KR20170136212A - 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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-
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Abstract
본 발명은, 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법에 있어서, 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액을 준비하는 단계와; 상기 줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성하는 단계와; 상기 혼합액을 동결건조하여 동결건조 조성물을 얻는 단계를 포함하는 것을 기술적 요지로 한다. 이에 의해 줄기세포 배양액과 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한 후, 이를 동결건조시킴으로 인해 배양액 내의 성장인자의 단백질 분해를 최소화하고 생리활성을 최대한 유지할 수 있다.
Description
본 발명은 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포 배양액과 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한 후, 이를 동결건조시킴으로 인해 배양액 내의 성장인자의 단백질 분해를 최소화하고 생리활성을 최대한 유지할 수 있는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
지방 줄기세포는 여러 성장인자(growth factor) 및 사이토카인(cytokine)을 분비한다고 알려져 있는 데, 이러한 성분들이 주 효능 물질이 되어 지방줄기세포의 배양액은 주름개선, 미백, 상처치유, 피부 재생, 항산화 등에 탁월한 효과가 있다고 보고되고 있다. 따라서 의약품 또는 화장품 산업에 있어 줄기세포를 이용하는 것은 그 줄기세포의 대사산물인 성장인자를 화장료에 함유시키는 것으로, 성장인자의 다양한 효능과 기전들이 입증됨에 따라 좋은 연구 모델로 많이 사용되어 지고 있다. 이러한 줄기세포에 포함되는 성장인자는 세포의 성장을 조절하는 단백질이기 때문에 이러한 성장인자가 액체 상태로 이용되어 지는 경우 안정성이 급격하게 하락할 가능성이 높다. 특히 줄기세포를 포함하는 시료를 액체 상태로 실온에서 보관할 경우 보관 방법 또는 보관하는 사람의 숙련도에 따라 온도에 민감하게 반응할 수 있고, 전체적인 시료의 물성 및 안정성에 변화가 생기면 시료 속에 녹아있는 성장인자들의 유효성도 확보되지 못한다.
이를 위해 종래기술로 줄기세포를 포함하는 시료를 동결건조시킨 상태로 보관하는 기술인 '대한민국특허청 등록특허 제10-0925341호 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물', '대한민국특허청 등록특허 제10-1479566호 줄기세포 분비 단백질을 이용한 아토피 개선용 조성물' 및 '대한민국특허청 등록특허 제10-1592864호 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물'이 알려져 있다. 동결건조란 수용액이나 수분을 다량 함유한 시료를 동결시키고 수분을 제거하여 건조물을 얻는 방법으로, 액상 상태의 물질을 고체화 시킴으로서 상온에서 장기간 보존의 용이성 및 재 용해성이 뛰어난 상태를 확보할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 생물학적 관점에서 단백질, 약제, 세균, 바이러스 등을 보존하는 방법으로 세포의 활동을 일시적으로 정지시켜 균종을 보존하는 목적으로 많이 사용되고 있다. 다시 말해, 혈액, 혈장, 혈청, 각종 효소 표준품, 동식물 조직, 미생물 혹은 호르몬 등의 특수 약품류를 그들의 생물 활성도를 손상시키지 않으면서 건조 보존하고자 하는 경우에 주로 사용된다고 할 수 있다.
한편, 동결건조된 성장인자는 완제품이 소비자에 의해 소비될 때까지 일정 수준의 활성도를 유지할 수 있어야 한다. 하지만 단백질 성장인자는 액상 상태로 존재할 때에는 안정성이 괄목할만한 수준이 아니며, 장기 보존과 안정성을 위해 동결건조를 하더라도 동결건조 상태를 보호할만한 제제가 없으면 생물학적 활성도를 기대하기 힘들어질 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 줄기세포 배양액과 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한 후, 이를 동결건조시킴으로 인해 배양액 내의 성장인자의 단백질 분해를 최소화하고 생리활성을 최대한 유지할 수 있는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적은, 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액을 준비하는 단계와; 상기 줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성하는 단계와; 상기 혼합액을 동결건조하여 동결건조 조성물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법에 의해서 달성된다.
