KR20180100546A - Parp 저해제를 이용한 소-세포성 폐암의 치료 방법 - Google Patents

Parp 저해제를 이용한 소-세포성 폐암의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리(ADP-리보스)중합효소 (PARP) 저해제 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 이용하여 Schlafen-11 (SLFN11)을 발현하는 소-세포성 폐암을 가진 개체를 치료하는 방법을 개시한다. 보다 상세하게는, 본 방법은 개체 유래의 종양 세포 샘플에서 SLFN11을 검출하는 단계; 및 팔라조파립 또는 팔라조파립의 토실레이트 염과 같은 PARP 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

PARP 저해제를 이용한 소-세포성 폐암의 치료 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2015년 10월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/246,538 "PARP 저해제를 이용한, 소-세포성 폐암의 치료 방법"에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 명세서는 PARP 저해제 또는 탈라조파립 (talazoparib) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 이용한 Schlafen-11 (SLFN11)을 발현하는 소-세포성 폐암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 개시한다.
소-세포성 폐암 (SCLC)은 폐암의 공격적인 서브타입으로서, 미국에서 전체 폐암의 대략 15%를 차지한다. SCLC는 세포 경계가 명확하지 않고 최소한의 세포질을 가지며 핵이 거의 없는 미세한 과립상의 염색질을 가진 소형 세포가 특징적이다. 이 질병의 공격적인 특성, 낮은 조기 진단율 및 효과적인 치료법 결여로 인해, 일반적으로 예후가 좋지 않다. 치료받지 않은 SCLC 환자의 진단 후 평균 생존 기간은 2-4개월에 불과하다. 화학요법 및/또는 방사선 요법을 이용하는 경우, SCLC 환자들에서 초기 반응율은 높지만 (대략 60 내지 80%), 대부분의 치료받은 환자들에서 재발하여, 이후 추가적인 전신 요법에 대부분 불응성이 된다. 그래서, 현 치료 요법을 이용하더라도, 제한기의 환자는 평균 생존 기간이 16-24개월이고, 확장기의 환자는 평균 생존 기간이 7-12개월이다. 환자 생존율을 개선하기 위해서는, 종양에 민감한 화학요법제로 환자를 치료하는 것이 필수적이다. SCLC 치료시 타겟 약물을 사용하는 것이 아직 충족되지 못한 주요한 의학적 과제로 남아있다. 비-소 세포성 폐암 (NSCLC)과 달리, 이 질병에 걸린 환자들에서 효능이 입증된 타겟 요법은 현재 존재하지 않는다. 따라서, 환자의 개인별 유전자 프로파일에 기반한 적절한 치료법을 SCLC 환자에 맞게 조정할 필요가 있다. 주어진 종양의 유전자 프로파일에 대한 이해 역시 조기 진단, 검출 및 치료 선택을 가능하게 해 줄 것이다.
증가된 SLFN11 발현이 토포이소머라제 저해제, 알킬화제 및 DNA 손상 물질에 대한 SCLC 세포의 감수성 증가와 양 (positive)의 상관관계를 가진 것으로 보고된 바 있다. Zoppoli et al., PNAS USA 2012, 109(37), 15030-15035; Zoppoli et al., Cancer Res. 2012, 72(8 Supplement): 4693을 참조한다. 폴리(ADP-리보스)중합효소 (PARP) 저해제는 항암 무기로 최근에 추가되었다. 특정 PARP 저해제는 촉매적 저해제로서 작용할 뿐만 아니라 PARP-DNA 복합체를 포획함으로써 PARP 독으로 작용한다 (Murai et al., Cancer Res. 2012: 72:5588-99). 탈라조파립 (BMN 673)은 종양 세포독성 및 PSRP 포획 활성 측면에서 지금까지 보고된 가장 강력한 PARP 저해제이다 (Shen et al., Clin . Cancer Res. 2013:19:5003-15; Murai et al., Mol . Cancer Ther . 2014:13:433-43). 탈라조파립은 생식 세포에 유해한 BRCA1/2 돌연변이를 가진 난소암 및 유방암 환자에서 현저한 임상 활성을 나타내었다 (De Bono et al., ASCO 2013, Abstract 2580). 그러나, BRCA 돌연변이가 PARP 저해제에 대한 SCLC의 높은 감수성을 예측하는 것으로 입증된 바 없다. 탈라조파립에 대한 항종양 반응은 SCLC 환자들에서도 발표되었다 (Wainberg et al., ASCO 2014, Abstract 7522). 이전 실험들에서, SCLC에서 탈라조파립 감수성과 관련있는 DNA 복구 단백질 마커들의 목록이 동정되었지만 (Cardnell et al., Clin . Cancer Res. 2013, 19(22), 6322-6328), 임상적으로 검증되진 않았다. 또한, NCI60 세포주 패널에 대한 시험관내 스크리닝을 통해, Schlafen 11 (SLFN11)의 발현 증가가 다양한 종양 세포주에서 탈라조파립 노출에 대한 세포 감수성 증가와 연관성이 있다는 것이, 밝혀졌다 (Murai et al., AACR 2014, Abstract 1718). 그러나, NCI60 패널에는 어떠한 SCLC-유래 세포주도 포함되어 있지 않으며, 그래서 어떤 구체적인 유전자 특징이 PARP 저해제 또는 탈라조파립에 대한 SCLC 세포의 감수성 증가와 연관되어 있는지에 대한 질문은 해명되지 않은 채 남아있다. 요컨대, SCLC 환자에서 PARP 저해제에 대한 응답성을 예측하는 검증된 유전자 프로파일은 존재하지 않는다. 이러한 결정 인자가 동정되면, PARP 저해제 또는 특히 탈라조파립에 대해 양호하게 반응할 수 있는 환자의 식별이 가능해질 것이다.
PARP 저해제를 이용하여 유전자 측면에서 감수성인 특정 SCLC 환자를 치료하는 방법에 대한 필요성이 남아있다. 나아가, SCLC에 대한 검증된, 임상적으로 관련된 바이오마커의 동정은 조기 검출과 적절한 치료학적 타겟팅을 가능케 할 것이다.
SCLC 세포주 38주로 구성된 콜렉션 연구를 통해, 탈라조파립의 단일-제제 치료에 대한 감수성이 다음과 같은 유전자들 각각의 발현과 밀접하게 연관되어 있다는 것이, 입증되었다: SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1. 시험관내 감수성 결과는 수종의 SCLC 세포주-유래 이종이식 (CDX) 모델에서 생체내에서 검증되었다. 특히, SCLC의 환자-유래 이종이식 (PDX) 샘플 12종을 이용한 생체내 실험에서, SLFN11 발현 (메신저 RNA 수준 및 단백질 수준 둘다에서)과 PARP 저해제 치료에 대한 종양의 감수성 간에 상관관계가 존재하는 것으로 드러났다.
이에, 본 발명은, 환자에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, SLFN11-, SIL1-, SLC25A3-, MAF-, AP3B1-, C1orf50-, BCL2-, DDX6- 및/또는 GULP1-양성 SCLC 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 SLFN11-양성 SCLC 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 환자에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, SLFN11-, SIL1-, SLC25A3-, MAF-, AP3B1-, C1orf50-, BCL2-, DDX6- 및/또는 GULP1-양성 SCLC 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 환자에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, SLFN11-양성 SCLC 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 환자에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, SLFN11을 발현하는 개체에서 SCLC를 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 개체에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, SLFN11을 발현하는 개체에서 SCLC를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 환자에게 PARP 저해제를 유효량으로 또는 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 발현하는 개체에서 SCLC를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면들에서, 개체는 SLFN11을 발현하며, 선택적으로 SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 발현한다.
또한, 본 발명은, 개체 유래의 종양 세포 샘플에서 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및 개체에 PARP 저해제를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 소-세포성 폐암 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체의 소-세포성 폐암 종양 샘플에서 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계를 포함하는, PARP 저해제 화학요법을 위한 소-세포성 폐암 개체를 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 선택적으로, 개체에게 PARP 저해제를 유효량으로 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은, 개체에서 SLFN11 발현을 검출하는 단계를 포함하는, PARP 저해제 화학요법을 위한 소-세포성 폐암 개체를 선별하는 방법에 관한 것으로서, 선택적으로 개체에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은, 개체 유래의 SCLC 종양 샘플에서 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계를 포함하는, 탈라조파립 화학요법을 위한 소-세포성 폐암 개체를 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 선택적으로 개체에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 측면에서, 본 방법은, 개체에서 SLFN11 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 탈라조파립 화학요법을 위한 소-세포성 폐암 개체를 선별하는 방법에 관한 것으로서, 선택적으로 개체에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 소-세포성 폐암을 앓고 있는 인간을 PARP 저해제로 치료하는 방법에 관한 것이다:
(a) 핵산-기반의 검출 분석을 수행하여, 인간 개체로부터 유래되는 생물 샘플의 세포에서 mRNA 발현을 검출함으로써, SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준을 검출하는 단계;
(b) 상기 인간 개체로부터 유래된 세포가 건강한 인간 대조군의 생물 샘플의 세포에서의 해당 유전자의 발현 수준 보다 더 높은 수준에서 상기한 하나 이상의 유전자를 발현하는 지를 확인하는 단계; 및
(c) 건강한 인간 대조군의 생물 샘플의 세포에서 해당 유전자의 발현 수준 보다 더 높은 수준으로 하나 이상의 유전자를 발현하는 인간 개체에게 PARP 저해제를 유효량으로 투여하여, 상기 인간 개체에서 소-세포성 폐암을 치료하는 단계.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인간 개체에서 SCLC를 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다:
(a) 핵산-기반의 검출 분석을 수행하여, 인간 개체로부터 유래되는 생물 샘플의 세포에서 mRNA 발현을 검출함으로써, SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준을 검출하는 단계;
(b) 상기 인간 개체로부터 유래된 세포가 건강한 인간 대조군의 생물 샘플의 세포에서의 해당 유전자의 발현 수준 보다 더 높은 수준에서 상기한 하나 이상의 유전자를 발현하는 지를 확인하는 단계; 및
(c) 건강한 인간 대조군의 생물 샘플의 세포에서 해당 유전자의 발현 수준 보다 더 높은 수준으로 하나 이상의 유전자를 발현하는 인간 개체에게 PARP 저해제를 유효량으로 투여하여, 상기 인간 개체에서 소-세포성 폐암을 치료하는 단계.
다른 측면에서, 본 발명은, 개체에서 SLFN11의 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 SCLC를 진단하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 선택적으로 개체에서 SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계를 더 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 환자에게 PARP 저해제를 유효량으로 또는 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, ATM 발현 수준 저하를 나타내는 소-세포성 폐암 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 개체에서 ATM 발현은 본원에 기술된 하나 이상의 검출 타겟과 더불어 검출된다. 다른 측면에서, 개체에서 ATM 발현은 감소된다.
본 발명의 부가적인 구현예들, 특징 및 이점들은 본 발명의 후술한 상세한 설명 및 실시를 통해 명확해질 것이다.
간결하게 하기 위해, 본 명세서에 인용된 특허 등의 간행물들의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 출원은 첨부된 도면과 더불어 하기 설명을 참조하여 이해될 수 있다.
도 1은 다양한 소-세포 폐암 (SCLC) 세포주에서 탈라조파립과 시스플라틴 감수성 간의 GI50 값 연관성을 예시한 것이다. 탈라조파립의 log10 스케일의 GI50 값은 x 축에, 시스플라틴의 GI50 값은 y 축에 나타낸다. 선형 회귀선이 도시되며, 스피어만 상관관계 및 p-값이 각각 R 및 P로서 나열된다.
도 2는 탈라조파립에 대한 세포주의 감수성을 예시한 것이다. 화살 표시가 없는 원은 5일간 실험한 세포주이고; 화살 표시가 첨부된 원은 7일간 실험한 세포주이다. 데이타 포인트의 크기는 log10(GI50)을 토대로 설정된다 (낮은 GI50 = 더 작은 크기의 원).
도 3A는 다양한 소-세포 폐암 주들에서 SLFN11 발현에 대한 로버스트 멀티-어레이 평균 (robust multi-array average, RMA) 스코어를 나타낸 것이다. RMA 스코어가 6 보다 큰 세포주 (라인 위, "고" RMA로 표시됨)와 RMA 스코어가 6 보다 작은 세포주 (라인 아래, "저" RMA로 표시됨)가 구분된다. 도 3B는 RMA 스코어의 고 또는 저에 따라 풀링한, 탈라조파립으로 처리된 세포주에서 최대 증식 저해 및 GI50의 상자그림을 도시한 것이다. 표시된 p-값은 ANOVA 검정에 기초한 것이다. 도 3C는 탈라조파립에 의한 최대 증식 저해에 따라 순위를 매긴 소-세포 폐암 (SCLC) 세포주의 워터폴 플롯을 도시한 것이다. 화살 표시가 없는 막대는 "고" RMA로 언급되는 세포주이고, 화살 표시가 있는 막대는 "저" RMA로 언급되는 세포주이다. 도 3D는 처리된 세포주에서 SLFN11 RMA 발현 스코어와 탈라조파립의 GI50 간의 상관관계를 도시한 것이다. 선형 회귀선이 도시되며, 스피어만 상관관계 및 p-값이 각각 R 및 P로 표시된다. 도 3E는 처리된 세포주에서 SLFN11 RMA 발현 스코어와 최대 증식 저해 간의 상관관계를 도시한 것이다. 선형 회귀선이 도시되며, 스피어만 상관관계 및 p-값이 각각 R 및 P로 표시된다.
도 4는 NCI SCLC 세포주 38주에서 탈라조파립 감수성과 관련있는 유전자 발현 특징을 도시한 것이다. 명목 p 값 < 0.001인 유전자는 표에서 박스로 강조 표시된다. 표 컬럼에는 유전자 명 = entrez 유전자 기호 (gene symbol); logFC = 감수성/내성 세포주 그룹들의 log 배수 변화; t = t 통계; P 값- = moderated t 검정에 기반한 명목 p 값; adj.P.val = FDR에 기초한 조정된 p 값. 박스 안에 강조 표시된 유전자들을 히트맵으로 도시하며, 히트맵에는 상위 유전자 9종을 이용한 계층적인 클러스터링이 도시된다. 히트맵 위의 바는 세포주 감수성 그룹을 표시한 것으로, "R"은 내성 그룹이고, "S"는 감수성 그룹이다.
도 5는 소-세포성 폐암 (SCLC) 세포주 12종에서 SLFN11 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. CCLE의 SLFN11 유전자 발현 데이타를 단백질 수준과 연관시키기 위해 블롯 아래 표에 열거한다.
도 6A, 6B 및 6C는 비히클 (삼각형), 시스플라틴 (원, 도 6A 및 6B) 및 탈라조파립 (BMN 673; 사각형)으로 처리된 NCI-H1048 (도 6A), NCI-H209 (도 6B) 및 NCI-H69 (도 6C) 소-세포 폐암 (SCLC) 이종이식체에 대한 경시적인 평균 종양 체적을 도시한 것이다.
도 7은 12종의 SCLC PDX 이종이식 모델에서의 평균 종양 체적에 대한 탈라조파립 매일 투여 효과 (베이스라인 대비 변화로 측정)를 도시한 것이다.
도 8A-8F는 비히클 (실선의 원) 또는 BMN 673 (점선의 삼각형)를 매일 투여한 후 부분 반응 (도 8A, 8B), 안정한 질환 (도 8C, 8D) 및 진행형 질환 (도 8E, 8F)을 가진 개개 동물의 종양 증식 곡선을 도시한 것이다.
도 9A는 12종의 PDX 이종이식 모델에 대한 단일 제제 탈라조파립 치료의 회귀 분석 결과를 도시한 것이다. 이 결과는 탈라조파립으로 치료한 진행형 질환 (PD, n = 6), 안정적인 질환 (SD, n = 3) 또는 부분 반응 (PR, n = 3)으로서 그룹핑된다. 대각선은 파지티브 값이고, 대각선이 없는 경우는 네거티브 값이다. 도 9B는 진행형 질환 (PD, n = 6), 안정적인 질환 (SD, n = 3) 또는 부분 반응 (PR, n = 3)을 나타내는 12종의 PDX 모델에서 탈라조파립 처리에 따른 SLFN11 단백질 발현을 도시한 것이다. 나타낸 p 값은 ANOVA 검사에 기초한다. 도 9C는 탈라조파립 치료에 따른 진행형 질환 (PD, n = 6), 안정적인 질환 (SD, n = 3) 또는 부분 반응 (PR, n = 3)에서 12종의 PDX 이종이식 모델에서의 RNA 서열분석 분석 (정규화 nominalized) 카운트 (log2))에 의한 SLFN11 발현을 도시한 것이다. 나타낸 p 값은 ANOVA 검사에 기초한다.
도 10A는 PDX 이종이식 모델의 PD, SD 및 PR 그룹들에서 ATM 단백질의 발현을 도시한 것이다. 도 10B는 RNA 서열분석에 의한 12종의 PDX 이종이식 모델에서의 ATM 발현을 도시한 것이다.
도 11은 HRD 스코어와 탈라조파립 감수성 (GI50) 간의 상관성을 도시한 것이다. 선형 회귀선이 도시되며, 스피어만 상관관계 및 p-값이 각각 R 및 P로 표시된다.
본 발명을 추가로 기술하기에 앞서, 본 발명은 기술된 구체적인 구현예들로 한정되지 않으며, 물론 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어들은 단순히 구체적인 구현예를 기술하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 첨부된 청구항으로만 제한되므로 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
일 측면에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 SLFN11을 발현하는 개체에서 소-세포성 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 SLFN11을 발현하는 개체에서 소-세포성 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 개체의 SCLC 종양 샘플에서 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및 개체에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 PARP 저해제 화학요법을 위한 소-세포성 폐암 개체를 선별하는 방법에 관한 것이다. 선별 방법에 대한 일부 구현예에서, SLFN11을 검출한다.
일부 구현예에서, 개체는 SLFN11을 발현한다. 다른 구현예들에서, 개체는 SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 발현한다. 일부 구현예에서, 개체는 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 증가된 발현 수준으로 가진다. 일부 구현예에서, 개체는 ATM을 발현한다. 다른 구현예들에서, 개체는 낮은 ATM 발현 수준을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 개체는 TP53 및/또는 RB1 돌연변이를 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 언급된 검출 단계는 ATM을 검출하는 단계 또는 ATM 발현의 감소된 수준을 검출하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 개체에서 SLFN11에 대한 RMA 스코어는 4 이상, 또는 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 8 이상이다. RMA 스코어는 특히 본원의 실시예에 기술된 방법을 이용함으로써 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 기초하여 결정된다.
일부 구현예에서, 개체는 40 이하, 35 이하, 30 이하, 25 이하 또는 20 이하의 Myriad HRD 스코어를 가진다. Myriad HRD 스코어의 결정은 상업적으로 구입가능한 검사 키트를 선택적으로 사용하여 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 달성된다.
본 발명의 방법에 대한 일부 구현예에서, 개체는 진행성 SCLC를 앓는 개체이다. 다른 구현예들에서, 개체는 시스플라틴 또는 카보플라틴과 같은 백금 약물로, 선택적으로 에토포시드와 조합하여 기존에 치료받은 적이 있거나, 또는 현재 치료 중인 개체이다.
