KR20190000009A - 드로소필라 멜라노개스터 s2를 이용한 메르스 항원 단백질 생산방법 - Google Patents

드로소필라 멜라노개스터 s2를 이용한 메르스 항원 단백질 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메르스 항원 단백질로서 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD) 항원의 제조 방법, 및 상기 항원에 대한 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

드로소필라 멜라노개스터 S2를 이용한 메르스 항원 단백질 생산방법 {A method for producing MERS antigen using Drosophila melanogastor S2}
본 발명은 메르스 항원 단백질로서 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD) 항원의 제조 방법, 및 상기 항원에 대한 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
중동호흡기증후군 (Middle East Respiratory Syndrome, MERS)은 메르스-코로나 바이러스 (MERS-CoV)의 감염에 의해 유발되는 질병으로 평균 5 일 정도의 잠복기를 지니며, 가까운 접촉에 의해 감염된다. 주요 증상은 감기와 유사하며 고열, 기침, 호흡곤란 등을 동반하고, 만성질환 또는 면역저하자의 경우 다발성 장기 부전으로 인해 사망하기도 한다. 메르스의 발생현황으로는 사우디, 레바논, 요르단 등의 중동 국가에서 주로 환자가 발생했으며, 이들 국가를 여행하고 돌아온 이들에 의해 미국과 유럽 등지에 전파되고 있다. 국내에는 2015 년 5 월 최초 환자가 보고되었으며 2016 년 1 월까지 186 명의 환자가 발생하고 38 명이 사망하여 20.4 %의 치사율을 보이고 있다. 이에, 메르스-코로나 바이러스의 감염을 진단하고, 이를 치료할 수 있는 기술개발의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 이용한 외래 단백질 생산방법은 단백질 발현량이 높고, 발현된 단백질은 동물세포에서 발현된 것과 유사하게 번역 후 수식 (당쇄화, 인산화, 지방산의 부가)이 일어나며, 복수의 단백질을 동시에 발현하거나 세포 밖으로 배출시킬 수 있어 복합 성분의 바이러스 외피단백질 및 바이러스 유사입자 등을 생산하기 용이하며, 분리 정제 및 대량 생산이 가능하여 제품화에 쉽게 응용할 수 있다. 기존에 동물세포 발현시스템 또는 재조합 배큘로바이러스를 이용한 메르스 항원 단백질 생산 방법에 대한 연구는 진행된 바 있지만 (Vaccine 2014, 32:5975-5982; Cell Res. 2013, 23:986-993), 곤충세포인 드로소필라 멜라노개스터 S2 (Drosophila melanogastor S2) 세포를 이용한 재조합 메르스 항원단백질 생산에 대한 연구는 현재까지 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 MERS-CoV의 항원을 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, MERS-CoV 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (receptor binding domain; MERS-RBD)을 곤충세포인 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 분비 생산할 수 있음을 확인하고, 상기 분비 생산된 MERS-RBD에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, MERS-RBD 항원의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조된 MERS-RBD 항원에 대한 단일클론항체를 생산하는 단계를 포함하는, MERS-RBD 항체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 MERS-RBD 항원, 이를 코딩하는 핵산 분자, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, MERS-RBD 항원의 제조 방법이다.
본 발명에서 메르스 바이러스는 중동 호흡기 증후군-코로나바이러스 (MERS-CoV)를 말한다. 인간에서 메르스 바이러스 감염의 임상적 특징은 무증상 감염으로부터 매우 중증의 폐렴까지 다양하고, 급성 호흡 장애 증후군, 패혈성 쇼크 및 다-기관 기능부전으로 사망을 야기할 수 있다. 때문에 중동 호흡기 증후군에 대한 백신으로 사용하거나, 또는 항체 생산을 위하여 메르스 바이러스에 대한 항원 제조 기술이 필요하다.
메르스 바이러스는 박쥐 코로나바이러스 HKU4 및 HKU5와 유사성을 공유한다. 이 바이러스는 표적 세포로의 진입을 위한 세포 수용체와의 상호 작용을 위해 스파이크 단백질을 사용한다. 특히, 메르스 바이러스는 상기 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 통해 인간 상피 및 내피 세포에서 디펩티딜 펩티다제 4 (DPP4)와 결합할 수 있고, 상기 수용체 결합 도메인은 DPP4와 상호작용하는 수용체 결합 서브도메인 및 코어로 구성된다. 이에, 본 발명의 하나의 양태는 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)을 항원으로서 제조하는 방법이다.