여기서, 상기 줄기세포 배양액을 준비하는 단계는, 배지에 상기 성장인자가 배출되도록 줄기세포를 배양하고, 상기 줄기세포를 상기 배지로부터 여과(filter)하여 얻으며, 상기 성장인자는, 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 형질전환성장인자(trans-forming growth factor, TGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin), 항산화효소(superoxide dismutase, SOD) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 성장인자는 상기 줄기세포 배양액 내에 150 내지 2,000pg/mL 농도로 포함되며, 상기 성장인자 보호제는 이당류, 글루코스 및 사이클로덱스트린을 포함하는 것이 바람직하다.
여기서, 상기 이당류는, 맥아당(malt sugar), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 멜리비오스(melibiose), 락토스(lactose), 투라노오스(turanose), 소포로오스(sophorose), 수크로오스(sucrose) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 혼합액 전체 100중량부 중 상기 이당류는 0.01 내지 0.3중량부, 상기 글루코스는 0.05 내지 0.5중량부, 상기 사이클로덱스트린은 0.02 내지 0.6중량부를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 동결건조는, -20 내지 -30℃에서 1차동결 및 -70 내지 -100℃에서 2차동결한 후, 진공 상태에서 20 내지 25℃에서 1차건조 및 30 내지 40℃에서 2차건조하여 온도가 점진적으로 조절되는 것이 바람직하다.
상기한 목적은 또한, 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한 후, 상기 혼합액을 동결건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물에 의해서도 달성된다.
여기서, 상기 동결건조 조성물은, 상기 혼합액 상태의 성장인자 농도로부터 동결건조 직후 성장인자의 농도 감소율이 5 내지 20%이며, 상기 동결건조 직후 성장인자의 농도로부터 실온에서 보관되는 상태의 분말형태 동결건조 조성물 성장인자의 농도 감소율이 5 내지 20%인 것이 바람직하다.
상술한 본 발명의 구성에 따르면 줄기세포 배양액과 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한 후, 이를 동결건조시킴으로 인해 배양액 내의 성장인자의 단백질 분해를 최소화하고 생리활성을 최대한 유지할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법의 순서도이고,
도 2는 사이클 테스트 후의 성장인자 농도 변화를 나타낸 그래프이고,
도 3은 동결건조 직후와 사이클 테스트 후 성장인자 농도를 비교한 그래프이고,
도 4는 동결건조시키지 않은 초기배지 상태와 사이클 테스트 후 성장인자 농도를 비교한 그래프이다.
도 2는 사이클 테스트 후의 성장인자 농도 변화를 나타낸 그래프이고,
도 3은 동결건조 직후와 사이클 테스트 후 성장인자 농도를 비교한 그래프이고,
도 4는 동결건조시키지 않은 초기배지 상태와 사이클 테스트 후 성장인자 농도를 비교한 그래프이다.
이하 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 따른 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 및 그 제조방법을 상세히 설명한다. 본 발명의 동결건조 조성물은 줄기세포 배양액으로부터 얻어지는 성장인자와, 성장인자를 보호하는 보호제를 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이 동결건조 조성물 제조방법은 먼저, 줄기세포 배양액을 준비한다(S1).
줄기세포 배양액은 줄기세포를 배지에서 배양한 후 줄기세포로부터 성장인자가 배출된 배양액을 의미한다. 배지에서 줄기세포를 배양하게 되면 줄기세포가 다양한 성장인자를 외부로 배출하게 되는데, 배출되는 성장인자는 배지에 용해된 상태로 존재한다. 이 상태에서 줄기세포를 배지로부터 여과(filter)와 같은 방법을 통해 제거하게 되면 배지와 성장인자의 혼합액으로 이루어진 줄기세포 배양액을 얻을 수 있게 된다. 화장 조성물의 경우 줄기세포를 포함할 수 없기 때문에 배지에서 줄기세포를 배양하여 성장인자만 얻고 줄기세포는 배양액으로부터 제거하게 된다.
이와 같이 줄기세포 배양액 내에 용해되어 있는 성장인자는 줄기세포로부터 얻을 수 있는 성장인자로, 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 형질전환성장인자(trans-forming growth factor, TGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin), 항산화효소(superoxide dismutase, SOD) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 줄기세포로부터 얻는 성장인자를 포함할 경우 피부 구성 세포인 섬유아세포의 이동 촉진, 활성화 효과, 피부재생, 항노화, 콜라겐 합성증가, 티로시나아제의 활성억제, 멜라닌 합성억제, 모발성장 및 축소된 모낭 복원 효과 등을 기대할 수 있다.