일부 구현예에서, PARP 저해제는 PARP 활성을 저해하는 임의의 화합물이다. 다른 구현예들에서, PARP 저해제는 탈라조파립, 올라파립, 루카파립, 벨리파립, CEP9722, MK4827 또는 BGB-290, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 다른 구현예들에서, PARP 저해제는 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 추가적인 구현예들에서, PARP 저해제는 탈라조파립의 토실레이트 염이다. 탈라조파립은 아래에 나타낸 구조를 가진다:
Figure pct00001
일부 구현예에서, 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 약 25 내지 약 1100 ㎍/day, 또는 1일 당 약 0.5 내지 약 2 mg, 또는 약 1 mg/day, 또는 약 0.10-0.75 mg/kg/day, 또는 약 0.25-0.30 mg/kg/day의 용량으로 경구로 매일 1회로 투여된다. 본원에 제시된 투여량 수치는 탈라조파립의 유리 염기 형태의 용량을 지칭하거나, 또는 투여되는 탈라조파립 염 형태의 유리 염기 당량으로서 계산된다. 예를 들어, 탈라조파립 토실레이트의 투여량 1 mg은 탈라조파립의 유리 염기 당량 1 mg에 해당되는 함량의 탈라조파립 토실레이트를 의미한다.
일부 구현예에서, PARP 저해제는 한가지 이상의 화학요법, 수술 및/또는 방사선 치료와 조합하여 투여된다. 다른 구현예들에서, 하나 이상의 화학요법은 DNA 손상제 (DNA damaging agent), 테모졸로미드 (temozolomide), 토포이소머라제 1 저해제 (topoisomerase 1 inhibitor), 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan), 토포이소머라제 2 저해제, 에토포시드 (etoposide), 엔잘루타미드 (enzalutamide), ATR 저해제, EGFR 저해제, 백금 약물 (platinum drug), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin) 또는 에토포시드 (etoposide)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 면역조직학적 분석, 면역조직화학적 염색 (IHC) 분석, in-situ LC/MS 분석, 프로모터 메틸화 분석, 세포학적 분석, mRNA 발현 분석, RT-PCR 분석, 노던 블롯 분석, 단백질 발현 면역흡착 분석 (ELISA), 효소-연계된 면역스팟 분석 (ELISPOT), 측면 유동 검사 (lateral flow test) 분석, 효소 면역분석, 형광 편광 면역분석, 화학발광 면역분석 (CLIA) 또는 형광 활성화된 분류 분석 (FACS)에 의해 검출된다.
일부 구현예에서, 개체 유래의 테스트 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용해 결정되며, 각각의 바이오마커의 발현 수준은 정상 샘플 또는 표준 샘플내 대응되는 바이오마커의 발현 수준과 비교된다. 일부 구현예에서, 정상 샘플 또는 표준 샘플에서의 수준과 비교해 테스트 샘플의 증가된 발현 수준은, 이 개체가 PARP 저해제 요법에 반응할 가능성이 있다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 증가된 발현 수준은 PARP 저해제 요법에 대한 반응성을 의미하며, 여기서 하나 이상의 유전자 또는 단백질은 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예들에서, 한가지 유전자 또는 단백질은 SLFN11이다.
달리 언급되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어와 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 바와 유사 또는 등가의 임의 방법 및 물질들이 본 발명을 실시 또는 테스트하는데에도 사용될 수 있지만, 이하 바람직한 방법 및 물질을 기술한다. 본원에 언급된 모든 간행물들은, 간행물에 인용된 방법 및/또는 물질을 개시 및 기술하기 위해, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구항에서, 단수형 "a", "an" 및 "the"은 내용상 명백하게 상충되지 않은 한 복수의 언급도 포함함에 주목하여야 한다. 또한, 청구항이 임의의 선택 요소를 배제하는 것으로 작성될 수 있다는 것도 주목한다. 이와 같이, 이러한 기술은 청구항 요소들의 언급과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같이 배타적인 용어 또는 "네거티브" 제한을 적용하기 위한 선행 기준으로서 작용하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "비롯하여", "함유하는" 및 "포함하는"은 개방된, 비-제한적인 의미로 사용된다.
보다 간결한 설명을 제공하기 위해, 본원에 제시된 일부 정량적인 표현에는 용어 "약"이 부가되지 않는다. 용어 "약"이 명확하게 사용되거나 또는 사용되지 않든 간에, 본원에 제시된 모든 값은 실제 제시된 값을 의미할 뿐만 아니라, 또한 이러한 제시된 값에 대한 실험적 및/또는 측정 조건에 따른 등가치 및 대략치를 비롯하여, 당해 기술 분야의 당업자가 합리적으로 추론할 수 있는 제시된 값에 대한 대략치도 언급하는 의미로 이해된다. %로 제시된 농도는 달리 언급되지 않은 한 중량 비율을 의미한다.
본원에서, "개체"는 영장류 (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류 (예, 마우스 또는 랫), 기니아피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼 및 소와 같은 모든 포유류 등의 동물, 또는 인간을 의미한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 다른 구현예들에서, 개체는, 현재 흡연자 또는 기존에 흡연자였던 개체 등의, SCLC 발병 고-위험성으로 간주될 수 있는, 인간이다. 특정 구현예에서, 개체는 SCLC를 앓고 있거나, 또는 진단된다. 본원에서, "개인"은 개체 또는 환자를 지칭한다. 건강한 또는 정상 개체는, 대상 질환 또는 병태 (예, 폐 질환, 폐-관련 질환 또는 기타 폐 병태 등)를 통상적인 진단 방법에 의해 검출할 수 없는, 개체이다.
"생물 샘플", "샘플" 및 "테스트 샘플"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 폐암 또는 (예, 심각한 흡연자와 같이 개인 이력 또는 가족력에 기초하여) 폐암 위험이 있는 포유류로부터 분리된 샘플 등의, 개체로부터 분리된 임의의 장기, 조직, 세포 또는 세포 추출물일 수 있다. 예를 들어, 샘플로는, 비-제한적인 예로, 폐암에 걸린 포유류로부터 분리된, 고형 폐 종양으로부터 유래된 세포 또는 조직 (예, 바이옵시 또는 부검), 가래, 기침 (cough), 기관지폐포 세척액, 기관지 브러싱물 (bronchial brushing), 볼 점막, 말초혈, 전혈, 적혈구 농축액 (red cell concentrate), 혈소판 농축액, 백혈구 농축액, 혈액 세포 단백질, 혈액 혈장, 혈소판-풍부 혈장 (platelet-rich plasma), 혈장 농축물, 혈장의 임의 분획의 침강물 (precipitate from any fractionation of the plasma), 혈장의 임의 분획의 상층물 (supernatant from any fractionation of the plasma), 혈액 혈장 단백질 분획 (blood plasma protein fraction), 정제 또는 일부 정제된 혈액 단백질 또는 기타 성분, 혈청, 조직 또는 세침 생검 샘플 및 흉수 (pleural fluid) 등, 또는 환자 (인간 또는 동물), 실험 개체, 건강한 자원자 또는 실험 동물로부터 수득되는, 임의의 기타 생검, 또는 이들의 임의 추출물 등이 있을 수 있다. 샘플 소스로는 혈액 (전혈, 백혈구, 말초혈 단핵구 세포, 연층 (buffy coat), 혈장 및 혈청 등), 객담, 눈물, 점액, 코 세척물 (nasal wash), 코 흡인물, 숨, 뇨, 정액, 타액, 복막 세척물 (peritoneal washing), 낭액 (cystic fluid), 뇌척수막 액 (meningeal fluid), 양수 (amniotic fluid), 선액 (glandular fluid), 림프액 (lymph fluid), 세포액 (cytologic fluid), 복수, 흉수 (pleural fluid), 유두 흡인물 (nipple aspirate), 기관지 흡인물 (bronchial aspirate), 기관지 브러싱물, 활액 (synovial fluid), 관절 흡인물 (joint aspirate), 장기 분비물 (organ secretions), 세포, 세포 추출물 및 뇌척수액 (cerebrospinal fluid) 등이 있다. 샘플은 또한 실험에 의해 분리된 상기한 생물 소스 전체의 분획을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청 또는 혈장으로, 또는 적혈구 세포 또는 백혈구 세포 (백혈구)를 함유한 분획으로 분획화될 수 있다. 필요한 경우, 샘플은 개체 유래 샘플들의 조합, 예를 들어 조직과 체액 샘플의 조합일 수 있다. 용어 "생물 샘플"은 또한 변 샘플, 조직 샘플 또는 조직 생검 등으로부터 유래되는 균질화된 고체 물질을 함유한 물질을 예로 포함한다. 용어 "생물 샘플"은 또한 조직 배양물 또는 세포 배양물로부터 유래되는 물질을 포함한다. 생물 샘플을 수득하는 임의의 적절한 방법이 채택될 수 있으며; 예시적인 방법으로는, 사혈 (phlebotomy), 면봉법 (swab)(예, 볼 면봉법 (buccal swab)) 및 세침 흡인 생검 시술 (fine needle aspirate biopsy procedure)을 포함한다. 세침 흡인에 적합한 조직의 예로는 림프절, 폐, 폐 세척액, BAL (기관지폐포 세척액, bronchoalveolar lavage), 흉막, 갑상선, 유방, 췌장 및 간을 포함한다. 샘플은, 또한, 예를 들어, 미세절개 (micro dissection) (예, 레이저 포획 미세절개 (laser capture microdissection; LCM) 또는 레이저 미세 절개 (laser micro dissection; LMD)), 방광 세척 (bladder wash), 도말 (smear) (예, PAP 도말) 또는 유관 세척 (ductal lavage)에 의해 수집될 수 있다. 개체로부터 수득 또는 유래되는 "생물 샘플"은 개체로부터 수득한 후 임의의 적절한 방식으로 가공된 임의의 상기한 샘플을 포함한다. 또한, 샘플은 조직학적 목적으로 입수된 동결 단편과 같은 조직 단편을 포함할 수 있다. 또한, "샘플"은 실험 조건 하에 구축된 세포 또는 세포주, 즉 개체로부터 직접 분리되지 않은 것일 수 있다. "대조군" 또는 "기준"은 베이스라인 발현 또는 활성 측정에 사용하기 위해 수득한 샘플을 포함한다. 이에, 대조군 샘플은 비-암성 세포 또는 조직으로부터, 예를 들어, 개체의 종양 또는 암 세포 주위 세포로부터; 암이 없는 개체로부터; 암 위험성이 있는 것으로 의심되지 않는 개체로부터; 또는 이러한 개체로부터 유래된 세포 또는 세포주 등으로부터, 다수의 수단에 의해 수득될 수 있다. 또한, 대조군은 기존에 확립된 표준, 예를 들어 기존에 특정화된 SCLC를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따라 수행되는 임의의 검사 또는 분석이 확립된 표준과 비교될 수 있으며, 각 시기의 비교를 위한 대조군 샘플을 수득하는 것이 필수적이지 않을 수도 있다.
나아가, 생물 샘플은 다수 개체들에서 생물 샘플을 취하고, 이를 취합하거나 또는 각 개체의 생물 샘플의 분액을 취합함으로써 유래될 수 있음을 인지하여야 한다. 취합된 샘플은 한명의 개체로부터 수득한 샘플로서 처리될 수 있으며, 취합된 샘플에서 암의 존재가 확인되면, 각 개체의 생물 샘플에서 관련 결과들에 대해 다시 검사할 수 있다.
본원에서, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 호환적으로 임의 길이의 아미노산으로 된 폴리머를 지칭한다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개지 (interrupting)될 수 있다. 또한, 이 용어는 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 리피드화 (lipidation), 아세틸화, 인산화 또는 표지 성분과의 접합 등의 임의의 그외 조작 또는 변형으로, 변형된 아미노산 폴리머를 포괄한다. 또한, 이의 정의에는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예, 비-천연 아미노산 포함) 또는 당해 기술 분야에 공지된 기타 변형을 포함하는 폴리펩타이드도 포함된다. 폴리펩타이드는 단쇄 또는 결합된 체인 (associated chain)일 수 있다. 또한, 프리단백질 (preprotein) 및 온전한 성숙형 단백질; 성숙 단백질로부터 유래된 펩타이드 또는 폴리펩타이드; 단백질의 단편; 스플라이스 변이체; 단백질의 재조합 형태; 아미노산 변형, 결손 또는 치환을 가진 단백질 변이체; 분해물 (digest); 및 번역 후 수정, 예를 들어 당화, 아세틸화, 인산화 등도 상기한 정의에 포함된다.
본 발명은 바이오마커, 예를 들어, 폐암 및/또는 악성 폐암 세포를 가진 개체로부터 유래된 조직학적으로 정상적인 세포에서 암이 없는 개체로부터 유래된 정상 세포와 비교해 차별적으로 발현되는, 핵산 분자 및 이의 발현 산물을 제공한다.
"바이오마커"는 특이적인 생물학적 특성의 분자 지표로서, 본원에서 세포 또는 조직에서 차별적인 발현이 소-세포성 폐암의 존재 또는 부재를 나타내거나 또는 PARP 저해제 노출에 대해 증가된 또는 감소된 감수성을 나타내는, 핵산 분자 (예, 유전자 또는 유전자 단편) 또는 이의 발현 산물 (예, 폴리펩타이드 또는 이의 펩타이드 단편 또는 변이체)이다. 본원에서, "발현 산물"은 폴리뉴클레오티드 서열에 대응되거나 또는 이로부터 유래되는, 전사된 센스 또는 안티센스 RNA 분자 (예, mRNA) 또는 번역된 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 발현 산물은 폴리뉴클레오티드 서열로부터 전사된 RNA 발현 산물에 해당되는 증폭 산물 (앰플리콘) 또는 cDNA를 지칭할 수 있다. 바이오마커는 실험실 분석 및 의학적 영상 등의 다양한 방법에 의해 검출 및 측정할 수 있다. 바이오마커가 단백질인 경우, 생물 샘플에서 대응되는 단백질 바이오마커의 양 또는 존재 또는 부재의 대체 지표 (surrogate measure)으로서 대응되는 유전자의 발현 또는 바이오마커를 코딩하는 유전자의 메틸화 상태 또는 바이오마커의 발현을 통제하는 단백질을 이용하는 것도 가능하다.
"차별적인 발현" 또는 "차별적으로 발현된"은, 폐암을 가진 개체로부터 유래된 세포, 조직 또는 샘플에서의 바이오마커의 빈도 또는 양 또는 둘다가 기준 세포 또는 조직 또는 샘플과 비교해 차이가 있는 것을 의미하며, 예를 들어, 악성 폐암 세포 및/또는 폐암을 가진 개체로부터 유래된 정상 세포 (즉, 악성 관련 변화를 가진 세포)에서, 기준 또는 정상 세포, 예를 들어, 암이 없거나 또는 검출가능한 암이 없는 개체로부터 유래되는 세포, 또는 성공적인 폐암 적출을 시술받은 개체로부터 유래되는 정상 세포와 비교해, 차이가 있는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 대조군 또는 기준 세포는 SCLC 또는 NSCLC일 수 있다. 일부 구현예에서, 차별적인 발현은 기준 세포와 비교해 악성 폐암 세포에서 바이오마커의 빈도 또는 양 또는 둘다에서의 차이를 의미한다. 예를 들어, 바이오마커의 차별적인 차이는, 기준 개체의 샘플과 비교해, 폐암 환자의 샘플에서의 바이오마커의 증가된 또는 감소된 발현 수준, 예를 들어, 건강한 개체 및 기관지염 및 세기관지염과 같은 호흡기 감염을 가진 개체 등의, 비-폐암 대조군으로부터 채집된 혈액, 뇨, 타액, 혈청, 흉수 또는 기관지폐포세척액에서 단백질 수준 또는 항체 역가의 측정치와 비교해, 폐암 환자로부터 채집된 혈액, 뇨, 타액, 혈청, 흉수 또는 기관지폐포세척액에서의 단백질 수준 또는 항체 역가의 측정치의 증가된 수준 또는 감소된 수준을 지칭할 수 있다. 다른 예로 또는 아울러, 바이오마커의 차별적인 발현은 기준 개체의 샘플과 비교해 폐암 환자의 샘플에서 바이오마커의 높은 빈도 또는 낮은 빈도의 검출을 지칭할 수 있다. 바이오마커는 양, 빈도 또는 이 두가지 측면에서 차별적으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 바이오마커의 차별적인 발현은 여러 시점에, 예를 들어 치료 전 및 치료 후에 측정할 수 있다. "발현의 수준" 또는 "발현성 수준"은, 세포에서 유전자에 의해 코딩되는, mRNA 수준 뿐만 아니라 pre-mRNA 초기 전사체(들), 전사체에서 가공된 중간체, 성숙 mRNA 및 분해 산물의 수준, 및 세포에서 단백질, 단백질 단편 및 분해 산물의 수준을 의미한다. 적절한 비교는 또한 동일 환자에서의 정상 세포내 검출 산물의 수준에 대해 행해질 수 있거나, 또는 히스토리컬 데이타베이스와의 비교에 의해 행해질 수 있다.
바이오마커의 양 또는 빈도 또는 이 둘다의 차이는 통계학적 기법과 같은 임의의 적절한 기법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 폐암 샘플에서 바이오마커의 검출 빈도가, p<0.05가 일반적으로 통계적으로 유의한 것으로 간주되는, 스튜던트의 t 검정 또는 ANOVA 검정과 같은 표준 통계 분석에 의한 측정에 따라, 기준 샘플에서 보다 유의하게 더 높거나 또는 낮으면, 바이오마커는 폐암 샘플 및 기준 샘플 간에 차별적으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 샘플과 비교해 소-세포성 폐암에서 더 높거나 또는 낮은 빈도로 검출된다면, 바이오마커는 차별적으로 발현되는 것이며; 예를 들어, 검출은 기준 샘플과 비교해 폐암에서 높거나 또는 낮은 빈도로 적어도 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 이상, 또는 2배, 5배, 10배 또는 그 이상의 배수일 수 있다. 다른 예로 또는 아울러, 폐암에서의 바이오마커가, 예를 들어, 기준 샘플에서의 바이오마커의 양 보다 낮은 또는 높은 빈도로 통계학적으로 유의하게 다르다면, 예를 들어, 기준 샘플에서의 바이오마커의 양과 비교하였을 때 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 이상, 또는 2배, 5배, 10배 또는 그 이상으로 다르거나, 또는 한 샘플에서는 검출가능하지만 다른 것에서는 검출가능하지 않다면, 바이오마커는 차별적으로 발현되는 것이다. 일부 구현예에서, 차별적인 발현은 발현에서의 증가 또는 감소를 지칭할 수 있으며, 이는 기준 샘플과 비교해 테스트 샘플에서 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 이상, 또는 2배, 5배, 10배 또는 그 이상의 증가 또는 감소일 수 있다.
본 발명에 따라, PARP 저해제에 감수성인 소-세포성 폐암 개체를 동정하기 위한 바이오마커는, SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1을 포함한다. 이들 바이마커들 중 2 이상, 예컨대, 이들 바이오마커들 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9종이 본 발명에 따른 분석에서 임의 조합으로 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커들 중 하나 이상이 분석에서 구체적으로 제외될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, PARP 저해제 또는 탈라조파립에 대한 감수성을 결정하거나, 또는 SCLC 및 NSCLC를 구분하는데 특정 조합이 사용될 것이다. 본 발명의 특정 구현예에서, SLFN11이 사용되거나, 또는 SLFN11은 SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커와 조합하여 사용된다.
