KR20170136573A - 트랜스젠 발현을 위한 식물 프로모터 - Google Patents

트랜스젠 발현을 위한 식물 프로모터 Download PDF

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KR20170136573A
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대런 헤밍웨이
칼라 아스무스
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앤드루 애스베리
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터를 사용하여, 식물 또는 식물 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하기 위해 식물에서 기능하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 관한 것이다.

Description

트랜스젠 발현을 위한 식물 프로모터
관련 특허 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 4월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/147,868의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본원에 동시에 제출되고 다음과 같이 식별되는 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록이 전체적으로 참조로써 포함된다: 2016년 3월 22일에 생성된 “77035-WO-PCT-20160322-Sequence-Listing-ST25.txt”라는 명칭의 하나의 36.7 KB ACII (Text) 파일.
발명 분야
일반적으로 본 발명은 식물 또는 식물 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하기 위해 식물에서 기능하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 관한 것이다. 특정 실시양태들은 프로모터를 포함하는 방법 (예컨대, 핵산 분자를 세포에 도입하기 위함) 및 프로모터를 포함하는 세포, 세포 배양물, 조직, 유기체, 및 유기체의 부분 뿐만 아니라 이로부터 생산된 생성물에 관한 것이다.
농업적으로 바람직한 형질 또는 특성을 도입하기 위해 다수의 식물 종이 트랜스젠 (transgene)으로 형질전환될 수 있다. 식물 종은 특정한 바람직한 형질을 갖도록 개발되고/되거나 변형된다. 일반적으로, 바람직한 형질은, 예를 들어 영양가 품질 개선, 수율 증가, 해충 또는 질병 저항성 부여, 가뭄 및 스트레스 내성 증가, 원예 품질 (예를 들면, 착색 및 성장) 개선, 제초제 내성 부여, 식물로부터 산업상 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산 가능 및/또는 약제의 생산 가능을 포함한다.
단일 게놈 유전자좌에 스택킹된 다중 트랜스젠을 포함하는 트랜스제닉 식물 종은 식물 형질전환 기술을 통해 생산된다. 식물 형질전환 기술은 식물 세포 내로의 트랜스젠의 도입, 식물 게놈 내에 안정하게 통합된 트랜스젠 복사본을 함유하는 생식력 있는 트랜스제닉 식물의 회수, 및 식물 게놈의 전사 및 번역을 통한 후속 트랜스젠 발현에 의한 바람직한 형질 및 표현형을 보유하는 트랜스제닉 식물의 생성을 야기한다. 그러나, 형질 스택으로서 조작된 다중 트랜스젠을 고도로 발현하는 트랜스제닉 식물 종의 생산을 가능하게 하는 기작이 바람직하다.
마찬가지로, 식물의 특정한 조직 또는 기관 내에서 트랜스젠이 발현되도록 하는 기작이 바람직하다. 예를 들어, 토양-매개 병원체에 의한 감염에 대한 식물의 증가된 저항성은 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리 내에서 강하게 발현되도록 식물 게놈을 병원체-저항성 유전자로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 예컨대 세포 분열 또는 신장과 같은 특정 성장 또는 발달 단계에 있는 식물 조직에서 트랜스젠을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 제초제에 대한 내성 또는 지상 곤충 및 해충에 대한 저항성을 제공하기 위해 식물의 잎 및 줄기 조직에서 트랜스젠을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 특정 식물 조직에서 트랜스젠의 바람직한 발현 수준을 유도할 수 있는 신규한 유전자 조절 요소에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 실시양태에서, 본 발명은 폴리링커 서열; 비 메탈로티오네인-유사 유전자; 또는 폴리링커 서열 및 비 메탈로티오네인-유사 유전자의 조합에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 벡터에 관한 것으로서, 여기서 상기 프로모터는 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 길이가 2,000 bp이다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어져 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 선택성 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된다. 이러한 실시양태의 측면에서, 트랜스젠은 살곤충제 저항성, 제초제 내성, 질소 사용 효율, 물 사용 효율, 또는 영양 품질을 부여하는 선택성 마커 또는 유전자 산물을 암호화한다. 서열번호 1의 프로모터는 3’ 비번역 폴리뉴클레오티드 서열 (3’ -UTR)과 함께 사용하기 위해 제공되며, 이러한 3' 비번역 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 상기 3’ 비번역 서열은 상기 폴리링커 또는 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 서열번호 1의 프로모터는 5’ 비번역 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 사용하기 위해 제공되며, 이러한 5’ 비번역 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 상기 5’ 비번역 서열은 상기 폴리링커 또는 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 서열번호 1의 프로모터는 인트론 서열을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 서열번호 1의 프로모터는 지하 조직 특이적 발현을 유도한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-브라키포듐(non-Panicum) 식물을 제공한다. 이러한 실시양태에 따르면, 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕 수수, 대두, 목화, 아라비돕시스, 담배, 해바라기, 및 카놀라로 이루어진 군으로부터 선택된다. 결과적으로, 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-브라키포듐 식물은 일부 실시양태에서 제아 메이스(Zea mays)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 트랜스젠은 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 식물의 게놈에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터이며 상기 프로모터는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시양태에서, 비- 브라키포듐 식물은 서열번호 3을 포함하는 3’ 비번역 서열 또는 서열번호 3과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 3’ 비번역 서열을 포함하며, 여기서 상기 3’ 비번역 서열은 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결된다. 추가의 실시양태에서, 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 지하 조직 특이적 발현을 갖는 트랜스젠의 발현을 유도한다. 추가의 실시양태에서, 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 2,000 bp이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 식물 세포를 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)를 포함하는 유전자 발현 카세트로 형질전환하는 단계; 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하는 단계; 및 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 식물 세포를 형질전환하는 단계는 식물 형질전환 방법으로 수행된다. 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 유전자총 (biolistics) 형질전환 방법, 탄화 규소 형질전환 방법, 원형질 형질전환 방법, 및 리포좀 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스제닉 식물 세포에 걸쳐 항시적으로 (constitutively) 발현된다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스제닉 식물 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 따라서, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법은 트랜스제닉 식물에 트랜스제닉 식물 세포를 재생시키는 단계, 및 트랜스제닉 식물을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 트랜스제닉 식물은 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 단자엽 트랜스제닉 식물 세포 또는 쌍자엽 트랜스제닉 식물 세포이다. 예컨대, 쌍자엽 트랜스제닉 식물 세포는 아라비돕시스 식물 세포, 담배 식물 세포, 대두 식물 세포, 카놀라 식물 세포, 및 목화 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가로, 단자엽 트랜스제닉 식물 세포는 옥수수 식물 세포, 벼 식물 세포, 및 밀 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 방법에 사용되는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1의 3’ 말단에 작동가능하게 연결된 제1 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 식물 세포에서 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 식물 형질전환 방법에 의해 식물 세포에 도입된다. 이와 같이, 이러한 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 유전자총법 형질전환 방법, 탄화 규소 형질전환 방법, 원형질 형질전환 방법, 및 리포좀 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 식물 세포에 걸쳐 항시적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 식물 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 이와 같이, 트랜스제닉 식물 세포는 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포이다. 예컨대, 쌍자엽 식물 세포는 아라비돕시스 식물 세포, 담배 식물 세포, 대두 식물 세포, 카놀라 식물 세포, 및 목화 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로, 단자엽 식물 세포는 옥수수 식물 세포, 벼 식물 세포, 및 밀 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 트랜스제닉 이벤트를 포함한다. 양태의 일 측면에서, 트랜스제닉 이벤트는 농업적 형질을 포함한다. 따라서, 농업적 형질은 살곤충제 저항성 형질, 제초제 내성 형질, 질소 사용 효율 형질, 물 사용 효율 형질, 영양 품질 형질, DNA 결합 형질, 선택성 마커 형질, 소형 RNA 형질, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 농업적 형질은 제초제 내성 형질을 포함한다. 양태의 일 측면에서, 제초제 내성 형질은 aad-1 암호화 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 범용 제품 (commodity product)을 생산한다. 범용 제품은 단백질 농축물, 단백질 분리물, 곡물, 식사, 밀가루, 오일, 또는 섬유소로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 쌍자엽 식물 세포 또는 단자엽 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 단자엽 식물 세포는 옥수수 식물 세포이다. 다른 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 길이가 2,000 bp이다. 추가의 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1로 이루어져 있다. 추가의 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1의 3’ 말단에 작동가능하게 연결된 서열번호 1로 이루어져 있다. 다른 실시양태에서 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 지하 식물 조직에서 농업적 형질의 발현을 유도한다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 지하 조직 특이적 발현을 유도한다. 다른 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 식물 세포 내에서 발현 활성을 갖는다. 일 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하는 개방형-판독 프레임 폴리뉴클레오티드; 및 종결 서열을 포함한다. 추가의 실시양태는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 길이가 2,000 bp이다.
상기 특색 및 다른 특색이 여러 실시양태에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이고, 이는 첨부된 도면을 참조로 진행된다.
도 1: 본 도면은 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 (B 디스타키온 MTL 프로모터로 표지됨) 및 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR (B 디스타키온 MTL 3’UTR로 표지됨)을 포함하는 pDAB102419의 개략도이다.
도 2: 본 도면은 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 (2,000 bp) 및 서열번호 7(1,730 bp), 서열번호 8 (1,530 bp), 서열번호 9 (1,330 bp), 서열번호 10 (1,130 bp) 및 서열번호 11 (1,001 bp)의 절단된(truncated) 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 폴리뉴클레오티드 정렬을 제공한다.
도 3: 본 도면은 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 서열번호 12의 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 폴리뉴클레오티드 정렬을 제공한다.
도 4: 본 도면은 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR 및 서열번호 13(264 bp), 서열번호 14 (332 bp), 서열번호 15 (630 bp) 및 서열번호 16 (727 bp)의 절단된(truncated) 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR의 폴리뉴클레오티드 정렬을 제공한다.
도 5: 본 도면은 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’-UTR의 폴리뉴클레오티드 정렬을 제공한다.
I. 몇몇 실시양태의 개관
트랜스제닉 식물 제품의 개발은 점점 복잡해지고 있다. 상업적으로 실현가능한 트랜스제닉 식물은 현재 다수의 트랜스젠을 단일 유전자좌에 스태킹하는 것을 필요로 한다. 기초 연구 또는 생명공학기술 응용예들에 사용되는 식물 프로모터는 일반적으로 단방향성으로서, 이의 3’ 말단 (하류)에 융합된 오직 하나의 유전자만을 지시한다. 따라서, 각각의 트랜스젠이 통상적으로 발현을 위한 프로모터를 필요로 하며, 여기서 다수의 프로모터가 하나의 유전자 스택 내에서 다수의 트랜스젠을 발현시키기 위해 요구된다. 유전자 스택에서의 트랜스젠의 수가 증가함에 따라, 상이한 트랜스젠의 유사한 수준의 발현 패턴을 수득하기 위해 동일한 프로모터가 일상적으로 사용된다. 유사한 수준의 트랜스젠 발현을 수득하는 것은 단일 다인성 (polygenic) 형질을 생산하는데 필수적이다. 불행하게도, 동일한 프로모터에 의해 유도되는 다중-유전자 구조체는 유전자 침묵을 야기하여 트랜스제닉 생성물이 덜 효율적인 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 반복된 프로모터 요소는 상동성-기반 유전자 침묵을 야기할 수 있다. 또한, 트랜스젠 내의 반복 서열은 폴리뉴클레오티드 재배열을 야기하는 유전자 내부의 유전자좌 상동성 재조합을 야기할 수 있다. 트랜스젠의 이러한 침묵 및 재배열은 트랜스젠을 발현하기 위해 생산된 트랜스제닉 식물의 성능에 바람직하지 않은 영향을 미칠 것이다. 추가로, 프로모터 반복에 의한 전사 인자 (TF)-결합 부위의 초과는 전사 불활성화를 유도하는 내인성 TF를 고갈시킬 수 있다. 대사 공학 및 형질 스태킹을 위해 식물에 다수의 유전자를 도입할 필요성을 고려했을 때, 다수의 유전자의 발현을 유도하는 트랜스제닉 작물을 개발하기 위해 다양한 프로모터가 필요하다.
프로모터 식별의 특정 문제점은 다른 식물 조직에서 발현되지 않는 식물의 특정 세포 유형, 발달 단계 및/또는 기능과 관련된 조직-특이적 프로모터를 식별할 필요가 있다는 것이다. 조직 특이적 (즉, 조직 선호) 또는 기관 특이적 프로모터는 식물의 핵, 뿌리, 잎, 또는 융단 조직 (tapetum)과 같은 특정 조직에서 유전자 발현을 유도한다. 조직 및 발달 단계 특이적 프로모터는 식물 발달 동안 특정 조직에서 또는 특정 시기에 발현되는 유전자의 발현을 관찰함으로써 초기에 식별될 수 있다. 이러한 조직 특이적 프로모터는 트랜스제닉 식물 산업에서 특정 용도에 필요하며, 조직 및/또는 발달 단계 선택 방식으로 이종 유전자의 특이적 발현을 가능케 함으로써 다양한 기관, 조직, 및/또는 시기에서 차별적으로 이종 유전자의 발현을 나타내지만 다른 조직에서는 그렇지 않기 때문에 바람직하다. 예를 들어, 토양-매개 병원체에 의한 감염에 대한 식물의 증가된 저항성은 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리 내에서 강하게 발현되도록 식물 게놈을 병원체-저항성 유전자로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 예컨대 세포 분열 또는 신장과 같은 특정 성장 또는 발달 단계에 있는 식물 조직에서 트랜스젠을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 응용은 조직 특이적 프로모터를 사용하여 유세포 (parenchyma cell)를 발달시키는 것과 같은 특정 조직 유형에서 농업적 형질을 암호화하는 트랜스젠의 발현을 제한하는 것이 바람직하다. 이와 같이, 프로모터의 식별에 있어서의 특정 문제점은 프로모터를 식별하고, 특정 조직 발현을 위한 세포의 발달 특성에 식별된 프로모터를 연관시키는 방법이다.
프로모터의 식별과 관련된 또 다른 문제점은 복제된 DNA 단편이 원하는 특정 발현 패턴으로 전사를 유도하도록 모든 관련 시스-작용 및 트랜스-활성화 전사 제어 요소를 클로닝할 필요성이다. 이러한 제어 요소가 번역 개시 또는 시작 위치로부터 멀리 위치해 있다는 것을 고려했을 때, 프로모터를 포함하도록 선택된 폴리뉴클레오티드의 크기는 발현 수준 및 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 패턴을 제공하는데 중요하다. 프로모터 길이는 기능 정보를 포함한다는 것이 공지되어 있고, 상이한 유전자는 게놈 내의 다른 유전자의 프로모터보다 길거나 짧은 프로모터를 갖는 것으로 나타났다. 프로모터의 전사 시작 부위를 밝히고 프로모터 영역의 기능 유전자 요소를 예측하는 것은 어렵다. 또한, 조절 모티프 및 시스- 및 트랜스-조절 요소의 복잡성, 다양성 및 내재적 퇴화 (degenerate) 특성이 어려움에 추가된다 (Blanchette, Mathieu, 등 "Genome-wide computational prediction of transcriptional regulatory modules reveals new insights into human gene expression." Genome research 16.5 (2006): 656-668). 시스- 및 트랜스-조절 요소는 필수 부위 및 특정 시기에서만 발생하는 유전자의 공간적 및 일시적인 발현을 조절하는 프로모터의 원위 (distal) 부위에 위치한다 (Porto, Milena Silva, 등 "Plant promoters: an approach of structure and function." Molecular biotechnology 56.1 (2014): 38-49). 기존의 프로모터 분석 도구는 게놈 서열에서 이러한 시스 조절 요소를 신뢰성있게 식별할 수 없으므로, 일반적으로 서열 내용에만 집중되기 때문에 너무 많은 위 양성 (false positive)을 예측한다 (Fickett JW, Hatzigeorgiou AG (1997) Eukaryotic promoter recognition. Genome research 7: 861-878). 따라서, 프로모터 조절 요소의 식별은 바람직한 방식으로 작동가능하게 연결된 트랜스젠의 발현을 유도하는 특정 크기의 적절한 서열을 수득할 것을 요구한다.
식물에서 트랜스젠을 발현시키기 위한 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 조절 요소의 사용을 통해 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
II 용어 및 약어
출원서 전체에서 다수의 용어가 사용된다. 이러한 용어에 주어진 범주를 포함하여, 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관적인 이해를 제공하기 위해 다음의 정의가 제공된다.
본원에서 사용된 용어 “인트론”은 전사되지만 번역되지 않는 유전자 (또는 발현된 관심 폴리뉴클레오티드 서열) 내에 포함된 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 인트론은 발현되는 DNA 서열 내의 비번역 핵산 서열뿐만 아니라, 이로부터 전사된 RNA 분자 내의 상응 서열을 포함한다. 본원에 기술된 구조체는 또한 번역 및/또는 mRNA 안정성을 향상시키는 서열, 예컨대 인트론을 또한 함유할 수 있다. 이러한 인트론의 하나의 예는 아라비돕시스 탈리아나의 히스톤 H3 변이체의 유전자 II의 제1 인트론 또는 통상적으로 공지된 임의의 다른 인트론 서열이다. 인트론은 프로모터 서열과 함께 조합되어 사용되어 번역 및/또는 mRNA 안정성을 향상시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 “단리된”은 이의 자연 환경으로부터 제거되거나, 화합물이 처음 형성될 때 존재하는 다른 화합물로부터 제거된 것을 의미한다. 용어 “단리된”은 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 후 회수된 천연 원료뿐만 아니라 물질 (예컨대, 핵산 및 단백질), 또는 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드와 같은 화학적으로 합성된 화합물로부터 단리된 물질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 “정제된”은 천연 또는 자연 환경에서 분자 또는 화합물과 정상적으로 결합된 오염물이 실질적으로 없거나 화합물이 처음 형성될 때 존재하는 다른 화합물에 비해 농도가 실질적으로 농후한 형태의 분자 또는 화합물의 단리물을 지칭하며, 원래의 조성물의 다른 구성요소로부터 분리된 결과로서 순도가 증가한 것을 의미한다. 용어 “정제된 핵산”은 본원에서 폴리펩티드, 지질 및 탄수화물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 생물학적 화합물로부터 분리, 분리되어 생산, 또는 정제되었지만 구성요소의 화학적 또는 기능적 변화에 영향을 미치는 핵산 서열을 기술하기 위해 사용된다 (예컨대, 핵산은 단백질 오염물질을 제거하고 핵산과 염색체의 나머지 DNA를 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 정제될 수 있음).
본원에 사용된 용어 “합성”은 시험관 내 공정에 의해 화학적 합성을 통해 생성된 폴리뉴클레오티드 (즉, DNA 또는 RNA) 분자를 지칭한다. 예컨대, 합성 DNA는 Eppendorf™ 튜브 내에서 반응하는 동안 생성되어 합성 DNA가 DNA 또는 RNA의 천연 가닥에서 효소적으로 생산될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 다른 실험실적 방법이 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 포스포라미디트를 사용하는 고상 합성을 통해 올리고 합성기에서 화학적으로 합성될 수 있다. 합성된 올리고뉴클레오티드는 복합체로서 서로 어닐링되어 “합성된” 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에서 사용하기 위해 용이하게 구현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “약”은 10퍼센트로 표시된 값 또는 범위보다 크거나 작은 것을 의미하지만, 임의의 값 또는 값의 범위를 이보다 넓은 정의로만 지정하려는 것은 아니다. “약”이라는 용어에 의해 선행된 각각의 값 또는 값의 범위는 언급된 절대값 또는 값의 범위의 실시양태를 포함하도록 의도된다.
본 발명의 목적을 위해, “유전자”는 유전자 산물 (하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라, 이러한 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접하는지의 여부를 불문하고, 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 침묵자 (silencer), 절연체, 경계 요소, 복제 기점, 기질 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 “천연” 또는 “자연”은 자연에서 발견되는 상태를 정의한다. “천연 DNA 서열”은 천연 수단 또는 전통적인 육종 기술에 의해 생산되었으나 유전 공학 (예컨대, 분자 생물학/ 형질전환 기법)의 사용에 의해 생산되지 않은, 자연에 존재하는 DNA 서열이다.
본원에 사용된 “트랜스젠”은 예컨대, 비제한적으로 mRNA를 포함하여, 유전자 산물을 암호화하는 핵산 서열로 정의된다. 일 실시양태에서, 트랜스젠은 외인성 핵산이며, 여기서 트랜스젠 서열은 트랜스젠이 정상적으로 발견되지 않는 곳에서 유전 공학 (또는 이의 자손)에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 일 실시예에서, 트랜스젠은 산업적으로 또는 약학적으로 유용한 화합물, 또는 바람직한 농업적 형질 (예컨대, 제초제-저항성 유전자)을 암호화하는 유전자를 암호화한다. 또 다른 실시예에서, 트랜스젠은 안티센스 (antisense) 핵산 서열이며, 여기서 안티센스 핵산 서열의 발현은 타겟 핵산 서열의 발현을 억제한다. 일 실시양태에서, 트랜스젠은 내인성 핵산 서열의 추가의 게놈 복사본이 요구되는 경우 내인성 핵산이거나, 숙주 유기체 내의 타겟 핵산 서열에 대해 안티센스 배향인 핵산이다.
본원에 사용된 용어 "비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠" 또는 "비 메탈로티오네인-유사 유전자"는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 암호화 서열 (서열번호 6)과 80% 미만의 서열 동일성을 갖는 임의의 트랜스젠이다.
