KR20180115531A - 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법 및 그에 따라 제조된 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체 - Google Patents
세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법 및 그에 따라 제조된 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인체에 무해한 셀룰로오스 나노섬유를 활용해 세포 배양 및 생체 조직을 재생할 수 있도록 도와주는 3차원 구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는, 안정적이고 균일하게 세포를 캡슐화할 수 있을 뿐 아니라, 균일한 크기의 기공을 가짐에 따라 영양분 및 산소 등에 대해 우수한 투과율을 보여, 지속적인 세포 성장 및 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 상기 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 세포 배양 혹은 생체 조직 재생과 같은 여러 조직 공학 분야에 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법 및 이에 의해 제조된 세포배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에 관한 것이다.
세포배양은 바이오 분야 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는데 매우 광범위하게 이용되고 있다. 세포배양에 있어 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 된 기질(substrate)로 이루어진 2차원 표면에서 세포를 배양하는 방법이다.
그러나, 통상적인 2차원적 세포배양 시 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상은 실제 생체 조직환경에서 일어나는 현상과 크게 다르다. 실제 세포는 세포외기질(extracellular matrix)에 부착되어 3차원적 생체조직 환경에서 성장하기 때문이다. 즉, 2차원적 세포배양 방법은 3차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점이 있다. 따라서, 2차원적 세포배양 방법이 지니고 있는 상기 문제점을 해결하기 위해 최근 3차원적 세포 배양에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다.
3차원적 생체조직 모사 세포배양 환경을 조성하기 위해 주로 이용하고 있는 방법은 세포를 구멍이 나있는 3차원 세포 배양 생체 조직을 이용하여 배양하는 것이다. 3차원 세포 배양 생체 조직을 제작하는 데 사용되고 있는 생체재료들 중 대표적인 천연 고분자 하이드로겔로는 콜라젠, 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 젤라틴 (gelatin), 피브린(fibrin), 매트리젤(matrigel)이 있다. 이중 매트리젤이 3차원 세포 배양 생체 조직을 제작하는데 있어서 가장 탁월한 물질이지만, 암세포 유래 물질이기 때문에 실험실에서의 사용은 (in vitro) 가능하나 실제 사람이나 동물에게 임상 적용을 하는 것은 불가능하다. 따라서, 인체에 무해한 생체재료로 이루어진 3차원적 세포배양 구조체에 대한 연구 및 개발은 매우 중요한 의의를 지닌다.
셀룰로오스는 무미/무취의 천연 고분자 다당체로서, D-글루코스 단위체가 β-1,4 결합으로 무수히 결합하여 이루어진 다당류 물질이고, 자연계에 가장 많이 존재하는 유기화합물 섬유소이다. 또한, 식물세포벽의 기본구조이며 화학식은 (C6H10O5)n으로 물에 녹지 않는다는 특징을 가진다. 셀룰로오스는 다당류 중에서도 분자량이 수만에서 수십만으로 가장 크고 공업적으로는 종이나 방직용 섬유로 대량 사용되며, 셀룰로오스 유도체는 플라스틱, 폭발물, 접착제, 필름 등의 용도로 사용되고 있다.
특히 셀룰로오스를 10억분의 1m 크기로 만든 초미립자 상태의 셀룰로오스인 셀룰로오스 나노섬유는 우수한 생체적합성, 높은 열 안정성, 저밀도, 저공극, 낮은 공기투과율, 높은 투명도 등의 특징을 가지고 있어 새로운 의료용 첨단 신소재로서 이용될 가능성을 가지고 있다.
그러나, 아직까지 셀룰로오스 나노섬유를 이용하여 3차원 세포배양을 수행하기 위한 구조체에 대한 보고는 많지 않으며, 셀룰로오스 나노섬유와 같은 유용한 신소재를 활용한 세포 배양 구조체에 대한 필요성이 있다.
이에, 본 발명자들은 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 개발하고자 노력한 결과, 낮은 기계적 물성을 가져 세포를 구조체 내에서 균일하게 분포시키지 못하고 세포성장률이 배양 7일 이후 급격히 떨어지는 매트리젤에 비해, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 세포를 구조체 내에서 균일하게 분포시킬 수 있고 장기적인 성장 및 분화를 일으킬 수도 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인체에 무해한 셀룰로오스 나노섬유를 활용해 세포 배양 및 생체 조직을 재생할 수 있도록 도와주는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 단계; (b) 상기 셀룰로오스 나노섬유와 세포 포함 배지를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 혼합물에 이가양이온을 첨가하여 겔화된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제공한다.
