KR20180040586A - 절편화된 조직의 사용자-한정된 영역에서의 유전자 발현의 동시적인 정량화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특히, 사용자-한정된(user-defined) 조직 영역, 사용자-한정된 세포, 및/또는 세포에서 사용자-한정된 세포내 구조에서 단백질 및/또는 핵산 발현의 동시적인, 다중화된(multiplexed) 검출 및 정량화를 위한 프로브, 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

절편화된 조직의 사용자-한정된 영역에서의 유전자 발현의 동시적인 정량화
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 62/193,809; 2015년 12월 1일에 출원된 미국 가출원 62/261,657; 2016년 1월 11일에 출원된 미국 가출원 62/277,289; 및 2016년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 62/323,023에 대해 우선권 및 이득을 주장한다. 상기 언급된 출원들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
표준 면역조직화학 및 계내 혼성화 방법은 기껏해야 6개 내지 10개의 단백질 또는 핵산 표적들을 동시적으로 검출할 수 있으며, 3개 내지 4개의 표적이 전형적이다. 사용자-한정된 조직 영역, 사용자-한정된 세포, 및/또는 세포에서 사용자-한정된 세포내(subcellular) 구조에서 단백질 및/또는 핵산 발현의 동시적인, 다중화된(multiplexed) 검출 및 정량화를 위한 프로브, 조성물, 방법 및 키트가 요망되고 있다.
본 발명은 사용자-한정된 조직 영역, 사용자-한정된 세포, 및/또는 세포에서 사용자-한정된 세포내 구조에서 단백질 및/또는 핵산 발현의 동시적인, 다중화된 검출 및 정량화를 위한 프로브, 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 (1) 조직 시료 내 적어도 하나의 세포에서의 또는 세포로부터의 적어도 하나의 표적을, 표적-결합 도메인 및 신호 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계; (2) 신호 올리고뉴클레오타이드를 방출시키기에 충분한 힘을 조직 시료의 위치에 제공하는 단계; 및 (3) 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드를 수집하고 확인하여, 힘이 제공된 조직 시료의 특정 위치에서의 또는 특정 위치로부터의 적어도 하나의 표적을 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 위치는 사용자-한정된 조직 영역, 사용자-한정된 세포, 및/또는 세포에서 사용자-한정된 세포내 구조이다. 표적은 핵산(예, mRNA 및 miRNA) 및/또는 단백질일 수 있다. 표적-결합 도메인은 단일 가닥 핵산, 부분 이중 가닥 핵산, 또는 단백질-결합 분자, 예를 들어, 항체, 펩타이드, 앱타머(aptamer) 및 펩토이드(peptoid)일 수 있다. 실시형태들에서, 2개 이상의 표적(즉, 단백질, 핵산 및 이의 조합)이 검출된다. 실시형태들에서, 3,　4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 표적, 및 이들 숫자 사이의 임의의 수의 표적이 검출되며; 예를 들어, 800개 이상의 상이한 표적들이 검출될 수 있다. 실시형태들에서, 검출 단계는 각각의 표적의 존재비(abundance)를 정량화하는 단계를 포함한다.
실시형태들에서, 본 방법은 조직 시료의 적어도 하나의 제2 특정 위치 상에서 적어도 단계 (2) 및 단계 (3)을 반복하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 제2 특정 위치는 적어도 하나의 제2 세포를 포함한다. 실시형태들에서, 검출 단계는 제1 특정 위치에서의 또는 특정 위치로부터의 적어도 하나의 표적의 존재비 및 적어도 제2 특정 위치에서의 또는 제2 특정 위치로부터의 적어도 하나의 표적의 존재비를 비교하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 세포 및 적어도 제2 세포는 동일한 세포 유형이거나 별개의 세포 유형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 단계는 제1 세포 유형에서의 또는 제1 세포 유형으로부터의 적어도 하나의 표적의 존재비 및 적어도 하나의 제2 세포 유형에서의 또는 제2 세포 유형으로부터의 적어도 하나의 표적의 존재비를 정량화하는 단계를 포함한다. 실시형태들에서, 제1 및 제2 세포 유형은 독립적으로, 정상 세포 및 비정상 세포, 예를 들어 질병에 걸린 세포 및 암성 세포로부터 선택된다.
실시형태들에서, 적어도 하나의 세포는 표면에 직접적으로 고정되어 있거나, 적어도 하나의 다른 세포를 통해 표면에 간접적으로 고정되어 있다. 조직 시료는 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀 포매된(FFPE) 시료 또는 비고정된 시료로부터 수득되는 2 ㎛ 내지 1,000 ㎛ 두께의 조직 절편일 수 있다. 적어도 하나의 세포는 고정되거나 비고정될 수 있다. 적어도 하나의 세포는, 염색된 또는 표지된 세포에서 세포내 구조 또는 세포 구조의 시각화를 가능하게 하는 단계 (2) 이전에 염색되거나 표지될 수 있다. 대안적으로, 조직 절편의 경우, 프로브와 접촉되는 절편에 인접한 절편은 단계 (2) 이전에 염색되거나 표지됨으로써, 이러한 프로브와 접촉되는 절편 내의 상응하는 세포 또는 근접한 세포에서의 세포내 구조, 세포 구조 또는 조직-관련 구조의 추정을 가능하게 할 수 있다. 이러한 염색 또는 표지화 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다.
상기 양태에서, 적어도 하나의 프로브에는 표적-결합 도메인과 신호 올리고뉴클레오타이드 사이에 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커)가 위치하여 추가로 포함된다. 절단 가능한 링커는 광절단 가능할 수 있으며, 이러한 링커는 적합한 간섭 광원(예를 들어, 레이저 및 UV 광원) 또는 적합한 비간섭 광원(예를 들어, arc 램프 및 발광 다이오드(LED))에 의해 제공되는 광에 의해 절단된다. 광원은 적어도 하나의 세포의 적어도 하나의 세포내 구조에 방사선을 조사하고, 적어도 하나의 세포의 적어도 하나의 세포내 구조에서의 또는 이로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비가 검출될 수 있다. 또한, 광원은 먼저 적어도 하나의 세포에서의 적어도 하나의 세포내 구조에 방사선을 조사한 다음, 이후에 적어도 제2 세포에서의 적어도 하나의 세포내 구조에 방사선을 조사할 수 있어서, 적어도 하나의 세포에서 적어도 하나의 세포내 구조에서의 또는 이로부터의 적어도 하나의 표적의 존재비와 적어도 제2 세포에서 적어도 하나의 세포내 구조에서의 또는 이로부터의 적어도 하나의 표적의 존재비를 비교할 수 있다.
실시형태들에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 핵산 또는 부분 이중 가닥 핵산이다.
실시형태들에서, 시료는 슬라이드 상으로 고정된 배양된 세포 또는 해리된(dissociated) 세포(고정되거나 비고정됨)일 수 있다. 시료는 세포(1차 세포 및 배양된 세포주 둘 다를 포함함) 및/또는 조직(배양된 또는 외식된 조직을 포함함)을 포함할 수 있다. 시료는 배양된 세포, 1차 세포, 또는 외식편(explant)으로부터 해리된 세포를 포함할 수 있다.
실시형태들에서, 시야보다 더 작은 관심 영역(예를 들어 단일 세포, 또는 세포 내 세포내 구조)의 조사(illumination)는 광을 비추기 위해 레이저 주사 장치(예를 들어, 공초점) 또는 디지털 미러 장치(DMD)의 사용을 포함한다.
실시형태들에서, 프로브는, 바람직하게는 항체의 힌지-영역 중쇄에 부위-특이적이며 안정한 시스테인 바이오컨쥬게이션 방법에 의해 제조된다. 실시형태들에서, 프로브는 1개 항체 당 복수의(즉, 1개 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의) 표지된 올리고뉴클레오타이드들을 포함할 수 있다.
검출은 중합효소 반응, 역전사효소 반응, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이로의 혼성화, 질량 분석법, 형광 분자 비콘(beacon)으로의 혼성화, 시퀀싱 반응 또는 nCounter® 분자 바코드(Molecular Barcode)를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, nCounter® 시스템 및 NanoString Technologies®의 방법이 사용된다.
실시형태들에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 액체 층류, 난류 또는 천이 유동(transitional flow)을 통해 조직으로부터 수집된다. 이러한 유동은 예를 들어 조직과 상기 조직 위로 위치한 유체 장치 또는 불투과성 장벽 사이에 25 ㎛ 내지 500 ㎛의 깊이를 갖는 채널을 통해서일 수 있다.
실시형태들에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 세포에 근접한 용액, 예를 들어 적어도 이러한 세포 바로 위에 존재하는 용액으로부터 수집된다. 근접 용액(proximal solution)은 예를 들어, 피펫, 모세관 튜브, 마이크로어레이 핀, 홀(hole)을 포함하는 유동 셀, 당업계에 공지된 또 다른 적합한 흡인 시스템 또는 이들의 임의의 조합을 통해 흡인함으로써 수집될 수 있다. 모세관 튜브는 광력(light force), 예를 들어 UV 광을 적어도 하나의 세포에 투과시킬 수 있는 광학 장치를 포함할 수 있다. 피펫 또는 마이크로어레이 핀은 복수의 피펫 또는 마이크로어레이 핀을 포함하는 어레이에 부착될 수 있다. 근접 용액은 음이온성 중합체, 예를 들어 덱스트란 설페이트, 및/또는 연어 정자 DNA를 포함할 수 있고/거나 수집된 신호 올리고뉴클레오타이드는 음이온성 중합체, 예를 들어 덱스트란 설페이트, 및/또는 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에 첨가될 수 있다. 연어 정자 DNA 외에도 또는 그 대신에, 당업계에 공지된 다른 비-특이적 차단제가 사용될 수 있다.
실시형태들에서, 이러한 방법은 조직 시료의 동시적인 공간 분해(spatially-resolved) DNA, RNA 및/또는 단백질 검출을 제공한다.
실시형태들에서, 디지털 판독은 5 로그(log) 이상의 선형 동적 범위를 포함한다.
실시형태들에서, 프로브는 면역조직화학(IHC) 또는 계내 혼성화(ISH)에 사용된 농도보다 전형적으로 더 낮은 농도에서 시료에 제공된다. 대안적으로, 농도는 IHC 또는 ISH에 사용된 농도보다 상당히 더 낮을 수 있다. 예를 들어, 프로브 농도는 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 25배 미만, 30배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1,000배 미만, 2,000배 미만, 또는 이들 숫자 사이의 임의의 수일 수 있다. 실시형태들에서, 프로브는 100　nM, 70　nM, 60　nM, 50　nM, 40　nM, 30　nM, 20　nM, 10　nM, 9　nM, 8　nM, 7　nM, 6　nM, 5　nM, 4　nM, 3　nM, 2　nM, 1　nM, 0.9　nM, 0.8　nM, 0.7　nM, 0.6　nM, 0.5　nM, 0.4　nM, 0.3　nM, 0.2　nM, 0.1　nM, 0.09　nM, 0.08　nM, 0.07　nM, 0.06　nM, 0.05　nM, 0.04　nM, 0.03　nM, 0.02　nM, 0.01　nM 및 이보다 낮은 농도 및 이들 숫자 사이의 임의의 농도로 제공된다.
실시형태들에서, 조직 시료는 슬라이드에 부착되고, 먼저 형광(예를 들어, 형광 표지된 항체 및 형광 염색(예를 들어 DAPI))을 사용하여 이미지화되고, 이어서 단백질 및/또는 핵산의 발현이 시료로부터 디지털 계수된다.
실시형태들에서, 온전한 프로브 분자를 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드로부터 제거하기 위해, 네거티브 정제 방법, 예를 들어 온전한 프로브 분자를, 이러한 온전한 프로브의 일부와 상보적인 고정된 올리고뉴클레오타이드, 또는 이러한 온전한 프로브의 일부를 인지하고 결합하는 고정된 항체 또는 단백질-결합 모티프와 접촉시키는 단계를 포함하는 친화성 정제 방법이 사용된다. 실시형태들에서, 온전한 프로브의 표적 결합 도메인은, 고정된 올리고뉴클레오타이드에 부분적으로 상보적이거나 고정된 항체 또는 단백질-결합 모티프에 의해 인지되거나 결합될 수 있는 유니버셜 정제 태그 또는 서열을 포함한다. 당업계에 잘 공지된 이러한 임의의 태그 또는 서열이 이들 실시형태들에서 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 양태 또는 실시형태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다. 본 개시내용이 이의 상세한 설명과 함께 기재되긴 하였지만, 상기 설명은 예시를 위한 것이고, 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 다른 양태, 이점 및 변형들이 하기 청구항의 범위 내에 포함된다.
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도 1: 2개의 예시적인 프로브들을 보여준다. 핵산 백본(단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA)은 검은색 직선으로 도시되어 있다. 프로브는 각각, 적색으로 도시된 표적-결합 도메인을 포함한다. 상단 프로브는 핵산 백본에 혼성화된 표지된 RNA 분절을 포함하는 반면, 하단 프로브는 핵산 백본에 혼성화된 표지된 DNA 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 절단 가능한 모티프(예를 들어 절단 가능한 링커, 도시되지 않음)는 백본과 표적-결합 도메인 사이에, 또는 백본 내에 위치할 수 있다. 절단 가능한 모티프는 신호 올리고뉴클레오타이드를 결합된 표적 핵산 또는 단백질로부터 방출시킬 수 있으며; 그런 다음, 신호 올리고뉴클레오타이드가 수집되고 검출된다.
도 2: 표적 핵산에 직접적으로 결합할 수 있는 제1 유형의 프로브를 보여준다(상단). 하기 이미지에서, 프로브는 청색 곡선으로 나타낸 표적 핵산에 결합되어 있다. 이 도면 및 이후의 도면에서, 리포터 프로브는 표지된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 6개의 위치들을 포함한다(유색 원형으로 확인됨). 프로브가, 표지된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있는 위치를 포함하기 때문에, 이러한 프로브는 또한, 리포터 프로브로 지칭될 수 있다.
도 3: 본 발명의 제1 유형의 이중-프로브 조성물을 보여준다. 여기서, 제1 유형의 프로브는 표적 핵산에 직접적으로 결합하고, 제1 유형의 포착 프로브는 표적 핵산에 직접적으로 결합한다. 포착 프로브는, 별표로 나타낸 적어도 하나의 친화성 시약을 포함할 수 있다. 시료 내 표적 핵산은 청색 곡선으로 나타나 있다.