본원에서 정의된 “유전자 산물”은 유전자에 의해 생산된 임의의 생성물이다. 예컨대, 유전자 산물은 유전자의 직접적인 전사 산물 (예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA) 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 공정에 의해 변형된 RNA, 및 예컨대 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다. 유전자 발현은 예컨대 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는 제제에 세포, 조직 또는 유기체를 노출시키는 것과 같은 외부 신호에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA에서 RNA, 단백질에 이르는 임의의 경로에서 조절될 수 있다. 유전자 발현 조절은, 예컨대 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, mRNA와 같은 중간 분자의 분해, 또는 이들이 만들어진 후에 특이적 단백질 분자의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해, 또는 이들의 조합을 통해 작용하는 제어를 통해 발생한다. 유전자 발현은 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 계 내(in situ), 또는 생체 내 단백질 활성 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “유전자 발현”은 종종 단백질 합성을 포함하여, 핵산 전사 단위 (예컨대, 게놈 DNA 포함)의 암호화된 정보를 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 부분으로 전환시키는 공정을 지칭한다. 유전자 발현은 예컨대 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는 제제에 세포, 조직 또는 유기체를 노출시키는 것과 같은 외부 신호에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA에서 RNA, 단백질에 이르는 임의의 경로에서 조절될 수 있다. 유전자 발현 조절은, 예컨대 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, mRNA와 같은 중간 분자의 분해, 또는 이들이 만들어진 후에 특이적 단백질 분자의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해, 또는 이들의 조합을 통해 작용하는 제어를 통해 발생한다. 유전자 발현은 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 계 내(in situ), 또는 생체 내 단백질 활성 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “상동성-기반 유전자 침묵” (HBGS)은 전사 유전자 침묵 및 전사 후 유전자 침묵 둘 모두를 포함하는 유전적 용어이다. 연결되지 않은 침묵 유전자좌에 의한 타겟 유전자좌의 침묵은 각각 프로모터 또는 전사된 서열에 상응하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 생산에 의해, 전사 억제 (전사 유전자 침묵; TGS) 또는 mRNA 분해 (전사 후 유전자 침묵; PTGS)로부터 야기될 수 있다. 각 과정에서 별개의 세포 성분의 관여는 dsRNA-유도된 TGS 및 PTGS가 고전적인 공통의 기작의 다양화로부터 야기되었을 가능성을 시사한다. 그러나, TGS 및 PTGS의 엄중한 비교는 일반적으로 별개의 침묵 유전자좌의 분석에 의존하기 때문에 달성하기가 어려웠다. 일부 예에서, 단일 트랜스젠 유전자좌는 상이한 타겟 유전자의 프로모터 및 전사된 서열에 상응하는 dsRNA의 생산으로 인해 TGS 및 PTGS 둘 모두를 유발할 수 있다. Mourrain 등 (2007) Planta 225:365-79. siRNA는 상동성 서열 상의 TGS 및 PTGS를 유발하는 실제 분자일 가능성이 높다: 이러한 모델에서 siRNA는 트랜스젠 서열의 메틸화를 내인성 프로모터에 확산시키는 것을 통해 시스 및 트랜스에서 상동성 서열의 침묵 및 메틸화를 유발할 것이다.
본원에 사용된 용어 “핵산 분자” (또는 “핵산” 또는 “폴리뉴클레오티드”)는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 이들의 합성 형태 및 혼합된 중합체의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 둘 중 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 “핵산 분자”는 “핵산” 및 “폴리뉴클레오티드”와 동의어이다. 핵산 분자는 달리 명시되지 않는 한, 통상적으로 길이가 적어도 10 염기이다. 상기 용어는 중간 길이의 RNA 또는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 상기 용어는 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생적 및/또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 연결에 의해 연결된 자연-발생 및 변형된 뉴클레오티드 둘 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 당업자에 의해 용이하게 인지될 수 있는 바와 같이 비-자연적인 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들면, 비하전된 연결, 예컨대 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카바메이트 등; 하전된 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 팬던트 모이어티, 예컨대 펩티드; 삽입제, 예컨대 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결, 예컨대 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분 이중나선, 삼중나선, 헤어핀, 원형, 및 패드록 (padlock) 입체형태를 비롯한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
전사는 DNA 가닥을 따라 5'에서 3'으로의 방식으로 진행된다. 이는 RNA가 성장하는 쇄의 3' 말단으로의 리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트의 순차적 첨가에 의해 제조된다는 것을 의미한다 (피로포스페이트가 필수적으로 제거됨). 선형 또는 환형 핵산 분자에서, 별개의 요소 (예를 들면, 특정한 뉴클레오티드 서열)는 이들이 추가의 요소로부터 5' 방향으로 동일한 핵산에 결합하거나 결합할 것이라면 추가의 요소에 대해 "상류" 또는 “5’”인 것으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 별개의 요소는 이들이 추가의 요소로부터 3' 방향으로 동일한 핵산에 결합하거나 결합할 것이라면 추가의 요소에 대해 "하류" 또는 “3’”일 수 있다
본원에 사용된 용어 염기 “위치"는 지정된 핵산 내의 주어진 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다. 지정된 핵산은 기준 핵산과의 정렬 (하기 참조)에 의해 규정될 수 있다.
혼성화는 수소 결합을 통한 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 결합을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 및 이들의 유사체는 상보적 염기 사이에서, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴 (Hoogsteen), 또는 역 후그스틴 수소 결합을 포함하는, 수소 결합을 통해 혼성화된다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소함유 염기로 이루어진다. 이러한 질소함유 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에 수소 결합을 형성하고, 피리민딘의 퓨린에의 결합은 "염기 쌍형성"으로서 지칭된다. 보다 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합을 형성할 것이고, G는 C에 결합할 것이다. "상보적"은 2개의 별개의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에서 발생하는 염기 쌍형성을 지칭한다.
"특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적"은 안정한 및 특이적 결합이 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 타겟 사이에서 발생하도록 하기에 충분한 정도의 상보성을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화하기 위해 타겟 서열에 대해 100% 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드의 타겟 DNA 또는 RNA 분자에의 결합이 타겟 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해하는 경우에 특이적으로 혼성화가능하고, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에, 예를 들어 생체내 검정 또는 시스템의 경우에서의 생리학적 조건 하에 올리고뉴클레오티드의 비-타겟 서열에의 비-특이적 결합을 회피하기에 충분한 정도의 상보성이 존재한다. 이러한 결합은 특이적 혼성화로서 지칭된다.
특정한 정도의 엄중도를 발생시키는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg2+ 농도)가 혼성화의 엄중도에 기여하지만, 세척 시간도 또한 엄중도에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄중도를 획득하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 Sambrook 등 (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 및 11에 논의되어 있다.
본원에 사용된 용어 "엄중한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 타겟 사이에 50% 미만의 미스매치가 있는 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포괄한다. "엄중한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄중도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중증도의 엄중도"의 조건은 50% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자가 그 조건 하에 혼성화하지 않는 것이고; "고도의 엄중도"의 조건은 20% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 그 조건 하에 혼성화하지 않는 것이고; "매우 고도의 엄중도"의 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 그 조건 하에 혼성화하지 않는 것이다.
특정 실시양태에서, 엄중한 조건은 65℃ 에서의 혼성화에 이어서, 40분 동안 65℃ 에서 0.1x SSC/0.1% SDS로의 세척을 포함할 수 있다.
하기는 대표적인 비-제한적 혼성화 조건이다:
매우 고도의 엄중도: 16시간 동안 65℃ 에서 5x SSC 완충제 중에서 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃ 에서 0.5x SSC 완충제 중에서 2회 세척.
고도의 엄중도: 16-20시간 동안 65-70℃ 에서 5x-6x SSC 완충제 중에서 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2xSSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃ 에서 1x SSC 완충제 중에서 2회 세척
중증도의 엄중도: 16-20시간 동안 실온에서 55℃로 6x SSC 완충제 중에서 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온에서 55℃로 2x-3x SSC 완충제 중에서 적어도 2회 세척.
특정 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 매우 고도의 엄중도의 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 이러한 실시양태 및 추가의 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 고도의 엄중도의 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 이러한 실시양태 및 추가의 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 중증도의 엄중도의 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다.
올리고뉴클레오티드: "올리고뉴클레오티드"는 짧은 핵산 중합체이다. 올리고뉴클레오티드는 더 긴 핵산 절편의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동 합성기는 수백 개의 염기쌍 길이 까지의 올리고뉴클레오티드 합성을 허용한다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, 이는 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고데옥시리보뉴클레오티드)로 구성된 올리고뉴클레오티드는 소형 DNA 서열의 증폭을 위한 기술인 PCR에 사용될 수 있다. PCR에서, DNA 중합효소가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하도록 하는 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로서 지칭된다.
본원에 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문단에서 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 윈도우 상에서 최대의 상응도를 위해 정렬된 경우에 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들면, 핵산 서열 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 측정된 값을 지칭하며, 여기서 비교 윈도우 중 서열의 일부는, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여, 첨가, 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에서 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우에서의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예컨대 다음에 다양한 프로그램 또는 정렬 알고리즘이 기술되어 있다: Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson 및 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins 및 Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins 및 Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet 등 (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang 등 (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson 등 (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana 등 (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰을, 예를 들어, Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에서 확인할 수 있다.
국립 생물공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) (NCBI)의 베이직 로컬 얼라인머트서치 툴 (Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST™; Altschul 등 (1990))이 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물공학 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다) 및 인터넷을 포함하는 여러 출처로부터 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명이 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션 하에 입수가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능을 디폴트 파라미터를 사용하여 이용할 수 있다. 기준 서열에 대한 유사성이 더 큰 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가되었을 때 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적인 관계에 있을 때 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미칠 때 프로모터가 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합에 의해 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열들은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-암호화 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에는 동일한 판독 프레임 내에 있다. 그러나, 작동적으로 연결되기 위해 요소들이 인접할 필요는 없다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 일반적으로 유전자의 상류에 (유전자의 5' 영역을 향해) 위치하고 유전자의 전사를 개시하고 유도하는데 필요한 DNA의 영역을 지칭한다. 프로모터는, 프로모터가 제어하는 유전자의 적절한 활성화 또는 억제를 허용할 수 있다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특정 서열을 함유할 수 있다. 이들 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합할 수 있고, 이는 유전자의 암호화 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 중합효소의 동원을 유발한다. 프로모터는 일반적으로 5'-UTR, 인트론, 및 리더 서열을 비롯한 유전자의 상류에 위치하는 모든 유전자 조절 요소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "상류-프로모터"는 전사의 개시를 지시하기에 충분한 인접 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상류-프로모터는 TATA 박스, 개시 서열, TFIIB 인식 요소, 및 다른 프로모터 모티프를 포함하는 여러 서열 모티프를 갖는 전사의 개시 부위를 포괄한다 (Jennifer, E.F. 등, (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). 상류-프로모터는 TFIIA, B, D, E, F, 및 H와 같은 기본적 또는 일반적 전사 인자를 사용하는 다중-서브유닛 효소인 RNA 중합효소 II에 대한 작용 부위를 제공한다. 이들 인자는 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 촉매하는 전사 개시전 복합체로 조립된다.
상류-프로모터의 활성화는 다양한 단백질이 결합하고 후속적으로 전사 개시 복합체와 상호작용하여 유전자 발현을 활성화시키는 조절 DNA 서열 요소의 첨가 서열에 의해 수행된다. 이들 유전자 조절 요소 서열은 특정 DNA-결합 인자와 상호작용한다. 이들 서열 모티프는 때때로 시스-요소로서 지칭될 수 있다. 조직-특이적 또는 발달-특이적 전사 인자가 결합하는 이러한 시스-요소는 개별적으로 또는 조합되어 프로모터의 시공적 발현 패턴을 전사수준에서 결정할 수 있다. 이들 시스-요소는 작동가능하게 연결된 유전자에 대해 발휘하는 제어 유형에서 광범위하게 다르다. 일부의 요소는 환경 반응 (예를 들면, 온도, 수분, 및 상처)에 반응하여 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 증가시키도록 작용한다. 다른 시스-요소는 발달 신호 (예를 들면, 발아, 종자 성숙, 및 개화) 또는 공간 정보 (예를 들면, 조직 특이성)에 반응할 수 있다. 예를 들어, Langridge 등, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23을 참조한다. 이들 시스-요소는 전사 개시점으로부터 다양한 거리에 위치하며, 일부 시스-요소 (근위 요소로 불림)는 최소 코어 프로모터 영역에 인접한 반면, 다른 요소는 프로모터 (인핸서)의 수 킬로염기 상류 또는 하류에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "5’ 비번역 영역” 또는 “5’-UTR”은 프리 (pre)-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 5’ 말단의 비번역 분절로서 정의된다. 예를 들어, 성숙한 mRNA에서, 5’-UTR은 전형적으로 이의 5’ 말단에 7-메틸구아노신 캡을 가지고 있으며, 스플라이싱, 폴리아데닐화, mRNA를 세포질쪽으로 내보내는 것, 번역 기구에 의해 mRNA의 5’ 말단을 식별하는 것, 및 mRNA를 분해로부터 보호하는 것과 같은 다수의 과정에 관여한다.
본원에 사용된 용어 "전사 종결자”는 프리-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 3’ 말단의 전사된 분절로서 정의된다. 예를 들어, “폴리아데닐화 신호” 부위를 넘어서는 보다 긴 DNA 스트레치가 프리-mRNA로서 전사된다. 이러한 DNA 서열은 통상적으로 프리-mRNA를 성숙한 RNA로 적절하게 처리하기 위한 전사 종결 신호를 함유한다.
본원에 사용된 용어 "3’ 비번역 영역” 또는 “3’-UTR”은 프리-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 3’ 말단의 비번역 분절로서 정의된다. 예를 들어, 성숙한 mRNA에서, 이러한 영역은 폴리-(A) 꼬리를 가지고 있으며, mRNA 안정성, 번역 개시, 및 mRNA 방출 (export)에서 다수의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 3’-UTR은 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결자를 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “폴리아데닐화 신호”는 폴리-(A) 중합효소가 존재할 때, 폴리아데닐화 부위에서 폴리아데닐화될 수 있는 전사물을 허용하는 mRNA 전사물에 존재하는 핵산 서열을 지칭하며, 예컨대 폴리-(A) 신호의 10 내지 30 염기 하류에 위치한다. 다수의 폴레아데닐화 신호가 당업계에 공지되어 있으며 본 발명에 유용하다. 예시적인 서열은 Loke J., 등, (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468에 기술되어 있는 바와 같이, AAUAAA 및 이의 변이체를 포함한다.
”DNA 결합 트랜스젠”은 DNA 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 암호화 서열이다. DNA 결합 단백질은 후속적으로 다른 분자에 서로 결합할 수 있다. 결합 단백질은, 예컨대 DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질), 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 그 자체에 결합할 수 있고/있거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성함), 하나 이상의 상이한 단백질 또는 단백질 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 이상의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예컨대, 아연 손가락 (zinc finger) 단백질은 DNA-결합, RNA-결합, 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
DNA 결합 단백질의 예시는 다음을 포함한다: 메가뉴클레아제, 아연 손가락, CRISPR, 및 소정의 뉴클레오티드 서열에 결합하기 위해 “조작될”수 있는 TALE 결합 단백질. 전형적으로, 조작된 DNA 결합 단백질 (예컨대, 아연 손가락, CRISPR, 또는 TALE)은 비-자연발생적인 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하기 위한 방법의 비-제한적인 예시가 설계되고 선택된다. 설계된 DNA 결합 단백질은 자연에서 발생하지 않는 단백질로서, 이의 설계/조성이 주로 합리적인 기준에서 나온다. 합리적인 설계 기준은 기존 ZFP, CRISPR, 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스의 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예컨대, 미국특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조한다; 또한, WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 특허 공개 제20110301073호, 제20110239315호 및 제20119145940호를 참조한다.
”아연 손가락 DNA 결합 단백질” (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 손가락을 통해 서열-특이적인 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 보다 큰 단백질 내의 도메인이며, 이의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열 영역이다. 용어 아연 손가락 DNA 결합 단백질은 종종 아연 손가락 단백질 또는 ZFP로 약칭된다. 아연 손가락 결합 도메인은 소정의 뉴클레오티드 서열에 결합하기 위해 “조작”될 수 있다. 아연 손가락 단백질을 조작하기 위한 방법의 비-제한적인 예시가 설계되고 선택된다. 설계된 아연 손가락 단백질은 자연에서 발생하지 않는 단백질이며, 이의 설계/고안은 주로 합리적인 기준에서 나온다. 합리적인 설계 기준은 기존 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스의 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 컴퓨터화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예컨대, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호 및 제6,794,136호를 참조한다; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496를 참조한다.
또 다른 실시예에서, 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생적이거나 조작된 (비-자연발생적인) TAL 효과기 (effector) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예컨대, 이의 전체가 참조로써 본원에 포함된 미국특허 공개 제20110301073호를 참조한다. 산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물성 식물에서 다수의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 산토모나스의 병원성은 식물 세포 내로 하나 이상의 다른 효과기 단백질을 주입하는 보존된 III형 분비 (T3S) 시스템에 의존한다. 이러한 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성제를 모방하고 식물 전사물을 조작하는 전사 활성제-유사 (TALEN) 효과기가 있다 (Kay 등, (2007) Science 318:648-651 참조). 이러한 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성분석된 TAL-효과기 중 하나는 산토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아 (Bonas 등, (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 및 WO2010079430 참조)로부터의 AvrBs3이다. TAL-효과기는 종열 반복 배열 (tandem repeat)의 중앙 집중화된 도메인을 함유하며, 각각의 반복은 약 34개의 아미노산을 함유하며, 이는 이러한 단백질의 DNA 결합 특이성의 핵심이다. 또한, 이들은 핵 위치화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (리뷰를 위해 Schornack S, 등, (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272를 참조한다). 또한, 식물병원성 박테리아인 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum)의 2개의 유전자인, 지정된 brg11 및 hpx17이 R. 솔라나시아룸 비오바 (biovar) 균주 GMI1000 및 비오바 4 균주 RS1000에서 산토모나스의 AvrBs3 패밀리와 상동성인 것으로 확인되었다 (Heuer 등, (2007) Appl 및 Enviro Micro 73(13): 4379-4384 참조). 이러한 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만 hpx17의 반복 도메인에서 1,575 bp가 결실되어 다르다. 그러나, 두 유전자 산물 모두 산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예컨대, 이의 전체가 참조로써 본원에 포함된 미국 특허 공개 제20110301073호를 참조한다.
이러한 TAL 효과기의 특이성은 종열 반복 배열에서 발견되는 서열에 의존한다. 반복된 서열은 약 102 bp를 포함하고, 반복은 전형적으로 서로 91 내지 100% 상동성이다 (Bonas 등, ibid). 반복물의 다형성은 통상적으로 12 및 13 위치에 있으며, TAL 효과기의 타겟 서열에서 인접 뉴클레오티드의 동일성을 갖는 12 및 13 위치의 초가변 이잔기 (hypervariable diresidue)의 동일성과 일대일 대응이 있는 것으로 보인다 (Moscou 및 Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch 등, (2009) Science 326:1509-1512 참조). 실험적으로, 이러한 TAL-효과기의 DNA 인식 위한 천연 암호는 12 및 13 위치의 HD 서열이 시토신 (C)에 대한 결합을 유도하고, NG가 T에 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고 NN이 A 또는 G에 결합하고, ING가 T에 결합하도록 결정되었다. 이러한 DNA 결합 반복은 새로운 조합 및 반복 수를 갖는 단백질로 조립되어, 새로운 서열과 상호작용하고 식물 세포의 비 내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 생성한다 (Boch 등, ibid). 조작된 TAL 단백질은 효모 리포터 분석 (플라스미드 기반 타겟)에서 활성을 나타내는 TAL 효과기 도메인 뉴클레아제 융합 (TALEN)을 생성하기 위해 Fok I 절단 절반 도메인에 연결되어 있다.
CRISPR (군집형태로 규칙적으로 공간사이의 짧은 회문반복 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR 연관된 (Associated)) 뉴클레아제 시스템은 게놈 조작에 사용될 수 있는 박테리아 시스템에 기반한 최근에 조작된 뉴클레아제 세스템이다. 이는 다수의 박테리아와 고세균 (Archaea)의 적응 면역 반응의 일부에 기반한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아에 침투하면, 침입자의 DNA의 분절이 “면역” 반응에 의해 CRISPR RNA (crRNA)로 전환된다. 이러한 crRNA는 이어서, 부분적 상보성 영역을 통해 tracrRNA라고 불리는 또 다른 종류의 RNA와 결합하여 Cas9 뉴클레아제를 “프로토스페이서 (protospacer)”로 불리는 타겟 DNA의 crRNA에 상동성인 영역으로 안내한다. Cas9은 crRNA 전사물 내에 포함된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위의 이중-가닥 절단 (DBS)에서 무딘 말단 (blunt end)을 생성하도록 DNA를 절단한다. Cas9은 부위 특이적인 DNA 인식 및 절단을 위한 crRNA 및 tracrRNA 둘 모두를 필요로 한다. 이러한 시스템은 현재 crRNA와 tracrRNA가 하나의 분자 (“단일 가이드 RNA”)로 조합될 수 있도록 조작되었으며, 단일 가이드 RNA의 crRNA 등가 부분은 Cas9 뉴클레아제를 유도하여 임의의 원하는 서열을 타겟화하도록 조작될 수 있다 (Jinek 등, (2012) Science 337, pp. 816-821, Jinek 등, (2013), eLife 2:e00471, 및 David Segal, (2013) eLife 2:e00563 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 게놈의 원하는 타겟에서 DSB를 생성하도록 조작될 수 있으며, DSB의 수리는 오류 유발 수선 (error prone repair)을 증가시키기는 수리 억제제의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다.