본 발명에서, 상기 메르스 바이러스의 스파이크 단백질은 예컨대 NCBI accession number AKL59401로 지칭되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 MERS-RBD는 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 377-588 번째 아미노산으로 이루어진 것일 수 있고, 상기 MERS-RBD를 코딩하는 핵산이 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적 일 실시예에서는 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에서 MERS-RBD 항원을 발현시키기 위해 MERS-RBD 야생형 서열 (서열번호 1)과 서열 상이성이 25.9 %인 MERS-RBD 변이 서열 (서열번호 2)을 확보하였다 (도 1).
본 발명의 MERS-RBD 항원 제조 방법은 MERS-RBD 항원을 발현하는 형질전환 세포의 제조 단계 및 상기 형질전환 세포로부터 MERS-RBD 항원을 생산하는 단계를 포함한다. 이하, 각 단계를 상세히 설명한다.
먼저, MERS-RBD 항원을 발현하는 형질전환 세포의 제조 단계는 MERS-RBD를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 드로소필라 멜라노게스터 S2 세포는 외래 단백질의 발현량이 높고, 상기 세포에서 발현된 단백질은 원단백질과 유사한 번역 후 수식 (당쇄화, 인산화, 지방산의 부가 등) 과정을 거친다. 또한, 발현된 단백질을 세포 밖으로 쉽게 배출시킬 수 있어, 외래 단백질을 대량 생산하고 분리 정제하는데 매우 용이하여 유용 외래 단백질의 대량 생산을 위한 장점을 가진다. 그러나 현재까지 드로소필라 멜라노게스터 S2 세포에서 MERS-RBD를 발현시킬 수 있는지에 대해서는 전혀 보고된바 없었다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로, 구체적으로 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 본 발명의 프로모터 외에 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λBL3, λBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pMT계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 그러나 본 발명에 있어 사용될 수 있는 벡터는 이에 제한되지 않으며, 드로소필라 멜라노게스터 S2 세포에서 발현에 이용할 수 있는 벡터라면 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 상기 발현 벡터는 단백질 분비 신호 (secretion signal) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 분비 신호는 벡터로부터 발현된 단백질이 세포 밖으로 분비되는 것을 유도하는 것으로, 예컨대 BiP 분비 신호 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 본 발명에 따른 MERS-RBD를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 숙주세포 내에 도입하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환된 목적 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다음으로, MERS-RBD 항원을 생산하는 단계는 상기 형질전환 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 형질전환 세포를 적당히 조절된 환경에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 배양과정은 당업계에 알려진 드로소필라 멜라노게스터 S2 세포의 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 본 발명의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알콜, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알콜; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스 및 살균된 전처리 당밀 (즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소듐-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 형질전환세포의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 15 ℃ 내지 35 ℃일 수 있으며, 보다 구체적으로 25 ℃ 내지 30 ℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있다.
상기 형질전환 세포는 MERS-RBD 항원을 발현하므로, 배양 배지에서 배양됨으로써 형질전환 세포 내 또는 배양 배지에 MERS-RBD 항원이 포함될 수 있다. 본 발명의 구체적 일 실시예에서는 MERS-RBD 항원을 발현하도록 형질전환된 세포를 배양하여 약 30 kDA 크기의 MERS-RBD 단백질이 세포내부 및 세포 배양 배지에 존재하는 것을 확인하였으며, 특히 BiP 시그널 서열에 의해 세포 밖으로 MERS-RBD 단백질이 분비되어 대부분의 MERS-RBD 단백질이 세포 배양 배지에 존재하는 것을 확인하였다 (도 3). 따라서 MERS-RBD 단백질이 생산되어 세포 내 축적되거나 분비되어 세포 배양 배지에 존재하게 된다.
일례로, 본 발명의 MERS-RBD 항원 제조 방법은 상기 형질전환 세포를 배양한 배양 배지로부터 MERS-RBD 항원을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양 배지에서 항원을 수득하는 경우 별도로 세포를 용해하여 단백질을 분리하는 과정을 거치지 않으므로, MERS-RBD 항원 제조에 있어서 제조 공정이 간편해지고 제조 비용을 낮출 수 있다는 이점이 있다.
상기 MERS-RBD 항원을 회수하는 단계는 본 발명의 세포 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 MERS-RBD 항원을 회수할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 친화성 크로마토그래피 등이 사용될 수 있으며, 또한 당해 분야에 공지된 적합한 방법이 조합하여 사용될 수 있다.