도 4: 시료 내 표적 핵산에 간접적으로 결합할 수 있는 제2 유형의 프로브(또는 리포터 프로브)를 보여준다(상단). 여기서, 프로브의 표적은 녹색으로 나타낸 중재자 올리고뉴클레오타이드이며, 이러한 중재자 올리고뉴클레오타이드는 결국 하단 이미지에서 청색 곡선으로 나타낸 시료 내 표적 핵산에 결합한다. 중재자 올리고뉴클레오타이드가 핵산 백본을 포함하고 표적 핵산에 결합할 수 있기 때문에, 이러한 중재자 올리고뉴클레오타이드는 본원에 정의된 바와 같이 프로브로 지칭될 수 있을 것이다.
도 5: 본 발명의 제2 유형의 이중-프로브 조성물을 보여준다. 여기서, 제2 유형의 프로브는 (녹색으로 나타낸 중재자 올리고뉴클레오타이드를 통해) 시료 내 표적 핵산에 간접적으로 결합하고, 제2 유형의 포착 프로브는 (오렌지색으로 나타낸 또 다른 중재자 올리고뉴클레오타이드를 통해) 시료 내 표적 핵산에 간접적으로 결합한다. 포착 프로브는 별표로 나타낸 적어도 하나의 친화성 시약을 포함할 수 있다.
도 6: 시료 내 표적 핵산에 간접적으로 결합된 제2 유형의 프로브(도 4에 예시되어 있음)로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드의 방출을 보여준다. 프로브(또는 리포터 프로브) 내에서 절단 가능한 모티프의 위치는, 어떤 물질이 방출되는 신호 올리고뉴클레오타이드와 함께 포함되는지에 영향을 미친다.
도 7: 단백질의 검출에 사용되는 3가지 유형의 프로브들을 보여준다. 상단 배열에서, 프로브는 단백질-결합 도메인에 부착된 핵산을 포함하며; 이 배열에서, 절단 가능한 모티프(예를 들어 절단 가능한 링커, 도시되지 않음)는 핵산과 단백질-결합 도메인 사이에 또는 핵산 자체 내에 포함될 수 있다. 중간 배열에서, 단백질-결합 도메인은 핵산에 부착되어 있고, 프로브는 핵산에 혼성화한다. 프로브(표적-결합 도메인, 및 단백질-결합 도메인에 부착된 핵산(녹색으로 나타냄)을 포함함)는, 표적-결합 도메인이 단백질 표적에 결합하기 이전 또는 이후에 프로브에 의해 결합될 수 있다(도 8에 도시된 바와 같음). 절단 가능한 모티프는 백본, 또는 단백질-결합 도메인에 부착된 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에 포함될 수 있다. 도 2 및 도 4에 도시된 제1 유형의 프로브 또는 제2 유형의 프로브는 단백질의 검출을 위해 이러한 배열로 사용될 수 있다. 하단 배열에서, 단백질-결합 도메인은 핵산에 부착되어 있고, 중재자 올리고뉴클레오타이드(적색으로 나타냄)가 프로브, 및 단백질-결합 도메인에 부착된 핵산 둘 다에 혼성화한다. 도 2 및 도 4에 도시된 제1 유형의 프로브 또는 제2 유형의 프로브는 단백질 검출을 위해 이러한 배열로 사용될 수 있다.
도 8: 도 7의 중간 프로브 및 하단 프로브를 보여준다. 상단의 2개 이미지는 단백질에 결합하기 이전 및 결합한 이후의 프로브를 보여준다. 다음 이미지는, 프로브의 절단 가능한 모티프가 절단된 이후의 프로브를 보여주며; 이러한 이미지에서, 절단 가능한 모티프는 핵산과 표적-결합 도메인 사이에 존재한다. 일단, 핵산이 방출되면, 방출된 핵산은 신호 올리고뉴클레오타이드로 간주될 수 있다. 하단 이미지에서, 신호 올리고뉴클레오타이드(프로브의 방출된 핵산)는 리포터 프로브(예를 들어 도 2 및 도 4에 도시된 바와 같음)에 의해 결합된다.
도 9: 도 7에 도시된 중간 배열의 프로브 및 도 8의 프로브로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드의 방출을 보여준다. 프로브(또는 리포터 프로브) 내의 절단 가능한 모티프의 위치는, 어떤 물질이 방출되는 신호 올리고뉴클레오타이드와 함께 포함되는지에 영향을 미친다.
도 10: 하나의 관심 영역(ROI)으로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드가 검출되는 본 발명의 방법의 단계를 보여준다.
도 11: 관심 영역이 조직 시료의 제1 연속 절편 상에 위치해 있고, 프로브가 조직 시료의 제2 연속 절편에 적용되는 본 발명의 방법의 단계를 보여준다. 신호 올리고뉴클레오타이드는 제2 연속 절편의 제1 관심 영역 내 표적에 결합된 프로브로부터 방출되고 수집된다. 그런 다음, 신호 올리고뉴클레오타이드가 제2 연속 절편의 제2(최대 n번째) 관심 영역 내의 표적에 결합된 프로브로부터 방출되고 수집된다.
도 12: 제1 관심 영역으로부터의 복수의 표적 핵산 및/또는 단백질들의 다중화된 검출, 및 후속해서 제2 관심 영역으로부터의 복수의 표적 핵산 및/또는 단백질들의 다중화된 검출을 보여준다.
도 13: 본 발명의 방법의 단계를 예시한다. 도시된 방법은 본원에서 "nCounter® 디지털 다중화된 면역조직화학(IHC)"으로 지칭될 수 있다.
도 14: 표준 TSA-기반 다중화된 UHC(하단)와 비교하여, nCounter® 디지털 다중화된 IHC(상단)를 이용하여 수행 가능한 간략화된 작업흐름 및 고차원의 다중화를 설명한 순서도이다.
도 15: Ti-E 현미경에 부착된 디지털 미러 장치(DMD)(상단) 및 FFPE 조직 절편의 명시야 이미지(하단)를 보여주는 사진이다. FFPE 조직(광시야 이미지) 상의 광 조사(백색 스팟)는 크기가 약 10 ㎛ 내지 20 ㎛, 즉 단일 세포 크기의 다수의 ROI들을 보여준다.
도 16: 본 방법이 디지털 미러 장치(DMD)의 사용을 포함하는 경우, 본 발명에 수반되는 컴포넌트 및 광 경로를 예시한다. DMD를 이용한 광시야 조사는 시료 상에 초점을 맞추었다. LED는, 전체 시야를 한꺼번에 여기시키기에 충분한 조사를, 약 80개 내지 600개의 DMD 픽셀이 10 ㎛ 직경 세포를 조사하도록 하는 단일 세포 조사와 함께 제공한다. 정상 등급의 DMD는 충분한 단일 세포 해상도를 제공할 것이다. DS: 색선별 미러, FW: 필터 휠 및 DMD: 디지털 미러 장치.
도 17: 본 방법이 레이저 주사 장치(예를 들어, 공초점 주사 장치)의 사용을 포함하는 경우, 본 발명에 수반되는 컴포넌트 및 광 경로를 예시한다. 공초점 주사 배열에서, 갈보 미러(galvo-mirror)는 광을 유도한다. 이 방법은 저렴한 405　nm 레이저를 필요로 한다. DS: 색선별 미러, FW: 필터 휠 및 MM: 전동 미러.
도 18: 초기에 Ki-67(세포 증식 마커; 녹색) 및 CD3(면역 세포 마커; 적색)의 2색 형광을 사용하여 이미지화된 편도선 시료의 전반적인 조직 형태를 구축하는 현미경 사진을 보여준다. 12개의 영역들(도 19에서 확대된 4개의 영역들을 포함)이 백색 상자로 표시되어 있다.
도 19: 도 18에 도시된 4개의 영역들에 대한 Ki-67 및 CD3의 nCounter® 데이터 계수를 보여주는 그래프이다. 이미지들은 (다양한 부가적인 대조군들이 검사될 수 있도록) 연속 절편들로부터 수득되었다. 일반적으로, 시료는 형광 항체를 이용하여 이미지화된 다음, 동일한 슬라이드를 사용하여 (uv 노출을 통해) 디지털 계수될 수 있다. 12개의 영역들(여기서 도시된 4개의 영역들을 포함)에 걸쳐 분석된 다수의 표적들은 Ki-67 및 CD3의 위치의 별개 프로파일을 보여준다. 그래프 아래에는 4개의 영역들의 확대도가 나타나 있다.
도 20: 도 18에 도시된 편도선 시료로부터의 12개의 관심 영역(ROI)들 상에서 30플렉스 올리고-항체 칵테일로부터의 예시적인 계수를 보여준다. 데이터는 (다양한 부가적인 대조군들이 검사될 수 있도록) 연속 절편들로부터 수득되었다.
도 21: 초기에 CD3(적색), CD8(녹색) 및 DAPI(청색)의 3색 형광을 사용하여 이미지화된 림프절로부터의 흑색종 시료에서 T 세포의 전반적인 조직 형태를 구축하는 현미경 사진을 보여준다. 백색 원형은 직경이 25 ㎛이고, 3개의 세포들을 둘러싸고 있다.
도 22: FFPE 림프절 조직 절편(5 ㎛ 두께)으로부터의 CD3 컨쥬게이트의 방출에 대한 nCounter® 데이터를 UV 조사 면적(100 ㎛ 내지 1 mm의 직경)의 함수로서 보여준다. 필드 조리개 크기는 도면 아래에 나타나 있다.
도 23: 도 21 및 도 22에 도시된 바와 동일한 실험으로부터 FFPE 림프절 조직 절편(5 ㎛ 두께)으로부터의 CD45 컨쥬게이트의 방출에 대한 nCounter® 데이터를 UV 조사 면적(100 ㎛ 내지 1 mm의 직경)의 함수로서 보여준다.
도 24: 도 21 내지 도 23에 도시된 바와 동일한 실험으로부터 FFPE 림프절 조직 절편(5 ㎛ 두께)으로부터의 PD1 컨쥬게이트의 방출에 대한 nCounter® 데이터를 UV 조사 면적(100 ㎛ 내지 1 mm의 직경)의 함수로서 보여준다.
도 25: Her2 형광을 IHC 염색에 의해 확인하는 현미경 사진(중앙 패널)으로 나타난 바와 같이 가변적인 수준의 Her2 단백질을 함유하는 유방 종양 조직의 조직 마이크로어레이(TMA; 좌측 패널)를 보여준다. 우측 패널은 중앙 패널의 단일 영역의 확대도를 보여준다.
도 26: Her2 상태(ASCO-CAP 가이드라인) 대 48개의 대표적인 영역들에 대한 nCounter® 계수 데이터를 보여준다.
도 27: 도 26에서 언급된 48개의 영역들에 대한 픽셀 강도 합계(x103) 대 nCounter® 계수의 플롯이다.
도 28: 초기에 CD3(적색) 및 DAPI(청색)의 2색 형광을 사용하여 이미지화된 흑색종 시료의 전반적인 조직 형태를 구축하는 현미경 사진이다. 10개의 예시적인 영역들은 백색 상자로 표시되어 있다.
도 29: 도 28에 도시된 시료로부터의 10개의 관심 영역(ROI)들 상에서 30플렉스 올리고-항체 칵테일로부터의 예시적인 계수를 보여준다.
도 30a 및 도 30b: 편도선 조직 시료(녹색)에서 단일 세포(청색)의, 디지털 미러 장치(DMD)를 사용한 UV 조사를 보여주는 현미경 사진이다.
도 31a 내지 31d: 편도선 조직 시료에서 단일 세포(밝은 백색)의, 디지털 미러 장치(DMD)를 사용한 UV 조사를 보여주는 현미경 사진이다. 도 31b는 도 31a에서 주목한 단일 세포를 강조한 것이고; 도 31d는 도 31c에서 주목한 단일 세포를 강조한 것이다.
도 32: 공간 분해 FFPE 조직 단백질 검정법에서의 단계들을 보여준다. 단계들은, 핵산-검출 검정법에서 시료가 항체보다는 핵산 표적-결합 도메인을 포함하는 프로브와 결합된다는 점을 제외하고는, 핵산-검출 검정법의 단계들과 유사하다.
도 33: 공간 분해 FFPE 조직 단백질 검정법에서의 단계들을 보여준다.
도 34: 전체 조직 또는 전체 시료가 예를 들어 표준 UV 겔 박스에 의해 조사되어, 사전에 프로브에 부착된 신호 올리고뉴클레오타이드를 방출하는 일 실시형태의 데이터를 보여준다.
도 35: 일부 조직 또는 시료가 예를 들어 현미경, 즉 현미경 하에서의 UV 절단에 의해 조사되는 일 실시형태를 보여준다(시간 적정 실험).
도 36: 일부 조직 또는 시료가 예를 들어 현미경, 즉 현미경 하에서의 UV 절단에 의해 조사되는 일 실시형태를 보여준다(조사 면적 적정 실험).
도 37: 일부 조직 또는 시료가 예를 들어 현미경, 즉 현미경 하에서의 UV 절단에 의해 조사되는 일 실시형태를 보여준다(조사 면적 적정 실험 -다중 표적).
도 38: 우선, 조직(예를 들어 유방암 시료) 내 관심 영역에서 마커의 발현에 대해 확인한 다음, 이러한 관심 영역에 (예를 들어 UV를 이용하여) 조사하여, 프로브로부터 신호 올리고뉴클레오타이드를 방출시키는 일 실시형태를 보여준다.
도 39: 조직이 유동 셀 내에 포매된 일 실시형태를 보여준다. 다수의 분획들에 대한 데이터가 도시되어 있다. 도 38의 데이터와 마찬가지로, 도 39에서 관심 영역에서 형광 표지된 마커의 발현에 예비확인한다. 장치의 배열을 보여주는 사진 및 도식도가 또한 나타나 있다.
도 40: 작은 홀을 가진 유동 셀 내에 조직이 포매된 일 실시형태를 보여준다. 장치의 배열을 보여주는 사진 및 도식도가 또한 나타나 있다.
도 41a 내지 도 41c: 작은 홀을 가진 유동 셀을 사용하면, 조직의 전체 표면으로부터 용리물을 수집하는 것보다 상당한 신호 대 노이즈 개선을 가짐을 보여주는 일 실시형태이다. 장치의 배열을 보여주는 사진 및 도식도가 또한 나타나 있다.
도 42a 내지 도 42c: 작은 홀을 가진 유동 셀(12개 또는 96개의 홀 포맷)을 사용한 실시형태에서의 데이터를 보여준다.
도 43a 및 도 43b: 전체 조직 용리가 수행된 유동 셀로부터의 백그라운드 신호(도 43a) 및 용리가 관심 영역 바로 위에서 발생한 유동 셀로부터의 백그라운드 신호(도 43b)를 비교한 데이터를 보여준다.