또 다른 실시예에서, DNA 결합 트랜스젠은 조작된 (비-자연발생적인) 메가뉴클레아제 (귀소 (homing) 엔도뉴클레아제로도 기술됨)를 포함하는 부위 특이적 뉴클레아제이다. 귀소 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제 예컨대 I- SceI, I- CeuI, PI- PspI, PI- Sce, I- SceIV, I- CsmI, I- PanI, I- SceII, I- PpoI, I- SceIII, I- CreI, I- TevI, I- TevII 및 I- TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; Belfort 등, (1997) Nucleid Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon 등, (1989) Gene 82:115-118; Perler 등, (1994) Nucleid Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble 등, (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등, (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다. 또한, 귀소 엔도뉴클라아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 타겟 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예컨대, Chevalier 등, (2002) Molec. Cell 10:895 905; Epinat 등, (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952 2962; Ashworth 등, (2006) Nature 441:656 659; Paques 등, (2007) Current Gene Therapy 7:49 66; 미국 특허 공개 제20070117128호를 참조한다. 귀소 엔도뉴클라아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체로서 뉴클레아제와 관련하여 변경될 수 있거나 (즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “형질전환”은 핵산 분자가 이러한 세포에 도입될 수 있는 모든 기법을 포함한다. 예시는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터로 형질감염; 플라스미드 벡터로 형질전환; 전기천공; 리포펙션; 미세주입 (Mueller 등, (1978) Cell 15:579 85); 아그로박테리움-매개 전달; 직접 DNA 흡수; 휘스커스 (whiskers™)-매개 형질전환; 및 미세발사체 충격. 이러한 기법은 식물 세포의 안정한 형질전환 및 일시적인 형질전환 둘 모두를 위해 사용될 수 있다. "안정적인 형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 게놈 내로 도입하여, 유전적으로 안정적인 유전을 유발시키는 것을 지칭한다. 일단 안정적으로 형질전환되면, 핵산 단편은 숙주 유기체 및 임의의 후속 세대의 게놈 내에 안정적으로 통합된다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉(transgenic)" 유기체로서 지칭된다. "일시적 형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 핵 또는 DNA-함유 소기관 내로 도입하여, 유전적으로 안정적인 유전의 부재 하의 유전자 발현을 유발시키는 것을 지칭한다.
외인성 핵산 서열. 일 실시예에서, 트랜스젠은 유전자 서열 (예컨대, 제초제-저항성 유전자), 산업적으로 또는 약학적으로 유용한 화합물을 암호화하는 유전자, 또는 바람직한 농업적 형질을 암호화하는 유전자이다. 또 다른 실시예에서, 트랜스젠은 안티센스 핵산 서열이며, 여기서 안티센스 핵산 서열의 발현은 타겟 핵산 서열의 발현을 저해한다. 트랜스젠은 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예컨대, 프로모터)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스젠이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 내인성 핵산 서열이며, 여기서 내인성 핵산 서열의 추가의 게놈 복사본이 바람직하거나, 숙주 유기체에서 타겟 핵산 분자의 서열에 대해 안티센스 배향인 핵산 서열이다.
본원에 사용된 용어 트랜스제닉 “이벤트”는 식물 세포를 이종성 DNA, 즉, 관심 트랜스젠을 포함하는 핵산 구조체로 형질전환하는 단계, 트랜스젠이 상기 식물의 게놈에 삽입되어 생성된 식물 집단을 재생시키는 단계, 및 특정 게놈 위치에 삽입되어 특징화된 특정 식물을 선별하는 단계에 의해 생산된다. 용어 “이벤트”는 원래의 형질전환체 및 이종 DNA를 포함하는 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 “이벤트”는 또한 형질전환체와 게놈/트랜스젠 DNA를 포함하는 또 다른 변이체 사이의 성적 이종교배에 의해 생산된 자손을 지칭한다. 반복친 (recurrent parent)에 대한 반복적인 역교배 후에도, 형질전환된 부모로부터 삽입된 트랜스젠 DNA 및 측부 (flanking) 게놈 DNA (게놈/트랜스젠 DNA)가 동일한 염색체 위치에서의 교배 자손에 존재한다. 용어 “이벤트”는 또한 본래의 형질전환체 및 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접한 측부의 게놈 서열을 포함하는 이의 자손을 지칭하며, 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 부모계 (예컨대, 원래의 형질전환체 및 자가수정에 의한 자손) 및 삽입된 DNA를 함유하지 않은 부모계의 성적 교배의 결과로서 관심 트랜스젠을 포함하는 삽입된 DNA를 수용하는 자손에 전달될 것이로 기대된다.
본원에 사용된 용어 “중합효소 연쇄 반응” 또는 “PCR”은 1987년 7월 28일에 발행된 미국특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같이 미량의 핵산, RNA 및/또는 DNA가 증폭되는 공정 또는 기법을 정의한다. 일반적으로, 관심 영역 또는 그 이상의 영역의 말단으로부터의 서열 정보가 이용가능해야 하므로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있어야 하고; 이러한 프라이머는 증폭되어야 할 주형의 반대 가닥과 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5’ 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등으로부터 전사된 cDNA를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 Mullis 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)를 참조한다.
본원에 사용된 용어 “프라이머”는 조건이 프라이머 신장 산물의 합성에 적절할 때 상보적인 가닥을 따라 합성 개시 지점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 합성 조건은 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 적어도 하나의 중합-유도제 예컨대 역전사효소 또는 DNA 중합효소를 포함한다. 이들은 적절한 완충액에 존재하며, 이는 적절한 보조-인자 또는 pH 및 다양한 적절한 온도 등과 같이 조건에 영향을 주는 구성요소를 포함할 수 있다. 프라이머는 바람직하게는 증폭 효율이 최적화되도록 단일 가닥 서열이지만, 이중 가닥 서열이 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “프로브”는 타겟 서열을 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. TaqMan® 또는 TaqMan®-스타일 검정 방법에서, 프로브는 2개의 프라이머의 어닐링 부위 사이에 위치한 타겟의 일부에 혼성화한다. 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 또는 약 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 검출가능한 표지, 예컨대 형광단 (Texas-Red®, 플루오레세인 (Fluorescein) 이소시오시아네이트 등)을 추가로 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는, 예컨대 프로브의 5’ 말단 또는 프로브의 3’ 말단에 위치한 프로브 올리고뉴클레오티드에 공유결합적으로 직접 부착될 수 있다. 또한, 형광단을 포함하는 프로브는 예컨대 켄쳐 (quencher) 예컨대 Black Hole Quencher™, Iowa Black™ 등을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 “제한 엔도뉴클레아제” 및 “제한 효소”는 박테리아 효소를 지칭하며, 각각은 특이적 뉴클레오티드에서 또는 그 근처에서 이중-가닥 DNA를 절단한다. 유형-2 제한 효소는 동일한 부위에서 DNA를 인식하고 절단하며, 비제한적으로 XbaI, BamHI, HindIII, EcoRI, XhoI, SalI, KpnI, AvaI, PstI 및 SmaI을 포함한다.
본원에 사용된 용어 “벡터”는 “구조체”, “클로닝 벡터” 및 “발현 벡터”와 상호교환적으로 사용되며, DNA 또는 RNA 서열 (예컨대, 외래 유전자)가 숙주 세포에 도입되어 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열을 발현 (예컨대, 전사 또는 번역)하는 것을 촉진할 수 있는 비히클을 의미한다. “비-바이러스 벡터”는 바이러스 또는 레트로바이러스를 포함하지 않는 임의의 벡터를 의미하도록 의도된다. 일부 실시양태에서, “벡터”는 적어도 하나의 DNA 복제 기점 및 적어도 하나의 선택성 마커 유전자를 포함하는 DNA 서열이다. 예시는, 비제한적으로 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 외인성 DNA를 세포내로 운반하는 바이러스를 포함한다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택성 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시켜 세포가 벡터에 의해 암호화된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 용어 “플라스미드”는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상염색체 복제가 가능한 핵산의 환형 가닥을 정의한다. 이러한 용어는 DNA 또는 RNA일 수 있고 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는 핵산을 포함한다. 정의의 플라스미드는 또한 박테리아의 복제 기점에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 “선택성 마커 유전자”는 본원에 사용된 바와 같이 선택성 마커 유전자가 삽입된 세포의 식별을 용이하게 하는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 다른 발현 카세트를 정의한다. 예컨대, “선택성 마커 유전자”는 리포터 유전자뿐만 아니라, 예컨대 식물 세포를 선택 제제로부터 보호하거나 선택 제제에 대한 저항성/내성을 제공하기 위한 식물 형질전환에서 사용되는 유전자를 포함한다. 일 실시양태에서, 기능적 선택성 마커를 수용하는 세포 또는 식물만이 선택 제제를 갖는 조건 하에서 분열 또는 성장할 수 있다. 선택 제제의 예시는, 예컨대 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타마이신, 및 하이그로마이신을 포함하는 항생제를 포함할 수 있다. 이러한 선택성 마커는 항생제인 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II), 관련된 항생제인 네오마이신, 파로모마이신, 겐타마이신, 및 G418에 대한 유전자, 또는 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 다른 선택성 마커 유전자는 bar 또는 pat (글루포시네이트 암모늄 또는 포스피노트리신에 대한 저항성), 아세토락테이트 합성효소 (ALS, 설포닐우레아 (SU)와 같은 억제제에 대한 저항성), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB), 및 분지쇄 아미노산의 합성 제 1단계를 방지하는 설포닐아미노 카보닐 트리아졸리논, 글리포세이트, 2,4-D, 및 금속 저항성 또는 민감성을 포함하여 제초제 내성을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 선택성 마커 유전자로서 사용될 수 있는 “리포터 유전자”의 예시는 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼린 포스파타제 등과 같은 발현된 리포터 유전자 단백질의 시각적인 관찰을 포함한다. 어구 “마커-양성”은 선택성 마커 유전자를 포함하도록 형질전환된 식물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “검출가능 마커”는 예컨대 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터, 또는 효소와 같은 검출 가능한 표지를 지칭한다. 검출가능 마커의 예는, 비제한적으로 다음을 포함한다: 형광 표지 (예컨대, FITC, 로다민, 란탄족 인광체 (lanthanide phosphor)), 효소 표지 (예컨대, 홍당무 과산화효소 (horseradish peroxidase), β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제), 화학발광체, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프 (예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일 실시양태에서, 검출가능 마커는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암 (spacer arm)에 의해 부착될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “카세트”, “발현 카세트” 및 “유전자 발현 카세트”는 특정 제한 부위에서 또는 상동성 재조합에 의해 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내에 삽입될 수 있는 DNA 단편을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, DNA 단편은 관심 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 또는 번역을 위한 적절한 판독 프레임에 카세트가 확실히 삽입되도록 설계된다. 일 실시양태에서, 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 암호화하고 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 폴리뉴클레오티드 이외의 요소를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 또한 숙주 세포에서 관심 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 향상시키도록 하는 요소를 포함할 수 있다. 이러한 요소는, 비제한적으로 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 “링커” 또는 “스페이서”는 2개의 실재물을 서로 결합시키는 결합, 분자 또는 분자의 군이다. 링커 및 스페이서는 2개의 실재물의 최적의 간격을 제공하거나 두 실재물이 서로 분리되도록 하는 불안정한 연결을 추가로 제공할 수 있다. 불안정한 연결은 광분해가능한 기, 산-불안정한 모이어티, 염기-불안정한 모이어티 및 효소-분해가능한 기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 “폴리링커” 또는 “다중 클로닝 부위”는 핵산 서열 상의 서로의 10개의 뉴클레오티드 내에 위치한 3개 이상의 유형-2 제한 효소 부위의 군집을 정의한다. 폴리링커를 포함하는 구조체는 유전자의 암호화 영역과 같은 핵산 서열의 삽입 및/또는 절단을 위해 사용된다. 다른 예시에서, 본원에 사용된 용어 “폴리링커”는 임의의 공지된 이음새 없는 (seamless) 클로닝 방법 (즉, Gibson Assembly®, NEBuilder HiFiDNA Assembly®, Golden Gate Assembly®, BioBrick® Assembly 등)을 통해 2개의 서열을 결합시키는 것을 목표로 하는 뉴클레오티드 스트레치를 지칭한다. 폴리링커를 포함하는 구조체는 유전자의 암호화 영역과 같은 핵산 서열의 삽입 및/또는 절단을 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 “대조군”은 비교 목적을 위해 분석 절차에서 사용되는 샘플을 지칭한다. 대조군은 “양성” 또는 “음성”일 수 있다. 예컨대, 분석 절차의 목적이 세포 또는 조직에서 상이하게 발현된 전사물 또는 폴리펩티드를 검출하는 것일 경우, 일반적으로 원하는 발현을 나타내는 공지된 식물로부터의 샘플과 같은 양성 대조군, 및 원하는 발현이 결핍된 공지된 식물로부터의 샘플과 같은 음성 대조군을 포함하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 “식물”은 전체 (whole) 식물 및 임의의 자손, 세포, 조직, 또는 식물의 부분을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 식물 부류는 일반적으로 속씨 식물 (단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨 식물, 양치 식물 및 다세포 조류를 포함하여 돌연변이 유발이 가능한 고등 및 하등 식물 부류와 같이 광범위하다. 따라서, “식물”은 쌍자엽 및 단자엽 식물을 포함한다. 용어 “식물 부분”은 식물의 임의의 부분을 포함하며, 예컨대 비제한적으로 다음을 포함한다: 종자 (성숙 종자 및 비성숙 종자); 식물 가지(cutting); 식물 세포; 식물 세포 배양물; 식물 기관 (예컨대, 화분, 배아, 꽃, 과일, 싹, 잎, 뿌리, 줄기, 및 외식편 (explant)). 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 원형질, 캘러스, 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 다른 군일 수 있다. 식물 세포 또는 조직 배양물은 세포 또는 조직이 수득된 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생할 수 있고, 이러한 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있다. 대조적으로, 일부 식물 세포는 식물을 생산하기 위해 재생될 수 없다. 식물 세포 또는 조직 배양물에서 재생가능한 세포는 배아, 원형질, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 뿌리 끝, 실크, 꽃, 커넬, 귀, 껍질 (cob), 겉껍질 (husk), 또는 줄기 (stalk)일 수 있다.
식물 부분은 수확가능한 부분 및 자손 식물의 번식에 유용한 부분을 포함한다. 번식에 유용한 식물 부분은, 예컨대 비제한적으로 종자; 열매; 가지; 묘목; 괴경 (tuber); 및 근경 (rootstock)을 포함한다. 수확가능한 식물 부분은 임의의 유용한 식물 부분은, 예컨대 비제한적으로 꽃; 화분; 묘목; 괴경; 잎; 줄기; 열매; 종자; 및 뿌리를 포함하여 임의의 유용한 식물 부분일 수 있다.
식물 세포는 원형질 및 세포 벽을 포함하여, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포, 또는 세포 응집물 (예컨대, 이쇄성 (friable) 캘러스 및 배양된 세포)의 형태일 수 있으며, 보다 높은 조직화된 단위 (예컨대, 식물 조직, 식물 기관, 및 식물)의 부분일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질, 배우자 생성 세포, 또는 전체 식물로 재생시킬 수 있는 세포 또는 세포 집합일 수 있다. 이와 같이, 다수의 식물 세포를 포함하고 전체 식물로 재생시킬 수 있는 종자가 본원의 일 실시양태에서 “식물 세포”로 고려된다.
본원에 사용된 용어 “소형 RNA”는 비-암호화 리보핵산 (ncRNA)의 일부 부류를 지칭한다. 용어 소형 RNA는 박테리아 세포, 동물, 식물, 및 균류에서 생산된 ncRNA의 단쇄를 기술한다. 이러한 ncRNA의 단쇄는 세포 내에서 자연적으로 생산될 수 있거나 단쇄 또는 ncRNA를 발현하는 외인성 서열의 도입에 의해 생산될 수 있다. 소형 RNA 서열은 단백질을 직접적으로 암호화하지 않으며, 소형 RNA 서열이 전사되기만 하고 번역되지는 않는다는 점에서 다른 RNA와 기능상의 차이가 있다. 소형 RNA 서열은 유전자 발현 및 변형을 포함하여, 다른 세포 기능과 관련되어 있다. 소형 RNA 분자는 통상적으로 약 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 소형 RNA 서열은 보다 긴 전구체로부터 유도될 수 있다. 전구체는 자기-상보적 영역에서 서로 접히는 구조를 형성하며; 이어서 이들은 동물에서 뉴클레아제인 다이서 (Dicer) 또는 식물에서 DCL1에 의해 처리된다.
마이크로RNA (miRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 소형 핵소체 (nucleolar) RNA (snoRNA)를 포함하여, 다수의 유형의 소형 RNA가 자연적으로 존재하거나 인공적으로 생산된다. 마이크로 RNA 및 siRNA와 같은 특정 유형의 소형 RNA가 유전자 침묵 및 RNA 간섭 (RNAi)에서 중요하다. 유전자 침묵은 정상적으로 발현되는 유전자가 세포내 요소, 이러한 경우 소형 RNA에 의해 “꺼지는” 유전자 조절 과정이다. 이러한 유전적 정보에 의해 정상적으로 형성되는 단백질은 간섭에 의해 형성되지 않으며, 이러한 유전자에 암호화된 정보가 발현으로부터 차단된다.
본원에 사용된 용어 “소형 RNA”는 “아주 작은 (tiny) RNA” (Storz, (2002) Science 296:12603; Illangasekare 등, (1999) RNA 5:14821489); 원핵생물의 “소형 RNA” (sRNA) (Wassarman 등, (1999) Trends Microbiol. 7:3745); 진핵생물의 “비암호화 RNA (ncRNA)”; “마이크로RNA (miRNA)”; “소형 비mRNA (snmRNA)”; “기능적 RNA (fRNA)”; “전달 RNA (tRNA)”; “촉매 RNA” [예컨대, 리보자임, 자가-아실화 리보자임 포함 (Illangaskare 등, (1999) RNA 5:14821489); “소형 핵소체 RNAs (snoRNAs),” “tmRNA” (“10S RNA,”로도 알려짐, Muto 등, (1998) Trends Biochem Sci. 23:2529; 및 Gillet 등, (2001) Mol Microbiol. 42:879885); RNAi 분자, 비제한적으로“소형 간섭 RNA (siRNA) 포함,” “엔도리보뉴클레아제제조된 siRNA (esiRNA),” “짧은 헤어핀 RNA (shRNA),” 및 “소형 일시적으로 조절된 RNA (stRNA),” “다이서 (diced) siRNA (dsiRNA),”과 같이 문헌에 기술된 RNA 분자, 및 앱타머, 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 우라실 염기를 포함하는 다른 합성 핵산을 포함한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를, 예컨대 Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 “하나의 (a, an)” 및 “그(the)”는 문맥이 달리 명확하고 불분명하게 지시하지 않는 한 복수의 인용을 포함한다.
III. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 이를 포함하는 핵산
식물에서 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠을 발현하기 위한 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터를 사용 방법 및 조성물이 제공된다. 일 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터일 수 있다.
일 실시양태에서, 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터이다. 일 실시양태에서, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 실시양태에서, 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 일 실시양태에서, 폴리링커에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 실시양태에서, 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트가 제공된다. 일 실시양태에서, 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 일 실시양태에서, 프로모터는 서열번호 1. 예시적인 실시양태에서, 핵산 벡터는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하며, 여기서 상기 트랜스젠은 살곤충제 저항성 트랜스젠, 제초제 내성 트랜스젠, 질소 사용 효율 트랜스젠, 물 사용 효율 트랜스젠, 영양 품질 트랜스젠, DNA 결합 트랜스젠, 소형 RNA 트랜스젠, 선택성 마커 트랜스젠, 또는 이들의 조합일 수 있다.
트랜스젠 발현은 또한 유전자의 암호화 서열의 하류에 위치한 3’-비번역 유전자 영역 (즉, 3’-UTR)에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 및 3’-UTR 둘 모두는 트랜스젠 발현을 조절할 수 있다. 프로모터가 전사를 유도하는데 필수적인 반면, 3’-UTR 유전자 영역은 전사를 종결시키고 번역 및 단백질 합성을 위해 생성된 mRNA 전사물의 폴리아데닐화를 개시할 수 있다. 3’-UTR 유전자 영역은 트랜스젠의 안정한 발현을 돕는다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR을 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 일 실시양태에서, 핵산 벡터는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함한다. 일 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR은 서열번호 3이다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR을 포함하는 핵산 벡터가 제공되며, 여기서 3’ -UTR은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 일 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR을 포함하는 핵산 벡터가 제공되며, 여기서 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR 둘 모두는 폴리링커의 반대편 말단에 작동가능하게 연결된다. 일 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트가 제공되며, 여기서 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR 둘 모두는 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 반대편 말단에 작동가능하게 연결된다. 일 실시양태에서, 3’ -UTR은 서열번호 3으로 이루어져 있다. 일 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 3’ -UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트가 제공되며, 여기서 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1을 포함하고 3’ -UTR은 서열번호 3을 포함하고 여기서 프로모터 및 3’ -UTR은 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 반대편 말단에 작동가능하게 연결된다. 이러한 실시양태의 측면에서, 3’ -UTR은 서열번호 3으로 이루어져 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 프로모터는 서열번호 1. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함하며, 상기 트랜스젠은 살곤충제 저항성 트랜스젠, 제초제 내성 트랜스젠, 질소 사용 효율 트랜스젠, 물 사용 효율 트랜스젠, 영양 품질 트랜스젠, DNA 결합 트랜스젠, 소형 RNA 트랜스젠, 선택성 마커 트랜스젠, 또는 이들의 조합일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 트랜스젠은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 동일한 메탈로티오네인-유사 유전자로부터의 3’ -UTR에 작동가능하게 연결된다.