여기서 줄기세포 배양액 내의 성장인자는 150 내지 2,000pg/mL 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 성장인자의 농도가 150pg/mL 미만일 경우 이를 포함하는 줄기세포 배양액을 원료로 사용함에 있어 효능을 발휘하기에는 무리가 있으며, 2,000pg/mL을 초과하는 농도로는 숙련도가 매우 필요하기 때문에 이 농도를 초과하여서는 얻기가 힘들다.
또한 배지는 배양액 상태로 화장 조성물에 포함되기 때문에 무형철 배지를 사용하며, 뿐만 아니라 생체에 이롭지 못한 항생제와 같은 성분들은 포함하지 않는 것이 바람직하다.
줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한다(S2).
배지와 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 성장인자가 시간 또는 주변 환경에 의해 손실되지 않고 그 양이 유지되도록 한다. 또한 추후의 동결건조 과정에서 급격하게 변화되는 온도로부터 성장인자를 보호하는 역할도 수행한다. 여기서 성장인자 보호제는 이당류, 글루코스 및 사이클로덱스트린을 포함한 혼합제이다. 이당류는 단백질인 성장인자가 단백질 결합이 끊어져 분해되지 않도록 단백질 결합제 역할을 하며, 맥아당(malt sugar), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 멜리비오스(melibiose), 락토스(lactose), 투라노오스(turanose), 소포로오스(sophorose), 수크로오스(sucrose) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그 중 이당류는 글루코스(glucose)를 포함하는 이당류를 사용하는 것이 더 바람직한데, 글루코스를 포함하는 이당류는 맥아당, 겐티오비오스, 락토스, 투라노오스, 소포로오스, 수크로오스가 있다. 최적의 이당류는 락토스를 사용하는 것으로, α-락토스 또는 β-락토스 모두를 사용 가능하다. 이러한 이당류는 줄기세포 배양액과 성장인자 보호제가 혼합된 혼합액 전제 100중량부 중 0.01 내지 0.3중량부 혼합된다. 이당류가 0.01중량부 미만일 경우 성장인자가 분해되는 것을 방지하지 못하기 때문에 성장인자 보호제 역할을 제대로 수행할 수 없으며, 0.3중량부를 초과할 경우 동결건조에 영향을 미치게 된다.
성장인자 보호제 중 글루코스(glucose)는 이당류와 마찬가지로 성장인자의 단백질 결합이 끊어지는 것을 방지하는 역할을 하며, 천연에서 얻을 수 있는 D-글루코스 또는 인위적 합성으로 형성되는 L-글루코스 중 어느 것을 사용하여도 무방하다. 이러한 글루코스는 혼합액 전체 100중량부 중 0.05 내지 0.5중량부 혼합되는 것이 바람직한데, 글루코스가 0.05중량부 미만일 경우 이당류와 마찬가지로 성장인자가 단백질 분해되는 것을 방지할 수 없으며, 0.5중량부를 초과할 경우 전체 건조량에 영향을 미치게 되어 수분이 함유되지 않은 분말 형태의 조성물을 얻기 힘들다.
이당류 및 글루코스와 함께 성장인자 보호제에 포함되는 사이클로덱스트린(cyclodextrin)은 성장인자가 분해되지 않고 안정된 상태로 존재하도록 안정화제 및 산화방지제의 목적으로 사용된다. 이러한 사이클로덱스트린은 6원환으로 이루어진 α-사이클로덱스트린, 7원환으로 이루어진 β-사이클로덱스트린, 8원환으로 이루어진 γ-사이클로덱스트린 중 적어도 어느 하나를 혼합하여 사용 가능하다. 사이클로덱스트린은 혼합액 전체 100중량부 중 0.02 내지 0.6중량부 혼합되는 것이 바람직한데, 0.02중량부 미만일 경우 안정화제 및 산화방지제 역할을 제대로 하지 못하며, 0.6중량부를 초과할 경우 동결건조가 완벽히 이루어지기 힘들다는 단점이 있다.