도 44: 다중 관심 영역 흡인 실시형태에 대한 열린 표면을 이용한 용리제 수집을 보여주는 도식이다. 이 도면에서, 회전(rotary) 밸브 선별을 이용한 흡인/분배 용리제에 대한 다중 튜브 어레이가 도시되어 있다.
도 45: 용리제 수집이 모세관(마이크로 흡인기)을 통해 수행되는 실시형태를 보여주는 사진 및 도식도를 포함한다.
도 46a 및 도 46b: 용리제 수집이 모세관(마이크로 흡인기)을 통해 수행되는 도 45의 실시형태의 데이터를 보여준다.
도 47: 다중 관심 영역 흡인 실시형태 또는 단일 관심 영역에 대한 열린 표면을 이용한 용리제 수집을 보여주는 도식도이다. 이 도면에서, 흡인/분배를 위한 모세관 작용 대 피펫팅을 사용하는 다중 튜브 어레이, 및 고정된 위치에서의 단일 튜브/피펫이 도시되어 있다.
도 48: 조합된 모세관 및 렌즈를 통한 조사 및 유체 수집을 보여주는 도식도이다.
도 49: 96웰 그리드를 포함하는 공간 분해 FFPE 조직 검정법의 실시형태에서의 단계들을 보여주는 도식도이다.
도 50: 본원에 기재된 방법 및 장치를 사용하여 단일 세포 또는 2개의 세포로부터 수득된 단백질 발현 데이터를 보여준다.
도 51: 단일 종양 시료로부터의 연속 절편 상에 위치한 관심 영역을 확인시켜 준다.
도 52: 실시예 16의 검정법에 포함된 9개의 RNA 프로브들 중 6개에 대해 수득된 계수를 보여준다.
도 53: 도 52에 도시된 계수의 평균 및 표준 편차를 보여준다.
도 54: nCounter® 분자 바코드에 동시적으로 혼성화되고 NanoString Technologies®의 nCounter® 시스템에 의해 디지털 계수된 프로브에 대한 RNA 발현 데이터 및 단백질 데이터를 보여준다.
도 55: 단일 가닥 DNA 프로브 및 부분 이중 가닥 DNA 프로브로부터 수득된 RNA 발현 데이터를 보여준다.
도 56: 연어 정자 DNA의 존재 하에 혼성화된 프로브로부터 수득된 RNA 발현 데이터를 보여준다.
도 57: PSA(전립선-특이적 항원)에 특이적인 프로브로부터의 RNA 발현 데이터를 보여준다.
도 58: 비-표준, 서브-nM 농도에서 프로브의 특이성 증가를 보여준다.
본 발명은 부분적으로, 사용자-한정된 조직 영역, 사용자-한정된 세포, 및/또는 세포에서 사용자-한정된 세포내 구조에서 단백질 및/또는 핵산 발현의 동시적인, 다중화된 검출 및 정량화를 위한 프로브, 조성물, 방법 및 키트를 기반으로 한다.
본 발명은 제1 관심 영역(예를 들어 조직 유형, 세포(정상 세포 및 비정상 세포를 포함), 및 세포 내 세포내 구조)에 존재하는 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 동일성 및 존재비와, 제2 관심 영역에 존재하는 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 동일성 및 존재비의 비교를 제공한다. 관심 영역 및 수행될 수 있는 비교의 수에 대해 미리 정해진 상한은 없으며; 상한은 시료의 크기와 비교하여 관심 영역의 수와 관련이 있다. 예로서, 단일 세포가 관심 영역에 존재하는 경우, 절편은 수백개 내지 수천개의 관심 영역들을 가질 수 있으나; 조직 절편이 오로지 2개의 세포 유형만 포함하는 경우, 절편은 오로지 2개의 관심 영역을 가질 수 있다(각각 오로지 1개의 세포 유형만 포함함).
본 발명은 표준 면역조직화학 또는 계내 혼성화 방법을 이용하여 가능한 정도보다 더 높은 정도의 다중화를 제공한다. 표준 면역조직화학 방법에서는 최대 6개 내지 10개의 단백질 표적의 동시적인 검출이 가능하며, 3개 내지 4개의 단백질 표적은 더 전형적이다. 유사하게는, 계내 혼성화 방법은 10개 미만의 핵산 표적의 동시적인 검출로 제한된다. 본 발명은 시료의 한정된 영역으로부터의 핵산 표적 및/또는 단백질 표적의 큰 조합의 검출을 제공한다. 본 발명은 디지털 정량화에 의한 객관적인 측정의 증가 및 신뢰도와 일관성의 증가를 제공하며, 이로써 다수의 센터들로부터의 결과들을 비교할 수 있다.
본 발명의 프로브는 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화(비공유 결합)될 수 있는 한정된 위치를 갖는 핵산 백본(단일 가닥 DNA 또는 RNA)을 가질 수 있다. 도 1을 참조한다. 이러한 프로브(적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있는 한정된 위치를 가짐)는 또한, 본원에서 리포터 프로브로 지칭된다. 리포터 프로브의 백본 상의 위치의 수는 1 내지 100 이상의 범위이다. 실시형태들에서, 위치의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 15, 20, 30, 40 또는 50, 또는 이들 숫자 사이의 임의의 범위이다. 사실상, 백본 상의 (표적 핵산의 검출 및/또는 표적 단백질의 검출을 위한) 위치의 수는, 이러한 백본의 조작이 당업자의 능력 내에 있기 때문에 제한되지 않는다. 프로브 세트에 의해 검출 가능한 표적 핵산 및/또는 단백질의 수는 프로브의 백본에 포함된 위치의 수에 따라 다르다.
본원에 사용된 바와 같이, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 검출 가능한 표지를 포함하는 RNA 분절, 또는 검출 가능한 표지를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
핵산 백본의 위치는 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화(비공유 결합)될 수 있다. 대안적으로, 이러한 위치는, 검출 가능한 표지가 결여된 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될 수 있다. 각각의 위치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21 내지 100개 이상의 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 각각의 위치에 혼성화되는 표지된 올리고뉴클레오타이드의 수는 이러한 올리고뉴클레오타이드의 위치의 길이 및 크기에 따라 다르다. 위치는 약 300개 내지 약 1,500개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 20개 내지 약 1500개 뉴클레오타이드 길이로 다양하다. 실시형태들에서, 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 800개 내지 약 1300개 리보뉴클레오타이드로 다양하다. 다른 실시형태에서, 표지된(또는 비표지된) 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 20개 내지 약　55개 데옥시리보뉴클레오타이드로 다양하고; 이러한 올리고뉴클레오타이드는 약 65℃ 내지 약 85℃, 예를 들어 약 80℃의 용융/혼성화 온도를 갖도록 설계된다. 예를 들어, 약 1,100개 뉴클레오타이드 길이의 위치는 약 25개 내지 약 45개 올리고뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있으며, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 약 45개 내지 약 25개의 데옥시리보뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 실시형태들에서, 각각의 위치는, 약 33개의 데옥시리보뉴클레오타이드 길이를 가진 표지된 올리고뉴클레오타이드 약 34개에 혼성화된다. 표지된 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 단일 가닥 DNA이다.
각각의 표지된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 검출 가능한 표지 단량체를 이용하여 표지될 수 있다. 표지는 올리고뉴클레오타이드의 말단, 올리고뉴클레오타이드 내의 임의의 지점 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 검출 가능한 표지를 뉴클레오타이드에 커플링시킬 수 있는 아민-변형을 가진 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 표지된 올리고뉴클레오타이드는 직접적으로(예를 들어 광 발광에 의해) 또는 간접적으로(예를 들어 형광 표지된 항체의 결합에 의해) 검출될 수 있는 형광 색소, 양자점, 염료, 효소, 나노입자, 화학발광 마커, 비오틴, 또는 당업계에 공지된 다른 단량체들과 같은 여러 가지 표지 단량체들 중 임의의 표지 단량체를 이용하여 표지될 수 있다. 본 발명에 의해 이용될 수 있는 표지의 바람직한 예로는 형광단이 있다. 몇몇 형광단들은 뉴클레오타이드의 표지를 위한 표지 단량체로서 사용될 수 있으며, 그 예로는 GFP-관련 단백질, 시아닌 염료, 플루오레세인, 로다민, ALEXA Flour™, Texas Red, FAM, JOE, TAMRA 및 ROX 등이 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 몇몇 상이한 형광단들이 공지되어 있고, 전체 스펙트럼을 아우르는 더 많은 형광단들이 계속해서 제조되고 있다.
각각의 위치와 (이러한 위치와 표지된 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 통해) 연관된 표지는 선행 위치 또는 후속 위치의 표지와 공간적으로 분리 가능하고 스펙트럼적으로 구별 가능하다. 프로브의 공간적으로 분리 가능하고 스펙트럼적으로 구별 가능한, 순서가 매겨진 일련의 표지는 본원에서 바코드 또는 표지 코드로 지칭된다. 특정 프로브에 의해 결합된 표적 핵산 또는 표적 단백질을 바코드 또는 표지 코드에 의해 확인할 수 있다.
표지된 올리고뉴클레오타이드들은 표준 혼성화 반응, 예를 들어 65℃, 5xSSPE 하에 이들의 위치에 혼성화하며; 이로써, 리포터 프로브 또는 프로브들을 자가 조립할 수 있다. 더 긴 RNA 분자를 표지된 올리고뉴클레오타이드로서 사용하는 프로브(예를 들어 US2003/0013091에 기재된 바와 같음)는 더 긴 RNA 분자를 통한 다수의 백본들의 가교를 피하기 위해 더 높은 온도에서, 최종 사용자가 아닌 제작 장소에서 예비 조립되어야 하며; 예비 조립 단계 후, 백그라운드를 증가시키는 과량의 비혼성화된 RNA 분자를 제거하기 위해, 정제가 후속된다. 짧은 단일 가닥의 표지된 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함함)의 사용은 프로브들의 제작을 크게 간략화시키고, 이들의 제작과 연관된 비용을 절감시킨다.
실시형태들에서, 프로브는 면역조직화학(IHC) 또는 계내 혼성화(ISH)에 사용되는 농도보다 전형적으로 더 낮은 농도로 시료에 제공된다. 대안적으로, 농도는 IHC 또는 ISH에 사용되는 농도보다 상당히 더 낮을 수 있다. 예를 들어, 프로브 농도는 2배 미만, 5배 미만, 10배 미만, 20배 미만, 25배 미만, 30배 미만, 50배 미만, 60배 미만, 70배 미만, 80배 미만, 90배 미만, 100배 미만, 200배 미만, 300배 미만, 400배 미만, 500배 미만, 600배 미만, 700배 미만, 800배 미만, 900배 미만, 1,000배 미만, 2,000배 미만 또는 그보다 낮으며, 이들 숫자 사이의 임의의 수일 수 있다. 실시형태들에서, 프로브는 100　nM, 70　nM, 60　nM, 50　nM, 40　nM, 30　nM, 20　nM, 10　nM, 9　nM, 8　nM, 7　nM, 6　nM, 5　nM, 4　nM, 3　nM, 2　nM, 1　nM, 0.9　nM, 0.8　nM, 0.7　nM, 0.6　nM, 0.5　nM, 0.4　nM, 0.3　nM, 0.2　nM, 0.1　nM, 0.09　nM, 0.08　nM, 0.07　nM, 0.06　nM, 0.05　nM, 0.04　nM, 0.03　nM, 0.02　nM, 0.01　nM, 및 그보다 낮으며, 이들 숫자 사이의 임의의 농도로 제공된다.
프로브는 상업적으로 입수 가능한 카트리지, 소프트웨어, 시스템, 예를 들어 nCounter®를 사용하는 nCounter® 시스템을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있다.
단백질 검출 동안 백그라운드 노이즈는 온전한 프로브 분자의 네거티브 정제를 수행함으로써 감소될 수 있다. 이러한 정제는 관심 영역으로부터 용리물을 수집한 후 항체 또는 광절단 가능한 링커의 친화성 정제를 수행함으로써 수행될 수 있다. 통상적으로, 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드는 용액으로부터 빠져 나오지 않게 될 것이다. 피펫 팁, 튜브 또는 플레이트 내의 단백질-G 또는 단백질-O 메커니즘이 이 단계에 이용될 수 있다. 이러한 장치 및 시약들은 상업적으로 입수 가능하다.
핵산 검출 동안 백그라운드 노이즈는 온전한 프로브 분자의 네거티브 정제를 수행함으로써 감소될 수 있다. 이러한 정제는 관심 영역으로부터 용리물을 수집한 후 표적-결합 도메인 또는 광절단 가능한 링커의 친화성 정제를 수행함으로써 수행될 수 있다. 통상적으로, 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드는 용액으로부터 빠져 나오지 않게 될 것이다. 네거티브 정제를 돕기 위해, 유니버셜 정제 서열이 프로브, 예를 들어 표적-결합 도메인에 포함될 수 있다.
도 1은 단일 가닥 핵산 백본 및 적색으로 도시된 표적-결합 도메인을 포함하는 2개의 예시적인 프로브들을 보여준다. 상단 프로브는 백본 내 위치에 혼성화된 표지된 RNA 분절을 포함하는 반면, 하단 프로브는 핵산 백본 내 위치에 혼성화된 표지된 DNA 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 도 1 및 본 개시내용의 어디에서나 도시된 색상은 비제한적이며; 당업계에 공지된 다른 유색 표지 및 다른 검출 가능한 표지들도 본 발명의 프로브에 사용될 수 있다.
본 발명의 프로브는 표적 핵산의 검출에 사용될 수 있다. 도 2 및 도 4는 이러한 양태를 예시하고 있다. 이러한 프로브는 적어도 하나의 백본 및 표적 핵산-결합 영역을 포함한다. 표적 핵산-결합 영역은 바람직하게는 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이이고, 보다 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오타이드 길이이다. 특정한 실시형태에서, 표적 핵산-결합 영역은 대략 10개 내지 500개, 20개 내지 400개, 25개, 30개 내지 300개, 35개, 40개 내지 200개, 또는 50개 내지 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 표적 핵산의 결합 및 확인을 위한 프로브 및 방법은 예를 들어, US2003/0013091, US2007/0166708, US2010/0015607, US2010/0261026, US2010/0262374, US2010/0112710, US2010/0047924 및 US2014/0371088에 기재되어 있으며, 이들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
표적 핵산은 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 cRNA, 메신저 RNA(mRNA) 또는 miRNA일 수 있고; 바람직하게는 DNA는 cDNA이다.