트랜스젠 발현은 또한 프로모터 서열의 하류에 위치한 인트론 영역에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 및 인트론 모두는 트랜스젠 발현을 조절할 수 있다. 프로모터가 전사를 유도하는데 필수적인 반면, 인트론의 존재는 발현 수준을 증가시켜 번역 및 단백질 합성을 위한 mRNA 전사물을 생성할 수 있다. 인트론 유전자 영역은 트랜스젠의 안정한 발현을 돕는다. 추가의 실시양태에서, 인트론은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
트랜스젠 발현은 또한 프로모터 서열의 하류에 위치한 5’-UTR 영역에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 및 5’-UTR 모두는 트랜스젠 발현을 조절할 수 있다. 프로모터가 전사를 유도하는데 필수적인 반면, 5’-UTR의 존재는 발현 수준을 증가시켜 번역 및 단백질 합성을 위한 mRNA 전사물을 생성할 수 있다. 5’-UTR 유전자 영역은 트랜스젠의 안정한 발현을 돕는다. 추가의 실시양태에서, 5’ -UTR은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 또한 하나 이상의 추가의 서열 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 엑손 (예컨대, 엽록체 수송 펩티드 또는 ER 보유 신호와 같은 리더 또는 신호 펩티드)을 포함할 수 있다. 예컨대 비제한적으로, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 추가의 실시양태와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 내에 혼입된 엑손을 암호화할 수 있다.
일 실시양태에서, 핵산 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 유전자 발현 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 바이러스, 또는 직접적인 형질전환 또는 공여 DNA와 같은 유전자 타겟화에 사용하기 위한 절단된 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 재조합 유전자 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터가 제공되며, 여기서 재조합 유전자 발현 카세트는 폴리링커 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터, 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 실시양태에서, 재조합 유전자 카세트는 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함한다. 일 실시양태에서, 재조합 유전자 카세트는 폴리링커 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함한다. 폴리링커는, 암호화 서열이 폴리링커의 제한 부위 중 하나에 삽입되는 것이 상기 암호화 서열을 작동가능하게 연결하여 벡터가 숙주 세포에 형질전환되거나 형질감염될 때 상기 암호화 서열의 발현을 가능케 하는 방식으로 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 실시양태에 따르면, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에 따르면, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에 따르면, 프로모터 서열은 총 길이가 1.5, 2, 2.5, 3 또는 4 kb 이하이다. 일 실시양태에 따르면, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2,000 bp 서열로 이루어져 있다. 일 실시양태에 따르면, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2,000 bp 서열로 이루어져 있다.
브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터가 서열번호 12인 실시양태가 추가로 제공된다. 이러한 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 서열은 본원에서 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 본원에 개시된 대상에 의해 제공되는 바와 같은 서열번호 1 대신 사용될 수 있는 대안적인 프로모터 서열이 제공된다. 서열번호 1 및 서열번호 12의 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 97.2%의 서열 동일성을 공유한다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 추가의 실시양태로서 서열번호 12의 프로모터가 제공된다.
또한 도 2에 도시된 바와 같이 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 한 실시양태로서 서열번호 7(1,730 bp), 서열번호 8 (1,530 bp), 서열번호 9 (1,330 bp), 서열번호 10 (1,130 bp) 및 서열번호 11 (1,001 bp)가 제공된다. 이러한 절단된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 서열은 본원에서 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 본원에 개시된 대상에 의해 제공되는 바와 같은 서열번호 1 대신 사용될 수 있는 대안적인 프로모터 서열이 제공된다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 추가의 실시양태로서 서열번호 7의 1,730 bp 프로모터가 제공된다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 추가의 실시양태로서 서열번호 8의 1,530 bp 프로모터가 제공된다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 추가의 실시양태로서 서열번호 9의 1,330 bp 프로모터가 제공된다. 또한, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 추가의 실시양태로서 서열번호 10의 1,130 bp 프로모터가 제공된다. 또한, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터의 추가의 실시양태로서 서열번호 9의 1,001 bp 프로모터가 제공된다.
일 실시양태에 따르면, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터, 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠 및 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’-UTR로 이루어진 유전자 카세트를 포함하는 핵산 벡터가 제공된다. 일 실시양태에서, 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’-UTR은 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 3’ 말단에 작동가능하게 연결된다. 추가의 실시양태에서, 3' 비번역 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 적어도 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 3' 비번역 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2,000 bp 서열, 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠 및 3’-UTR로 이루어진 유전자 카세트를 포함하는 핵산 벡터가 제공되며, 여기서 서열번호 1은 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 5’ 말단에 작동가능하게 연결되고 서열번호 3의 3’-UTR은 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 3’ 말단에 작동가능하게 연결된다. 일 실시양태에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2,000 bp 서열, 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠 및 3’-UTR로 이루어진 유전자 카세트를 포함하는 핵산 벡터가 제공되며, 여기서 서열번호 1은 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 5’ 말단에 작동가능하게 연결되고 서열번호 3의 3’-UTR은 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠의 3’ 말단에 작동가능하게 연결된다. 추가의 실시양태에서, 3' 비번역 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 적어도 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 3' 비번역 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 적어도 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 1,002 bp 서열로 이루어져 있다. 추가의 실시양태에서, 3' 비번역 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 3' 비번역 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 1,002 bp 서열로 이루어져 있다.
브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR의 실시양태로서 서열번호 17 및 서열번호 18이 추가로 제공된다. 이러한 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’-UTR 서열은 본원에서 트랜스젠 발현을 종결시키기 위해 사용될 수 있으며, 본원에 개시된 대상에 의해 제공되는 바와 같은 서열번호 3 대신 사용될 수 있는 대안적인 3’-UTR 서열이 제공된다. 서열번호 3 및 서열번호 17의 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 94.2%의 서열 동일성을 공유한다. 서열번호 3 및 서열번호 18의 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 97.5%의 서열 동일성을 공유한다. 마지막으로, 서열번호 18 및 서열번호 17의 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 92.7%의 서열 동일성을 공유한다. 서열번호 17의 3’-UTR이 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR의 추가의 실시양태로서 제공된다. 서열번호 18의 3’-UTR이 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR의 추가의 실시양태로서 제공된다.
또한 도 4에 도시된 바와 같이 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3' -UTR의 실시양태로서 서열번호 13 (264 bp), 서열번호 14 (332 bp), 서열번호 15 (630 bp) 및 서열번호 16 (727 bp)가 제공된다. 이러한 절단된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3' -UTR 서열은 본원에서 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 본원에 개시된 대상에 의해 제공되는 바와 같은 서열번호 3대신 사용될 수 있는 대안적인 3' -UTR 서열이 제공된다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3' -UTR의 추가의 실시양태로서 서열번호 13의 264 bp 3' -UTR가 제공된다. 또한, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3' -UTR의 추가의 실시양태로서 서열번호 14의 332 bp 3' -UTR가 제공된다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3' -UTR의 추가의 실시양태로서 서열번호 15의 630 bp 3' -UTR가 제공된다. 또한, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3' -UTR 의 추가의 실시양태로서 서열번호 16의 727 bp 3' -UTR가 제공된다.
일 실시양태에서, 프로모터 및 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠 및 선택적으로 다음의 요소 중 하나 이상을 포함하는 핵산 구조체가 제공된다:
a) 5' 비번역 영역;
b) 인트론; 및
c) 3' 비번역 영역,
여기서,
프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 98%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있고; 그리고
3’ 비번역 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 98%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있고; 추가로, 상기 프로모터는 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결되고, 각각의 선택적인 요소는 존재하는 경우, 상기 프로모터 및 트랜스젠 둘 모두에 또한 작동가능하게 연결된다. 추가의 실시양태에서, 바로 위에 개시된 핵산 구조체를 포함하는 트랜스제닉 세포가 제공된다. 일 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 식물 세포이며, 추가의 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 세포를 포함하는 식물이 제공된다.
일 실시양태에서, 프로모터 및 비 메탈로티오네인-유사 트랜스젠 및 선택적으로 다음의 요소 중 하나 이상을 포함하는 핵산 구조체가 제공된다:
a) 3' 비번역 영역,
여기서,
프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 98%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있고; 그리고
3’ 비번역 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 98%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있고; 추가로, 상기 프로모터는 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결되고, 각각의 선택적인 요소는 존재하는 경우, 상기 프로모터 및 트랜스젠 둘 모두에 또한 작동가능하게 연결된다. 추가의 실시양태에서, 바로 위에 개시된 핵산 구조체를 포함하는 트랜스제닉 세포가 제공된다. 일 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 식물 세포이며, 추가의 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 세포를 포함하는 식물이 제공된다.
일 실시양태에서, 핵산 구조체는 프로모터 및 폴리링커 및 선택적으로 다음의 요소 중 하나 이상을 포함하는 핵산 구조체가 제공된다:
a) 5' 비번역 영역,
b) 인트론, 및
c) 3' 비번역 영역,
여기서,
프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 98%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있고; 그리고
3’ 비번역 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 3과 98%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있고; 추가로, 상기 프로모터는 상기 폴리링커에 작동가능하게 연결되고, 각각의 선택적인 요소는 존재하는 경우, 상기 프로모터 및 폴리링커 둘 모두에 또한 작동가능하게 연결된다.
일 실시양태에 따르면, 핵산 벡터는 선택성 마커를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 일 실시양태에 따르면, 재조합 유전자 카세트는 아그로박테리움 T-DNA 보더 (border)에 작동가능하게 연결된다. 일 실시양태에 따르면, 재조합 유전자 카세트는 제1 및 제2 T-DNA 보더를 추가로 포함하며, 여기서 제1 T-DNA 보더는 유전자 구조체의 하나의 말단에 작동가능하게 연결되고, 제2 T-DNA 보더는 유전자 구조체의 다른 말단에 작동가능하게 연결된다. 제1 및 제2 아그로박테리움 T-DNA 보더는 노팔린 합성 아그로박테리움 T-DNA 보더, 오코토핀 합성 아그로박테리움 T-DNA 보더, 만노핀 합성 아그로박테리움 T-DNA 보더, 숙시나모핀 합성 아그로박테리움 T-DNA 보더 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 균주에서 유래된 T-DNA 보더 서열로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 노팔린 합성 균주, 만노핀 합성 균주, 숙시나모핀 합성 균주, 또는 옥토핀 합성 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 아그로박테리움 균주가 제공되며, 여기서 상기 균주는 플라스미드를 포함하고, 상기 플라스미드는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택된 서열에 작동가능하게 연결된 트랜스젠을 포함한다.
본 발명에 개시된 구조체에서 사용하기에 적절한 관심 트랜스젠은, 비제한적으로 (1) 해충 또는 질병에 대한 저항성, (2) 제초제에 대한 내성, (3) 가치 부가된 농업적 형질, 예컨대; 수율 향상, 질소 사용 효율, 물 사용 효율, 및 영양 품질, (4) 부위 특이적 방식의 단백질의 DNA로의 결합, (5) 소형 RNA 발현, 및 (6) 선택성 마커를 부여하는 암호화 서열을 포함한다. 일 실시양태에 따르면, 트랜스젠은 살곤충제 저항성, 제초제 내성, 소형 RNA 발현, 질소 사용 효율, 물 사용 효율, 또는 영양 품질을 부여하는 선택성 마커 또는 유전자 산물을 암호화한다.
1. 곤충 저항성
다양한 곤충 저항성 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다양한 곤충 저항성 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 서열은 이어서 선택된 벡터 내에 혼입되어 형질전환된 식물 (“형질전환체”)의 식별 및 선택을 가능케 할 수 있다. 예시적인 곤충 저항성 암호화 서열이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 곤충 저항성 암호화 서열의 실시양태에서, 다음의 형질이 제공된다. 예시적인 인시목 (Lepidopteran) 곤충 저항성을 제공하는 암호화 서열은 다음을 포함한다: cry1A; cry1A.105; cry1Ab; cry1Ab(절단된); cry1Ab-Ac (융합 단백질); cry1Ac (Widestrike®로 판매됨); cry1C; cry1F (Widestrike®로 판매됨); cry1Fa2; cry2Ab2; cry2Ae; cry9C; mocry1F; pinII (프로테아제 억제제 단백질); vip3A(a); 및 vip3Aa20. 예시적인 딱정벌레목 (Coleopteran) 곤충 저항성을 제공하는 암호화 서열은 다음을 포함한다: cry34Ab1 (Herculex®로 판매됨); cry35Ab1 (Herculex®로 판매됨); cry3A; cry3Bb1; dvsnf7; 및 mcry3A. 예시적인 다중-곤충 저항성을 제공하는 암호화 서열은 ecry31.Ab를 포함한다. 상기 나열된 곤충 저항성 유전자는 제한을 의미하는 것은 아니다. 임의의 곤충 저항성 유전자가 본 발명에 의해 포함된다.
2. 제초제 내성
다양한 제초제 내성 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다양한 제초제 내성 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 서열은 이어서 선택된 벡터 내에 혼입되어 형질전환된 식물 (“형질전환체”)의 식별 및 선택을 가능케 할 수 있다. 예시적인 제초제 내성 암호화 서열이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 제초제 내성 암호화 서열의 실시양태에서, 다음의 형질이 제공된다. 글리포세이트 제초제는 EPSPS 효소 (5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소)를 저해하는 작용 방식을 포함한다. 이러한 효소는 식물의 성장 및 발달에 필수적인 방향족 아미노산의 생합성과 관련이 있다. 이러한 효소를 저해하는데 사용될 수 있는 다양한 효소 기작이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 효소를 암호화하는 유전자는 본 발명의 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 실시양태에서, 선택성 마커 유전자는, 비제한적으로 다음을 포함하는 글리포세이트 저항성 유전자를 암호화하는 유전자를 포함한다: 돌연변이 EPSPS 유전자 예컨대 2mEPSPS 유전자, cp4 EPSPS 유전자, mEPSPS 유전자, dgt-28 유전자; aroA 유전자; 및 글리포세이트 분해 유전자 예컨대 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 (gat) 및 글리포세이트 산화효소 유전자 (gox). 이러한 형질은 현재 Gly-TolTM, Optimum® GAT®, Agrisure® GT 및 Roundup Ready®로 판매되고 있다. 글루포시네이트 및/또는 비알라포스 화합물에 대한 저항성 유전자는 dsm-2, bar 및 pat 유전자를 포함한다. bar 및 pat 형질은 현재 LibertyLink®로 판매되고 있다. 2,4-D 예컨대 aad-1 유전자 (aad-1 유전자가 아르옥시페녹시프로피오네이트 제초제에 대한 활성을 추가로 가짐을 주목해야 한다) 및 aad-12 유전자 (aad-12 유전자가 피리딜옥시아세테이트 합성 옥신에 대한 활성을 추가로 가짐을 주목해야 한다)에 대한 저항성을 제공하는 내성 유전자가 또한 포함된다. 이러한 형질은 Enlist® 작물 보호 기술로서 판매되고 있다. ALS 억제제 (설포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 설포닐아미노-카보닐-트리아졸리논)에 대한 저항성 유전자가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 저항성 유전자는 대부분 공통적으로 ALS 암호화 유전자 서열에 대해 점 돌연변이로부터 야기된다. 다른 ALS 억제제 저항성 유전자는 hra 유전자, csr1-2 유전자, Sr-HrA 유전자, 및 surB 유전자를 포함한다. 일부 형질은 Clearfield®이라는 상표명으로 판매되고 있다. HPPD를 억제하는 제초제는 피라졸론 예컨대 피라족시펜, 벤조페납, 및 토프라메존; 트리케톤 예컨대 메조트리온, 설코트리온, 템보트리온, 벤조바이사이클론; 및 디케토니트릴 예컨대 이족사플루톨을 포함한다. 이러한 예시적인 HPPD 제초제는 공지된 형질에 의해 내성화될 수 있다. 예시적인 HPPD 억제제는 hppdPF_W336 유전자 (이족사플루톨에 대한 저항성) 및 avhppd-03 유전자 (메오스트리온에 대한 저항성)을 포함한다. 옥시닐 제초제 내성 형질의 예는 bxn 유전자를 포함하며, 이는 제초제/항생제인 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 것으로 나타났다. 디캄바에 대한 저항성 유전자는 국제 PCT 공개 WO 2008/105890에 개시된 바와 같은 디캄바 모노옥시게나제 유전자 (dmo)를 포함한다. PPO 또는 PROTOX 억제 유형 제초제 (예컨대, 아실플루오르패느 뷰타펜아실, 플루프로파질, 펜톡사존, 카펜트라존, 플루아졸레이트, 피라플루펜, 아클로니펜, 아자페니딘, 플루미옥사진, 플루미클로락, 비페녹스, 옥시플루오르펜, 락토펜, 포메사펜, 플루오로글리코펜, 및 설펜트라존)에 대한 저항성 유전자가 당업계에 공지되어 있다. PPO에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자는 야생형 아라비돕시스 탈리아나 PPO 효소의 과발현을 포함하여 (Lermontova I 및 Grimm B, (2000) Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX Oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether Herbicide acifluorfen. Plant Physiol 122:75-83.), B. 서브틸리스 PPO 유전자 (Li, X. 및 Nicholl D. 2005. Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops. Pest Manag. Sci. 61:277-285 및 Choi KW, Han O, Lee HJ, Yun YC, Moon YH, Kim MK, Kuk YI, Han SU 및 Guh JO, (1998) Generation of resistance to the diphenyl ether Herbicide, oxyfluorfen, via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen Oxidase gene in transgenic tobacco plants. Biosci Biotechnol Biochem 62:558-560.)를 포함한다. 피리딘옥시 또는 페녹시 프로피온산 및 사이클로헥손에 대한 저항성 유전자는 ACCase 억제제-암호화 유전자 (예컨대, Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3)를 포함한다. 사이클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로파논산에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자는 할록시폽, 디클로폽, 페녹시프롭, 플루아지폽, 및 퀴잘로폽을 포함한다. 마지막으로, 제초제는 광합성을 억제할 수 있는데, 트리아진 또는 벤조니트릴을 포함하여 psbA 유전자 (트리아진에 대한 내성), 1s+ 유전자 (트리아진에 대한 내성), 및 니트릴라제 유전자 (벤조니트릴에 대한 내성)에 의해 내성이 제공된다. 상기 나열된 제초제 내성 유전자는 제한하려는 의미는 아니다. 임의의 제초제 내성 유전자가 본 발명에 의해 포함된다.
3. 농업적 형질
다양한 농업적 형질 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다양한 농업적 형질 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 서열은 이어서 선택된 벡터 내에 혼입되어 형질전환된 식물 (“형질전환체”)의 식별 및 선택을 가능케 할 수 있다. 예시적인 농업적 형질 암호화 서열이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 농업적 형질 암호화 서열의 실시양태에서, 다음의 형질이 제공된다. pg 유전자에 의해 제공된 과일 연화의 지연은 세포벽에서 펙틴 분자를 파괴시키는 폴리갈락투로나제 효소의 생산을 억제하여 과일의 연화가 지연시킨다. 추가로, acc 유전자의 과일 숙성/노화의 지연은 천연의 acc 합성효소 유전자의 정상적인 발현을 억제하여, 에틸렌 생성을 감소시키고 과일 숙성을 지연시킨다. 반면에 accd 유전자는 과일 숙성 호르몬인 에틸렌의 전구체를 대사시켜, 과일의 숙성을 지연시킨다. 대안적으로, sam-k 유전자는 에틸렌 생산을 위한 기질인 S-아데노실 메티오닌 (SAM)을 감소시킴으로써 숙성을 지연시킨다. cspB 유전자에 의해 제공되는 가뭄 스트레스 내성 표현형은 RNA 안정성과 번역을 보존함으로써 수분 스트레스 조건 하에서 정상적인 세포 기능을 유지한다. 또 다른 예는 수분 스트레스에 대한 내성을 부여하는 삼투 방지제 화합물인 글리신 베타인의 생산을 촉매하는 EcBetA 유전자를 포함한다. 또한, RmBetA 유전자는 수분 스트레스에 대한 내성을 부여하는 삼투 방지제 화합물인 글리신 베타인의 생산을 촉매한다. 식물의 주야간 생리학적 과정을 조절하기 위해 하나 이상의 내인성 전사 인자와 상호 작용하는 단백질을 발현하는 bbx32 유전자가 광합성과 수확량 증대에 제공된다. 에탄올 생산은 전분을 분해하는데 사용되는 아밀라제의 열안정성 증가에 의해 바이오에탄올 생산을 향상시키는 열안정성 알파-아밀라제 효소를 암호화하는 amy797E 유전자의 발현에 의해 증가될 수 있다. 마지막으로, 변형된 아민노산 조성물은 아미노산인 리신의 생산을 증가시키는 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 효소를 암호화하는 cordapA 유전자의 발현에 의해 야기될 수 있다. 상기 나열된 농업적 형질 암호화 서열은 제한하려는 의미는 아니다. 임의의 농업적 형질 암호화 서열이 본 발명에 의해 포함된다.
4. DNA 결합 단백질
다양한 DNA 결합 단백질 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다양한 DNA 결합 단백질 암호화 서열이 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 서열은 이어서 선택된 벡터 내에 혼입되어 형질전환된 식물 (“형질전환체”)의 식별 및 선택을 가능케 할 수 있다. 예시적인 DNA 결합 단백질 암호화 서열이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 DNA 결합 단백질 암호화 서열의 실시양태에서, 다음 유형의 DNA 결합 단백질이 포함될 수 있다: 아연 손가락, 탈렌, CRISPRS, 및 메가뉴클레아제. 상기 나열된 DNA 결합 단백질 암호화 서열은 제한하려는 의미는 아니다. 임의의 DNA 결합 단백질 암호화 서열이 본 발명에 의해 포함된다.