본 발명에 따른 바이오마커는 본원에 기술된 핵산 분자 및 이의 발현 산물의 실질적으로 동일한 상동체 및 변이체, 예를 들어, 본 발명의 바이오마커와 기능적으로 등가의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자, 예를 들어, 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체 또는 유전자 코드의 축중으로 인해 본원에 언급된 핵산 분자 및 폴리펩타이드와 상이한 스플라이스 변이체 또는 종 변이체와 같이, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결손을 가진 서열을 포함한다. 종 변이체는, 제조되는 폴리펩타이드가 일반적으로 서로 유의한 아미노산 동일성 및 기능적 유사성을 가질 것임에도 불구하고, 종 간에 다른 핵산 서열이다. 다형체 변이체 (예, 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP)는 주어진 종들의 개체들 간의 특정 유전자의 핵산 서열에서의 변이이다.
"실질적으로 동일한" 서열은, 아미노산 또는 핵산 분자의 생물학적 기능을 파괴하지 않는 서열 위치에 위치된, 본원에 논의된 바와 같이 하나 이상의 보존적인 치환에 의해, 또는 하나 이상의 비-보존적인 치환, 결손 또는 삽입에 의해서만 기준 서열과 상이한, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이다. 이러한 서열은, 예를 들어, Align Program (Myers and Miller, CABIOS, 1989, 4:11-17) 또는 FASTA를 이용하여 비교에 사용되는 서열에 대해 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서 최적으로 정렬되었을 때, 10% 내지 99%의 임의 정수 범위이거나 또는 보다 일반적으로 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50, 55% 또는 60% 또는 적어도 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 거의 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 폴리펩타이드의 경우, 비교 서열들의 길이는 적어도 2, 5, 10 또는 15개의 아미노산, 또는 적어도 20, 25 또는 30개의 아미노산일 수 있다. 다른 구현예에서, 비교 서열들의 길이는 적어도 35, 40 또는 50개의 아미노산, 또는 60개 이상, 80개 이상 또는 100개 이상의 아미노산, 또는 단백질의 전장일 수 있다. 핵산 분자의 경우, 비교 서열의 길이는 적어도 5, 10, 15, 20 또는 25개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 30, 40 또는 50개의 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 구현예에서, 비교 서열의 길이는 적어도 60, 70, 80 또는 90개의 뉴클레오티드, 또는 100개 이상, 200개 이상 또는 500개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 서열 동일성은 공개적으로 이용가능한 서열 분석 소프트웨어를 이용해 쉽게 측정할 수 있다 (예, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, 또는 BLAST software available from the National Library of Medicine, 또는 본원에 기술된 등). 이용가능한 소프트웨어의 예로는 프로그램 Pile-up 및 PrettyBox를 포함한다. 이러한 소프트웨어는 다양한, 결손, 치환 및 기타 변형에 대해 상동성 정도를 지정함으로써 비슷한 서열들을 매칭한다. 다른 예로 또는 아울러, 2개의 핵산 서열은, 고 엄격 조건에서 혼성한다면, "실질적으로 동일"할 수 있다. 일부 구현예에서, 고 엄격 조건은, 예를 들어, 0.5 M NaHPO4, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA 및 1% BSA (fraction V)를 함유한 완충제 중의 65℃의 온도에서, 또는 48% 포름아미드, 4.8x SSC, 0.2 M Tris-Cl, pH 7.6, 1x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 0.1% SDS를 함유한 완충제 중의 42℃의 온도에서, 뉴클레오티드 500개 이상의 길이인 DNA 프로브를 사용하여 이루어지는 혼성화에 상응하는 혼성화를 허용하는 조건이다 (이는 고 엄격 노던 또는 서든 혼성화의 전형적인 조건임). 혼성화는 약 20-30분, 또는 약 2-6시간, 또는 약 10-15시간, 또는 24시간 이상의 기간에 걸쳐 수행할 수 있다. 고 엄격 혼성화는 또한 고 엄격 PCR, DNA 서열분석, 단일 가닥 입체형태 (conformational) 다형성 분석 및 인 시추 혼성화 등의, 분자 생물학자에 의해 일상적으로 수행되는 다수의 기법들의 성공에 의존한다. 노던 및 서든 혼성화와는 대조적으로, 이러한 기법들은 통상적으로 상대적으로 짧은 프로브 (예, 통상적으로 PCR 또는 서열분석의 경우 뉴클레오티드 약 16개 이상, 및 인 시추 혼성화의 경우 뉴클레오티드 약 40개 이상)로 수행된다. 이러한 기법에 사용되는 고 엄격 조건은 분자 생물학 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 이러한 예들은, 예를 들어, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1998에서 찾아 볼 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바이오마커를 이용한 시약 준비
본원에 기술된 바이오마커는 본원에 기술된 바이오마커에 특이적으로 결합하거나 또는 혼성하는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 항체, 및 이의 상동체 및 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
● 항체
"항체"는 임의 이소형의 전체 항체 (IgG, IgA, IgM, IgE, 등), 다클론 항체 및 이들의 단편 등의, 항원-결합 영역을 가진 분자를 포함한다. 항체 단편은 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체, Fv, scFv 등을 포함한다. 항체는, 예를 들어, Harlow and Lane (Harlow and Lane Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988)에 기술되거나 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 바와 같은, 표준 제조 기법을 이용해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 바이오마커에 대한 코딩 서열은 토끼의 면역화에 필요한 정도로 정제할 수 있다. 항혈청 (antisera)의 잠재적인 저 친화성 또는 특이성 문제를 최소화하기 위해, 각 단백질에 대해 2 또는 3가지 폴리펩타이드 구조체를 제조할 수 있으며, 각 구조체는 적어도 2마리의 토끼에 주사할 수 있다. 항혈청은 바람직하게는 3번 이상의 부스터 주사 등의 일련의 주사에 의해 만들어질 수 있다. 일차 면역은 프로인드 완전 보강제를 사용해 수행될 수 있으며, 이후의 면역화는 프로인드 불완전 보강제를 사용해 수행될 수 있다. 항체 역가는 정제된 단백질을 이용한 서든 블롯 및 면역침강 분석을 이용해 모니터링할 수 있다. 면역 혈청은 CNBr-세파로스-커플링된 단백질을 이용한 친화성에 의해 정제할 수 있다. 항혈청 특이성은 관련없는 단백질 군을 사용해 측정할 수 있다. 항체 단편은 재조합에 의해 또는 단백질분해 절단에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 바이오마커의 상대적으로 고유한 면역원성 영역에 대응되는 펩타이드를 제조할 수 있으며, 이를 도입된 C-말단 라이신을 통해 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)과 커플링할 수 있다. 이들 펩타이드 각각에 대한 항혈청은 BSA에 접합된 펩타이드 상에서 친화성에 의해 정제할 수 있으며, 펩타이드 접합체를 이용한 ELISA 및 웨스턴 블롯에서, 그리고 웨스턴 블롯 및 면역침강에 의해 특이성을 검사할 수 있다.
본 발명의 임의의 한가지 폴리펩타이드 바이오마커에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 표준 하이드리도마 기법 (예, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976; Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., 1981)에 따라 제조된다. 다른 구현예에서, 단일클론 항체는 본 발명의 폴리펩타이드와 파지 디스플레이 라이브러리를 이용해 제조될 수 있다 (Vaughan et al., Nature Biotech 14:309-314, 1996). 제조 후, 단일클론 항체는 웨스턴 블롯 또는 면역침강에 의해 특이성을 검사할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 고 빈도의 하전된 잔기 (charged residue)와 같은 기준에 의해 면역원성일 가능성이 높은 폴리펩타이드 단편을 사용해 제조할 수 있다. 항체는, 예를 들어, 한가지 종에서 유래된 항원 결합 단편과 다른 종에서 유래된 Fc 영역을 포함하는 키메라 항체를 이용하거나, 또는 적절한 종의 하이브리도마로부터 제조된 항체를 이용함으로써, 부적절한 숙주 면역 반응을 최소화하도록 맞춤 제조할 수 있다. 예를 들어, SLFN11을 이용해, 특정 SLFN11 영역에 대해 특이적이도록 항체를 맞춤 제조한다.
항체가, 항원, 예를 들어, 본원에 기술된 바이오마커를 인지 및 결합하지만 샘플내 다른 분자를 실질적으로 인지 및 결합하지 않을 경우, 항체는 항원을 "특이적으로 결합한다". 이러한 항체는, 예를 들어, 샘플내 다른 기준 분자에 대한 항체 친화성 보다 적어도 2, 5, 10, 100, 1000 또는 10000배 높은 항원 친화성을 가진다. 이러한 조건에서 항체에 대한 특이적으로 결합하기 위해서는 특정 바이오마커에 대한 특이성을 위해 선택된 항체가 필요할 수 있다. 예를 들어, 랫, 마우스 또는 인간과 같은 특정 종에서 유래된 바이오마커에 대해 생성된 다클론 항체는, 바이오마커와 특이적으로 면역반응하지만 다형체 변이체 및 바이오마커의 대립유전자를 제외한 다른 단백질과는 반응하지 않는, 다클론 항체에 대해서만 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 랫, 마우스 또는 인간 등의 특정 종 유래의 바이오마커에 대해 생성된 다클론 항체는, 그 종 유래의 바이오마커와 특이적으로 면역반응하지만 다형성 변이체 및 바이오마커의 대립유전자 등의 다른 단백질과는 면역반응하지 않는, 다클론 항체에 대해서만 선택될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체는 샘플을 항체와 접촉시키고, 샘플내 바이오마커에 결합된 항체 복합체의 존재를 검출함으로써, 면역분석에 사용될 수 있다. 면역분석에 사용되는 항체는 본원에 기술된 바와 같이 또는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 생산하거나, 또는 Dako Canada, Inc., Mississauga, ON와 같은 공급자로부터 상업적으로 입수가능할 수 있다. 항체는, 후속적인 분석 공정을 용이하게 하기 위해, 샘플과 접촉시키기 전에 고체 지지체 (예, 나일론, 유리, 세라믹, 플라스틱 등)에 고정될 수 있다. 항체-바이오마커 복합체는 방사성, 형광, 발광, 화학발광, 흡광의 검출 또는 현미경, 영상화 등에 의해서와 같이, 다양한 표준 절차를 이용해, 가시화 또는 검출할 수 있다. 면역분석으로는 면역조직화학, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 웨스턴 블롯팅, 면역방사측정 분석 (IRMA), 측면 유동 (lateral flow), 소멸 (evanescence) (DiaMed AG, Cressier surMorat, Switzerland, as described in European Patent Publications EP1371967, EP1079226 및 EP1204856), 면역조직/세포-화학 및 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 기타 방법 등이 있다. 면역분석은 샘플내 바이오마커의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 샘플내 바이오마커의 양을 측정하는데 사용할 수 있다. 항체-바이오마커 복합체의 양은 샘플에 존재하는 것으로 알려진 폴리펩타이드 등의 기준 또는 표준과의 비교에 의해 측정할 수 있다. 또한, 항체-바이오마커 복합체의 양은 기준 또는 대조군 샘플내 바이오마커의 양과 같이 기준 또는 표준과의 비교에 의해 측정할 수 있다. 즉, 샘플내 바이오마커의 양은 절대치로서 정량하여야 하는 것은 아니며, 기준 또는 대조군에 대한 상대치로서 측정할 수 있다.
● 프로브 및 프라이머
"프로브" 또는 "프라이머"는 상보적인 서열 (타겟)을 함유한 제2 DNA 또는 RNA 분자와 염기 쌍을 형성할 수 있는 지정된 서열의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자이다. 형성되는 하이브리드 분자의 안정성은 형성되는 염기 쌍 형성 범위에 따라 결정되며, 프로브와 타겟 분자 간의 상보성 정도와 혼성화 조건의 엄격성 정도 등의 파라미터에 의해 영향을 받는다. 혼성화 엄격성 정도는 온도, 염 농도 및 포름아미드와 같은 유기 분자의 농도 등의 파라미터에 의해 영향을 받으며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법으로 측정한다. 본원에 기술된 핵산 바이오마커에 특이적인 프로브 또는 프라이머 또는 이의 일부는, 프로브 또는 프라이머가 사용되는 조건 및 목적에 따라, 뉴클레오티드를 임의 범위내 값 등의 8개 이상 내지 500개 이상의 임의 정수 개의 길이로 다양할 수 있다. 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 뉴클레오티드 8, 10, 15, 20 또는 25개 길이일 수 있거나, 또는 뉴클레오티드 적어도 30개, 40개, 50개 또는 60개의 길이일 수 있거나, 또는 뉴클레오티드 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상 또는 1000개 이상의 길이일 수 있다. 본원에 기술된 핵산 바이오마커에 특이적인 프로브 또는 프라이머는 본원에 기술된 핵산 바이오마커에 대해 20-30% 이상의 서열 동일성, 또는 적어도 55-57%의 서열 동일성, 또는 적어도 75-85%의 서열 동일성, 또는 적어도 85-99%의 서열 동일성, 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 프로브 또는 프라이머는, 예를 들어, 증폭에 의해 게놈 DNA 또는 cDNA로부터, 또는 클로닝된 DNA 세그먼트로부터 유래될 수 있으며, 한명의 개체로부터 유래된 하나의 유전자의 전체 또는 일부를 나타내는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열을 포함할 수 있다. 프로브는 고유한 서열을 가질 수 있으며 (예, 핵산 바이오마커에 대한 100% 동일성), 및/또는 공지된 서열을 가질 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 화학적으로 합성할 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 본원에 기술된 고 엄격 조건 하에 핵산 바이오마커와 혼성화할 수 있다.
프로브 또는 프라이머는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 방사성으로 또는 비-방사성으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 핵산 서열분석, 중합효소 연쇄 반응 (예, RT- PCR)에 의한 핵산 증폭, 단일 가닥 입체형태 다형성 (SSCP), 제한 효소 단편 다형성 (RFLP) 분석, 서든 혼성화, 노던 혼성화, 인 시추 혼성화, 전기영동 이동성 변동 분석 (EMSA), 형광 인 시추 혼성화 (FISH) 및 그외 당해 기술 분야에 당업자에게 공지된 방법 등의, 핵산 혼성화를 수반하는 폐암 검출 방법에 사용될 수 있다.
"검출가능하게 표지된"은 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머, 유전자 또는 이의 단편, 또는 cDNA 분자를 제조 및 존재를 동정하기 위한 임의 수단을 의미한다. 분자를 검출가능하게 표지하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 비-제한적인 예로, 방사성 표지 (예, 32P 또는 35S와 같은 동위원소 이용) 및 비-방사성 표지, 예를 들어 효소적 표지 (예, 포스래디시 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제), 화학발광 표지, 형광 표지 (예, 플루오레세인 사용), 생발솽 표지 또는 프로브에 부착된 리간드의 항체 검출 등을 포함한다. 또한, 이 정의에는, 간접 수단, 예를 들어 관찰 또는 분석될 수 있는 제2 모이어티 (예, 플루오레세인-표지된 스트렙타비딘)에 결합된, 제1 모이어티 (예, 바이오틴)와 결합된 분자에 의해 검출가능하게 표지된 분자가 포함된다. 표지물은 또한 디옥시게닌 (digoxigenin), 루시퍼라제 및 에쿼린 (aequorin)을 포함한다.
● 분석 및 키트
본 발명의 바이오마커를 이용해 제조되는 항체, 프로브, 프라이머 및 기타 시약을 사용해, 폐암을 검출하는데 사용하기 위한 어레이를 제조할 수 있다. "어레이" 또는 "매트릭스"는 표면 상에, 주소 지정 가능한 (addressable) 위치들 또는 독립적인 부위를 각각 나타내는 "어드레스"들의 패턴 또는 배치를 나타내는 것을 의미한다. 어레이는, 일반적으로 핵산 분자, 폴리펩타이드, 항체, 조직 등이 프로브에 대한 혼성화 패턴을 용이하게 확인가능하도록 지정된 차원의 배치 (specified dimensional arrangement)로 부착되는, 고체 지지체 (예, 나일론, 유리, 세라믹, 플라스틱 등)를 필요로 한다.
일반적으로, 프로브 (예, 항체, 핵산 프로브 또는 프라이머, 폴리펩타이드 등)를 어레이 표면 상에 고정하고, 결합에 적합한 조건 하에, 타겟 결합 파트너 (예, 항체의 경우, 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 또는 프로브의 경우, 프로브에 혼성하는 핵산 분자)를 포함하는 샘플과 접촉시킨다. 적절한 경우, 샘플내 결합되지 않은 물질을 제거할 수 있다. 결합된 타겟을 검출하고, 결합 결과를 적절한 통계적 방법 또는 다른 방법을 이용해 분석한다. 프로브 또는 타겟은 검출 및 이후의 분석을 용이하게 하기 위해 검출가능하게 표지될 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커에 대응되는 복수의 프로브들이 사용될 수 있다. 복수의 프로브는 본원에 기술된 하나 이상의 바이오마커에 해당될 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커에 결합할 수 있는 프로브 외에도, 어레이는 한가지 실험의 결과를 다른 실험의 결과에 대해 정규화 (normalization)하여 복수의 실험을 정량적인 수준에서 비교할 수 있도록, 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 항체를 대조 및 참조할 수 있다. 즉, 본 발명은 핵산, 폴리펩타이드, 항체 또는 세포 어레이를 이용한 생물학적 분석을 제공한다.
또한, 본 발명은 소-세포성 폐암에서 특히 본원에서 동정된 유전자 발현 모티프를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 본원에 기술된 바이오마커에 대응되는 하나 이상의 시약, 예를 들어, 체액내 항원으로서 분비되는 바이오마커, 바이오마커에 특이적인 항체에 결합하는 재조합 단백질 또는 바이오마커에 혼성하는 핵산 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는, 예를 들어, 본원에 기술된 바이오마커에 해당되는 복수의 시약을 어레이 상에 포함할 수 있다. 키트는 검출 시약, 예를 들어 검출가능하게 표지된 시약을 포함할 수 있다. 키트는 폐암의 (조기) 검출 및 서브타입핑 (subtyping)에 있어 키트의 서면 기재된 사용 설명서를 포함할 수 있으며, 대조군 또는 기준 표준물, 세척액, 분석 소프트웨어 등과 같은 정보 및 기타 시약을 포함할 수 있다.
진단 방법 및 기타 방법
본원에 동정된 하나 이상의 바이오마커를 발현하는 소-세포성 폐암 개체는 면역조직화학, ELISA, 웨스턴 블롯팅 또는 진단 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 다른 방법 등의 면역분석에 의해 하나 이상의 바이오마커의 차별적인 발현을 검출함으로써 진단할 수 있다.
개개 바이오마커 및 2종 이상의 바이오마커의 조합이 유용한 진단제이다. 특히, 본원에 기술된 하나 이상의 바이오마커의 조합은 폐암의 정확한 (조기) 진단과 서브타입 동정을 실시할 수 있다. 여러가지 샘플들에서 복수의 바이오마커들 간의 차별적인 발현 편차로, 특정 타입의 폐암의 존재 또는 부재, 폐암에 대한 특정 요법의 반응을 진단 또는 예측할 수 있거나, 또는 폐암 발병 위험도를 더 잘 평가할 수 있다. 예를 들어, SLFN11의 발현을 이용해, PARP 저해제 요법 또는 탈라조파립 요법을 위한 환자를 선별하거나 또는 샘플내 SCLC의 존재를 검출할 수 있다. 적합한 통계학적 방법 및 알고리즘, 예를 들어, 로지스틱 회귀 알고리즘을 이용해, 진단, 예후 예측, 치료진단 또는 기타 목적을 위해 복수의 바이오마커를 분석 및 이용할 수 있다. 바이오마커 (또는 임의의 하나 이상의 바이오마커의 특정 조합)를, 예를 들어, 소-세포성 폐암의 치료 전, 치료 중 및 치료 후에, 여러 번 검출 및 측정할 수 있다.