이와 같은 성장인자 보호제는 혼합액 전체 100중량부 중 1중량부 이하로 함유되는 것이 바람직하다. 성장인자 보호제에 포함된 이당류, 글루코스 및 사이클로덱스트린은 수분과 쉽게 접촉하기 때문에 이를 많이 사용할 경우 동결건조가 완벽히 이루어지지 않고, 일부 점성이 있는 상태가 될 수 있으며 동결건조 조성물을 보관할 때에도 시간이 지날수록 수분을 머금어 성장인자의 보관에 영향을 미칠 우려가 있다. 따라서 성장인자 보호제는 줄기세포 배양액과 성장인자 보호제가 혼합된 혼합액 전체 100중량부 중 1중량부 이하로 첨가하는 것이 바람직하다.
혼합액을 동결건조하여 동결건조 조성물을 얻는다(S3).
줄기세포 배양액과 성장인자 보호제로 이루어진 혼합액을 동결건조하여 수분 또는 배지에 포함된 액체를 모두 제거하여 분말 형태로 이루어진 동결건조 조성물을 얻는다. 분말 형태의 동결건조 조성물은 액체를 포함하지 않은 건조한 상태이기 때문에 성장인자가 단백질 분해될 우려가 적으며, 특히 성장인자 보호제가 함께 포함되어 있기 때문에 동결건조 중 또는 동결건조 후에도 성장인자가 그 양을 유지하도록 보호하는 역할을 한다. 이러한 동결건조 과정은 성장인자가 급격한 온도 변화로 인해 단백질 결합이 끊어지는 것을 방지하기 위해 -20 내지 -30℃에서 하루 정도 1차동결을 실시하고, 그 후 이를 다시 -70 내지 -100℃에서 하루 정도 2차동결을 실시한다. 경우에 따라서는 처음부터 -70 내지 -100℃에서 동결을 실시하여도 되지만 성장인자의 수득률을 높이기 위해서는 1차동결 및 2차동결을 함께 실시하는 것이 바람직하다. 동결온도가 -70℃보다 높을 경우 일부 액체가 얼지 않고 액체상태로 존재할 가능성이 있으며, -100℃보다 낮은 온도를 가지는 동결기기를 구비하기 힘들다는 단점이 있다.
동결과 마찬가지로 건조과정도 1차건조 및 2차건조와 같이 온도의 편차변화를 최대한 줄이고 점진적으로 증가하도록 여러 단계를 거쳐 진행할 수 있다. 1차건조 과정은 진공 상태에서 20 내지 25℃에서 하루 정도 건조하고, 이후에 진공 상태에서 30 내지 40℃에서 다시 하루 정도 건조하여 액체는 모두 제거하면서 성장인자의 분해는 최소화할 수 있다. 건조 온도가 20℃ 미만일 경우 건조가 제대로 이루어지지 않을 수 있고, 40℃를 초과할 경우에는 단백질로 이루어진 성장인자가 비활성화되는 상태가 될 수 있다.
최종으로 얻어지는 동결건조 조성물은 동결건조 전 혼합액 상태의 성장인자 농도로부터 동결건조 직후 성장인자의 농도가 5 내지 20% 사이의 감소율을 보이는 것이 바람직하며, 동결건조 직후의 성장인자의 농도로부터 실온에서 보관되는 상태의 분말 형태 동결건조 조성물의 성장인자 농도가 5 내지 20% 사이의 감소율을 보이는 것이 바람직하다. 이와 같이 환경 변화에 따른 성장인자 감소율은 5% 미만으로는 얻기 힘드며, 20%를 초과할 경우 성장인자를 보호하기 위해 첨가되는 보호제가 제 역할을 수행하지 못하는 것이기 때문에 첨가하는 의미가 없어지게 된다.
본 발명의 동결건조 조성물은 하기의 실시예를 통해 성장인자의 안정성이 있다는 것을 객관적인 평가 결과로 증명이 되었다. 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> : 동결건조 조성물 제조
1) 줄기세포를 배지에 배양한 후 줄기세포를 여과하고 남은 성장인자 및 배지로 이루어진 배양액을 준비한다.
2) 줄기세포 배양액 내에 보호제인 β-D-글루코스(β-D-glucose) 0.4중량부, 락토스(lactose) 0.2중량부, 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 0.3중량부를 첨가한 후 함께 혼합한다.
3) 줄기세포 배양액과 보호제가 혼합된 혼합액을 -22℃에서 1일간 예비동결을 실시하고, 그 후 다시 -75℃에서 1일간 동결과정을 진행한다. 그 다음으로 동결된 혼합액을 20℃에서 1차 건조, 35℃에서 2차 건조 과정을 통해 혼합액 내에 수분을 모두 제거하여, 분말 상태의 동결건조 조성물을 형성한다.
