이트 판독장치(PerkinElmer) 상에서 판독하였다. 데이터를 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 3 또는 4-파라미터 로지스틱 공식을 이용한 곡선 피팅에 의해 IC50값을 결정하였다.
전체 억제 곡선을 얻은 항체에 있어서, IC50값을 계산하였고, 아래의 표 11에 요약한다. 정제 IgG 조제물은 IL-33에 반응하여 TF-1 증식을 억제할 수 있었다. 도 7의 A는 TF-1 증식 검정에 대한 IL330065 및 IL330101의 억제 백분율(대조군 mAb 및 hST2/Fc 대비)을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고, y-축은 최대 반응의 백분율이다.
IL-33 항체에 의한 Huvec IL-6 방출의 억제
사이토카인 방출 검정을 이용해서 항-IL-33 항체에 의한 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Huvec)로부터의 IL-33 유도 IL-6 생성의 억제를 평가하였다 세포를 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 IL-33에 노출시켰다.
Huvec을 Cambrex에서 입수하고 제조업체의 프로토콜에 따라 완전 EBM-2 배지(Lonza)에서 유지하였다. 세포를 아큐타제(PAA, #L11-007)를 이용해서 플라스크로부터 수확하고 96-웰 평탄-바닥 조직-배양 처리 플레이트(Costar, #3598) 내로 배양 배지[EGM-2 SingleQuot 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, #CC-4176) 함유 EBM-2(Lonza, #CC-3156)] 중에 1x104/100 ㎕/웰로 접종하고 18~24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 상기 시점 후, 배지를 흡인하여 세포 단층을 온전히 놔두고, 아래에 논의된 바와 같이 검정 평가 샘플로 대체하였다.
정제 IgG(2개씩)의 평가 용액을 96웰 U-형 바닥 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201) 내의 완전 배양 배지 중에서 원하는 농도까지 희석하였다. IL-33(Adipogen)을 적절한 평가 항체와 혼합된 완전 배양 배지 중에 제조하여 30 ng/mL의 최종 IL-33 농도를 얻었다. 모든 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 뒤 검정 플레이트로 120 ㎕의 IL-33/항체 혼합물을 옮겼다. 18~24시간 인큐베이션 후, IL-6을 유로퓸 판독측정을 위해 채택된 ELISA(R&D Systems, DY206)에 의해 세포 상청액 중에 측정하였다. 검은색 Fluro-Nunc Maxisorp 플레이트(VWR, #437111)를 50 ㎕ 포획 항체로 코팅하고, 자동화 플레이트 세척장치(Biotek)를 이용해서 PBS-Tween(0.01%)으로 3회 세척하고, 실온에서 1~2시간 동안 250 ㎕/웰의 PBS/1% BSA(Sigma, #A9576)로 차단하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 실온에서 1~2시간 동안 50 ㎕ 비만 세포 검정 상청액과 인큐베이션하였다. PBS-Tween으로 3회 세척 후, 플레이트를 제조업체의 지침에 따라 검출 항체(50 ㎕/웰)와 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBS-Tween 중에 3회 세척하고, 스트렙타비딘-유로퓸(PerkinElmer, 1244-360)을 DELFIA® 검정 완충액(PerkinElmer, 4002-0010) 중에 1:1000으로 희석하고 실온에서 45~60분 동안 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 이어서 플레이트를 DELFIA 세척 완충액 중에 7회 세척한 뒤 50 ㎕/웰의 증강 용액(PerkinElmer, 4001-0010)을 첨가하고, 시간차 형광측정(여기 340 nM, 방출 615 nM)을 이용해서 분석하였다. 데이터를 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 3 또는 4-파라미터 로지스틱 공식을 이용한 곡선 피팅에 의해 IC50값을 결정하였다. 전체 억제 곡선을 얻은 항체에 있어서, IC50값을 계산하였고, 아래의 표 11에 요약한다. 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL330149 및 IL330180의 정제 IgG 조제물(IgG1 또는 IgG1-TM)은 대조군 항체에 비해 IL-6 생성을 억제하였다. 예시적 결합 구성원의 역가는 본질적으로 IgG1-TM Fc 서열 돌연변이(L234F, L235E 및 P331S)의 존재에 의해 영향받지 않았으며, 나타낸 데이터는 두 포맷에 대한 정보를 조합한다. 도 7의 B는 IL330065 및 IL330101(인간 ST2-Fc, 항-IL33 pAb AF3625(R & D Systems) 및 대조군mAb 대비)에 대한 최대 IL-6 방출 백분율을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고, y-축은 최대 반응의 백분율이다.
인간 비만 세포 사이토카인 방출의 억제
사이토카인 방출 검정을 이용해서 인간 비만 세포로부터의 항-IL-33 항체에 의한 IL-33 유도 IL-6 생성의 억제를 평가하였다 IL-6에 부가하여, 세포 상청액 중 다른 사이토카인(IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF 및 TNFα)을 대안적 듀오세트 ELISA 또는 Mesoscale Discovery 멀티플렉스 분석을 이용해서 측정하였다.
인간 비만 세포를 본질적으로 문헌[Andersen et al. (J Immunol Methods 336:166-174 (2008))]에 기재된 바와 같이 탯줄 혈액 CD133+ 전구체 세포(Lonza, #2C-108)의 시험관내 분화에 의해 생성하였다. 제조업체의 지침에 따라 전구체 세포를 해동하고 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, 15140-122) 및 성장 인자: 100 ng/mL 줄기 세포 인자(Peprotech, #AF-300-07) 및 50 ng/mL IL-6(Peprotech, #AF-200-6)이 보충된 무혈청 증식 배지(StemSpan, #09650) 중에서 8주 동안 시험관내 배양하였다. 또한, 1 ng/mL IL-3(R&D Systems, #203-IL)을 최초 3주 동안 배양 배지 중에 포함시켰다. 세포를 5x105/mL 미만으로 계속 유지하였다.
비만 세포를 검정 배지(StemSpan, #09650; 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, 15140-122) 및 100 ng/mL 줄기 세포 인자(Peprotech, #AF-300-07)) 중에 하룻밤 동안 배양한 뒤, 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 IL-33에 노출시켰다.
사이토카인 방출 검정을 위해, 세포를 제거하고, 펠렛화하고(10분 동안 150 g) 검정 배지(StemSpan, #09650, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, 15140-122) 및 100 ng/mL 줄기 세포 인자(Peprotech, #AF-300-07)) 중에 재현탁하였다. 세포를 플라스크로 복귀시키고 18~24시간 동안 배양한 뒤 검정을 설정하였다. 샘플 평가를 위해, IgG의 평가 용액(2개씩)을 96웰 U형-바닥 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201) 내의 검정 배지 중에 원하는 농도까지 적정하고, 50 ㎕의 평가 용액을 96웰 평탄-바닥 조직-배양 처리 플레이트(Costar, #3598)로 옮겼다. 검정 배지 중에 90 ng/ml까지 희석된 50 ㎕의 재조합 인간 IL-33(Adipogen, #522-098-3010)을 적절한 평가 항체 적정물로 첨가하여 총 부피 100 ㎕/웰을 얻었다. 이어서 50 ㎕의 세포 현탁액(1.5x105)을 100 ㎕의 IL-33 또는 IL-33 및 항체 혼합물에 첨가하여 총 검정 부피 150 ㎕/웰 및 총 세포수 5x104/웰을 얻었다. 최종 검정 농도 30 ng/mL의 IL-33을 검정에서 이용하였고, 최대 사이토카인 반응의 약 50~80%를 제공하는 용량으로 선택하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 18~24시간 동안 인큐베이션하였다.
IL-6을 유로퓸 판독측정을 위해 채택된 ELISA(R&D Systems, DY206)에 의해 세포 상청액 중에 측정하였다. 검은색 Fluro-Nunc Maxisorp 플레이트(VWR, #437111)를 50 ㎕ 포획 항체로 코팅하고, 자동화 플레이트 세척장치(Biotek)를 이용해서 PBS-Tween(0.01%)으로 3회 세척하고, 실온에서 1~2시간 동안 250 ㎕/웰의 PBS/1% BSA(Sigma, #A9576)로 차단하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, 실온에서 1~2시간 동안 50 ㎕ 비만 세포 검정 상청액과 인큐베이션하였다. PBS-Tween으로 3회 세척 후, 플레이트를 제조업체의 지침에 따라 검출 항체(50 ㎕/웰)와 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBS-Tween 중에 3회 세척하고, 스트렙타비딘-유로퓸(PerkinElmer, 1244-360)을 DELFIA® 검정 완충액(PerkinElmer, 4002-0010) 중에 1:1000으로 희석하고 실온에서 45~60분 동안 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 이어서 플레이트를 DELFIA 세척 완충액 중에 7회 세척한 뒤 50 ㎕/웰의 증강 용액(PerkinElmer, 4001-0010)을 첨가하고, 시간차 형광 측정(여기 340 nM, 방출 615 nM)을 이용해서 분석하였다. 데이터를 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 3 또는 4-파라미터 로지스틱 공식을 이용한 곡선 피팅에 의해 IC50값을 결정하였다.
도 8의 A는 증가하는 농도의 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180에 의한 IL-6 생성의 감소를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응%이다. 평가 항체의 정제 IgG 조제물은 대조군 항체에 비해 IL-6 활성을 억제할 수 있었다. 예시적 결합 구성원의 역가는 본질적으로 IgG1-TM Fc 서열 돌연변이(L234F, L235E 및 P331S)의 존재에 의해 영향받지 않았으며, 데이터는 두 포맷에 대한 정보를 조합한다. TF-1 증식 검정, HUVEC IL-6 생성 및 비만 세포 IL-6 생성에 대한 IC50 결과를 표 11에 나타낸다.
[표 11]
Figure pct00037
세포 상청액 중 추가 사이토카인(IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 GM-CSF)을 제조업체의 지침에 Meso-Scale Diagnostics Demonstration 10-플렉스 인간 사이토카인 검정(#K15002B-1)을 이용하여 검출하였다. 사이토카인을 상술된 IL-6 ELISA과 유사한 프로토콜을 이용해서 유로퓸 판독측정을 위해 채택된 ELISA에 의해 세포 상청액 중에 측정하였다.
비만 세포는 IL-33(Meso-Scale Diagnostics Demonstration 10-플렉스 인간 사이토카인 검정 #K15002B-1; R&D Systems, #DY213)을 이용한 자극 후 일정 범위의 사이토카인을 생성하는 것으로 나타났다. 도 8의 B~F는 각각 GM-CSF, IL10, IL-8, IL-13 및 IL-5의 IL-33-유도 생성의 억제를 나타낸다. 이들 결과는 항체 IL330065, IL330101, IL330107 및 IL330149가 측정된 모든 사이토카인의 IL-33-유도 생성을 억제할 수 있었음을 나타낸다.
원상태 전장 IL-33의 결합 및 중화
상술된 선택 및 활성 연구는 재조합 사제 또는 상업적 원천의 성숙 IL-33(아미노산 112~270)을 이용하였다. 전장 IL-33이 또한 활성일 수 있음을 제시한다(Cayrol et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106(22):9021-6 (2009); Hayakawa et al., Biochem Biophys Res Commun 387(1):218-22 (2009); Talabot-Ayer et al., J Biol Chem. 284(29):19420-6 (2009)). 전장 IL-33에 대한 항체의 결합을 평가하기 위해, 전장 IL-33을 클로닝하고 HEK293-EBNA 세포에서 발현시켰다. 후술되는 바와 같이, 선택된 항체는 웨스턴 블롯에 의해 결정되는 전장 IL-33에 결합하는 것으로 나타났다.
전장 인간 IL-33의 클로닝 및 발현
인간으로부터의 전장(FL) IL-33을 인코딩하는 cDNA 분자(Swiss Prot 접근 번호 O95760 아미노산 1~270)를 프라이머 연장 PCR 클로닝에 의해 합성하여 pDONR221(Invitrogen, 12536-017) 내로 클로닝하고 제조업체의 지침에 따라 LR Gateway Clonase II 효소(Invitrogen, 12538-120)를 이용해서 포유류 발현 벡터 pDEST12.2(Invitrogen)로 전달하였다. pDEST12.2 벡터를 pCEP4 벡터(Invitrogen)로부터의 oriP 복제 기원을 함유하도록 변형하여 EBNA-1 유전자 산물(예컨대 HEK293-EBNA 세포)을 발현하는 세포주 내로의 형질감염 시 에피좀 플라스미드 복제를 허용하였다. HEK293-EBNA 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen, 11668-019)으로 형질감염시켰다. FL HuIL-33 발현 세포(및 모의-형질감염 대조군)를 프로테아제 억제제(Roche, 05892791001)의 존재 하에 초음파분쇄를 이용해서 용해시켰다.
전장 인간 IL-33을 발현하는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석
세포 용해물로부터의 단백질을 변성시키고 SDS 샘플 완충액 및 DTT로 환원시킨 후 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 막을 1 h 동안 PBS-T 중 5% 탈지 건조유로 차단하고, 1 h 동안 일차 항체(0.5 ㎍/ml)와 인큐베이션하고, PBS-T 중에 3회 세척한 뒤, HRP-접합 이차 항체(염소 항-인간 IgG(Sigma, A0170)의 1/10,000 희석물)와 1 h 동안 인큐베이션하고, PBS-T 중 3회 세척하였다. HRP를 Amersham ECL + 검출 시약(GE healthcare, RPN2132)으로 검출하였다. 매직 마크(Magic Mark XP(Invitrogen, LC5602)의 크기까지의 이동과 비교하여 크기를 산정하였다. 도 9는 웨스턴 블롯에 의한 전장 인간 IL-33에 대한 IL-33 항체(IL330065, IL330101, IL330107 및 IL330149)의 결합을 나타낸다.
전장 IL-33 세포 용해물에 대한 비만 세포 사이토카인 반응의 중화
전장(FL) HuIL-33을 발현하는 HEK293-EBNA 세포(및 모의-형질감염 대조군)를 아큐타제(PAA, #L11-007)를 이용한 형질감염 24시간 후 수확하였다. 세포를 PBS로 5x107/mL까지 희석하고, 조직 균질화장치를 이용해서 30초 동안 균질화하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. 비만 세포를 다양한 농도의 세포 용해물로 자극하였다. 사이토카인 생성의 자극은 전장 IL-33-형질감염 세포 용해물로만 관찰되었으며, 모의 형질감염 세포 용해물로는 관찰되지 않았다. 최대-미만 사이토카인 방출을 자극한 용해물의 농도(약 EC50)를 항체 중화 연구를 위해 선택하였다.
사이토카인 방출 검정을 위해, 비만 세포를 검정 배지(StemSpan, #09650; 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, 15140-122) 및 100 ng/mL 줄기 세포 인자(Peprotech, #AF-300-07)) 중에 하룻밤 동안 배양한 뒤, 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 FL HuIL-33에 노출시켰다. IL-6 및 IL-13 생성을 18~24시간 후 검정 상청액의 ELISA에 의해 검출하였다. 프로토콜의 상세 설명은 전술되었다(실시예 2-0007).
도 10은 전장 IL-33-형질감염 세포의 세포 용해물에 의해 자극된 비만 세포 IL-6 및 IL-13 생성에 대한 항-IL-33 항체 IL330065 및 IL330101의 효과를 나타낸다. 정제 IgG 조제물은 전장 IL-33 세포 용해물에 의해 유도된 IL-6(도 10의 A) 및 IL-13(도 10의 B) 생성을 억제할 수 있었다.
IL-33 항체의 비-경쟁적 작용 방식
정제 IgG에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
항-IL-33 항체가 ST2 수용체에 대한 Flag®-His 태그화 IL-33의 결합을 억제하는 능력을 그 전체 방법이 실시예 1에 기재된 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다.
도 11의 A는 증가하는 농도의 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180을 이용한 HTRF® 수용체-리간드 경쟁 검정의 특이적 결합 결과를 나타낸다. 이들 결과는 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180이 IL-33:ST2 상호작용의 경쟁적 억제제가 아님을 나타낸다.
IgG에 의한 Huvec에서의 NFkB 신호전달의 억제
IL-33에 반응하는 Huvec에서의 NFkB 신호전달을 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역형광 염색에 의해 검출되는, p65/RelA NFkB 서브유닛의 핵 전위에 의해 평가하였다.
도 11의 B는 증가하는 농도의 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107 및 IL330149를 이용한 Huvec NFkB 전위를 나타낸다. 이들 결과는 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107 및 IL330149가 자극 30분 후 IL-33-자극 Huvec에서 p65/RelA NFkB의 핵 전위를 억제하지 않았음을 나타낸다. 결과는 항체 IL330065, IL330099, IL330101, IL330107, IL33149 및 IL330180의 ST2에 대한 IL-33 결합 억제의 실패와 일치한다.
HTRF ® 에피토프 경쟁 검정에서 IL-33 항체의 에피토프 빈 설정(binning)
항체가 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대해 mAb IL330101 또는 mAb IL330180과 경쟁하는 능력을 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 에피토프 경쟁 검정에서 평가하였다.
후술되는, HTRF® 에피토프 경쟁 검정을 이용해서 바이오틴화 IL-33으로의 IgG 포맷의 선도 항체의 결합을 측정하였다. 선도 항체에 대한 유사 에피토프를 인식하는 평가 scFv 샘플은 IL-33으로의 결합에 대해 선도 항체와 경쟁하여, 검정 신호의 감소를 야기할 것이다.
5㎕의 각각의 항체 평가 샘플의 희석물을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 첨가함으로써 정제 항-IL-33 scFv 항체 샘플을 선도 항체로의 바이오틴화 인간 IL-33 결합의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 8 nM IL330180 IgG1 또는 12 nM IL330101 IgG1 및 40 nM 항 인간 Fc 검출(Cisbio International, 61HFXLB)을 함유하는 용액을 제조하고, 2.5 ㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다. 여기에 4 nM(IL330180 에피토프 경쟁 검정을 위해) 또는 18 nM(IL330101 에피토프 경쟁 검정을 위해) 바이오틴화 인간 IL-33(Axxora, AG-40B-0038; 바이오틴화) 및 4.65 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB) 함유 용액 2.5 ㎕의 첨가가 뒤따랐다. 0.8 M 칼륨 플루오라이드(BDH 103444T) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma A9576)을 함유하는 Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185)로 이루어진 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 2시간에 이어 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 후 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서의 시간차 형광을 판독하였다. 데이터를 전술된 바와 같이 식 1 내지 3을 이용해서 분석하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 바이오틴화 IL-33/스트렙타비딘 크립테이트 조합을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의된다.
IL330101 및 IL330180 에피토프 경쟁 검정에 대한 결과를 각각 도 8A 및 8B에 나타낸다. 도 12의 A는 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 IL330101 scFv, IL330107 scFv, IL330149 scFv, IL330065 scFv, 비관련 scFv 및 IL330180 scFv와 mAb IL330101의 경쟁적 결합을 나타낸다. 이들 결과는 IL330101 scFv, IL330107 scFv, IL330149 scFv가 바이오틴화 인간 IL-33으로의 IL330101 결합을 경쟁적으로 억제하였음을 나타낸다.
도 12의 B는 생화학적 HTRF®에서 평가된 바이오틴화 인간 IL-33으로의 결합에 대한 IL330180, IL330101, IL330149, IL330065 및 비관련 scFv와 mAb IL330180의 경쟁적 결합을 나타낸다. 이들 결과는 IL330101, IL330149 및 IL330065가 바이오틴화 인간 IL-33으로의 IL330180 결합을 경쟁적으로 억제하지 않음을 나타낸다.
상기 방법을 이용한 에피토프 빈 설정은 표 12에 상세히 나타낸 바와 같이, 패널 1의 IL330101, IL330107 및 IL330149, 패널 2의 IL330065 및 패널 3의 IL330180을 포함하는 3개 패널의 항체를 나타낸다.
[표 12]
Figure pct00038
실시예 3 항-IL-33 Ab IL330101의 최적화
친화도 성숙
IL330101을 표적화 돌연변이화 접근 및 친화도-기반 파지 디스플레이 선택을 이용해서 최적화하였다. 선도 클론으로부터 유도된 대규모 scFv-파지 라이브러리를 문헌[Clackson, T. and Lowman , H.B . Phage Display - A Practical Approach, 2004. Oxford University Press]에 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학 기법을 이용해서 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역 2 및 3(CDR2 및 CDR3) 및 경쇄(VL) CDR3의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이화에 의해 생성하였다. 인간 및 마우스 IL-33에 대해 더 높은 친화도를 갖는 변이체를 선택하기 위해, 라이브러리로 친화도-기반 파지 디스플레이 선택을 거쳤다. 선택은 본질적으로 전술된 바와 같이 실시예 1 및 2에 기재된 시약을 이용해서 수행하였다(Thompson, J et al. J Mol Biol , 1996. 256: p. 77-88). 간략하게, scFv-파지 입자를 용액 중 재조합 바이오틴화 인간 IL-33(Adipogen; 실시예 1 내의 단백질 변형에 기재된 바와 같이 바이오틴화)과 인큐베이션하였다. 이어서 항원에 결합된 ScFv-파지를 제조업체의 권장사항에 따라 스트렙타비딘-코팅 상자성 비드(Dynabeads® M-280) 상에 포획하였다. 이어서 선택된 scFv-파지 입자를 전술된 바와 같이 구제하고(Osbourn , J.K ., et al. Immunotechnology, 1996. 2(3): p. 181-96), 선택 공정을 교대하는 그리고 감소하는 농도의 - 전형적으로 4회 선택에 걸쳐 500 nM 내지 500 pM의 인간 또는 마우스 바이오틴화 IL-33의 존재 하에 반복하였다.
미정제 scFv에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
선택 산출물로부터의 대표적 수의 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 박테리아 원형질막 주위공간에서 발현시키고(Kipriyanov , et al. J Immunol Methods 200(1-2): 69 -77 (1997)) 균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:mAb-결합 검정에서 이의 억제 활성에 대해 스크리닝하였다. 본 검정에서, 샘플은 바이오틴화 인간 IL-33 또는 마우스 IL-33 FLAG®His로의 결합에 대해 IL330101 IgG와 경쟁하였다. 이러한 에피토프 경쟁 검정은 항-IL-33 IgG와 유사한 에피토프를 인식하는 평가 항체 샘플이 바이오틴화 IL-33으로의 결합에 대해 IgG와 경쟁하여 검정 신호에서 감소를 일으킬 것이라는 원리에 기반한다.
5㎕의 샘플을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 첨가함으로써 미정제 항-IL-33 scFv 샘플을 IL330101에 대한 바이오틴화 인간 또는 마우스 IL-33 FLAG®His 결합의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 40 nM 항 인간 Fc XL665 검출(Cisbio International, 61HFCXLB)과 조합된 12 nM IL330101 함유 용액을 인간 IL-33 검정을 위해 제조하고 40 nM 항 인간 Fc XL665 검출(Cisbio International, 61HFCXLB)과 조합된 2 nM IL330101을 마우스 검정을 위해 제조하였다. 2.5㎕를 검정 플레이트로 첨가하였다. 여기에 인간 검정을 위해 4.6 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 18 nM 바이오틴화 인간 IL-33(Adipogen, AG-40B-0038) 함유 용액 또는 게잡이원숭이 검정을 위해 4.6 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 2 nM 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 함유 용액 2.5 ㎕ 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 4시간에 이어 섭씨 4도에서 16시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용하여 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다.
에피토프 경쟁 검정이 그 감도 한계에 도달하면, 중간 최적화 mAb IL330259를 이용한 검정을 미정제 scFv 샘플의 평가를 위해 이용하였다. 5㎕의 각각의 샘플을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 첨가함으로써 미정제 항-IL-33 항체 샘플을 DyLight 표지 IL330259에 대한 바이오틴화 인간 IL-33 또는 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 결합의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 20 nM DyLight 표지 IL330259 함유 용액을 인간 IL-33 검정을 위해 제조하고 4 nM DyLight 표지 IL330259를 마우스 검정을 위해 제조하고 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다(제조업체의 지침에 따라 키트(Thermo Scientific, 53051)를 이용해서 IgG 표지). 여기에 6 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 20 nM 바이오틴화 인간 IL-33(Adipogen, AG-40B-0038) 또는 1.6 nM 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 함유 용액 2.5㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 4시간에 이어 섭씨 4도에서 16시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용하여 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다:
정제 scFv에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
IL330101 대비 미정제 원형질막 주위공간 추출물로서 IL-33:mAb 상호작용에 대해 더 큰 억제 효과를 나타낸 단일쇄 Fv 클론으로 DNA 서열분석을 거쳤다(Osbourn, et al. Immunotechnology 2(3):181-96 (1996); Vaughan, et al. Nat Biotechnol 14(3):309-14 (1996)). 고유한 scFv를 다시 박테리아에서 발현시키고 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다(WO01/66754에 나타낸 바와 같음). 이들 샘플의 역가를 전술된 바와 같이, 그러나 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His 검정을 추가하여(바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His을 12 nM 농도로 첨가하였음) 바이오틴화 인간 IL-33, 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 또는 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His으로의 결합에 대해 IL330101 IgG 대비 정제 조제물의 희석 시리즈를 경쟁시켜 결정하였다.