본원에 기술된 바이오마커의 검출은 폐암의 (조기) 검출 및 서브타입핑을 위한 일차 스크리닝으로서 수행될 수 있으며, 및/또는 가래 세포학 (sputum cytology), 가슴 X선, CT 스캔, spiral CT, PET, 특수 추적인자, 예, 89Zr, 11C, 형광 염료를 이용한 PET-CT, 신티그램 촬영술, 바이옵시, 전통적인 형태적 MAC 분석 등과 같은, 통례적인 폐암 진단 방법과 연계하여 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커의 검출은, 또한, pRb2/pl30, p53 및/또는 Ras 등의 기존에 인지된 폐암 바이오마커와 함께 사용하여 수행될 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커의 검출은, 예를 들어, 폐암 위험 개체 (예, 심각한 흡연자)에서 바이오마커의 베이스라인을 측정하기 위해 수행되거나, 또는 예를 들어 특정 연령 이상 (예, 60세 이상)에서 심각한 흡연자에 대한 일상적인 검사의 일환으로서 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 바이오마커 패널은 분자 진단 및/또는 검출 및/또는 폐암에 대한 치료 모니터링 및/또는 PARP 저해제 치료를 위한 개체 동정에 사용하기 위한 것이다. 본원에 기술된 바이오마커의 검출은 의료 실무자가 진단 결과에 따라 개체에 적절한 작업 코스 (예, 추가 검사, 수술, 시술 없음 등)를 결정하게 할 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커의 검출은 또한 소-세포성 폐암의 존재 또는 부재, 소-세포성 폐암의 조기 진단, 소-세포성 폐암의 예후 예측, 소-세포성 폐암의 서브타입 동정, 소-세포성 폐암에 대한 치료 효능 평가, 개체에서 소-세포성 폐암 요법의 모니터링 또는 소-세포성 폐암에 대한 요법을 시술받았으며 관해 상태인 개체에서 소-세포성 폐암의 재발 검출을 확인하는데 도움이 될 수 있다. 다른 측면에서, 바이오마커 및 바이오마커를 이용하여 제조된 시약을 사용해 SCLC 치료제를 동정할 수 있다. 키트 및 어레이를 사용해, 본 발명에 따른 바이오마커를 측정하고, 폐암을 진단하고 서브타입을 동정할 수 있다. 또한, 키트를 사용해, SCLC 요법에 대한 개체의 반응을 모니터링하여, 의료 실무자가 검사 결과에 따라 치료를 수정할 수 있다. 또한, 키트를 사용해, 소분자, 펩타이드 등과 같은 폐암 치료제를 동정 및 검증할 수 있다.
본원에서, "바이오마커 값 (biomarker value)", "값 (value)", "바이오마커 수준" 및 "수준"은, 상호 호환적으로, 생물 샘플에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 이용해 수득되고, 생물 샘플에서 바이오마커의, 이에 대한 또는 이에 대응되는 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가, 수준, 발현 수준, 측정된 수준의 비율 등을 나타내는, 측정치를 치징한다. "값" 또는 "수준"의 실제 성질은 바이오마커를 검출하기 위해 사용되는 구체적인 분석 방법의 특정 설계 및 컴포넌트에 따라 결정된다.
바이오마커가 개체에서 비정상적인 프로세스, 질환 또는 기타 증상을 나타내거나 또는 이의 신호일 경우, 그 바이오마커는 개체에서 정상적인 프로세스 또는 질환 또는 기타 증상의 부재를 나타내거나 또는 이의 신호인 바이오마커의 발현 수준 또는 값과 비교해, 과다-발현 또는 과소-발현되는 것으로서, 일반적으로 기술된다. "상향-조절", "상향-조절된", "과다-발현", "과다-발현된" 및 이의 임의 변형된 표현들은, 상호 호환적으로, 건강한 또는 정상 개체 유래의 유사한 생물 샘플에서 전형적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다, 생물학적 샘플의 바이오마커 값 또는 수준이 더 높은 것을 의미하기 위해 사용된다.
"하향-조절", "하향-조절된", "과소-발현", "과소-발현된" 및 이의 임의 변형된 표현들은, 상호 호환적으로, 건강한 또는 정상 개체 유래의 유사한 생물 샘플에서 전형적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다, 생물학적 샘플의 바이오마커 값 또는 수준이 더 낮은 것을 의미하기 위해 사용된다. 이들 용어는 또한 특정 질환의 여러 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 범위 또는 수준 범위) 보다 낮은 생물학적 샘플내 바이오마커의 값 또는 수준을 의미할 수 있다.
나아가, 과다-발현된 또는 과소-발현된 바이오마커는, 또한, "차별적으로 발현되는" 것으로, 또는 개체에서 정상적인 프로세스의 신호를 또는 질환 또는 기타 병태의 부재를 의미하거나 또는 이의 신호인, 바이오마커의 "정상적인" 발현 수준 또는 값과 비교해, "차별적인 수준" 또는 "차별적인 값"을 가지는 것으로 언급될 수 있다. 따라서, 바이오마커의 "차별적인 발현"은 바이오마커의 "정상적인" 발현 수준과의 차이로서 언급될 수도 있다.
용어 "차별적인 유전자 발현" 및 "차별적인 발현"은, 상호 호환적으로, 정상 또는 대조군 개체에서의 발현과 비교해, 특정 질환을 앓고 있는 개체에서 발현이 높거나 또는 낮은 수준으로 활성화되는 유전자 (또는 이의 대응되는 단백질 발현 산물)를 지칭하기 위해 사용된다. 또한, 이들 용어는, 동일 질환의 여러 단계들에서 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자 (또는 대응되는 단백질 발현 산물)을 포함한다. 또한, 차별적으로 발현된 유전자가 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화 또는 저해될 수 있거나, 또는 대안적인 스플라이싱을 수행하여 여러가지 폴리펩타이드 산물을 만들 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 차이는 mRNA 수준, 표면 발현, 폴리펩타이드의 분비 또는 그외 분할 (partitioning) 등의 다양한 변화에 의해 입증될 수 있다. 차별적인 유전자 발현은 2종 이상의 유전자 또는 유전자 산물들 간의 발현 비교; 또는 2종 이상의 유전자 또는 이의 유전자 산물들 간의 발현율의 비교; 또는 심지어 정상 개체와 질환을 앓고 있는 개체 간에, 또는 동일 질환의 여러 단계들 간에 동일 유전자의 상이하게 가공된 2종의 산물의 비교를 포함할 수 있다. 차별적인 발현은, 예를 들어, 정상 세포 및 질환에 걸린 세포들에서, 또는 서로 다른 질병 현상 또는 질병 단계로 이행된 세포들에서, 유전자 또는 이의 발현 산물 측면에서 시간적 또는 세포적 발현 패턴의 정량적 차이 뿐만 아니라 정성적인 차이 둘다를 포함한다.
본원에서, 바이오마커 값에 대한 "검출" 또는 "측정"은 바이오마커 값에 대응되는 신호를 관찰 및 기록하는데 필요한 장치 및 신호를 발생시키는데 필요한 물질/들의 사용을 포함한다. 다양한 구현예들에서, 바이오마커 값은, 형광, 화학발광, 표면 플라스몬 공명, 표면 음파, 질량 분광측정, 적외선 분광법, 라만 분광법, 원자력 현미경, 주사 터널 현미경, 전기화학 검출법, 핵 자기 공명, 양자점 등의, 임의의 적합한 방법을 이용해 검출한다.
"진단한다", "진단하는", "진단" 및 이의 변형어들은 개체와 관련된 하나 이상의 신호, 증상, 데이타 또는 기타 정보를 기초로 개체의 건강 상태 또는 병태를 검출, 측정 또는 인지하는 것을 의미한다. 개체의 건강 상태는 건강/정상으로 진단되거나 (예, 질병 또는 병태가 없는 것으로 진단) 또는 아픈/비정상적으로 진단 (예, 질병 또는 병태가 존재하는 것으로 진단 또는 특징의 평가)될 수 있다. 용어 "진단한다", "진단하는", "진단" 등은 특정 질환 또는 병태에 대해 질환의 최초 검출; 질환의 특징 규명 또는 분류; 질환의 진행, 관해 또는 재발의 검출; 및 개체에 치료 또는 요법 투여 후 질환 반응의 검출을 포괄한다. SCLC의 진단은 암을 앓고 있는 개체를 그렇지 않은 개체와 구분하는 것을 포함한다.
"예후를 예측한다", "예후를 예측하는", "예후 예측" 및 이의 변형어들은 질환 또는 병태를 앓고 있는 개체에서 질환 또는 병태의 향후 코스를 예측 (예, 환자 생존성 예측)하는 것을 의미하며, 이들 용어는 개체에 대한 치료 또는 요법 투여 후 질환 반응의 평가를 포함한다.
바이오마커의 사용 예
다양한 예시적인 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 분석 방법 등의 임의의 다수 분석 방법에 의해, 혈청 또는 혈장과 같은 개체의 순환계에 존재하는 하나 이상의 바이오마커에 해당되는 하나 이상의 바이오마커의 값을 검출함으로써, 개체에서 SCLC를 진단하는 방법을 제공한다. 이들 바이오마커는, 예를 들어, SCLC인 개체에서 SCLC가 아닌 개체와 비교해 차별적으로 발현되거나, 또는 PARP 저해제 치료에 감수성일 가능성이 높은 SCLC 개체에서 차별적으로 발현된다. 개체에서 바이오마커의 차별적인 발현의 검출은, 예를 들어, SCLC의 조기 진단을 허용하거나, 또는 SCLC 재발을 모니터링하거나, 또는 PARP 저해제 요법의 처방을 위해, 또는 기타 임상적인 처방을 위해, 사용될 수 있다.
본원에 기술된 임의 바이오마커는 다음과 같은 임의 증상 등의 SCLC에 대한 다양한 임상 증상들에 사용될 수 있다: (예, 고-위험성 개체 또는 집단에서) SCLC의 검출; 비-소 세포성 폐암 (NSCLC)과 소-세포성 폐암 (SCLC)을 구분함으로써와 같이, SCLC 특징 규명 (예, SCLC 타입, 서브타입 또는 단계 결정); SCLC 예후 확인; SCLC 진행 또는 관해 모니터링; SCLC 재발 모니터링; 전이 모이터링; 치료 선택, 특히 PARP 저해제 또는 탈라조파립을 이용한 치료 선택; 치료제 또는 기타 치료에 대한 반응 모니터링; 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스크리닝을 위한 개체의 계층화 (예, SCLC 위험성이 더 높아 spiral-CT 스크리닝이 유리할 가능성이 가장 높은 개체 동정, 그에 따른 CT의 긍정적인 예측치 증가); 바이오마커 검사 결과와 흡연력 등과 같은 부가적인 생의학적 정보 또는 결절 크기 (nodule size), 형태 등의 조합 (예, CT 검사 또는 바이오마커 타겟팅 단독과 비해 진단 성능이 증가된 분석을 제공하기 위함임); 악성 또는 양성으로서의 폐 결절의 용이한 진단; 폐 결절이 CT에서 관찰되었을 때 임상적인 결정의 용이한 수립 (예, 바이오마커-기반의 검사가 음성인 경우와 같이 결절 위험성이 낮은 것으로 보이면, 결정 크기의 분류와 더불어 또는 분류 없이, XT 스캔 반복 지시, 또는 바이오마커-기반의 검사가 양성인 경우와 같이 결절 위험성이 높은 것으로 보이면, 결정 크기의 분류와 더불어 또는 분류 없이, 생검 고려); 및 임상적인 추적에 대한 용이한 결정 수립 (예, CT 스캔 반복, 세침 바이옵시, 결절 절개 또는 CT에서 석회화되지 않은 결절 관찰 후 개흉술 실시 여부). 바이오마커 검사는 고 위험도의 개체에 대해 CT 또는 가슴 X선 스크리닝에서의 긍정적인 예측치 (PPV)를 향상시킬 수 있다. CT 스캐닝과 연계된 이의 활용 외에도, 본원에 기술된 바이오마커는 또한 가슴 X선, 기관지경 검사 또는 형광 기관지경 검사, MRI 또는 PET 스캔과 더불어 사용될 수 있다. 또한, 언급된 바이오마커는, 또한, SCLC의 증상 또는 그외 임상적인 관련 요인들이 영상 기법에 의해 검출되기 전 또는 증상이 나타나기 전에, 이러한 특정한 용도를 허용하는데 유용할 수 있다. 이는, CT 스캔 또는 그외 영상 방법에서 동정된 중요하기 않은 폐 결절을 가진 개체를 구별하는 단계, SCLC에 대한 고 위험성 흡연자를 스크리닝하는 단계 및 SCLC인 개체를 진단하는 단계를 더 포함한다.
본원에 기술된 임의의 바이오마커를 이용해 SCLC를 진단하는 방식의 예로서, SCLC를 가진 것으로 확인되지 않은 개체에서 언급된 하나 이상의 바이오마커의 차별적인 발현은, 개체가 SCLC를 앓는다는 것을 의미할 수 있으며, 따라서 치료가 가장 효과적인 질환의 초기 단계에, 아마도 다른 수단에 의해 검출되기 전에 또는 증상이 나타나기 전에, SCLC를 검출할 수 있다. SCLC 코스 동안에 하나 이상의 바이오마커의 과다-발현은 SCLC 진행을 의미하는 것일 수 있으며, 예를 들어, SCLC 종양이 증식 및/또는 전이성인 (즉, 이는 예후가 불량하다는 의미임) 반면, 하나 이상의 바이오마커가 차별적으로 발현되는 수준의 감소 (예, 이후의 바이오마커 검사에서, 개체에서의 발현 수준이 "정상" 발현 수준으로 이동 또는 근접해짐)는 SCLC의 관해, 예를 들어, SCLC 종양의 축소 (즉, 양호한 또는 우수한 예후를 의미함)를 의미하는 것일 수 있다. 마찬가지로, SCLC 처리 코스 동안에 하나 이상의 바이오마커가 차별적으로 발현되는 수준의 증가 (예, 이후의 바이오마커 검사에서, 개체에서의 발현 수준이 "정상" 발현 수준에서 멀리 이동함)는, SCLC가 진행 중이며, 따라서, 치료 효과가 없다는 것을 의미할 수 있으며, 반면 SCLC 치료 코스 동안에 하나 이상의 바이오마커의 차별적인 발현의 감소는 SCLC의 관해를 의미하는 것일 수 있으며, 따라서 치료가 효과적으로 작동한다는 것을 의미한다. 또한, 개체가 명백하게 SCLC에서 치유된 후, 하나 이상의 바이오마커의 차별적인 발현의 증가 또는 감소는, SCLC 재발을 의미하는 것일 수 있다. 이러한 상황에서, 예를 들어, SCLC의 재발이 이후에까지 검출되지 않는 경우에 비해 보다 이른 시기에, 개체는 치료 (또는, 개체가 치료 유지 중인 경우에, 투여량 및/또는 빈도를 높이도록 변형된 치료 용법)를 재개할 수 있다. 또한, 개체에서 하나 이상의 바이오마커의 차별적인 발현 수준은 특정 치료제에 대한 개체의 반응을 나타내는 예측 인자일 수 있다. SCLC 재발 또는 진행의 모니터링시, 바이오마커 발현 수준의 변화는, SCLC 활성을 측정하거나 또는 치료에 변화 필요성을 확인하기 위해서와 같이, 반복적인 영상 촬영 (예, 반복적인 CT 스캐닝)의 필요성을 의미하는 것일 수 있다.
본원에 기술된 임의 바이오마커의 검출은, 치료 성공을 평가하거나 또는 치료 후 SCLC 관해, 재발 및/또는 (전이 등의) 진행을 모니터링하기 위해, SCLC 치료 이후에 또는 SCLC 치료와 더불어 유용할 수 있다. SCLC 치료는, 예를 들어, 개체에 치료제 투여, 수술 (예, SCLC 종양의 일정 부분 이상의 외과적 절제 또는 SCLC 및 주변 조직의 제거), 방사성 요법 실시, 또는 당해 기술 분야에 사용되는 임의의 다른 타입의 SCLC 치료, 및 이들 치료의 임의 조합을 포함할 수 있다. 폐암 치료는, 예를 들어, 개체에 치료제 투여, 수술 (예, 폐암의 일정 부분 이상의 외과적 절제), 방사성 요법 실시 또는 당해 기술 분야에 사용되는 임의의 다른 타입의 SCLC 치료 및 이들 치료들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, siRNA 분자는 유전자 발현을 저해하며, 타겟화된 폐암 치료제로서 이용할 수 있는, 이중 가닥의 합성 RNA 분자이다. 예를 들어, 임의의 바이오마커는 치료 후 적어도 1번 검출할 수 있거나, 또는 치료 후 여러 번 (예, 일정한 간격으로) 검출할 수 있거나, 또는 치료 전과 치료 후 2번 검출할 수 있다. 개체에서 시간 경과에 따른 임의 바이오마커의 차별적인 발현 수준은 SCLC 진행, 관해 또는 재발을 의미하는 것일 수 있으며, 이의 예로는 하기 중 임의의 것을 포함한다: 치료 전 바이오마커의 발현 수준과 비교해 치료 후 바이오마커의 발현 수준의 증가 또는 감소; 치료 후 이른 시점에서의 바이오마커의 발현 수준과 비교해 치료 후 나중 시점에서의 바이오마커의 발현 수준의 증가 또는 감소; 및 바이오마커의 정상 수준과 비교해 치료 후 한 시점에 바이오마커의 차별적인 발현 수준.
구체적인 예로서, 본원에 기술된 임의 바이오마커에 대한 바이오마커의 수준은 수술 전 및 수술 후 (예, 수술 후 2-16주) 혈청 또는 혈장 샘플에서 측정할 수 있다. 수술 후 샘플에서의 바이오마커의 발현 수준(들)이 수술 전 샘플에 비해 증가된 것은 SCLC의 진행 (예, 수술 실패)을 의미할 수 있는 반면, 수술 후 샘플에서의 바이오마커 발현 수준(들)이 수술 전 샘플에 비해 감소된 것은 SCLC의 퇴행 (예, 수술로 폐 종양이 성공적으로 제거됨)을 의미할 수 있다. 바이오마커 수준의에 대한 비슷한 분석을, 다른 형태의 치료 전 또는 치료 후에, 예를 들어 치료제 또는 암 백신의 투여 또는 방사선 치료 전과 치료 후에 수행할 수 있다.
가닥-단독 진단 검사 (stand-alone diagnostic test)로서 바이오마커 수준 검사와 더불어, 바이오마커 수준은, 또한, 질환의 감수성 위험도 증가를 의미하는, SNP 검출 또는 그외 유전적 병변 또는 가변성 검출과 병용하여, 검사할 수 있다 (예, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).