이와 같은 단계를 통해 실시예 1의 동결건조 조성물이 만들어지며, 상기와 같은 방법과 동일한 방법을 통해 성분비가 다른 비교예 1 내지 3의 동결건조 조성물을 추가로 제조한다. 이와 같이 제조된 실시예 1, 비교예 1 내지 3으로 제조된 동결건조 조성물의 조성비는 표 1을 통해 확인할 수 있다.
| 성분 | 중량부 | |||
| 실시예 1 | 비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 | |
| β-D-글루코스 | 0.4 | - | - | 0.4 |
| 락토스 | 0.2 | - | - | - |
| 수크로스 | - | - | 0.5 | 0.3 |
| 사이클로덱스트린 | 0.3 | - | - | - |
| 2-데옥시-D-글루코스 | - | - | - | - |
| 비타민 C | - | - | 0.2 | - |
| 성장인자 | 잔부 | 100 | 잔부 | 잔부 |
<실시예 2> : 성장인자 농도 확인
실시예 및 비교예를 통해 제조된 동결건조 조성물을 냉장보관 1일, 실온보관 1일 및 45℃에서 보관 1일을 한 사이클(cycle)로 하여 총 4번의 사이클을 거친 후 실시예 1, 비교예 1 내지 3의 동결건조 조성물을 성장인자 측정 ELISA KIT를 사용하여 동결건조 조성물 내에 성장인자 양을 측정하였다. 사용된 ELISA KIT는 Quantikine ELISA Human VEGF (Catalog No. DEV 00, R&D systems, Inc)를 이용하여 측정되었으며, 사용된 ELISA READER는 ENPOCH (BioTek Instrument, Inc.)를 사용하였으며, 측정 프로토콜은 동봉된 설명서에 준하여 실험되었다.
| 성장인자 Conc. (pg/mL) | ||||
| CTL | 실시예 1 | 비교예 1 | 비교예 2 | 비교예 3 |
| 1028.09 | 867.18 | 326.27 | 472.18 | 670.36 |
표 2 및 도 2는 사이클 테스트 후의 성장인자 농도 변화를 나타낸 것이다. 여기서 CTL은 동결건조가 이루어지기 전 액상 상태의 혼합액에 포함된 성장인자의 양을 나타낸 것으로 실시예 및 비교예와는 달리 사이클이라는 물리적 변화를 주지 않은 순수한 상태를 말한다. 이러한 CTL은 1028.09pg/mL이며, 성장인자와 보호제를 포함하는 실시예 1의 동결건조 조성물은 867.18pg/mL으로 초기의 성장인자 양보다는 조금 줄어들었지만 감소폭은 크지 않은 것을 확인할 수 있다. 이에 비해 아무 보호제를 첨가하지 않은 비교예 1은 성장인자가 326.27pg/mL으로 반 이상이 분해된 것을 확인할 수 있으며, 단백질 보호제인 수크로스와 액상 배지에서 성장인자를 보호하는 비타민 C만 포함된 비교예 2도 472.18pg/mL로 반 이상 줄어든 것을 확인할 수 있다. 비교예 3의 경우 사이클로덱스트린을 포함하지 않은 동결건조 조성물인데 이는 670.36pg/mL으로 비교예 1 및 2보다는 성장인자가 많이 포함되었으나 실시예 1에 비해서는 그 양이 적은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명의 이당류, 글루코스 및 사이클로덱스트린을 모두 포함하는 보호제를 줄기세포 배양액과 혼합하여 동결시키는 것이 줄기세포의 성장인자의 단백질 분해를 방지하고 이를 보호할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 3은 실시예 1의 동결건조 직후와 사이클이란 물리적 변화를 주었을 때 성장인자 농도를 비교한 그래프로, 동결건조 직후 성장인자 농도는 899.7pg/mL이고 사이클 후 성장인자 농도는 776.6pg/mL으로 성장인자의 농도가 감소하기는 했지만 감소율이 14% 정도인 것으로 보아 보호제가 제 역할을 제대로 수행하는 것을 알 수 있다.