5. 소형 RNA
다양한 소형 RNA가 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다양한 소형 RNA가 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 서열은 이어서 선택된 벡터 내에 혼입되어 형질전환된 식물 (“형질전환체”)의 식별 및 선택을 가능케 할 수 있다. 예시적인 소형 RNA 형질이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 소형 RNA 암호화 서열의 실시양태에서, 다음의 형질이 제공된다. 예를 들어, 항-efe 소형 RNA의 지연된 과일 숙성/노화는 에틸렌-형성 효소를 암호화하는 ACO 유전자의 침묵을 통해 에틸렌의 생산을 억제함으로써 숙성을 지연시킨다. ccomt 소형 RNA의 변경된 리그닌 생산은 내인성 S-아데노실-L-메티오닌: 트랜스-카페오일 CoA 3-O-메틸트랜스퍼라제 (CCOMT 유전자)의 억제에 의해 구아나실 (G) 리그닌의 함량을 감소시킨다. 또한, 솔라눔 베루코숨 (Solanum verrucosum) 의 흑점 손상 내성 (Black Spot Bruise Tolerance)은 Ppo5 전사물의 분해를 유발하여 흑점 손상 발달을 막는 Ppo5 소형 RNA에 의해 감소될 수 있다. 또한, 서양 옥수수 뿌리벌레 (Western Corn Rootworm) Snf7 유전자의 240 bp 단편을 함유하는 dsRNA로 서양 옥수수 뿌리벌레를 억제하는 dvsnf7 소형 RNA가 포함된다. 변형된 전분/탄수화물은 pPhL 소형 RNA (전분 분해를 통해 환원 당의 형성을 제한하기 위해 PhL 전 사체를 분해함) 및 pR1 소형 RNA (전분 분해를 통해 환원 당의 형성을 제한하기 위해 R1 전사물을 분해함)와 같은 소형 RNA로부터 유래될 수 있다. 추가로, asn1 소형 RNA로 인해 생성된 아크릴아미드의 감소와 같은 이점은 아스파라긴 형성을 저해하고 폴리아크릴아미드를 감소시키는 Asn1의 분해를 유발한다는 것이다. 마지막으로, 비-갈변형의 pgas ppo 억제 소형 RNA는 비-갈변형의 사과를 생산하기 위해 PPO를 억제한다. 상기 나열된 소형 RNA는 제한하려는 의미는 아니다. 임의의 소형 RNA 암호화 서열이 본 발명에 의해 포함된다.
6. 선택성 마커
리포터 유전자로도 기술된 다양한 선택성 마커가 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 리포터 유전자로도 기술된 다양한 선택성 마커가 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80, 85, 90, 95 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 작동가능하게 연결된 서열은 이어서 선택된 벡터 내에 혼입되어 형질전환된 식물 (“형질전환체”)의 식별 및 선택을 가능케 할 수 있다. 예컨대, DNA 서열분석 및 PCR (중합효소 연쇄 반응), 써던 블롯팅, RNA 블롯팅, 벡터로부터 발현된 단백질 검출을 위한 면역학적 방법을 포함하여, 형질전환된 식물에서 선택성 마커의 발현을 확인할 수 있는 다양한 방법이 있다. 그러나, 통상적으로 리포터 유전자는 발현 시 유색 산물을 생산하는 단백질의 육안 관찰을 통해 관찰된다. 예시적인 리포터 유전자가 당업계에 공지되어 있고 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP, Phi-YFP), 적색 형광 단백질 (DsRFP, RFP, 등), β-갈락토시다제 등을 암호화한다 (Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001 참조, 이의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
선택성 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선별을 위해 사용된다. 선택성 마커 유전자는 항생제 저항성을 암호화하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO), 스펙티노마이신/스트렙티노마이신 저항성 (ADD), 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HGR)와 같은 유전자 뿐만 아니라 제초제 화합물에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 저항성 유전자는 일반적으로 제초제에 민감하지 않은 변형된 타겟 단백질 또는 식물이 제기능을 발휘하기 전에 제초제를 분해하거나 해독하는 효소를 암호화한다. 예컨대, 글리포세이트에 대한 저항성은 돌연변이 타겟 효소인 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)를 암호화하는 유전자를 사용하여 수득된다. EPSPS에 대한 유전자 및 돌연변이가 공지되어 있으며 아래 추가로 기술된다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 저항성은 각각의 제초제를 해독하는 단백질의 예인 PAT 또는 DSM-2, 니트릴라제, AAD-1 또는 AAD-12를 암호화하는 박테리아 유전자를 사용함으로써 수득된다.
일 실시양태에서, 제초제는 이미다졸리논 또는 설포닐우레아를 포함하여 생장점 또는 분열 조직을 억제할 수 있고, 이러한 제초제에 대한 아세토히드록시산 합성효소 (AHAS)의 저항성/내성에 대한 유전자 및 아세토락테이트 합성효소 (ALS)가 널리 공지되어 있다. 글리포세이트 저항성 유전자는 돌연변이 5-에놀피루빌시키메이트3-포스페이트 합성효소 (EPSP) 및 dgt-28 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자의 다양한 형태의 생체 내 돌연변이 유발을 통해), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자, 각각)을 포함한다. 다른 포스포노 화합물에 대한 저항성 유전자는, 스트렙토마이세스 하이그로스코피큐스 및 스트렙토마이세스 비리디크로모진을 포함하여, 스트렙토마이세스 종으로부터의 bar 및 pat 유전자, 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 사이클로헥사논 (ACCase 억제제-암호화 유전자)을 포함한다. 사이클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로피온산 (할록시폽, 디클로폽, 페녹시프롭, 플루아지폽, 퀴잘로폽 포함)에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자는 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 (ACCase); Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3의 유전자를 포함한다. 일 실시양태에서, 제초제는 트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)를 포함하여, 광합성을 억제할 수 있다. 또한, 이러한 선택성 마커는 포스포만노스 이성화효소 (PMI) 효소와 같은 양성 선택성 마커를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 선택성 마커 유전자는, 비제한적으로 다음을 암호화하는 유전자를 포함한다: 2,4-D; 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II; 시아나미드 히드라타제; 아스파테이트 키나아제; 디히드로디피콜리네이트 합성효소; 트립토판 디카르복실라제; 디히드로디피콜리네이트 합성효소 및 탈감각 아스파테이트 키나아제; bar 유전자; 트립토판 디카르복실라제; 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO); 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG); 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제; 2,2-디클로프로피온산 디할로게나제; 아세토히드록시산 합성효소; 5-에놀피루빌-시키메이트-포스페이트 합성효소 (aroA); 할로아릴니트릴라제; 아세틸-보조효소 A 카르복실라제; 디히드로프테로에이트 합성효소 (sul I); 및 32 kD 광계 II 폴리펩티드 (psbA). 일 실시양태는 또한 다음에 대한 저항성을 암호화하는 선택 마커 유전자를 포함하다: 클로람페니콜; 메토트렉세이트; 하이그로마이신; 스펙티노마이신; 브로목시닐; 글리포세이트; 및 포스피노트리신. 상기 나열된 선택성 마커 유전자는 제한을 의미하는 것은 아니다. 임의의 리포터 또는 선택성 마커 유전자가 본 발명에 의해 포함된다.
일부 실시양태에서, 암호화 서열은 식물에서 최적의 발현을 위해 합성된다. 예컨대, 일 실시양태에서, 유전자의 암호화 서열은 식물에서 발현을 향상시키기 위해 코돈 최적화에 의해 변형된다. 살곤충제 저항성 트랜스젠, 제초제 저항성 트랜스젠, 질소 사용 효율 트랜스젠, 물 사용 효율 트랜스젠, 영양 품질 트랜스젠, DNA 결합 트랜스젠, 또는 선택성 마커 트랜스젠은 특정 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 대안적으로 쌍자엽 또는 단자엽 식물에서의 최적의 발현을 위해 변형될 수 있다. 식물 선호 코돈은 관심의 특정 식물 종에서 가장 많은 양으로 발현된 단백질에서 가장 높은 빈도의 코돈으로부터 결정될 수 있다. 일 실시양태에서, 암호화 서열, 유전자, 또는 트랜스젠은 식물에서 보다 높은 수준으로 발현되도록 설계되어 보다 높은 형질전환 효율을 야기한다. 유전자의 식물 최적화 방법에 널리 공지되어 있다. 합성 DNA 서열의 최적화 및 생산에 대한 지침을, 예컨대 본원에 참조로써 포함되어 있는 WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, 미국특허 제6166302호, 및 미국특허 제5380831호에서 확인할 수 있다.
형질전환
적절한 식물의 형질전환 방법은, DNA가 세포 내에 도입되는 임의의 방법, 예컨대 제한없이: 전기천공 (예컨대, 미국특허 제5,384,253호 참조); 미세 발사 주입법(예컨대, 미국특허 제5,015,580호, 제5,550,318호, 제5,538,880호, 제6,160,208호, 제6,399,861호, 및 제6,403,865호 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환 (예컨대, 미국특허 제5,635,055호, 제5,824,877호, 제5,591,616호; 제5,981,840호, 및 제6,384,301호 참조); 및 원형질 형질전환 (예컨대, 미국특허 제5,508,184호 참조)을 포함한다.
DNA 구조체는 탄화 규소 섬유소와 함께 교반하는 것과 같은 기법을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내에 직접 도입될 수 있거나 (예컨대, 미국특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호 참조), DNA 구조체는 예컨대 DNA 입자 충격 발사법 (예컨대, Klein 등 (1987) Nature 327:70-73 참조)과 같은 유전자 충격 방법을 사용하여 식물 조직에 직접적으로 도입될 수 있다. 대안적으로, DNA 구조체는 나노입자 형질전환 (예컨대, 미국 공개 특허 제20090104700호, 이의 전체가 참조로써 본원에 포함됨)을 통해 식물 세포에 도입될 수 있다.
또한, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스 예컨대 리조비움 종 NGR234, 시노히조보이움 멜리로티, 메조히조비움 로티, 감자 바이러스 X, 꽃양배추 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 사용하여 달성될 수 있으며, 예컨대, Chung 등 (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4를 참조한다.
형질전환 기법의 적용을 통해, 사실상 모든 식물 종의 세포가 안정적으로 형질전환될 수 있으며, 이러한 세포는 널리 공지된 기법에 의해 트랜스제닉 식물로 개발될 수 있다. 예컨대, 목화 형질전환의 맥락에서 특히 유용할 수 있는 기법이, 미국특허 제5,846,797호, 제5,159,135호, 제5,004,863호, 및 제6,624,344호에 기술되어 있으며; 브라시카 식물의 형질전환 기법은 특히, 예컨대 미국특허 제5,750,871호에 기술되어 있으며; 콩 형질전환 기법이 예컨대 미국특허 제6,384,301호에 기술되어 있으며; 옥수수 형질전환 기법이, 예컨대 미국특허 제7,060,876호 및 제5,591,616호 및 국제 PCT 공개 WO 95/06722에 기술되어 있다.
수용 세포에 외인성 핵산을 전달을 수행한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 동정된다. 형질전환체를 동정하는 능력을 향상시키기 위해, 형질전환체를 생성시키는데 사용된 형질전환 벡터를 갖는 선택성 마커 유전자를 사용하고자 할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 형질전환된 세포 집단은 세포를 선택제 또는 제제에 노출시킴으로써 분석될 수 있거나 세포는 원하는 마커 유전자 형질에 대해 선별될 수 있다.
선택제에 노출되어 생존하는 세포, 또는 선별 분석에서 양성인 세포는 식물 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일 실시양태에서, 임의의 적절한 식물 조직 배양 배지는 추가의 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함하는 것에 의해 변형될 수 있다. 조직은 충분한 조직이 식물 재생 노력을 시작하기에 충분할 때까지, 또는 반복된 횟수의 수동적인 선택에 이어, 조직의 형태가 재생에 적절할 때까지 (예컨대, 적어도 2주) 성장 조절제를 갖는 기본 배지에서 유지될 수 있으며, 이어서 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨진다. 배양은 충분한 싹 형성이 발생할 때까지 주기적으로 옮겨진다. 싹이 형성되면, 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨진다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물은 추가의 성장 및 성숙을 위해 토양으로 옮겨질 수 있다.
분자 확인
형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물은 조작된 식물 재료를 형질전환 DNA에 존재하는 마커 유전자에 의해 암호화된 형질에 대해 선택 또는 선별함으로써 동정 또는 단리될 수 있다. 예컨대, 선택은 조작된 식물 재료를 형질전환 유전자 구조체가 저항성을 부여하는 억제량의 항생제 또는 제초제를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 또한, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한 재조합 핵산 구조체에 존재할 수 있는 임의의 가시적인 마커 유전자 (예컨대, β글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 또는 gfp 유전자)의 활성에 대해 선별함으로써 동정될 수 있다. 이러한 선택 및 선별 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 트랜스제닉 식물을 동정하는데 사용될 수 있는 분자적 확인 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 일부 예시적인 방법이 아래 추가로 기술되어 있다.
분자 비콘(Molecular Beacon)이 서열 검출에서 사용하기 위해 기술되어 왔다. 요컨대, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브는 측부 게놈과 삽입된 DNA 접합부와 중첩되도도록 설계되어 있다. FRET 프로브의 독특한 구조는 형광 및 ??칭 모이어티를 근접하게 유지하는 2차 구조를 포함하도록 한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입된 DNA 서열의 하나의 프라이머 및 측부 게놈 서열의 하나)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환된다. 성공적인 PCR 증폭 후에, 타겟 서열에 PFET 프로브를 혼성화시키는 것은 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 및 ??칭 모이어티의 공간적인 분리를 초래한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 측부 게놈/트랜스젠 삽입 서열의 존재를 나타낸다. 증폭 반응으로서의 검출을 위한 이러한 분자 비콘 분석법이 본 발명의 실시양태다.
TAQMAN® (Life Technologies, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)으로도 알려진 가수분해 프로브 분석법은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량화하는 방법이다. 요컨대, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브는 이벤트-특이적 검출을 위해 트랜스젠 및 측부 게놈 서열의 하나에서 하나의 올리고로 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입된 DNA 서열의 하나의 프라이머 및 측부 게놈 서열의 하나)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상의 ??칭 모이어티로부터 형광 모이어티를 절단 및 방출시킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 측부/트랜스젠 삽입 서열의 존재를 나타낸다. 증폭 반응으로서의 검출을 위한 이러한 가수분해 프로브 분석법이 본 발명의 실시양태다.
KASPar® 분석법은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량화하는 방법이다. 요컨대, 통합된 유전자 발현 카세트 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA 샘플은 KASPar® 분석 시스템으로 공지된 분석법에 기초한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 선별된다. 본 발명의 실시에서 사용되는 KASPar® 분석법은 다수의 프라이머를 함유하는 KASPar® PCR 분석 혼합물을 사용할 수 있다. PCR 분석 혼합물에 사용되는 프라이머는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 정방향 프라이머는 DNA 폴리뉴클레오티드의 특이적 영역에 상응하는 서열을 함유하고, 역방향 프라이머는 게놈 서열의 특이적 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 또한, PCR 분석 혼합물에 사용되는 프라이머는 적어도 하나의 정방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 예컨대, KASPar® PCR 분석 혼합물은 2개의 상이한 대립유전자에 상응하는 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 정방향 프라이머 중 하나는 내인성 게놈 서열의 특이적 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 제2의 정방향 프라이머는 DNA 폴리뉴클레오티드의 특이적 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 역방향 프라이머는 게놈 서열의 특이적 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 증폭 반응의 검출을 위한 이러한 KASPar® 분석법이 본 발명의 실시양태다.
일부 실시양태에서, 형광 신호 또는 형광 염료는 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료, 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 증폭 반응은 유동 세포 계측법에 의해 검출가능한 농도 범위에서 세포 DNA를 염색할 수 있고, 실시간 열 순환기에 의해 검출가능한 형광 방출 스펙트럼을 갖는 적절한 제2형광 DNA 염료를 사용하여 수행된다. 당업자는 다른 핵산 염료가 공지되어 있고 계속적으로 확인되고 있음을 이해해야 한다. YO-PRO-1®, SYTOX 녹색®, SYBR 녹색 I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO®, 및 TOTO®과 같이, 적절한 여기 및 방출 스펙트럼을 갖는 임의의 적절한 핵산 염료가 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 제2형광 DNA 염료는 10 μM 미만, 4 μM 미만, 또는 2.7 μM 미만으로 사용되는 SYTO13®이다.
추가의 실시양태에서, 차세대 염기서열 분석 (NGS)이 검출에 사용될 수 있다. Brautigma 등, 2010에 기술된 바와 같이, DNA 서열 분석은 단리되고 증폭된 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 증폭된 단편은 단리되어 벡터 내에 서브-클로닝 되고 쇄-종결자 방법 (Sanger 서열분석으로도 지칭됨) 또는 염료-종결자 서열분석을 사용하여 서열분석될 수 있다. 또한, 증폭체(amplicon)는 차세대 염기서열 분석으로 서열분석될 수 있다. NGS 기법은 서브-클로닝 단계를 필요로 하지 않으며, 다중 서열분석 판독이 단일 반응으로 완료될 수 있다. 3종의 NGS 플랫폼이 상업적으로 이용가능하며, 454 Life Sciences Roche의 Genome Sequencer FLX™, Solexa의 Illumina Genome Analyser™ 및 Applied Biosystems의 SOLiD™ (‘Sequencing by Oligo Ligation and Detection’에 대한 약어)이다. 또한, 현재 개발중인 2종의 단일 분자 서열분석 방법이 존재한다. 여기에는 Helicos Bioscience™의 진정한 단일 분자 서열분석 (tSMS) 및 Pacific Biosciences의 단일 분자 실시간™ 서열분석 (SMRT)이 포함된다.
454 Life Sciences/Roche에서 판매하는 Genome Sequencher FLX™는 길게 판독하는 NGS이며, 에멀젼 PCR 및 파이로시퀀싱을 사용하여 시퀀싱 판독을 생성한다. 300 내지 800 bp의 DNA 단편 또는 3 내지 20 kb의 단편을 함유하는 라이브러리가 사용될 수 있다. 이러한 반응은 총 250 내지 400 메가염기를 산출할 때마다 약 250 내지 400 염기를 백만 번 이상 판독할 수 있다. 이러한 기법은 가장 긴 판독을 생성하지만 실행 당 총 서열의 출력은 다른 NGS 기법에 비해 낮다.
Solexa™에서 판매하는 Illumina Genome Analyser™은 형광 염료-표지된 가역성 종결자 뉴클레오티드를 사용하는 합성 접근법에 의한 서열분석을 사용하는 짧은 판독 NGS이며, 고상 브릿지 PCR을 기반으로 한다. 최대 10 kb의 DNA 단편을 함유하는 쌍으로된 말단 서열분석 라이브러리의 구축이 사용될 수 있다. 상기 반응은 길이가 35 내지 76 염기인 1억개가 넘은 짧은 판독을 생성한다. 이러한 데이터는 실행 당 3 내지 6 기가염기를 생성할 수 있다.
Applied Biosystems™에서 판매하는 Sequencing by Oligo Ligation and Detection (SOLiD)는 짧은 판독 기법이다. 이러한 NGS 기법은 길이가 최대 10 kb인 단편화된 이중 가닥 DNA를 사용한다. 이러한 시스템은 염료-표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 라이게이션 및 에멀젼 PCR에 의한 서열분석을 사용하여 실행 당 최대 30 기가염기의 총 서열 결과물을 야기하는 10억개의 짧은 판독을 생성한다.
Helicos Bioscience™의 tSMS 및 Pacific Biosciences™의 SMRT는 서열 반응을 위해 단일 DNA 분자를 사용하는 상이한 접근법을 적용한다. tSMS Helicos™ 시스템은 실행 당 21 기가염기를 생성하는 최대 8억개의 짧은 판독을 생성한다. 이러한 반응은 '합성에 의한 서열분석' 접근법으로서 기술된 형광 염료-표지된 가상 종결자 뉴클레오티드를 사용하여 완료된다.
Pacific Biosciences™에서 판매하는 SMRT 차세대 염기서열 분석은 합성에 의한 실시간 서열분석을 사용한다. 이러한 기법은 가역적 종결자에 의해 제한되지 않기 때문에 최대 1,000 bp의 길이의 판독을 생성할 수 있다. 이러한 기법을 사용하여 하루에 2배체 인간 게놈의 1배 적용 범위와 동일한 원시 판독 처리량이 생성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 검출은 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 및 써던 블롯을 포함하여 블롯팅 분석법을 사용하여 완료될 수 있다. 이러한 블롯팅 분석법은 생물학적 샘플의 동정 및 정량화를 위한 생물학적 연구에서 일반적으로 사용되는 기법이다. 이러한 분석법은 우선 전기영동에 의해 겔로부터 샘플 성분을 분리한 후, 겔에서 전기영동적으로 분리된 성분을 니트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오리드 (PVDF), 또는 나일론과 같은 재료로 만들어진 전달 막으로 이동시키는 것을 포함한다. 분석물은 또한 사전 분리 없이 진공, 모세관 작용 또는 압력을 가함으로써 이러한 지지체에 직접 얼룩지게 하거나 지지체의 특정 영역에 향하게 할 수 있다. 전달 막은 이어서 시각적으로 또는 자동화된 판독기에 의해 분석물이 서로 구별되고 검출되는 능력을 향상시키기 위해 일반적으로 전달 후 처리에 적용된다.
추가의 실시양태에서, 검출은 액체 샘플 또는 습식 샘플에서 물질, 일반적으로 항원의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 면역분석법을 사용하는, ELISA 분석법을 사용하여 완료될 수 있다. 샘플로부터의 항원은 플레이트의 표면에 부착된다. 이어서, 항원에 결합할 수 있도록 표면 위에 특이적 항체가 추가로 적용된다. 이러한 항체는 효소와 연결되어 있으며, 마지막 단계에서, 효소 기질을 함유하는 물질이 첨가된다. 후속 반응은 검출가능한 신호, 가장 일반적으로 기질의 색 변화를 생성한다.
트랜스제닉 식물
일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함한다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 서열번호 1로부터 선택된 서열 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함한다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 서열번호 1로부터 선택된 서열 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 서열번호 3으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR 을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 서열번호 3으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3으로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR 을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 비- 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1로부터 선택된 서열, 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 비- 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1로부터 선택된 서열, 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하며, 여기서 상기 트랜스젠은 살곤충제 저항성 트랜스젠, 제초제 저항성 트랜스젠, 질소 사용 효율 트랜스젠, 물 사용 효율 트랜스젠, 영양 품질 트랜스젠, DNA 결합 트랜스젠, 선택성 마커 트랜스젠, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 비-내인성 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 유도된 프로모터 서열을 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포가 제공되며, 여기서 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 유도된 프로모터 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 비-브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포가 제공된다. 일 실시양태에서, 비-브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포가 제공된다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 쌍자엽 또는 단자엽 식물로부터 유도된 쌍자엽 또는 단자엽 식물 또는 세포 또는 조직이다. 일 실시양태에서, 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕 수수, 대두, 목화, 해바라기, 및 카놀라로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 식물은 제아 메이스이다. 일 실시양태에 따르면, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 비- 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물은 제아 메이스이다. 일 실시양태에 따르면, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 비- 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1 또는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 여기서 상기 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 일 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 여기서 상기 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 일 실시양태에 따르면, 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유도된 프로모터를 포함하는 유전자 구조체는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포의 게놈에 통합된다.