가닥-단독 진단 검사로서 바이오마커 수준의 검사와 더불어, 바이오마커 수준은 CT 스캐닝과 같은 방사선 스캐닝과 병용하여, 수행될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는, SCLC 위험성이 있는 대규모 무증상성 집단 (예, 흡연자)을 스크리닝하는 등의, CT 스캐닝을 수행하는데 의학적 및 경제적인 타당한 이유를 도모할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 수준의 "pre-CT" 검사를 이용해, 바이오마커 수준을 토대로 SCLC 위험성이 가장 높고 CT 스캐닝에 우선 순위가 되어야 하는 개체를 동정하는 등과 같이, CT 스캐닝에 대한 고 위험도 개체를 계층화할 수 있다. CT 검사 수행시, 하나 이상의 바이오마커의 바이오마커 수준 (예, 혈청 또는 혈장 샘플의 앱타머 분석에 의한 측정)을 측정할 수 있으며, 부가적인 생의학적 정보 (예, CT 검사에 의해 측정되는 종양 파라미터)와 연계하여 진단 스코어를 평가하여, CT 또는 바이오마커 단독 검사에 비해 긍정적인 예측치 (PPV)를 강화할 수 있다. 바이오마커 수준을 측정하기 위한 "post-CT" 앱타머 패널을 이용해, CT (또는 그외 영상 기법)에 의해 관찰되는 폐 결절이 악성 또는 양성일 가능성을 확인할 수 있다.
본원에 기술된 임의 바이오마커의 검출은 post-CT 검사에 유용할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 검사는 CT 단독에 비해 위 양성 검사 결과를 현저하게 줄이거나 또는 없앨 수 있다. 나아가, 바이오마커 검사는 환자의 치료를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 폐 결절의 크기가 5 mm 미만인 경우, 바이오마커 검사 결과는 보다 초기에 환자를 "관찰 및 대기"에서 생검으로 진행시킬 수 있으며; 폐 결절이 5-9 mm이면, 바이오마커 검사는 위 양성 스캔에서 생검 또는 개흉술의 사용을 생략할 수 있으며; 폐 결절이 10 mm 보다 크면, 바이오마커 검사는 양성 결절을 가진 환자들의 서브 집단에서 수술을 생략시킬 수 있다. 바이오마커 검사에 기초한 일부 환자에서 생검 필요성의 소거는, 결절 생검과 관련한 심각한 병리학적 문제와 결절의 위치에 따른 결절 조직의 입수 곤란성이 존재하므로, 유익할 것이다. 마찬가지로, 실제 양성인 결절을 가진 환자와 같이, 일부 환자에서 수술 필요성의 제거는, 수술과 관련된 불필요한 위험성과 비용을 방지할 것이다.
고 위험성 개체에서 방사성 스크리닝과 연계한 바이오마커 수준의 검사 (영상 스캔에서 관찰된 폐 결절 또는 덩어리의 크기 또는 기타 특징들과 연계하여, 바이오마커 수준 분석) 외에도, 바이오마커에 대한 정보는 또한 다른 타입의 데이타, 특히 개체의 SCLC 위험성을 표시하는 데이타 (예, 환자의 임상 병력, 직업 관련 노출 이력, 증상, 암의 가족력, 개체가 흡연자인지의 유무와 같은 위험 요소, 및/또는 다른 바이오마커의 상태 등)와 함께 평가할 수 있다. 이러한 다양한 데이타는 컴퓨터 또는 다른 장치/디바이스에서 구현될 수 있는 컴퓨터 프로그램/소프트웨어 등의 자동화된 방법에 의해 평가할 수 있다.
또한, 임의의 기술된 바이오마커는 영상 검사에 사용될 수 있다. 예를 들어, 영상화 물질은, 다른 용도들 중에서도, SCLC 진단을 보조하기 위해, 질병의 진행/관해 또는 전이를 모니터링하기 위해, 질환의 재발을 모니터링하기 위해, 또는 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는, 언급된 임의의 바이오마커와 커플링될 수 있다.
바이오마커 및 바이오마커 값의 검출 및 측정
본원에 기술된 바이오마커에 대한 바이오마커 값은 공지된 다양한 임의의 분석 방법을 이용해 검출할 수 있다. 일 구현예에서, 바이오마커 값은 포획 시약을 이용해 검출한다. 본원에서, "포획 물질" 또는 "포획 시약"은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 다양한 구현예에서, 포획 시약은 용액 중에 바이오마커에 노출되거나 또는 바이오마커에 노출될 수 있으며, 포획 시약은 고체 지지체 상에서 이차 피처 (feature)와 반응성인 피처를 포함한다. 이들 구현예에서, 포획 시약을 용액 중에 바이오마커에 노출시킬 수 있으며, 고체 지지체 상에 바이오마커를 고정하기 위해 포획 시약 상의 피처를 고체 지지체 상의 이차 피처와 함께 사용할 수 있다. 포획 시약은 수행할 분석 유형을 토대로 선택된다. 포획 시약은, 비-제한적으로, 앱타머, 항체, 항원, 애드넥틴 (adnectin), 안키린 (ankyrin), 기타 항체 모방체 및 그외 단백질 스캐폴드, 자가항체 (autoantibody), 키메라, 소분자, F(ab')2 단편, 단쇄 항체 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 어피바디 (affybody), 나노바디 (nanobody), 임프린티드 폴리머 (imprinted polymer), 아비머 (avimer), 펩티드 모방체, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체 및 합성 수용체, 및 이들의 변형체 및 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체를 이용해 검출한다. 다른 구현예에서, 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체로부터 유래되며, 예를 들어, 바이오마커/포획 시약 상호작용에 후속적인 반응의 결과로서 간접적으로 검출되지만, 바이오마커/포획 시약 복합체의 형성에 의존한다.
일부 구현예에서, 바이오마커 값은 생물 샘플에서 바이오마커로부터 직접 검출된다. 일 구현예에서, 바이오마커는 생물 샘플에서 2종 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 형태를 이용해 검출된다. 멀티플렉스 형태의 일 구현예에서, 포획 시약은 고체 지지체 상에 분리된 위치에 직접 또는 간접적으로, 공유적으로 또는 비-공유적으로 고정된다. 다른 구현예에서, 멀티플렉스 형태는, 각 고체 지지체에, 예를 들어, 양자점과 같은 고체 지지체와 조합된 고유한 포획 시약을 가진, 분리된 고체 지지체들을 이용한다. 다른 구현예에서, 개개 디바이스는 생물 샘플에서 검출되는 복수의 바이오마커들 중 각각의 하나를 검출하기 위해 사용된다. 개개 디바이스는 생물 샘플에서 각 바이오마커를 동시에 처리할 수 있도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트는, 플레이트의 각각의 웰을 사용해 생물 샘플에서 검출할 복수의 바이오마커들 중 하나를 고유하게 분석하도록, 사용될 수 있다.
전술한 구현예들 중 하나 이상의 구현예에서, 형광 테그를 이용해 바이오마커/포획 복합체의 구성 성분을 표지함으로써 바이오마커 값을 검출할 수 있다. 다양한 구현예에서, 형광 표지 물질은 공지된 기법을 이용해 본원에 기술된 임의의 바이오마커에 특이적인 포획 시약과 접합시킬 수 있으며, 이후 형광 표지 물질을 사용해 대응되는 바이오마커 값을 검출할 수 있다. 적절한 형광 표지 물질로는, 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실 (dansyl), 알로피코시아닌 (allophycocyanin), PBXL-3, Qdot 605, Lissamine, 피코에리트린 (phycoerythrin), Texas Red 및 그외 다른 화합물 등이 있다.
일 구현예에서, 형광 표지 물질은 형광 염료 분자이다. 일부 구현예에서, 형광 염료 분자는 인돌륨 고리의 3-탄소 상의 치환기가 화학적으로 반응성 기 또는 접합된 물질을 포함하는, 하나 이상의 치환된 인돌륨 고리 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 염료 분자로는 AlexFluor 분자, 예를 들어, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680 또는 AlexaFluor 700 등이 있다. 다른 구현예들에서, 염료 분자로는 제1 타입의 염료 분자 및 제2 타입의 염료 분자, 예를 들어, 2종의 서로 다른 AlexaFluor 분자를 포함한다. 다른 구현예들에서, 염료 분자는 제1 타입 및 제2 타입의 염료 분자를 포함하며, 2종의 염료 분자는 서로 다른 방출 스펙트럼을 가진다.
형광은 매우 다양한 분석 형태와 상용성인 다양한 장치로 측정할 수 있다. 예를 들어, 분광형광측정기는 마이크로타이터 플레이트, 현미경 슬라이드, 프린트된 어레이 (printed array), 큐벳 등을 분석하도록 설계된 것이다. Principles of Fluorescence Spectroscopy, by J. R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004. See Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, January 2002를 참조한다.
하나 이상의 전술한 구현예에서, 화학발광 테그를 선택적으로 사용해 바이오마커/포획 복합체의 구성 성분을 표지해 바이오마커 값을 검출할 수 있다. 적합한 화학발광 물질로는 임의의 옥살릴 클로라이드, Rodamin 6G, Ru(bipy)32+, TMAE (테트라키스(다이메틸아미노) 에틸렌), Pyrogallol (1,2,3-트리하이드록시벤젠), Lucigenin, 퍼옥시옥살레이트, 아릴 옥살레이트, 아크리디늄 에스테르, 다이옥세탄 등이 있다.
또 다른 구현예에서, 검출 방법은, 바이오마커 값에 대응되는 검출 신호를 발생시키는 효소/기질 조합을 포함한다. 일반적으로, 효소는 분광광도법, 형광 및 화학발광 등의 다양한 기법을 이용해 측정할 수 있는 발색성 기질의 화학적 변이를 촉매한다. 적합한 효소로는, 예를 들어, 루시퍼라제, 루시페린, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼라인 포스파타제, beta-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 우리카제 (uricase), 잔틴 옥시다제, 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다.
또 다른 구현예에서, 검출 방법은 형광, 화학발광, 방사성 핵종 또는 측정가능한 신호를 발생시키는 효소/기질 조합로 된 조합일 수 있다. 멀티모드 시그널링은 바이오마커 분석 포맷에서 독특하고 유익한 특징을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 본원에 기술된 바이오마커에 대한 바이오마커 값은, 본원에 기술된 바와 같이, 싱글플렉스 앱타머 분석 (amer assay), 멀티플렉스 앱타머 분석 (multiplexed aptamer assay), 싱글플렉스 또는 멀티플렉스 면역분석, mRNA 발현 프로파일링, miRNA 발현 프로파일링, 질량 분광측정 분석, 조직/세포학적 방법 등의, 공지된 분석 방법을 이용해 검출할 수 있다.
생체내 분자 영상화 기술을 이용한 바이오마커의 검출
임의의 언급된 바이오마커는 또한 분자 영상화 검사에 이용될 수 있다. 예를 들어, 영상화 물질이 임의의 언급된 바이오마커와 커플링될 수 있으며, 이를 이용해 다른 용도들 중에서도, SCLC 진단을 보조하거나, 질환 진행/관해 또는 전이를 모니터링하거나, 질환의 재발을 모니터링하거나, 또는 치료에 대한 반응을 모니터링할 수 있다.
생체내 영상화 기술은 개체의 체내에 특정 질환의 상태를 결정하는 비-침습적인 방법을 제공한다. 예를 들어, 신체의 전역, 또는 심지어 전신을 3차원 이미지로 살펴볼 수 있으며, 따라서 신체의 형태 및 구조에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 기술들은 본원에 언급된 바이오마커의 검출과 조합하여, 암 상태, 특히 개체의 SCLC 상태에 대한 정보를 제공할 수 있다.
생체내 분자 영상화 기술의 사용은 다양한 기술적인 진보로 인해 확대되고 있다. 이러한 진보로는, 유용한 정보를 제공하기 위한 충분한 민감성과 정확성을 가진, 체내 강한 신호를 제공할 수 있는, 방사성 표지 물질 및/또는 형광 표지 물질 등의 새로운 콘트라스트 물질 또는 표지 물질의 개발; 및 신체 외부에서 신호를 검출 및 분석할 수 있는 강력하고 새로운 영상화 기술의 개발을 포함한다. 콘트라스트 물질은 적절한 영상화 시스템에서 가시화될 수 있으며, 이로써 콘트라스트 물질이 위치된 신체의 영역 또는 영역들의 이미지를 제공할 수 있다. 콘트라스트 물질은, 앱타머 또는 항체와 같은 포획 시약과, 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질, 또는 (예, 유전자 발현을 검출하기 위한) 올리고뉴클레오티드와, 또는 이들 임의의 것을 하나 이상의 거대 분자 및/또는 다른 미립자 형태와 함께 포함하는 복합체와 결합 또는 조합될 수 있다.
또한, 콘트라스트 물질은 영상화에 사용가능한 방사성 원자를 특징으로 할 수 있다. 적합한 방사성 원자로는 신티그래프 실험 (scintigraphic study)을 위한 테크네튬-99m 또는 요오드-123 등이 있다. 그외 쉽게 검출가능한 모이어티로는, 예를 들어, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같이, 자기 공명 영상 (MRI)을 위한 스핀 표지 물질 등이 있다. 이러한 표지 물질은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
표준 영상화 기술로는, 비-제한적으로, 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층촬영 스캐닝, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT) 등이 있다. 진단 목적의 생체내 영상화를 위해 이용가능한 검출 장치의 타입은 소정의 콘트라스트 물질, 예를 들어 소정의 방사성 핵종 및 타겟 (단백질, mRNA 등)에 사용되는 특정 바이오마커를 선택하는데, 주요 인자이다. 선택된 방사성 핵종은 전형적으로 소정의 타입의 장치에 의해 검출가능한 붕괴 (decay) 타입을 가진다. 또한, 생체내 진단을 위해 방사성 핵종이 선택된 경우, 이의 반감기는 타겟 조직에 의해 최대 흡수 시기를 검출할 수 있을 만큼 충분히 길어야 하지만 숙주의 유해한 피복이 최소화될 만큼 충분히 짧아야 한다.
예시적인 영상화 기술로는, 비-제한적으로, 방사성 핵종이 전신 또는 국소적으로 개체에게 투여되는, 영상화 기술인, PET 및 SPECT를 포함한다. 이후 방사성 트레이서 (radiotracer)의 흡수를 경시적으로 측정하고, 이를 이용해 타겟 조직 및 바이오마커에 대한 정보를 수득한다. 사용되는 특정 동위원소의 고-에너지 (감마선) 방출 및 이를 검출하기 위해 사용되는 장치의 민감성 및 정교함으로 인해, 2차원적인 방사능 분포를 신체 외부에서 추론할 수 있다.
PET에서 일반적으로 사용되는 양전자-방출 핵종으로는, 예를 들어, 탄소-11, 질소-13, 산소-15 및 불소-18을 포함한다. 전자 포획 및/또는 감마-방출에 의해 붕괴되는 동위원소는 SPECT에 이용되며, 예를 들어 요오드-123 및 테크네튬-99m 등이 있다. 아미노산을 테크네튬-99m으로 표지하는 방법의 예는, 킬레이팅 전구체의 존재 하에 과테크니튬산 이온을 환원시켜, 민감한 테크네튬-99m-전구체 복합체를 형성한 다음, 2 기능성 변형된 주화성 펩타이드의 금속 결합 기와 반응시켜, 테크네튬-99m-주화성 펩타이드 접합체를 형성하는 방법이다.
항체가 종종 생체내 영상화 진단 방법에 사용된다. 생체내 진단을 위한 항체의 제조 및 사용은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 개체의 질환 상태를 진단 또는 평가하기 위한 목적으로, 본원에 기술된 임의의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를, 사용되는 특정 바이오마커에 따라 검출가능한, 특정 타입의 암 (예, SCLC)을 가진 것으로 의심되는 개체에 주사할 수 있다. 사용되는 표지 물질은 기존에 개시된 바와 같이 사용할 영상 기술에 따라 선택될 것이다. 표지 물질의 국지화 (localization)는 암의 전파를 검출할 수 있다. 장기 또는 조직내 표지 물질의 양은 장기 또는 조직내 암의 존재 또는 부재를 측정할 수 있게 해준다.
마찬가지로, 이러한 생체내 영상 진단 방법에 앱타머가 사용될 수 있다. 예를 들어, 개체의 SCLC 상태를 진단 또는 평가하기 위한 목적으로, 본원에 기술된 특정 바이오마커를 동정하기 위해 사용되는 (따라서, 특정 바이오마커에 특이적으로 결합하는) 앱타머를 적절하게 표지하여, 특정 바이오마커에 따라 검출가능한 SCLC에 걸린 것으로 의심되는 개체에 주사할 수 있다. 사용되는 표지 물질은 기존에 개시된 바와 같이 사용할 영상 기법에 따라 선택될 것이다. 표지 물질의 국지화는 암의 전파를 확인할 수 있게 해준다. 장기 또는 조직내 표지 물질의 양은 장기 또는 조직내 암의 존재 또는 부재를 확인할 수 있게 해준다. 앱타머-특이 영상화 물질 (aptamer-directed imaging agent)은 다른 영상화 물질과 비교해 조직 침투, 조직 분포, 카이네틱스, 제거, 효능 및 선택성과 관련해 독특하고 유익한 특징을 가질 수 있다.
또한, 이러한 기법들은, 선택적으로, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 영상화를 통해 유전자 발현을 검출하기 위해, 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용해 수행할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 표지 물질로서 형광 분자 또는 방사핵종을 이용한 인 시추 혼성화에 사용된다. 유전자 발현을 검출하는 다른 방법은, 예를 들어, 리포터 유전자의 활성 검출이다.
영상 기법의 또 다른 일반적인 타입은, 개체 내부의 형광 신호를 개체의 외부에 존재하는 광학 장치에 의해 검출하는, 광학 영상화이다. 이들 신호는 실제 형광 및/또는 생발광으로 인한 것일 수 있다. 광학 검출 장치의 민감도 개선은 생체내 진단 분석에서의 광학 영상의 유용성을 개선시킨다.
생체내 분자 바이오마커 영상의 사용은, 예를 들어, 장기간의 치료가 윤리적으로 의심스러운 것으로 간주될 수 있는, 다발성 경화증과 같은 질병에서, 장기간의 위약 치료를 방지하거나 및/또는 새로운 암 요법에 대한 실험에서 임상적인 효능을 보다 신속하게 측정하기 위해, 임상 실험 등에서, 증가하고 있다.
조직/세포학적 방법을 이용한 바이오마커 값의 측정
SCLC를 평가하기 위해, 다양한 조직 샘플을 조직학적 또는 세포학적 방법에 이용할 수 있다. 샘플 선택은 원발성 종양 위치 및 전이 부위에 따라 결정된다. 예를 들어, 엔도- 및 트랜스-기관지 생검, 세침 흡인물, 커팅 니들, 및 코어 생검이 조직학적 방법에 사용될 수 있다. 기관지 세척액 및 브러싱물, 흉막 흡인물, 흉수 및 가래도 세포학적 방법에 사용될 수 있다. 세포 분석이 SCLC를 진단하는데 여전히 사용되고 있지만, 암을 검출하기 위한 보다 나은 민감성을 제공하기 위한 조직학적 방법들이 공지되어 있다. SCLC인 개체에서 상향-조절 또는 하향-조절되는 것으로 입증된 본원에서 동정된 임의의 바이오마커를 사용해 질병의 지표로서 조직학적 표본을 염색할 수 있다.