본 발명에 따른 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 3차원 구조체는 우수한 기계적 특성을 가질 뿐 아니라, 전단응력(shear stress)에 좌우되는 점성을 가졌기 때문에 쉽게 세포 배지와 혼합될 수 있으며, 전단응력이 사라진 다음에는 3차원 구조를 유지함으로써 세포가 급격히 침강하는 것을 방지하고 균일한 분포를 가질 수 있도록 도와준다. 또한 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체는 이가양이온을 첨가함으로써 쉽고 빠르게 겔화될 수 있으며, 이러한 겔화 과정은 다른 방법에 비해 간편하고 세포에 미치는 피해가 적기 때문에 실제 임상에 적용하기에 유리하다. 또한 이렇게 만들어진 겔은 더욱 우수한 기계적 물성을 가질 뿐 아니라, 충분히 큰 기공과 높은 투과성을 가지고 있어서 세포가 자라는데 필요한 영양분 및 산소 등의 투과가 잘 일어나므로, 이를 세포 배양에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1는 셀룰로오스 나노섬유의 전단응력-의존적인 유동학적 성질을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 1의 a는 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체 및 메트리겔 전구체에서 전단응력(shear stress)이 있는 환경과 없는 환경에서의 탄성계수(elastic modulus), 손실 탄성률(loss modulus), 복소점도(complex viscosity) 등을 레오미터를 이용해 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 b는 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체와 메트리겔 전구체에서의 세포 고정력 차이를 나타낸 것이다.
도 2는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체와 매트리젤에서의 캡슐화된 세포의 분포에 관한 SEM 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체가 CaCl2 용액에 의해 겔화되고, 겔화 됨으로써 기계적 물성이 증가하는 것을 나타낸 도이다. 도 3의 a는 세포가 캡슐화된 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체가 Ca2 +용액에 담긴 배지에서 가교 및 고정되는 과정을 나타낸 것이다. 도 3의 b는 셀룰로오스 나노섬유에서 Ca2+와의 연결부위를 나타낸 것이다. 도 3의 c는 셀룰로오스 나노섬유 탄성계수의 변화 그래프이다.
도 4는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체와 매트리젤에서의 기공의 크기 및 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 알부민 단백질 투과율을 나타낸 도이다. 도 4의 a는 매트리젤과 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 각각의 3차원 구조체의 기공 크기를 나타낸 것이다. 도 4의 b는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에서 FITC-BSA의 투과도를 나타낸 것이다. 도 4의 c는 BSA 투과도를 시간 제곱근의 함수로 도시한 것이다.
도 5는 3차원 셀룰로오스 구조체에 캡슐화된 세포들이 3주 동안 잘 생장하고 있음을 매트리젤과 비교하여 나타낸 도이다. 도 5의 a는 3차원 구조체에 캡슐화된 조골세포에 대하여 1일 및 21일 경과 후 LIVE/DEAD 염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 5의 b는 매트리젤과 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 각각의 3차원 구조체 내부에서의 조골세포의 생장 정도를 나타낸 그래프이다. 도 5의 c는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에 14일간 배양된 전조골세포의 이광자 공초점 이미지(two-photon confocal image)를 나타낸 것이다.
도 6은 캡슐화된 세포가 정상적으로 분화됨을 나타낸 도이다(DM은 조골세포의 분화를 유도하는 세포 배양 배지(differentiation medium)). 도 6의 a는 분화 자극을 주지 않은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체, 분화 자극을 받은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체, 분화 자극을 받은 매트리젤에서의 세포의 분화여부를 나타낸 것이다. 도 6의 b는 골형성 유전자인 Runx2, T1Col 및 OCN의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, unpaired t-test).