도 13: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 IL330101, IL330259로 IL330101에 대한 바이오틴화 인간 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
IL330101보다 큰 정도로 IL-33:mAb 상호작용을 억제할 수 있는 정제 scFv 조제물을 IgG 포맷으로의 전환을 위해 선택하였다. IgG 발현 및 정제 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.
에피토프 경쟁 검정이 그 감도 한계에 도달하면, 중간 최적화 mAb(IL330259)를 이용한 검정을 정제 scFv 샘플의 평가를 위해 이용하였다. 정제 항-IL-33 항체 샘플을 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His 검정(바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His를 12 nM 농도로 첨가함)을 추가하여 상술된 바와 같이 IL330259로의 바이오틴화 인간 IL-33, 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 또는 바이오틴화 게잡이원숭이 FLAG®His IL-33 결합의 억제에 대해 평가하였다.
서열 및 에피토프 경쟁 데이터에 기반하여, 선택된 VH 및 VL 산출물을 표준 분자 생물학 기법에 의해 재조합하여 클론이 무작위 페어링된 VH 및 VL 서열을 함유하는 라이브러리(예를 들어, VH CDR2/VL CDR3 및 VH CDR3/VL CDR3 라이브러리)를 형성하였다. 대안적으로, VH CDR3 및 VL CDR3 서열을 무작위 페어링하고, 개선된 변이체 풀로부터 선택된 특이적 VH CDR2 서열과 재조합하여 모든 3개 CDR이 비-모체인 라이브러리를 생성하였다. 전형적으로, 감소하고 교대하는 농도의 10 nM 내지 10 pM의 인간 및 마우스 바이오틴화 IL-33을 이용하는 5회의 친화도 선택을 모든 재조합 라이브러리 상에서 수행하여 개선된 역학을 갖는 scFv 서열을 확인하였다. 대안적으로, 4회의 선택에 걸쳐 - '오프율'또는 '경쟁'선택으로 당분야에 공지되어 있는 공정 - 증가하는 양의 시간 동안(예를 들어, 30분, 1시간, 2시간 또는 4시간) 1000x비바이오틴화 IL-33의 존재 하에 고정 농도의 바이오틴화 IL-33(예를 들어, 1 nM, 100 pM 또는 300 pM)을 이용해서 재조합 라이브러리를 선택하여 개선된 역학을 갖는 scFv 서열을 확인하였다.
샘플을 다시 전술된 바와 같이 IL330101 모체 항체 또는 VH CDR2 최적화 항체 IL330259 에 대한 표지-huIL-33의 결합을 억제하는 능력에 대해 HTRFβ 에피토프 경쟁 검정에서 스크리닝하였다. IL330101에 비해 유의미하게 개선된 억제 효과를 나타낸 ScFv로 DNA 서열분석을 거치고, 고유한 변이체를 추가 특성규명을 위해 정제 scFv로서 생성하였다. 억제성 scFv를 실시예 1에 기재된 바와 같은 완전 면역글로불린 G1(IgG1) 항체 포맷으로 전환하였다.
대안적으로, 개별적인 고유한 VH CDR2, VH CDR3 및 VL CDR3 서열을 특이적으로 그리고 합리적으로 재조합하고 IgG로서 직접 생성하였다. 본 실시예에서, IgG를 임의의 추가적인 친화도 선택 없이 개선된 동역학에 대해 평가하였다.
개선된 역학을 갖는 항체를 모든 전략으로부터 확인하였으며, IL330259, IL330377, IL330388, IL330396, IL330398 및 H338L293에 의해 예시된다.
IL330101 모체 및 최적화 항-IL-33 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 IMGT 데이터베이스에서의 공지된 인간 생식계열 서열과 정렬하고(Lefranc , M. P. et al. Nucl . Acids Res. 2009. 37(Database issue): D1006-D1012), 가장 가까운 생식계열을 서열 유사성에 의해 확인하였다. IL330101 항체 계통의 VH 도메인에 있어서, 이는 IGHV3-21/IGHJ2였다. VL 도메인에 있어서, 이는 IGLV3-25/IGLJ3이었다. 변화시키지 않고 놔둔 Vernier 잔기(Foote , J., et al. J Mol Biol , 1992. 224: p. 487)를 고려하지 않으면, VH 도메인의 프레임워크에서는 요구되는 변화가 없었으며 VL 프레임워크에서는 4개 변화가 존재하였다(V3E, T5M, A45V 및 V104L; Kabat 넘버링). 이들 위치를 적절한 돌연변이화 프라이머로 표준 부위 지정 돌연변이화 기법을 이용해서 나타낸 바와 같이 변화시켰다. 상기 방식에서 생식계열이었던 항체는 다양한 영역의 항체IL330259, H338L293, IL330377, IL330388, IL330396 및 IL330398에 대응하는 'fgl'접두어.SEQ ID NO와 함께 서열 목록에서 나타나며 표 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure pct00039
정제 IgG에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
DyLight 표지 IL330101 IgG에 대한 바이오틴화 인간 IL-33, 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 또는 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His의 결합을 억제하는 항-IL-33 항체의 능력을 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다.
5㎕의 각각의 농도의 샘플을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 첨가함으로써 정제 항-IL-33 항체 샘플을 DyLight 표지 IL330101에 대한 바이오틴화 인간 IL-33, 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 또는 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His IL-33 결합의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 40 nM의 DyLight 표지 IL330101을 함유하는 용액을 제조하고, 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다(제조업체의 지침에 따라 키트(Thermo Scientific, 53051)를 이용해서 표지). 여기에 4.6 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 40 nM 바이오틴화 인간 IL-33(Adipogen, AG-40B-0038), 2.5 nM 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 또는 12 nM 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG® His 함유 용액 2.5㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 4시간에 이어 섭씨 4도에서 16시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용하여 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다:
도 14의 A: 증가하는 농도의 IL-33 IgG1 항체 IL330101, IL330259로 IL330101에 대한 바이오틴화 인간 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
에피토프 경쟁 검정이 그 감도 한계에 도달하면, 중간 최적화 mAb IL330259를 이용한 검정을 정제 IgG 샘플의 평가를 위해 이용하였다. 이는 정제 scFv의 평가에 대해 기재된 바와 같다.
IL330259 에피토프 경쟁 검정이 그 감도 한계에 도달하면, 최적화 mAb(H338L293)을 이용한 제3 검정을 정제 IgG 샘플의 평가를 위해 이용하였다. 5㎕의 각각의 샘플을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 첨가함으로써 정제 항-IL-33 항체 샘플을 DyLight 표지 H338L293에 대한 바이오틴화 인간 IL-33, 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG®His 또는 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 결합의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 20 nM의 DyLight 표지 H338L293을 함유하는 용액을 제조하고, 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다(제조업체의 지침에 따라 키트(Thermo Scientific, 53051)를 이용해서 표지). 여기에 4.6 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 4 nM 바이오틴화 인간 IL-33(Adipogen, AG-40B-0038), 0.8 nM 바이오틴화 마우스 IL-33 FLAG®His 또는 1.6 nM 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 FLAG® His 함유 용액 2.5 ㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 4시간에 이어 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용하여 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다:
도 14의 B: 증가하는 농도의 IgG1 항체 H338L293, IL330396 및 IL330388로 H338L293에 대한 바이오틴화 인간 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
IL-33 항체에 의한 Huvec IL-6 생성의 억제
항체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 Huvec으로부터의 IL-33-자극 IL-6 생성을 억제하는 능력에 대해 평가하였다.
도 15의 A는 증가하는 농도의 항체(IL330101, IL330377, H338L293, IL330388, IL330396, IL330398)에 의한 IL-6 생성의 감소를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응%이다. 항체의 정제 IgG 조제물은 100% 억제한 상업적인 폴리클로날 항체에 비해 최대 약 70%만큼 IL-6 활성을 억제하였다.
IL-33 항체에 의한 비만 세포 IL-6 생성의 억제
항체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 인간 탯줄 혈액 유래 비만 세포로부터의 IL-33-자극 IL-6 생성을 억제하는 능력에 대해 평가하였다.
도 15의 B는 증가하는 농도의 항체(IL330101, H338L293, IL330388, IL330396)에 의한 IL-6 생성의 감소를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응%이다. 항체의 정제 IgG 조제물은 음성 대조군 항체에 비해, IL-6 활성을 100%만큼 억제하였다.
HUVEC IL-6 생성 및 비만 세포 IL-6 생성에 대한 IC50 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
Figure pct00040
항체 약리학
탯줄 혈액-유래 비만 세포로부터의 IL-6 생성을 실시예 2에 기재된 방법을 이용해서 증가하는 농도의 IL-33(Adipogen)에 의해 유도하였다. 상기 용량-반응을 증가하는 농도의 H338L293 또는 IL330388의 존재 하에 수행하여 IL-33 용량-반응 곡선의 우측향 이동을 일으켰다. 항체의 부재 및 존재 하에 IL-33에 대한 EC50값을 GraphPad PRISM 소프트웨어(La Jolla, CA, USA)를 이용해서 계산하고, 용량 비(DR)를 계산하였다. 데이터를 log [항체] M (x-축) 대 log [DR-1] (y-축)으로 도식화하였다. 이는 알로스테리 조정인자의 특징인 비-경쟁적 프로필(곡선형 그래프)을 명확히 나타낸다. 이를 조사하기 위해, 각각의 실험으로부터의 데이터를 정상화하고 단일 데이터 세트로 조합하였다. 알로스테리 모델을 Prism Graphpad 소프트웨어를 이용해서 피팅하고 Kb 및 알파 값을 결정하였다. 알파 값은 검사된 두 선도물질 모두 유사하여, 약 0.02의 알파 값을 시사하였다(즉, 항체가 결합되는 경우 IL-33 친화도/역가의 최대 감소가 약 50배임). 기능적 친화도(Kb)를 H338L293(약 4.2 nM) 및 IL330388 약 1.7 nM)에 대해 산정할 수 있다.
도 16은 비만 세포 IL-6 생성 검정에서 IL330388 및 H338L293의 Schild 분석을 나타낸다. 두 항체는 모두 알로스테리 조정인자의 프로필을 나타낸다.
BIAcore를 이용한 IL-33 항체에 대한 결합 친화도 계산
인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33에 대한 예시적 결합 구성원의 정제 IgG 샘플의 결합 친화도를 BIAcore 2000(GE healthcare)을 이용해서 용액 친화도에 의해 결정하였다. 바이오틴화-IL33 표면을 스트렙타비딘 코팅 센서 칩(GE healthcare cat. No. BR-1000-32) 상에 고정화하였다. 항-IL33 항체를 다양한 농도의 표지되지 않은 IL33과 인큐베이션하고 48시간 동안 25℃에서 평형화하였다. IL33 칩에 걸쳐 샘플을 흘리고 표준 항체 곡선 대비 반응을 측정함으로써 자유 항체의 양을 결정하였다. 친화도를 BIAevaluation 소프트웨어에서 용액 친화도 피팅을 이용하여 결정하였다. 인간, 게잡이원숭이 또는 마우스 IL-33에 대한 항체 IL330101, H338L293, IL330388, IL330396 결합에 대한 친화도를 표 15에 나타낸다.
[표 15]
Figure pct00041
실시예 4 IL-33의 산화환원 조절
시약
인간 IL-33의 성숙 성분(아미노산 112~270)을 인코딩하는 cDNA; 접근 번호(Swiss-Prot) O95760을 프라이머 연장 PCR에 의해 합성하고 pJexpress404(DNA 2.0) 내로 클로닝하였다. 단백질의 N-말단에 10xhis, Avitag 및 인자-Xa 프로테아제 절단 부위(MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR)를 함유하도록 코딩 서열을 변형하였다. 이. 콜라이(E.coli) BL21(DE3) 세포를 형질전환함으로써 N-말단 태그화 His10/Avitag IL33-01(WT, SEQ ID 632)을 생성하였다. 형질전환된 세포를 18시간 동안 37℃에서 자동유도 배지(Overnight Express™ Autoinduction System 1, Merck Millipore, 71300-4) 중에 배양한 뒤 세포를 원심분리에 의해 수확하고 -20℃에서 보관하였다. 완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche, 11697498001), 2.5 u/ml Benzonase 뉴클레아제(merck Millipore, 70746-3) 및 1 mg/ml 재조합 라이소자임을 함유하는 BugBuster(Merck Millipore, 70921-5) 중에 세포를 재현탁하였다. 4℃에서 2시간 동안 75,000xg에서 원심분리에 의해 세포 용해물을 청정화하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 중에 용출하며 상청액으로부터 IL-33 단백질을 정제하였다. 인산염 완충 식염수 pH 7.4 중 Superdex 75 10/300 GL 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IL-33을 추가 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 IL-33을 함유하는 분획을 풀링하고Nanodrop A280 측정에 의해 농도를 측정하였다. SDS PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.
태그가 제거된 IL-33(BK349)을 생성하기 위해, N-말단 태그화 His10/Avitag IL33-01을 1시간 동안 RT에서 2xDPBS 완충액 중 단백질 1 mg 당 10 유닛의 인자 Xa(GE healthcare 27-0849-01)와 인큐베이션하였다. 1 ml/분의 유속으로 S75 컬럼(GE healthcare 28-9893-33) 상에서 2xDPBS 중 SEC 크로마토그래피를 이용해서 태그화되지 않은 IL33을 정제하였다.
표 16에 개략된 다른 시약은 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다.
[표 16]
Figure pct00042
단백질 변형
본원에서 이용된 IgG 및 변형 수용체 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 EZ 링크 설포-NHS-LC-바이오틴(Thermo/Pierce, 21335)을 이용해서 자유 아민을 통해 바이오틴화하였다. 본원에서 이용된 IL-33 단백질을 EZ 링크 바이오틴-BMCC(Perbio/Pierce, 제품 번호 21900)를 이용해서 자유 시스테인을 통해 바이오틴화하였다.
IL-33은 시험관내에서 활성을 빠르게 소실함
그 방법이 각각 실시예 1 및 2에 기재된 HUVEC 신호전달 검정(30분) 및 IL-6 생성 검정(18~24시간)에서 IL-33 활성을 측정하였다.
도 17은 HUVEC 신호전달 검정(30분) 및 IL-6 생성 검정(18~24시간)에서 측정된, 인간 IL-33, 시스테인-바이오틴화 IL-33 또는 세포 배양 배지-사전처리 IL-33의 활성을 나타낸다. 도 17의 A는 NFkB 또는 IL-6 검정에 의해 측정되는 인간 IL-33 활성(Adipogen)의 비교를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 인간 IL-33 농도이고 y-축은 최대 반응 백분율이다. IL-33은 단시간(30분) 검정 대비 하룻밤 동안 유의미하게 덜 강력하였다. 시스테인 잔기를 통해 바이오틴화 인간 IL-33 Flag®His는 단기간(30분) 및 장기간(하룻밤) 검정 간에 활성을 소실하지 않았다(도 17의 B). 상기 현상을 조사하기 위해, IL-33(BK349)을 세포 배양 배지(EGM-2 SingleQuot 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, #CC-4176) 함유 EBM-2 (Lonza, #CC-3156)) 중에 18시간 동안 사전 처리한 뒤, NFkB 신호전달을 유도하는 능력에 대해 미처리 IL-33과 비교하였다. 배양 배지로 사전 처리한 IL-33은 유의미한 활성 손실을 나타내었다(도 17의 C).
IL-33의 SDS-PAGE 분석
IL-33 단백질의 잠재적 변화를 조사하기 위해, PBS/0.1% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 Iscoves Modified Dulbeccos 배지(IMDM)-처리 인간 IL-33(BK349 또는 인간 IL-33 Flag®His) 및 마우스 IL-33 Flag®His를 환원성 또는 비-환원성 조건 하에 SDS PAGE 전기영동에 의해 분석하였다. 샘플을 1xNuPAGE 겔 로딩 완충액(Invitrogen) 중에 제조하고 3분 동안 90℃에서 변성시켰다. 환원 샘플은 2% 베타-메르캅토에탄올을 함유하였다. 제조업체의 지침에 따라 MOPS 진행 완충액(Invitrogen)으로 NuPAGE Novex 12% Bis-Tris 미니 겔(Invitrogen) 상에서 샘플을 진행시켰다. 환원 및 비-환원 샘플을 별도 겔 상에서 진행시켰다. 레인 당 500 ng의 IL-33을 로딩하였다. 겔을 ddH20 중 진탕 플랫폼 상에서 3 x 5분 세척한 다음 EzBlue(Coomassie brilliant blue G-250 기반 겔 염색 시약, Sigma G1041)를 이용해서 1시간 동안 염색하였다. 겔을 dH2O 중에 탈염색하고 Epsom Scanner를 이용해서 스캐닝하였다.
도 18은 Iscoves Modified Dulbeccos 배지(IMDM)를 이용한 처리 이전 또는 이후, 환원성 또는 비-환원성 조건 하에 인간 또는 마우스 IL-33의 SDS-PAGE를 나타낸다. IMDM으로의 처리 이후 IL-33의 겉보기 분자량 차이가 비-환원성 조건 하에서만 관찰되어, 인간 및 마우스 IL-33 모두에 대한 산화환원-관련 변형의 존재를 시사하였다. 도 18의 A는 비-환원성 조건 하에서만 관찰된 IMDM을 이용한 처리 이후 인간 IL-33(BK349)의 겉보기 분자량 차이를 나타낸다. 도 18의 B는 비-환원성 조건 하의 비-바이오틴화 대 바이오틴화, 인간 IL-33 Flag®His를 나타낸다. 겉보기 분자량의 차이가 IL-33 Flag®His에 대해 관찰되었지만, IMDM 처리 이후 시스테인 바이오틴화 IL-33 Flag®His에 대해서는 관찰되지 않았다. 도 18의 C는 비-환원성 조건 하에서만 관찰된 IMDM을 이용한 처리 이후 마우스 IL-33 Flag®His의 겉보기 분자량 차이를 나타낸다.
질량 분광측정 분석 및 디설파이드 맵핑
추가 분석을 위해 인간 IL-33의 배지-처리 형태를 정제하였다. 인간 IL-33(BK349)을 37℃에서 18시간 동안 60% IMDM 배지와 함께 또는 PBS 중 최종 단백질 농도 300 ug/ml로 인큐베이션하였다. 18시간 후, AKTAxpress FPLC 시스템(GE healthcare)을 이용해서 2xDPBS 중 S75 16:600 Superdex 컬럼(GE healthcare 28-9893-33) 상의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용해서 배지 처리 IL33을 배지 성분으로부터 정제하였다. 피크 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하고, 응집되지 않은 순수한 분획을 풀링하여 LC-MS에 의해 분석하였다.
도 19는 SEC에 의한 IMDM-처리 인간 IL-33의 정제를 나타낸다. 단량체 분획을 추가 분석을 위해 수집하였다.
LC-MS
Synapt G1 사극자 비행 시간(QToF) 질량 분광측정계(Waters, Milford, US)에 커플링된 Acquity UPLC를 이용해서 역상(RP) LC-MS 분석을 수행하였다. 1 mg/ml 로 10 mM Tris HCl pH 8 중에 희석된 1 ㎍의 정제 단백질을 65℃에서 유지되는 50 mm x 2.1 mm, 1.7 ㎛ 입자 크기 BEH300 C4 분석용 컬럼(Waters, Milford , US) 상으로 주입하였다. 5분 이원 구배를 이용해서 0.15 mL/분의 일정한 유속으로 단백질을 용출하였다; 용매 B는 처음에는 1분에 걸쳐 5%부터 95%까지 증가시켰고, 2분에 걸쳐 20%로 감소시킨 후 추가 2분에 걸쳐 5%로 복귀시켰다. 후속 주입 전에 5분 동안 고농도(95%) 및 저농도(5%) 용매 B 간 교대에 의해 컬럼을 세정하였다. 용매 A(물) 및 B(아세토니트릴)에 0.01%(v/v) 트리플루오로아세트산 및 0.1%(v/v) 포름산을 보충하였다. 500~4500 m/z에서 스펙트럼을 획득하였다. 중요 기기 파라미터에는 +ve 이온화 모드, 소스 전압: 3.4 kV, 샘플 콘 전압: 50 V, 소스 온도: 140℃, 탈용매화 온도: 400℃가 포함되었다. BioPharmaLynx(Waters, Milford, US)를 이용하여 전하 엔벨로프를 디콘볼루션하였다.
도 20은 LC-MS에 의해 결정된 PBS 대 IMDM 처리 IL-33의 온전한 질량을 나타낸다. IMDM-처리 IL-33은 2개의 디설파이드 결합 형성과 양립되는 PBS-처리 IL-33 대비 4 Da 손실을 나타내었다.
디설파이드 결합 맵핑
각각의 샘플에 있어서, 100 mM 나트륨 포스페이트, 1 mM N-에틸말레이미드, pH 7.0 완충액 중 3 mg/ml로 50 ㎍의 단백질을 제조하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 건조 샘플을 7 M 구아니딘 HCl, 100 mM NaCl, 10 mM 나트륨 포스페이트 중에 재현탁하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 변성된 단백질을 0.3 mg/ml까지 희석하고 37℃에서 2 M 구아나딘, 100 mM 나트륨 포스페이트, 0.1 mM EDTA, pH 7.0 중 E:S 비 1:50으로 Glu-C를 이용해서 소화시켰다. 2시간 후, Lys-C의 제2, 균등 분취물을 첨가하였다. 추가 2시간 후, 소화물을 분리하였다; 환원 분석을 위해, 소화물을 실온에서 15분 동안 50 mM 디티오트레이톨과 인큐베이션하였다. Synapt G2 QToF 질량 분광측정계(Waters, Milford, US)에 커플링된 Acquity UPLC를 이용하여 RP LC-MS에 의해 환원 및 비-환원 샘플을 분석하였다. 각각의 샘플에 있어서, 5 ug의 Lys-C 소화물을 55℃에서 유지되는 150 mm x 2.1 mm, 1.7 ㎛ 입자 크기 BEH300 C18 분석용 컬럼(Waters, Milford, US) 상에 주입하였다. 펩타이드를 75분 이원 구배를 이용해서 0.2 mL/분의 일정한 유속으로 용출하였다: 용매 B는 0%부터 35%까지 증가시켰다. 후속 주입 전에 5분 동안 고농도(95%) 및 저농도(5%) 용매 B 간 교대에 의해 컬럼을 세정하였다. 용매 A(물) 및 B(아세토니트릴)에 0.02%(v/v) 트리플루오로아세트산을 보충하였다. 데이터 독립적 획득 방식을 이용해서 50~2000 m/z 간 스펙트럼을 획득하였다. BioPharmaLynx(Waters, Milford, US)를 이용해서 저 및 고 에너지 스펙트럼을 처리하였다.
도 21은 IMDM-처리 인간 IL-33의 디설파이드 맵핑을 나타낸다. 도 21a는 DSB IL-33의 비-환원 및 환원 Lys-C 펩타이드 맵핑 분석으로부터의 조합, 디콘볼루션 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 21b는 시스테인 함유 펩타이드에 대한 단리 스펙트럼을 나타낸다. 환원 및 비-환원 샘플에 고유한 펩타이드를 각각 녹색 및 파란색으로 강조한다. 데이터는 2개의 디설파이드 가교 형성과 일치하였다. 확인된 하나의 종은 각각 시스테인 C208-C249 및 C227-C232 간 가교를 가졌다. 그러나, 우세한 피크가 분해되지 않았고 다른 종이 존재할 수 있다. 도 21c는 디설파이드 결합 IL-33의 비-환원 및 환원 Lys-C 펩타이드 맵핑 분석에 의해 확인된 디설파이드 결합 펩타이드의 서열을 나타낸다. 디설파이드 결합은 2개 하이픈(--)으로 나타낸다. Lys-C 절단오류는 사각 괄호로 나타낸다.
디설파이드 결합 IL-33의 NMR 분석
IL-33의 보고된 구조에 따르면(Lingel , A. et al. Structure 17, 1398-1410 (2009); Liu , X. et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 110, 14918-14923 (2013)), 시스테인 잔기는 중대한 입체형태 변화 없이는 디설파이드 결합이 일어나도록 충분히 가까이 인접해 있지 않다. 이를 조사하기 위해, NMR 이종핵 다중 양자 정합(HMQC) 분석을 수행하였다.
15 N-IL-33 단백질의 생성
N-말단 6His 태그 및 TEV 프로테아제 절단 부위(SEQ ID. 633)를 갖는 야생형 IL-33을 인코딩하는 DNA를 이용해서 이. 콜라이 BL21 Gold 세포를 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 5 g/L의 15N-IsoGro™ 분말이 보충된 M9 최소 배지 중 37℃에서 이들이 0.6 내지 0.8의 OD600nm에 도달할 때까지 배양하고, 이 때 100 mM IPTG의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 배양을 추가 20시간 동안 18℃에서 계속한 뒤 세포를 원심분리에 의해 수확하고 -80℃에서 보관하였다. 세포를 완전 프로테아제 억제제 정제(Roche, 11697498001), 2.5 U/ml Benzonase 뉴클레아제(merck Millipore, 70746-3) 및 1 mg/ml 재조합 라이소자임을 함유하는 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중에 재현탁하였다. 재현탁 세포를 25 kpsi에서 Constant Systems 세포 분쇄장치를 이용해서 용해시키고 4℃에서 2시간 동안 75,000xg에서 원심분리에 의해 청정화하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중에 용출하며 상청액으로부터 IL-33을 정제하였다. 용출 단백질을 TEV 프로테아제와 함께 인큐베이션하고 4℃에서 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 내로 투석하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 절단되지 않은 IL-33으로부터 탈-태그화 단백질을 분리하였다. AKTAxpress FPLC 시스템(GE healthcare)을 이용해서 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5, 100 mM NaCl, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 HiLoad 16/60 Superdex 75 컬럼(GE healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IL-33을 추가 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다.