일 구현예에서, 폐 조직 세포 샘플의 세포학적 평가에 대응되는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 이상의 포획 시약이 사용되며, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 세포 샘플을 수집하는 단계, 세포 샘플을 고정하는 단계, 현미경 슬라이드 상에서 세포 샘플을 탈수, 클리어링 (clearing), 고정화 단계, 세포 샘플을 투과화하는 단계, 분석물 회수 (analyte retrieval)를 위해 처리하는 단계, 염색하는 단계, 탈색하는 단계, 세척하는 단계, 차단하는 단계 및 하나 이상의 포획 시약과/완충화된 용액에서 반응시키는 단계. 다른 구현예에서, 세포 샘플은 세포 블럭 (cell block)으로부터 제조된다.
다른 구현예에서, 대응되는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 이상의 포획 시약(들)이 폐 조직 샘플의 조직학적 평가에 사용되며, 하나 이상의 하기 단계를 포함할 수 있다: 조직 표면을 수집하는 단계, 조직 샘플을 고정하는 단계, 현미경 슬라이드 상에서 세포 샘플을 탈수, 클리어링 (clearing), 고정화 단계, 세포 샘플을 투과화하는 단계, 분석물 회수 (analyte retrieval)를 위해 처리하는 단계, 염색하는 단계, 탈색하는 단계, 세척하는 단계, 차단하는 단계, 재수화하는 단계 및 하나 이상의 포획 시약과 완충화된 용액에서 반응시키는 단계. 다른 구현예에서, 고정 단계 및 탈수 단계는 동결 단계로 대체된다.
다른 구현예에서, 대응되는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 이상의 앱타머(들)를 조직 샘플 또는 세포 샘플과 반응시키고, 핵산 증폭 방법에서 핵산 타겟으로서 사용할 수 있다. 적합한 핵산 증폭 방법으로는, 예를 들어, PCR, q-beta 레플리카제 (replicase), 롤링 서클 증폭 (rolling circle amplification), 가닥 치환 (strand displacement), 헬리카제 의존적인 증폭 (helicase dependent amplification), 루프 매개 등온 증폭 (loop mediated isothermal amplification), 리가제 연쇄 반응 및 제한 효소 및 고리화를 이용한 롤링 서클 증폭 (restriction and circularization aided rolling circle amplification) 등이 있다.
일 구현예에서, 조직 또는 세포 평가에 사용하기 위한 대응되는 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 포획 시약(들)이 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있는 완충화된 용액 중에 혼합된다: 차단 물질, 경쟁 물질, 디터전트 (detergent), 안정화제, 캐리어 핵산, 다가음이온성 물질 등.
"세포 프로토콜"은 일반적으로 샘플 수집, 샘플 고정, 샘플 고정 및 염색을 포함한다. "세포 준비"는 준비된 세포를 염색하기 위해 하나 이상의 느린 off-rate 앱타머 (slow off-rate aptamer)의 사용을 포함하는, 샘플 수집 후 수개의 처리 단계를 포함할 수 있다.
샘플 수집은 무처리된 이동 용기에 샘플을 바로 넣는 단계, 샘플을 동일 타입의 배지가 든 이동 용기에 두는 단계, 또는 어떠한 처리 또는 고정 처리 없이 슬라이드 상에 샘플을 바로 두는 단계를 포함할 수 있다.
샘플 고정은 폴리라이신, 젤라틴 또는 실란으로 처리된 유리 슬라이드에 수집된 표본의 일부에 적용함으로써, 개선시킬 수 있다. 슬라이드 전체에 세포를 얇고 균일한 층으로 도포함으로써 슬라이드를 준비할 수 있다. 기계적 변형 (mechanical distortion)을 최소화하기 위해 일반적으로 주의를 기울여야 하며, 아티팩트 (artifact)를 건조시킨다. 액체 표본은 세포 블럭 방법으로 가공할 수 있다. 다른 예로, 액체 표본은 고정 용액과 1:1로 혼합하여 실온에서 약 10분간 둘 수 있다.
세포 블럭은 잔류 유출물, 가래, 뇨 침전물 (urine sediment), 위액, 폐 체액, 세포 스크랩핑 또는 세침 흡인물로부터 제조될 수 있다. 세포를 원심분리 또는 막 여과에 의해 농축 또는 패킹한다. 세포 블럭의 다수 제조 방법들이 개발되어 있다. 대표적인 방법으로는 고정 침사 (fixed sediment), 박테리아 아가 또는 막 여과 방법을 포함한다. 고정 침사 방법에서, 세포 침전물을 Bouins, 피크르산 (picric acid) 또는 완충화된 포르말린과 같은 고정제와 혼합한 다음 혼합물을 원심분리하여 고정된 세포를 펠릿화한다. 상층액을 분리하고, 세포 펠릿을 가능한 완전히 건조시킨다. 펠릿을 수집하여, 렌즈 페이퍼 (lens paper)로 감은 다음 조직 카세트 안에 둔다. 조직 카세트를 추가의 고정제가 든 병 (jar)에 넣고, 조직 샘플로서 처리한다. 아가 방법은 매우 비슷하지만, 펠릿을 분리하여 페이퍼 타월 위에서 건조시키고, 절반 절단한다. 유리 슬라이드 상의 용융된 아가 방울에 컷 슬라이드를 둔 다음, 아가 안에 방울이 생기지 않게 하면서 펠릿을 아가로 덮는다. 아가를 굳힌 다음 임의의 과량의 아가를 제거한다. 이를 조직 카세트 안에 넣고, 조직 처리를 완료한다. 다른 예로, 펠릿을 65℃에서 2% 액체 아가에 직접 현탁하고, 샘플을 원심분리할 수 있다. 아가 세포 펠릿을 4℃에서 1시간 동안 경화되게 둔다. 원심분리 관에서 고체 아가를 분리하여, 절반으로 자를 수 있다. 아가를 필터 페이터로 감은 다음 조직 카세트에 둔다. 이후로의 처리는 전술한 바와 같다. 원심분리는 막 여과를 이용한 임의의 고정으로 치환? 수 있다. 이들 임의의 공정을 이용해 "세포 블럭 샘플"을 제조할 수 있다.
세포 블럭은 Lowicryl 수지, LR White, LR Gold, Unicryl 및 MonoStep 등의 특수 수지를 사용해 제조할 수 있다. 이들 수지는 점성이 낮으며, 자외선 (UV) 광을 사용해 저온에서 중합할 수 있다. 임베딩 공정 (embedding process)은, 계속적으로, 탈수 중에 샘플의 냉각, 수지로의 샘플의 이동 및 적절한 UV 파장 하 최종 저온에서 블럭의 중합을 수반한다.
세포형태 검사를 위해 헤마톡실린-에오신으로 세포 블럭 섹션을 염색할 수 있으며, 이때 추가적인 섹션이 특정 마커에 대한 검사에 이용된다.
공정이 세포 공정 또는 조직학적 공정이든, 샘플의 분해를 방지하기 위해 추가적인 처리 전에 샘플을 고정시킬 수 있다. 이러한 과정을 "고정"이라고 하며, 상호 호환적으로 사용될 수 있는 매우 다양한 물질 및 절차들이 개시되어 있다. 샘플 고정 프로토콜 및 시약들 모두 검출할 타겟 및 분석할 특정 세포/조직 타입을 기초로 실험적으로 최상으로 선정된다. 샘플 고정은 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 메탄올, 포르말린 또는 이소프로판올 등의 시약에 의존한다. 샘플은 가능한 수집 및 슬라이드에 첨가 후 즉시 고정되어야 한다. 그러나, 선택된 고정제는 다양한 분자 타겟에 구조적인 변화를 유도하여, 이후의 검출을 더 어렵게 만들 수 있다. 고정 (fixation) 및 고정화 (immobilization) 공정 및 이의 순서는 세포의 외양을 변형시킬 수 있으며, 이러한 변화는 세포검사기사 (cytotechnologist)에 의해 예측 및 인지되어야 한다. 고정제는 특정 세포 타입의 수축을 야기할 수 있으며, 세포질에 과립체 (granular) 또는 망상체 (reticular)가 나타나게 유발할 수 있다. 다수의 고정제들이 세포 구성 성분을 가교함으로써 작용한다. 이는 특이적인 에피토프를 손상시키거나 또는 변형시킬 수 있으며, 새로운 에피토프를 생성시킬 수 있으며, 분자 조합 (molecular association)을 야기할 수 있으며, 막 투과성을 낮출 수 있다. 포르말린 고정이 가장 일반적인 세포/조직학적 방식 중 하나이다. 포르말린은 이웃한 단백질들 간에 또는 단백질내에 메틸 브릿지를 형성한다. 또한, 고정에 침전 또는 응고가 사용되는데, 에탄올이 이런 타입의 조건에 흔히 사용된다. 가교 및 침전의 조합도 고정에 사용될 수 있다. 형태학적 정보의 보존에는 강력한 고정 공정이 최선이며, 보다 약한 고정 공정은 분자 타겟을 보존하는데 최선이다.
대표적인 고정제는 50% 앱솔루트 에탄올, 2 mM 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 1.85% 포름알데하이드이다. 이 공식에 대한 변형으로 오직 에탄올 (50% - 95%), 메탄올 (20% - 50%) 및 포르말린 (포름알데하이드)만 포함한다. 다른 일반적인 고정제는 2% PEG 1500, 50% 에탄올 및 3% 메탄올이다. 슬라이드를 실온에서 약 10-15분간 고정제 안에 둔 다음 꺼내 건조시킨다. 슬라이드가 고정되면, 이를 PBS와 같은 완충화 용액으로 헹굴 수 있다.
매우 다양한 염료를 사용해 세포, 세포내 및 조직 피처 또는 형태학적 구조를 차별적으로 강조 및 대조하거나 또는 "염색"할 수 있다. 헤마톡실린을 사용해 핵을 청색 또는 검정색으로 염색한다. Orange G-6 및 Eosin Azure 둘다 세포의 세포질을 염색한다. Orange G는 케라틴과 글리코겐 함유된 세포를 노란색으로 염색한다. Eosin Y는 핵, 섬모, 적혈구 세포 및 표재성 상피 편평 세포를 염색하는데 사용된다. 공기 중에 건조한 슬라이드에는 로마노우스키 염색이 사용되며, 다형태성 (pleomorphism)을 강화하고, 세포외 물질을 세포질내 물질과 구분하는데 사용가능하다.
염색 공정은 세포의 염료 투과성을 높이기 위한 처리를 포함할 수 있다. 세포에 디터전트 처리를 이용해, 투과성을 높일 수 있다. 세포 및 조직 투과성을 높이기 위해, 고정된 샘플을 용매, 사포닌 또는 비-이온성 디터전트로 추가로 처리할 수 있다. 또한, 효소적 분해는 조직 샘플에서 특이적인 타겟의 접근성을 향상시킬 수 있다.
염색 후, 샘플을 알코올 농도를 높이면서 연속적으로 알코올로 헹굼으로써 탈수시킨다. 마지막 헹굼은, 슬라이드에 적용할 커버슬립과 가까운 굴절 지수를 가지는, 자일렌 또는 자일렌 기질, 예를 들어, 시트러스 테르펜을 사용해 행해진다. 이러한 마지막 단계를 클리어링이라 한다. 샘플이 탈수 및 클리어링화된 후, 마운팅 매질 (mounting medium)을 적용한다. 마운팅 매질은 유리에 가까운 굴절 지수를 가지도록 선택되며, 슬라이드에 커버슬립을 결합시킬 수 있다. 또한, 이는 세포 샘플의 추가적인 건조, 수축 (shrinking) 또는 페이딩 (fading)을 저해할 것이다.
사용되는 염료 또는 공정과 무관하게, 폐 세포 표본에 대한 최종적인 평가는, 형태에 대한 시각적인 검경과 마커 (marker)의 존재 또는 부재의 확인을 허용하는, 몇가지 타입의 현미경에 의해 수행된다. 현미경 방법의 예로는 브라이트필드 (brightfield), 위상 콘트라스트 (phase contrast), 형광 및 차등 간섭 위상차를 포함한다.
검경 후 샘플에 대한 이차적인 검사가 필요하다면, 커버슬립을 제거하고, 슬라이드를 탈색 (destain)시킬 수 있다. 탈색은, 염료 첨가 없이 슬라이드를 본래 염색하는데 사용되는 오리지날 용매 시스템을, 오리지날 염색 공정과 역순으로 사용하는 단계를 포함한다. 또한, 탈색은 세포가 무색이 될 때까지 산 알코올에 슬라이드를 침지함으로써, 완료할 수 있다. 무색이 되면, 슬라이드를 수조에서 잘 헹구고, 2차 염색 공정을 적용한다.
또한, 특이적인 분자 차별화 (specific molecular differentiation)는 항체 또는 핵산 프로브 또는 앱타머 등의 특이적인 분자 시약의 사용에 의한 세포의 형태적 분석과 함께 가능할 수 있다. 이는 진단 세포학적 방법의 정확도를 개선한다. 미세-절제 (micro-dissection)를 이용해, 추가적인 검사, 특히 비정상적인 염색체, 유전자 발현 또는 돌연변이에 대한 유전자 평가를 위해 세포 서브세트를 분리할 수 있다.
조직학적 평가를 위한 조직 샘플의 준비는 고정, 탈수, 침투, 임베딩 및 단편화 (sectioning)를 포함한다. 조직학적 방법에 사용되는 고정 시약은 세포학적 방법에 사용되는 것과 매우 유사하거나 동일하며, 개개 단백질과 같은 분자를 희생시키고 형태적 특징을 보존하는 동일한 문제를 가진다. 조직 샘플을 고정 및 탈수하지 않고 대신 동결시킨 다음 동결된 채 단편화 한다면, 시간을 절약할 수 있다. 이는 좀더 순한 처리 공정이며, 더 많은 개개 마커들을 보존할 수 있다. 그러나, 세포내 정보가 얼음 결정의 도입으로 인해 없어지기 때문에, 동결은 조직 샘플을 장기간 보관하는데에는 적합하지 않다. 또한, 동결된 조직 샘플에서 얼음은 단편화 공정에서 매우 얇은 슬라이스의 제조를 어렵게 하며, 그래서, 일부 현미경 해상도와 세포내 구조 이미지를 잃을 수 있다. 포르말린 고정과 더불어, 오스뮴 테트록사이드를 사용해 고정하고, 인지질 (막)을 염색한다.
조직의 탈수는 알코올 농도 증가에 따른 연속 세척으로 달성된다. 클리어링은 알코올 및 임베딩 물질과 혼화성인 물질을 사용하며, 50:50 알코올 클리어링 시약에서 출발하여 100% 클리어링제 (자일렌 또는 자일렌 치환물)까지의 단계적인 공정을 수반한다. 침투는 조직을 임베딩 물질의 액체 (따뜻한 왁스, 니트로셀룰로스 용액)와 먼저 50:50 임베딩 물질/클리어링 물질 비율에서 인큐베이션한 다음 100% 임베딩 물질과 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 임베딩은 조직을 몰드 또는 카세트에 넣고, 왁스, 아가 또는 젤라틴 등의 용융된 임베딩 물질을 충진함으로써, 완료된다. 임베딩 물질을 경화시킨다. 경화된 조직 샘플을 이후 염색 및 후속적인 검경을 위해 얇은 섹션으로 절단할 수 있다.
염색하기 전에, 조직 단편에서 왁스를 제거하고, 재수화한다. 자일렌을 사용해 단편에서 왁스를 제거하고, 하나 이상의 자일렌 변화를 적용할 수 있으며, 알코올 농도를 감소시키면서 연속적으로 세척하여 조직을 재수화한다. 왁스를 제거하기 전에, 조직 단편을 약 80℃에서 약 20분간 유리 슬라이드에 열 고정화할 수 있다.
레이저 캡처 미세-절제로 조직 단편에서 추가적인 분석을 위해 세포의 세브세트를 분리할 수 있다.
세포학적 방법에서와 같이, 현미경적 특징의 시각화를 강화하기 위해, 조직 단편 또는 슬라이스를 다양한 염료로 염색할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 다수의 염료들을 사용해 특이적인 특징을 강화 또는 동정할 수 있다.
분자 시약과 세포/조직 샘플 간의 상호작용을 추가로 높이기 위해, "분석물 회수 (analyte retrieval)"를 위한 다수 기법들이 개발되었다. 첫번째 기법은 고정된 샘플의 고온 가열을 이용하는 것이다. 이 방법은 또한 열-유도된 에피토프 회수 (heat-induced epitope retrieval) 또는 HIER로 지칭된다. 스트림 가열 (steam heating), 마이크로웨이브 조사, 자동멸균, 수조 및 가압 쿡킹 (pressure cooking) 또는 이들 가열 방법의 조합 등의, 다양한 열처리 기법들이 사용된다. 분석물 회수 용액은, 예를 들어, 물, 사이트레이트 및 정상 식염수 완충제를 포함한다. 분석물 회수의 주요 인자는 고온에서의 시간이지만, 보다 낮은 온도에서의 장기간 역시 성공적으로 이용된다. 분석물 회수에 있어 또 다른 주요 인자는 가열 용액의 pH이다. 낮은 pH는 최상의 면역염색을 제공하는 것으로 밝혀졌지만, 또한 음성 대조군으로서 제2 조직의 사용을 대개 필요로하는 백그라운드가 나타나게 만든다. 가장 일관된 이점 (백그라운드 증가 없이 면역염색 증가)은 일반적으로 완충제 조성과 무관하게 높은 pH 용액으로 달성된다. 특이적인 타겟에 대한 분석물 회수 공정은 공정 최적화의 변수로서 열, 시간 pH 및 완충제 조성이 실험적으로 최적화된다. 마이크로웨이브를 이용한 분석물 회수 방법은 여러가지 타겟을 항체 시약으로 연속 염색할 수 있다. 염색 단계에서 항체 및 효소 복합체를 수득하는데 소요되는 시간이 또한 세포 막 분석물을 분해하는 것으로 입증되었다. 마이크로웨이브 열처리 방법은 물론 인 시추 혼성화 방법을 개선시킨다.
분석물 회수 공정을 개시하기 위해, 단편에서 먼저 왁스를 제거하고, 수화시킨다. 그런 후, 슬라이드를 디쉬 또는 병 안에 든 l0 mM 소듐 사이트레이트 완충제 pH 6.0 중에 둔다. 대표적인 절차는 1100W 마이크로웨이브를 사용하며, 2분간 100% 파워로 슬라이드에 마이크로웨이브를 조사한 다음, 슬라이드가 액체 중에 커버된 상태인 지를 체크한 후 18분간 20% 파워로 슬라이드에 마이크로웨이브를 조사한다. 그런 후, 슬라이드를 노출된 용기에서 냉각시킨 다음 증류수로 헹군다. HIER을 효소적 분해와 함께 사용하여, 면역화학제에 대한 타겟의 반응성을 개선할 수 있다.
이러한 효소 분해 프로토콜은 프로테나제 K를 사용한다. 프로테나제 K는 50 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, pH 8.0 완충제 중에 20 g/mL의 농도로 준비된다. 먼저, 각각 5분씩, 자일렌을 2번 교체하여 단편에서 왁스를 제거한다. 그런 후, 샘플을 각각 3분씩 100% 에탄올로 2회, 각각 1분씩 95% 및 80% 에탄올로 수화한 다음 증류수에서 헹군다. 단편을 프로테나제 K 작업 용액으로 덮고, 습윤 챔버에서 37℃에서 10-20분간 인큐베이션한다 (최적 인큐베이션 시간은 조직의 타입 및 고정 정도에 따라 달라질 수 있음). 단편을 10분간 실온에서 냉각시킨 다음 PBS Tween 20에서 2x2분간 헹군다. 필요에 따라, 단편은, 내인성 화합물 및 효소로부터 잠재적인 간섭을 소거하기 위해, 차단 처리될 수 있다. 그런 후, 단편을 일차 항체 희석 완충제에서 적절한 희석 비율로 일차 항체와 실온에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 그 후, 단편을 PBS Tween 20으로 2x2분간 헹군다. 특수 처리가 필요한 경우, 추가적인 차단이 수행될 수 있으며, 그런 후, PBS Tween 20으로 3x2분간 헹군 다음 마지막으로 면역염색 프로토콜을 완료한다.