도 2는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체와 매트리젤에서의 캡슐화된 세포의 분포에 관한 SEM 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체가 CaCl2 용액에 의해 겔화되고, 겔화 됨으로써 기계적 물성이 증가하는 것을 나타낸 도이다. 도 3의 a는 세포가 캡슐화된 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체가 Ca2 +용액에 담긴 배지에서 가교 및 고정되는 과정을 나타낸 것이다. 도 3의 b는 셀룰로오스 나노섬유에서 Ca2+와의 연결부위를 나타낸 것이다. 도 3의 c는 셀룰로오스 나노섬유 탄성계수의 변화 그래프이다.
도 4는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체와 매트리젤에서의 기공의 크기 및 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 알부민 단백질 투과율을 나타낸 도이다. 도 4의 a는 매트리젤과 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 각각의 3차원 구조체의 기공 크기를 나타낸 것이다. 도 4의 b는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에서 FITC-BSA의 투과도를 나타낸 것이다. 도 4의 c는 BSA 투과도를 시간 제곱근의 함수로 도시한 것이다.
도 5는 3차원 셀룰로오스 구조체에 캡슐화된 세포들이 3주 동안 잘 생장하고 있음을 매트리젤과 비교하여 나타낸 도이다. 도 5의 a는 3차원 구조체에 캡슐화된 조골세포에 대하여 1일 및 21일 경과 후 LIVE/DEAD 염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 5의 b는 매트리젤과 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 각각의 3차원 구조체 내부에서의 조골세포의 생장 정도를 나타낸 그래프이다. 도 5의 c는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에 14일간 배양된 전조골세포의 이광자 공초점 이미지(two-photon confocal image)를 나타낸 것이다.
도 6은 캡슐화된 세포가 정상적으로 분화됨을 나타낸 도이다(DM은 조골세포의 분화를 유도하는 세포 배양 배지(differentiation medium)). 도 6의 a는 분화 자극을 주지 않은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체, 분화 자극을 받은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체, 분화 자극을 받은 매트리젤에서의 세포의 분화여부를 나타낸 것이다. 도 6의 b는 골형성 유전자인 Runx2, T1Col 및 OCN의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, unpaired t-test).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 (a) 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 단계; (b) 상기 셀룰로오스 나노섬유와 세포 포함 배지를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 혼합물에 이가양이온을 첨가하여 겔화된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 세포 지지 및 유지 능력이 우수하며, 이를 통해 장기적인 세포 배양 및 조직 재생에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명의 (a) 단계는, 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유의 제조단계는 증류수에 셀룰로오스 펄프를 첨가한 후, (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl, TEMPO), 브로민화나트륨(NaBr), 5% 치아염소산나트륨(NaClO), 및 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유는 표면개질된 셀룰로오스 나노섬유일 수 있고, 바람직하게는 카르복실기로 표면개질된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 수산화나트륨(NaOH)를 첨가하여 실온에서 반응시킨 후, 카르복실기로 산화된 셀룰로오스를 얻고, 이를 고압 균질기에 넣고 그라인딩함으로써 물에 분산된 카르복실기로 표면개질된 셀룰로오스 나노섬유를 제조하였다. 보다 구체적으로, 상기 (a) 단계는 셀룰로오스의 수산기를 카르복시산기로 전환하기 위한 산화단계를 포함한다. 상기 산화단계는 셀룰로오스 섬유 표면에 카르복시산기를 도입하여 매체에 균일하게 분산되도록 분산특성을 개선하는 과정이다. 일반적으로 수산기(OH)의 산화반응은, 하기 반응식 1에 나타낸 것처럼 수산(OH)기가 우선적으로 알데하이드기 (COH)로 전환되고, 이를 더욱 산화시키면 카르복시산기(COOH)로 전환된다.
[반응식 1]
알콜(-OH) → 알데하이드(-COH) → 카르복시산(-COOH)
본 발명의 (b) 단계는, 셀룰로오스 나노섬유와 세포 포함 배지를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계이다.
본 발명의 '셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체'란 이가양이온에 의해 가교 및 고정되기 이전의 셀룰로오스 나노섬유의 표면에 있는 -OH기가 TEMPO 존재 하에서 카르복실기로 산화된 상태를 말한다.