순수한 IL-33을 함유하는 분획을 풀링하고Nanodrop A280 측정에 의해 농도를 측정하였다. Amicon 10,000 분자량 컷-오프 회전 농축장치를 이용해서 NMR 분석을 위해 9.5 mg/ml의 최종 농도까지 단백질을 농축하였다.
PBS pH 7.4 중 정제된 15N 표지 단백질을 37℃에서 18시간 동안 0.28 mg/ml의 최종 단백질 농도로 60% IMDM 배지와 인큐베이션하였다. 18시간 후, Amicon 10,000 분자량 컷-오프 회전 농축장치를 이용해서 0.8 mg/ml의 농도까지 단백질을 농축하였다. 이어서 PBS pH 7.4 중 HiLoad 16/60 Superdex 75를 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제하였다. 피크 분획을 SDS PAGE에 의해 분석하고, 응집되지 않은 순수한 분획을 풀링하였다. 마지막으로 Amicon 10,000 분자량 컷-오프 회전 농축장치를 이용해서 NMR 분석을 위해 1.8 mg/ml(100 μM)의 농도까지 단백질을 농축하였다.
NMR 분석
Z-축 구배로 5 mm TCI Cryoprobe가 장착된 Bruker Avance 600 MHz 분광측정계 수행 Topspin 2.3 상에서 298 K에서 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 15N-표지 IL33 WT 샘플을 5% 중수소 옥사이드를 첨가하여 기재된 바와 같이 제조하여 샘플 잠금(locking)을 허용하였다. (F2xF1) 1024x64 콤플렉스 포인트(상태-TPPI 모드로), 9615x1460 Hz 스윕 폭, 53.4 ms x 43.8 ms 획득 시간으로, sofast HMQC 펄스 시퀀스(Schanda, P; Brutscher , B; Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds, J. Am. Chem . Soc . (2005) 127 , 8014- 5)를 이용해서 예시된 1H-15N 연관 스펙트럼을 획득하였다.
도 22의 A는 IMDM 처리 WT IL33의 SDS PAGE 분석을 나타낸다. NMR을 위한 농축 이전 및 이후 환원 및 비-환원 IMDM 처리 WT IL33을 나타내는 SDS PAGE.
도 22의 B는 WT IL33의 NMR 분석을 나타낸다. 검은색 및 빨간색으로 각각 도식화된 IMDM 배지 처리 이전 및 이후 0.1 mM 15N-표지 IL33 WT에 대한 1H-15N HMQC 스펙트럼 오버레이. 2개 스펙트럼의 비교는 IMDM 처리 이후 완전히 상이하고, 덜 구조화된 구조를 시사한다.
원형 이색성(CD) 분광측정.
입체형태 변화를 확인하고 추가 조사하기 위해, 원형 이색성(CD) 분광측정 분석을 수행하였다.
원-UV 및 근-UV CD 분석을 Jasco-815 기기(Easton, Maryland) 상에서 수행하였다. 원-UV CD를 위해, 완충 용액 10 mM 포스페이트 pH=6.9 중 20℃에서 각각 redIL-33 및 DSB IL-33에 대해 0.14 mg/mL 및 0.12 mg/mL의 샘플 농도에서 1 mm 경로길이 큐벳에서 파장 범위 180~260 nm에 걸쳐 스펙트럼을 기록하였다. 근-UV CD를 위해, 완충 용액 DPBS 중 20℃에서 각각 redIL-33 및 DSB IL-33에 대해 1.38 mg/mL 및 0.89 mg/mL의 샘플 농도에서 10 mm 경로길이 큐벳에서 파장 범위 260~350 nm에 걸쳐 스펙트럼을 기록하였다. 완충 용액의 CD 스펙트럼을 기록하고 기기, 큐벳 및 기준선 효과에 대해 교정하기 위해 모든 샘플 스펙트럼으로부터 감산하였다. 스펙트럼의 이차 구조 요소로의 디콘볼루션을 위해 CD Pro 소프트웨어를 이용하였다.
도 22의 C: 근-UV 원형 이색성(CD) 분광측정. 파장 범위 260~350 nm에 걸쳐 스펙트럼을 기록하였다. 최종 스펙트럼은 4회 스캐닝의 평균이었다. 방향족 아미노산 및 디설파이드 흡수 밴드를 문헌[Kelly S. M. et al. How to study proteins by Circular Dichroism . Biochimica et Biophysica Acta , 1751, 119-139 (2005)]로부터 채택한다. Trp 흡수 주위 타원율에서 관찰된 차이는 단독 트립토판(W193)의 환경 변화와 일치하여, 환원 및 DSB IL-33 간에 상기 영역에서 3차 구조에 대한 변화를 나타낸다. 260 nm 주의에서의 세기 차이는 디설파이드 결합 형성으로부터 추가 발색단 도입과 일치한다.
도 22의 D: IL-33의 중요 특색. 해석된 IL-33 구조 내에서 Trp193, 시스테인 및 ST2 결합 부위( Liu , X. et al. Structural insights into the interaction of IL-33 with its receptors. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 110, 14918-14923 (2013))가 시사된다(Lingel 2009)
도 22의 E: 원-UV 원형 이색성(CD) 분광측정. 파장 범위 190~260 nm에 걸쳐 스펙트럼을 기록하였다. 최종 스펙트럼은 8회 스캐닝의 평균이었다. 원-UV 스펙트럼은 상기 단백질 패밀리에서 이전에 나타난 바와 같이 우세한 β-시트 이차 구조와 일치한다(Chang B. S. et al, Formation of an active dimer during storage of interleukin-1 receptor antagonist in aqueous solution. Biophysical Journal. 71, 3399-3406 (1996); Craig S. et al. Conformation, Stability and folding of Interleukin1β. Biochemistry. 26, 3570-3576 (1987); Hailey K.L . et al. Pro-interleukin (IL)- 1β shares a core region of stability as compared with mature IL- 1β while maintaining a distinctly different configurational landscape. J. Biol . Chem . 284. 26137-26148 (2009); Hazudat D. et al. Purification and characterisation of Human Recombinant Precursor Interleukin 1β. J. Biol . Chem . 264, 1689-1693 (1989); Meyers C.A . et al, Purification and characterization of Human recombinant interleukin - 1β . J. Biol . Chem . 262, 11176-11181 (1987)). 스펙트럼은 크게 상이하여 환원 IL-33 대비 DSB IL-33에서 이차 구조의 변화를 나타낸다.
CD 스펙트럼은 IL-33 형태 간 중대한 입체형태 변화를 시사하였다. redIL-33 스펙트럼은 공개된 데이터와 일치하였다. DSB-IL-33 스펙트럼은 환원된 형태와 상이한 구조화 단백질과 일치하였다. 환원 및 DSB-IL-33 간에 가장 크게 변경될 수 있는 영역을 맵핑하기 위해, 수소/중수소-교환 질량 분광측정을 수행하였다.
수소/중수소-교환 질량 분광측정(HDX-MS).
단백질을 인산염 완충 식염수, pH 7.4 중에 3.5 uM까지 희석하였다. 상기 스톡을 이용해서 중수소화(10 mM 나트륨 포스페이트, pD 6.6) 수성 용매로 10-배 희석함으로써 표지화 실험을 개시하였다. 초기 맵핑 실험을 수행하여 질량 스펙트럼으로부터의 종을 IL33으로부터의 소화 펩타이드 서열로 지정하였다. 이를 대부분 기재된 바와 같이 수행하였다21. 간략하게, 양성자화 희석 단백질을 최종 혼합물 pH가 2.55이도록, 켄칭 용액(100 mM 칼륨 포스페이트, pH 2.55, 0.1 M TCEP, 1℃)과 1:1로 혼합하였다. 켄칭된 단백질을 고정화 펩신 컬럼(2.0x30 mm; Poroszyme, Life Technologies), C18 트랩핑 컬럼(VanGuard ACQUITY BEH 2.1x5 mm; Waters) 및 분석용 C18 컬럼(1.0x100 mm ACQUITY BEH; Waters)을 갖는 Waters HDX Manager 내로 주입하였다. 이동상은 이의 pH가 2.55이도록, H2O 중 0.1% 포름산(A) 및 ACN 중 0.1% 포름산(B)이었다. 단백질을 100 ㎕/분의 완충액 A 중 펩신 및 트랩핑 컬럼으로 적용하고, 40 ㎕/분에서 3~40% B의 선형 구배로 분석용 컬럼으로부터 용출하였다. 펩타이드 서열을 Protein Lynx Global Server(Waters) 3.0.2 및 DynamX 3.0(Waters)으로 MSE 단편 데이터로부터 지정하였다. 질량 분광측정계를 MS 스캐닝 전용으로 설정한 것을 제외하고, 표지화 데이터를 서열분석을 위한 것과 마찬가지로 획득하였다. 펩타이드-수준 데이터를 DynamX and MatLab(Mathworks)에서 분석하였다.
도 23은 환원 및 DSB IL-33의 수소-교환 질량 분광측정(HX-MS) 분석을 나타낸다. 도 23의 A 환원 IL-33(왼쪽 패널) 및 DSB IL-33(오른쪽 패널)에서 분획 수소 교환(중수소에 대한)의 비교. 비교 목적을 위해 두 경우 모두에서 데이터를 공개 IL-33 구조( lingel 2009) 상에 맵핑한다. 데이터 HX-MS 데이터가 수득될 수 없는 서열 커버범위 내의 갭을 회청색으로 강조한다. 시스테인 잔기의 측쇄를 막대로 나타낸다. 도 23의 B는 차별적 HX-MS 데이터에 ST2 결합 부위가 오버레이된 구조 모델(빨간색 및 선홍색)을 나타낸다( Liu 2013). 진청색은 환원 IL-33 대비 DSB IL-33에서의 증가된 수소 교환 영역을 나타낸다. ST2 결합 부위 1은 H/D 교환에서 가장 큰 차이를 갖는 영역에 있으며, 구조 내에서 변형될 수 있었다.
ST2에 대한 환원 대 DSB IL-33의 결합(BIAcore)
디설파이드 결합 IL-33은 환원, ST2-결합 IL-33 형태(도 22, 23)와 매우 상이한 구조일 수 있고, 디설파이드 결합 형태로의 전환은 기능적 활성의 손실과 연관되었다(도 17의 C). 이를 조사하기 위해, IL-33의 디설파이드 결합 형태를 BIAcore 분석에 의해 ST2에 결합하는 능력에 대해 평가하였다. ST2의 세포외 도메인에 대한 IL-33의 직접적 결합을 BIAcore 2000(GE healthcare)를 이용해서 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다. ST2를 CM5 센서 칩(GE healthcare BR-1003-99) 상에서 항-인간 Fc 포획(GE healthcare BR-1003-39)을 이용하여 Fc-태그를 통해 고정화하여 약 150 RU의 안정한 표면을 얻었다. IL-33을 3분 동안 30 ul/분으로 표면에 걸쳐 흘려 연합 속도를 결정하였다. 15분 동안 30 ul/분으로 완충액을 흘려서 해리를 측정하였다. BIAevaluation 소프트웨어를 이용해서 센소그램을 해석하고, 1:1(Langmuir) 결합 모델을 이용한 이중 참조 감산 센소그램을 이용해서 동역학을 결정하였다.
도 24의 A는 ST2에 대한 redIL-33 결합을 나타낸다. 7.8 nM 내지 0.24 nM의 센소그램을 나타내며, 0.2 nM의 KD를 얻었다.
도 24의 B는 ST2에 대한 디설파이드 결합된 IL-33(IL33-DSB) 결합을 나타낸다. 500 nM 내지 0.24 nM의 센소그램을 나타내며, 명확한 결합이 관찰되지 않았다.
ST2 결합 및 활성의 손실은 본 발명자들로 하여금 산화가 IL-33 활성을 종결시키고 생체내 ST2-의존적 면역학적 반응 기간을 제한하는 기전일 수 있다고 가정하게 하였다.
IL-33 형태의 검출
디설파이드-결합 형태의 IL-33이 실제로 생체내 존재하는 것을 확인하기 위해, 3개의 상이한 상업적 IL-33 검출 검정(2개의 인간 IL-33 및 1개의 마우스 IL-33)을 이용하였다. 인간 및 마우스 IL-33 Duoset ELISA(RnD Systems)를 MSD 포맷으로 전환하였다(Meso Scale Discovery, Rockville, MD). 포획 항체의 코팅 농도는 다음과 같았다: 항-마우스 IL-33 pAb 37.5 ug/ml; 항-인간 IL-33 pAb 18 ug/mL. 포획 항체를 0.03% Triton X-100 함유 PBS 중에 희석하고 각 웰의 중심으로 표준 결합 플레이트(Meso Scale Discovery, Rockville, MD) 상에 5 ㎕를 스팟 코팅하고 실온에서 하룻밤 동안 건조하도록 두었다. 플레이트를 PBS-Tween 중에서 3회 세척하고, 플레이트를 밀봉하여 진탕하며(450 rpm) 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 25 ㎕ 검정 희석제로 차단하였다. 25 ㎕의 샘플 또는 검정 희석제 중 희석된 교정인자를 차단 검정 플레이트로 옮기고, 이를 진탕하며(450 rpm) 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween 및 25 ㎕의 검출 시약(둘 다 항체 희석제 중 1 ㎍/ml로 희석된 검출 항체 + 스트렙타비딘 SulfoTag) 중에 3회 세척하였다. 플레이트를 밀봉하여 진탕하며 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween 중에 3회 세척하였다. 증류수 중 2회 희석된 150 ㎕의 판독 완충액 T를 첨가하였다. 플레이트를 15분 내에 판독하였다(Meso Scale Discovery, Rockville, MD).
Millipore 인간 IL-33 검정(Cat #HTH17MAG-14K 로트 2159117)을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, IL-33 표준 및 샘플을 검정 완충액 중에 희석하고 빛으로부터 보호하며, 진탕하며(500 rpm) 실온에서 1시간 동안 비드와 인큐베이션하였다. 웰 내용물을 제거하고 200 ㎕의 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 웰 당 25 ㎕의 검출 항체를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 25 ㎕의 스트렙타비딘-PE를 첨가하고(세척 없이) 플레이트를 진탕하고(850 rpm) 빛으로부터 보호하며 추가 30분 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 웰 내용물을 제거하고 200 ㎕의 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 샘플을 125 ㎕ 검정 완충액 중에 재현탁하고 커버로 덮고 30초 동안 850 rpm에서 진탕하였다. 샘플을 Bio-Plex 200(BioRad) 상에서 분석하였다. 이중선 검출 게이트를 5000(저) 및 25000(고)으로 설정하여 영역 당 50개 비드를 카운팅하며(영역 44), 플레이트를 저 RP1에서 판독하였다.
도 25는 환원 및 디설파이드 결합 IL-33 형태의 검출을 위한 3개의 상업적 IL-33 ELISA 검정의 분석을 나타낸다. 환원 및 디설파이드 결합 형태 모두에 대한 검정 신호의 간섭에 대한 ST2의 효과를 또한 나타낸다. 도 25의 A 및 B는 2개의 상업적 인간 IL-33 검정이 디설파이드-결합 형태의 IL-33(IL33-DSB)을 우선적으로 검출함을 나타내어, 이것이 다른 연구자들이 현재까지 인간 생체외 샘플에서 측정했던 주요 종임을 제시한다. 산화/디설파이드 결합 IL-33 검정 신호가 아닌 '환원'신호가 sST2의 첨가에 의해 제거될 수 있다. 도 25의 C는 환원 및 산화 형태의 마우스 IL-33을 모두 검출하는 마우스 IL-33 검정을 나타낸다. 산화 IL-33 검정 신호가 아닌 '환원'신호는 sST2의 첨가에 의해 제거될 수 있다.
본 발명자들은 환원, ST2-활성 형태의 인간 IL-33에 특이적인 상업적 검정을 확인할 수 없었으므로, 독자적인 신규 검정을 개발하였다. IL330425 mAb(SEQ ID NO. 62 및 67) 또는 IL330004 mAb(SEQ ID NO. 12 및 17)를 포획 항체로 이용하였다. 포획 IL-33을 바이오틴화 sST2.Fc(R&D systems) 또는 바이오틴화 IL330425(SEQ ID NO. 62 및 67)로 각각 검출하였다. 포획 항체를 0.03% Triton X-100 함유 PBS 중에 150 ug/mL까지 희석하고 각 웰의 중심으로 표준 결합 플레이트(Meso Scale Discovery, Rockville, MD) 상에 5 ㎕를 스팟 코팅하고 실온에서 하룻밤 동안 건조하도록 두었다. 플레이트를 PBS-Tween 중에서 3회 세척하고, 플레이트를 밀봉하여 진탕하며(450 rpm) 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 25 ㎕ 검정 희석제로 차단하였다. 25 ㎕의 샘플 또는 검정 희석제 중 희석된 교정인자를 차단 검정 플레이트로 옮기고, 이를 진탕하며(450 rpm) 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween 및 25 ㎕의 검출 시약(둘 다 항체 희석제 중 1 ㎍/ml로 희석된 검출 항체 + 스트렙타비딘 SulfoTag) 중에 3회 세척하였다. 플레이트를 밀봉하고 진탕하며 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-Tween 중에 3회 세척하였다. 증류수 중 2회 희석된 150 ㎕의 판독 완충액 T를 첨가하였다. 플레이트를 15분 내에 판독하였다(Meso Scale Discovery, Rockville, MD).
도 26의 A, B는 환원 IL-33의 검출에 특이적인 ELISA 검정을 나타낸다. 디설파이드 결합 형태의 검출은 관찰되지 않는다.
디설파이드 결합 형태 IL-33으로의 전환 시간 경과
상술된 바와 같은 상이한 IL-33 형태를 검출하는 검정을 이용해서 redIL-33으로부터 그 디설파이드 결합 형태로의 전환의 시간 경과를 모니터링하였다. 10 ug/mL의 탈태그화 redIL-33을 37℃에서 100% 인간 혈청, PBS/1% BSA 또는 IMDM/1% BSA 중에 인큐베이션하였다. 시점 t=0, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간에, 10 ㎕의 분취물을 제거하여 90 ul PBS/1% BSA에 첨가하고(1 ug/ml까지 1/10 희석), 이를 3 x 30 ul 분취물로 분할하고 드라이 아이스 상에서 급속 냉동한 뒤 -80℃에서 보관하였다. t=0에 샘플을 또한 냉동/해동 사이클을 위한 대조군으로서 ELISA 분석 직전에 신선 제조하였다. 디설파이드 결합 및 환원 IL-33을 각각 측정하기 위해 상술된 인간 MSD(R&D Systems) 및 IL33004/IL330425-바이오틴 검정을 이용해서 샘플을 분석하였다. 함께, 이들 검정은 환원 형태에서 디설파이드-결합 형태의 IL-33으로의 전환의 모니터링을 허용하였다.
ELISA로부터의 결과를 확인하기 위해, 시간 경과 샘플 내의 IL-33을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 샘플로 환원성 또는 비-환원성 조건 하에 SDS-PAGE를 거쳤다. 샘플을 1xNuPAGE 겔 로딩 완충액(Invitrogen) 중에 제조하고 3분 동안 90℃에서 변성시켰다. 환원 샘플은 2% 베타-메르캅토에탄올을 함유하였다. 제조업체의 지침에 따라 MOPS 진행 완충액(Invitrogen)으로 NuPAGE Novex 12% Bis-Tris 미니 겔(Invitrogen) 상에서 샘플을 진행시켰다. 환원 및 비-환원 샘플을 별도 겔 상에서 진행시켰다. 레인 당 100 pg의 IL-33을 로딩하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막(Invitrogen cat. no. IB3010-02)으로 옮기고 항-IL-33 pAb(R&D systems)로 웨스턴 블로팅에 의해 검출하였다.
도 27은 IMDM 또는 인간 혈청 중 인큐베이션된 인간 IL-33의 시간 경과를 나타낸다. 도 27의 A: IL-33 ELISA(IL33004/IL330425-바이오틴 및 인간 R&D systems MSD 검정)를 이용해서 환원 및 디설파이드 결합 IL-33을 각각 검출하였다. 도 27의 B: 웨스턴 블롯 분석을 이용해서 환원 및 디설파이드 결합 IL-33 형태를 검출하였다. 디설파이드 결합 형태의 IL-33으로의 전환은 1~2시간 내에 50% 전환되며 신속히 일어났다. 환원 IL-33의 소실은 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석 모두에서 산화 IL-33의 출현과 잘 연관되었다.
인간화 IL-33 트랜스제닉 마우스의 생성
내인성 IL-33의 거동 및 수명을 연구하기 위해, 마우스 IL-33에 대한 유전자가 인간 IL-33 유전자로 대체된 트랜스제닉 마우스를 이용하였다. 인간화 IL-33 트랜스제닉 마우스를 후술된 바와 같이 생성하였다. 간략하게, 마우스 게놈 단편(C57BL/6J RPCIB-731 BAC 라이브러리로부터 수득), 인간 게놈 단편(인간 RPCIB-753 BAC 라이브러리로부터 수득) 및 선택된 특색(예컨대 재조합 부위 및 선택 마커)을 조합하여 표적화 벡터를 제조하였다(데이터는 나타내지 않음).
표적화 벡터를 BstBI로 선형화하고 TaconicArtemis Balb/cJ ES 세포주(Balb/c.2) 내로 전기천공하고 ES 세포 클론을 퓨로마이신(양성 선택) 및 갱사이클로비어(음성 선택)로 선택하였다. 이어서 생성 퓨로마이신-내성 ES 세포 클론을 PCR 및 서던 분석의 조합에 의해 스크리닝하여 정확히 표적화된 ES 클론을 확인하였다. 이들을 증식시키고 액체 질소 중에 냉동하였다.
호르몬 투여 후, 과배란 C57BL/6 암컷을 C57BL/6 수컷과 짝짓기시켰다. dpc 3.5에 자궁으로부터 포배를 단리하였다. 마이크로주사를 위해, 미네랄 오일 하에 15% FCS 함유 DMEM 액적에 포배를 두었다. 12~15마이크로미터의 내경을 갖는 평탄 팁, 압전 구동 마이크로주사-피펫을 이용하여 각각의 포배 내로 10~15개의 표적화 BALB/c ES 세포를 주사하였다. 회수 후, 8개의 주사 포배를 짝짓기 2.5일 후 가임신 NMRI 암컷의 각각의 자궁 뿔로 옮겼다. C57BL/6 숙주에 대한 ES 세포의 코트 색상 기여(흰색/검은색)에 의해 키메라(G0)에서 키메라 현상을 측정하였다. 고도 키메라성 마우스를 Flp 재조합효소 유전자(Flp-Deleter 계통)의 존재에 대해 계통 BALB/cJBomTac 암컷 돌연변이체와 교배하였다. 코트 색상에 의해 생식계열 전달을 흰색, 계통 BALB/c, 후손(G1)의 존재에 의해 확인하였다. 표적화 대립유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 유전형 분석에 의해 실제 생식계열 전달을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
생체내 IL-33의 산화환원 형태의 존재.
마우스에서 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) 유도 기도 염증 모델이 이전에 설명되었다(Kouzaki et al. J. Immunol . 2011, 186: 4375 -4387; Bartemes et al J Immunol , 2012, 188: 1503 -1513). 수컷 또는 암컷 야생형 또는 인간화 IL-33 마우스(6~10주)를 이소플루란으로 잠시 마취하고 총 부피 50 ㎕ 중 25 ㎍의 알터나리아 알터나타(ALT) 추출물(Greer, Lenoir, NC) 또는 비히클을 비내 투여하였다. ALT 유발접종 후 여러 시점에, 마우스를 펜토바르비탈 나트륨으로 최종 마취한 뒤 기관지폐포 세척(BAL)하였다. 기관지폐포 세척액(BALF)을 경기관 캐뉼라를 통해 세척에 의해 수집하였다(0.3 ml, 0.3 ml 및 0.4 ml). BALF를 원심분리하고 상청액을 상술된 검정을 이용해서 산화환원 형태의 IL-33의 존재에 대해 분석하였다. 모든 작업을 적절한 프로젝트 승인 권한 하의 UK 본사 윤리 및 사육 표준에 따라 수행하였다.