또한, 실온에서 1% SDS를 사용한 단순 처리가 면역조직화학적 염색을 향상시키는 것으로 입증된 바 있다. 분석물 회수 방법을 슬라이드에 탑재된 단편 뿐만 아니라 자유 유동성 단편에 적용할 수 있다. 또 다른 처리 옵션은 시트르산 및 0.1 Nonident P40 pH 6.0이 든 용기에 슬라이드를 배치하여, 95℃까지 가열하는 것이다. 그 후, PBS와 같은 완충제 용액으로 슬라이드를 헹군다.
조직의 면역학적 염색에서, 혈청 또는 탈지 건조 밀크와 같은 단백질 용액에 단편을 침지함으로써 조직 단백질로 항체의 비-특이적인 결합을 차단하는 것이 유용할 수 있다.
차단 반응은 내인성 바이오틴의 수준 감소; 내인성 하전 효과 (charge effect) 제거; 내인성 뉴클레아제의 불활성화; 및/또는 퍼옥시다제 및 알칼라인 포스파타제와 같은 내인성 효소의 불활성화 필요성을 포함할 수 있다. 내인성 뉴클레아제는 프로테나제 K를 이용한 분해, 열 처리, EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트제의 사용, 캐리어 DNA 또는 RNA의 도입, 우레아, 티오우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 구아니딘 티오시아네이트, 리튬 퍼클로레이트 등과 같은 카오트로피제 (chaotrope) 또는 다이에틸 피로카보네이트의 처리에 의해 불활성화될 수 있다. 알칼라인 포스파타제는 실온에서 5분간 0.1 N HCl 처리 또는 1 mM 레바미솔 (levamisole) 처리에 의해 불활성화될 수 있다. 퍼옥시다제 활성은 0.03% 과산화수소로 처리하여 없앨 수 있다. 내인성 바이오틴은 슬라이드 또는 단편을 아비딘 (스트렙타비딘, 뉴트라비딘이 치환될 수 있음) 용액 중에 실온에서 15분 이상 침지함으로써, 차단시킬 수 있다. 그런 후, 슬라이드 또는 단편을 완충제에서 10분 이상 헹군다. 이는 3번 이상 반복할 수 있다. 그 후, 슬라이드 또는 단편을 바이오틴 용액에 10분간 침지한다. 이는 매번 신선한 바이오틴 용액을 사용해 3번 이상 반복할 수 있다. 완충제 세척 공정은 반복된다. 차단 프로토콜은, 세포 또는 조직 구조물 또는 대상 타겟 또는 타겟들의 손상을 방지하기 위해, 최소화되어야 하지만, 한가지 이상의 프로토콜을 조합하여, 하나 이상의 느린 off-rate 앱타머와의 반응 전에, 슬라이드 또는 단편을 "차단"할 수 있다. Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, authored by Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998을 참조한다.
질량 분광측정 방법을 이용한 바이오마커 값의 결정
다양한 구성의 질량 분광측정기를 사용해 바이오마커의 값을 검출할 수 있다. 수종의 타입의 질량 분광측정기들이 이용가능하거나, 또는 다양한 구성으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 질량 분광측정기는 다음과 같은 주요 컴포넌트를 가진다: 샘플 유입구, 이온 소스, 질량 분석기, 검출기, 진공 시스템 및 장치-제어 시스템 및 데이타 시스템. 샘플 유입구, 이온 소스 및 질량 분석기에서의 차이가 일반적으로 장치의 타입과 이의 역량을 결정한다. 예를 들어, 유입구는 모세관-컬럼 액체 크로마토그래피 소스일 수 있거나, 또는 매트릭스-보조형 레이저 탈착에서 사용되는 바와 같이 직접 프로브 또는 스테이지일 수 있다. 일반적인 이온 소스는, 예를 들어, 나노분무 및 마이크로분무 등의 전자분무, 또는 매트릭스-보조형 레이저 탈착이다. 일반적인 질량 분석기는 사중극자 질량 필터, 이온 트랩 질량 분석기 및 비행 시간 질량 분석기를 포함한다. 부가적인 질량 분광측정 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)).
단백질 바이오마커 및 바이오마커 값은 다음과 같은 임의의 방법으로 검출 및 측정할 수 있다: 전자분무 이온화 질량 분광측정법 (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI- MS/(MS)n, 매트릭스-보조형 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (MALDI - TOF - MS), 표면 강화된 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS), 실리카에서 탈착/이온화 (desorption/ionization on silicon, DIOS), 이차 이온 질량 분광측정법 (secondary ion mass spectrometry, SIMS), 사중극자 비행 시간 (quadrupole time-of-flight, Q-TOF), 탠덤 비행 시간 (tandem time-of-flight, TOF/TOF) 기법, 소위 ultraflex III TOF/TOF, 대기압 화학 이온화 질량 분광측정법 (atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, 대기압 광 이온화 질량 분광측정법 (atmospheric pressure photoionization mass spectrometry, APPI-MS), APPI-MS/MS 및 APPI-(MS)N, 사중극자 질량 분광측정법 (quadrupole mass spectrometry), 푸리에 변환 질량 분광측정법 (Fourier transform mass spectrometry, FTMS), 정량적인 질량 분광측정법 (quantitative mass spectrometry), 및 이온 포착 질량 분광측정법 (ion trap mass spectrometry).
샘플 준비 전략을 이용해, 단백질 바이오마커의 질량 분광측정 규명과 바이오마커 값의 측정 전에, 샘플을 표지 및 농화한다. 표지 방법은, 비-제한적으로, 상대 및 절대 정량화를 위한 등압성 백 (isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 및 세포 배양시 아미노산을 이용한 안정적인 동위원소 표지 방법 (SILAC)을 포함한다. 질량 분광측정 분석 전에 후보 바이오마커 단백질에 대해 샘플을 선택적으로 농화하기 위해 사용되는 포획 시약으로는, 비-제한적으로, 앱타머, 항체, 핵산 프로브, 키메라, 소분자, F(ab')2 단편, 단쇄 항체 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 어피바디, 나노바디, 안키린, 도메인 항체, 얼터너티브 항체 스캐폴드 (예, 다이아바디) 인프리팅된 폴리머, 아비머, 펩티드 모방체, 펩토이드 (peptoid), 펩타이드 핵산, 트레오스 (threose) 핵산, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체 및 합성 수용체, 및 이의 변형체 및 단편 등이 있다.
근접 라이게이션 (Proximity Ligation) 분석을 이용한 바이오마커 값 결정
근접 라이게이션 분석을 이용해 바이오마커 값을 측정할 수 있다. 간략하게는, 테스트 샘플을, 한쌍의 항체 또는 한쌍의 앱타머일 수 있는, 한쌍의 친화성 프로브와 접촉시키고, 쌍의 각 멤버를 올리고뉴클레오티드로 연장시킨다. 친화성 프로브들의 쌍에 대한 타겟은 하나의 단백질에서의 2개의 분리된 결정부위이거나, 또는 2개의 서로 다른 단백질 각각에서의 하나의 결정부위일 수 있으며, 이는 호모- 또는 헤테로-다량체 복합체로서 존재할 수 있다. 프로브가 타겟 결정부에 결합되면, 올리고뉴클레오티드의 자유 말단들은 서로 혼성화할 만큼 충분히 근접하게 오게 된다. 올리고뉴클레오티드 연장부의 혼성화는, 올리고뉴클레오티드 연장부들이 충분히 근접하게 배치되었을 때, 올리고뉴클레오티드 연장부를 함께 연결하도록 작용하는 일반적인 커넥터 올리고뉴클레오티드에 의해, 촉진된다. 프로브의 올리고뉴클레오티드 연장부가 혼성화되면, 연장부의 말단들은 효소적인 DNA 라이게이션에 의해 함께 연결된다.
각각의 올리고뉴클레오티드 연장부는 PCR 증폭을 위한 프라이머 부위를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 연장부들이 서로 라이게이션되면, 올리고뉴클레오티드는 연속적인 DNA 서열을 형성하게 되고, 이는 PCR 증폭을 통해 타겟 단백질의 동일성 및 양에 대한 정보 뿐만 아니라 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 제공해주며, 이때 타겟 결정부는 2개의 서로 다른 단백질 상에 위치한다. 근접 라이게이션은 실시간 PCR 사용을 통해 실시간 단백질 농도 및 상호작용 정보를 위한 고도로 민감하고 특이성 높은 분석을 제공할 수 있다. 대상 결정부에 결합되지 않는 프로브는 근접하게 배치되는 대응되는 올리고뉴클레오티드 연장부를 가지지 않으며, 라이게이션 또는 PCR 증폭을 진행할 수 없어, 신호를 발생시키지 않는다.
전술한 분석은 본원에 기술된 방법에 유용한 바이오마커 값을 검출할 수 있으며, 방법은 개체 유래의 생물 샘플에서 본원에 제공된 바이오마커들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 바이오마커에 각각 대응되는 적어도 N개의 바이오마커 값을 검출하는 단계를 포함하며, 상세히 후술된 바와 같이, 바이오마커 값을 이용한 분류는, 개체가 SCLC를 앓고 있는지 또는 개체가 PARP 저해제 화학요법이 유익할 가능성이 있는지를 나타낸다. 언급된 SCLC 바이오마커들 중 특정 바이오마커는 개체를 PARP 저해제 화학요법을 받도록 배정하는데 단독으로 사용가능하지만, 또한 이는 단독으로 또는 2종 이상의 바이오마커로 된 패널로서 각각 사용가능한 SCLC 바이오마커들의 복수 서브세트로서 조합하여, SCLC를 검출 및 진단하는데 사용가능하다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현예들은 본원에 기술된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 조합을 제공한다. 다른 구현예에서, N은 바이오마커 1-10개 중 임의 개수로 선택된다. N은 전술한 임의 범위 뿐만 아니라 비슷하지만 더 높은 범위에서의 임의 수로 선택될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본원에 기술된 임의 방법에 따르면, 바이오마커 값은 개별적으로 검출 및 분류될 수 있거나, 또는 예를 들어, 멀티플렉스 분석 포맷에서와 같이, 종합적으로 검출 및 분류될 수 있다.
다른 측면에서, 개체로부터 유래된 생물 샘플에서 본원에 제공된 바이오마커들로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커에 각각 대응되는 N개 이상의 바이오마커 값을 검출하는 단계를 포함하는, PARP 저해제에 대한 감수성 증가 가능성 또는 SCLC 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 상세히 후술된 바와 같은 바이오마커 값의 분류는 개체에서 SCLC의 부재를 나타낸다.
달리 언급되지 않은 경우를 제외하고는, 본 구현예들의 방법 및 기법은 일반적으로 당해 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 본 명세서 전체에 인용 및 논의된 다양한 일반적인, 보다 구체적인 참조 문헌에 기술된 바와 같이, 수행된다.
명확하게 하기 위해, 개별 구현예의 맥락에서 기술된, 본 발명의 일부 특징들은, 또한, 하나의 구현예로 조합하여 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 역으로, 간결하게 하기 위해, 단독 구현예의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 또한 분리하여 또는 임의의 적절한 서브조합으로 제공될 수 있다. 변수가 표시된 화학 군들에 대한 구현예들의 모든 조합은, 본 발명에 구체적으로 포함되며, 각각 및 모든 조합이 개별적이고 명시적으로 기술된 것과 같이, 상기한 조합이 안정적인 화합물인 화합물 (즉, 생물학적 활성에 대해 분리, 특징 규명 및 검사될 수 있는 화합물)을 포괄하는 수준으로, 본원에 기술된다. 또한, 이러한 변수를 기술한 구현예들에 열거된 화학 군들의 모든 서브조합 역시 본 발명에 구체적으로 포함되며, 화학 군들의 각각 및 모든 서브조합이 개별적이고 구체적으로 본원에 명시된 것처럼 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 테스트 샘플은 폐 조직, 기관지 생검, 가래 및/또는 혈액 혈청으로부터 수득할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 열거 또는 예시된 종들이 전부 망라된 것이 아니며, 이들 정의된 용어 범위내에서 추가적인 종들 역시 선택될 수 있다는 것을, 인지할 것이다.
본원에 기술된 모든 식들은 그 구조식의 화합물 뿐만 아니라 일부 변형체 또는 형태들을 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본원에 제공된 식은 라세믹 형태 또는 하나 이상의 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 기하 이성질체 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에 제시된 임의의 식은 상기한 화합물의 수화물, 용매화물 또는 다형체, 또는 이들의 혼합물에 관한 것으로 의도된다.
본원에 제시된 임의 식은 또한 비-표지된 형태 뿐만 아니라 화합물의 동위원소 표지된 형태를 나타내는 것으로 의도된다. 동위원소 표지된 화합물은, 하나 이상의 원자가 선택된 원자 질량 또는 질량수를 가진 원자로 치환된 것이다. 구현예들의 화합물에 병합될 수 있는 동위원소의 예로는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소, 염소 및 요오드의 동위원소, 예로 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl 및 125I을 각각 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은, 개체에게 무독성, 생물학적으로 허용성인 또는 투여하기에 생물학적으로 적합한, 본원에 표시된 화합물의 유리 산 또는 염기의 염을 의미하는 것으로 의도된다. 일반적으로, S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19를 참조한다. 바람직한 약제학적으로 허용가능한 염은 약리학적으로 효과적이고, 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 없이 개체의 조직과 접촉하기에 적합한, 염이다. 본원에 기술된 화합물은 충분한 산성 기, 충분한 염기성 기, 양쪽 타입의 관능기, 또는 각 타입 2 이상을 가질 수 있으며, 그에 따라 다수의 무기 또는 유기 염기 및 무기 및 유기 산과 반응하여, 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다.
약학적 조성물 및 치료 방법
치료 목적으로, 본원에 기술된 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 무독성이며, 개체에 투여하기에 생물학적으로 적합한, 물질이다. 이러한 부형제는 본원에 기술된 화합물의 투여를 용이하게 하며, 활성 성분과 혼용가능하다. 약제학적으로 허용가능한 부형제의 예로 안정화제, 윤활제, 계면활성제, 희석제, 항산화제, 결합제, 착색제, 벌킹제, 유화제 또는 맛 변형제 (taste-modifying agent) 등이 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 멸균 조성물 (sterile composition)이다. 약학적 조성물은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되거나 이용가능하게 된 컴파운딩 기법을 이용해 제조할 수 있다.
조성물을 관리하는 국립 및 지방 규제에 부합하는 조성물 등의, 멸균 조성물 역시 본 발명에 포함된다.
본원에 기술된 약학적 조성물 및 화합물은, 다양한 투약 형태를 제조하기 위해, 적절한 약제학적 용매 또는 담체 중의 용액제, 유제, 현탁제 또는 분산제로서, 또는 환제, 정제, 로젠제, 좌제, 사셰제, 당의정제, 과립제, 산제, 재구성용 산제, 또는 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 따른 고체 담체가 첨가된 캡슐제로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 비경구, 직장, 코, 국소 또는 눈 경로와 같은 적절한 전달 경로에 의해, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 정맥내 또는 경구 투여용으로 제형화된다.
경구 투여용인 경우, PARP 저해제 또는 탈라조파립은 정제 또는 캡슐제와 같은 고체 형태로, 또는 용액, 유제 또는 현탁제로서 제조될 수 있다. 경구 조성물을 제조하기 위해, 활성 물질을 제형화하여, 예를 들어, 매일 약 0.01 내지 약 50 mg/kg, 또는 매일 0.05 내지 약 20 mg/kg, 또는 매일 약 0.1 내지 약 10 mg/kg의 투여량 (dosage)으로 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 경구 투약 형태는 약 25 내지 약 1100 ㎍/day, 또는 약 0.5 내지 약 2 mg/day, 또는 약 1 mg/day, 또는 약 0.10 내지 0.75 mg/kg/day, 또는 약 0.25 내지 0.30 mg/kg/day의 용량 (dose)을 제공한다. 경구 정제는 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 착향제, 착색제 및 보존제와 같은 혼용가능한 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 활성 성분(들)을 포함할 수 있다. 적절한 불활성 충진제로 소듐 카보네이트, 칼슘 카보네이트, 소듐 포스페이트, 칼슘 포스페이트, 락토스, 전분, 당 (sugar), 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 있다. 액체 경구 부형제의 예로는 에탄올, 글리세롤, 물 등이 있다. 예시적인 붕해제는 전분, 폴리비닐-피롤리돈 (PVP), 소듐 전분 글리콜레이트, 미세결정 셀룰로스 및 알긴산을 포함한다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있다. 윤활제는, 존재하는 경우, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 필요에 따라, 위장관내 흡수를 지연하기 위해, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트 등의 물질로 정제를 코팅하거나, 또는 장용 코팅제로 코팅할 수 있다.
경구 투여용 캡슐제는 경질 및 연질 젤라틴 캡슐제를 포함한다. 경질 젤라틴 캡슐제를 제조하기 위해, 활성 성분(들)을 고체, 반-고체 또는 액체 희석제와 혼합할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐제는 활성 성분을 물, 오일, 예를 들어 땅콩 오일 또는 올리브 오일, 액체 파라핀, 단쇄 지방산의 모노 및 다이-글리세라이드의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 400 또는 프로필렌 글리콜과 혼합함으로써, 제조할 수 있다.
경구 투여용 액체는 현탁제, 용액제, 유제 또는 시럽제 형태일 수 있거나, 또는 물 또는 그외 적합한 비히클로 사용 전에 재구성하기 위한 건조 산물로서 동결건조 또는 제공될 수 있다. 이러한 액체 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어, 현탁화제 (예, 소르비톨, 메틸 셀룰로스, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 알루미늄 스테아레이트 겔 등); 비-수성 비히클, 예컨대, 오일 (예, 아몬드 오일 또는 분획화된 코코넛 오일), 프로필렌 글리콜, 에틸 알코올 또는 물; 보존제 (예, 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산); 습윤제, 예로 레시틴; 및 적절한 경우, 착향제 또는 착색제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 좌제로서 직장 투여용으로 제형화될 수 있다. 정맥내, 근육내, 복막내, 비강내 또는 피하 경로 등의 비경구 용도의 경우, 본 발명의 물질들은 멸균 수용액 또는 현탁액 중에 제공될 수 있으며, 적절한 pH 및 등장성으로 완충화되거나 또는 비경구 허용가능한 오일 중에 제공될 수 있다. 적절한 수성 비히클은 링거액 및 등장성 염화나트륨이다. 이러한 형태는 앰플 또는 1회용 주사 기구와 같은 단위 투여량 형태 (unit-dose form)로, 적절한 투여량을 취할 수 있는 바이얼과 같은 다중-투여량 형태 (multi-dose form)로, 또는 주사용 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있는 고체 형태 또는 프리-농축물 (pre-concentrate)로 제공될 수 있다. 예시적인 주입 투여량은 수분 내지 수일 범위의 기간 동안 약제학적 담체와 혼합된 물질 약 1 내지 1000 ㎍/kg/minute 범위이다.