상기 회수 단계는 분리 공정 및/또는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 상기 형질전환 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 상기 형질전환 세포를 배양한 배양 배지로부터 MERS-RBD 항원을 회수하는 단계; 및 상기 MERS-RBD 항원에 대한 단일클론항체를 생산하는 단계를 포함하는, MERS-RBD 항체의 제조 방법이다.
MERS-RBD를 드로소필라 멜라노게스터 S2 세포에서 발현시켜 MERS-RBD 항원을 회수하는 과정은 상기 설명한 바와 같다. 본 발명에서는 상기 방법으로 제조된 MERS-RBD 항원을 이용하여 MERS-RBD에 대한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명의 단일클론항체는 본 발명에서 제조된 MERS-RBD를 항원으로 하는 항체로서, 상기 MERS-RBD에 포함되는 에피토프에 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명에서 상기 단일클론항체의 제조방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 본 발명의 방법으로 제조된 MERS-RBD 항원을 이용하여 당업계에 공지된 적절한 항체 제조방법을 통해 MERS-RBD 특이적인 단일클론항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 제조된 재조합 MERS-RBD 단백질을 주사한 마우스로부터 림프절 세포를 수득하고, 이를 골수종세포와 융합하여 MERS-RBD 단백질 특이 항체를 생산하는 5 종의 단일클론 하이브리도마 세포주 (C1F2, 2F9, D2G2, D4E3, 1E9)를 확보하였다. 상기 세포주들로부터 분리 정제된 각각의 단일클론항체는 모두 재조합 MERS-RBD 단백질에 대해 높은 결합능력을 갖는다 (도 5).
본 발명의 또 다른 양태는 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 377-588 번째 아미노산으로 이루어진 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD) 단편으로 구성된 항원 단백질, 상기 항원 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포이다.
MERS-RBD 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 핵산 분자에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
통상의 기술자는 본 발명의 서열번호 2의 염기서열로 구성된 핵산 분자를 발현, 운반, 증폭, 변형 등의 목적으로 활용하기 위하여 적절한 벡터 내에 포함시킬 수 있고, 또한 이를 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조할 수 있다. 따라서 상기 벡터는 그 목적에 따라 얼마든지 달라질 수 있고 당업자는 공지된 벡터를 사용하고자 하는 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기 형질전환 세포는 미생물, 곤충 세포, 포유류 세포일 수 있고, 상기 벡터와 마찬가지로 당업자가 사용하고자 하는 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 분리된 세포일 수 있다.
본 발명에서 확보한 형질전환된 곤충세포 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 생산된 재조합 메르스 바이러스 항원단백질 MERS-RBD 및 메르스 특이 단일클론 항체는 메르스 바이러스 진단을 위한 진단키트 개발에 활용될 수 있다. 또한 재조합 메르스 바이러스 항원단백질 MERS-RBD 및 메르스 특이 단일클론 항체는 메르스 바이러스들의 감염을 예방할 수 있는 백신소재 및 치료를 위한 항체로 활용 가능하다. 메르스 바이러스의 감염 진단, 메르스 바이러스 감염 예방을 위한 백신소재 및 치료를 위한 항체 개발 등에 활용되어 메르스 바이러스 감염에 의한 중동호흡기증후군에 대처하기 위한 방안으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 메르스 바이러스 스파이크 단백질 리셉터 결합도메인 (MERS-RBD)의 염기서열과 곤충세포 코돈사용빈도에 최적화된 메르스 바이러스 스파이크 단백질 리셉터 결합도메인 (S2-MERS-RBD)의 염기서열을 비교한 결과이다.
도 2는 재조합 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드로 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포의 세포 단백질 추출물 (intracellular fraction) 및 배양 배지 (medium fraction)에서 재조합 MERS-RBD 단백질의 존재를 anti-V5 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석 결과이다.
도 4는 재조합 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드로 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포의 배양 배지에서 Ni-NTA 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피 방법으로 재조합 MERS-RBD 단백질을 분리 정제하고 SDS-PAGE 후 은 염색법 (silver staining)으로 확인한 결과이다.