도 28은 여러 ELISA 검정의 조합을 이용하여, ALT 비내 유발접종 후 다양한 시점에 수집된 인간화 IL-33 마우스로부터의 BALF 분석을 나타낸다. (A) Millipore, (B) R&D systems 및 (C) IL330425/sST2-바이오틴 검정을 이용하여 sST2의 존재 또는 부재 하에 IL-33을 측정하였다(왼쪽 그래프). sST2의 존재 하 신호(환원 IL-33 분획으로부터의 신호가 제거됨)를 디설파이드 결합 IL-33 표준과 비교하여 디설파이드 결합 IL-33의 수준을 정량하였다. 환원 IL-33 신호는 ST2의 존재 및 부재 하 IL-33 측정 간 신호에서의 차이로 계산되었으며, 환원 IL-33 표준에 대비하여 정량되었다. 환원 IL-33에 대한 산정은 오른쪽 그래프에 나타낸다. 모든 검정은 방출 IL-33이 우선적으로 그 환원 형태로 5 내지 30분에 최대로, 이어서 급격히 감소하여 120분 경에는 검출 불가능해짐을 나타낸다. 반대로, IL-33-DSB는 시점 0으로부터 점차 증가하여, 30~120분에 피크를 형성하고 24시간 경에 소실된다. 이들 데이터는 IL-33이 환원 형태로 방출된 후 생체내에서 IL33-DSB로 급격히 산화되는 모델과 일치한다.
도 29는 ALT 비내 유발접종 후 다양한 시점에 수집된 야생형 BALB/c 마우스로부터의 BALF 분석을 나타낸다. 도 29의 A 마우스 IL-33 ELISA(R&D systems)를 이용하여 sST2의 존재 또는 부재 하에 IL-33을 측정하였다(배지-처리 마우스 IL-33이 표준 곡선으로 이용됨). 도 29의 B sST2의 존재 하 신호(환원 IL-33 분획으로부터의 신호가 제거됨)를 배지-처리 마우스 IL-33 표준과 비교하여 산화 IL-33의 수준을 정량하였다. 환원 IL-33 신호는 ST2의 존재 및 부재 하 IL-33 측정 간 신호에서의 차이로 계산되었으며, 환원 마우스 IL-33 표준에 대비하여 정량되었다. 데이터는 방출 IL-33이 우선적으로 그 환원 형태로, 15분에 피크를 형성한 뒤 급속히 감소되어 120분 경에 검출 불가능해짐을 나타낸다. 반대로, IL-33-DSB는 시점 0으로부터 점차 증가하여, 45~60분에 피크를 형성하고 24시간 경에 소실된다. 이들 데이터는 IL-33이 환원 형태로 방출된 후 생체내에서 IL33-DSB로 급속히 산화되는 모델과 일치한다.
실시예 5 항-IL-33 항체의 특성규명
H338L293은 입체형태 변화를 유도함
그 생성이 실시예 2 및 3에 기재된 모노클로날 항체 H338L293(SEQ ID NO 182 및 187)은 IL-33의 알로스테리 조정인자이다. IL-33은 입체형태를 디설파이드 결합 형태로 유의미하게 변화시킬 수 있다(실시예 4에 기재된 바와 같음). 하기 실험은 H338L293 mAb가 IL-33 분자를 탈안정화하여, 그 비-폴딩을 촉진하고 디설파이드 결합 형태로의 전환을 가속화하는 것으로 나타난다. 본원에서 이용되는 시약 및 단백질 변형은 앞 실시예에 기재된 바와 같았다.
Sypro orange 검정
Sypro orange는 소수성 표면에 비특이적으로 결합하며, 물은 Sypro Orange의 형광을 강력히 켄칭한다. 단백질이 비-폴딩되면, 노출된 소수성 표면이 염료에 결합하여 형광 증가를 일으킨다. 5 uM의 항체를 1xDPBS 중 5000x스톡(Life technologies S-6650)으로부터 희석된 8xSYPRO orange 염료의 존재 하에 25℃에서 20 uM redIL-33과 인큐베이션하였다. Chromo4 Real Time 검출장치(Bio-rad)를 이용해서 형광(여기 490 nm 및 방출 575 nm)을 매분마다 측정하였다. 본 발명자들은 redIL-33이나 항체 단독이 아니라 redIL-33과 H338L293 항체의 인큐베이션으로 단백질 비-폴딩을 시사하는 형광 신호가 증가함을 관찰하였다.
도 30의 A는 8xSYPRO 오렌지 염료의 존재 하에 25℃에서 20 uM redIL33과 함께 5 uM 항체의 인큐베이션 100분 후의 상대 형광 단위를 나타낸다. IL330004 또는 대조군 mAb가 아닌 redIL-33 H338L293의 존재 하에, 단백질 비-폴딩을 시사하는 형광 신호가 증가한다.
도 30의 B는 8xSYPRO 오렌지 염료의 존재 하에 25℃에서 20 uM redIL33과 함께 다양한 농도의 H338L293의 인큐베이션 후 경시적인 상대 형광 단위를 나타낸다. 형광 신호는 항체 농도 증가와 함께 증가하였다.
SDS-PAGE 전기영동
H338L293이 IL-33의 디설파이드 결합에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해, 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 분석을 비교함으로써 IL-33을 H338L293의 존재 하에 모니터링하였다. 100 ug/ml 재조합 인간 IL-33112-270(BK349)을 1.5 mg/ml H338L293 mAb, NIP228 mAb를 함유하거나 mAb가 첨가되지 않은 PBS/0.1% BSA 중에 인큐베이션하였다. 샘플을 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 20 h 동안 인큐베이션하였다. 1 ug의 IL-33 함유 샘플을 환원성 및 비-환원성 조건 하에 Novex 12% Bis-Tris 미니 NuPAGE 겔(Invitrogen) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. SDS-PAGE 후 겔을 ddH20 중에 3 x 5분 세척하고, 1 h 동안 EzBlue(Sigma G1041, coomassie brilliant blue G-250 기반 단백질 염색) 중에 인큐베이션하고, 겔의 배경이 깨끗해질 때까지 ddH20 중에 탈염색하였다. 모든 겔 염색 단계를 로킹(rocking) 플랫폼 상에서 실온에서 수행하였다. 겔을 Epsom 디지털 스캐너를 이용해서 가시화하였다.
도 30의 C는 IL-33의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 대조군 mAb 또는 mAb 비함유가 아닌 H338L293과 IL-33의 사전인큐베이션은 비-환원성 조건 하에 더 빠르게 이동하는, 디설파이드 결합 형태의 IL-33의 존재를 증가시켰다.
IgG에 의한 Huvec에서의 NFkB 신호전달의 억제
IL-33에 반응한 인간 탯줄 정맥 내피 세포에서의 NFkB 신호전달을 실시예 1에 기재된 바와 같은 면역형광 염색에 의해 검출된, p65/RelA NFkB 서브유닛의 핵 전위에 의해 평가하였다. 세포를 30분 또는 6시간 동안 여러 농도의 평가 항체 H338L293의 존재 하에 가변 IL-33 농도로 자극하였다.
도 31은 HUVEC 상에서 IL-33 자극 NFkB 전위에 대한 H338L293의 효과를 나타낸다. 이들 결과는 이전에 나타낸 바와 같이, H338L293이 자극 30분 후 IL-33-자극 Huvec에서 p65/RelA NFkB의 핵 전위를 억제하지 않았음을 나타낸다. 그러나 6시간 후, 억제가 나타난다. 결과는 H338L293이 ST2에 대한 IL-33 결합을 직접 억제하지 못하지만 수 시간 내에 IL-33을 비-ST2 결합 형태로 전환하는 능력과 일치한다.
정제 IgG에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
H338L293이 ST2 수용체로의 FLAG®His 태그화 IL-33의 결합을 억제하는 능력을 실시예 1에 기재된 바와 같이 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다. 2가지 조건을 평가하였다. 먼저 항체 및 IL-33을 정확히 실시예 1에서와 같이 검정에 동시 첨가하였다. 이전에서와 같이, 정제 IgG 조제물은 평가 농도에서 IL-33:ST2 상호작용을 억제할 수 없었다. 두 번째로, H338L293을 검정에 대한 첨가 18시간 전에 IL-33FLAG®His와 사전 인큐베이션하였다. 상기 경우, IL-33:ST2 결합의 농도-의존적 억제를 관찰하였다. 함께 종합하면, 이들 데이터는 H338L293이 경시적으로 IL-33을 비-ST2 결합 형태로 전환하는 것과 일치한다.
도 32는 증가하는 농도의 H338L293으로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다. 이들 결과는 H338L293이 리간드와의 연장된 사전-인큐베이션 후에만 ST2에 대한 IL-33 결합을 억제함을 나타낸다.
에피토프 맵핑
H338L293 IgG에 대한 IL-33 결합 방식을 명확히 하기 위해, 이 IgG의 에피토프 맵핑을 시도하였다. IL-33:IgG 복합체의 형성을 관찰하기 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 실험을 수행하였다. BioSep-SES-S 2000 컬럼(300 x 7.4 mm, s/n 550331-4)을 Agilent HP1100 HPLC 상에서 0.5 mL/분으로 Dulbecco의 PBS로 평형화하였다. 다이오드 어레이 검출장치(DAD)로부터의 280 nm 신호를 이용해서 피크를 검출하였다. 이들 연구는 항체-항원 복합체 형성이 적어도 수 시간이 걸리는 명확히 느린 것임을 확인시켜 주었다. 완전 복합체 형성을 위한 충분한 시간이 허용되면, 사전-형성된 IL-33:IgG 복합체에 트립신을 첨가한 뒤 SEC 분석하였다. 36분 트립신 소화는 주 피크의 체류 시간을 14.1분까지 증가시켰다(미처리 복합 피크 용출 시간(13.6분) 및 온전한 H338L292 IgG 용출(14.4분) 간 중간). 이어서 질량 분광측정 방법을 이용해서 최소 H338L293 IgG 에피토프를 확인하였다. 포획 14.1분 피크로부터의 Shimadzu MALDI-TOF MS 관찰 질량은 3,209 및 4,485.3 Da이었다. ABI4800 MALDI-TOF MS 관찰 질량은 고 강도로 3,208.9 Da 피크였고, 이차적인 4,486.4 Da 피크도 존재하였다. 3206~3208 Da의 관찰된 전구체 이온 질량 및 3,206 Da 전구체 이온의 ABI4800 MS/MS 단편화 분석은 예측되는 트립신 분해 IL-33 단편 MLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHK과 매칭되었다. 이는 아래 나타낸 바와 같은 r 인간 IL-33-Flag His10(SEQ ID NO. 627)의 전반적 일차 서열 내에 놓인다:-
Figure pct00043
이어서 절단물(LSPTKDFWLHANNKEHSVELHK)과 함께 확인된 펩타이드 및 둘 다의 스크램블된 변이체를 화학적으로 합성하고 확인용 T100 Biacore(GE Healthcare) 결합 연구에서 이용하였다. 단백질 G'(Sigma Aldrich, P4689)을 제조업체의 지침에 따라 표준 아민 커플링 시약을 이용해서 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 표면으로 공유 커플링하였다. 단백질 G'표면을 Fc 도메인을 통해 H338L293 또는 ST2-Fc를 포획하기 위해 이용하여 사이클 당 약 290 RU의 표면 밀도를 제공하였다. 일정 범위의 농도에서 HBS-EP+ 완충액 중 제조된 IL33 펩타이드를 센서 칩 표면에 걸쳐 통과시켰다. 항체 각각의 주입 간에 pH 1.7 및 pH 1.5의 2회의 10 mM 글리신 세척을 이용해서 표면을 재생시켰다. Biacore T100 평가 소프트웨어 2.0.3(GE Healthcare)를 이용해서 생성 센소그램을 평가하고 1:1 Langmuir 결합 모델로 피팅시켜, 상대 결합 데이터를 제공하였다.
전장 합성 에피토프 펩타이드는 H338L293 IgG에 강력히 결합했지만 IL-33 수용체(ST2-Fc)에는 결합하지 않았다. 전장 및 절단된 합성 펩타이드는 둘 다 H338L293에 강력히 결합했지만, 스크램블된 전장 및 절단된 버전은 결합하지 않았다. 이는 펩타이드 절제에 의해 확인된 IL-33 단편이 인공물이 아니며 H338L293 에피토프의 코어를 나타낸다는 강력한 증거이다. 0.625~20 nM의 절단된 펩타이드를 H338L293 IgG에 걸쳐 흘려 친화도를 산정하였다. 우수한 품질의 1:1 피팅이 수득되어 2.36 nM의 KD값을 얻었다.
도 33은 H338L293의 에피토프 맵핑을 나타낸다. 상부 패널은 트립신으로의 소화 이전 및 이후 H338L293과 IL33:IgG 복합체의 SEC 분석을 나타낸다. 하부 패널은 문헌[Lingel et al 2009]에 의해 기재된 IL-33 구조 내에서 검은색으로 나타낸 H338L293에 강하게 결합하는 것으로 결정된 절단물 펩타이드를 나타낸다.
실시예 6 Cys→Ser IL-33 돌연변이체
디설파이드 결합 형태로의 그 전환에서 인간 IL-33의 4개 자유 시스테인의 역할을 이해하기 위해, 모든 가능한 Cys-에서-Ser으로의 돌연변이체의 전체 패널을 생성하였다. 대부분의 이들 돌연변이체 IL-33 분자는 야생형 IL-33 대비 ST2를 통해 유사한 초기 활성을 나타내었다. 배지 중 인큐베이션 후, 돌연변이체는 2개의 디설파이드 결합을 형성하는 능력의 부재와 일치하게, 더 빠른 겔 이동을 나타내지 않았다. 그러나, 배지 처리 후 역가 손실은 돌연변이체 별로 달랐다.
IL-33 시스테인의 세린으로의 돌연변이체 패널의 생성
인간 IL-33(112-270)의 성숙 성분을 인코딩하는 cDNA 분자; 접근 번호(Swiss-Prot) O95760 및 1, 2, 3 또는 4개의 시스테인 잔기가 세린으로 돌연변이된 일련의 변이체의 모든 조합(총 15개)을 프라이머 연장 PCR에 의해 합성하고 pJexpress404(DNA 2.0) 내로 클로닝하였다. 단백질의 N-말단에 10xhis, Avitag 및 인자-Xa 프로테아제 절단 부위(MHHHHHHHHHHAAGLNDIFEAQKIEWHEAAIEGR)를 함유하도록 야생형(WT) 및 돌연변이체 IL-33 코딩 서열을 변형하였다.
IL-33 돌연변이체를 인코딩하는 DNA를 이용해서 이.콜라이 BL21 Gold 세포를 형질전환하였다. 형질전환된 세포가 0.3 내지 0.5의 OD600nm에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 이어서 배양을 18℃에서 0.6 내지 0.8의 OD600nm에 도달할 때까지 성장시키고, 이 때 100 mM IPTG의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 배양을 추가 20시간 동안 18℃에서 계속한 뒤 세포를 원심분리에 의해 수확하고 -80℃에서 보관하였다.
세포를 완전 프로테아제 억제제 정제(Roche, 11697498001), 2.5 u/ml Benzonase 뉴클레아제(merck Millipore, 70746-3) 및 1 mg/ml 재조합 라이소자임을 함유하는 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중에 재현탁하였다. 재현탁 세포를 25 kpsi에서 Constant Systems 세포 분쇄장치를 이용해서 용해시키고 4℃에서 2시간 동안 75,000xg에서 원심분리에 의해 청정화하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올로 용출하며 IL33을 상청액으로부터 정제하였다. 인산염 완충 식염수 pH 7.4 중 Superdex 75 10/300 GL 컬럼(Ge Healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IL33을 추가 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 IL33을 함유하는 분획을 풀링하고Nanodrop A280 측정에 의해 농도를 측정하였다. 최종 샘플을 SDS PAGE 및 온전한 질량 분광측정에 의해 분석하였다. 단백질을 액체 질소 중에 급속 냉동하였다.
[표 17]
Figure pct00044
IL-33 Cys → Ser 돌연변이체의 활성
단백질 온전성을 확인하기 위해, 미처리 야생형 IL-33(IL33-01) 및 IL-33 돌연변이체의 활성을 ST2-의존적 신호전달 검정에서 측정하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역형광 염색에 의해 검출되는 p65/RelA NFkB 서브유닛의 핵 전위에 의해 IL-33에 반응한 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Huvec)에서의 NFκB 신호전달을 평가하였다. 세포 배양 배지 처리 후 활성 손실을 조사하기 위해, IL-33 단백질 01-16을 Iscoves Modified Dulbeccos 배지(IMDM) 중에 하룻밤 동안 인큐베이션하고 미처리 단백질 대비 평가하였다.
[표 18]
Figure pct00045
도 34는 IMDM을 이용한 18시간 동안의 처리 이전 및 이후 IL-33 돌연변이체의 활성을 나타낸다. 배양 배지로 사전 처리된 야생형 IL-33(IL33-01)은 검출 가능한 활성을 완전 소실하였다. 모든 돌연변이체는 WT에 비해 적은 역가 손실을 나타내었다. 일부 돌연변이체는 역가 손실로부터 완전 보호되었다.
인간 비만 세포 사이토카인 방출
돌연변이체가 시험관내에서 더 긴 시점에 하류 반응을 자극하는 데 있어서 더 강력한지를 확인하기 위해, 하룻밤 동안의 비만 세포 IL-6 생성 검정을 이용해서 인간 IL-33 야생형 및 선택된 돌연변이체의 활성을 측정하였다. 검정 방법은 실시예 2에 기재된다. 데이터는 IL33-11에 의해 예시된다.
도 35의 A는 IL33-11이 인간 비만 세포 IL-6 생성의 자극에서 IL-33 WT에 비해 더 큰 역가를 가짐을 나타낸다. 사전 처리 없이 IL33-01(WT) 및 IL33-11을 이용해서 다양한 농도로 인간 탯줄 혈액 유래 비만 세포로부터의 IL-6 생성을 자극하였으며, 여기서 x-축은 몰 농도로 IL-33의 농도이며 y-축은 18시간 후 상청액 중 검출된 IL-6의 수준이다.
돌연변이체 IL-33의 생체내 역가
암컷 BALB/c 마우스(6~8주)를 이소플루란으로 짧게 마취하고 총 부피 50 ㎕로 0.1~10 ug의 야생형 인간 IL-33(IL33-01, SEQ ID NO: 632), IL33-11(SEQ ID NO: 643) 또는 비히클을 비내 투여하였다. 유발접종 24시간 후, 마우스를 펜토바르비탈 나트륨으로 최종 마취한 뒤 기관지폐포 세척(BAL)하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 BALF를 수집하고 분석하였다.
도 35의 B는 IL33-11 이중 돌연변이체의 비내 투여가 원상태 IL-33 대비 동등한 ST2-의존적 IL-5 반응을 위해 단지 1/10만큼의 단백질을 필요로 했음을 나타낸다. 이는 마우스 폐 환경에서 야생형 IL-33의 보다 신속한 비활성화와 대비되는 돌연변이체의 연장된 활성과 일치한다.
IL33-11의 NMR 분석
IL33-11 및 야생형 인간 IL-33 단백질(IL33-01) 간 입체형태 차이를 조사하기 위해, NMR 분석을 수행하였다.
15 N-IL-33 단백질의 생성
N-말단 6His 태그 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 갖는 야생형 IL-33을 인코딩하는 DNA(SEQ ID. 633)를 이용해서 이. 콜라이 BL21 Gold 세포를 형질전환하였다. 형질전환 세포를 5 g/L의 15N-IsoGro™ 분말이 보충된 M9 최소 배지 중 37에서 이들이 0.6 내지 0.8의 OD600nm에 도달할 때까지 배양하고, 이 때 100 mM IPTG의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도하였다. 배양을 추가 20시간 동안 18℃에서 계속한 뒤 세포를 원심분리에 의해 수확하고 -80℃에서 보관하였다. 세포를 완전 프로테아제 억제제 정제(Roche, 11697498001), 2.5 U/ml Benzonase 뉴클레아제(merck Millipore, 70746-3) 및 1 mg/ml 재조합 라이소자임을 함유하는 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중에 재현탁하였다. 재현탁 세포를 25 kpsi에서 Constant Systems 세포 분쇄장치를 이용해서 용해시키고 4℃에서 2시간 동안 75,000xg에서 원심분리에 의해 청정화하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중에 용출하며 상청액으로부터 IL-33을 정제하였다. 용출 단백질을 TEV 프로테아제와 함께 인큐베이션하고 4℃에서 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 내로 투석하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 절단되지 않은 IL-33으로부터 탈-태그화 단백질을 분리하였다. AKTAxpress FPLC 시스템(GE healthcare)을 이용해서 20 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.5, 100 mM NaCl, 5 mM 베타메르캅토에탄올 중 HiLoad 16/60 Superdex 75 컬럼(GE healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IL-33을 추가 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 IL-33을 함유하는 분획을 풀링하고Nanodrop A280 측정에 의해 농도를 측정하였다. Amicon 10,000 분자량 컷-오프 회전 농축장치를 이용해서 NMR 분석을 위해 1.8 mg/ml(100 μM)의 최종 농도까지 단백질을 농축하였다.
NMR 분석
Z-축 구배로 5 mm TCI Cryoprobe가 장착된 Bruker Avance 600 MHz 분광측정계 수행 Topspin 2.3 상에서 298 K에서 NMR 스펙트럼을 기록하였다. 15N-표지 IL33 WT 샘플을 5% 중수소 옥사이드를 첨가하며 기재된 바와 같이 제조하여 샘플 잠금(locking)을 허용하였다. (F2xF1) 1024x64 콤플렉스 포인트(상태-TPPI 모드로), 9615x1460 Hz 스윕 폭, 53.4 ms x 43.8 ms 획득 시간으로, sofast HMQC 펄스 시퀀스(Schanda, P; Brutscher , B; Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds, J. Am. Chem . Soc . (2005) 127 , 8014- 5)를 이용해서 예시된 1H-15N 연관 스펙트럼을 획득하였다.
도 36은 검은색 및 빨간색으로 각각 도식화된 0.1 mM 15N-표지 IL33-01 및 IL33-11에 대한 1H-15N HMQC 스펙트럼의 오버레이를 나타낸다. 관련 잔기에 대한 지정을 나타낸다. 데이터는 예상되는 C208 및 C259 근처의 피크 이동을 나타낸다. 그러나, 입체형태 변화를 시사할 수 있는 T185에서 A196으로의 예상보다 더욱 더 큰 피크 이동이 존재한다.
실시예 7 IL33-11을 이용한 항-IL-33 항체의 단리 및 확인
Cys→Ser 돌연변이체 IL-33 단백질은 IL-33을 그 환원 형태로 안정화하며 야생형과 상이한 입체형태를 갖는다(실시예 6에 기재된 바와 같음). 돌연변이체 단백질은 상이한 항체 에피토프의 이용 가능성 또는 더 큰 에피토프 수명/안정성을 제공할 수 있고 이에 따라 중화 IL-33 항체, 특히 환원 형태의 IL-33의 단리에 유용할 수 있다. 본 실시예는 산화-내성 돌연변이체 IL33-11 단백질을 이용하여 파지 디스플레이에 의해 IL-33 항체를 단리한다.
재조합 단백질
N-말단 태그화 His10/Avitag IL33-01(WT, SEQ ID NO. 632), N-말단 태그화 His10/Avitag IL33-11(C208S, C259S, SEQ ID 643) 및 N-말단 태그화 His10/Avitag cyno IL-33(SEQ ID 649)을 이.콜라이 BL21(DE3) 세포의 형질전환에 의해 생성하였다. 형질전환 세포를 18시간 동안 37℃에서 자동유도 배지(Overnight Express™ Autoinduction System 1, Merck Millipore, 71300-4) 중에 배양한 뒤 원심분리에 의해 세포를 수확하고 -20에서 보관하였다. 완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche, 11697498001), 2.5 u/ml Benzonase 뉴클레아제(merck Millipore, 70746-3) 및 1 mg/ml 재조합 라이소자임을 함유하는 BugBuster(Merck Millipore, 70921-5) 중에 세포를 재현탁하였다. 4℃에서 2시간 동안 75,000 xg에서 원심분리에 의해 세포 용해물을 청정화하였다. 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 중 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸로 용출하며 상청액으로부터 IL-33 단백질을 정제하였다. 인산염 완충 식염수 pH 7.4 중 Superdex 75 10/300 GL 컬럼을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IL-33을 추가 정제하였다. SDS PAGE에 의해 피크 분획을 분석하였다. 순수한 IL-33을 함유하는 분획을 풀링하고Nanodrop A280 측정에 의해 농도를 측정하였다. SDS PAGE에 의해 최종 샘플을 분석하였다.
실시예 1에 기재된 인간 ST2 벡터를 C-말단 Flag-His 태그(SEQ ID NO 650)를 갖는 인간 ST2 ECD를 함유하도록 변형하였다.
[표 19]
Figure pct00046
단백질 변형
Avitag 서열 모티프(GLNDIFEAQKIEWHE)를 함유하는 단백질을 제조업체의 프로토콜에 따라 바이오틴 리가제(BirA) 효소(Avidty, Bulk BirA)를 이용해서 바이오틴화하였다. 본원에서 이용되는 Avitag가 없는 모든 IgG 및 변형 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 EZ 링크 설포-NHS-LC-바이오틴(Thermo/Pierce, 21335)을 이용해서 자유 아민을 통해 바이오틴화하였다.