본 발명의 프로브는 표적 핵산에 직접적으로 혼성화하는 데 사용될 수 있다. 도 2는 이러한 실시형태의 프로브(또는 조성물)를 예시하고 있다. 프로브는 적색으로 도시된 표적 핵산 결합 도메인을 포함한다. 표적 핵산은 청색 곡선으로 도시되어 있다. 도 3은 도 2의 프로브 및 포착 프로브를 포함하는 이중 프로브 조성물을 예시하고 있다. 포착 프로브는 별표로 표시된 적어도 하나의 친화성 시약을 포함한다. 적어도 하나의 친화성 모이어티는 공유 수단 또는 비공유 수단에 의해 포착 프로브에 부착될 수 있다. 정제 및/또는 고정에 적절한 다양한 친화성 모이어티들이 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 친화성 모이어티는 비오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘이다. 다른 친화성 태그는 특이적인 결합 파트너에 의해 인지되며, 따라서 이러한 결합 파트너에의 친화성 결합에 의한 단리 및 고정을 촉진하며, 상기 결합 파트너는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 이들 도면에서, 각각의 프로브는 표지된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 6개의 위치를 포함하고, 각각의 위치는 유색 원형에 의해 확인된다.
본 발명의 임의의 프로브는 친화성 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 프로브는 시료에 존재하는 표적 핵산에 (중재자 올리고뉴클레오타이드를 통해) 간접적으로 혼성화하는 데 사용될 수 있다. 도 4는 이러한 실시형태의 프로브(또는 조성물)를 예시하고 있다. 프로브는 적색으로 도시된 표적 핵산 결합 도메인을 포함하고, 이러한 도메인은 합성 올리고뉴클레오타이드(중재자 올리고뉴클레오타이드; 녹색으로 도시됨)에 결합하고, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 다시 생물학적 시료 내 표적 핵산에 결합한다. 중재자 올리고뉴클레오타이드는 본원에 정의된 바와 같이 핵산 백본을 포함하고 표적 핵산에 결합할 수 있기 때문에 프로브라고 지칭될 수 있을 것이다. 생물학적 시료에 존재하는 표적 핵산은 청색 곡선으로 도시되어 있다. 도　5는 도 4의 프로브 및 포착 프로브를 포함하는 이중-프로브 조성물을 예시하고 있다. 이들 실시형태에서, 프로브의 표적 핵산-결합 영역은, 시료에 존재하는 표적 핵산과 상이한 중재자 올리고뉴클레오타이드(즉, 합성 올리고뉴클레오타이드)의 영역에 혼성화한다. 따라서, 프로브의 표적 결합 영역은 시료 내 궁극적인 표적 핵산과는 독립적이다. 이는, 검정법의 표적(시료에 존재함)-특이적 구성성분이 보다 고비용의 프로브가 아닌 저렴하고 광범위하게 입수 가능한 합성 DNA 올리고뉴클레오타이드에 포함되기 때문에, 검정법 설계 시 경제적이고 신속한 융통성을 허용한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오타이드는 간단하게는, 시료에 존재하는 표적 핵산에 혼성화하는 영역 및 프로브에 혼성화하는 영역을 포함하도록 설계된다. 따라서, 단일 세트의 간접-결합 프로브는, 단순히 검정법의 표적-특이적 (합성) 올리고뉴클레오타이드 부분을 대체함으로써, 상이한 실험들에서 (시료에 존재하는) 무한정의 여러 가지 표적 핵산들을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 프로브 또는 프로브들은 적합한 힘의 적용 후, 신호 올리고뉴클레오타이드의 방출을 허용하는 영역을 포함할 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 이러한 영역은 절단 가능한 모티프(예를 들어, 제한 효소 부위 또는 절단 가능한 링커)이다. 절단 가능한 모티프는 신호 올리고뉴클레오타이드를 결합된 표적 핵산 또는 단백질로부터 방출시킬 수 있고, 그런 다음 신호 올리고뉴클레오타이드가 수집 및 검출된다. 본원에 사용된 바와 같이, 신호 올리고뉴클레오타이드는, 현재 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드와 혼성화된 위치를 갖고 있는 프로브의 영역이거나, 프로브의 표적-결합 도메인으로부터 방출될 수 있는 프로브(예를 들어 핵산 분자)의 영역이다. 신호 올리고뉴클레오타이드는 프로브의 나머지로부터 분리(즉, 절단 및 방출)될 수 있는 경우 방출 가능하다고 일컬어진다. 절단 가능한 모티브의 예로는, 광절단 가능한 링커가 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프로브에서(본원에 기재된 바와 같이), 절단 가능한 모티프는 핵산과 표적-결합 도메인 사이, 백본과 표적-결합 도메인 사이, 또는 백본 내에 위치할 수 있다. 도 6에서, 절단 가능한 모티프의 위치에 대한 비제한적인 옵션은 프로브 내의 갭(gap) 또는 중재자 올리고뉴클레오타이드 내의 갭으로부터 추론될 수 있다.
본 발명의 프로브는 표적 단백질의 검출에 사용될 수 있다. 도 7은 이러한 실시형태의 프로브(또는 조성물)를 예시하고 있다. 이러한 프로브는 적어도 하나의 백본 및 표적 단백질-결합 영역을 포함한다. 본 발명의 단백질-표적화 프로브에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 단백질-결합 도메인에 부착된 핵산일 수 있다. 이들 프로브에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는, 표지된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화하기 위한 위치를 포함하는 프로브에 의해 표적화되고 결합된다. 이러한 프로브는 도 7의 중간 이미지에 도시되어 있다. 이 이미지에서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 녹색 선으로 도시되어 있다. 프로브는, 이러한 프로브가 (이의 단백질-결합 도메인을 통해) 단백질에 결합하기 이전에 또는 이러한 프로브가 단백질에 결합한 이후에, 프로브에 의해 결합될 수 있다. 신호 올리고뉴클레오타이드는, 이러한 신호 올리고뉴클레오타이드가 표적-결합 도메인으로부터 이미 방출되었을 때까지는 프로브에 의해 결합될 필요가 없다(이러한 구현예는 도시되어 있지 않음).
표적 단백질에 결합할 수 있는 프로브의 영역은, 적어도 하나의 표적 단백질, 적어도 하나의 표적 단백질 대리물(surrogate) 또는 둘 다와 결합하도록 설계되어 있고, 적절한 조건 하에 단백질 프로브 및 표적 단백질을 포함하는 분자 복합체를 형성할 수 있는 분자 또는 조립물(assembly)을 포함한다. 표적 단백질에 결합할 수 있는 영역은 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 펩토이드를 포함한다. 항체는 비제한적으로 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 모노특이적 항체, 재조합적으로 발현된 항체, 인간화된 항체, 식물 항체 등을 포함한 여러 가지 공급원들로부터 수득될 수 있다. 용어 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 아미노산 서열은 본원에서, 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 상호호환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산 또는 합성 아미노산에 의해 간섭을 받을 수 있다. 중합체라는 용어는 또한, 예를 들어 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 처리, 예컨대 표지 구성성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산이라는 용어는 천연 및/또는 비천연 아미노산 또는 합성 아미노산을 지칭하며, 그 예로는 글리신, 및 D 또는 L 광학이성질체 둘 다, 및 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체(peptidomimetic) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 표적 단백질에 결합시키고 확인하기 위한 프로브 및 방법은 예를 들어 US2011/0086774에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시형태들에서, 프로브는 바람직하게는, 항체의 힌지-영역 중쇄에 대해 부위 특이적이며 안정한 시스테인 바이오컨쥬게이션 방법에 의해 제조된다. 이러한 제조 방법은 표지된 올리고뉴클레오타이드 대 항체의 화학량론적 비를 상대적으로 조절 가능하게 제공한다. 프로브는 1개 항체 당 복수의(즉, 1개 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의) 표지된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 1개 항체 당 3개 또는 4개의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 "더 무거운" 프로브는, 표지된 올리고뉴클레오타이드가 결여된 항체, 또는 1개 항체 당 1개 또는 2개의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 "더 가벼운" 프로브보다 상당히 덜 민감하다.
단백질-표적화 프로브 및 핵산-표적화 프로브는, 조건이 단백질 표적 및 핵산 표적 둘 다의 결합을 허용하는 한, 동시적으로 적용될 수 있다. 대안적으로, 단백질-표적화 프로브 및 핵산-표적화 프로브는, 단백질 표적 및 핵산 표적 둘 다의 결합을 허용하는 조건이 불가능한 경우, 순차적으로 적용될 수 있다.
프로브 세트는 프로브 조성물과 동의어이다. 프로브 세트는 즉, 하나의 표적에 대해 적어도 하나의 화학종의 프로브를 포함한다. 프로브 세트는 바람직하게는, 적어도 2개의, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 화학종의 프로브를 포함한다. 프로브 세트는 각각의 화학종의 프로브의 하나의 또는 다수의 복사체를 포함할 수 있다.
제1 세트의 프로브만 시료에 적용될 수 있다. 대안적으로, 제2 세트(또는 더 높은 수의 세트)의 프로브는 그 후에 시료에 적용될 수 있다. 제1 세트 및 제2 세트(또는 더 높은 수의 세트)는 오로지 핵산, 오로지 단백질 또는 이들의 조합을 표적화할 수 있다.
본 발명에서, 2개 이상의 표적들(즉, 단백질, 핵산 또는 이들의 조합)이 검출되며: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 표적, 및 이들 숫자 사이의 임의의 수의 표적이 검출된다.
프로브 세트는 표적화되는 세포 유형 또는 조직 유형을 기반으로 미리 한정될 수 있다. 예를 들어, 조직이 유방암인 경우, 프로브 세트는 유방암 세포와 관련된 단백질(예를 들어 Her2, EGFR 및 PR)에 대한 프로브 및/또는 정상 유방 조직과 관련된 단백질에 대한 프로브를 포함할 것이다. 부가적으로는, 프로브 세트는 표적화되는 세포 또는 조직의 발달 상태를 기반으로 미리 한정될 수 있다. 대안적으로, 프로브 세트는 관심 세포내 부위, 예를 들어 핵, 세포질 및 막을 기반으로 미리 한정될 수 있다. 예를 들어, Foxp3, 히스톤 H3 또는 P-S6에 대한 항체는 핵을 표지하며, CD3, CD4, PD-1 또는 CD45RO에 대한 항체는 세포질을 표지하고, PD-L1에 대한 항체는 막을 표지한다.
프로브는 화학적으로 합성될 수 있거나, 프로브를 인코딩하는 핵산이 클로닝된 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 프로브 또는 프로브 세트는 본 발명의 방법 및 키트에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 프로브에 있어서, 표지 코드와 표적 핵산 또는 표적 단백질의 결합은 고정되지 않는다.
본 발명의 프로브는 임의의 시료, 예를 들어 생물학적 시료에 존재하는 표적 핵산 또는 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 시료는 비제한적으로 세포(1차 세포 및 배양된 세포주를 둘 다 포함함) 및 조직(배양된 조직 또는 외식된 조직을 포함함)을 포함하는 것들을 임의의 수로 포함할 수 있다. 실시형태들에서, (고정되거나 비고정된) 조직 시료가 포매되며, 연속해서 절편화되고, 현미경 슬라이드 상에 고정된다. 잘 공지된 바와 같이, 연속 절편 쌍은 2개의 연속 절편들에 존재하는 적어도 하나의 세포를 포함할 것이다. 제1 연속 절편 상에 위치한 구조 및 세포 유형은 인접한 연속 절편 상에서 유사한 위치를 가질 것이다. 시료는 슬라이드에 상에 고정된, 배양된 세포 또는 해리된 세포(고정되거나 비고정됨)일 수 있다.
실시형태들에서, 조직 시료는 생검처리된 종양 또는 이의 일부, 즉 임상적으로 관련된 조직 시료이다. 예를 들어, 종양은 유방암으로부터 유래될 수 있다. 시료는 절제된 림프절일 수 있다.
시료는 다세포성 유기체를 포함한 사실상 임의의 유기체, 예를 들어 식물계, 진균류 및 동물계로부터 수득될 수 있으며; 바람직하게는, 시료는 동물, 예를 들어 포유류로부터 수득된다. 인간 시료가 특히 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 프로브, 조성물, 방법 및 키트는 질환의 진단에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환을 진단하다 또는 진단이라는 용어는 질환을 예측하거나 진단하며, 질환에 걸릴 소인을 확인하며, 질환의 치료를 모니터링하고, 질병의 치료 반응, 및 질환, 질환 진행 및 질환의 특정 치료에 대한 반응의 예후를 진단하는 것을 포함한다. 예를 들어, 조직 시료는, 시료 내 질병 또는 악성 세포 유형의 마커의 존재 및/또는 양을 (비-질병 상태와 비교하여) 확인함으로써 질병 또는 암을 진단하거나 또는 병기분류(staging)를 하기 위해, 본원에 기재된 프로브, 방법 또는 키트 중 임의의 것에 따라 검정될 수 있다.
일반적으로, 슬라이드에 부착된 시료는 우선, 형태, 관심 영역, 관심 세포 유형 및 단일 세포를 확인하기 위해 형광(예를 들어, 형광 항체 또는 형광 염색(예를 들어, DAPI))을 사용하여 이미지화될 수 있으며, 그런 다음 단백질 및/또는 핵산의 발현이 동일한 슬라이드 상의 시료로부터 디지털 계수될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 키트는 시료 내에서 단백질 및/또는 핵산의 결합을 촉진하기 위해, 즉 혼성화 반응을 수행하기 위해 프로브 및 다른 시약, 예를 들어 완충제 및 당업계에 공지된 다른 시약을 포함할 수 있다.
키트는 또한, 키트의 구성성분들에 대한 사용 설명서, 예컨대 비제한적으로, 표지된 올리고뉴클레오타이드를 프로브에 혼성화하며, 프로브를 표적-특이적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화하며, 표적-특이적 올리고뉴클레오타이드를 표적 핵산에 혼성화하고/거나 프로브를 표적 단백질에 혼성화하는 데 필요한 정보를 포함할 것이다.
표적 핵산 및/또는 표적 단백질의 검출에 대한 예시적인 프로토콜은 하기와 같이, 도 10 내지 도 14(상단)에 도시된 바와 같이 기재되어 있다.