본 발명의 '셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체'란 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체가 이가양이온 용액이 담긴 배지에서 가교되어 이가양이온-카복시산염 복합체가 형성된 상태를 말한다. 예컨대, Ca2 + 용액이 담긴 배지에서 가교되어 칼슘-카복시산염(Ca-carboxylate) 복합체가 형성된 상태를 말한다. 또한 본 발명의 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 하이드로겔 상태인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 셀룰로오스 나노섬유에 혼합되는 세포는 장기적인 세포 배양 및 생체 조직 재생을 위한 목적으로 사용될 수 있으며, 목적 및 용도에 따라 1차 세포(primary cells), 줄기세포 등 다양한 종류의 세포를 혼합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 1차 세포란 개체에서 추출한 조직에서 유전자 등의 조작 없이 분리한 세포로 생체 장기 또는 조직의 기능을 대변하는 세포이다.
본 발명에 있어서, 상기 1차 세포는 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte)， 신경아세포(neuroblast)， 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte)， 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포， 각질세포(keratinocyte)， 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte)， 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포， 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는, 조골세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 종류를 특정하지 않으나, 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체 줄기세포에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, 성체 줄기세포는 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니고, 바람직하게는, 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, '조골세포(osteoblast, OB)'는 뼈 형성을 담당하는 단핵 세포이다. 조골세포는 OCN(osteocalcin) 등과 같은 뼈 형성에 관여하는 단백질들을 발현하는 특화된 섬유아세포로서, 제1형 콜라겐(type 1 collagen)으로 주로 구성된 유골(osteoid) 매트릭스를 형성시키며, 상기 유골 매트릭스 내에 석회화를 가져와 뼈를 형성시키는 역할을 수행한다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있다면, 상기 조골세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 사용 가능한 세포 배양 배지는 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F-12) 배지, PCM 배지 또는 MSC 확장 배지 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상술하여 예로 든 배지에는 배양을 위해 선택된 세포가 포함되며, 세포 포함 배지는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제조하기 위한 목적으로 셀룰로오스 나노섬유와 혼합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 1×105 내지 10×105개, 바람직하게는 1×105내지 5×105개, 더욱 바람직하게는 2×105 내지 4×105개인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 (c) 단계는, 셀룰로오스 나노섬유와 세포 포함 배지의 혼합물에 이가양이온을 첨가하여 겔화된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제조하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 이가양이온은 Ca2 +, Cu2 +, Mg2 + 및 Zn2 + 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있고, 바람직하게는 Ca2+일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이가양이온은 CaCl2, CuCl2, CuCO3, CuSO4, MgCl2, MgSO4, ZnCl2 및 ZnSO4으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 이가양이온 제공 화합물에 의해 첨가될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 이가양이온 제공 화합물은 10 내지 200mM, 바람직하게는 10 내지 100mM, 더욱 바람직하게는 30 내지 80mM이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 셀룰로오스 나노섬유를 50 mM CaCl2에 침지시켰다. 이때 CaCl2 용액은 10 내지 200 mM, 바람직하게는 10 내지 100mM, 더욱 바람직하게는 30 내지 80mM이 사용 될 수 있다. 상기 (c) 단계의 겔화는 20 내지 37℃에서 20 내지 40분, 바람직하게는 30분 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 이가양이온을 통해 가교될 수 있으며, 바람직하게는 Ca2 +, Cu2 +, Mg2 + 및 Zn2 + 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종, 더욱 바람직하게는 Ca2 +을 통해 가교되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 이가양이온은 CaCl2, CuCl2, CuCO3, CuSO4, MgCl2, MgSO4, ZnCl2 및 ZnSO4으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 이가양이온 제공 화합물에 의해 첨가될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 균일한 크기의 기공을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 조골세포 배양용인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 영양분 및 산소 등에 대해 우수한 투과율을 보여, 세포 생장에 활용 가능하다. 특히, 세포의 장기적, 예컨대, 7일 내지 32일, 바람직하게는 7일 내지 21일의 배양 및 유지가 가능하며, 배양된 세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 카르복실기로
표면개질된
셀룰로오스 나노섬유 제조
물에 분산된 셀룰로오스 나노섬유를 제조하였다. 먼저, 2000 mL의 증류수에 20g의 셀룰로오스 펄프를 첨가한 후, 0.312 g의 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl, TEMPO), 2.085g의 브로민화나트륨(NaBr), 및 270 mL의 5% 치아염소산나트륨(NaClO)를 첨가하고, 1M의 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 pH를 10으로 조정하였다. 그 후, 더욱 균일한 셀룰로오스의 용매 내 분산을 위해 초음파(SONICS & MATERIALS, INC., USA)를 20 kHz에서 5분 동안 인가한 후, 패리스태틱 펌프(peristatic pump)를 이용하여 0.7 mL/분의 속도로 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하였다. 실온에서 20시간 동안 반응시킨 후, 카르복실기로 산화된 셀룰로오스를 얻었고, 이를 고압 균질기에 넣고 그라인딩함으로써 물에 분산된 카르복실기로 표면개질된 셀룰로오스 나노섬유(이하, '셀룰로오스 나노섬유'라 한다)를 제조하였다.