일 실시양태에서, 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 비-브라키포듐 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포가 제공된다. 일 실시양태에서, 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 비-브라키포듐 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포가 제공된다. 일 실시양태에 따르면, 비-브라키포듐 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 쌍자엽 또는 단자엽 식물로부터 유도된 쌍자엽 또는 단자엽 식물 또는 식물 세포 또는 조직이다. 일 실시양태에서, 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕 수수, 대두, 목화, 해바라기, 및 카놀라로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 식물은 제아 메이스이다. 일 실시양태에 따르면, 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열은 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포의 게놈에 통합된다.
일 실시양태에서, 서열번호 3 또는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 트랜스젠의 5’ 말단 및 3’ 비번역 서열에 작동가능하게 연결된, 서열번호 1, 또는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 비-브라키포듐 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포가 제공되며, 여기서 상기 3’ 비번역 서열은 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결된다. 일 실시양태에 따르면, 비-브라키포듐 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 쌍자엽 또는 단자엽 식물로부터 유도된 쌍자엽 또는 단자엽 식물 또는 식물 세포 또는 조직이다. 일 실시양태에서, 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕 수수, 대두, 목화, 해바라기, 및 카놀라로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 식물은 제아 메이스이다. 일 실시양태에 따르면, 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열은 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포의 게놈에 통합된다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 단자엽 식물일 수 있다. 단자엽 식물 식물 조직, 또는 식물 세포는 비제한적으로, 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 수수, 지팽이풀, 잔디풀, 및 라이밀일 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 쌍자엽 식물일 수 있다. 쌍자엽 식물 식물 조직, 또는 식물 세포는 비제한적으로, 알팔파, 유채, 카놀라, 인도 겨자, 에티오피아 겨자, 대두, 해바라기, 목화, 콩, 브로콜리, 양배추, 꽃양배추, 샐러리, 오이, 가지, 상추; 멜론, 완두콩, 후추, 땅콩, 감자, 호박, 홍당무, 시금치, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 및 수박일 수 있다.
당업자는 외인성 서열이 트랜스제닉 식물에 안정하게 통합되고 작동가능한 것으로 확인된 후, 성적 교배에 의해 다른 식물에 도입될 수 있음을 인지할 것이다. 교배될 종에 따라, 임의의 다양한 표준 육종 기술이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 종자를 포함하며, 여기서 상기 종자는 본 발명의 유전자 조절 요소를 함유하는 트랜스젠 또는 유전자 구조체를 갖는다. 본 발명은 또한 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 자손, 복제물, 세포주 또는 세포를 포함하며, 여기서 상기 자손, 복제물, 세포주 또는 세포는 본 발명의 유전자 조절 요소를 함유하는 트랜스젠 또는 유전자 구조체를 갖는다.
본 발명은 또한 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 배양물을 포함하며, 여기서 상기 트랜스제닉 식물은 본 발명의 유전자 조절 요소를 함유하는 트랜스젠 또는 유전자 구조체를 갖는다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 식물은, 그 중에서도 본 발명에 따른 핵산 분자로 형질전환 됨으로써 본 발명의 유전자 조절 요소를 함유하는 하나 이상의 원하는 형질 또는 트랜스제닉 이벤트를 갖도록 조작될 수 있으며, 당업자에 공지된 임의의 방법에 의해 재배되거나 배양될 수 있다.
트랜스젠 발현 방법
일 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠 또는 폴리링커 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠 또는 폴리링커 서열에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 3’ -UTR 을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1로부터 선택된 서열 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 또 다른 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR은 서열번호 3으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 일 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 3’ -UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1로부터 선택된 서열 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 일 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 서열번호 1로부터 선택된 서열 또는 서열번호 1로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 또 다른 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR은 서열번호 3으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 또 다른 실시양태에서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR은 서열번호 3으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3으로부터 선택된 서열과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어져 있다. 일 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 함유하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 함유하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스젠을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 유전자 발현 카세트, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
다음의 실시예가 소정의 특정 특징 및/또는 실시양태를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 예시된 특정 특징 또는 실시양태로 본 발명을 제한하기 위해 고려되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터
브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) (서열번호 1)로부터의 프로모터는 브라키포듐 디스타키온 게놈 DNA (gDNA) 서열로부터 동정된 2,000 bp 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이러한 프로모터 서열을 제아 메이스 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)를 사용하여 Phytozome 데이터베이스 Goodstein 등, 2012()를 BLAST하여 동정하였다. 생성된 히트 (hit)를 분석하고 추가의 분석을 위해 단일의 암호화 서열을 선택하였다. 수 백만의 염기쌍을 스패닝한 인접한 염색체 서열의 평가로부터, 이종 암호화 서열의 발현에 사용하기 위해 2,000 bp 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하고 단리하였다. 이러한 신규한 폴리뉴클레오티드 서열을 유전자 발현을 유도하기 위한 조절 서열로서 사용하기 위해 분석하였다. 아래 서열 (서열번호 2)에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 2,000 bp 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 1 내지 2,000 염기쌍으로 제공하였다. 서열번호 6의 천연 mtl 유전자 암호화 서열을 2,001 내지 2,345 염기쌍으로 제공하였다. 서열번호 3의 1,002 bp 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 2,346 내지 3,347 염기쌍으로 제공하였다. 따라서, 서열번호 2는 다음과 같이 제공된다:
gacagtgacataagagcatctccagtgattcagtgagataccccaaagtcatccaaatgtccgtttcggccgaaatggacatgctggccagaaaaacatctcccaatgggttaccccaaatagatattttgtatgttttgtccggcccaatccccaaacatctcctaaatttggggcaactttgcggtgtccagtgtccggtgtccgggcccacttctttttctcccaagcgagcatcttcctcccgaagcacgaagcccccgtc
실시예 2: 벡터 구축
트랜스젠의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 상류로부터의 프로모터를 통합시키기 위해 다음의 벡터를 구축하였다. 벡터 구조체 pDAB120419은 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 의해 유도되고 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR에 의해 측부에 위치한 phi-yfp 트랜스젠 (Phi-황색 형광 단백질; Clontech, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)인, 유전자 발현 카세트를 함유했다. 이러한 유전자 발현 카세트의 도식이 도 1에 나타나 있고 서열번호 4로 제공된다. 또한, 벡터는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 (Christensen 등, (1992) Plant Molecular Biology 18; 675 689)에 의해 유도되는 aad-1 트랜스젠 (미국특허 제7,838,733호)을 함유하고 제아 메이스 리파아제 3’ -UTR (미국특허 제7,179,902호)에 의해 종결되는 선택성 마커 유전자 발현 카세트를 함유한다. 이러한 유전자 발현 카세트의 도식이 도 1에 나타나 있고 서열번호 5로 제공된다. 이러한 구조체는 외부 공급자 (Geneart via Life Technologies, 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 의해 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자로부터 새롭게 설계된 프로모터를 합성하고, GeneArt® Seamless Cloning 및 Assembly Kit (Life technologies) 및 제한 효소를 사용하여 Gateway™ (Life Technologies) 공여 벡터에 프로모터를 클로닝함으로써 구축하였다. 생성된 공여 벡터를 Gateway™ 클로닝 시스템 (Life Technologies)을 사용하여 최종 이원 (binary) 목적지 벡터에 통합시켰다. pDAB120419의 클론을 수득하고 제한 효소 소화 및 서열분석을 통해 확인하였다. 생성된 구조체는 프로모터의 3’ 말단에 작동가능하게 연결된 트랜스젠의 발현을 강력하게 유도할 수 있는 프로모터를 함유하였다.
실시예 3: 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 조절 요소
서열번호 1의 2,000 bp 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 프로모터 서열을 변경함으로써 변형하였다. 변이체를 설계하고 서열번호 12로 제공하였다. 서열번호 1의 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 및 서열번호 12의 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터를 비교하는 정렬이 도 3에 제공되어 있다. 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 12의 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 97.2%의 서열 동일성을 공유한다. 서열번호 1의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터로부터 유래된 신규한 프로모터 서열이 본원에 제공되어 있다. 일 실시양태에서, 서열번호 12의 신규한 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 12의 신규한 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열은 관심 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있고 3’-UTR, 예컨대 서열번호 3의 3’-UTR 측부에 위치할 수 있고, 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있다.
서열번호 3의 1,002 bp 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 3’ -UTR 서열을 변경함으로써 변형하였다. 새로운 변이체를 설계하고 서열번호 17 및 서열번호 18로 제공하였다. 서열번호 3의 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 변형된 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR을 비교하는 정렬이 도 5에 제공되어 있다. 도 5에 나타난 바와 같이, 서열번호 3 및 서열번호 17의 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 94.2%의 서열 동일성을 공유한다. 도 5에 나타난 바와 같이, 서열번호 3 및 서열번호 18의 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 97.5%의 서열 동일성을 공유한다. 마지막으로, 도 5에 나타난 바와 같이, 서열번호 18 및 서열번호 17의 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 92.7%의 서열 동일성을 공유한다. 서열번호 3의 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 3’ -UTR로부터 유래된 신규한 3’ -UTR 서열이 본원에 제공되어 있다. 일 실시양태에서, 서열번호 17의 신규한 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스젠의 발현을 종결시키기 위해 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 17의 신규한 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터, 예컨대 서열번호 1의 프로모터에 의해 유도되는 트랜스젠에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 서열번호 18의 신규한 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스젠의 발현을 종결시키기 위해 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 서열번호 18의 신규한 3’ -UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터, 예컨대 서열번호 1의 프로모터에 의해 유도되는 트랜스젠에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 트랜스젠의 발현을 유도하기 위해 유전자 발현 카세트에서 사용될 수 있다.
실시예 4: 옥수수 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환:
이원 발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 (RecA 결핍 3원 (ternary) 균주) (국제 공개 특허 WO2012016222)에 형질전환시켰다. 박테리아 클론을 선택하고, 이원 플라스미드 DNA를 제한 효소 소화를 통해 단리하고 확인하였다.
아그로박테리움 배양 개시:
글리세롤 저장액으로부터 아그로박테리움 배양물을 AB 최소 배지 상에 스트리킹 하고 (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79; 수크로스 없이 5 g/L 글루코스 및 15 g/L Bacto™ Agar를 첨가하여 제조) 어두운 곳에서 3일 동안 20 ℃에서 인큐베이션하였다. 아그로박테리움 배양물을 이어서 YEP 배지 플레이트 상에 스트리킹하고 (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79) 어두운 곳에서 1일 동안 20 ℃에서 인큐베이션하였다.
실험 당일에, 접종 배지 혼합물 (2.2 g/L MS 염, 68.4 g/L 수크로스, 36 g/L 글루코스, 115 mg/L L-프롤린, 2 mg/L 글리신, 100 mg/L 미오-이노시톨, 0.05 mg/L 니코틴산, 0.5 mg/L 피리독신 HCl, 0.5 mg/L 티아민 HCl) 및 아세토시린곤을 실험 크기에 적절한 부피로 제조하였다. 100% 디메틸 설폭시드 중의 아세토시린곤의 1 M 저장 용액을 접종 배지에 첨가하여 200 μM의 최종 아세토시린곤 농도로 제조하였다.
각각의 구조체에 대해, YEP 플레이트로부터의 1 내지 2 루프의 아그로박테리움을 멸균의, 일회용 50 ml 원심분리 튜브 내부의 15 ml의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물에 현탁하고 600 nm (O.D.600)에서 용액의 광학 밀도를 분광광도계로 측정하였다. 현탁액을 이어서 추가의 접종 배지/아세토리시린곤 혼합물을 사용하여 0.25 내지 0.35 O.D.600로 희석하였다. 아그로박테리움 현탁액 튜브를 이어서 사용 전 1 내지 4시간 동안 실온에서 약 75 rpm으로 설정된 플랫폼 진탕기에 수평으로 놓았다.
옥수수 형질전환:
실험적 구조체를 근교 계통인 제아 메이스 c.v. B104로부터 단리한 미성숙 배아의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 옥수수에 형질전환시켰다. 사용한 방법은 Ishida 등, (1996) Nature Biotechnol 14:745-750 및 Frame 등, (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034에 공개된 것과 유사하지만, 고성능 형질전환에 적합한 것으로 만드는 일부 변형 및 개선이 있었다. 옥수수에서 다수의 트랜스제닉 이벤트를 생산하기 위해 사용된 방법의 예시가 미국특허 출원 공개 제2013/0157369 A1호에 주어져 있으며, 배아 감염 및 공-배양 단계부터 시작한다.
추정의 T0 트랜스제닉 식물체를 Phytatrays™ (Sigma-Aldrich; 미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 휴미노돔 (humidome) (Arco Plastics Ltd.)으로 덮인 성장 배지 (Premix BX; Premier Tech Horticulture)가 채워진 소형 3.5” 플라스틱 포트 (T. O. Plastics; 미네소타 주 클리어워터 소재)에 이식하고, 이어서 성장실 (28 ℃ 낮/ 24 ℃ 밤, 16-시간 광주기, 50 내지 70% RH, 200 μEm-2 ch-1 광도)에서 튼튼하게 (hardened-off)하였다. 식물이 V3 내지 V4의 발달 단계에 도달했을 때 (3 내지 4 잎사귀가 보이기 시작했을 때), 이를 Sunshine Custom Blend 160 토양 혼합물에 이식하고 온실에서 개화하도록 성장시켰다 (광 노출 유형: 광 (Photo) 또는 동화 (Assimilation); 높은 빛 한계; 1200 PAR; 16-시간 낮 길이; 27 ℃ 낮/ 24 ℃ 밤). 식물을 트랜스젠의 상대적인 복사본 수를 검출하도록 고안된 프라이머를 사용하여 qPCR 검정법으로 트랜스젠 복사본 수를 분석하고, 진전을 위해 선택된 추정의 단일 복사본 이벤트를 5 갤런 포트에 이식하였다.
실시예 5: 복사본 수의 분자적 확인
트랜스제닉 Z. 메이스 식물의 게놈 내에서 phi-yfp 트랜스젠의 안정적인 통합을 가수분해 프로브 검정법을 통해 확인하였다. 캘러스로부터 발달한 안정적으로 형질전환된 트랜스제닉 Z. 메이스 묘목을 수득하고 전장 T-가닥 삽입물의 낮은 복사본 수 (1 내지 2 복사본)를 포함하는 이벤트를 확인하기 위해 분석하였다. 확인된 묘목을 온실로 진전시키고 성장시켰다.
Roche Light Cycler480™ 시스템을 트랜스젠 복사본 수를 결정하기 위해 사용하였다. 이러한 방법은 단일 분석에서 phi-yfp 유전자 및 내인성 Z. 메이스 기준 유전자인 인버타제 (유전자은행 수탁번호: U16123.1)에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 바이플렉스 (biplex) TaqMan® 반응을 사용한다. 복사본 수 및 접합자 (zygosity)를 공지된 복사본 수 표준에 대한 비교로서 인버타제-특이적 형광에 대한 phi-yfp 특이적 형광의 강도를 측정하여 결정하였다.
phi-yfp 유전자-특이적 DNA 단편을 FAM™ 형광 염료로 표지된 프로브를 함유하는 하나의 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭하고, 인버타제를 HEX™ 형광으로 표지된 프로브를 함유하는 두 번째 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭하였다. 샘플의 복사본 수 및 접합자를 공지된 복사본 수에 대한 비교로서, 기준 유전자인 인버타제에 특이적인 형광에 대해 리포터 유전자인 phi-yfp에 특이적인 상대적인 형광 강도를 측정하여 결정하였다.
실시예 6: 단백질 발현의 분자적 확인
단백질 추출:
Nunc® 96-웰 Maxi-Sorp 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc., 일리노이주 락포드 소재)를 ELSIA에 사용하였다. 상기 플레이트를 마우스 단클론 항 Phi-YFP 포획 항체 (OriGene Technologies Inc., 메릴랜드주 락빌 소재)로 코팅하였다. 상기 항체를 PBS (1 μg/mL) 중에 희석하고 150 μL의 희석된 PBS를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 350 μL의 세척 완충액 [0.05% Tween®-20 (Sigma-Aldrich, 미조리주 세인트 루이스 소재)가 보충된 1X PBS]로 4회 세척하기 전에 20 내지 30분 동안 실온에 두었다. 다음으로, 상기 플레이트를 웰 당 200 μL의 블로킹 완충액 [0.05% Tween®-20 및 0.5% BSA (Millipore Probumin®)가 보충된 1X PBS]으로 +37 ℃에서 최소 1시간 동안 블로킹하고 이어서 350 μL의 세척 완충액 (Tomtec QuadraWash™ 2, Tomtec, Inc., 코네티컷주 함덴 소재)으로 4회 세척하였다.
Phi-YFP ELISA에서, Evrogen 재조합 Phi-YFP 1mg/mL (Axxora LLC, 뉴욕주 파밍데일 소재)를 표준으로서 사용하였다. 5-파라미터 맞춤 표준 곡선 (1 ng/ml 내지 0.125 ng/ml 사이의 표준)을 사용하여 모든 데이터가 곡선의 선 부분에 위치함을 확인하였다. 다음으로, 100 μL의 표준 또는 샘플을 웰에 첨가하였다. 분석 완충액 중의 최소 1:4 희석 샘플을 사용하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기 (250 rpm; Titer Plate 진탕기) 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 350 μL의 세척 완충액 (Tomtec QuadraWash™ 2)으로 4회 세척하였다. 약 100 μL의 1 μg/mL Evrogen 토끼 다클론 항 Phi-YFP 1차 항체 (Axxora)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 250 rpm에서 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 350 μL의 세척 완충액 (Tomtec QuadraWash™ 2)으로 4회 세척하였다. 다음으로, 블로킹/분석 완충액 중에 1:5000으로 희석된 100 μL의 항-토끼 IgG HRP 2차 항체 (Thermo Scientific)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 250 rpm에서 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 350 μL의 세척 완충액 (Tomtec QuadraWash™ 2)으로 4회 세척하였다. 이어서 100 μL의 Pierce 1 Step Ultra TMB ELISA™ (Thermo Scientific) 기질을 웰에 첨가하고 10분 동안 온화하게 진탕하였다. 50 μL의 0.4N H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 650 nm 기준 필터를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
Phi-YFP 발현 수준을 Acadia BioSciences (메인주 포틀랜드 소재)의 키트를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 상기 ELISA를 추출물의 다중 희석 및 공급자에 의해 제공된 시약 및 지침을 사용하여 수행하였다. 단백질 수준을 총 가용성 단백질 분석법을 사용하여 정규화하고, Thermo Scientific에 의해 공급된 660 nm 단백질 분석 시약을 사용하여 공급자의 지침에 따라 수행하였다.
실시예 7: 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현
옥수수 식물을 상기된 바와 같은 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터를 포함하는 유전자 발현 구조체로 형질전환하였다. ELISA 분석으로 신규한 프로모터가 트랜스젠의 강력한 발현을 유도함을 확인하였다. 신규한 프로모터 구조체를 포함하는 트랜스제닉 식물로부터 수득된 Phi-YFP 단백질의 정량적인 측정을 표 1에 나타냈다. 상기 데이터는 신규한 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 (즉, pDAB120419)를 포함하는 식물에서 Phi-YFP 단백질이 잎 조직에 비해 뿌리 조직에서 우선적으로 더 높게 발현됨을 나타낸다.
B. 디스타키온 MTL 프로모터 T0의 Phi-YFP 및 AAD1 발현
구조체
 이벤트
 PhiYFP(ng/mg) AAD1(ng/mg)
잎 뿌리 잎 뿌리
120419 120419[1]-002.001 3 ND 107 ND
120419 120419[1]-003.001 3 ND 116 ND
120419 120419[1]-005.001 3 ND 392 ND
120419 120419[1]-007.001 3 22 149 129
120419 120419[1]-010.001 3 ND 110 ND
120419 120419[1]-011.001 3 55 111 62
120419 120419[1]-014.001 3 ND 162 ND
120419 120419[1]-017.001 3 ND 324 ND
120419 120419[1]-018.001 3 607 412 372
120419 120419[1]-023.001 3 ND 103 ND
120419 120419[1]-024.001 3 ND 107 ND
120419 120419[1]-026.001 3 346 289 147
120419 120419[1]-027.001 3 234 415 177
120419 120419[1]-031.001 3 41 900 233
120419 120419[1]-032.001 3 ND 175 ND
120419 120419[1]-033.001 3 ND 313 ND
120419 120419[1]-035.001 3 79 651 210
ND- 측정되지 않음
안정적으로 통합된 pDAB120419 트랜스제닉 이벤트를 함유하는 T0 단일 트랜스젠 복사본 식물을 야생형 B104 옥수수 식물과 역교배하여 성숙한 식물로 성장되는 T1 종자를 수득하였다. 이러한 성숙한 식물로부터, 반접합성 T1 식물을 AAD1 및 Phi-YFP 단백질의 발현을 측정하기 위한 분석에 사용하였다. 구조체 당 5개의 이벤트 및 이벤트 당 10개의 식물을 단백질 발현 분석에 사용하였다. 구조체 당 3개의 이벤트 및 이벤트 당 3 내지 5개의 식물을 다른 조직 유형 발현에 사용하였다. 접합성 분석을 Phi-YFP 및AAD1에 대해 수행하였다. 신규한 프로모터 구조체를 포함하는 T1 트랜스제닉 식물의 잎, 껍질, 겉껍질, 화분, 뿌리, 실크 및 줄기 조직을 포함하여 상이한 조직 유형으로부터 수득된 Phi-YFP 및 AAD1 단백질의 정량적인 ELISA 측정치를 표 2에 나타냈다. 상기 데이터는 T0 잎 발현 결과를 확인하고, Phi-YFP 단백질의 일관된 고 발현이 신규 프로모터 (pDAB120419)를 함유하는 주로 식물의 뿌리 조직 유형들에서 수득되었음을 추가로 보여준다. 이러한 데이터는 본원에서 설명되는 신규 프로모터가 식물에서 트랜스젠의 뿌리 우선적 발현을 유도하고, 이러한 발현 프로파일이 제1세대에서 제2세대로 유전될 수 있음을 입증한다. 따라서, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터는 생명공학 응용예에서 유용하다.