다중화된 면역조직화학 방법 및/또는 핵산 계내 혼성화 방법과 일관되도록 제조된 (살아 있거나 고정된) 세포 또는 (예를 들어, 포르말린-고정 파라핀 포매된(FFPE)) 조직 절편을 제조하고, 유리 슬라이드 또는 적합한 고체 지지체 상에 고정한다. 세포 또는 조직 절편의 표면으로의 접근은 보존되어, 유체 교환이 가능하며; 이러한 유체 교환은 유체 챔버 시약 교환 시스템(예를 들어, 미국 오레건주 벤드 소재의 Grace™ Bio-Labs)을 사용함으로써 달성될 수 있다. 관심 영역(ROI)은 프로브가 제공되는 연속 절편 또는 인접한 연속 절편 상에서 확인된다. 첫번째 경우, 관심 세포/조직의 전반적인 거시적 특징을 확인하기 위해, 관심 세포/조직에 대한 전체(full) "거시적 특징" 이미징 방법, 예를 들어 DAPI 염색, 막 염색, 미토콘드리아 염색, 특이적인 에피토프 염색 및 특이적인 전사체 염색이 수행된다. 대안적으로, 관심 영역(ROI)은 프로브가 제공되는 연속 절편에 인접한 연속 절편 상에서 확인되며; 여기서, (상기 기재된 바와 같이) 전체 "거시적 특징" 이미징은 제1 연속 절편(도 11 및 도 12에서 절편 #1) 상에서 수행된다. 이러한 이미징은 일반적으로, 인접한 연속 절편 상에서 관심 영역(도 10의 패널 B에서 적색 선, 및 도 11 및 도 12의 절편 #2에서 녹색 타원 및 녹색 삼각형)을 확인할 것이며, 여기서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 적합하고 직접적인 힘의 적용 시 프로브로부터 방출될 것이다. 연속 절편들은 서로 약 5 ㎛ 내지 15 ㎛만큼 이격되어 존재할 수 있다.
도 13 및 도 14(상단)는 본 발명의 단계를 추가로 예시한다. 도 13에 도시된 단계들은 하기 단계들을 포함한다. (1) 공정: FFPE 슬라이드 마운팅된 조직을, 광절단 가능한 링커를 통해 DNA 올리고에 컨쥬게이션된 1차 항체의 칵테일 및 한정된 수의 가시광 파장 이미징 시약과 함께 인큐베이션한다. (2) 시야: 관심 영역(ROI)을 저-플렉스(low-plex)에서 가시광 기반 이미징 시약을 이용하여 확인하여, 종양 슬라이스의 전반적인 "구조"를 (예를 들어 핵을 이미지화하고/거나 1개 또는 2개의 중요한(key) 종양 바이오마커를 사용하여) 구축한다. (3) 프로파일: 선택된 ROI를 고 해상도 멀티플렉스 프로파일링을 위해 선택하고, 선별된 영역으로부터의 올리고는 UV 광에 노출된 후 방출된다. (4) 플레이팅(plating): 그런 다음, 유리(free) 광절단된 올리고를 예를 들어 미세모세관-기반 "빨대(sipper)"를 통해 수집하고, 후속적인 정량화를 위해 마이크로플레이트 웰에 보관한다. (5) 디지털 계수: 디지털 계수 단계 동안, 마이크로플레이트 내의 공간 분해된 ROI로부터의 광절단된 올리고를 4-색, 6-스팟 광학 바코드에 혼성화하여, 표준 NanoString nCounter® 판독 장비(예를 들어, SPRINT, Flex 및 MAX)를 사용하여 단일 ROI 내에서 단백질 표적(최대 800-플렉스 마커에 걸쳐 분포됨)의 최대 약 백만개의 디지털 계수를 구축한다.
관심 영역은 시료, 세포 유형, 세포, 또는 세포 내 세포내 구조에 존재하는 조직 유형일 수 있다.
프로브 세트를 포함하는 조성물이 연속 절편에 적용되며, 각각의 프로브는 방출 가능한 신호 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 프로브 세트는 단백질을 표적화하거나, 핵산을 표적화하거나 또는 둘 다인 프로브를 포함할 수 있다. 조성물은 포착 프로브를 포함할 수 있다. 프로브가 표적(단백질 및/또는 핵산)에 간접적으로 결합하는 경우, 적용되는 조성물은 중재자 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 조성물은 시료에서 단백질 및/또는 핵산의 결합을 촉진하기 위해 당업계에 공지된 다른 시약을 포함할 것이다.
차단 단계는 조성물이 적용되기 이전 및/또는 이후에 수행된다.
광절단 가능한 링커를 포함하는 프로브의 경우, 고체 지지체(예를 들어, 현미경 슬라이드)는, 광절단 가능한 링커를 절단할 수 있는 파장의 여기광을 제공할 수 있는 현미경에 놓인다. 제1 관심 영역(도 10의 패널 B에서 적샌 선, 및 도 11 및 도 12에서 ROIi)은 광에 의해 여기되며, 이로써 광절단 가능한 링커가 절단되고, 신호 올리고뉴클레오타이드가 방출된다. 도 6 및 도 9에 예시된 바와 같이, 신호 올리고뉴클레오타이드는, 리포터 프로브에 의해 결합되어 있거나 결합될 수 있는 프로브로부터의 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산과 결합된 위치를 현재 갖고 있는 프로브의 적어도 하나의 영역을 포함한다. 여기광을 오로지 ROIi에만 조사함으로써, 신호 올리고뉴클레오타이드는 ROIi 내의 프로브로부터만 방출되고, ROIi 외부에 위치한 프로브로부터는 방출되지 않으며, 이러한 프로브들은 이들의 신호 올리고뉴클레오타이드를 보유한다. 따라서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 ROIi 내의 표적에 결합된 프로브에 대해서만 수집되며, 이로써 ROIi 내에 위치한 표적(단백질 및/또는 핵산)의 동일성 및 양의 검출이 가능해진다.
절편의 표면은 소량의 완충제(약 5 ㎕ 내지 30 ㎕)로 세척되고, (방출된 신호 올리고뉴클레오타이드를 함유하는) 용리물은 제1 시료 용기(도 12에서 시료 "i"로서 도시됨) 내로 수집된다. 절편의 표면은 추가로 헹구어져서, 용리물로부터 생략된 임의의 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드가 제거된다.
제2 관심 영역(도 11 및 도 12에서 ROIj)이 광에 의해 여기되어, 광절단 가능한 링커가 절단되고, 신호 올리고뉴클레오타이드가 제2 관심 영역으로부터 방출된다. 다시, 여기광을 오로지 ROIj에만 조사함으로써, 신호 올리고뉴클레오타이드는 ROIj 내의 프로브로부터만 방출되고, ROIj 외부에 위치한 프로브로부터는 방출되지 않으며, 이러한 프로브들은 이들의 신호 올리고뉴클레오타이드를 보유한다. 따라서, 신호 올리고뉴클레오타이드는 ROIj 내의 표적에 결합된 프로브에 대해서만 수집되며, 이로써 ROIj내에 위치한 표적(단백질 및/또는 핵산)의 동일성 및 양의 검출이 가능해진다.
절편의 표면은 소량의 완충제(약 5 ㎕ 내지 30 ㎕)로 세척되고, (방출된 신호 올리고뉴클레오타이드를 함유하는) 용리물은 제1 시료 용기(도 12에서 시료 "j"로서 도시됨) 내로 수집된다. 절편의 표면은 추가로 헹구어져서, 용리물로부터 생략된 임의의 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드가 제거된다.
여기 단계, 세척 단계 및 헹굼 단계는, 모든 관심 영역들(최대 ROIn)로부터 신호 올리고뉴클레오타이드가 수집될 때까지 반복된다.
본 발명의 부가적인 이점, 특징 및 실시형태들은 본원과 함께 출원된 부록에 예시되어 있다. 예로서, 신호 올리고뉴클레오타이드를 수집하기 위한 다양한 방법 및 장치들, 및 힘을 제공하기 위한 다양한 방식들이 나타나 있다. 더욱이, 부록은 다른 실시형태들을 능가하는 본 발명의 소정의 실시형태들로부터 수득된 예상치 못하게 개선된 결과들을 제공한다. 약 7배 내지 약 200배의 신호-대-노이즈 개선을 나타내는 데이터가 나타나 있다.
검출은 당업계에 공지된 임의의 현미경 유형 장치 또는 시스템을 사용할 수 있다. 장치 또는 시스템은 디지털 미러 장치(DMD; 도 15 및 도 16 참조)와 함께 광시야 조사를 포함할 수 있으며; 이의 이점은, DMD 및 컨트롤러가 또한 LED(프로브를 광절단함)를 구동할 수 있고 본질적으로 부가적인 비용이 들지 않으며, 실시가 용이하고, 10 mm 내지 40 mm 세포를 포함할 약 1 mm 크기의 작은 특징 크기를 허용하고, 이용 가능한 가전제품(예컨대 프로젝터)을 추진하기 때문에, 감축된 비용을 포함한다. 장치 또는 시스템은 레이저 주사 장치, 예를 들어 공초점을 포함할 수 있으며, 도 16을 참조한다. 이의 이점은, 더 작은 형태학적 특징이 조사 및 이미지화될 수 있다는 점이지만; 이들 장치와 관련하여 부가적인 비용이 수반된다.
시료 내 각각의 관심 영역에 존재하는 복수의 표적 단백질 및/또는 표적 핵산들은 각각의 용리물 시료에서 중합효소 반응, 역전사효소 반응, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이로의 혼성화, 질량 분석법, 형광 분자 비콘으로의 혼성화, 시퀀싱 반응 또는 nCounter® 분자 바코드를 사용하여 확인된다. US2003/0013091, US2007/0166708, US2010/0015607, US2010/0261026, US2010/0262374, US2010/0112710, US2010/0047924, US2014/0371088 및 US2011/0086774에 기재된 바와 같이 NanoString Technologies®의 nCounter® 시스템 및 방법이 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 확인에 바람직한 수단이다. NanoString Technologies®의 nCounter® 시스템 및 방법은 복수의(800개 이상의) 별개 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 동시적인 다중화된 확인을 가능하게 한다.
더불어, 제1 관심 영역(예를 들어 조직 유형, 세포 유형(정상 세포 및 비정상 세포를 포함함), 및 세포 내 세포내 구조)에 존재하는 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 동일성 및 존재비, 및 제2 관심 영역 또는 그 이상의 관심 영역에 존재하는 표적 단백질 및/또는 표적 핵산의 동일성 및 존재비의 비교가 수행될 수 있다.
본 발명은 (예를 들어) 종양 및 이의 인접한 정상 조직 내의 별개의 영역으로부터 800개 이하의 관심 단백질들의 다중화된 검출 및 비교를 제공하며; 따라서, 종양 및 이의 미세환경의 체계적인 조사가 가능하다.
본 발명은 면역치료법 및 다른 표적화된 치료법에 대한 신규 반응을 밝히기 위해 계속 진행중인 임상 연구에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, (예를 들어) 종양에서 면역 바이오마커의 발견을 가능하게 하며, 이는 동반 진단법의 개발에 사용될 수 있다.
면역조직화학은 FFPE 조직 절편에서 단백질 발현 및 위치화를 분석하기 위한 강력한 기술이다. 그러나, 면역조직화학에는 동적 범위의 결여, 어려운 정량화, 및 매우 제한된 다중화에 대한 노동 집약적인 작업흐름을 포함한 다수의 난관들이 존재한다. 본원에서, 고도로 다중화된(최대 800-플렉스) 검정법, 즉 nCounter® 디지털 다중화된 면역조직화학(IHC) 검정법에서 단백질의 공간 분해된, 디지털 특징화를 가능하게 하는 nCounter® 바코딩 기술을 기반으로 한 신규 플랫폼이 개시된다. 이러한 검정법은 집속 관통 대물렌즈 UV(예를 들어 약 365 nm) 노출을 사용하여 조직의 별개의 영역으로부터 방출되는, 광절단 가능한 올리고뉴클레오타이드 태그에 커플링된 항체에 의존한다. 절단된 태그는 nCounter® 검정법에서 정량화되고, 계수는 다시 조직 위치로 맵핑되어, 단백질 존재비의 공간 분해된 디지털 프로파일이 수득된다. 단백질 검출은, 광절단 가능한 올리고뉴클레오타이드 태그를 포함하는 핵산 프로브를 사용하는 핵산 검출 검정법과 함께 또는 이와는 별도로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단백질 존재비의 공간 분해된 디지털 프로파일, 단백질 및 핵산 존재비의 공간 분해된 디지털 프로파일, 및 핵산 존재비의 공간 분해된 디지털 프로파일을 제공할 수 있다.
검정법의 이점으로는, 높은 민감성(예를 들어 약 1개 내지 4개의 세포), 큰 동적 범위(105 초과)를 포함하여 모든 디지털 계수, 고도로 다중화됨(예를 들어, 30개의 표적 내지 기기 장치의 변화 없이 측정 가능한(scalable) 800개의 표적), 간단한 작업흐름, FFPE와의 상용성, 2차 항체(단백질 검출용) 또는 증폭 시약이 없음, 및 임상 검정법에 대한 잠재성 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수형 참조를 포함한다.
문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명확하지 않은 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "또는"은 "또는" 및 "및" 둘 다를 포함하는 것으로 이해되고, 망라한다.
문맥으로부터 구체적으로 언급되거나 명확하지 않은 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 당업계에서 정상적인 관용 범위 내에 있는 것으로 이해되며, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내에 있다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 다르게 명확하지 않은 한, 본원에 제공된 모든 수치들은 용어 "약"에 의해 변형된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 당업계의 당업자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 다른 프로브, 조성물, 방법 및 키트가 본 발명의 실시에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 사용된 용어는 오로지 특정한 실시형태를 기재하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1: 본 발명은 FFPE 조직 절편에서 다중화된 표적을 정량화하기 위한 "바코딩-잠재성"을 제공한다.
종양내 이종성은 표적화된 치료법의 실시에 있어서 중요한 과제로서 나타났다. 조직학적으로, 면역조직화학(IHC)은 단백질의 공간적 이종성을 평가하는 데 사용되어 왔으나; 높은 멀티플렉스 및 넓은 동적 범위에서는 단백질 존재비의 정량화가 어려웠다.