선택
본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이, 그러나 IL33-11 C208S, C259S 돌연변이체 단백질을 이용하여 선택을 수행하였다. 간략하게, scFv-파지 입자를 용액 중 바이오틴화 재조합 IL-33-11과 인큐베이션하였다(Avi 태그를 통해 바이오틴화). 입자를 2시간 동안 100 nM 바이오틴화 재조합 IL33-11과 인큐베이션하였다. 이어서 항원에 결합된 ScFv를 제조업체의 권장사항에 따라 스트렙타비딘-코팅 상자성 비드(Dynabeads®, M-280) 상에 포획하였다. 미결합 파지를 PBS-Tween을 이용하여 일련의 세척 사이클로 세척 제거하였다. 항원 상에 보유된 파지 입자를 용출하고, 박테리아 내로 감염시키고, 다음 회의 선택을 위해 구제하였다. 감소하는 농도의 바이오틴화 IL33-11(50 nM 및 25 nM)의 존재 하에 2회 더 선택을 수행하였다.
미정제 scFv에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
상술된 2 또는 3회 선택 후 선택 산출물로부터 대표적 수의 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 박테리아 원형질막 주위공간에서 발현시키고(Kipriyanov, et al. J Immunol Methods 200(1-2): 69-77 (1997)) 균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:ST2-결합 검정에서 이의 억제 활성에 대해 스크리닝하였다. 본질적으로 방법은 실시예 1에 기재된 것들과 유사하였다. 상기 검정에서, 샘플은 바이오틴화 인간 IL33-01(IL33-01, SEQ ID No. 632)(야생형) 또는 바이오틴화 인간 IL33-11(IL33-11, SEQ ID No. 643)로의 결합에 대해 FLAG®His-태그화 인간 ST2와 경쟁하였다.
5㎕의 각각의 항체 평가 샘플의 희석물을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 첨가함으로써 FLAG®-His 태그화 ST2에 대한 바이오틴화 IL-33 결합의 억제에 대해 미정제 항-IL-33 항체 샘플을 평가하였다. 다음으로, 4 nM 인간 FLAG®-His 태그화 ST2 및 5 nM 항-FLAG® XL665 검출(Cisbio International, 61FG2XLB) 함유 용액을 제조하고 2.5㎕의 혼합물을 검정 플레이트에 첨가하였다. 여기에 1.5 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 2.4 nM 바이오틴화 인간 IL33-01 또는 IL33-11을 함유하는 용액 2.5㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 플레이트를 섭씨 4도에서 추가 16시간(하룻밤) 동안 인큐베이션하고 다시 시간차 형광을 판독하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 인간 IL33-01 또는 IL33-11을 스트렙타비딘 크립테이트 검출 단독으로 대체하여 정의되었다. 데이터를 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석하였다.
정제 scFv에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
두 시점에 모두 미정제 원형질막 주위공간 추출물로서 IL-33:ST2 상호작용에 대해 억제 효과를 나타낸 단일쇄 Fv 클론으로 DNA 서열분석을 거쳤다(Osbourn , et al. Immunotechnology 2(3):181-96 (1996); Vaughan, et al. Nat Biotechnol 14(3):309-14 (1996)). 고유한 scFv를 다시 박테리아에서 발현시키고 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다(WO01/66754에 나타낸 바와 같음). 상술된 바와 같이 바이오틴화 IL33-01 또는 바이오틴화 IL33-11로의 결합에 대해 FLAG®His-태그화 인간 ST2 대비 정제 조제물의 희석 시리즈를 경쟁시켜서 이들 샘플의 역가를 결정하였다. 검정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하거나(1시간 인큐베이션), 검정 플레이트를 실온에서 1시간에 이어 섭씨 4도에서 16시간 동안 인큐베이션하였다(하룻밤 인큐베이션). 두 시점에서 모두 IL-33:ST2 상호작용을 억제할 수 있는 정제 scFv 조제물을 IgG 포맷으로의 전환을 위해 선택하였다.
도 37의 A: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 33v20064로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성된 1시간 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 37의 B: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 33v20064로 인간 ST2에 대한 IL33-11 결합에 의해 생성된 1시간 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 37의 C: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 33v20064로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성된 하룻밤 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 37의 D: 증가하는 농도의 IL-33 scFv 항체 33v20064로 인간 ST2에 대한 인간 IL33-11 결합에 의해 생성된 하룻밤 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
scFv의 IgG1로의 재포맷설정
IL-33:ST2 상호작용을 억제할 수 있는 정제 scFv 조제물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 완전 면역글로불린 G1(IgG1) 항체 포맷으로 전환하였다. IL330004(실시예 1, SEQ ID No. 12 및 17)와 유사하거나 더 큰 정도로 억제한 항체로 추가 분석을 위해 더 이용하였다. 이러한 항체는 33v20064로 예시한다. 항체 33v20064의 다양한 영역에 대응하는 SEQ ID NO을 표 20에 나타낸다.
[표 20]
Figure pct00047
정제 IgG에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
항-IL-33 항체가 FLAG®-His 태그화 ST2 수용체에 대한 바이오틴화 IL-33-01의 결합을 억제하는 능력을 그 원리가 상술된 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다. 인간 바이오틴화 인간 IL-33-01(SEQ ID No. 632)로의 결합에 대해 인간 FLAG®-His 태그화 ST2 대비 정제 IgG의 희석 시리즈를 경쟁시킴으로써 정제 IgG 조제물의 활성을 결정하였다.
도 38의 A: 증가하는 농도의 33v20064 IgG1 항체로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성된 1시간 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 38의 B: 증가하는 농도의 33v20064 IgG1 항체로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성된 하룻밤 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
IgG에 의한 Huvec에서의 IL-6 생성의 억제
33v20064를 HUVEC에서 IL-33 자극 IL-6 생성의 억제에 대해 평가하였으며, 그 방법은 실시예 2에 기재된다. His-Avi 인간 IL-33 야생형(IL33-01, SEQ ID No. 632)(30 ng/mL) 또는 His-Avi 돌연변이체 IL-33(IL33-11, SEQ ID No. 643)(30 ng/mL)을 이용해서 다양한 농도의 평가 항체의 존재 하에 HUVEC을 자극하였다.
도 39의 A: IL330004 및 항-NIP IgG1 음성 대조군 항체, NIP228 대비 항체 33v20064에 의한 IL33-01(WT) 자극 HUVEC으로부터의 IL-6 생성의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응 백분율이다. 33v20064는 높은 항체 농도에서 WT IL-33에 대한 반응의 부분적 억제를 나타낸 반면, IL330004는 효과를 나타내지 않았다.
도 39의 B: IL330004 및 항-NIP IgG1 음성 대조군 항체, NIP228 대비 항체 33v20064에 의한 IL33-11 자극 HUVEC으로부터의 IL-6 생성 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응 백분율이다. 33v20064는 IL330004 대비 IL33-11 돌연변이체에 의해 자극된 IL-6 생성의 보다 완전한 억제를 나타내었다.
항-IL-33 항체의 교차-반응성
균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:mAb-결합 검정을 이용해서 항 IL-33 항체 33v20064의 교차-반응성을 결정하였다. 본 검정에서, 샘플을 DyLight 표지 33v20064 IgG에 대한 결합에 대해 바이오틴화 인간 IL-33-01(SEQ ID No. 632)과 경쟁시켰다.
[표 21]
Figure pct00048
384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)로 IL-33 샘플의 각각의 희석물 5 ㎕를 첨가하여 DyLight 표지 33v20064에 대한 인간 IL-33 결합의 억제에 대해 인간, 게잡이원숭이 및 마우스 IL-33 FLAG®His(실시예 1에 기재됨)를 평가하였다. 다음으로, 20 nM의 DyLight 표지 33v20064를 함유하는 용액을 제조하고, 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다(제조업체의 지침에 따라 키트(Innova Biosciences, 326-0010)를 이용해서 표지). 여기에 1.5 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 1.2 nM 바이오틴화 인간 IL-33-01을 함유하는 용액 2.5㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 인간 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용해서 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다. 4-파라미터 로지스틱 공식(식 4)을 이용한 곡선 피팅에 의해 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해서 IC50값을 결정하였다. 이들 결과는 33v20064가 게잡이원숭이 IL-33과 교차 반응함을 나타내었다. 그러나 33v20064는 마우스 IL-33과 경쟁을 나타내지 않았다.
도 40의 A: 증가하는 농도의 평가 단백질로, DyLight 표지 33v20064에 대한 바이오틴화 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 평가 샘플 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다. FRET 신호의 억제가 인간 및 게잡이원숭이 IL-33으로 관찰되었으나, 마우스 IL-33으로는 관찰되지 않았다.
항-IL-33 항체의 선택성
균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:mAb-결합 검정을 이용해서 항 IL-33 항체 33v20064의 선택성을 결정하였다. 본 검정에서, 샘플은 DyLight 표지 33v20064 IgG로의 결합에 대해 바이오틴화 His-Avi 인간 IL-33(IL33-01, SEQ ID No. 632)과 경쟁하였다. 인간 IL-1 알파 및 인간 IL-1 베타를 상술된 바와 같이 DyLight 표지 33v20064에 대한 바이오틴화 IL-33-01 결합의 억제에 대해 평가하였다. 이들 결과는 33v20064가 인간 IL-1 알파 또는 IL-1 베타와 경쟁을 보이지 않음을 나타낸다.
도 40의 B: 증가하는 농도의 평가 단백질로, DyLight 표지 33v20064에 대한 바이오틴화 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성된, FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 평가 샘플 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다. FRET 신호의 억제는 인간 IL-1 알파 또는 IL-1 베타로 관찰되지 않았다.
실시예 8 항-IL-33 Ab 33v20064의 최적화
33v20064의 프레임워크 영역 생식계열화
모체 항체 33v20064의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 IMGT 데이터베이스에서 공지된 인간 생식계열 서열과 정렬하고(Lefranc , M. P. et al. Nucl . Acids Res. 2009. 37(Database issue): D1006-D1012), 가장 가까운 생식계열을 서열 유사성에 의해 확인하였다. 33v20064 항체 계통의 VH 도메인에 있어서, 이는 IGHV3-23*01이었다. VL 도메인에 있어서, 이는 IGLV3-1이었다. 생식계열화를 33v20064 상에서 친화도 성숙 공정 전에 수행하였다. 변화시키지 않고 놔둔 Vernier 잔기(Foote 1992)를 고려하지 않으면, 33v20064의 VL 도메인의 프레임워크에 생식계열과 상이한 6개 잔기가 있었고, 그 중 5개를 적절한 돌연변이화 프라이머로 Kunkel 돌연변이화 방법(Clackson , T. and Lowman , H.B . Phage Display - A Practical Approach, 2004. Oxford University Press)을 이용해서 가장 가까운 생식계열 서열로 복귀시켰다. 상기 생식계열화 산물은 33_640001이었다. 서열 ID 번호는 표 22에 기재된다.
[표 22]
Figure pct00049
정제 scFv에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
33_640001의 활성을 그 비-생식계열화 모체, 33v20064와 비교하였다. FLAG®-His 태그화 ST2 수용체에 대한 바이오틴화 His Avi 인간 IL-33(IL33-01, SEQ ID No. 632)의 결합을 억제하는 scFv 항체의 능력을 실시예 7에 기재된 바와 같이 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다.
도 41의 A: 증가하는 농도의 scFv 항체로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성된 1시간 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다. 33_640001은 그 비-생식계열화 모체와 동등한 활성을 가졌다.
도 41의 B: 증가하는 농도의 scFv 항체로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성된 하룻밤 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다. 33_640001은 그 비-생식계열화 모체와 동등한 활성을 가졌다.
친화도 성숙
33v20064를 표적화 돌연변이화 접근 및 친화도-기반 파지 디스플레이 선택을 이용해서 최적화하였다. 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학 기법을 이용하여(Clackson 2004) 가변 중쇄(VH) 상보성 결정 영역 3(CDR3) 및 경쇄(VL) CDR3의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이화에 의해 생식계열화 모체(33_640001)로부터 유도된 대규모 scFv-파지 라이브러리를 생성하였다. VH CDR3에 있어서, 이전 Kabat-정의 CDR의 두 Vernier 위치(즉 VH 위치 93 및 94)를 또한 표적화 돌연변이화 접근에서 잠재적 최적화를 위해 포함시켰다. 인간 IL-33에 대해 더 높은 친화도를 갖는 변이체를 선택하기 위해 라이브러리로 친화도-기반 파지 디스플레이 선택을 거쳤다. 순차적 회에서 바이오틴화 His-Avi 인간 IL-33 야생형(IL33-01, SEQ ID NO. 632) 및 바이오틴화 His Avi 돌연변이체 IL-33(IL33-11, SEQ ID NO. 643) 항원을 교대하며, 또는 모든 회에서 바이오틴화 IL33-11 항원만으로 이들 선택을 수행하였다. 선택은 본질적으로 전술된 바와 같이 수행하였다(Thompson 1996). 간략하게, scFv-파지 입자를 용액 중 재조합 바이오틴화 항원과 인큐베이션하였다. 이어서 항원에 결합된 ScFv-파지를 제조업체의 권장사항에 따라 스트렙타비딘-코팅 상자성 비드(Dynabeads® M-280) 상에 포획하였다. 이어서 선택된 scFv-파지 입자를 전술된 바와 같이 구제하고(Osbourn , J.K ., et al. Immunotechnology , 1996. 2(3): p. 181-96), 감소하는 농도의 바이오틴 항원 - 전형적으로 5회 선택에 걸쳐 50 nM 내지 10 pM의 존재 하에 선택 공정을 반복하였다.
33v20064를 또한 본질적으로 Hanes 등에 의해 기재된 바와 같은 리보솜 디스플레이 기술을 이용해서 최적화하였다(Hanes, J., et al. Methods in Enzymology , 2000. 328: p. 404-30). 후속 선택을 위해 모체 scFv 클론 33v20064를 라이브러리 구축 및 리보솜 디스플레이 포맷으로의 전환을 위한 주형으로서 이용하였다. DNA 수준에서, mRNA로의 효율적 전사를 위해 T7 프로모터를 5'-말단에 부가하였다. mRNA 수준에서, 구축물은 원핵생물 리보솜-결합 부위(샤인-달가노 서열)를 함유하였다. 단일쇄의 3'-말단에서, 정지 코돈을 제거하고 M13 박테리오파지 gIII(유전자 III)의 일부를 신생 scFv 폴리펩타이드 및 리보솜 간 스페이서로서 작용하도록 부가하였다(Hanes 2000).
모체(33v20064) scFv 구축물로부터 유도된 리보솜 디스플레이 라이브러리를 제조업체의 권장사항에 따라 Diversify™ PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 무작위 돌연변이화 키트(BD Biosciences)를 이용하여 무작위 돌연변이화에 의해 생성하였다. 1000개 염기쌍 당 평균 8.1개 뉴클레오타이드 변화를 도입하도록 상기 오차-경향성 PCR(EP)을 위한 조건을 선택하였다(제조업체에 따라). 이어서 생성 EP 라이브러리를 친화도-기반 리보솜 디스플레이 선택(Hanes 2000)에서 이용하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RiboMAX™ Large Scale RNA 생성 시스템(T7)(Promega) 및 이.콜라이-기반 원핵생물 무세포 번역 시스템을 이용해서 scFv를 시험관내 발현시켰다. 생성된 scFv 항체-리보솜-mRNA(ARM) 복합체를 바이오틴화 인간 IL-33 항원과 함께, 순차적 회에서 바이오틴화 IL33-01 및 바이오틴화 IL33-11 항원을 교대하며, 또는 모든 회에서 바이오틴화 IL-33-11 항원으로만 용액 중 인큐베이션하였다. 비결합 ARM을 세척 제거하면서 특이적으로 결합된 삼원 복합체(IL-33:ARM)를 제조업체의 권장사항(Dynal)에 따라 스트렙타비딘-코팅 상자성 비드(Dynabeads® M-280) 상에서 포획하였다. 이어서 결합 scFv를 인코딩하는 mRNA를 역전사-PCR(RT-PCR)에 의해 회수하였다. IL-33에 대해 더 높은 친화도를 갖는 클론을 농축하고 이에 의해 선택하기 위해, 감소하는 농도의 바이오틴화 인간 IL-33(5회에 걸쳐 100 nM에서 100 pM로)을 이용한 추가 회의 선택을 위해 수득 집단 상에서 선택 공정을 반복하였다. 3, 4 및 5 선택 회로부터의 산출물을 pCantab6 내로 서브클로닝하고(McCafferty , J., et al. Appl Biochem Biotechnol , 1994. 47(2-3): p. 157.), 개선된 클론을 후술된 바와 같이 확인하였다.
미정제 scFv에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
선택 산출물로부터의 대표적 수의 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. ScFv를 박테리아 원형질막 주위공간에서 발현시키고(Kipriyanov , et al. J Immunol Methods 200(1-2): 69-77 (1997)) 균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:mAb-결합 검정에서 이의 억제 활성에 대해 스크리닝하였다. 본 검정에서, 샘플은 바이오틴화 His Avi IL-33-01(SEQ ID NO. 632) 또는 바이오틴화 His Avi 게잡이원숭이 IL-33(SEQ ID NO. 649)으로의 결합에 대해 DyLight 표지 33v20064 IgG와 경쟁하였다. 이러한 에피토프 경쟁 검정은 표지 항-IL-33 IgG에 대해 유사한 에피토프를 인식하는 평가 항체 샘플이 바이오틴화 IL-33으로의 결합에 대해 표지 IgG와 경쟁하여 검정 신호를 감소시킬 것이라는 원리에 기반한다.
384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)에 5㎕의 샘플을 첨가함으로써 미정제 항-IL-33 항체 샘플을 DyLight 표지 33v20064에 대한 바이오틴화 His Avi IL33-01(인간) 또는 바이오틴화 His Avi 게잡이원숭이 IL-33 결합의 억제에 대해 평가하였다. 다음으로, 2.4 nM DyLight 표지 33v20064 함유 용액을 인간 IL-33 검정을 위해 제조하고 6 nM DyLight 표지 33v20064를 게잡이원숭이 검정을 위해 제조하여 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다(제조업체의 지침에 따라 키트(Innova Biosciences, 326-0010)를 이용해서 표지). 여기에 인간 검정을 위해 0.75 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 0.8 nM 바이오틴화 인간 IL-33-01 함유 용액 또는 게잡이원숭이 검정을 위해 1.5 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 4 nM 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 함유 용액 2.5 ㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용하여 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다.
에피토프 경쟁 검정이 그 감도 한계에 도달하면, 중간 최적화 mAb 33_640027을 이용한 검정을 미정제 scFv 샘플의 평가를 위해 이용하였다. 검정은 본질적으로 다음 변형을 포함하여 33v20064 경쟁 검정에 대해 기재된 바와 같았다: 20 nM DyLight 표지 33_640027을 제조하였고, 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다. 여기에 인간 검정을 위해 0.75 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 0.32 nM 바이오틴화 인간 IL-33-01 함유 용액 또는 게잡이원숭이 검정을 위해 1.5 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 0.8 nM 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 함유 용액 2.5 ㎕의 첨가가 뒤따랐다.
정제 scFv에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
미정제 원형질막 주위공간 추출물로서 IL-33:mAb 상호작용에 대해 억제 효과를 나타낸 단일쇄 Fv 클론으로 DNA 서열분석을 거쳤다(Osbourn , et al. Immunotechnology 2(3):181-96 (1996); Vaughan, et al. Nat Biotechnol 14(3):309-14 (1996)). 고유한 scFv를 다시 박테리아에서 발현시키고 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다(WO01/66754에 나타낸 바와 같음). 바이오틴화 His Avi IL33-01, 바이오틴화 His Avi IL33-11 또는 바이오틴화 His Avi 게잡이원숭이 IL-33으로의 결합에 대해 DyLight 표지 33v20064 IgG 또는 DyLight 표지 33_640027 IgG 대비 정제 조제물의 희석 시리즈를 경쟁시켜서 정제 항-IL-33 항체 샘플을 억제 역가에 대해 평가하였다. 방법은 앞 섹션에 기재된 바와 같다.
[표 23]
Figure pct00050
scFv의 IgG1로의 재포맷설정
IL-33:mAb 결합 검정으로부터 원하는 특성을 갖는 단일쇄 Fv 클론을 실시예 1에 기재된 바와 같이 완전 면역글로불린 G1(IgG1) 항체 포맷으로 전환하였다. 이들에는 항체 33_640027(EP 라이브러리 선택으로부터 유도됨) 및 33_640047, 33_640050(VH CDR3 블록 돌연변이화 라이브러리 선택으로부터 유도됨)이 포함되며 이들 항체의 다양한 영역에 대응하는 SEQ ID NO는 표 24에 나타낸다.
[표 24]
Figure pct00051
정제 IgG에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
DyLight 표지 33v20064 IgG 또는 DyLight 표지 33_640027 IgG로의 바이오틴화 His Avi IL33-01, 바이오틴화 His Avi IL33-11 또는 바이오틴화 His Avi 게잡이원숭이 IL-33의 결합을 억제하는 항-IL-33 항체의 능력을 기재된 바와 같이 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다. IL-33:mAb 결합 검정으로부터 원하는 특성을 갖는 IgG를 추가 분석을 위해 선택하였다.
IgG에 의한 Huvec에서의 IL-8 생성의 억제
사이토카인 방출 검정을 이용해서 항-IL-33 항체에 의한 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Huvec)로부터의 IL-33 유도 IL-8 생성의 억제를 평가하였다. 세포를 약간의 변형을 포함하여 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 평가 항체 또는 ST2.Fc(R&D systems)의 존재 또는 부재 하에 IL-33에 노출시켰다. 정제 IgG의 평가 용액(2개씩)을 완전 배양 배지 중에 원하는 농도까지 희석하였다. N-말단 His Avi IL-33(IL33-01, SEQ ID NO 632)을 적절한 평가 항체와 혼합된 완전 배양 배지 중에 제조하여 2 ng/mL의 최종 IL-33 농도를 얻었다. 모든 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 뒤 검정 플레이트로 IL-33/항체 혼합물을 옮겼다. 18~24시간 인큐베이션 후, 실시예 2에 기재된 바와 같이 유로퓸 판독을 위해 채택된 ELISA(R&D Systems, DY208)에 의해 세포 상청액 중 IL-8을 측정하였다. 데이터를 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하였다. 4-파라미터 로지스틱 공식을 이용한 곡선 피팅에 의해 IC50값을 결정하였다. IC50값을 계산하였고, 아래의 표 25에 요약한다.
도 42의 A는 33v20064, 33_640050, 인간 ST2-Fc 또는 대조군 mAb의 존재 하에 IL33-01로 자극된 HUVEC을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응의 백분율이다(IL-8 생성).
포유류 전장 IL-33의 중화
전장 IL-33도 활성이다(Cayrol et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106(22):9021-6 (2009); Hayakawa et al., Biochem Biophys Res Commun 387(1):218-22 (2009); Talabot-Ayer et al., J Biol Chem. 284(29):19420-6 (2009)).
전장 IL-33을 중화하는 항체의 능력을 평가하기 위해, 전장(FL) HuIL-33을 발현하는 HEK293-EBNA 세포(및 모의-형질감염 대조군)를 아큐타제(PAA, #L11-007)를 이용한 형질감염 24시간 후 수확하였다. 세포를 PBS로 1x108/mL까지 희석하고, 조직 균질화장치를 이용해서 30초 동안 균질화하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. HUVEC을 다양한 농도의 세포 용해물로 자극하였다. 사이토카인 생성의 자극은 전장 IL-33-형질감염 세포 용해물로만 관찰되었으며, 모의 형질감염 세포 용해물로는 관찰되지 않았다. 최대-미만 사이토카인 방출(약 EC50)을 자극한 용해물의 1:1000 농도를 항체 중화 연구를 위해 선택하였다. 실험을 상술된 바와 같이 수행하였다. IC50값을 계산하였고, 아래의 표 25에 요약한다.
도 42의 B는 33v20064, 33_640050, 인간 ST2-Fc 또는 대조군 mAb의 존재 하에 전장 IL33 세포 용해물로 자극된 HUVEC을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응의 백분율이다(IL-8 생성).
[표 25]
Figure pct00052
IgG에 의한 IL-33의 디설파이드-결합 형태의 방지
IL-33-01(0.14 nM 또는 3 ng/mL)을 37℃, 5% CO2에서 0~24시간 동안 항체(25 ug/mL) 또는 인간 ST2-Fc(105 ug/mL)의 존재 또는 부재 하에, 둘 다 1% BSA를 함유하는 IMDM 또는 PBS 중에 인큐베이션하였다. 다양한 시점에 분취물을 제거하고 PBS 또는 sST2를 함유하는 사전-냉각 플레이트에 첨가하였다(최종 농도 10.5 ug/mL). 수확 시 sST2를 대조군 mAb 및 미처리 샘플 내로 스파이크 첨가하여 IL-33 산화 반응이 계속되는 것을 정지시켰다. 샘플을 사전-냉동 96웰 플레이트 내로 분취하고 -80℃에서 보관하였다. 스트렙타비딘-HRP 대신 DELFIA 검출 시스템(Perkin Elmer)으로 치환하여 계속하며 인간 IL-33 ELISA를 제조업체의 지침에 따라 수행하였다(R&D Systems, Cat # DY3625, 로트 # 1362797). 간략하게, 검은색 96웰 Maxisorp 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 웰 당 50 uL의 포획 항체로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 중 300 uL 0.05% Tween-20으로 3회 세척하고 실온에서 1시간 동안 PBS 중 1% BSA 150 uL로 차단하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 웰 당 50 uL의 샘플 또는 표준물질을 실온에서 2시간 동안 진탕하며 플레이트에 첨가하였다(400 rpm). 플레이트를 3회 세척하고, 웰 당 50 uL의 검출 항체를 실온에서 2시간 동안 진탕하며 플레이트에 첨가하였다(400 rpm). 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고 웰 당 50 uL의 DELFIA 검정 완충액 중 1:1000으로 희석된 스트렙타비딘-유로퓸을 실온에서 40분 동안 진탕하며 빛으로부터 보호된 플레이트에 첨가하였다(400 rpm). 플레이트를 웰 당 300 uL의 DELFIA 세척 완충액으로 7회 세척하였다. 웰 당 50 uL의 DELFIA 증강 용액(실온까지 사전-가온됨)을 플레이트에 첨가하였다. 빛으로부터 보호되며 실온에서 10분 인큐베이션 후, EnVision 플레이트 판독장치(PerkinElmer)를 이용해서 형광을 측정하였다. 표준 및 데이터 외삽은 Microsoft Excel에서 수행하였고, 후속 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어에서 수행하였다.