실시예
2: 셀룰로오스 나노섬유의 기계적 (
유동학적
) 성질 분석
실시예 1에서 제조된 셀룰로오스 나노섬유의 기계적 특성을 분석하기 위하여, 전단응력(shear stress)이 있는 환경과 없는 환경에서의 탄성계수(elastic modulus), 손실 탄성률(loss modulus), 복소점도(complex viscosity) 등을 레오미터를 이용해 측정하였으며, 그 결과를 도 1의 a에 나타내었다.
도 1의 a에서, η*는 복소점도를, G'는 전단저장탄성률(shear storage modulus)을, G''는 전단손실탄성률(shear loss modulus)를 의미한다. 셀룰로오스 나노섬유의 표면에 있는 -OH기는 TEMPO 존재 하에서 카르복실기로 산화된다. 지름이 10 내지 20nm인 셀룰로오스 나노섬유가 영양분이 없는 Eagle's medium buffer에 균일하게 흩어지면, 2 내지 3 중량(wt)%의 투명하고 점성이 있는 부드러운 겔이 형성된다. 상기 겔은 G'(전단저장탄성률)가 ~82 Pa, η*(복소점도)가 ~812 pa-sec이며, 이를 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체라고 명명하였다. 메트리겔을 포함한 콜라겐 기반의 하이드로겔이 모두 냉장보관을 요하는 것과 달리, 상기 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체는 실온에서 보관할 수 있고, 안정성이 높아 고압증기멸균기로 살균도 가능하다. 도 1의 a에 나타낸 바와 같이, 매트리젤 전구체의 경우 전단응력에 관계없이 낮은 모듈러스 및 점성 값을 보임을 확인하였다. 이에 반해, 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체는 전단응력이 계속 가해짐에 따라 모듈러스와 점성 모두 감소하는 추세를 보였지만 전단응력이 사라진 후, 이내 다시 처음 가졌던 모듈러스와 점성을 빠르게 회복하는 경향을 보였다.
또한, 매트리젤과 셀룰로오스 나노섬유의 이와 같은 물성에 기인하여 세포 고정력에 있어 차이를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체와 메트리젤 전구체에 각각 세포를 위치시키고 교반하는 경우 시간에 따른 겔 내 세포의 분포를 도 1의 b에 나타내었다.
도 1의 b에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체는 단지 전조골세포를 교반시키는 것만으로 세포들을 겔 내에 캡슐화시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 하이드로겔 전구체에서 수소결합의 즉각적인 가교(cross-linking)에 의한다. 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체에 조골세포를 위치시키고 교반하는 경우, 1분 후, 3시간 후에도 교반된 세포는 하이드로겔 전구체 내에 균일하게 고정되어 분포됨을 확인하였다. 반면, 메트리젤 전구체의 경우에는 교반 1분 후에도 이미 세포들이 아래쪽으로 가라앉기 시작하고, 3시간 후에는 모든 세포들이 아래쪽에만 가라앉아 있는 것을 확인하였다. 이로써 셀룰로오스 나노섬유는 교반하는 힘이 가해질 때 쉽게 세포와 섞였다가 힘이 사라지면 금세 물성을 회복하여 세포를 제자리에 고정할 수 있음을 확인하였다.
셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 및 메트리겔 각각에 세포를 위치시키고 세포의 분포를 SEM을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체의 복소점도(η*)와 전단저장탄성률(G')은 교반에 의해 피브릴(미세섬유)의 수소결합이 분해되면서 감소하였다. 이를 통해 세포가 겔 내에서 균질하게 흩어지는 것을 확인하였다. 전단응력(shear stress)이 사라지면, 하이드로겔 전구체의 복소점도 및 전단저장탄성률은 30초 안으로 수소결합의 가교를 재형성 하면서 원래의 값을 회복하였다. 결과적으로, 도 2에 나타낸 것과 같이, 세포를 제자리에 고정하지 못해 시간이 지날수록 아래쪽으로 가라앉는 매트리젤과 달리, 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체에서 균일하게 흩어진 세포들은 세포 바닥에 가라앉지 않고 그 자리에 기계적으로 고정됨을 확인하였다.
실시예
3: 셀룰로오스 나노섬유를 이용한 3차원 구조체 제조 및 물성 확인
3 중량%의 셀룰로오스 나노섬유 600mg을 20mL 생리식염수에 넣고 잘 섞어준 다음, 고압멸균기에 넣고 121℃에서 15분간 멸균하고 30분간 초음파 처리(ultrasonication)를 하였다. 그 후, 1mL의 셀룰로오스 나노섬유에 3×105개의 MC3T3 cell line 조골세포(RIKEN Cell Bank (RCB1126), Tsubuka Science City, Ibaraki, 일본)가 들어있는 배지(MEM 알파)를 잘 혼합해준 다음, 24 웰 세포 배양 플레이트에 넣어주었다. 웰 모양을 따라 3차원 원통 형태를 이루고 있는 셀룰로오스 나노섬유에 50mM CaCl2을 한 방울씩 천천히 떨어뜨리고 총 30분 동안 37℃ 인큐베이터에서 침지시켰다. 본 실시예에서는 3% 셀룰로오스 나노섬유 500㎕에 50mM CaCl2 1.5㎖를 혼합하였다. 겔화된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 생리식염수를 이용해 3차례 씻은 후, 세포 배양용 배지를 넣어주었다.
셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체가 CaCl2 용액 첨가에 의해 가교되고 고정됨으로써 겔화되는 과정 및 이에 따른 기계적 물성을 변화를 도 3에 나타내었다.
도 3의 a 및 b에는 조골세포가 담지된 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체가 Ca2 +용액이 담긴 배지에서 가교 및 고정되는 과정을 나타내었다. 메트리겔을 비롯한 콜라겐 기반의 하이드로겔들은 가교시킬 때 pH, 이온강도(ionic strength) 및 온도 등의 변화가 요구되므로 하이드로겔을 가교시킴에 있어서 겔에 캡슐화된 세포에 스트레스를 주게 된다. 반면, 도 3의 a에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에 따른 전조골세포를 포함한 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체의 경우 단지 50mM CaCl2 용액의 추가만으로도 칼슘-카복시산염(Ca-carboxylate) 복합체를 형성하면서 가교되고, 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔을 형성하였다(이하, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체라 한다).
도 3의 b에는 셀룰로오스 나노섬유와 Ca2 +와의 연결부위를 나타내었다. 또한, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔 전구체보다 더 투명하고 좀더 잘 서있을 수 있는 것을 확인하였다.
도 3의 c에는 Ca2 +를 첨가시킨 후 시간에 따른 셀룰로오스 나노섬유의 탄성계수를 나타내었다. 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 Ca2 +에의 침지 시간(0~60분)에 따라서 전단저장탄성률을 ~90 내지 3,200 Pa로 조절할 수 있음을 확인하였다. 한편, 메트리젤의 경우 완전히 가교시킨 경우의 전단저장탄성률이 ~350 Pa이며, 매우 연약하고 스스로 서있을 수 없어 세포가 캡슐화된 메트리겔은 다루기 쉽지 않음을 확인하였다. 따라서, Ca2 +로 가교된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 가교되기 전보다 높은 기계적 물성을 가짐을 확인하였다.