이 실시예에서, 포르말린-고정 파라핀 포매된(FFPE) 조직 절편 내의 단백질을, 광절단 가능한 링커 및 형광 바코드를 포함하는 항체-포함 프로브로 표지하였다. 후속해서, 프로브 - FFPE 조직 절편의 사용자-한정된 ROI 내의 ― 를 집속 UV 광에 노출시킴으로써, (형광 바코드를 포함하는) 신호 올리고뉴클레오타이드를 ROI로부터 방출시켰다. 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드를 FFPE 시료로부터 세척해 내고, 수집하였다. 그런 다음, 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드로부터의 형광 바코드를 NanoString Technologies®의 nCounter® 시스템에 의해 인지하고 디지털 계수하였으며, 이로써 조직 절편의 사용자-한정된 공간적 영역 내의 각각의 표적화된 단백질의 존재비를 정량화하였다. 신호 올리고뉴클레오타이드가 제1 ROI로부터 방출되고 수집된 후, 집속 UV 광이 FFPE 조직 절편의 제2 사용자-한정된 ROI에 노출되었으며, 이로써 신호 올리고뉴클레오타이드가 제2 ROI로부터 방출되었다. 이러한 비제한적인 실시예에서, 관찰된 계수에 대한 UV 조사 면적에 대한 높은 선형도(0.97 < R2 < 0.99)가 관찰되었으며, 검출 공간적 해상도는 약 100 ㎛ x 100 ㎛이거나 대략 100개 세포이었다. 예상치 못하게도, 본 발명은 단일 FFPE 조직 절편 내의 동적 범위의 5.5 로그(밑(base) 10)를 이용하여 800개 이하의 표적을 정량화학 위해 "바코딩-잠재성"을 제공한다.
실시예 2: 본 발명은 FFPE 조직 절편에서 신호 증폭 없이 단백질 발현을 정량화하고 보다 고차원의 표적 항원 다중화를 달성하기 위한 실질적이고 실현 가능한 접근법을 제공한다.
정량적인 다중화된 면역조직화학은, 체크포인트 차단이 종양 미세환경에 어떻게 영향을 미치는지 추가로 정의하는 시공간적 구조화 및 상호의존을 확인하는 독특한 능력을 갖고 있기 때문에, 종양학 내에서 큰 관심 분야로서 나타났다. 이러한 실시예는, FFPE 조직 절편 내의 표적 항원과 상호작용하는 광절단 가능한 올리고-태깅된 1차 항체를 사용하는 1-단계, 증폭-불포함 염색 방법을 기재하고 있다. 자외선(UV) 광을 이용한 조사를 적용하여, 올리고를 항체로부터 방출시키고, 후속해서 용리제 수집, 정량화, 및 항원 존재비에 상응하는 디지털 계수를 수행한다.
우선, 여러 가지 컨쥬게이션 방법을 조사하였으며; 이는, 주로 힌지 영역 중쇄에 안정하고 부위 특이적이며, 올리고뉴클레오타이드 대 항체의 화학량론적 비율의 측면에서 상대적으로 조절 가능한 시스테인 바이오컨쥬게이션 방법을 구축하였다.
다음으로, UV에 의해 유도된 절단 면적과 측정된 디지털 단백질 계수 사이의 관계를 확인하기 위해 선형 회귀 분석을 수행하였으며; 이로부터 높은 선형도(0.97 < R2 < 0.99)를 관찰하였으며, 이는 FFPE 조직 상에서의 이러한 다중화된 단백질 계수 방법과 연관된 기본적인 메커니즘/전제를 확인시켜 주었다.
컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드의 존재가 항체-항원 상호작용에 미치는 영향을 확인하기 위해, FFPE 조직 절편에서 동일한 조건 하에, 비변형된 항체에 대한 표지된 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 항체의 성능을 민감도, 특이성 및 신호 강도의 측면에서 비교하였다. 항체 성능과 표적 항원의 세포내 위치 사이의 관계를 확인하기 위해, 핵, 세포질 또는 막에 위치화된 항원을 표적화하는 항체를 선별하였다. 선별된 항체는 Foxp3, 히스톤 H3, P-S6(핵 항원), CD3, CD4, PD-1, CD45RO(세포질 항원) 및 PD-L1(막 항원)을 표적화하였다. 민감성의 측면에서, 일반적으로 "더 무거운" 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 항체(1개 항체 당 3개 또는 4개의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 가짐)가 비컨쥬게이션된 항체 또는 "더 가벼운" 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 항체(1개 항체 당 1개 또는 2개의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 가짐)와 비교하여 상당히 덜 민감한 것으로 확인되었다. 핵, 세포질 및 막 표적 항원에 걸쳐 민감성, 특이성 및 강도의 측면에서, 비컨쥬게이션된 또는 "더 가벼운" 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 항체 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
본 발명은, 면역치료 개입 이전 및 동안에 종양에서 면역 전망(landscape)을 포괄적으로 정의하기 위해, 실용적이고 실현 가능한 방법을 사용하여 절대 단백질 발현 수준을 측정하는 고도로 다중화된 단백질 프로파일링을 제공한다.
실시예 3: 본 발명은 FFPE 조직으로부터 공간 분해된, 다중화된 단백질 검출을 제공한다.
방법
항체 - 이 실시예 및 실시예 4 내지 6에서 사용된 항체는 "표적(클론 ID, 판매 회사))": H3(D1H2, CST), CD8(OTI3H6, Origene), CD4(SP35, Spring Bio), FOXP3(D2W8E, CST), B7-H3(D9M2L, CST), S6(54D2, CST), B7-H4(D1M8I, CST), Granzyme B(OTI4E4, Origene), Ki67(8D5, CST), PD-1(Nat105, Cell Marque), CD3(MRQ-39, Cell Marque), Vista(D1L2G, CST), Her2(29D8, CST), PR(D8Q2J, CST), ER(SP1, Spring Bio), EGFR(D38B1, CST), CD56(MRQ-42, Cell Marque), PD-L1(E1L3N, CST), CD45(2B11&PD7/26, Cell Marque), TIM-3(D5D5R, CST) 및 Pan Keratin(C11, CST), CD45RO(UCHL1, Cell Marque)를 포함할 수 있다.
편도선 현미경 검사 - 편도선 FFPE 블록(Amsbio)의 5 ㎛ 절편을 슬라이드 상에 마운팅하였다. IHC를 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 항원 회복을 프레셔 쿠커(pressure cooker)를 이용하여 수행하였다. 편도선 절편의 염색을 CD3 1차 항체 MRQ-39(토끼 mAb, Cell Marque) 및 Ki-67 1차 항체 8D5(마우스 mAb, CST)를 이용하여 수행하였다. 2차 인큐베이션을 Alexa594 표지된 염소 α 토끼(Life Tech.) 및 Alexa488 표지된 염소 α 마우스(Life Tech.)와 함께 수행하였다.
여기서, 슬라이드에 부착된 시료를 먼저 형광 항체를 사용하여 이미지화하고, 그런 다음 단백질의 발현을 시료로부터 디지털 계수하였다.
도 10 내지 도 14(상단)에 예시된 단계들과 유사한 단계들을 사용하였다. 선별된 ROI의 UV 절단에 의해, 전체 30-플렉스 디지털 프로파일링(nCounter® 계수)이 가능하였다.
결과
도 18은 초기에 Ki-67(세포 증식 마커; 녹색) 및 CD3(면역 세포 마커; 적색)의 2색 형광을 사용하여 이미지화된 편도선 시료의 전반적인 조직 형태를 구축하는 현미경 사진을 보여준다. 12개의 영역들(도 19에서 확대된 4개의 영역들을 포함함)에 걸쳐 분석된 다수의 표적들은 Ki-67 및 CD3 위치화에 대한 3개의 별개 프로파일들을 보여준다. 도 19는 도 18에 도시된 4개의 영역들에 대한 Ki-67 및 CD3에 대한 nCounter® 계수를 보여준다. 도 20은 도 18에 도시된 편도선 시료로부터의 12개의 관심 영역(ROI) 상에서 30-플렉스 올리고-항체 칵테일로부터의 예시적인 계수를 보여준다. 데이터를 (다양한 부가적인 대조군들을 검사할 수 있도록) 연속 절편들로부터 수득하였다. 도시된 바와 같이, 조직 시료 영역을 발현된 마커의 강도 및 동일성을 기반으로 분류할 수 있다. 예시적인 분류는 "CD3-농화된", "Ki67-농화된", "혼합된" 및 "결합 조직"으로 나타나 있다.
이들 데이터는, 본 발명이 복수의(여기서 적어도 30개의) 단백질 마커들의 공간 분해된 검출을 제공함을 보여준다. 사용되는 단백질 프로브(항체)의 수를 증가시킴으로써, 800개 이하의 상이한 단백질 마커들이 유사한 해상도로 검출될 수 있다.
실시예 4: 본 발명은 FFPE 조직으로부터 다중화된 단백질 검출 및 접근적 단일 세포 해상도를 제공한다.
방법
흑색종 현미경 검사 - 흑색종(림프절 유래) FFPE 블록(Asterand)의 5 ㎛ 절편을 슬라이드 상에 마운팅하였다. IHC를 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 항원 회복을 프레셔 쿠커를 이용하여 수행하였다.
여기서, 시료를 먼저 형광을 사용하여 이미지화하고, 그런 다음 단백질의 발현을 시료로부터 디지털 계수하였다.
도 10 내지 도 14(상단)에 예시된 단계들과 유사한 단계들을 사용하였다.
결과
도 21은 초기에 CD3(적색), CD8(녹색) 및 DAPI(청색)의 3색 형광을 사용하여 이미지화된 림프절의 흑색종 시료에서 T 세포의 전반적인 조직 형태를 구축하는 현미경 사진을 보여준다. 백색 원형은 직경이 25 ㎛이고 3개의 세포들을 둘러싸고 있다.
도 22는 FFPE 림프절 조직 절편(5 ㎛ 두께)으로부터의 CD3 컨쥬게이트 방출의 nCounter® 데이터를 UV 조사 면적(100 ㎛ 내지 1 mm 직경)의 함수로서 보여준다. 검출 계수의 한계(LOD = 백그라운드 계수 + 2x 표준 편차)는 26 ㎛ 직경의 공간적 해상도에 상응한다. 필드 조리개 크기는 도면 아래에 나타나 있다. 도 23 및 도 24는 (각각 동일한 실험으로부터의) CD45 및 PD1에 대한 데이터를 보여준다.
데이터는 약 1개 내지 4개의 세포에 상응하는 본 발명의 공간적 검출 능력을 보여준다.
실시예 5: 본 발명은 임상적으로 관련된 검정법에서 정량적인 성능을 제공한다.
방법
도 10 내지 도 14(상단)에 예시된 단계들과 유사한 단계들을 사용하였다.
유방암 조직 마이크로어레이(TMA): US Biomax, Inc.사로부터 수득한 TMA BR1504a, US Biomax 웹사이트(www.biomax.us/tissue-arrays/Breast/BR1504a)로부터 수득한 H&E 염색 이미지. 도 25의 좌측 패널에 도시된 절편과 동일한 블록으로부터의 절편을 Her2 1차 항체 29D8(토끼 mAb, CST) 및 Alexa594 표지된 염소 α 토끼(Life Tech.)로 염색하였다. 계수를 또한, 히스톤 H3, 리보좀 단백질 S6, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 마우스 IgG 아이소타입 대조군 및 토끼 IgG 아이소타입 대조군(데이터는 도시되지 않음)에 대해서도 수득하였다. TMA BR1504a에 대한 Her2 병리학 점수는 US Biomax, Inc.(www.biomax.us/tissue-arrays/Breast/BR1504a)에 의해 제공되었다. 염색을 Her2 1차 항체 29D8(토끼 mAb, CST) 및 Alexa594 표지된 염소 α 토끼(Life Tech.)를 이용하여 수행하였다. 다른 토끼 1차 항체들이 1차 칵테일에 사용되긴 하였지만, 이들 항체로부터의 형광은 Her2 형광과 비교하여 무시할 만하였다. 픽셀 강도 합계(λ = 594에서)를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수득하였다. 이를 위해, 백그라운드 값을 강도 = 0으로 설정하고, 최고 강도를 강도 = 255로 설정하였다. 1개 ROI 당 모든 픽셀 강도들의 합계가 나타나 있다.
여기서, 시료를 먼저 형광을 사용하여 이미지화하고, 그런 다음 단백질의 발현을 시료로부터 디지털 계수하였다.
결과
도 25(좌측 패널)는, IHC 염색에 의해 Her2 형광을 확인하는 현미경 사진(중앙 패널)에 나타난 바와 같이 가변적인 수준의 Her2 단백질을 함유하는 유방 종양 조직의 조직 마이크로어레이(TMA)를 보여준다. 우측 패널은 중앙 패널의 단일 영역의 확대도를 보여주고; 이러한 영역은 다중화된 항체 칵테일로 염색되었다.
도 26은 48개의 대표적인 영역들에 대한 nCounter® 계수 데이터 대 Her2 상태(ASCO-CAP 가이드라인)를 보여준다. 도 27은 상기 언급된 48개의 영역들에 대한 nCounter® 계수 대 픽셀 강도 합계(x103)를 그래프로 나타낸 것이다.
이들 디지털 계수 데이터는 ASCO-CAP 가이드라인을 통한 시각적인 Her2 상태 점수(R2 = 0.51, 도 26)와 비교하여 형광 강도(R2 = 0.92, 도 27)의 높은 상관관계를 보여준다.
실시예 6: 본 발명은 조직 시료에서 특이적인 세포 유형의 존재비를 보여준다.
도 10 내지 도 14 (상단)에 예시된 단계들과 유사한 단계들을 사용하였으며; 슬라이드에 부착된 흑색종 시료를 먼저 형광을 사용하여 이미지화한 다음, 단백질의 발현을 시료로부터 디지털 계수하였다.
도 28은 CD3(면역 세포 마커; 적색) 및 DAPI(세포 핵; 청색)의 2색 형광을 사용하여 흑색종 시료의 전반적인 조직 형태를 구축하는 현미경 사진을 보여준다. 30개의 항체 칵테일을 사용한 발현 데이터를 백색 상자로 표시한 10개의 영역들로부터 수득하였다. 도 29는 도 28에 도시된 흑색종 시료로부터의 10개의 관심 영역(ROI)들에 대한 30-플렉스 올리고-항체 칵테일로부터의 예시적인 nCounter® 계수를 보여준다. 13개의 마커들에 대한 계수가 나타나 있으며, 각각의 마커는 백그라운드보다 높은 발현 계수를 갖는다. "면역 침윤물-농화된"으로서 확인된 영역 5, 6 및 7은 T 세포 마커 및 T 세포 조절 마커의 발현을 가장 높게 갖는다.
이들 데이터는, 본 발명이 복수의(여기서는 적어도 30개의) 단백질 마커들의 공간 분해된 검출을 제공함을 보여준다. 사용되는 단백질 프로브(항체)의 수를 증가시킴으로써, 800개 이하의 상이한 단백질 마커들이 유사한 해상도로 검출될 수 있다.
실시예 7: 디지털 미러 장치(DMD)는 단일 세포를 조사할 수 있다.
도 30 및 도 31은, 디지털 미러 장치(DMD)를 사용한 UV 조사가 편도선 조직 시료 내 단일 세포를 조사할 수 있음을 보여주는 현미경 사진이다.