트랜스제닉 옥수수 식물의 상이한 조직 유형에서의 단백질 발현
구조체 이벤트 조직 평균(Phi-YFP ng/mg) 평균(AAD1 ng/mg)
120419 120419[1]-002 잎 V4 0.3 34.5
120419 120419[1]-002 뿌리 V4 608.7 2419.7
120419 120419[1]-014 잎 V4 0.0 32.4
120419 120419[1]-014 뿌리 V4 418.0 2375.7
120419 120419[1]-023 껍질 R3 0.0 2794.7
120419 120419[1]-023 겉껍질 R3 0.0 4495.0
120419 120419[1]-023 잎 R3 47.4 1387.0
120419 120419[1]-023 잎 V12 0.0 188.3
120419 120419[1]-023 잎 V4 0.1 30.3
120419 120419[1]-023 화분 R3 0.0 1003.7
120419 120419[1]-023 뿌리 R3 0.0 355.0
120419 120419[1]-023 뿌리 V4 274.3 1536.0
120419 120419[1]-023 실크 R3 0.7 4515.0
120419 120419[1]-023 줄기 R3 1.7 6545.7
120419 120419[1]-024 껍질 R3 0.0 3615.7
120419 120419[1]-024 겉껍질 R3 0.0 4998.3
120419 120419[1]-024 커넬 R3 0.0 2100.0
120419 120419[1]-024 잎 R3 3.2 1498.2
표 2 계속됨:
120419 120419[1]-024 잎 V12 0.0 240.3
120419 120419[1]-024 잎 V4 0.9 38.8
120419 120419[1]-024 화분 R3 0.0 4313.0
120419 120419[1]-024 뿌리 R3 0.0 964.7
120419 120419[1]-024 뿌리 V4 132.0 1001.0
120419 120419[1]-024 실크 R3 0.3 7784.3
120419 120419[1]-024 줄기 R3 0.0 5991.0
120419 120419[1]-033 껍질 R3 0.0 4212.7
120419 120419[1]-033 겉껍질 R3 0.0 5691.0
120419 120419[1]-033 커넬 R3 0.0 1804.0
120419 120419[1]-033 잎 R3 0.3 1463.5
120419 120419[1]-033 잎 V12 0.0 398.4
120419 120419[1]-033 잎 V4 0.6 30.7
120419 120419[1]-033 화분 R3 0.0 3759.3
120419 120419[1]-033 뿌리 R3 0.0 1461.0
120419 120419[1]-033 뿌리 V4 787.3 3445.0
120419 120419[1]-033 실크 R3 0.0 7656.3
120419 120419[1]-033 줄기 R3 0.0 6670.0
Phi-YFP ELISA 결과는 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 조절 요소 (서열번호 1)이 구조체 pDAB120419로 형질전환된 T0 이벤트에서의 Phi-YFP에서, 특이적으로 뿌리 조직에서, 지하-우선적 발현을 유도함을 나타낸다. 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터 조절 요소에 의해 Phi-YFP의 무시할만한 발현이 이러한 이벤트의 잎 조직에서 관찰되었다 (표 1 및 표 2). 형질전환으로부터 생산된 이벤트는 또한 잎 및 뿌리 조직 둘 모두에서 AAD1 단백질을 발현하였다. 이러한 이벤트에서의 AAD1의 발현은 다른 조직에서의 Phi-YFP의 발현 수준을 비교하는 대조군으로서 사용하였다. 요컨대, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl) 프로모터는 옥수수와 같은 식물 종에서 지하 조직 내에서 트랜스젠의 강력한 발현을 위해 발생되었다.
실시예 8: 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 작물 형질전환
특허 출원 WO 2007/053482의 실시예 11 또는 실시예 13에 선행하여 기술된 동일한 기법을 사용하여 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자로 대두를 형질전환할 수 있다.
미국특허 제7,838,733호의 실시예 14 또는 특허 출원 WO 2007/053482 (Wright 등)의 실시예 12에 선행하여 기술된 동일한 기법을 사용하여 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자로 목화를 형질전환할 수 있다.
미국특허 제7,838,733호의 실시예 26 또는 특허 출원 WO 2007/053482 (Wright 등)의 실시예 22에 선행하여 기술된 동일한 기법을 사용하여 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자로 카놀라를 형질전환할 수 있다.
특허 출원 WO 2013/116700A1 (Lira 등)의 실시예 23에 선행하여 기술된 동일한 기법을 사용하여 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자로 밀을 형질전환 할 수 있다.
특허 출원 WO 2013/116700A1 (Lira 등)의 실시예 19에 선행하여 기술된 동일한 기법을 사용하여 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자로 벼를 형질전환할 수 있다.
실시예 9: 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하겨 연결된 유전자의 아그로박테리움-매개 형질전환
본 발명을 고려하여, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 본 발명의 실시양태에 따라 추가의 작물을 형질전환 할 수 있다. 호밀의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해, 예컨대 Popelka JC, Xu J, Altpeter F., “Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye,” Transgenic Res. 2003 Oct;12(5):587-96.)을 참조한다. 수수의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해, 예컨대 Zhao 등, “Agrobacterium-mediated sorghum transformation,” Plant Mol Biol. 2000 Dec;44(6):789-98을 참조한다. 보리의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해, 예컨대 Tingay 등, “Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation,” The Plant Journal, (1997) 11: 1369-1376을 참조한다. 밀의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해, 예컨대 Cheng 등, “Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens,” Plant Physiol. 1997 Nov;115(3):971-980을 참조한다. 벼의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해, 예컨대 Hiei 등, “Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens,” Plant Mol. Biol. 1997 Sep;35(1-2):205-18을 참조한다.
이러한 식물 및 다른 식물의 라틴어 명칭이 아래 주어져 있다. 예컨대, 이러한 식물 및 다른 식물에, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자를 형질전환시키기 위해 다른 (비-아그로박테리움) 형질전환 기법이 사용될 수 있음을 분명히 해야한다. 예시는 비제한적으로 다음을 포함한다: 옥수수 (제아 메이스), 밀 (트리티쿰 종), 벼 (오리자 종 및 지자니아 종), 보리 (호르데움 종), 목화 (아브로마 아우구스타 및 고시피움 종), 대두 (글리신 맥스 ), 사탕 (sugar) 및 테이블 비트 (베타 종), 사탕 수수 (아렌가 피나타), 토마토 (리코퍼시콘 에스쿨렌툼 및 다른 종, 피살리스 익소카르파 , 솔라늄 인카늄 및 다른 종, 및 시포만드라 베타세아 ), 감자 (솔라늄 튜베로숨), 고구마 (이포모에아 베타타스), 호밀 (시케일 종), 후추 (카프시쿰 아늄, 차이니즈, 및 프루테센스), 상추 (락투카 사티바, 퍼레니스, 및 풀켈라), 양상추 (브라시카 종), 샐러리 (아피움 그라베올렌), 가지 (솔라늄 멜론게나), 땅콩 (아라키스 히포게아), 수수 (소르굼 종), 알팔파 (메디카고 사티바), 당근 (다쿠스 카로타), 콩 (파세오루스 종 및 다른 속), 귀리 (아베나 사티바 및 스트리고사), 완두콩 (피섬 비그나, 및 테트라고노로부스 종), 해바라기 (헬리안투스 안누스), 스쿼시 (쿠쿠르비타 종), 오이 (쿠쿠미스 사티바), 담배 (니코티아나 종), 아라비돕시스 (아라비돕시스 탈리아나), 잔디풀 (롤리움, 아그로스티스, 포아, 시노돈, 및 다른 속, 클로버 (트리폴리움), 베취 (비시아). 예컨대, 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자로 이러한 식물을 형질전환시키는 것이 본 발명에서 고려되는 일 실시양태다.
작동가능하게 연결된 유전자를 유도하기 위한 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터의 사용은 다수의 낙엽수 및 상록수 수목 종에서 사용될 수 있다. 이러한 응용예들 또한 본 발명의 실시양태의 범위 내에 있다. 이러한 종은, 비제한적으로 다음을 포함한다; 오리나무 (알누스 종), 물푸레나무 (프락시누스 종), 사시나무 및 포퓰러나무 종 (포퓰러스 종), 너도밤나무 (파구스 종), 자작나무 (베툴라 종), 체리나무 (프루누스 종), 유칼립투스 나무 (유칼립투스 종), 히코리 나무(카리아 종), 단풍나무 (에이서 종), 참나무 (퀘르쿠스 종), 및 소나무 (피누스 종).
작동가능하게 연결된 유전자를 유도하기 위한 브라키포듐 디스타키온 메탈로티오네인-유사 유전자 (mtl)로부터의 프로모터의 사용은 다수의 장식용 및 열매가 열리는 종에서 사용될 수 있다. 이러한 응용예들 또한 본 발명의 실시양태의 범위 내에 있다. 예시는 비제한적으로 다음을 포함한다; 장미 (로사 종), 버닝 부쉬 (으오니무스 종), 페튜니아 (페튜니아 종), 베고니아 (베고니아 종), 진달래 (로도덴드론 종), 크랩애플 또는 사과 나무 (말루스 종), 배나무 (피루스 종), 복숭아 나무 (프루누스 종), 및 매리골드 (타게테스 종).
다수의 예시적인 측면 및 실시양태가 상기 논의되어 있지만, 당업자는 특정 변형, 치환, 추가 및 이들의 하위 조합을 인지할 것이다. 따라서, 이하의 첨부된 청구 범위 및 이후의 청구 범위는 이의 진정한 사상 및 범위 내에 있는 모든 이러한 변형, 치환, 추가 및 하위 조합을 포함하는 것으로 해석된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Kumar, Sandeep Hemingway, Daren Ausmus, Carla Worden, Andrew Ashberry, Andrew <120> PLANT PROMOTER FOR TRANSGENE EXPRESSION <130> 77035-WO-PCT <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 1 tttcgtgtgc ttacttgggg cttcctttgg gcctgcggaa gcagacggcg tgccagctga 60 gaccgttggt ggacaatgtg gatggacgtc tagcttcgtg gaaggccctt ctcctttcca 120 agggaggatg actggtgctg gtcaagtcca ccctgacagc gatgccggtc tactcgatga 180 tgtcactcga cctttcggac aagatcatca aaggggtgga caagatctgt cgtggtttcc 240 tttggcgtgg tcagaaggac gctaaagggg ggggggcatt gtatggtggc ttgggtcgtg 300 gtgtgttcgc cgaagccttt cggtggactc ggaattccaa atcttcgcat gctcaacgag 360 gccttgaggg tccgctagag gtggcttgag agggtggacg attccaaacc atgggtcggt 420 ttcaaggttg agacgcccag aggtctatgt tatctttgag gcggccactt cctctttggt 480 gggcgatggc cggaagaccc tcttctggac cgatcgttgg ctgcatggcg tctgttttcg 540 agatgcgttc ctgatcctcg tgggccatgt ttgccacaag tttttgcgca cgcgcacagt 600 gcgggaggct 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ctctaaatac gaaaatacaa acatcctaat gttattccaa 1500 ctatgctact ccctccgttc ctaaactctt atctttgttt ttgttcaaat ttgtaccaaa 1560 caacgacaaa aatttagtaa cggaggaagt atatatacga agtgatacca aataaggtgt 1620 ttctttactt gaaagctagt tcctctgagg taaaagaaat gatgaggatc aaggaaggcc 1680 catttcttgc cggcacgcag ttgccgaagt cagtagattt aaaatgacct cacatactga 1740 agaaggaaag ggaagttaac cacgccattg ttgctttagc agaaagcaac catatcctaa 1800 ttaacatcac agtacacgtt gaaacggcag ggcacgataa ttggtgaaga ctgattccag 1860 ggagcatcgt ggcacgcaaa aacgcccttg ccttgttccc ttataaatag tggtgcagaa 1920 gatacatttg tgatcaccat ctcaaagcgc ctctttattc ccctttcatc ttgagcttaa 1980 gtactagaga aaaattaagg 2000 <210> 2 <211> 3340 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 2 tttcgtgtgc ttacttgggg cttcctttgg gcctgcggaa gcagacggcg tgccagctga 60 gaccgttggt ggacaatgtg gatggacgtc tagcttcgtg gaaggccctt ctcctttcca 120 agggaggatg actggtgctg gtcaagtcca ccctgacagc gatgccggtc tactcgatga 180 tgtcactcga cctttcggac aagatcatca aaggggtgga caagatctgt cgtggtttcc 240 tttggcgtgg tcagaaggac gctaaagggg ggggggcatt gtatggtggc ttgggtcgtg 300 gtgtgttcgc cgaagccttt cggtggactc ggaattccaa atcttcgcat gctcaacgag 360 gccttgaggg tccgctagag gtggcttgag agggtggacg attccaaacc atgggtcggt 420 ttcaaggttg agacgcccag aggtctatgt tatctttgag gcggccactt cctctttggt 480 gggcgatggc cggaagaccc tcttctggac cgatcgttgg ctgcatggcg tctgttttcg 540 agatgcgttc ctgatcctcg tgggccatgt ttgccacaag tttttgcgca cgcgcacagt 600 gcgggaggct ctgcatggag cgtggactgg cgacatgggt ccagacctaa agggaagcta 660 ctcttgagga gttcctcact ctctgggact ggcttcgtgg ggtccaactg gaagaaggga 720 gggccgactc tcttcattgg aactggtctc gtggtgatag ttactcggca aagactgctt 780 atgcgaatct cttcactggc cgcatggttg acccgttagc ggctgagatc tagggcttcg 840 gagaggtgtc gtttcttcgt ctggctcgca gttcgaaata gatgctagac ggcggatcgc 900 ttgcgaggcg tgggcttccc caccctgaca agtgtcagga gatggagacc atttcccatc 960 tactcttggg gtgtgtcttg gcgaggcagg tttgggagcg cttgtgggcg gcttggggac 1020 acgtggagtg ggctccgaat gcggatgcta ctctgcggga atggtggtct tctcttccct 1080 taccacggcg agcccggagg gacttccgga cggggatcat acttgttctt tggaccattt 1140 ggtgccattg gaatgatgtg gccttccttg cagcttgtcg tgcttcgcct ccaggaggag 1200 tttggtcggt gggcgcacgc cggcctcttt aggggtagag tgtctattcc agccttgatg 1260 gtgagtggtt ggatagctag cacatagtct ttttttctct ttcttgccac ttggtgatgt 1320 tgtattgccg cttcggcgtt gtactagcct tctggctctt cttatttaat cgatgatgca 1380 cccgctgggt ggcattcttg aaattttttt gagaaaatac tcctacaaag gaagtacagt 1440 aatttgatac acaatgcttt ctctaaatac gaaaatacaa acatcctaat gttattccaa 1500 ctatgctact ccctccgttc ctaaactctt atctttgttt ttgttcaaat ttgtaccaaa 1560 caacgacaaa aatttagtaa cggaggaagt atatatacga agtgatacca aataaggtgt 1620 ttctttactt gaaagctagt tcctctgagg taaaagaaat gatgaggatc aaggaaggcc 1680 catttcttgc cggcacgcag ttgccgaagt cagtagattt aaaatgacct cacatactga 1740 agaaggaaag ggaagttaac cacgccattg ttgctttagc agaaagcaac catatcctaa 1800 ttaacatcac agtacacgtt gaaacggcag ggcacgataa ttggtgaaga ctgattccag 1860 ggagcatcgt ggcacgcaaa aacgcccttg ccttgttccc ttataaatag tggtgcagaa 1920 gatacatttg tgatcaccat ctcaaagcgc ctctttattc ccctttcatc ttgagcttaa 1980 gtactagaga aaaattaagg atgtcttgca gctgtggatc tggatgcagc tgcggctcaa 2040 actgcacctg cgggtatgta tagatgctta attctgtgtt gcagattact acgtagctgc 2100 taataccatc taagtaatga caatgctttc tcatgatgat caattttcat ttgctgtgtg 2160 gttcagcaag atgtaccctg acttggcaga gaagagcggc ggcacccagc aggccaccac 2220 catgatcctc ggcgttgcgc ctgctaaggc ccagtttgag gaggccgccg agtccggtga 2280 ggccggccat ggctgcagct gcggcgccaa ctgcaagtgc gacccgtgca actgctaaga 2340 tgcacgcgac gcgctgctgc ttgtggtgtg tgtttgtgtg atctcgactg aataaaaggg 2400 acacggtaca tccggggttg gttggtgctc gagtcgagtg tgcaaggttg tgtggtttgc 2460 cagctcttgg tgtgtgtctc cttgtgctca tgtgacttgt gaaaccatta atagtaacca 2520 ctttgtgctt gtgtgtgtgt gggcacctgt gtttctgtaa tggtctatct ggagtgaata 2580 tatacaagac aggtttgcct aaccatgcct tttccttcct tgaggtcatc gcgccaacac 2640 gaatgacgag aaccaatgat cttaggacta tcaaatagac aatataactc agcatggagc 2700 aatgtactgc taatgaacgg tcctaatcaa tacagttggg aagcagtaat cgatggaaaa 2760 cacttcctca gttcagaagg 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cassette; where the promoter of SEQ ID NO:1 and the 3'UTR of SEQ ID NO:3 drive the phi-yfp gene. <400> 4 tttcgtgtgc ttacttgggg cttcctttgg gcctgcggaa gcagacggcg tgccagctga 60 gaccgttggt ggacaatgtg gatggacgtc tagcttcgtg gaaggccctt ctcctttcca 120 agggaggatg actggtgctg gtcaagtcca ccctgacagc gatgccggtc tactcgatga 180 tgtcactcga cctttcggac aagatcatca aaggggtgga caagatctgt cgtggtttcc 240 tttggcgtgg tcagaaggac gctaaagggg ggggggcatt gtatggtggc ttgggtcgtg 300 gtgtgttcgc cgaagccttt cggtggactc ggaattccaa atcttcgcat gctcaacgag 360 gccttgaggg tccgctagag gtggcttgag agggtggacg attccaaacc atgggtcggt 420 ttcaaggttg agacgcccag aggtctatgt tatctttgag gcggccactt cctctttggt 480 gggcgatggc cggaagaccc tcttctggac cgatcgttgg ctgcatggcg tctgttttcg 540 agatgcgttc ctgatcctcg tgggccatgt ttgccacaag tttttgcgca cgcgcacagt 600 gcgggaggct ctgcatggag cgtggactgg cgacatgggt ccagacctaa agggaagcta 660 ctcttgagga gttcctcact ctctgggact ggcttcgtgg ggtccaactg gaagaaggga 720 gggccgactc tcttcattgg aactggtctc gtggtgatag ttactcggca 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tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800 ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc 1860 ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920 tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980 tgttacttct gcaggtacag tagttagttg aggtaccgga tccacacgac accatggctc 2040 atgctgccct cagccctctc tcccaacgct ttgagagaat agctgtccag ccactcactg 2100 gtgtccttgg tgctgagatc actggagtgg acttgaggga accacttgat gacagcacct 2160 ggaatgagat attggatgcc ttccacactt accaagtcat ctactttcct ggccaagcaa 2220 tcaccaatga gcagcacatt gcattctcaa gaaggtttgg accagttgat ccagtgcctc 2280 ttctcaagag cattgaaggc tatccagagg ttcagatgat ccgcagagaa gccaatgagt 2340 ctggaagggt gattggtgat gactggcaca cagactccac tttccttgat gcacctccag 2400 ctgctgttgt gatgagggcc atagatgttc ctgagcatgg cggagacact gggttccttt 2460 caatgtacac agcttgggag accttgtctc caaccatgca agccaccatc gaagggctca 2520 acgttgtgca ctctgccaca cgtgtgttcg gttccctcta ccaagcacag aaccgtcgct 2580 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tcctctgagg 1380 taaaagaaat gatgaggatc aaggaaggcc catttcttgc cggcacgcag ttgccgaagt 1440 cagtagattt aaaatgacct cacatactga agaaggaaag ggaagttaac cacgccattg 1500 ttgctttagc agaaagcaac catatcctaa ttaacatcac agtacacgtt gaaacggcag 1560 ggcacgataa ttggtgaaga ctgattccag ggagcatcgt ggcacgcaaa aacgcccttg 1620 ccttgttccc ttataaatag tggtgcagaa gatacatttg tgatcaccat ctcaaagcgc 1680 ctctttattc ccctttcatc ttgagcttaa gtactagaga aaaattaagg 1730 <210> 8 <211> 1530 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 8 cctctttggt gggcgatggc cggaagaccc tcttctggac cgatcgttgg ctgcatggcg 60 tctgttttcg agatgcgttc ctgatcctcg tgggccatgt ttgccacaag tttttgcgca 120 cgcgcacagt gcgggaggct ctgcatggag cgtggactgg cgacatgggt ccagacctaa 180 agggaagcta ctcttgagga gttcctcact ctctgggact ggcttcgtgg ggtccaactg 240 gaagaaggga gggccgactc tcttcattgg aactggtctc gtggtgatag ttactcggca 300 aagactgctt atgcgaatct cttcactggc cgcatggttg acccgttagc ggctgagatc 360 tagggcttcg gagaggtgtc gtttcttcgt ctggctcgca gttcgaaata gatgctagac 420 ggcggatcgc ttgcgaggcg tgggcttccc caccctgaca agtgtcagga gatggagacc 480 atttcccatc tactcttggg gtgtgtcttg gcgaggcagg tttgggagcg cttgtgggcg 540 gcttggggac acgtggagtg ggctccgaat gcggatgcta ctctgcggga atggtggtct 600 tctcttccct taccacggcg agcccggagg gacttccgga cggggatcat acttgttctt 660 tggaccattt ggtgccattg gaatgatgtg gccttccttg cagcttgtcg tgcttcgcct 720 ccaggaggag tttggtcggt gggcgcacgc cggcctcttt aggggtagag tgtctattcc 780 agccttgatg gtgagtggtt ggatagctag cacatagtct ttttttctct ttcttgccac 840 ttggtgatgt tgtattgccg cttcggcgtt gtactagcct tctggctctt cttatttaat 900 cgatgatgca cccgctgggt ggcattcttg aaattttttt gagaaaatac tcctacaaag 960 gaagtacagt aatttgatac acaatgcttt ctctaaatac gaaaatacaa acatcctaat 1020 gttattccaa ctatgctact ccctccgttc ctaaactctt atctttgttt ttgttcaaat 