실시예 4, 도 24의 A에서 논의된 바와 같이, 상기 ELISA는 본 실험에서 측정된 IL-33 농도 범위 내에서 주로 디설파이드 결합 IL-33(IL33-DSB)을 검출한다. ELISA는 본원에서 평가 항체의 존재 하에 IL-33의 그 디설파이드 결합 형태로의 전환을 모니터링하기 위해 이용된다.
도 43은 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 IMDM(도 43의 A) 또는 PBS(도 43의 B) 중에서의 인큐베이션 동안 IL33-01의 그 디설파이드 결합 형태(IL33-DSB)로의 전환을 나타내며, 여기서 x-축은 시간(hour)이고 y-축은 IL-33-DSB의 농도이다. IL330004 및 33v20064는 IL-33의 IL33-DSB로의 전환 속도를 늦춘다. 33_640050 및 ST2.Fc는 평가된 시간 경과에 걸쳐 IL-33-DSB로의 전환을 방지한다.
유익한 돌연변이의 재조합 및 추가 최적화
추가적인 친화도 개선의 생성을 목표로, 이전 선택 및 스트리닝 캐스케이드로부터 확인된 유익한 돌연변이를 단순한 부가 접근에 의해 또는 추가 선택과 함께 재조합 라이브러리 접근을 통해, 여러 상이한 방식으로 재조합하였다.
서열 분석은 여러 선도 항체 서열에서 우세한 2개의 단일-지점 돌연변이 '핫스팟'; VH CDR3에서의 I98M 및 VL CDR2에서의 Q50R(Kabat 넘버링)이 존재함을 제시하였다. 이들 두 돌연변이를 33_640001 구축물 상에 그래프팅하고, 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 새로운 항체, 33_640036을 생성하였다. 추가 재조합에서, 33_640047의 VH를 33_640036의 VL과 페어링시켜 항체 33_640117을 생성하였다. 이들은 부가 접근을 이용한 서열 재조합의 예이다. SEQ ID NO를 표 26에 나타낸다.
[표 26]
Figure pct00053
추가적으로, VH CDR3 및 VL CDR3 영역을 커버하는 블록 돌연변이화 라이브러리로부터의 선택 산출물은 친화도 개선 및 우수한 서열 다양성을 나타내었으며 이에 따라 집단 클로닝 접근을 이용해서 재조합하였다. 3회 선택 산출물을 재조합하여 클론이 무작위 페어링, 개별 무작위화 VH CDR3 및 VL CDR3 서열을 함유하는 라이브러리를 형성하였다. 이어서 이들 재조합 VH CDR3/VL CDR3 라이브러리를 순차적 회에서 바이오틴화 His Avi 인간 IL-33 야생형(IL33-01, SEQ ID NO. 632) 및 바이오틴화 His Avi 돌연변이체 IL-33(IL33-11, SEQ ID NO. 643) 항원을 교대하여, 또는 모든 회에서 바이오틴화 His Avi IL33-11 항원만으로, 리보솜 디스플레이 선택에서 이용하였다. 선택은 감소하는 농도의 바이오틴화 항원의 존재 하에 - 5회 선택에 걸쳐 50 nM부터 30 pM까지, 본질적으로 개별 CDR3 라이브러리에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.
조정제 scFv-함유 원형질막 주위공간 추출물을 재조합 VH CDR3/VL CDR3 라이브러리의 선택 산출물로부터의 대표적 수의 개별 scFv로부터 제조하였다. DyLight 표지 33v20064 IgG 또는 DyLight 표지 33_640027 IgG에 대한 바이오틴화 His Avi IL33-01 또는 바이오틴화 His Avi 게잡이원숭이 IL-33의 결합을 억제하는 항-IL-33 항체의 능력을 기재된 바와 같이 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다. 모체 scFv 및 재조합-전 생성된 선도물 대비 유의미하게 개선된 억제 효과를 나타낸 ScFv 변이체로 DNA 서열분석을 거치고, 고유한 재조합 변이체를 정제 scFv로서 생성하고 앞 섹션에 기재된 바와 같이 평가하였다.
이들 재조합 라이브러리로부터 수득된 최적화 항체가 33_640076, 33_640081, 33_640082, 33_640084, 33_640086 및 33_640087로 예시된다. 이들 항체의 SEQ ID NO를 표 27에 나타낸다.
[표 27]
Figure pct00054
추가적인 자연 돌연변이를 반복 회의 PCR 증폭 결과로 리보솜 디스플레이 선택 절차 동안 scFv 포맷으로 이들 항체의 가변 영역 내에 도입하였다. 이들 이벤트는 산출물의 서열 다양성을 추가하지만 종종 이것이 프레임워크 영역에서 일어나는 경우 바람직하지 못하다. 따라서 33_640076, 33_640081, 33_640082, 33_640084, 33_640086 및 33_640087의 프레임워크 영역에서 일어난 자연 돌연변이를 표준 분자 생물학 기법을 이용해서 실시예 3에 기재된 바와 같이 IgG 구축물 상에서 생식계열로 다시 복귀시켰다. 임의의 CDR에서 또는 CDR에 인접한 Vernier 잔기(예로 Kabat 넘버링에 의한 VH 위치 27, 28, 29, 30, 93 및 94)에서 일어난 이러한 자연 돌연변이는 변화시키지 않고 놔두었다. 친화도를 증가시키기 위한 추가 전략으로서, 앞서 확인된 '핫스팟'(VL CDR2에서의 Q50R 돌연변이)을 또한 구축물 상에 동시에 그래프팅하였다. 이들 생식계열화 및 핫스팟 그래프팅 변형으로 생성된 항체는 각각 이의 모체 항체 33_640076, 33_640081, 33_640082, 33_640084, 33_640086 및 33_640087에 대응하여, 33_640076-1, 33_640081-A, 33_640082-2, 33_640084-2, 33_640086-2 및 33_640087-2로 명명하였다. 이들 항체의 SEQ ID NO.를 표 28에 나타낸다.
[표 28]
Figure pct00055
추가 CDR의 최적화
친화도를 증가시키기 위한 추가 전략으로서, 추가 CDR을 최적화하였다. 기재된 바와 같은 표준 분자 생물학 기법을 이용하여(Clackson 2004) 가변 중쇄(VH) CDR1 및 CDR2 및 경쇄(VL) CDR1 및 CDR2의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이화에 의해 생식계열화 모체(33_640001)로부터 유도된 대규모 scFv-파지 라이브러리를 생성하였다. 선택 및 스크리닝은 VHVL CDR3 라이브러리에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 가장 개선된 항체 변이체는 VH CDR2 라이브러리로부터 수득하였다. 이들은 33_640166, 33_640169, 33_640170으로 예시된다. 이들 항체의 SEQ ID NO.를 표 29에 나타낸다.
[표 29]
Figure pct00056
친화도에서 추가 개선을 달성하기 위한 추가 전략으로서, 33_640166, 33_640169 및 33_640170의 VH CDR2 서열을 표준 분자 생물학 방법을 이용해서 33_640076-1, 33_640082-2, 33_640086-2 및 33_640087-2의 IgG 구축물 상으로 그래프팅하였다. 이들 재조합으로 생성된 항체는 33_640076-4, 33_640082-4, 33_640082-6, 33_640082-7, 33_640086-6 및 33_640087-7로 예시되었다. 서열 기원 및 SEQ ID NO를 표 30에 나타낸다.
[표 30]
Figure pct00057
유익한 VH CDR3/VL CDR3 및 VH CDR2 서열의 재조합을 또한 집단 클로닝 및 선택 접근을 이용해서 수행하였다. 표준 분자 생물학 기법을 이용해서 VH CDR2 영역을 커버하는 블록 돌연변이화 라이브러리로부터의 3회 선택 산출물을 집단 클로닝 접근에서 재조합 VH CDR3/VL CDR3 라이브러리의 3회 선택 산출물과 재조합하였다. 다수의 scFv 변이체를 포함하는 선택 산출물을 재조합하여 클론이 VH CDR3/VL CDR3 및 VH CDR2 선택에서 유도된 무작위 페어링 서열을 함유하는 라이브러리를 형성하였다. 선택은 감소하는 농도의 바이오틴화 항원의 존재 하에 - 전형적으로 5회 선택에 걸쳐 3 nM부터 3 pM까지, VHVL CDR3 라이브러리에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다. 선택 산출물로부터 대표적 수의 개별 scFv로부터의 조정제 scFv-함유 원형질막 주위공간 추출물을 VHVL CDR3 라이브러리에 대해 기재된 바와 같이 생화학적 HTRF® 검정에서 스크리닝하였다. 모체 scFv 및 재조합-전 생성된 선도물질에 비해 유의미하게 개선된 억제 효과를 나타낸 ScFv 변이체로 DNA 서열분석을 거쳤다.
33_640027을 이용하는 에피토프 경쟁 검정이 그 감도 한계에 도달하면, 33_640117을 이용한 검정을 정제 scFv 샘플의 평가를 위해 이용하였다. 검정은 본질적으로 다음 변형을 포함하여 33v20064 경쟁 검정에 대해 기재된 바와 같았다: 2.5 nM DyLight 표지 33_640117을 제조하였고, 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다. 여기에 인간 검정을 위해 0.75 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 0.12 nM 바이오틴화 인간 IL-33-01 함유 용액 또는 게잡이원숭이 검정을 위해 1.5 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 0.24 nM 바이오틴화 게잡이원숭이 IL-33 함유 용액 2.5 ㎕의 첨가가 뒤따랐다. 1시간 및 하룻밤 인큐베이션 후 형광을 판독하였다. 두 시점 모두에서 가장 강력한 샘플을 IgG로의 재포맷설정을 위해 더 이용하였다.
고유한 재조합 변이체를 정제 scFv로서 평가한 뒤 가장 활성이 높은 scFv를 선택하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 IgG1 포맷으로 전환하였다. 이들 재조합 라이브러리로부터 수득된 항체는 33_640201 및 33_640237로 예시된다. 리보솜 디스플레이 선택 동안 33_640201 및 33_640237의 프레임워크 영역 내로 도입된 자연 돌연변이를 본 섹션에서 전술된 바와 같이 생식계열 서열로 다시 복귀시키고, 이의 생식계열화 대응물을 각각 33_640201-2 및 33_640237-2로 명명하였다. 이들 항체의 SEQ ID를 표 31에 나타낸다.
[표 31]
Figure pct00058
논리적 재조합 또는 집단 접근에 의해 VH CDR3/VL CDR3 및 VH CDR2에 대해 최적화된 항체에 대한 데이터가 도 44 및 45에서 33_640082-6, 33_640087-7, 33_640201 및 33_640237에 의해 예시된다.
정제 IgG에 의한 mAb에 대한 IL-33 결합의 억제
DyLight 표지 33_640117 IgG에 대한 바이오틴화 His Avi 인간 IL-33 또는 게잡이원숭이 His Avi IL-33의 결합을 억제하는 항-IL-33 항체의 능력을 상술된 바와 같이 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다.
도 44의 A는 증가하는 농도의 항체 33v20064, 33_640050, 33_640082-6, 33_640087-7, 33_640201 및 33_640237로 DyLight-표지 33_640117 IgG에 대한 바이오틴화 인간 IL-33(IL33-01) 결합에 의해 생성된, 1시간 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 44의 B는 증가하는 농도의 항체 33v20064, 33_640050, 33_640082-6, 33_640087-7, 33_640201 및 33_640237로 DyLight-표지 33_640117 IgG에 대한 바이오틴화 인간 IL-33(IL33-01) 결합에 의해 생성된, 하룻밤 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 특이적 결합 백분율이다.
도 44의 C는 증가하는 농도의 항체 33v20064, 33_640050, 33_640082-6, 33_640087-7, 33_640201 및 33_640237로 DyLight-표지 33_640117 IgG에 대한 바이오틴화 게잡이원숭이 His Avi IL-33 결합에 의해 생성된, 1시간 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 특이적 결합 백분율이다.
[표 32]
Figure pct00059
IgG에 의한 Huvec에서의 IL-8 생성의 억제
IgG를 Huvec IL-8 생성 검정에서 평가하였다. 세포를 전술된 바와 같이 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 N-말단 His Avi IL-33(IL33-01, SEQ ID NO 632) 또는 포유류 전장 IL-33 세포 용해물(FL-IL33 용해물)에 노출시켰다. IC50값을 계산하였고, 아래의 표 33에 요약한다.
도 45의 A는 평가 항체 33_640050, 33_640082-6, 33_640087-7, 33_640201 및 33_640237의 존재 하에 IL33-01로 자극된 HUVEC을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응의 백분율이다(IL-8 생성).
도 45의 B는 평가 항체 33_640050, 33_640082-6, 33_640087-7, 33_640201 및 33_640237의 존재 하에 전장 IL-33 세포 용해물로 자극된 HUVEC을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응의 백분율이다(IL-8 생성).
[표 33]
Figure pct00060
생식계열화 IGLJ 서열
항체 33_640076-4, 33_640081-A, 33_640082-6, 33_640082-7, 33_640084-2, 33_640086-6, 33_640087-7, 33_640201-2 및 33_640237-2의 VL 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 IMGT 데이터베이스에서 공지된 인간 IGLJ 생식계열 서열과 정렬하고(Lefranc, M. P. et al. Nucl . Acids Res. 2009. 37(Database issue): D1006-D1012), 가장 가까운 생식계열을 서열 유사성에 의해 확인하였다. 모든 이들 항체에 있어서, 이는 IGLJ2로, VL 영역의 위치 104에서 항체에 대해 단일 아미노산 차이를 가졌다(Kabat 넘버링). 상기 잔기를 표준 분자 생물학 방법을 이용해서 실시예 3에 기재된 바와 같이 생식계열로 복귀시켰다. 생성 항체를 각각 이의 모체 계통 33_640076-4, 33_640081-A, 33_640082-6, 33_640082-7, 33_640084-2, 33_640086-6, 33_640087-7, 33_640201-2 및 33_640237-2에 대응하여 33_640076-4B, 33_640081-AB, 33_640082-6B, 33_640082-7B, 33_640084-2B, 33_640086-6B, 33_640087-7B, 33_640201-2B 및 33_640237-2B로 명명하였다. 이들 항체의 VH 및 VL 영역의 SEQ ID를 표 34에 나타낸다
[표 34]
Figure pct00061
실시예 9 생체내 기도 염증 모델
IL-33 사이토카인 트랩의 클로닝, 발현 및 정제
마우스 IL-1RAcP 및 마우스 ST2에 대한 단백질 서열을 Swiss Prot으로부터 수득하였다(각각 접근 번호 Q61730 및 P14719). 마우스 IL-33 사이토카인 트랩은 문헌[Economides et al 2003]에 기반하여 설계하였으며 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 아미노산 1~359 Q61730 및 아미노산 27~332 P14719로 구성되었다. 단백질 서열을 코돈 최적화하고(Geneart) pDEST12.2 내로 클로닝하였다. OriP 단백질을 IL-1RAcP로부터의 원상태 신호 펩타이드를 이용해서 세포로부터 배지 내로 분비시켰다. CHO 세포에서의 발현을 위해, 게이트웨이 링커를 중첩 프라이머 PCR에 의해 제거하였다. 트랩 발현 벡터를 CHO-일시적 포유류 세포 내로 형질감염시켰다. 마우스 IL-33 트랩을 발현시키고 배지 내로 분비시켰다. 수확물을 풀링하고 여과한 뒤 단백질 A 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 배양 상청액을 5 ml Hitrap 단백질 A 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩하고 1xDPBS로 세척하고, 결합 트랩을 0.1 M 나트륨 시트레이트(pH 3.0)를 이용해서 컬럼으로부터 용출하여 Tris-HCl(pH 9.0)의 첨가에 의해 중화하였다. 용출 물질을 S200 16:600 Superdex 컬럼(GE healthcare)을 이용해서 1xDPBS 중 SEC에 의해 추가 정제하고, 농도를 아미노산 서열에 기반한 소멸 계수를 이용해서 분광측정으로 결정하였다(Mach et al., Anal. Biochem . 200(1):74-80 (1992)).
인간화 IL-33 마우스
인간화 IL-33 마우스의 생성 방법은 실시예 4에서 전술되었다. 인간화 마우스를 기도 및/또는 알러지성 염증 모델에서 이용하여 항-인간 IL-33 항체의 효과를 평가하였다.
생체내 기도 염증 모델
마우스에서 알터나리아 알터나타(ALT) 유도 기도 염증 모델은 이전에 기재되었다(Kouzaki et al. J. Immunol . 2011, 186: 4375 -4387; Bartemes et al J Immunol, 2012, 188: 1503 -1513). 내인성 IL-33이 ALT 노출 후 신속히 방출되어 폐에서 IL-33-의존적 IL-5 생성 및 호산구증가증을 유도한다. 수컷 또는 암컷 야생형 또는 인간화 IL-33 마우스(6~10주령)를 이소플루란으로 잠시 마취하고 총 부피 50 ㎕ 중 25 ㎍의 ALT 추출물(Greer, Lenoir, NC) 또는 비히클을 비내 투여하였다. 마우스에 평가 물질: IL330004 IgG(SEQ ID No. 12 및 17), H338L293 IgG(SEQ ID No. 182 및 187), 마우스 IL-33 Trap, 33_640050(SEQ ID no. 302 및 307), 이소형 대조군 IgG(NIP228) 또는 비히클(PBS, 10 ml/kg)을 ALT를 이용한 비내 유발접종 24시간 전(복강내 처리를 위해) 또는 2시간 전(비내 처리를 위해) 복강내 또는 비내 처리하였다. 유발접종 24시간 후, 마우스를 펜토바르비탈 나트륨으로 최종 마취한 뒤 사혈 및 기관지폐포 세척(BAL)하였다. 기관지폐포 세척액(BALF)을 경기관 캐뉼라를 통해 세척에 의해 수집하였다(0.3 ml, 0.3 ml & 0.4 ml). BALF를 원심분리하고, 세포를 계수하고(FACS(FacsCALIBER, BD)에 의한 총 세포) 상청액을 ELISA(Meso Scale Discovery, Rockville, MD)에 의해 사이토카인에 대해 분석하였다. Diff-Quik(Fisher Scientific, UK)으로 염색된 사이토스핀 조제물 상에서 차별적 세포 카운트(200세포/슬라이드)를 수행하였다. 모든 작업을 적절한 프로젝트 승인 권한 하의 UK 본사 윤리 및 사육 표준에 따라 수행하였다.
도 46은 H338L293이 야생형 BALB/c 마우스에서 ALT-유도 BAL IL-5 및 호산구증가증을 용량-의존적으로 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 ALT를 이용한 유발접종 전 -2시간에 비내 투여하였다(괄호 내에 나타낸 바와 같이 10, 30 또는 100 mg/kg). BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고, IL-5(도 46의 A) 및 호산구(도 46의 B)의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. 대조군 mAb 대비 *** p<0.001, ~~ p<0.01(n=4~8). 마우스 IL-33 Trap이 양성 대조군으로 이용되었다.
도 47은 IL330004(30 mg/kg)가 아닌 H338L293(30 mg/kg) 및 마우스 IL-33 Trap(10 mg/kg)이 인간화 IL-33 마우스에서 ALT-유도 BAL IL-5를 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 ALT를 이용한 유발접종 -2시간 전에 비내 투여하였다. BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고 IL-5의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. *** p<0.001, ** p<0.01(n=4).
도 48은 33_640050 투여가 인간화 IL-33 마우스에서 알터나리아-유도 BAL IL-5를 의존적으로 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 알터나리아를 이용한 유발접종 전 -24시간에 복강내 투여하였다(괄호 내에 나타낸 바와 같이 0.3, 3 또는 30 mg/kg). BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고 IL-5의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. *** p<0.001, ** p<0.01(n=4~5).
실시예 10 항-IL-33 항체의 특성규명
정제 IgG에 의한 ST2에 대한 IL-33 결합의 억제
항-IL-33 항체가 FLAG®-His 태그화 ST2 수용체에 대한 바이오틴화 IL33-01의 결합을 억제하는 능력을 그 원리가 상술된 생화학적 HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 경쟁 검정에서 평가하였다. 인간 바이오틴화 인간 IL33-01(SEQ ID No. 632)로의 결합에 대해 인간 FLAG®-His 태그화 ST2 대비 정제 IgG의 희석 시리즈를 경쟁시킴으로써 정제 IgG 조제물의 활성을 결정하였다.
도 49의 A: 증가하는 농도의 항체 33v20064, 33_640087-7, 33_640087-7B, 33_640050 및 33_640237-2B로 인간 ST2에 대한 인간 IL-33 결합에 의해 생성된 하룻밤 인큐베이션 후 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며, y-축은 특이적 결합 백분율이다.
IgG에 의한 Huvec에서의 IL-8 생성의 억제
IgG를 Huvec IL-8 생성 검정에서 평가하였다. 세포를 전술된 바와 같이 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 N-말단 His Avi IL-33(IL33-01, SEQ ID NO 632)에 노출시켰다. IC50값을 계산하였고, 아래의 표 35에 요약한다. 데이터는 IGLJ 서열의 생식계열화가 항체 역가에 어떠한 효과도 갖지 않았음을 나타낸다.
도 49의 B는 평가 항체 33_640087-7, 33_640087-7B, 33_640237-2 및 33_640237-2B의 존재 하에 IL33-01로 자극된 HUVEC을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이고 y-축은 최대 반응의 백분율이다(IL-8 생성).
[표 35]
Figure pct00062
항-IL-33 항체의 선택성 및 교차-반응성
균일한 FRET(형광 공명 에너지 전달) HTRF®(균일한 시간차 형광, Cisbio International) 기반 IL-33:mAb-결합 검정을 이용해서 생식계열화 항-IL-33 항체의 선택성 및 교차-반응성을 결정하였다. 본 검정에서, 샘플은 DyLight 표지 33_640087-7B IgG(SEQ ID No. 618 및 618) 또는 33_640237-2B IgG(SEQ ID No. 624 및 626)로의 결합에 대해 바이오틴화 인간 IL-33-01(SEQ ID No. 632)과 경쟁하였다.
DyLight650 표지 33_640087-7B 또는 DyLight650 표지 33_640237-2B로의 인간 IL-33의 억제에 대해 인간, cyno 및 마우스 IL-33 FLAG®His(실시예 1 및 표 21에 기재됨), 인간 IL-1 알파 및 IL-1 베타(R&D Systems)(표 21) 또는 래트 IL-33(GenScript)을 5㎕의 각각의 샘플 희석물을 384웰 저부피 검정 플레이트(Costar, 3673)로 첨가하여 평가하였다. 다음으로, 1.2 nM DyLight 표지 33_640087-7B 또는 33_640237-2B를 함유하는 용액을 제조하고, 2.5㎕를 검정 플레이트에 첨가하였다(제조업체의 지침에 따라 키트(Innova Biosciences, 326-0010)를 이용해서 표지). 여기에 0.75 nM 스트렙타비딘 크립테이트 검출(Cisbio International, 610SAKLB)과 조합된 0.12 nM 바이오틴화 인간 IL-33-01을 함유하는 용액 2.5㎕의 첨가가 뒤따랐다. Dulbecco PBS(Invitrogen, 14190185) 중 0.8 M 칼륨 플루오라이드(VWR, 26820.236) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA, PAA, K05-013)을 함유하는 검정 완충액 중에 모든 희석을 수행하였다. 검정 플레이트를 실온에서 4시간에 이어 섭씨 4도에서 18시간 동안 인큐베이션하고 시간차 형광을 EnVision 플레이트 판독장치(Perkin Elmer)를 이용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 샘플에 대한 665/620 nm 비에 이어 델타 F값%의 계산에 의해 데이터를 분석하였다. 665/620 nm 비를 이용하여 식 1을 이용해서 샘플 간섭에 대해 교정하였다. 이어서 각각의 샘플에 대한 델타 F%를 식 2를 이용해서 계산하였다. 음성 대조군(비-특이적 결합)은 스트렙타비딘 크립테이트 검출과 조합된 바이오틴화 인간 IL-33을 스트렙타비딘 크립테이트 검출만으로 대체하여 정의되었다. 이후 델타 F값%를 이용해서 식 3에 기재된 바와 같이 특이적 결합%를 계산하였다. 4-파라미터 로지스틱 공식(식 4)을 이용한 곡선 피팅에 의해 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해서 IC50값을 결정하였다. 이들 결과는 33_640087-7B 및 33_640237-2B가 마우스 IL-33, 래트 IL-33, 인간 IL-1 알파 또는 인간 IL-1 베타가 아닌 게잡이원숭이 IL-33과 교차 반응함을 나타내었다.