실시예
4: 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체의 기공 및 투과성 분석
셀룰로오스 나노섬유를 함유한 3차원 구조체가 세포 지지체로써 역할하기 위해서는 세포가 부착할 수 있고 세포 성장에 필요한 영양분이나 산소 등이 드나들 수 있는 충분한 크기의 기공 및 우수한 투과성이 필요하다. 따라서 이러한 기공 및 투과성을 분석하기 위해 CaCl2에 침지시킨 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 -80℃에서 얼린 다음 동결건조를 통해 수분을 모두 제거하였다. 그 후 전자주사현미경 (SEM)을 통해 구조체 내부에 있는 기공을 분석하였다. 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체와 매트리젤의 기공을 분석한 SEM 이미지를 도 4의 a에 나타내었다.
도 4의 a에 나타낸 바와 같이, 불규칙적인 크기를 가지는 매트리젤과 달리 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체는 비교적 균일한 크기의 기공이 있음을 알 수 있었다. 공극률(porosity)은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 물 부피 분율(%)로, 셀룰로오스 중량 퍼센트 및 셀룰로오스 밀도(1.5g/cm3)에 의해 계산되었다. 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 95.9±0.1%의 공극률을 가지고, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 평균 기공 크기는 310.8±26.1㎛ 임을 확인하였다.
3차원 구조체의 투과성을 알아보기 위해 형광물질이 표지된 알부민 단백질을 3차원 구조체 내부에 넣고 이 물질이 구조체로부터 빠져 나오는 방출 시간 및 양을 형광 측정을 통해 분석하였고 이를 도 4의 b 및 c에 나타내었다.
셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔의 물질이동 능력을 특징짓기 위해, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)의 유효확산계수(effective diffusion coefficient, Deff)가 측정하였고, BSA의 유효확산계수는 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)와 결합시켜 측정하였다. 도 4의 b는 FITC-BSA의 방출 프로필을 시간에 따른 유효확산계수를 도시하여 나타낸 것이고, 도 4의 c는 시간 제곱근의 함수로 BSA 방출도를 도시한 것이다. 도 4의 c에서, 초반의 직선 부분은 Fick's law에 의해 하이드로겔을 통해 방출되는 단백질의 확산을 나타낸 것이다. 셀룰로오스 나노섬유 하이드로겔에서의 BSA의 유효확산계수는 실온, PBS 조건에서 ~2.98×10-7cm2/s 였고, 이는 메트리젤(<2.2×10-7cm2/s), 콜라겐 나노섬유 하이드로겔(~1-2×10-7cm2/s) 및 자기조합 펩타이드 나노섬유 하이드로겔(~2.42×10-7cm2/s)의 유효확산계수보다 높은 값으로 확인되었다.
즉, 도 4의 b 및 4의 c에서 확인할 수 있는 바와 같이, BSA는 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체에서 가장 높은 투과율을 보이는 것을 확인하였다.
따라서, 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체는 세포생장에 필요한 영양분 또는 산소 공급이 우수하여 세포 배양용 3차원 구조체로서 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
실시예
5: 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체에서의 세포 생장
셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체에서 세포의 유지 및 생장, 분화를 확인하기 위해 조골세포(osteoblasts)를 이용해 세포실험을 진행하였다. 3차원 구조체에 조골세포(MC3T3 cells)를 캡슐화(encapsulation)한 다음, 1일과 21일이 지났을 때 조골세포의 생존 상태를 확인하였다. 이를 위해서 LIVE/DEAD® assays kit (Invitrogen) 및 cell counting kit (CCK-8)을 이용하여 살아있는 세포(녹색)와 죽은 세포(적색)의 존재를 확인하였다. 이는 살아있는 세포에서 세포간 에스테라아제(esterase) 활성이 있음을 반영하는 녹색 형광의 calcein-AM 염색과 죽은 세포에서 감지되는 혈장막 손실의 경우에 나타나는 적색 형광의 ethidium homodimer-1 염색을 동시에 실시해 죽은 세포와 살아있는 세포를 신속하게 구분하는 원리에 의한 것이다. 상기 실험 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 a에 나타낸 바와 같이, 1일째보다 21일이 지났을 때 조골세포의 생존률이 매우 높음을 확인하였다.
도 5의 b에는 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체 내부에서의 조골세포의 생장 정도를 매트리젤과 비교해 분석한 결과를 나타내었다.