이들 데이터는, 본 발명이 DMD를 사용하는 경우, 단일 세포 해상도를 수행할 수 있음을 보여준다.
실시예 8: 겔 박스는 전체 시료를 조사할 수 있고, 전체 시료에 결합된 프로브로부터 신호 올리고뉴클레오타이드를 방출시킬 수 있다.
도 34: 전체 조직 또는 시료가 예를 들어 표준 실험실 UV 겔 박스에 의해 조사되는 일 실시형태를 보여준다. 여기서, FFPE 조직 슬라이드를 광 패널 상에 놓았으며, 왁스 펜(wax pen)을 사용하여, FFPE 조직을 덮는 완충제 용액(TBS)을 가두었으며, UV 광 노출(276 nm 내지 362 nm, 예를 들어, 302 nm; 약 5 mW/cm2)을 유리 슬라이드(1 mm 두께)를 통해 조직에 적용하였다. 데이터는, UV 노출한 지 약 1분 이내에, 대부분의 신호 올리고뉴클레오타이드가 FFPE 결합된 항체로부터 방출됨을 보여준다. 계수를 양성 대조군에 대해 정상화한다.
실시예 9: 현미경으로부터의 조사는 시료 내 관심 영역을 조사할 수 있고, 관심 영역에 결합된 프로브로부터 신호 올리고뉴클레오타이드를 방출시킬 수 있다.
도 35는 일부 조직 또는 시료가 예를 들어 현미경, 즉 현미경 하에서의 UV 절단에 의해 조사되는 일 실시형태(시간 적정 실험)를 보여준다. 이는 전체 시료가 조사되는 실시예 8의 실험과 대조적이다. 여기서, UV LED(365 nm에서)가 20x 대물렌즈에 의해 약 150 mW/cm2로 적용된다. UV 조사는 이전의 형광(약 590 nm 여기) 광시야 이미지에 의해 확인된 전체 조직 면적을 스캔한다. 1개 시야(FOV) 당 약 1초 이내의 UV 노출 시, 대부분의 신호 올리고뉴클레오타이드가 FFPE 결합된 프로브로부터 방출된다. 실시예 8의 겔 박스 실험을 공간 분해되지 않은 100% 방출 대조군으로서 이용하였다. 계수는 양성 대조군에 대한 정상화된 비율이다. 청색: 가변적인 길이의 노출 시간에 따른 현미경 데이터; 적색: 겔 박스 2.5분 노출 데이터. 현미경 장치의 배열을 보여주는 사진 및 도식도가 또한, 나타나 있다.
도 36은 신호 올리고뉴클레오타이드가, 폐 조직 시료에 결합된 균일하게 분포된 항-히스톤(H3) 항체로부터 방출됨을 보여준다. 조직을, 약 450 ㎛ x 330 ㎛ = 0.15 mm2 크기의 1개 시야(FOV) 당 1초의 UV(365 nm, 20x 대물렌즈를 이용하여 약 150 mW/cm2)에 노출시켰다. 유출물의 수집에 사용된 "마크로 부피"는 약 70 ㎕이었다. 이는 검출 한계를 (FOV / 5) 약 99 ㎛ X 99 ㎛까지 감소시키며, 수집 유출물은 약 5 ㎕이다. 그러므로, 이 실시예에서, 검출 한계는 약 10개 세포 X 10개 세포 니셰(niche)이다. 이들 데이터는, 항체 신호가 공간 분해된 조사 면적 FOV에 비례함을 보여주고, "마크로 유체공학(macro-fluidics)" 검출 한계(LOD)를 추정한다.
도 37은 일부 조직 또는 시료가 예를 들어 현미경, 즉 다수의 표적들에 대한 현미경 하에서의 UV 절단에 의해 조사되는 일 실시형태(조사 면적 적정 실험)를 보여준다. 조직 내 다수의 표적들: 2개의 양성 표적(히스톤 H3 및 리보좀 S6) 및 8개의 음성 표적들의 UV 절단이 나타나 있다. 오로지 1개의 음성 표적(Ox40)만이 높은 백그라운드를 나타내었다. 0, 1, 4, 9 및 16개의 시야로부터 수득한 데이터가 나타나 있다.
실시예 10: 관심 영역은 표지 기술에 의해 미리-확인될 수 있고, 그런 다음 관심 영역이 조사되고, 신호 올리고뉴클레오타이드가 미리-확인된 관심 영역에 결합된 프로브로부터 방출된다.
도 38은 조직(예를 들어 유방암 시료) 내 관심 영역이 우선 마커(여기서는 Her2)의 발현에 대해 확인되고, 그런 다음 이러한 관심 영역이 (예를 들어 UV에 의해) 조사되어, 결합된 프로브로부터 신호 올리고뉴클레오타이드가 방출되는 일 실시형태를 보여준다. 도시된 데이터는 2개의 위치들로부터 방출된, 2개의 표적들(여기서는 Her2 및 히스톤 H3)에 대한 신호 올리고뉴클레오타이드의 양을 비교하고 있으며: 하나의 관심 영역은 Her2+로 미리-확인되었으며, 나머지 관심 영역은 Her2-로 미리-확인되었다.
실시예 11: 유동 셀 내에 포매된 시료는 전체 시료뿐만 아니라, 조사되고 신호 올리고뉴클레오타이드가 방출되는 관심 영역으로부터의 용리물의 수집을 제공한다.
도 39는 조직이 유동 셀 내에 포매된 일 실시형태를 보여준다. 여기서, FFPE 조직은 주사기 펌프에 의해 조절되는 미세유체 유동 셀(높이가 100 ㎛인 9 mm 원형 챔버의 부피는 대략 25 ㎕임[유동 셀의 높이가 300 ㎛인 경우, 대략적인 부피는 75 ㎕임]) 내에 포매되었다. 유동 셀 내에서의 UV 절단은 1개의 면적(9개의 FOV)의 조사 및 용리, 그런 다음 또 다른 면적(9개의 FOV)의 조사 및 용리에 대한 용리 프로파일을 보여준다. 다수의 분획들에 대한 데이터가 나타나 있다. 실시예 10의 데이터와 마찬가지로, 여기서 관심 영역은 형광 표지된 마커의 발현에 대해 미리-확인되었다.
실시예 12: 관심 영역에 걸쳐 작은 홀을 포함하는 유동 셀 내에 포매된 시료는, 전체 시료로부터가 아닌, 조사되고 신호 올리고뉴클레오타이드가 방출되는 관심 영역으로부터의 용리물의 효율적인 수집을 제공한다.
도 40은, 조직이 작은 홀을 가진 유동 셀 내에 포매된 일 실시형태를 보여준다. 여기서, 용리는 관심 영역의 바로 위에서 발생한다. 유체 챔버 위의 0.4 mm 내지 1 mm 직경의 홀을 통해 용리물(예를 들어, 5 ㎕ 수집 부피)이 수집될 수 있다. 9-홀 포맷, 96-홀 포맷 및 12-홀 포맷(조직 마이크로어레이(TMA)용)을 시험하였다. 다수의 시야들을 조합함으로써 형광 이미지를 생성하였다. 장치의 배열을 보여주는 사진 및 도식도가 또한, 나타나 있다.
도 41a 내지 도 41c는, 작은 홀을 가진 유동 셀을 사용하는 실시형태가, 조직의 전체 표면으로부터 용리물을 수집하는 경우보다 상당한 신호 대 노이즈 개선을 가짐을 보여준다. 데이터는, 관심 영역 위의 홀을 통한 용리물의 수집이 신호-대-노이즈를 약 7배 증가시킴을 보여준다. 이러한 실시형태에서, 유체 유동 셀(25 ㎕ 챔버) 위의 1 mm 직경 홀을 사용하여, 용리물(5 ㎕ 분획)을 수집하였다. 다수의 분획들에 대한 데이터가 나타나 있다.
도 42a 내지 도 42c는 작은 홀(12개 또는 96개 홀 포맷)을 가진 유동 셀을 사용한 데이터이다. 데이터는, 관심 영역 위의 홀을 통한 용리물의 수집이 신호-대-노이즈를 약 7배 증가시킴을 보여준다. 이러한 실시형태에서, 시야 조사를 홀의 중심에 초점을 맞추었으며; 1개 홀 당 용리물의 부피는 5 ㎕이었다.
도 43a 및 도 43b는, 전체 조직 용리가 수행된 유동 셀로부터의 백그라운드 신호(도 43a; 실시예 11), 및 관심 영역 바로 위에서 용리가 발생한 유동 셀로부터의 백그라운드 신호(도 43b)를 비교한 데이터를 보여준다. 도 43a에 도시된 바와 같이, 도 43b에서 도시된 백그라운드와 비교하여 전체 조직 용리에 대해 더 높은 백그라운드가 존재한다. 부가적으로는, 도 43b는 유입-유동(in-flow) 셀과 비-유동(non-flow) 셀 인큐베이션 사이에 차이가 없음을 보여준다.
실시예 13: 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드는 단일 튜브/피펫, 복수의 튜브/피펫 또는 다중 튜브/피펫 어레이를 통해 선택될 수 있다.
도 44는 다중-관심 영역 흡인 실시형태를 위해 열린 표면을 이용한 용리물 수집을 보여주는 도식도이다. 여기서, 회전 밸브 선별과 함께 용리물의 흡인/분배를 위한 다중 튜브 어레이가 도시되어 있다. 도 47을 또한 참조한다.
도 45는 용리물 수집이 모세관(마이크로 흡인기)을 통해서 수행되는 일 실시형태를 보여주는 사진 및 도식도를 보여준다. 도 47을 또한 참조한다. 도 46a 및 도 46b는 용리물 수집이 모세관(마이크로 흡인기)을 통해서 수행되는 도 45의 실시형태의 데이터를 보여준다. 이러한 실시형태는 신호 대 노이즈의 급격한 개선을 가지며: 신호 대 노이즈 비율이 홀 용리를 통한 유동 셀과 비교하여 약 10배 증가하고, 신호 대 노이즈 비율이 전체 조직 용리와 비교하여 약 200배 증가한다. 여기서, LOD 면적은 대략 60 ㎛ x 60 ㎛이다.
실시예 14: 조사 능력 및 용리 능력을 둘 다 갖는 장치는 한정된 관심 영역으로부터 핵산 및/또는 단백질 발현 데이터를 효율적이고 정확하게 수득할 수 있다.
도 48은 조합된 모세관 및 렌즈를 통한 조사 및 유체 수집을 보여주는 도식도이다.
실시예 15: 단백질 발현은 단일 세포로부터 검출되고 정량화될 수 있다.
도 50은 본원에 기재된 방법 및 장치를 사용하여 단일 세포 또는 2개의 세포로부터 수득된 단백질 발현 데이터를 보여준다. 상단 패널에서, S6 단백질이 적어도 하나의 세포로부터 검출되고 정량화되며, 하단 패널에서, CD45 단백질이 적어도 하나의 세포로부터 검출되고 정량화된다.
실시예 16: 본원에 기재된 방법 및 장치는 공간 분해된, 다중화된 RNA 표적 및/또는 단백질 표적 발현의 정확하고 효율적인 검출 및 정량화를 제공한다.
계내 혼성화(ISH)를 수행하여 DNA 올리고-기반 프로브("RNA 프로브")를 내인성 RNA에 혼성화하였으며, 각각의 프로브는 표적-결합 도메인, 신호 올리고뉴클레오타이드 및 광절단 가능한 링커를 포함한다. 5 ㎛ FFPE HER2 3+ 유방 조직 절편을 자일렌에서 탈파라핀화하고, 단계별(graded) 에탄올에서 부분적으로 재수화하고, 70% 에탄올에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 절편을 40 ㎍/ml 프로테이나제 K에서 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 조직을 50% 포름아미드/2X SSC에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 2X SSC 중 1 nM 프로브, 40% 포름아미드, 1 mg/ml 효모 tRNA, 10% 덱스트란 설페이트 및 0.2% BSA의 용액에서 37℃에서 밤새 수화시켰다. 혼성화 후, 50% 포름아미드/2X SSC에서의 2번의 엄격한 세척을 각각 37℃에서 25분 동안 수행하였다. 절편을 TO-PRO®-3(Thermo Fisher Scientific) 형광 핵산 염색으로 염색하여, 조직 형태를 시각화하였다. 그런 다음, 디지털 마이크로미러 장치에 의해 유도된 집속 UV 광을 사용하여, 사용자-한정된 관심 영역(ROI) 내 프로브로부터 DNA 신호 올리고뉴클레오타이드를 절단하였다. 각각의 조직 절편에 있어서, 2개의 ROI들은 종양성 조직을 포함하였으며, 2개의 ROI들은 정상 조직을 포함하였고, 2개의 ROI들은 조직을 전혀 포함하지 않았다(조직학 슬라이드 자체). 절단 후, 신호 올리고뉴클레오타이드를 수집하고, nCounter® 분자 바코드에 혼성화한 다음, NanoString Technologies®의 nCounter® 시스템에 의해 디지털 계수하였다. H&E를 조직 절편 상에서 수행하여, 종양성 조직 ROI 및 정상 조직 ROI를 입증하였다.
연속 절편 상에서, 표준 면역조직화학(IHC)을 "단백질 프로브"를 사용하여 수행하였으며, 각각의 단백질 프로브는 표적-결합 도메인으로서 항체, DNA 신호 올리고뉴클레오타이드 및 광절단 가능한 링커를 포함하였다. 그런 다음, 절편을 항-토끼 Alexa 594 2차 항체 및 TO-PRO®-3(Thermo Fisher Scientific) 형광 핵산 염색으로 염색하여, 조직 형태를 시각화하였다. 그런 다음, 디지털 마이크로미러 장치(DMD)에 의해 안내된 집속 UV 광을 사용하여, 사용자-한정된 ROI 내 프로브로부터 DNA 신호 올리고뉴클레오타이드를 절단하였다. 각각의 조직 절편에 있어서, 2개의 ROI들은 종양성 조직을 포함하였으며, 1개의 ROI는 정상 조직을 포함하였고, 2개의 ROI들은 조직을 전혀 포함하지 않았다(조직학 슬라이드 자체). ROI들은 ISH 프로브 절단을 위해 선별된 ROI들과 매칭되었다. 절단 후, 단백질 표적으로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드를 RNA 표적으로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드와 혼합하였으며, 이들 모두를 상기 기재된 바와 같이 정량화하였다. H&E를 조직 절편 상에서 수행하여, 종양성 조직 ROI 및 정상 조직 ROI를 입증하고, ROI들이 ISH 조직과 IHC 조직 사이에 올바르게 매칭되었는지 입증하였다.