도 50의 A: 증가하는 농도의 평가 단백질로, DyLight 표지 33_640087-7B(SEQ ID No. 618 및 618)에 대한 바이오틴화 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성되는 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 평가 샘플 농도이며 y-축은 특이적 결합 백분율이다. FRET 신호의 억제는 마우스 또는 래트 IL-33, 인간 IL-1 알파 또는 인간 IL-1 베타가 아닌 인간 및 게잡이원숭이 IL-33으로 관찰되었다.
도 50의 B: 증가하는 농도의 평가 단백질로, DyLight 표지 33_640237-2B(SEQ ID No. 624 및 626)에 대한 바이오틴화 인간 IL-33-01 결합에 의해 생성되는 FRET 신호의 억제를 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 평가 샘플 농도이며 y-축은 특이적 결합 백분율이다. FRET 신호의 억제는 마우스 또는 래트 IL-33, 인간 IL-1 알파 또는 인간 IL-1 베타가 아닌 인간 및 게잡이원숭이 IL-33으로 관찰되었다.
HUVEC IL-8 검정에서 내인성 IL-33의 중화
항체가 내인성 IL-33을 중화할 수 있는지를 결정하기 위해, 인간 폐 조직을 이용해서 내인성 IL-33 단백질원을 제공하였다. 연구는 NRES 영국 동부(Cambridge East) 연구 윤리 위원회(참조 번호 08/H0304/56Þ5)의 승인을 받았으며 조직은 환자의 사전 동의에 의해 공여받았다. 폐암 환자로부터 및 폐 이식 수술로부터의 비암성 인접 조직은 Papworth 병원 NHS Trust Research Tissue Bank에 의해 얼음 상 Aqix RS-I 배지(Aqix Ltd) 중에 공급받았다. 조직을 PBS 중 400 mg/mL로 희석하고, 조직 균질화장치를 이용해서 30초 동안 균질화하였다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. HUVEC을 다양한 농도의 폐 용해물로 자극하였다. 항체 중화 연구를 위해 IL-8 방출을 자극한 용해물의 EC50 농도를 선택하였다. 세포를 전술된 바와 같이 평가 항체의 존재 또는 부재 하에 폐 용해물에 노출시켰다. sST2는 최대 약 70%만큼 IL-8 반응을 억제하여, 전부는 아니라도 대부분의 IL-8 생성이 폐 용해물 내에서 내인성 IL-33에 의해 유도됨을 제시하였다. 33_640050 및 33_640087-7B IgG는 sST2와 유사한 정도로 IL-8 반응을 억제하여, 내인성 IL-33에 결합하고 이를 중화하는 이의 능력을 나타내었다. 33_640050 IgG는 0.032 nM의 IC50으로 폐 용해물을 중화하였다. 33_640087-7B는 0.013 nM의 IC50으로 폐 용해물을 중화하였다. sST2는 0.019 nM의 IC50으로 폐 용해물을 중화하였다.
도 51은 sST2 대비 평가 항체 33_640050 및 33_640087-7B의 존재 하에 인간 폐 용해물로 자극된 HUVEC을 나타내며, 여기서 x-축은 몰 농도의 항체 농도이며 y-축은 최대 반응 백분율(IL-8 생성)이다. sST2는 최대 약 70%만큼 IL-8 반응을 억제하여, 전부는 아니라도 대부분의 IL-8 생성이 폐 용해물 내에서 내인성 IL-33에 의해 유도됨을 제시하였다. 두 항체는 모두 sST2와 유사한 정도로 IL-8 반응을 억제하여, 내인성 IL-33에 결합하고 이를 중화하는 이의 능력을 나타내었다.
생체내 기도 염증 모델
인간화 IL-33 마우스의 생성 방법은 실시예 4에 전술되었다. 인간화 마우스를 실시예 9에 기재된 바와 같은 알터나리아 알터나타(ALT) 유도 기도 염증 모델에서 이용하여 33_640087-7B의 효과를 평가하였다. 수컷 또는 암컷 야생형 또는 인간화 IL-33 마우스(6~10주령)를 이소플루란으로 잠시 마취하고 총 부피 50 ㎕ 중 25 ㎍의 ALT 추출물(Greer, Lenoir, NC) 또는 비히클을 비내 투여하였다. 마우스를 ALT를 이용한 비내 유발접종 24시간 전에 평가 물질: 33_640087-7B IgG(SEQ ID No. 618 및 618), 이소형 대조군 IgG(NIP228) 또는 비히클(PBS, 10 ml/kg)로 복강내 처리하였다. 유발접종 24시간 후, 마우스를 펜토바르비탈 나트륨으로 최종 마취한 뒤 사혈 및 기관지폐포 세척(BAL)하였다. 기관지폐포 세척액(BALF)을 경기관 캐뉼라를 통해 세척에 의해 수집하였다(0.3 ml, 0.3 ml 및 0.4 ml). BALF를 원심분리하고 상청액을 ELISA에 의해 사이토카인에 대해 분석하였다(Meso Scale Discovery, Rockville, MD). 모든 작업을 적절한 프로젝트 승인 권한 하의 UK 본사 윤리 및 사육 표준에 따라 수행하였다.
도 52는 33_640087-7B 투여가 인간화 IL-33 마우스에서 알터나리아-유도 BAL IL-5를 용량 의존적으로 억제함을 나타낸다. 평가 물질을 25 ug의 알터나리아를 이용한 유발접종 전 -24시간에 복강내 투여하였다(괄호 내에 나타낸 바와 같이 0.1, 1, 3 또는 10 mg/kg). BALF를 ALT 유발접종 24시간 후 수확하고 IL-5의 존재에 대해 분석하였다. 평가 물질의 유의미한 효과를 Bonferroni의 다중 비교 평가와 함께 원-웨이 ANOVA를 이용해서 결정하였다. ***p<0.001, **p<0.01(n=5~6).
실시예 11 항-IL-33 항체의 친화도
재조합 인간 IL33에 대한 항-IL-33 항체 단편(Fab)의 친화도를 BIACORE™에 의한 실시간 상호작용 모니터링을 이용해서 33_640087-7B에 대해서는 KinExA™를 이용해서 평형에서 결정하였다. 두 방법론 모두에 있어서, biacore 분석을 위해 인간 IL33 단백질을 SEC-HPLC에 의해 정제하여 항원 및 또한 Fab의 품질을 보장하였다.
Biacore 친화도 분석
Fab 단편을 전장 IgG1으로부터의 파파인 절단에 의해 생성하고 SEC에 의해 정제하였다. 항체 단편(Fab)의 친화도를 25℃에서 Biacore T100을 이용해서 측정하였다. 스트렙타비딘을 10 mM 나트륨 아세테이트 pH 4.5 중 4 ㎍/ml의 농도로 표준 아민 커플링 기법을 이용해서 C1 칩 표면으로 공유 고정화하였다. 범위 115~170 RU의 전형적인 최종 스트렙타비딘 표면 밀도를 달성하였다. 재조합, 효소적 바이오틴화 인간 IL-33(사제 생성됨)을 HBS-EP+ 완충액 중 4 ㎍/ml로 스트렙타비딘 칩 표면 상으로 적정하여 포화 시 약 30 RU의 Fab 결합을 구현하였다(Rmax). 이러한 저수준의 분석물질 결합으로 최소 질량 수송 효과를 보장하였다.
IL-33 Fab를 HBS-EP+ 완충액 중 5 nM부터 78 pM까지 연속 희석하고 50 ㎕/분으로 칩 상에 흘려, 연합 3분 및 해리 최대 30분을 얻었다. 동일한 조건 하에 다회 완충액 단독 주입을 수행하여 최종 센소그램 세트의 이중 참조 감산을 허용하였고, 이를 BiaEval 소프트웨어(version 2.0.1)를 이용해서 분석하였다. 칩 표면을 3M MgCl2 펄스로 완전 재생시켰다.
인간 IL-33에 대한 HEK-EBNA 세포에서 발현된 ST2-Flag-His10(SEQ. ID no. 650)의 친화도를 상술된 것과 동일한 방법을 이용해서 BIACORE™에 의해 결정하였다.
[표 36]
Figure pct00063
KinExA 친화도 분석
SPR 검정으로 나타난 고친화도를 확인하기 위해, 동역학 배제 검정(KinExA)으로 전환하였다. KinExA은 더 높은 친화도의 단백질:단백질 상호작용, 특히 표면 기반 바이오센서 기법이 이의 실질 한계에 도달하는 pM 내지 pM 미만 범위의 상호작용의 분해에 바람직한 것이 점점 더 확인되고 있다(Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Qiaojuan JS , Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub- picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005; 334: 1004-1013).
항체 33_640087-7B의 친화도를 KinExA 3200 상에서 수행된 동역학 배제 검정에 의해 측정하였다. 샘플링 비드는 일정하게 진탕하면서 2시간 동안 실온에서 200 mg의 건조 UltraLink Biosupport Azlactone 비드를 2.5 ml의 50 mM 나트륨 수소 바이카보네이트 pH 8.4 중 110 ㎍의 IL-33(전술된 바와 같음)과 혼합하여 제조하였다. 비드를 헹구고 1 M Tris pH 8.7 중 10 mg/ml BSA로 차단하였다. 이용 전에, 비드를 D-PBS, 0.02% 나트륨 아자이드 내로 재현탁하였다. 33_640087-7B/IL-33 평형 혼합물을 DPBS(Dulbecco의 PBS) 중 1 mg/ml BSA, 0.02% 나트륨 아자이드로 이루어진 샘플 완충액 중에 제조하였다. 2개의 상이한 IgG 농도를 가변 IL-33 농도와, 5 pM의 33_640087-7B를 125 pM부터 61 fM까지 연속 희석된 IL-33과 및 500 fM 33_640087-7B를 62.5 pM부터 15 fM까지 연속 희석된 IL-33과 이용하였고, 둘 다 IL-33 대조군 없이 수행하였다. 형광 이차 검출 시약은 DPBS 중 1 mg/ml BSA, 0.02% 나트륨 아자이드, 0.1% Tween 20에 희석된 Alexa Fluor 647 염소 항-인간-Fc였다. 샘플을 25℃로 설정된 온도 조절 캐비넷에 수용하여 KinExA 상에서 분석하였다. 데이터를 KinExA Pro 소프트웨어 version 4.1.11을 이용해서 분석하였다.
KinExA 검정은 33_640087-7B가 인간 IL-33에 대해 142 fM(펨토몰 농도) 미만의 KD를 가짐을 시사한다(표 37).
[표 37]
Figure pct00064
실시예 12 산화 IL-33의 활성
산화 IL-33의 활성을 탐색하기 위한 생체내 파일롯 연구
실시예 4(또한 문헌[Cohen, E. S. et al. Oxidation of the alarmin IL-33 regulates ST2-dependent inflammation. Nat. Commun . 6:8327 doi : 10.1038/ncomms9327 (2015)] 참고)에서, IL-33의 산화, 디설파이드 결합 형태(DSB IL-33)의 발견을 기재하고, 상기 형태가 ST2에 결합하지 않음을 나타내었다. 산화 IL-33이 ST2와 무관한 대안적 활성을 가졌는지를 조사하기 위해, ST2-결핍 마우스를 2, 4 또는 6주 동안 인간 IL-33의 반복 투여로 복강내 또는 비내 처리하였다. 조직학적 분석을 여러 조직 상에서 수행하였다.
ST2-결핍 마우스를 전술된 바와 같이 생성하였다( Townsend , M.J ., Fallon , P.G., Matthews, D.J ., Jolin , H.E ., and McKenzie, A.N.J . (2000). T1/ST2-deficient mice demonstrate the importance of T1/ST2 in developing primary T helper cell type 2 responses. J. Exp . Med . 191, 1069-1076). 암컷 ST2-결핍 마우스(12주령)를 이소플루란으로 짧게 마취하고 총 부피 50 ㎕ 중 10 ㎍의 N-말단 His Avi IL-33(IL33-01, SEQ ID NO 632; 로트 번호 CCH168, 내독소 수준 0.03 EU/mg), 또는 비히클(PBS)을 비내 투여하였다. 대안적으로, IL-33 또는 비히클을 i.p. 주사에 의해 투여하였다. 상기 공정을 총 18회 처리 동안 주 3회 반복하였다. IL-33을 이용한 2 또는 4주 처리만을 수여받은 마우스에, IL-33 수여 전에, 처음 투여 4 또는 2주 동안 PBS를 투여하였다.
최종 처리 24시간 후, 마우스를 펜토바르비탈 나트륨으로 최종 마취한 후 사혈 및 기관지폐포 세척(BAL)하였다. EDTA 플러싱 주사기를 이용해서 심장 방혈로 혈액을 수집하였다. Sysmex XTVet 혈액학 분석장치를 이용해서 혈액학을 수행하였다. 잔여 혈액을 원심분리하고 혈장 추출하였다. 기관지폐포 세척액(BALF)을 경기관 캐뉼라를 통해 세척에 의해 수집하였다(0.3 ml, 0.3 ml 및 0.4 ml). BAL 세포를 계수하고(유세포 측정장치(MACSquant, Miltenye Biotec)에 의한 BAL 총 세포) BALF를 원심분리하여 상청액을 분리하고 ELISA(Meso Scale Discovery, Rockville, MD)에 의해 사이토카인에 대해 분석하였다. 차별적 세포 카운트(200세포/슬라이드)를 Diff-Quik(Fisher Scientific, UK)로 염색된 사이토스핀 조제물 상에서 수행하였다. PBS 세척 후, 폐를 기관 주입을 통해 10% 중성 완충 포르말린(NBF)으로 팽창시켜 24~48시간 동안 NBF 중 폐 구조를 유지하고 침지-고정하였다. 이이서 고정 폐 샘플을 4개의 동일 단면적으로 횡단 절단한 뒤 일련의 알코올, 자일렌을 통해 파라핀 왁스 내로 가공하였다. 마지막으로 폐 단면을 파라핀 왁스 블록 내로 포매하였다. 4 ㎛ 조직학 섹션을 절단하고 분석 및 염증 스코어링 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다.
모든 작업을 적절한 프로젝트 승인 권한 하의 UK 본사 윤리 및 사육 표준에 따라 수행하였다.
복강내 또는 비내 경로를 통한 IL-33 노출을 조사하기 위해, 인간 IL-33을 실시예 4에 기재된 바와 같이 Millipore 인간 IL-33 검정(Cat #HTH17MAG-14K 로트 2159117)을 이용해서 BALF 및 혈장 중에서 측정하였다. 검정 신호를 감소시키는 sST2-Fc의 능력을 이용하여 ST2-결합(환원) 대 비-ST2-결합(산화) IL-33의 존재를 결정하였다. 비내 투여 후, IL-33은 2, 4 및 6주 종결점에 BALF 및 혈장 중에서 일치하게 검출되었다. 검출된 대부분의 IL-33은 산화되었다. 단회 복강내 투여 후, IL-33은 투여 5시간 후 혈장에서 일시적으로 검출되었으나 24시간 경에는 검출 불가능하였다. 반복 IL-33 투여 후, 인간 IL-33은 2, 4 또는 6주 종결점에 BALF 또는 혈장 중에서 일치하게 검출되지 않았다. 이들 데이터는 산화 IL-33의 최적 전신 노출이 비내 투여를 통해 달성됨을 시사하였다.
도 53의 A. 생체내 파일롯 연구의 실험 설계. ST2-결핍 마우스에 6주 동안 인간 IL-33 또는 비히클(PBS)을 반복 투여로 복강내 또는 비내 처리료하였다(군 당 n=3~4). 조직, BALF 및 혈청을 최종 IL-33 투여 24시간 후 수집하였다.
도 53의 B. BALB/c 마우스에 대한 인간 IL-33의 반복 투여 후 BAL 유체 중 인간 IL-33 노출 분석. 인간 IL-33을 도 53의 A에 기재된 바와 같이 처리 마우스로부터의 BALF 중에 측정하였으며, 여기서 x-축은 처리군을 나타내고 y-축은 임의 단위의 인간 IL-33 검정 신호를 나타낸다. IL-33은 비내 투여 후 BALF에서만 검출되었다. 검출 IL-33은 주로 산화된 것으로 나타났다(비-ST2 결합).
도 53의 C 인간 IL-33(10 ug)의 단회 복강내 투여 후 혈장 중 IL-33 노출 분석. 인간 IL-33을 투여 2, 5, 24 및 48시간 후 혈장 중에 측정하였고, 여기서 x-축은 분석 시점을 나타내며 y-축은 임의 단위의 인간 IL-33 검정 신호를 나타낸다. IL-33은 투여 5시간 후 혈장에서 일시적으로 검출되었으나 24~48시간 경에는 검출 불가능하였다.
도 53의 D BALB/c 마우스에 대한 인간 IL-33의 반복 투여 후 혈장 중 인간 IL-33 노출 분석. 인간 IL-33을 도 53A에 기재된 바와 같이 처리 마우스로부터의 혈장 중에 측정하였으며, 여기서 x-축은 처리군을 나타내고 y-축은 임의 단위의 인간 IL-33 검정 신호를 나타낸다. IL-33은 비내 투여 후 혈장에서만 검출되었다. 검출 IL-33은 주로 산화된 것으로 나타났다(비-ST2 결합).
조직학적 분석을 여러 조직 상에서 수행하였다. 간, 뇌, 비장, 피부, 위, 림프절 또는 심장에서 대조군 대비 인간 IL-33 처리 마우스에서 관련 비정상성 없음. 폐에서, 증가된 림프구 혈관주위 염증은 대조군 대비 IL-33 처리 마우스에서 비내 군에서만 그리고 6주 처리 후에만 존재하였다. 이는 산화 IL-33에 대한 가장 높은 노출과 일치한다(도 53). 결론적으로, ST2 KO 마우스의 IL-33으로의 처리는 대조군 대비 IL-33 처리 마우스의 폐에서 혈관주위 림프구 침윤물의 존재를 증가시킨다. 상기 병리는 산화 IL-33을 통해 매개될 수 있다.
도 54의 A는 6주 동안 비내 PBS가 투여된 마우스로부터의 폐 조직의 대표적 H&E 염색 파라핀 섹션을 나타낸다(n=3)
도 54의 B는 6주 동안 비내 IL-33이 투여된 마우스로부터의 폐 조직의 대표적 H&E 염색 파라핀 섹션을 나타낸다(n=4).
IL-33 처리 마우스 폐의 경로 분석
관찰된 염증성 반응으로 이어지는 마우스 폐에서 산화 IL-33에 의해 조정된 경로에 대한 식견을 얻기 위해, 6주 PBS 처리 대 6주 IL-33-처리 동물로부터의 폐 조직 상에서 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
7마리 ST2KO 마우스(전술된 바와 같이 PBS가 투여된 3마리 및 IL33-01이 투여된 4마리)로부터의 폐 조직을 수집하고 350 uL의 RLT 완충액(Qiagen #79216) 내로 직접 배치하였다. 이어서 조직을 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen TissueLyser(Qiagen #85300)를 이용해서 손상시키고 RNA를 RNeasy Fibrous Tissue 키트(Qiagen #74704)를 이용해서 정제하였다. 이어서 상기 키트로부터의 정제 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Micro Columns(Qiagen #74004)을 이용해서 농축하였다. 이어서 RNA를 Affymetrix의 GeneChip WT Plus Reagent 키트(Affymetrix #902513)를 이용해서 단일쇄 DNA로 증폭하고 Mouse Transcriptome 1.0(MTA1.0) 유전자칩(Affymetrix #900720) 상으로 혼성화하고, Affymetrix Fluidics Station에서 세척하고 Affymetrix Genechip Scanner 3000 7G 상에서 스캐닝하였다. 이어서 데이터를 Affymetrix Expression 콘솔에서 처리하였다. 데이터를 Microsoft Excel에서 분석하고 4마리의 IL33-처리 마우스 중 적어도 2마리가 대조군 평균으로부터의 신호보다 ±1.2-배 초과 변화를 가진 유전자에 대해 정렬하였다. 정렬 유전자 목록을 Biological Database Network(BioDBnet v2.1)를 이용해서 KEGG ID로 전환하고 KEGG 경로 분석에서 분석하였다(http://www.kegg.jp; KEGG Mapper v2.5). KEGG 경로에서 분석된 동일한 유전자를 또한 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)(Qiagen)를 이용해서 분석하였다. IPA 분석은 세포 주기 관련 경로가 조정된 것으로 나타남을 제시하였다. 예시적 유전자가 표 38에 기재된다.
[표 38]
Figure pct00065
Huvec에서 DSB IL-33의 신호전달
산화(DSB) 인간 IL-33에 대한 반응이 인간 세포 상에서 관찰될 수 있는지를 확인하기 위해, 시험관내 인간 세포의 자극을 탐색하였다. 마우스 마이크로어레이 분석은 세포 주기에 관련된 경로의 활성화를 시사하였으며 이에 따라 p38 MAP 키나제 및 JAK-STAT 신호전달을 조사하였다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Huvec)를 제조업체의 지침에 따라 배양하고 환원 또는 DSB IL-33으로 자극하였다. p-p38 MAPK 또는 p-STAT5의 핵 전위를 면역형광 염색에 의해 검출하였다. 핵 염색 세기의 조영 및 정량을 ArrayScan VTi HCS 판독장치(Cellomics) 상에서 수행하였다. 검정은 본질적으로 NFkB p65/RelA 핵 전위에 대해 기재된 것과 동일했지만, 다음 변형을 포함하였다.
p-p38 MAPK 검정을 위해, Huvec을 96-웰 검은색 벽의 투명 평탄-바닥 콜라겐 I 코팅 플레이트(Greiner # 655956) 내로 배양 배지[EGM-2 SingleQuot 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, #CC-4176) 함유 EBM-2(Lonza, #CC-3156)] 중에 1x104/75 ㎕/웰로 접종하고 18~24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 환원 또는 DSB IL-33의 평가 샘플(2개씩)을 96웰 U형-바닥 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201) 내 완전 배양 배지 중에 원하는 농도까지 희석하고 75 uL를 Huvec 플레이트로 첨가하여 자극을 개시하였다. 37℃에서 15 또는 30분 검정 인큐베이션 후, 세포를 3.7% 포름알데하이드 용액 중 15분 동안 고정하였다(37℃로 사전 가온된 16% 용액 50 uL의 첨가에 의해). 고정제를 흡인하고 세포를 100 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 1:250 희석도의 포스포-p38 항체(Cell signalling #9211S)로 p-p38에 대해 염색하였다. 간략하게, 세포를 실온에서 15분 동안 투과화하고, 15분 동안 차단하고, 50 ㎕ 부피의 일차 항체 용액으로 1시간 동안 염색하였다. 플레이트를 차단 완충액 중 2회 세척하고 이차 항체 용액(DyLight 488-표지 염소 항-토끼 IgG; 1:400 희석도의 ThermoFisher Scientific #35552) 및 Hoechst 핵 염색(1:10000 희석도의 ThermoFisher Scientific #62249)으로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 플레이트를 PBS 중에 2회 세척하였다. 세포를 150 ㎕/웰 PBS의 최종 부피 중에 보관하고, 검은색 차광 밀봉(Perkin Elmer, #6005189)으로 덮은 뒤 ArrayScan VTi HCS 판독장치 상에서 판독하였다. 핵 염색 세기를 적합한 알고리즘을 이용해서 계산하였다. 데이터를 Graphpad Prism 소프트웨어를 이용해서 분석하였다.
pSTAT5 검정을 위해, Huvec을 96-웰 검은색 벽의 투명 평탄-바닥 콜라겐 I 코팅 플레이트(Greiner # 655956) 내로 배양 배지[EGM-2 SingleQuot 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, #CC-4176) 함유 EBM-2(Lonza, #CC-3156)] 중에 1x104/75 ㎕/웰로 접종하고 18~24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 상기 완전 배지를 흡인한 뒤, 세포를 100 uL PBS/웰 중에 2회 세척하고, PBS를 흡인하고 75 uL의 위축(Starve) 배지[pen/strep 함유 EBM-2(Lonza, #CC-3156)]를 각 웰에 첨가하였다. 이어서 세포를 18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 환원 또는 DSB IL-33의 평가 샘플(2개씩)을 96웰 U형-바닥 폴리프로필렌 플레이트(Greiner, 650201) 내 위축 배지 중에 원하는 농도까지 희석하고 75 uL를 Huvec 플레이트로 첨가하여 자극을 개시하였다. 37℃에서 15 또는 30분 검정 인큐베이션 후, 세포를 3.7% 포름알데하이드 용액 중에 15분 동안 고정하였다(37℃로 사전 가온된 16% 용액 50 uL의 첨가에 의해). 고정제를 흡인하고 세포를 100 ㎕/웰의 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 1:250 희석도의 포스포-STAT5 토끼 항체 C71E5(Cell Signalling #9314S)로 p-STAT5에 대해 염색하고, 상술된 바와 같이 검출하였다.