코, 흡입 또는 경구 투여의 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 예를 들어 적절한 담체를 또한 포함하는 스프레이 제형을 이용해 투여할 수 있다.
국소 적용하는 경우, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 크림제 또는 연고제로서 또는 국소 투여에 적합한 유사한 비히클로서 제형화된다. 국소 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 비히클에 대해 약물을 약 0.1% 내지 약 10%의 농도로 약제학적 담체와 혼합할 수 있다. 본 발명의 물질을 투여하는 다른 방식은 경피 전달을 달성하기 위한 패치 제형을 이용할 수 있다.
본원에서, 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 임상적인 결과를 비롯하여 유익한 또는 원하는 결과를 수득하는 방식을 지칭한다. 본 발명의 목적에서, 유익한 또는 원하는 결과는, 비-제한적으로, 증상의 완화 및/또는 증상의 정도 감소 및/또는 질환 또는 병태와 관련있는 증상의 악화 방지 및/또는 기존의 질환, 증상 또는 병태의 중증도 저하 또는 악화 억제를 포함한다. 즉, 치료는 기존 질환 증상의 완화 또는 악화 예방, 추가적인 증상의 발생 예방, 증상의 기저 전신성 요인의 완화 또는 예방, 장애 또는 질환의 저해, 예를 들어, 장애 또는 질환의 발생 정지, 장애 또는 질환의 경감, 장애 또는 질환의 퇴행 유발, 질환 또는 장애에 의해 유발되는 병태의 경감, 또는 질환 또는 장애의 증상 정지를 포함한다. 일 예에서, SCLC의 치료는, 예를 들어, 종양 크기 감소, 종양 증식 서행 또는 전이 감소에 의해 나타난다.
본 발명에 따른 치료 방법에서, "유효량"은 일반적으로 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 원하는 치료학적 이점을 제공하기에 충분한 함량 또는 용량을 의미한다. 본 발명에 따른 화합물의 유효량 또는 용량은 모델링, 용량 증가 또는 임상 실험 등의 일반적인 방법에 의해, 일반적인 인자, 예를 들어, 투여 또는 약물 전달 방식 또는 경로, 물질의 약동학적 특성, 감염의 중증도 및 코스, 개체의 건강 상태, 병태 및 체중, 치료 의사의 판단을 고려해, 정해질 수 있다. 용량의 예는 1일 당 개체의 체중 kg 당 활성 물질 약 1 ㎍ 내지 2 mg, 바람직하게는 약 0.05 내지 100 mg/kg/day, 또는 약 1 내지 35 mg/kg/day, 또는 약 0.1 내지 10 mg/kg/day의 범위이다. 총 용량은 단일한 또는 분할된 투약 단위 (예, BID, TID, QID)로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 매일 약 0.01 내지 약 50 mg/kg, 또는 매일 약 0.05 내지 약 20 mg/kg, 또는 매일 약 0.1 내지 약 10 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 투약 형태는 약 25 내지 약 1100 ㎍/day, 또는 약 0.5 내지 약 2 mg/day, 또는 약 1 mg/day, 또는 약 0.10 내지 0.75 mg/kg/day, 또는 약 0.25-0.30 mg/kg/day의 용량으로 제공된다. 일부 구현예에서, 일일 총 용량 (total daily dose)은 단일 용량으로 또는 단일 경구 용량으로 투여된다.
환자의 질환이 개선되면, 예방적 또는 유지 치료에 맞게 용량을 조정할 수 있다. 예를 들어, 투여의 투여량 또는 빈도, 또는 이 둘다는 증상의 함수로서, 원하는 치료학적 또는 예방학적 효과가 유지되는 수준까지 낮출 수 있다. 물론, 증상이 적절한 수준까지 완화되면, 치료를 중단할 수 있다. 그러나, 증상의 재발시 환자가 장기간 간헐적인 치료를 요구할 수 있다. 또한, 환자는 장기간 장기적인 치료를 요구할 수도 있다.
실시예
본원에 기술된 실시예는 단지 본 발명의 예시적인 구현예들을 설명하기 위해 제공된다. 즉, 본 발명이 본원에 논의된 이들 또는 임의의 다른 실시예에 기술된 구체적인 조건 또는 상세 내용으로 제한되지 않으며, 이러한 실시예들이 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는 것으로, 이해되어야 한다. 하기 실시예들은 예시를 제공하나, 본 발명의 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 단일 제제 탈라조파립을 이용한 세포주 세포독성 분석
다양한 SCLC 세포주 (38)들을 표 1에 나타낸 바와 같이 ATCC (American Type Culture Collection), ECACC (European Collection of Cell Cultures), JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources) 및 CLS 세포주 Service로부터 입수하였다.
표 1:
Figure pct00002
세포는 권고 배지에서 증식시켰으며, 미리 정해진 세포 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 0.2% DMSO 중의 2000, 400, 80, 16, 3.2 또는 0.64 nM 농도의 탈라조파립, 또는 100,000, 2000, 400, 80, 16 또는 3.2 nM 농도의 시스플라틴을 2세트로 첨가하고, 다시 5 또는 7일간 배양하였다. 세포 생존을 CellTiter Glo assay (Promega)으로 측정하였다. 세포 증식 저해는 2가지 방법으로 계산하였다: (a) IC50 (통례적인 생존율 (survival fraction) 방법)을 수득하기 위한 무처리 대조군 대비 처리 세포 카운트, 또는 (b) GI50 (일반 방법)을 수득하기 위한 베이스라인에서의 더블링 (doubling) 대비 처리시 베이스라인에서의 더블링, GraphPad Prism5 사용됨. 또한, 각 방법에서 최대 저해 수준을 구하였다.
38종의 SCLC 세포주들은 탈라조파립 (GI50 2 nM 내지 > 2000 nM, GI50 중간값 = 56 nM) 및 시스플라틴 처리 (GI50 10 nM 내지 > 10,000 nM)에 대해 광범위한 감수성 범위를 나타내었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 탈라조파립 및 시스플라틴에 대한 감수성은 충분한 상관성이 존재하였다 (스피어만 상관관계 = 0.756).
도 2에 나타낸 바와 같이, 탈라조파립에 대한 세포주 감수성과 관련된 유전자 발현 특징을 동정하기 위해, 세포주를 GI50 중앙값과 하기 기준을 이용한 탈라조파립에 의한 90% 실험적인 최대 GI 저해를 기반으로 감수성 그룹들로 분류하였다: 감수성: 최대 GI 저해 > 190 및 GI50 < 56 nM (스크리닝한 SCLC 세포주들의 평균); 내성: 최대 GI 저해 < 190 및 GI50 > 56 nM; 및 중간 수준인 나머지 세포주.
SCLC 세포주에 대한 유전자 발현 데이타를 CCLE portal (CCLE_Expression_Entrez_2012-09-29.gct; Barretina Caponigro Stransky et al., Nature 483, 603-307, 2012)에서 입수하였다. 36주의 SCLC 세포주들에서 평균 SLFN11 발현 수준은 5.78이었다. SLFN11 발현 수준이 6.0 보다 높은 세포주 16주는 고 SLFN11 그룹 (6.4 - 9.5)으로 표시하고, 나머지 20주의 SCLC 세포주들은 저 SLFN11 그룹 (3.6 - 5.0)으로 표시하였다.
스피어만 상관관계 및 ANOVA 검정 등의 표준 통계 분석을 수득한 데이타에 적용하였다. 감수성 세포주 군과 내성 세포주 군 간의 차별적으로 발현되는 유전자들을 R의 limma package에 의해 동정하였다 (Ritchie et al., Nucleic Acids es . 2015, 43(7): e47). R의 limma package를 이용한 moderated t-검정을, 감수성 세포주 군과 내성 세포주 군 간의 차별적인 유전자 발현 분석에 사용하였으며, R의 FDR 방법을 이용한 다중 이론 검정 (multiple hypothesis testing)으로 명목 p-값을 조정하였다. SLFN11이, 조정된 p-값 < 0.5 및 명목 p-값 2.3x10- 5을 이용한 본 분석에서, 가장 유의미한 피처였다. 탈라조파립에 대한 감수성에 기반한 차별적인 유전자 발현 분석에서, 도 3A-3E에 나타낸 바와 같이, 상위 유전자 발현 피처로서 SLFN11이 동정되었다.
도 4는 감수성과 연관된 상위 유전자 발현 피처를 도시한 것으로, 명목 p-값이 < 0.001인 피처들은 박스로 강조 표시하고, 좌측에 히트맵으로 작성하여 상위 9개 유전자의 계층 클러스터링을 도시하였다. 동정된 유전자 9종에는 SLFN11이 포함되었으며, 뿐만 아니라 세포자살 조절 (BCL2, GULP1), 온코진 (MAF), DNA/RNA 조절 (DDX6), 미-폴딩된 단백질 반응 (SIL1), 소기관 발생 (organelle biogenesis) (AP3B1) 및 포스페이트 수송 (SLC25A3)에 관여하는 유전자 및 기능 미확인 유전자 (C1orf50)가 포함되었으며, 이들 모두 탈라조파립에 대한 세포주 감수성과 관련하여 명목상 유의하였다.
12종의 SCLC 세포주로부터 추출한 세포 용해물에 SLFN11 항체를 사용해 웨스턴 블롯을 실시하였으며; β-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, SLFN11 단백질 수준은 CCLE 데이타베이스의 유전자 발현 RMA 데이타와 충분한 상관성이 존재하였으며, 이는 SLFN11 단백질 발현이 프로모터 메틸화와 같은 전사를 통해 후성적으로 조절됨을 시사한다.
실시예 2: 세포주 유래 이종이식 모델
인간 NCI-H1048, NCI-H209 및 NCI-H69 SCLC 종양 세포를 BALB/c 누드 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 평균 체적 약 130 mm3에 도달하면, 동물 (n = 8 /그룹)에 비히클 (Q1D x 28, p.o.), 시스플라틴 (6 mg/kg, Q6D x2 i.p.) 또는 탈라조파립 (0.33 mg/kg, Q1D x 28 p.o.)을 처리하였다. 종양 증식과 동물의 체중을 표준 방법으로 주당 2회 모니터링하였다.
고 SLFN11-발현성 SCLC 이종이식 모델 NCI-H1048 (도 6A) 및 NCI-H209 (도 6B) 뿐만 아니라 저 SLFN11-발현성 모델 NCI-H69 (도 6C)에서, 탈라조파립 단일 물질 처리에 대한 반응성을 평가하였다. 종양 증식 데이타를 통해, 비슷한 실험 조건에서, H209 및 H1048 모델이, H69 모델에 비해, 탈라조파립에 훨씬 더 민감하고, 그 반응이 RNA 수준과 연관성이 있는 것으로 검증되었다 (표 2).
표 2:
Figure pct00003
실시예 3: 인간 환자-유래의 이종이식 ( PDX ) 모델
12종의 인간 SCLC PDX 모델 (Crown Biosciences, OncoTest, WuxiAppTec)에서 탈라조파립 단일 물질 처리에 대한 반응을 평가하였다. PDX 종양을 3-13 계대에서 면역약화된 마우스에 피하 증식시켰다. 종양이 평균 체적 약 150 mm3에 도달하면, 동물 (n = 5 /그룹)에 비히클 (매일 1회 투여) 또는 최고 허용 용량의 탈라조파립 (MTD; 0.25 - 0.3 mg/kg, 매일 1회)을 경구 투여하였다. 종양 체적과 동물의 체중을 실험 종료시까지 또는 종양 크기가 2000 mm3을 넘을 때까지 매주 2회 측정하였다. 무처리 종양 샘플을 마우스에서 수집하였다. 1차 처리 후 21일 및 그 이후에 종양 체적 중앙값을 이용해, 베이스라인으로부터의 변화를 계산하여 반응을 평가하였다.
12종의 인간 SCLC PDX 모델에서 비히클 대조군과 비교하여 탈라조파립의 최고 허용 용량에서 추가로 테스트하였다. PDX 모델 12종 중 3종은 탈라조파립 처리 중에 베이스라인과 비교해 30% 이상의 종양 퇴행을 나타내어, 이를 부분 반응 (PR)으로 분류하였으며; PDX 종양 모델 12종 중 3종은 1차 투여 후 21일 및 그 이후에 종양 증식이 100% 미만으로, 안정적인 질환 (SD)-유사 반응을 나타내었고, 나머지 PDX 모델은 탈라조파립 처리에 내성을 나타내어 진행형 질환 (PD)으로 분류하였다 (도 7). 대표적인 각 종양 증식 곡선을 도 8A-8F에 도시한다.
역상 단백질 어레이 ( RPPA )
Byers et al., Cancer Discovery 2012. 2, 798에 기술된 방법을 이용해 PDX 종양 샘플을 대상으로 RPPA를 수행하였다. RPPA 분석에 사용되는 SLFN11 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Cat# sc-374339)에서 입수하였다. RPPA 분석에서, PR 및 SD 반응군들이 PD 반응군과 비교해 SLFN11 단백질을 더 높은 평균 수준으로 발현하였으며, p 값은 0.049인 것으로 확인되었다 (도 9A, 9B). RNA 수준에서, SLFN11 역시 PR 및 SD 군들에서 더 높고, p 값은 0.046이었다 (도 9C).
RNA- Seq 전사체 서열분석 및 분석
2종의 이종이식 종양을 각 PDX 모델에서 수집하고, AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen)를 사용해 총 RNA를 추출하였다. RNA 샘플에 Ribo-zero 키트 (Illumina)를 사용해 리보좀 RNA를 제거한 다음 라이브러리를 구축하였다. RNA 서열분석을 HiSeq4000 PE100으로 수행하였다. RNA-Seq 페어링된-말단 리드 (paired-end read)를, STAR (version 2.4.1b; Dobin et al., Bioinformatics 2012, 29(1): 15-21)을 이용해, 인간 (GRCh38, GENCODE에서 20 발표; Harrow et al., Genome Res. 2012, 22(9):1760-74) 및 마우스 (GRCm38.p3, GENCODE에서 M4 발표) 유래의 조합 게놈과 정렬하였다. 수득한 정렬 BAM 파일을 Samtools (version 1.2; Li et al., Bioinformatics 2009, 25: 2078-9)을 이용해 판독명으로 분류하였다. 인간 및 마우스 조합 주석 (GENCODE에서 각각 20 및 M4 발표)에서 각 유전자에 정렬된 리드 쌍의 수를 HTSeq (version 0.6.1p1; Anders et al., Bioinformatics 2015, 31(2): 166-9)로 카운팅하였다. 인간에만 고유하게 정렬될 수 있는 리드 쌍들을 사용해, 유전자 발현과 탈라조파립 감수성 간의 상관성을 조사하였다.
RPPA 및 RNA-Seq에 의한 바이오마커 분석을 통해, 도 10A 및 10B에 도시된 바와 같이, 저 ATM-발현성 PDX 모델이 탈라조파립에 더 감수성인 것으로 확인되었다.
유전자 돌연변이 분석
유전자 돌연변이 분석 결과, SCLC PDX 종양 12종 모두 SCLC에서 예측되는 TP53 및/또는 RB1 돌연변이를 가지고 있는 것으로, 확인된다 (표 3).
표 3:
Figure pct00004
N/A: 입수불가. Wt: 야생형
*종양 체적 중앙값 (n=5).
실시예 4: Myriad HRD 스코어 비교
도 11에 나타낸 바와 같이, 처리된 SCLC 세포주 또는 SCLC PDX 모델에서, 탈라조파립 반응과 Myriad HRD (상동적인 재조합 결핍, homologous recombination deficiency) 스코어 간에 명백한 연관성은 관찰되지 않았다.
본원 전체에서 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원 등의 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전술한 본 발명은 명확한 이해를 위해 예시 및 예를 들어 일부 상세하게 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 일부 최소한의 변화 및 수정이 실시될 수 있음이 자명하다. 따라서, 상세한 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (23)

  1. SLFN11을 발현하는 개체에서 소-세포성 폐암을 치료하는 방법으로서,
    상기 개체에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 소-세포성 폐암 개체를 치료하는 방법으로서,
    상기 개체 유래의 종양 세포 샘플에서 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및
    상기 개체에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 소-세포성 폐암 개체를 치료하는 방법으로서,
    상기 개체의 소-세포성 폐암 종양 샘플에서 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 및 GULP1 중 하나 이상을 검출하는 단계; 및
    상기 개체에게 유효량의 PARP 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PARP 저해제가 탈라조파립, 올라파립, 루카파립, 벨리파립, CEP9722, MK4827 또는 BGB-290, 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 PARP 저해제가 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 PARP 저해제가 탈라조파립의 토실레이트 염인, 방법.
  7. SLFN11을 발현하는 개체에서 소-세포성 폐암을 치료하는 방법으로서,
    상기 개체에게 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 1일 당 약 0.5 내지 약 2 mg, 또는 약 1 mg/day, 또는 약 0.10-0.75 mg/kg/day, 또는 약 0.25-0.30 mg/kg/day의 용량으로 경구로 매일 1회 투여되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 발현하는 개체인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상에 대한 증가된 발현 수준을 가지는 개체인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PARP 저해제 또는 탈라조파립 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 한가지 이상의 화학요법, 수술 및/또는 방사선치료와 병용하여 투여되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 한가지 이상의 화학요법이 DNA 손상제 (DNA damaging agent), 테모졸로미드 (temozolomide), 토포이소머라제 1 저해제 (topoisomerase 1 inhibitor), 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan), 토포이소머라제 2 저해제, 에토포시드 (etoposide), 엔잘루타미드 (enzalutamide), ATR 저해제, EGFR 저해제, 백금 약물 (platinum drug), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin) 또는 에토포시드 (etoposide)인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 이전에 백금 약물 또는 시스플라틴 또는 카포플라틴 치료를, 선택적으로 에토포시드와 병용하여 받은 적이 있는 개체인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 ATM을 감소된 수준으로 발현하는 개체인, 방법.
  15. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    검출되는 바이오마커들 중 하나가 SLFN11인, 방법.
  16. 제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 단계가, 면역조직학적 분석, 면역조직화학적 염색 (IHC) 분석, in-situ LC/MS 분석, 프로모터 메틸화 분석, 세포학적 분석, mRNA 발현 분석, RT-PCR 분석, 노던 블롯 분석, 단백질 발현 면역흡착 분석 (ELISA), 효소-연계된 면역스팟 분석 (ELISPOT), 측면 유동 검사 (lateral flow test) 분석, 효소 면역분석, 형광 편광 면역분석 (fluorescent polarization immunoassay), 화학발광 면역분석 (CLIA) 또는 형광 활성화된 분류 분석 (fluorescence activated sorting assay, FACS)에 의한 검출을 포함하는, 방법.
  17. 제1항 또는 제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상을 증가된 수준으로 발현하는 개체인, 방법.
  18. 제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 단계가 SLFN11, SIL1, SLC25A3, MAF, AP3B1, C1orf50, BCL2, DDX6 또는 GULP1 중 하나 이상의 증가된 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 개체는 ATM을 감소된 수준으로 발현하는 개체인, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 검출 단계는 ATM을 검출하는 단계 또는 ATM의 감소된 발현 수준을 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 TP53 및/또는 RB1 돌연변이를 발현하는 개체인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에서 SLFN11에 대한 RMA 스코어가 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 8 이상인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 40 이하, 35 이하, 30 이하, 25 이하, 또는 20 이하의 Myriad HRD 스코어를 가지는, 방법.
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