이에 비해 도 4는 동결건조시키지 않은 초기배지 상태와 사이클이랑 물리적 변화를 주었을 때 성장인자 농도를 비교한 그래프로, 초기배지의 농도는 976pg/mL인데 비해 사이클 후 배지는 312.6pg/mL으로 감소율이 68% 정도로, 성장인자 대부분이 단백질 분해된 것을 확인할 수 있다. 따라서 이를 통해 성장인자를 동결건조할 때 보호제를 함께 혼합하여 동결건조 할 경우 성장인자의 농도 감소율을 최소화할 수 있는 것을 알 수 있다.
이와 같이 본 발명의 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물은 조성물에 포함된 보호제가 성장인자를 포함하는 액상 상태의 배양액이 다양한 물리적, 화학적 요인에 의하여 변성되는 것을 방지한다. 또한 장기간 보존을 위하여 고체화시키는 동결건조 과정에서 성장인자 본연의 활성도를 최대한 유지할 수 있도록 도와주는 역할을 하며, 최종 조성물에 성장인자를 포함하는 양을 최대한 유지시켜준다. 이는 종래기술과 같이 단순히 장기보존을 위하여 고체 분말화 시키는 동결건조 과정에 그치는 것이 아니라, 장기보존은 물론이고 성장인자의 손실을 최대한으로 줄이고 성장인자의 활성 효과를 최대한 유지시키며, 안정성을 확보함으로써 원료 이용의 목적에 효율적으로 사용할 수 있도록 할 수 있다.
Claims (11)
- 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액을 준비하는 단계와;
상기 줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성하는 단계와;
상기 혼합액을 동결건조하여 동결건조 조성물을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 줄기세포 배양액을 준비하는 단계는,
배지에 상기 성장인자가 배출되도록 줄기세포를 배양하고, 상기 줄기세포를 상기 배지로부터 여과(filter)하여 얻는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 성장인자는,
혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 형질전환성장인자(trans-forming growth factor, TGF), 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin), 항산화효소(superoxide dismutase, SOD) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 성장인자는 상기 줄기세포 배양액 내에 150 내지 2,000pg/mL 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 성장인자 보호제는 이당류, 글루코스 및 사이클로덱스트린을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제 5항에 있어서,
상기 이당류는,
맥아당(malt sugar), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 멜리비오스(melibiose), 락토스(lactose), 투라노오스(turanose), 소포로오스(sophorose), 수크로오스(sucrose) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 혼합액 전체 100중량부 중 상기 이당류는 0.01 내지 0.3중량부, 상기 글루코스는 0.05 내지 0.5중량부, 상기 사이클로덱스트린은 0.02 내지 0.6중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 제 1항에 있어서,
상기 동결건조는,
-20 내지 -30℃에서 1차동결 및 -70 내지 -100℃에서 2차동결한 후, 진공 상태에서 20 내지 25℃에서 1차건조 및 30 내지 40℃에서 2차건조하여 온도가 점진적으로 조절되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물 제조방법. - 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액에 성장인자 보호제를 혼합하여 혼합액을 형성한 후, 상기 혼합액을 동결건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물.
- 제 9항에 있어서,
상기 동결건조 조성물은,
상기 혼합액 상태의 성장인자 농도로부터 동결건조 직후 성장인자의 농도 감소율이 5 내지 20%인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물. - 제 9항에 있어서,
상기 동결건조 조성물은,
상기 동결건조 직후 성장인자의 농도로부터 실온에서 보관되는 상태의 분말형태 동결건조 조성물 성장인자의 농도 감소율이 5 내지 20%인 것을 특징으로 하는 줄기세포 성장인자를 포함하는 동결건조 조성물.
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|---|---|---|---|---|
| CN113521019A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-22 | 吉林大学第一医院 | 一种间充质干细胞上清液冻干制剂及其制备方法 |
| KR20220121139A (ko) * | 2021-02-24 | 2022-08-31 | 황지연 | 줄기세포를 이용한 성장인자 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물 제조방법 및 이에 의해 제조된 화장료 조성물 및 화장료 조성물을 포함하는 화장품 |
-
2016
- 2016-06-01 KR KR1020160068011A patent/KR20170136212A/ko not_active Ceased
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| CN113521019B (zh) * | 2021-07-27 | 2023-08-18 | 吉林大学第一医院 | 一种间充质干细胞上清液冻干制剂及其制备方法 |
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