환원 IL-33은 p-p38 MAPK 신호전달을 유발하였으며, 이는 NFkB 신호전달에 대해 전술된 바와 유사하게(실시예 4~6) DSB 형태로의 산화 시 소실되었다(도 55의 A). 그러나 환원 IL-33이 아닌 DSB IL-33은 p-STAT5 신호전달을 유발하였다(도 55의 B). 따라서 인간 IL-33이 환원 형태로부터 DSB 형태로 전환 시 신호전달 경로 활성화에서 뚜렷한 변환이 관찰되었으며, DSB IL-33이 공지된 IL-33 경로와 구별되는 활성을 가질 수 있음을 제시하였다.
핵 전위 검정으로부터의 결과를 확인하기 위해, IL-33 신호전달을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. Huvec을 상술된 바와 같이 15분 동안 환원 또는 DSB IL-33(3 ng/mL)으로 자극하였다. 이어서 세포를 빙냉 PBS 중에 2회 세척하고 HALT 프로테아제 억제제(Pierce #78430)를 함유하는 250 uL RIPA 완충액(Pierce #89901)으로 용해시켰다. 샘플을 환원성 조건 하에 SDS-PAGE를 거쳤다. 샘플을 4xNuPAGE 겔 로딩 완충액(Invitrogen)과 3:1로 혼합하고 3분 동안 90℃에서 변성시켰다. 환원 샘플은 2% 베타-메르캅토에탄올을 함유하였다. 제조업체의 지침에 따라 MOPS 진행 완충액(Invitrogen)으로 NuPAGE Novex 4~12% Bis-Tris 미니 겔(Invitrogen) 상에서 샘플을 진행시켰다. 단백질을 니트로셀룰로스 막(Invitrogen cat. no. IB3010-02)으로 옮기고 토끼 포스포-p38 MAPK 항체(Cell signalling #9211S), 토끼 포스포-STAT5 항체 C71E5(Cell Signalling #9314S) 또는 토끼 p-JAK2 항체(Cell Signalling #3771S)를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출하였다. 일차 항체를 항-토끼-HRP(Cell Signalling #7074)로 검출하고 ECL 시약(Thermo Scientific #34096)을 이용해서 가시화하였다.
도 55의 A는 환원 IL-33 또는 DSB IL-33(IMDM 배지로 사전-처리된 IL33-01)에 반응하는 Huvec에서의 p-p38 MAPK 핵 전위 활성을 나타내며, 여기서 x-축은 IL-33 농도를 나타내고 y-축은 임의 단위의 핵 전위 신호를 나타낸다. 산화 IL-33이 아닌 환원 IL-33에 대해 농도 의존적 신호가 관찰되었다.
도 55의 B는 환원 IL-33 또는 DSB IL-33(IMDM 배지로 사전-처리된 IL33-01)에 반응하는 Huvec에서의 p-STAT5 핵 전위를 나타내며, 여기서 x-축은 IL-33 농도를 나타내고 y-축은 임의 단위의 핵 전위 신호를 나타낸다. 환원 IL-33이 아닌 DSB에 대해 농도 의존적 신호가 관찰되었다.
도 55의 C. 환원 IL-33 또는 DSB IL-33(IMDM 배지로 사전-처리된 IL33-01)으로 15분 동안 자극된 Huvec에서의 p-p38 MAPK, p-JAK2 및 p-STAT5에 대한 웨스턴 블롯 분석. DSB IL-33이 아닌 환원 IL-33을 이용한 자극 후 p-p38 MAPK의 활성화가 검출되었다. 환원 IL-33이 아닌 DSB IL-33을 이용한 자극 후 p-JAK2 및 p-STAT5의 활성화가 검출되었다.
DSB IL-33의 신호전달이 진행성 당화 종말 생성물에 대한 수용체(RAGE)를 통해 매개됨
Huvec에서 DSB IL-33에 의해 조정된 경로에 대한 식견을 얻기 위해, Huvec을 전술된 바와 같이 배양하고, 6웰 조직 배양 처리 플레이트(Nunc 140675)에 1x106 세포/웰로 접종하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 세포를 2 또는 6시간 동안 DSB IL-33으로 자극하였다. 세포를 350 uL의 RLT 완충액(Qiagen #79216) 중에 수집하였다. RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Micro 키트(Qiagen #74004)를 이용해서 정제하였다. 이어서 RNA를 Affymetrix의 GeneChip WT Plus Reagent 키트(Affymetrix #902513)를 이용해서 단일쇄 DNA로 증폭하고 Human Genome U133A 2.0(U133A 2.0) 유전자칩(Affymetrix #900469) 상으로 혼성화하고, Affymetrix Fluidics Station에서 세척하고 Affymetrix Genechip Scanner 3000 7G 상에서 스캐닝하였다. 그 뒤, 데이터를 Affymetrix Expression 콘솔에서 처리하고 미처리 대조군으로부터의 신호보다 ±1.8-배 초과 변화를 갖는 유전자에 대해 정렬하였다. 매우 적은 유전자 발현 변화가 관찰되었다(표 39). 그럼에도 불구하고, Ingenuity 경로 분석(IPA)(Qiagen)을 이용해서 제한된 유전자 패널을 분석하여, 2시간째에 EIF2 신호전달 경로 및 6시간째에 AGER 신호전달을 제시하였다. 잠재적으로 이들은 제거/진행성 당화 종말 생성물에 대한 수용체(RAGE) 경로 활성화를 제시하였다.
[표 39]
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진행성 당화 종말 생성물에 대한 수용체(RAGE)는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 다중-리간드 수용체이며, 고-이동성 그룹 박스 1(HMGB-1), S100 단백질 패밀리, 진행성 당화 종말 생성물(AGE) 및 β-시트 섬유상 물질을 포함하는 다양한 리간드를 인식한다. 이는 산화적 스트레스에 관여되는 것으로 여겨지며, 여러 질환의 발병기전에 연관되었다.
DSB가 RAGE와 직접 상호작용했는지를 평가하기 위해, ELISA 포맷을 이용해서 환원 IL-33 대 DSB IL-33에 대한 RAGE 결합을 탐색하였다(도 56의 A). 환원 또는 DSB N-말단 His Avi IL-33(IL33-01, SEQ ID NO 632)을 실시예 7에 기재된 바와 같이 바이오틴화하였다. 스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific, AB-1226)를 PBS 중 50 ㎍/ml의 바이오틴화 항원으로 코팅하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T(PBS + 1%(v/v) Tween-20)로 3회 세척하고 1시간 동안 300 ㎕/웰 차단 완충액(1% BSA 함유 PBS(Sigma, A9576))으로 차단하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하였다. RAGE-Fc(R&D Systems #1145-RG)를 차단 완충액 중 희석하고, IL-33-코팅 또는 대조군(IL-33 비함유) 웰로 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. RAGE-Fc를 실온에서 1시간 동안 차단 완충액 중 1:5000 희석된 항-인간 IgG HRP(Sigma, A0170), 50 ㎕/웰로 검출하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, TMB, 50 ㎕/웰(Sigma, T0440)로 발색시켰다. 반응을 50 ㎕/웰 0.1 M H2SO4로 켄칭한 뒤 450 nm에서 EnVision™ 플레이트 판독장치, 또는 유사한 장비 상에서 판독하였다.
DSB IL-33과 RAGE의 상호작용을 추가 확인하기 위해, Huvec에서 ST2-독립적 pSTAT5 신호전달을 억제하는 RAGE-Fc 또는 항-RAGE 항체의 능력을 평가하였다. 상기 목적을 위해, 다양한 농도의 DSB IL-33(IMDM-처리 IL33-01)을 이용하여 RAGE-Fc(R&D Systems #1145-RG), ST2-Fc(R&D Systems #523-ST), 항-RAGE mAb(WO 2008137552 참고) 또는 대조군 시약의 존재 또는 부재 하에 상술된 프로토콜에 따라 Huvec을 자극하였다. RAGE-Fc를 이용한 DSB IL-33의 중화(도 56의 B), 또는 항-RAGE mAb를 이용한 수용체의 중화(도 56의 C)는 pSTAT5 신호를 완전 억제할 수 있었다.
도 56의 A. ELISA에 의한 환원 IL-33 또는 DSB 플레이트 표면으로의 RAGE-Fc의 결합으로, 여기서 x-축은 RAGE-Fc 농도를 나타내며 y-축은 450 nM에서의 흡광도를 나타낸다. 데이터는 환원 IL-33 대비 DSB IL-33에 대한 RAGE의 증가된 결합을 나타낸다.
도 56의 B는 RAGE-Fc(50 ug/mL), ST2-Fc(50 ug/mL) 또는 항-NIP IgG1 음성 대조군 항체, NIP228(50 ug/mL)의 존재 하에 Huvec에서 DSB IL-33에 대한 pSTAT5 반응을 나타낸다. pSTAT5 신호전달은 ST2-Fc 또는 NIP228에 의해서가 아니라 RAGE-Fc에 의해 완전 억제되었다.
도 56의 C는 항-RAGE mAb, m4F4(10 ug/mL), 또는 마우스 IgG1 음성 대조군 항체(10 ug/mL)의 존재 하에 Huvec에서 DSB IL-33에 대한 pSTAT5 반응을 나타낸다. pSTAT5 신호전달은 대조군 mAb에 의해서가 아니라 m4F4에 의해 완전 억제되었다.
항-IL-33 항체를 이용한 DSB IL-33 활성의 방지
실시예 8에 기재된 바와 같이, IL-33에 결합하는 항체는 IL-33의 DSB 형태로의 산화를 방지할 수 있다(도 43의 A). Huvec에서 IL-33 항체가 pSTAT5 신호전달을 방지하는 능력을 평가하였다.
고정 농도의 33_640087-7B(SEQ ID No 616 및 618), 항-ST2(WO 2013/173761 Ab2; SEQ ID 85 및 SEQ ID 19로부터) 및 이소형 대조군 mAb를 IMDM 중에 제조한 뒤 96웰 U형-바닥 플레이트에서 WT IL-33의 적정물(역시 IMDM에서 제조됨)과 조합하였다(100 uL과 100 uL를). 플레이트를 하룻밤 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이들 '인큐베이션 전 처리'플레이트의 각 웰로부터의 75 uL를 pSTAT5 검정에 대해 상술된 바와 같이 제조된 '위축'세포에 첨가하고 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 빙냉 PBS 중에 2회 세척하고 eBioscience Phospho-STAT5A/B Instant One ELISA(eBioscience # 85-86112-11)로부터 100 uL 용해 완충액을 각 웰로 첨가하였다. 이어서 세포 용해물에서의 pSTAT5 활성을 제조업체의 지침에 따라 측정하였다.
도 57은 33_640087-7B(10 ug/mL) 또는 항-ST2 mAb, Ab2(10 ug/mL)의 존재 하에 IMDM으로 처리된 IL-33에 대한 Huvec에서의 pSTAT5 반응을 나타내며, 여기서 x-축은 IL-33의 농도이며 y축은 pSTAT5 신호이다. pSTAT5 신호전달은 항-ST2가 아니라 33_640087-7B에 의해 완전 억제되어, 상기 반응이 ST2-의존적임을 확인시켜 주었다.
항-IL-33 항체가 상피 세포에서 RAGE-의존적 반응을 억제함
RAGE는 폐 상피 세포에서 고도 발현된다. 폐 상피 세포주를 DSB IL-33 의존적 반응에 대해 평가하였다. 상기 목적을 위해, A549 세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS가 보충된 F12K 배지(Gibco #21127022) 중 배양하였다. 세포를 0.5% 트립신-EDTA(Gibco, #15400-054)로 수확하고, 세척하고, 배양 배지 중 1x105/세포/웰로 96웰 플레이트에 접종하였다. 이어서 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음 날 전체 배지를 제거하고, 세포를 PBS 중에 2회 세척하고 배지를 '위축'배지(1% Pen/Strep 함유 F12K 배지)로 대체하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
고정 농도의 33_640087-7B(SEQ ID No 616 및 618), 항-ST2(WO 2013/173761 Ab2(SEQ ID 85 및 SEQ ID 19) 참고), 항-RAGE m4F4(WO2008137552 참고) 및 이소형 대조군 mAb를 IMDM 중에 제조한 뒤 96웰 U형-바닥 플레이트에서 WT IL-33(역시 IMDM에서 제조됨)과 조합하였다(100 uL과 100 uL를). 세포 및 처리 플레이트를 모두 하룻밤 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이들 '인큐베이션 전 처리' 플레이트의 각 웰로부터의 75 uL를 상술된 바와 같이 제조된 '위축' 세포에 첨가하고 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 플레이트 인큐베이션하였다. 그 뒤 96웰 트랜스웰 플레이트를 저결합 96웰 리시버 플레이트에 추가함으로써 96웰 트랜스웰 시스템(Corning # CLS3422-48EA)을 설정하였다. 235 uL의 완전 배지(10% FBS 및 1% Pen/Strep이 보충된 F12K 배지)를 트랜스웰 시스템의 하부 챔버로 첨가하였다. 이어서 A549 세포가 처리된 96웰의 각 웰을 PBS 중에 세척하고, 트립신 처리하여 탈착하고, 5분 동안 1000 rpm에서 원심분리하고, 75 uL '위축' 배지 중에 재현탁하고 트랜스웰 시스템의 상부 챔버로 첨가하였다. 그 뒤 트랜스웰 플레이트를 16시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배지를 상부 및 하부 챔버로부터 모두 제거하고 세포를 235 uL 트립신을 이용해서 하부 챔버로부터 제거하였다. 그 뒤 100 uL의 트립신/세포 현탁액을 100 uL의 Cell Titer Glo(Promega #G7571)에 첨가하였다. 신선 A549 세포의 적정물을 트립신 중에 제조하고 50:50으로 Cell Titer Glo에 첨가하여 세포 수 표준 곡선을 생성하였다. 이어서 플레이트를 인큐베이션하고 제조업체의 지침에 따라 판독하였다.
도 58의 A는 33_640087-7B(10 ug/mL), 항-ST2 mAb, Ab2(10 ug/mL), 또는 항-RAGE mAb 4F4의 존재 하에 인큐베이션된 IL33-01을 이용한 처리 후 A549 세포의 이동을 나타내며, 여기서 x-축은 세포 사전-처리 조건을 나타내며 y축은 이동한 세포 수이다. 데이터는 DSB IL-33을 이용한 A549 세포의 사전-처리가 후속 세포 이동을 감소시킴을 나타낸다. 상기 이동의 억제는 항-ST2에 의해서가 아니라 항-RAGE mAb 및 33_640087-7B에 의해 역전되었다.
도 58의 B는 33_640087-7B(10 ug/mL) 또는 항-ST2 mAb, Ab2(10 ug/mL)의 존재 하에 인큐베이션된 DSB IL33-01을 이용한 처리 후 A549 세포의 이동을 나타내며, 여기서 x-축은 세포 사전-처리 조건을 나타내며 y축은 이동한 세포 수이다. 데이터는 DSB IL-33을 이용한 A549 세포의 사전-처리가 후속 세포 이동을 감소시킴을 나타낸다. 상기 이동의 억제는 33_640087-7B 또는 항-ST2에 의해서 역전되지 않았다
종합하면, 이들 데이터는 33_640087-7B가 IL-33의 환원, ST2-활성 형태에만 결합하는 그 능력과 일치하게, DSB IL-33을 직접 중화하기보다는 환원 IL-33의 DSB IL-33으로의 전환을 방지함으로써 DSB IL_33 활성을 억제함을 확인시켜준다.
SEQUENCE LISTING <110> Medimmune Ltd <120> A NOVEL IL33 FORM, MUTATED FORMS OF IL33, ANTIBODIES, ASSAYS AND METHODS OF USING THE SAME <130> IL33-105WO1 <140> US 62/140,913 <141> 31 March 2015 <150> tbd <151> 30 March 2016 <160> 650 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiensIL330002 VH DNA <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagtcg 300 tattacgatt tttggagtgg ccaatattac tttgattact gggggcgggg gaccacggtc 360 accgtctcga gt 372 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiensIL330002 VH PRT <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiensIL330002 VH CDR1 PRT <400> 3 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiensIL330002 VH CDR2 PRT <400> 4 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiensIL330002 VH CDR3 PRT <400> 5 Glu Ser Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 321 <212> DNA <213> 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240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatctg 300 tggatgatga actacgcggg cggcttgcgt tatcccttcg gctactgggg ccaagggacc 360 atggtcaccg tctcctca 378 <210> 624 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens33_640237-2B VH PRT <400> 624 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ala Asp Asp Phe Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Trp Met Met Asn Tyr Ala Gly Gly Leu Arg Tyr Pro 100 105 110 Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 625 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens33_640237-2B VL DNA <400> 625 tcctatgtgc tgactcagcc 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Tyr Leu Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp 65 70 75 80 Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser 85 90 95 Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr 100 105 110 Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu 115 120 125 His Lys Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His 130 135 140 Asn Met His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly 145 150 155 160 Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu 180 185 190 Thr <210> 646 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL33-14 <400> 646 Met His His His His His His His His His His Ala Ala Gly Leu Asn 1 5 10 15 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Ala Ile Glu 20 25 30 Gly Arg Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp 65 70 75 80 Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser 85 90 95 Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr 100 105 110 Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu 115 120 125 His Lys Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His 130 135 140 Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly 145 150 155 160 Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp 165 170 175 Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu 180 185 190 Thr <210> 647 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL33-15 <400> 647 Met His His His His His His His His His His Ala Ala Gly Leu Asn 1 5 10 15 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Ala Ile Glu 20 25 30 Gly Arg Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser 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Trp 35 40 45 Tyr Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg 50 55 60 Val Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala Val Ala 65 70 75 80 Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg 85 90 95 Thr Gly Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Ser Asp Cys Asn 100 105 110 Val Pro Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn 115 120 125 Ser Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro 130 135 140 Leu Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Arg 145 150 155 160 Ala His Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala 165 170 175 Gly Asp Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr 180 185 190 Ser Val Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe 195 200 205 Ser Leu Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala Gln Asn Glu Ile Lys Glu 210 215 220 Val Glu Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly 225 230 235 240 Lys Gly Thr Gln Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr 245 250 255 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln 260 265 270 Asn Gln Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Val Leu Arg 275 280 285 Ile Ala Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gln Tyr Asp Cys Leu 290 295 300 Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu Ser Arg 305 310 315 320 Lys Asn Pro Ile Asp His His Ser Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val 325 330 335 Val Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala His His 340 345 350 His His His His His His His His 355 360

Claims (58)

  1. IL-33 단백질 내의 원상태 시스테인 간 디설파이드 가교의 형성을 감소시키거나 제거하는 변형에 의해 환원 형태로 안정화된 단리 IL-33 단백질 또는 이의 활성 단편.
  2. 변형에 의해 환원 형태로 안정화된 단리 IL-33 단백질 또는 이의 활성 단편으로서,
    (i) 하나 이상의 원상태 시스테인이 대안적 아미노산에 의해 대체되고;
    (ii) 하나 이상의 원상태 시스테인이 결실되고;
    (iii) 하나 이상의 원상태 시스테인이 화학적 대상체에 접합되는 단리 IL-33 단백질 또는 이의 활성 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단백질은 하나 이상의 시스테인이 비-시스테인 아미노산으로 대체되도록 돌연변이되는, 예를 들어 Cys-208, Cys-227, Cys-232 및 Cys-259로부터 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 시스테인이 대체되는 단리 IL-33 단백질 또는 이의 활성 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    하나 이상의 시스테인 잔기가 세린 잔기에 의해 대체되는 단리 IL-33 단백질 또는 이의 활성 단편.
  5. redIL-33 단백질의 활성을 약화시키거나 억제하는 결합 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    redIL-33의 IL-33 DSB로의 산화를 촉매하는 결합 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    분자가 IL-33-DSB에 결합하는 결합 분자.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 분자.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)이 SEQ ID NO:183, SEQ ID NO: 184 및 SEQ ID NO: 185의 VH CDR 1~3을 가지는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하며, 하나 이상의 VHCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 가지는 결합 분자.
  10. 제8항에 있어서,
    SEQ ID NO:183, SEQ ID NO: 184 및 SEQ ID NO: 185의 VHCDR 1~3을 포함하는 결합 분자.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:188, SEQ ID NO: 189 및 SEQ ID NO: 190의 VLCDR 1~3을 가지는 VL 및 VH를 포함하며, 하나 이상의 VLCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 가지는 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    SEQ ID NO:188, SEQ ID NO: 189 및 SEQ ID NO: 190의 VLCDR 1~3을 포함하는 결합 분자.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 183의 서열을 가지는 VHCDR1, SEQ ID NO: 184의 서열을 가지는 VHCDR2, SEQ ID NO: 185의 서열을 가지는 VHCDR3, SEQ ID NO: 188의 서열을 가지는 VLCDR1, SEQ ID NO: 189의 서열을 가지는 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 190의 서열을 가지는 VLCDR3을 포함하는 결합 분자.
  14. IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및 VL이 각각 SEQ ID NO: 182 및 SEQ ID NO: 187과 적어도 95%, 90%, 또는 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서,
    SEQ ID NO: 182의 서열을 가지는 VH 및 SEQ ID NO: 187의 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제5항에 있어서,
    상기 분자가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 IL-33 단백질에 결합하는 결합 분자.
  17. 제5항 또는 제16항에 있어서,
    상기 분자가 야생형 redIL-33과 교차-반응성인 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    야생형 redIL-33에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  19. 제5항 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 544 및 SEQ ID NO: 545의 VH CDR을 가지는 가변 중쇄 도메인(VH) 및 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하며, 하나 이상의 VHCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 가지는 결합 분자.
  20. 제19항에 있어서,
    SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 544 및 SEQ ID NO: 545의 VHCDR 1~3을 포함하는 결합 분자.
  21. 제5항, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 549 및 SEQ ID NO: 550의 VLCDR 1~3을 가지는 VL 및 VH를 포함하며, 하나 이상의 VLCDR은 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 가지는 결합 분자.
  22. 제21항에 있어서,
    SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 549 및 SEQ ID NO: 550의 VLCDR 1~3을 포함하는 결합 분자.
  23. 제20항 및 제22항에 있어서,
    SEQ ID NO: 543의 서열을 가지는 VHCDR1, SEQ ID NO: 544의 서열을 가지는 VHCDR2, SEQ ID NO: 545의 서열을 가지는 VHCDR3, SEQ ID NO: 548의 서열을 가지는 VLCDR1, SEQ ID NO: 549의 서열을 가지는 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 550의 서열을 가지는 VLCDR3을 포함하는 결합 분자.
  24. IL-33에 특이적으로 결합하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및 VL이 각각 SEQ ID NO: 542 및 SEQ ID NO: 547과 적어도 95%, 90%, 또는 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제24항에 있어서,
    SEQ ID NO: 542의 서열을 가지는 VH 및 SEQ ID NO: 547의 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. IL-33DSB 단백질의 활성을 약화시키는 결합 분자.
  27. 제26항에 있어서,
    진행성 당화 종말 생성물(RAGE)에 대한 수용체로의 IL-33 DSB의 결합을 방지하거나 감소시키는 결합 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 결합 분자.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 분자가 제5항 내지 제8항 및 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항의 것인 결합 분자.
  30. 제5항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 제5항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    자연 발생 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 단일쇄 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 제5항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    모노클로날 항체인 결합 분자, 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  34. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자, 이의 항원-결합 단편의 VH를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자, 이의 항원-결합 단편의 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  37. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제36항의 벡터를 포함하는 조성물.
  38. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제36항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  39. 적어도 제1 및 제2 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 제1 및 제2 벡터가 동일하지 않으며, 상기 제1 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 제34항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 제2 벡터는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 제35항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  40. 항-IL33 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 제38항 또는 제39항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항의 방법에 의해 제조되는, 항-IL33 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 샘플 중 redIL-33 발현의 검출 방법으로서,
    (a) 세포-함유 샘플을 단리하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 샘플 중 상기 결합 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편 및 담체를 포함하는 약학 조성물.
  44. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편 및 제2 치료제를 포함하는 조합 제품.
  45. 치료법에서 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제43항의 약학 조성물 또는 제44항의 조합 제품의 용도.
  46. 염증성 질병을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항에서 정의되는 결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제43항의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편이 IL-33 유도 사이토카인 생성을 억제하는, 대상체의 치료 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서,
    결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편이 RAGE 매개 효과를 억제하는, 대상체의 치료 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편이 IL-33 유도 사이토카인 생성 및/또는 RAGE 매개 효과를 억제하는, 대상체에서 염증성 반응의 예방 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염증성 질병이 알러지성 장애인 방법.
  51. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염증성 질병이 천식 또는 COPD인 방법.
  52. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염증성 반응이 상기 대상체의 기도에 있는 방법.
  53. 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 확인 방법으로서, redIL-33에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 선택하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 redIL-33 단백질의 활성을 약화시키는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서,
    상기 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 자연 발생 항체, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 단일쇄 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 모노클로날 항체인 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 대상체에서 염증성 질병의 치료 또는 예방에 효과적인 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 염증성 질병이 천식 또는 만성 폐색성 폐 질환인 방법.
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