도 5는 하이브리도마 세포주에서 생산된 메르스 바이러스 단일클론 항체의 재조합 메르스 바이러스 항원단백질 MERS-RBD에 대한 결합 능력을 ELISA 방법으로 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합도메인 ( MERS -RBD) 유전자 확보
본 발명자들은 메르스 바이러스 (MERS-Cov/KOR/KNIH/002_05_2015) 스파이크 단백질 (NCBI accession number, AKL59401)의 수용체 결합 도메인 (receptor binding domain, RBD; 377 - 588 아미노산 잔기)을 드로소필라 멜라노개스터 S2 (Drosophila melanogastor S2)에서 발현시키기 위해, 기존 알려진 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)에 대한 염기서열 (서열번호 1)의 변이서열 (S2-MERS-RBD; 서열번호 2)을 확보하였다.
상기 S2-MERS-RBD 서열 (서열번호 2)은 MERS-RBD를 코딩하는 636 개의 염기서열 중 471 개의 염기서열은 야생형 (서열번호 1)과 동일하나 (서열 유사성 74.1 %), 나머지 165 개의 염기서열은 상이 (서열 상이성 25.9%)한 서열로 구성된다 (도 1).
실시예 2: 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포의 배양
드로소필라 멜라노개스터 S2 세포는 초파리속에 속하는 세포주의 하나로, 외래 단백질의 발현량이 높으며, 상기 세포에서 발현된 단백질은 원단백질과 유사한 번역 후 수식 (당쇄화, 인산화, 지방산의 부가 등) 과정을 거친다. 또한, 발현된 단백질을 세포 밖으로 쉽게 배출시킬 수 있어, 외래 단백질을 대량 생산하고 분리 정제하는데 매우 용이하여 유용 외래 단백질의 대량 생산을 위한 장점을 가진다. 하지만 지금까지 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 사용하여 재조합 MERS-RBD 단백질을 생산하는 방법은 전혀 보고된바 없었다.
본 발명에서 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포는 재조합 단백질 생산용 무단백질 배양 배지 및 HycloneTM SFX 곤충세포 배지 (Invitregen)를 이용하여 27 ℃에서 배양하였다.
실시예 3: 재조합 플라스미드 구축
재조합 MERS-RBD 단백질의 발현을 위한 재조합 플라스미드 제조를 위해 pMT/BiP-V5-His 플라스미드 벡터 (36 kb; Invitrogen)를 사용하였다. 상기 플라스미드 벡터는 메탈로티오네인 (methallothionein) 프로모터, 재조합 단백질의 세포 분비 신호 BiP 서열, V5 에피토프 표지 및 폴리히스티틴 부위를 지니고 있다.
상기 실시예 1에서 확보한 서열번호 2의 MERS-RBD DNA 절편 (S2-MERS-RBD)을 pMT/BiP-V5-His 플라스미드의 BglII, ApaI 제한효소 위치에 클로닝하여 S2-MERS-RBD 단백질의 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포 발현용 재조합 플라스미드 벡터를 확보하고, 이를 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His로 명명하였다 (도 2).
실시예 4: 형질전환 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포 확립
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드 벡터로 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 확립하기 위해 재조합 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드 벡터 (2.7 ㎍)와 하이그로마이신 저항성 유전자를 지니는 pCoHygro 플라스미드 벡터 (0.3 ㎍)를 100 ㎕의 Grace 무혈청 배지 (Invitrogen)에 혼합하고, Cellfectin II reagent (Invitrogen) 10 ㎕가 혼합된 100 ㎕의 Grace 무혈청 배지와 혼합한 후 실온에서 30 분간 반응시켰다. 3 x 106 개의 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포가 분주된 6-웰 플레이트의 웰에 상기 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His, pCoHygro 플라스미드 벡터/ Cellfectin II reagent 혼합액을 첨가하여 24 시간 동안 배양한 뒤, HyClone™ SFX 곤충세포 배양 배지로 교환한 후 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포배양 배지를 300 ㎍/ml 하이그로마이신을 함유하는 HyClone™ SFX 곤충세포 배양 배지로 3 - 4 일 간격으로 배지를 교환하며 약 45 일 간 배양하여, 하이그로마이신에 저항성을 지니며 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드 벡터가 안정적으로 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 선별하였다.
실시예 5: 안정적으로 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 재조합 MERS - RBD 단백질의 발현 확인
재조합 pMT/BiP-MERS-RBD-V5-His 플라스미드가 안정적으로 형질전환된 초파리 곤충세포에서 재조합 MERS-RBD 단백질의 발현을 확인하기 위해, 500 μM CuSO4를 함유하는 HyClone™ SFX 곤충세포 배양 배지에서 4 일간 배양한 세포 배양액에서 세포 추출물 및 배양 배지를 회수하고, 항-V5 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석을 통해 재조합 MERS-RBD 단백질의 존재를 확인하였다.