도 51은 동일한 종양 시료의 연속 절편들로부터 시료화된 ROI를 보여준다. 영역 1 내지 영역 4는 이 이미지에 나타나 있지 않으며, 그 대신 조직을 함유하지 않는 조직(음성 대조군 - "조직 무함유(no tissue)")의 일부로부터 취해졌다. 영역 5 내지 영역 8은 적은 수의 종양 세포를 함유하였다("정상 조직"). 영역 9 내지 영역 12는 많은 수의 종양 세포를 함유하였다("종양").
도 52는 이러한 검정법에 포함된 9개의 RNA 프로브들 중 6개에 대해 수득된 계수를 보여준다. 각각의 ROI에 있어서, UV 조사를 적용하기 이전에("-UV" 세트의 데이터), 및 플러스 UV 시료를 동일한 영역으로부터 수집하기 이전에("+UV" 세트의 데이터), 시료를 수집하였다. UV가 시료에 적용되지 않았을 때 계수의 백그라운드 수준을 수득하며; 따라서, 수득된 신호의 UV-의존성을 보여준다. +UV이지만 조직에 안내되지 않은 ROI들(즉, ROI 1 내지 4 - "조직 무함유")은 백그라운드 계수를 제공하였다. 주로 정상 조직인 영역(즉, ROI 5 내지 8 - "정상 조직")은 HER2 프로브에 대해 낮은 계수를 제공하였다(그래프 상의 오렌지색 막대). 주로 종양 조직인 영역(즉, ROI 9 내지 12 - "종양")은 HER2에 대해 더 높은 계수를 제공하였다. 유사하지만 덜 급격한 증가가 리보좀 S6 프로브에 대해서 나타났다(그래프에서 녹색 막대). 이러한 조직 유형에서 고도로 발현될 것으로 예상되지 않은 부가적인 대조군 프로브 표적화된 RNA는, 정상 조직과 종양 조직 사이에서 차별적인 수준을 보여주지 않는 일관된 계수를 제공하였다. 이들 대조군 프로브는 CD45, PSA(전립선-특이적 항원) 및 2개의 독특한 ERCC 서열들을 표적화하도록 설계되었다. 명확하게 하기 위해, 도 53은 도 52에 도시된 데이터의 평균 및 표준 편차를 보여준다.
이들 RNA 프로브 시료를 또한, 종양 시료의 시료 영역을 분석하는 단백질 프로브와 동시적으로 진행시켰다. 이를 위해, RNA 프로브 및 단백질 프로브를 nCounter® 분자 바코드에 동시적으로 혼성화하고, NanoString Technologies®의 nCounter® 시스템에 의해 디지털 계수하였다. 이러한 검정법에 대한 계수는 도 54에 나타나 있다. HER2 RNA 프로브 계수(상단 그래프에서 적색 막대)의 증가 및 단백질 프로브 계수(하단 그래프에서 적색 막대 및 오렌지색 막대)의 증가는 정상 영역과 비교하여 종양 영역에서 나타난다. 오로지 +UV 시료만 나타나 있다. 상기 기재된 바와 같이 -UV 대조군 시료들은 ("조직 무함유" 계수와 유사한) 백그라운드 계수를 제공하였기 때문에, 이 그래프에 나타나 있지 않다. ROI 6 및 ROI 8은, 매칭 단백질 프로브 시료가 수득되지 않았기 때문에 이 분석에서 누락되었다. 따라서, 단백질 프로브로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드 및 RNA 프로브로부터의 신호 올리고뉴클레오타이드는 함께 검출되고 정량화될 수 있다.
실시예 17: 부분 이중 가닥 프로브는 단일 가닥 프로브와 비교하여 더 높은 신호-대-노이즈 비율을 가진다.
실시예 16에 기재된 바와 같이 DNA 프로브(mRNA를 인지하고 결합함)를 5 ㎛ FFPE 조직 내 RNA에 계내 혼성화하였다. UV 절단을, 별도의 슬라이드 상에 마운팅된 전체 조직 절편 상에서, 2X SSC + 0.1% Tween 20에서 UV 광 박스(겔 박스)를 사용하여 3분 동안 수행하였다. 신호 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 방출 후, 이러한 신호 올리고뉴클레오타이드를 피펫에 의해 수집하였으며, 실시예 16에서와 같이 검출하였다. 단일 가닥 DNA 프로브, 부분 이중 가닥 DNA 프로브 및 무(no)프로브 대조군 계수가 도 55(상단 그래프)에서 HER2 3+ 유방 조직 및 편도선 조직에 대해 나타나 있다. 계수를 평균 백그라운드 계수(평균 ERCC 계수)로 나누어서 신호-대-노이즈 비율을 확인하였다; 도 55, 하단 그래프를 참조한다.
실시예 18: 연어 정자 DNA의 첨가는 프로브 혼성화를 개선한다.
상기 기재된 바와 같이 DNA 프로브(mRNA를 인지하고 결합함)를 5 ㎛ FFPE 조직 내 RNA에 계내 혼성화하였다. 혼성화 동안, 1 mg/ml 초음파처리된, 변성된 연어 정자 DNA를 효모 tRNA 대신에 사용하였다. 슬라이드를, 2X SSC 중 1nM 프로브, 40% 포름아미드, 1 mg/ml 초음파처리된, 변성된 연어 정자 DNA, 10% 덱스트란 설페이트 및 0.2% BSA의 용액으로 혼성화하였다. UV 절단, 및 신호 올리고뉴클레오타이드 수집 및 검출을 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단일 가닥 DNA 프로브가 HER2 3+ 유방 및 편도선(도 56)에서 나타나 있다. 계수를 평균 백그라운드 계수(평균 ERCC 계수)로 나누어서 신호-대-노이즈 비율을 확인하였다.
실시예 19: PSA(전립선-특이적 항원) RNA 프로브는 고도로 특이적이다.
상기 기재된 바와 같이 DNA 프로브(mRNA를 인지하고 결합함)를 5 ㎛ FFPE 전립선 절편 내 RNA에 계내 혼성화하였다. 1시간 동안의 에탄올 인큐베이션 대신에, 97℃에서 MES에서의 10분간의 인큐베이션을 사용하였다. UV 절단, 신호 올리고뉴클레오타이드 수집 및 검출, 및 신호-대-노이즈 비율 계산을 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였다. 계수 및 비율을 도 57에 나타낸다.
실시예 20: 프로브의 특이성은 비(non)표준, 서브-nM 농도에서 증가한다.
전형적으로, RNA를 인지하는 데 사용되는 계내 혼성화(ISH) 프로브들을 5 nM 내지 200 nM에서 혼성화한다. 놀랍게도, 본 발명의 핵산 인지 프로브는 0.2 nM 또는 그 이하에서 최상으로 거동하였으며, 이는 표준 ISH 프로브 농도보다 25배 내지 1,000배 더 낮은 농도이다.
상기 기재된 바와 같이 DNA 프로브를 FFPE HER2 3+ 유방 시료의 5 ㎛ 절편 내 RNA에 계내 혼성화하였다. 프로브를 5 nM, 1 nM, 0.2 nM 및 0.4 nM에서 사용하였다. UV 절단, 신호 올리고뉴클레오타이드 수집 및 검출, 및 배수 변화 계산을 실시예 17에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 58은, 프로브 농도를 감소시킴에 따라 계수가 감소하였음을 보여준다(상단 그래프). 그러나, 예상치 못하게도, 양성 프로브 계수를 음성 프로브 계수와 비교한 경우, 프로브를 서브-nM 농도에서 혼성화한 경우, 신호-대-노이즈에서 상당한 획득이 존재하였다.

Claims (53)

  1. (1) 시료 내 적어도 하나의 세포에서의 또는 세포로부터의 적어도 하나의 핵산 표적을, 표적-결합 도메인 및 신호 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계;
    (2) 신호 올리고뉴클레오타이드를 방출시키기에 충분한 힘을 시료의 위치에 제공하는 단계; 및
    (3) 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드를 수집하고 확인하여, 힘이 제공된 시료의 특정 위치에서의 또는 특정 위치로부터의 적어도 하나의 핵산 표적을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 검출 단계가 적어도 하나의 핵산 표적의 동일성(identity) 및 존재비(abundance)를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 표적이 적어도 2개의 별개 핵산 표적, 또는 동일 핵산 표적의 적어도 2개의 복사체를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 검출 단계가 각각의 별개 핵산 표적의 존재비를 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 시료의 적어도 제2 특정 위치 상에서 적어도 단계 (2) 및 단계 (3)을 반복하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 특정 위치가 적어도 제2 세포를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 검출 단계가, 특정 위치에서의 또는 특정 위치로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비와, 적어도 제2 특정 위치에서의 또는 제2 특정 위치로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비를 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 세포 및 적어도 제2 세포가 동일 세포 유형인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 세포 및 적어도 제2 세포가 별개 세포 유형인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 검출 단계가, 제1 세포 유형에서의 또는 제1 세포 유형으로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비와, 적어도 제2 세포 유형에서의 또는 제2 세포 유형으로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비를 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1 세포 유형 및 적어도 제2 세포 유형이 독립적으로 정상 세포 및 비정상 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포가 표면에 직접 고정되거나, 적어도 하나의 다른 세포를 통해 표면에 간접 고정되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 시료가 2 ㎛ 내지 1,000 ㎛ 두께의 조직 절편(tissue section)인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 조직 절편이 포르말린-고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 시료로부터 수득되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포가 배양된 세포, 1차 세포, 또는 외식편으로부터 해리된 세포인 방법.
  15. 제12항 또는 제14항에 있어서, 적어도 하나의 세포가 고정되거나 비고정되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포가 단계 (2) 이전에 염색 또는 표지되어, 그 염색된 또는 표지된 세포에서 세포내(subcellular) 구조, 세포 구조 또는 조직-관련 구조의 시각화를 허용하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로브가 표적-결합 도메인과 신호 올리고뉴클레오타이드 사이에 위치한 링커를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 올리고뉴클레오타이드가 단일 가닥 핵산 또는 부분 이중 가닥 핵산인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 네거티브 정제(negative purification)가, 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드로부터 온전한 프로브 분자를 제거하는데 이용되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 네거티브 정제가, 온전한 프로브를, 이 온전한 프로브의 일부와 상보적인 고정된 올리고뉴클레오타이드, 또는 상기 온전한 프로브의 일부를 인지하고 그 일부에 결합하는 고정된 항체 또는 단백질-결합 모티프와 접촉시키는 단계를 포함하는 친화성 정제(affinity purification)를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 온전한 프로브의 표적 결합 도메인이, 고정된 올리고뉴클레오타이드에 부분적으로 상보적이거나, 또는 고정된 항체 또는 단백질-결합 모티프에 의해 인지 또는 결합될 수 있는 유니버셜 정제 태그 또는 서열을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 절단 가능한 링커를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 절단 가능한 링커가 광절단 가능한 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제공되는 힘이 광(light)인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 광이 arc-램프, 레이저, 집속 UV 광원 및 발광 다이오드(LED)로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원에 의해 제공되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 광이 적어도 하나의 세포의 적어도 하나의 세포내 구조에 조사되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계가, 적어도 하나의 세포의 적어도 하나의 세포내 구조에서의 또는 세포내 구조로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 제5항에 있어서, 힘이 arc-램프, 레이저, 집속 UV 광원 및 발광 다이오드(LED)로부터 선택되는 광원에 의해 제공되는 광이고, 광원이 적어도 하나의 세포에서의 적어도 하나의 세포내 구조 및 적어도 제2 세포에서의 적어도 하나의 세포내 구조에 조사되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 검출 단계가, 적어도 하나의 세포의 적어도 하나의 세포내 구조에서의 또는 세포내 구조로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비와, 적어도 제2 세포의 적어도 하나의 세포내 구조에서의 또는 세포내 구조로부터의 적어도 하나의 핵산 표적의 존재비를 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적-결합 도메인이 단일 가닥 핵산 또는 부분 이중 가닥 핵산을 포함하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계가 중합효소 반응, 역전사효소 반응, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이로의 혼성화, 질량 분석법, 형광 분자 비콘(beacon)으로의 혼성화, 시퀀싱 반응 또는 nCounter® 분자 바코드(Molecular Barcode)를 포함하는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 표적이 DNA 또는 RNA인 방법.
  33. 제32항에 있어서, RNA가 cRNA, mRNA 또는 miRNA인 방법.
  34. 제32항에 있어서, DNA가 cDNA인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 올리고뉴클레오타이드가, 시료와 이 시료 위에 위치한 유체 장치 또는 불투과성 장벽 사이에 25 ㎛ 내지 500 ㎛의 깊이를 갖는 채널에서의 액체 층류, 난류 또는 천이 유동을 통해 시료로부터 수집되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 방출된 신호 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 세포에 근접한 용액으로부터 수집되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 근접 용액이 적어도 하나의 세포의 적어도 바로 위에 존재하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 근접 용액이 흡인에 의해 수집되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 흡인이 피펫, 모세관 튜브, 마이크로어레이 핀 및/또는 홀을 포함하는 유동 셀에 의한 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 모세관 튜브가, 적어도 하나의 세포에 광력(light force)을 투과시킬 수 있는 광학 장치를 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 광력이 UV 광인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 피펫 또는 마이크로어레이 핀이 복수의 피펫 또는 마이크로어레이 핀을 포함하는 어레이에 부착되는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 근접 용액이 음이온성 중합체, 바람직하게는 덱스트란 설페이트 및/또는 연어 정자 DNA를 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 수집된 신호 올리고뉴클레오타이드가 음이온성 중합체, 바람직하게는 덱스트란 설페이트 및/또는 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에 첨가되는 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 레이저 주사 장치를 사용하여 관심 영역을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 디지털 미러 장치(DMD)를 사용하여 관심 영역을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 시료의 동시적인 공간 분해(simultaneous spatially resolved) DNA, RNA 및/또는 단백질 검출을 제공하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 디지털 판독이 5 로그 초과의 선형 동적 범위를 포함하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 슬라이드에 부착되고, 먼저 형광을 사용하여 이미지화되고, 이어서 단백질 및/또는 핵산의 발현이 시료로부터 디지털 계수되는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브가 5 nM 이하의 농도로 제공되는 것인 방법
  51. 제50항에 있어서, 프로브가 1　nM 이하의 농도로 제공되는 것인 방법
  52. 제51항에 있어서, 프로브가 0.4　nM 이하의 농도로 제공되는 것인 방법
  53. 제52항에 있어서, 프로브가 0.2　nM 이하의 농도로 제공되는 것인 방법.
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