도 5의 b에 나타낸 바와 같이, 매트리젤에서는 우수한 초기 생장률을 보였지만 일주일이 지나자 급격히 생장률이 감소하는 것을 관찰할 수 있었던 것에 비해, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에서는 초기 생장률은 조금 미진하였지만 21일까지 계속해서 세포가 성장함을 관찰하였다. 이 결과로부터 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체가 장기적인 세포 유지 및 생장에 활용될 수 있음을 확인하였다.
도 5의 c에 나타낸 바와 같이, 확대된 이광자 현미경 이미지에서는, MC3T3 세포들이 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에서 다각형 모양으로 확장되어있는 것을 볼 수 있다. MC3T3 세포들은 일반적으로 히알루론산, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 알지네이트로 이루어진 하이드로겔에 캡슐화된 경우에는 증식이나 확장이 일어나지 않는데, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에 캡슐화된 경우 단단한 나노섬유 도메인 및 나노섬유 물질 이동 속도에 따라 MC3T3 세포의 integrin clustering이나 병소 접촉 형성(focal contact formation)이 촉진되는 것을 확인하였다.
실시예
6: 셀룰로오스 나노섬유로 이루어진 3차원 구조체에서의 세포 분화
조골세포의 분화 역시 칼슘 미네랄 염색 방법 (von Kossa staining) 및 유전자 발현 레벨 검사 (RT-PCR)를 통해 확인하였고 이를 도 6에 나타내었다.
분화 배지(differentiation medium, DM)를 이용하여 조골세포의 분화를 유도하였다. 도 6의 a에는 분화 자극을 주지 않은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체, 분화 자극을 받은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체, 그리고 분화 자극을 받은 메트리젤에서의 세포의 분화여부를 나타내었다.
도 6의 a에 나타낸 바와 같이, 조골세포의 분화 결과 생성된 칼슘 미네랄이 갈색으로 염색되었고, 분화자극을 받은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체가 가장 진한 갈색으로 염색되어 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에서 조골세포가 가장 많이 분화됨을 알 수 있었다. 한편, 매트리젤의 경우 약한 기계적 물성 때문에 염색 과정 동안 겔의 형태가 많이 훼손됨을 볼 수 있다.
도 6의 b에는 조골세포의 분화에 관련된 여러 유전자들의 발현 정도를 그래프로 나타내었다. 이를 위해, 분화자극 14일 후의 조골세포를 RT-PCR로 분석하였다. Runt-related transcription factor 2(Runx2), type 1 collagen (T1Col), osteocalcin(OCN)은 모두 골형성 유전자로서, 유전자의 발현 정도가 높을수록 조골세포의 분화능이 증가한 것임을 확인할 수 있다.
도 6의 b에 나타낸 바와 같이, 분화 자극을 받은 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에 이식된 세포에서 분화 유전자들의 발현이 가장 높은 것을 유의적으로 확인하였다.
따라서, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체에 조골세포를 배양하는 경우 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 우수함을 확인하였고, 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 세포 배양 및 이의 분화에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (14)
- (a) 셀룰로오스 나노섬유를 제조하는 단계;
(b) 상기 셀룰로오스 나노섬유와 세포 포함 배지를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및
(c) 상기 혼합물에 이가양이온을 첨가하여 겔화된 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 셀룰로오스 나노섬유는 카르복실기로 표면개질된 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 1차세포 및 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 조골세포인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 1×105 내지 5×105개인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 이가양이온은 Ca2 +, Cu2 +, Mg2 + 및 Zn2 +으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 이가양이온은 CaCl2, CuCl2, CuCO3, CuSO4, MgCl2, MgSO4, ZnCl2 및 ZnSO4으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 이가양이온 제공 화합물에 의해 첨가되는 것인, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 이가양이온 제공 화합물은 10 내지 200mM인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 20 내지 37℃의 온도에서 겔화된 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체의 제조방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체.
- 제10항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유는 이가양이온을 통해 가교되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체.
- 제11항에 있어서, 상기 이가양이온은 Ca2 +, Cu2 +, Mg2 + 및 Zn2 +으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체.
- 제10항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 균일한 크기의 기공을 갖는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체.
- 제10항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체는 조골세포 배양용인, 세포 배양용 셀룰로오스 나노섬유 3차원 구조체.
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2017
- 2017-04-13 KR KR1020170047949A patent/KR20180115531A/ko not_active Ceased
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