1080 ttgtaccaaa caacgacaaa aatttagtaa cggaggaagt atatatacga agtgatacca 1140 aataaggtgt ttctttactt gaaagctagt tcctctgagg taaaagaaat gatgaggatc 1200 aaggaaggcc catttcttgc cggcacgcag ttgccgaagt cagtagattt aaaatgacct 1260 cacatactga agaaggaaag ggaagttaac cacgccattg ttgctttagc agaaagcaac 1320 catatcctaa ttaacatcac agtacacgtt gaaacggcag ggcacgataa ttggtgaaga 1380 ctgattccag ggagcatcgt ggcacgcaaa aacgcccttg ccttgttccc ttataaatag 1440 tggtgcagaa gatacatttg tgatcaccat ctcaaagcgc ctctttattc ccctttcatc 1500 ttgagcttaa gtactagaga aaaattaagg 1530 <210> 9 <211> 1330 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 9 gttcctcact ctctgggact ggcttcgtgg ggtccaactg gaagaaggga gggccgactc 60 tcttcattgg aactggtctc gtggtgatag ttactcggca aagactgctt atgcgaatct 120 cttcactggc cgcatggttg acccgttagc ggctgagatc tagggcttcg gagaggtgtc 180 gtttcttcgt ctggctcgca gttcgaaata gatgctagac ggcggatcgc ttgcgaggcg 240 tgggcttccc caccctgaca agtgtcagga gatggagacc atttcccatc tactcttggg 300 gtgtgtcttg gcgaggcagg tttgggagcg cttgtgggcg gcttggggac acgtggagtg 360 ggctccgaat gcggatgcta ctctgcggga atggtggtct tctcttccct taccacggcg 420 agcccggagg gacttccgga cggggatcat acttgttctt tggaccattt ggtgccattg 480 gaatgatgtg gccttccttg cagcttgtcg tgcttcgcct ccaggaggag tttggtcggt 540 gggcgcacgc cggcctcttt aggggtagag tgtctattcc agccttgatg gtgagtggtt 600 ggatagctag cacatagtct ttttttctct ttcttgccac ttggtgatgt tgtattgccg 660 cttcggcgtt gtactagcct tctggctctt cttatttaat cgatgatgca cccgctgggt 720 ggcattcttg aaattttttt gagaaaatac tcctacaaag gaagtacagt aatttgatac 780 acaatgcttt ctctaaatac gaaaatacaa acatcctaat gttattccaa ctatgctact 840 ccctccgttc ctaaactctt atctttgttt ttgttcaaat ttgtaccaaa caacgacaaa 900 aatttagtaa cggaggaagt atatatacga agtgatacca aataaggtgt ttctttactt 960 gaaagctagt tcctctgagg taaaagaaat gatgaggatc aaggaaggcc catttcttgc 1020 cggcacgcag ttgccgaagt cagtagattt aaaatgacct cacatactga agaaggaaag 1080 ggaagttaac cacgccattg ttgctttagc agaaagcaac catatcctaa ttaacatcac 1140 agtacacgtt gaaacggcag ggcacgataa ttggtgaaga ctgattccag ggagcatcgt 1200 ggcacgcaaa aacgcccttg ccttgttccc ttataaatag tggtgcagaa gatacatttg 1260 tgatcaccat ctcaaagcgc ctctttattc ccctttcatc ttgagcttaa gtactagaga 1320 aaaattaagg 1330 <210> 10 <211> 1130 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 10 gttcgaaata gatgctagac ggcggatcgc ttgcgaggcg tgggcttccc caccctgaca 60 agtgtcagga gatggagacc atttcccatc tactcttggg gtgtgtcttg gcgaggcagg 120 tttgggagcg cttgtgggcg gcttggggac acgtggagtg ggctccgaat gcggatgcta 180 ctctgcggga atggtggtct tctcttccct taccacggcg agcccggagg gacttccgga 240 cggggatcat acttgttctt tggaccattt ggtgccattg gaatgatgtg gccttccttg 300 cagcttgtcg tgcttcgcct ccaggaggag tttggtcggt gggcgcacgc cggcctcttt 360 aggggtagag tgtctattcc agccttgatg gtgagtggtt ggatagctag cacatagtct 420 ttttttctct ttcttgccac ttggtgatgt tgtattgccg cttcggcgtt gtactagcct 480 tctggctctt cttatttaat cgatgatgca cccgctgggt ggcattcttg aaattttttt 540 gagaaaatac tcctacaaag gaagtacagt aatttgatac acaatgcttt ctctaaatac 600 gaaaatacaa acatcctaat gttattccaa ctatgctact ccctccgttc ctaaactctt 660 atctttgttt ttgttcaaat ttgtaccaaa caacgacaaa aatttagtaa cggaggaagt 720 atatatacga agtgatacca aataaggtgt ttctttactt gaaagctagt tcctctgagg 780 taaaagaaat gatgaggatc aaggaaggcc catttcttgc cggcacgcag ttgccgaagt 840 cagtagattt aaaatgacct cacatactga agaaggaaag ggaagttaac cacgccattg 900 ttgctttagc agaaagcaac catatcctaa ttaacatcac agtacacgtt gaaacggcag 960 ggcacgataa ttggtgaaga ctgattccag ggagcatcgt ggcacgcaaa aacgcccttg 1020 ccttgttccc ttataaatag tggtgcagaa gatacatttg tgatcaccat ctcaaagcgc 1080 ctctttattc ccctttcatc ttgagcttaa gtactagaga aaaattaagg 1130 <210> 11 <211> 1001 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 11 gcttgtgggc ggcttgggga cacgtggagt gggctccgaa tgcggatgct actctgcggg 60 aatggtggtc ttctcttccc ttaccacggc gagcccggag ggacttccgg acggggatca 120 tacttgttct ttggaccatt tggtgccatt ggaatgatgt ggccttcctt gcagcttgtc 180 gtgcttcgcc tccaggagga gtttggtcgg tgggcgcacg ccggcctctt taggggtaga 240 gtgtctattc cagccttgat ggtgagtggt tggatagcta gcacatagtc tttttttctc 300 tttcttgcca cttggtgatg ttgtattgcc gcttcggcgt tgtactagcc ttctggctct 360 tcttatttaa tcgatgatgc acccgctggg tggcattctt gaaatttttt tgagaaaata 420 ctcctacaaa ggaagtacag taatttgata cacaatgctt tctctaaata cgaaaataca 480 aacatcctaa tgttattcca actatgctac tccctccgtt cctaaactct tatctttgtt 540 tttgttcaaa tttgtaccaa acaacgacaa aaatttagta acggaggaag tatatatacg 600 aagtgatacc aaataaggtg tttctttact tgaaagctag ttcctctgag gtaaaagaaa 660 tgatgaggat caaggaaggc ccatttcttg ccggcacgca gttgccgaag tcagtagatt 720 taaaatgacc tcacatactg aagaaggaaa gggaagttaa ccacgccatt gttgctttag 780 cagaaagcaa ccatatccta attaacatca cagtacacgt tgaaacggca gggcacgata 840 attggtgaag actgattcca gggagcatcg tggcacgcaa aaacgccctt gccttgttcc 900 cttataaata gtggtgcaga agatacattt gtgatcacca tctcaaagcg cctctttatt 960 cccctttcat cttgagctta agtactagag aaaaattaag g 1001 <210> 12 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified version of a Brachypodium distachyon metallothionein-like gene (mtl) promoter <400> 12 tttcgtgtgc ttacttgggg cttcctttgg gcctgcggaa gcagacggcg tgccaggtac 60 gaggttgttg gtggacaatg tggatggacg atttctagct tcgtggaagg cccttctcct 120 taagggagga tgactggtgc tggtcaagtc caccctgaca gcgatgccgg tctactcgat 180 gatgtcactc gacctttcgg acaagatcat caaaggggtg gacaaggtat gtcgtggttt 240 cctttggcgt ggtcagaagg acgctaaagg ggggggggca ttgtatggtg gcttgggtcg 300 tggtgtgttc gccgaccgct ttcggtggac tcggcgtttc caaatcttcg catcctccca 360 gccttgaggg tccgctagag gtggcttgag agggtggacg attccaaacc cgatggtcgg 420 tttcaaggtt gagacgccca gaggtctatg ttatctttga ggcggccact tcctctttgg 480 tgggcgatgg ccggacgttt ccctcttctg gaccgattgt tggctgcatg gcgtctgttt 540 tcgagatgcg ttcctgatcc tcgtgggcca tgtttgccac aagtttttgc ttacgcgcac 600 agtgcgggag gctctgcatg gagcgtggac tggcgacatg ggtccagacc taaagggaag 660 ctactcttga ggacttcact ctctgggact ggcttcgtgg ggtccaactg gaagaaggga 720 gggccgactc tcttcattgg aactggtgtg gtggtgatag ttactcggca aagactgctt 780 atgcgaatct tcactggccg catggttgac ccgttagcgg ctgagagtta gggcttcgga 840 gaggtgtcgt ttcttcgtct ggctcgcagt tcttgaaata gatgctagac ggcggatcgc 900 ttgcgaggcg tgggcttccc caccctgaca agtgtcagga gatggagtcg atttcccatc 960 tactcttggg gtgtgtcttg gcgaggcagg tttgggagcg cttgtgggcg gcttggggac 1020 acgtggagtg ggctccgaat gcggatgcta ctctgcggga atggtggtct ttctcttccc 1080 ttaccacggc gagcccggag ggacttccgg acggggatca tacttgttct ttggaccatt 1140 tggtgccatt ggaatgatgt ggccttcctt gcagcttgtc gtgcttcgcc tggaggaatt 1200 gtttggtcgg tgggcgcacg ccggcctctt taggggtaga gtgtctattc cagccttgat 1260 ggtgagtggt tggatagcta gcacatagtc tttttttctc tttcttgcca cttggtgatg 1320 ttgtattgcc gcttcggcgt tgtactagcc ttctggctct tcttatttaa tgatgatgca 1380 cccgctgggt ggcattcttg aaattttttt gagaaaatac tcctacaaag gaagtacagt 1440 aatttgatac acaatgcttt ctctaaatac gaaaatacaa acatcctaat gttattccaa 1500 ctatgctact ccctccgttc ctaaactctt atctttgttt ttgttcaaat ttgtaccaaa 1560 caacgacaaa aatttagtaa cggaggaagt atatatacga agtgatacca aataaggtgt 1620 ttctttactt gaaagctagt tcctctgagg taaaagaaat gatgaggatc aaggaaggcc 1680 catttcttgc cggcacgcag ttgccgaagt cagtagattt aaaatgacct cacatactga 1740 agaaggaaag ggaagttaac cacgccattg ttgctttagc agaaagcaac catatcctaa 1800 ttaacatcac agtacacgtt gaaacggcag ggcacgataa ttggtgaaga ctgattccag 1860 ggagcatcgt ggcacgcaaa aacgcccttg ccttgttccc ttataaatag tggtgcagaa 1920 gatacatttg tgatcaccat ctcaaagcgc ctctttattc ccctttcatc ttgagcttaa 1980 gtactagaga aaaattaagg 2000 <210> 13 <211> 264 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 13 gatgcacgcg acgcgctgct gcttgtggtg tgtgtttgtg tgatctcgac tgaataaaag 60 ggacacggta catccggggt tggttggtgc tcgagtcgag tgtgcaaggt tgtgtggttt 120 gccagctctt ggtgtgtgtc tccttgtgct catgtgactt gtgaaaccat taatagtaac 180 cactttgtgc ttgtgtgtgt gtgggcacct gtgtttctgt aatggtctat ctggagtgaa 240 tatatacaag acaggtttgc ctaa 264 <210> 14 <211> 332 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 14 gatgcacgcg acgcgctgct gcttgtggtg tgtgtttgtg tgatctcgac tgaataaaag 60 ggacacggta catccggggt tggttggtgc tcgagtcgag tgtgcaaggt tgtgtggttt 120 gccagctctt ggtgtgtgtc tccttgtgct catgtgactt gtgaaaccat taatagtaac 180 cactttgtgc ttgtgtgtgt gtgggcacct gtgtttctgt aatggtctat ctggagtgaa 240 tatatacaag acaggtttgc ctaaccatgc cttttccttc cttgaggtca tcgcgccaac 300 acgaatgacg agaaccaatg atcttaggac ta 332 <210> 15 <211> 630 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 15 gatgcacgcg acgcgctgct gcttgtggtg tgtgtttgtg tgatctcgac tgaataaaag 60 ggacacggta catccggggt tggttggtgc tcgagtcgag tgtgcaaggt tgtgtggttt 120 gccagctctt ggtgtgtgtc tccttgtgct catgtgactt gtgaaaccat taatagtaac 180 cactttgtgc ttgtgtgtgt gtgggcacct gtgtttctgt aatggtctat ctggagtgaa 240 tatatacaag acaggtttgc ctaaccatgc cttttccttc cttgaggtca tcgcgccaac 300 acgaatgacg agaaccaatg atcttaggac tatcaaatag acaatataac tcagcatgga 360 gcaatgtact gctaatgaac ggtcctaatc aatacagttg ggaagcagta atcgatggaa 420 aacacttcct cagttcagaa gggaacatgt agatgggaaa gtaaacagga tatatagaca 480 catgcagtta ggtctaccac aagaagacat gccacaggac taaaaacaga agctgggttt 540 ggaacaactt atgcagacgc tagctatcca gataaacctt agagaaacag ctatgagaat 600 aagcgtctga aatttgtagt tgcctgtttg 630 <210> 16 <211> 727 <212> DNA <213> Brachypodium distachyon <400> 16 gatgcacgcg acgcgctgct gcttgtggtg tgtgtttgtg tgatctcgac tgaataaaag 60 ggacacggta catccggggt tggttggtgc tcgagtcgag tgtgcaaggt tgtgtggttt 120 gccagctctt ggtgtgtgtc tccttgtgct catgtgactt gtgaaaccat taatagtaac 180 cactttgtgc ttgtgtgtgt gtgggcacct gtgtttctgt aatggtctat ctggagtgaa 240 tatatacaag acaggtttgc ctaaccatgc cttttccttc cttgaggtca tcgcgccaac 300 acgaatgacg agaaccaatg atcttaggac tatcaaatag acaatataac tcagcatgga 360 gcaatgtact gctaatgaac ggtcctaatc aatacagttg ggaagcagta atcgatggaa 420 aacacttcct cagttcagaa gggaacatgt agatgggaaa gtaaacagga tatatagaca 480 catgcagtta ggtctaccac aagaagacat gccacaggac taaaaacaga agctgggttt 540 ggaacaactt atgcagacgc tagctatcca gataaacctt agagaaacag ctatgagaat 600 aagcgtctga aatttgtagt tgcctgtttg gaatggctta tggacgacaa gcttattttc 660 tggagtagcc tacaagtaca agccaaggca catgctgttc caaactggcc catattttgc 720 acaacca 727 <210> 17 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified version of the Brachypodium distachyon metallothionein-like gene (mtl) 3' -UTR <400> 17 gatgcacgcg acgcgctgct gcttgtggtg tgtgtttgtg tgatctcgac tgaataaaag 60 ggacacggta catccggggt tggttggtgc tcgagtcgag tgtgcaaggt tgtgtggttt 120 gccagctctt ggtgtgtgtc tccttgtgct catgtgactt gtgaaaccat taatagtaac 180 cactttgtgc ttgtgtgtgt gtgggcacct gtgtttctgt aatggtctat ctggagtgaa 240 tatatacaag acaggtttgc ctaaccatgc cttttccttc cttgaggtca tcgcgccaac 300 acgaatgacg agaaccaatg atcttaggac tatcaaatag acaatataac tcagcatgga 360 gcaatgtact gctaatgaac ggtcctaatc aatacagttg ggaagcagtc agaagggaac 420 atgtagatgg gaaagtaaac aggatatata gacacatgca gttaggtcta ccacaagata 480 tatatacaag acaggtttgc ctaatccatg ccacaggact aaaaacagaa gctgggtttg 540 gaacaactta tgcagacgct agctatccag ataaacctta gagaaacagc tatgagaata 600 agcgtctgaa atttgtagtt gcctgtttgg aatggcttat ggacgacacg taattttctg 660 gagtagccta caagtacaag ccaaggcaca tgctgttcca aactggccca tattttgcac 720 aaccaaagga aaagagacag tgacataaga gcatctccag tgattcagtg agatacccca 780 aagtcatcca aatgtccgtt tcggccgaaa tggacatgct ggccagaaaa acatctccca 840 atgggcgatc ccaaatagat attttgtatg ttttgtccgg cccaatcccc aaacatctcc 900 taaatttggg gcaactttgc ggtgtccagt gtccggtgtc cgggcccact tctttttctc 960 ccaagcgagc atcttcctcc cgaagcacga agcccccgtc 1000 <210> 18 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified version of a Brachypodium distachyon metallothionein-like gene (mtl) 3' -UTR <400> 18 gatgcacgcg acgcgctgct gcttgtggtg tgtgtttgtg tgatctcgac tgaataaaag 60 ggacacggta catccggggt tggttggtgc tcgaagttgg tgtgcaaggt tgtgtggttt 120 gccagctctt ggtgtgtgtc tccttgtgct catgtgactt gtgaaaccat taatagtaac 180 cactttgtgc ttgtgtgtgt gtgggcacct gtgtttctgt aatggtctat ctggagtgaa 240 tatatacaag acaggtttgc ctaaccatgc cttttccttc cttgaggtca tcgcgccaac 300 acgaatgacg agaaccaatg atcttaggac tatcaaatag acaatataac tcagcatgga 360 gcaatgtact gctaatgaac ggtcctaatc aatacagttg ggaagcagta atgtggaaaa 420 cacttcctca gttcagaagg gaacatgtag atgggaaagt aaacaggata tatagacaca 480 tgcagttagg tctaccacaa gacatgccac aggactaaaa acagaagctg ggtttggaac 540 aacttatgca gactgctatc cagataaacc ttagagaaac agctatgaga ataagcgtct 600 gaaatttgta gttgcctgtt tggaatggct tatggacgac aatgagtgta ttttctggag 660 tagcctacaa gtacaagcca aggcacatgc tgttccaaac tggcccatat tttgcacaac 720 caaaggaaaa gagacagtga cataagagca tctccagtga ttcagtgaga taccccaaag 780 tcatccaaat gtccgtttcg gccgaaatgg acatgctggc cagaaaaaca tctcccaatg 840 ggtctaacac cccaaataga tattttgtat gttttgtccg gcccaatccc caaacatctc 900 ctaaatttgg ggcaactttg cggtgtccag tgtccggtgt ccgggcccac ttctttttct 960 cccaagcgag catcttcctc ccgaagcacg aagcccccgt c 1001

Claims (18)

  1. a) 폴리링커 서열;
    b) 비 메탈로티오네인-유사 유전자; 또는
    c) a)와 b)의 조합에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 벡터로서, 여기서 상기 프로모터는 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터의 길이가 2.0 Kb인 핵산 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 선택성 마커를 암호화하는 서열을 더 포함하는 핵산 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 핵산 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 트랜스젠이 살곤충제 저항성, 소형 RNA 발현, 부위 특이적 뉴클레아제, 제초제 내성, 질소 사용 효율, 물 사용 효율, 영양 품질 또는 DNA 결합 단백질을 부여하는 선택성 마커 또는 유전자 산물을 암호화하는 핵산 벡터.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 제5항에 있어서, 서열번호 3과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 3' 비번역 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 핵산 벡터로서, 여기서 상기 3’ 비번역 서열은 상기 폴리링커 또는 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결되는 핵산 벡터.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 제5항에 있어서, 5' 비번역 서열을 더 포함하는 핵산 벡터.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항 또는 제5항에 있어서, 인트론 서열을 더 포함하는 핵산 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 지하 조직 특이적 발현을 갖는 핵산 벡터.
  11. 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-브라키포듐 식물.
  12. 제11항에 있어서, 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕 수수, 대두, 목화, 아라비돕시스, 담배, 해바라기, 및 카놀라로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물.
  13. 제11항에 있어서, 옥수수인 식물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스젠이 상기 식물의 게놈에 삽입된 식물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 프로모터가 트랜스젠에 작동가능하게 연결된 식물.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 3을 포함하는 3’ 비번역 서열 또는 서열번호 3과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 3’ 비번역 서열을 더 포함하는 식물로서, 여기서 상기 3’ 비번역 서열은 상기 트랜스젠에 작동가능하게 연결되는 식물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 트랜스젠이 지하 조직 특이적 발현을 갖는 식물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 프로모터의 길이가 2.0 Kb인 식물.
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