그 결과, 재조합 MERS-RBD 단백질은 약 30 kDa의 크기로 발현되어 세포내부 및 세포 배양 배지에 존재하는 것을 확인하였다 (도 3). 이 결과는 재조합 MERS-RBD 단백질이 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 안정적으로 발현된다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 재조합 MERS-RBD 단백질은 BiP 시그널 서열에 의하여 세포 밖으로 분비되어 존재할 수 있고, 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 발현된 대부분의 재조합 MERS-RBD 단백질이 세포 배양 배지에 존재하는 것을 알 수 있었다 (도 3, lane 3과 4의 비교). 이는 BiP 시그널서열에 의해 재조합 MERS-RBD 단백질이 세포 밖으로 효율적으로 분비 된다는 것을 의미한다.
실시예 6: 재조합 MERS - RBD 단백질의 분리 정제
재조합 MERS-RBD 단백질을 분리 정제하기 위해 500 μM CuSO4를 함유하는 HyClone™ SFX 곤충세포 배양 배지에서 4 일간 배양한 세포 배양액에서 배양 배지를 회수하고, Ni-NTA 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피 방법으로 상기 배양 배지로부터 재조합 MERS-RBD 단백질을 분리 정제하였다. 분리 정제된 재조합 MERS-RBD 단백질의 순도를 SDS-PAGE 후 은 염색법으로 확인하였다 (도 4).
실시예 7: 재조합 MERS - RBD 단백질 동물면역 및 림프절 세포 확보
재조합 MERS-RBD 단백질을 BALB/c 마우스의 발바닥 (food pad)에 주사하여 면역반응을 유도하였다. 재조합 MERS-RBD 단백질에 의한 면역반응을 촉진시키기 위해 1 차 면역 시에는 CFA (Complete Freund's adjuvant)를 재조합 MERS-RBD 단백질과 1 : 1 (v/v)로 혼합하여 사용하였고, 2, 3 차 부스팅 면역 시에는 IFA (Incomplete Freund's adjuvant)를 재조합 MERS-RBD 단백질과 1 : 1 (v/v)로 혼합하여 사용하였다. 면역은 1 주일 간격으로 총 3 회 실시하였으며 1 회 면역 시 마우스 한 마리당 200 ㎍의 재조합 MERS-RBD 단백질을 주사하였다.
최종 면역 3 일 후 마우스를 CO2 가스를 이용하여 희생시키고 오금 (popliteal)에서 림프절을 적출하였다. 적출한 림프절을 RPMI1640 배지로 세척하고 글라인더로 갈아 단세포화 하였으며, RPMI1640 배지를 이용하여 3 회 세척한 후 재조합 MERS-RBD 단백질 특이 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 (hybridoma) 세포를 확보하기 위한 SP2/0 골수종세포와의 세포융합실험에 이용하였다.
실시예 8: SP2/0 골수종세포 배양
HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 유전자가 결여된 SP2/0 골수종세포는 10 % 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum; FBS)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 37 ℃에서 배양하였다.
실시예 9: 세포융합 및 재조합 MERS - RBD 단백질 특이항체 생산 단일클론 하이브리도마 세포 확보
SP2/0 골수종세포를 RPMI1640 배지로 세척하고 재조합 MERS-RBD 단백질이 면역된 마우스에서 회수한 림프절 세포와 1 : 5로 혼합한 후 원심분리하여 침전시켰다. 상층액 제거 후 침전된 세포를 가볍게 쳐서 잘 섞어 준 다음, 50 % PEG1500 용액 1 ml을 1 분에 걸쳐 천천히 점적하였다. RPMI 배지를 30 초당 1 ml, 30 초당 3 ml, 1 분당 17 ml로 순차적으로 점적하고 5 분간 반응하여 세포들의 융합을 유도하였다. 반응 종료 후 1,200 rpm에서 5 분간 원심분리하고 HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine)가 포함된 RPMI1640 배지에 부유시킨 후 96-웰 플레이트에 분주하고 배양하였다.
세포 융합 후 세포가 웰의 바닥에 60 ~ 70 % 정도 자랐을 때 세포 배양액을 회수하고 간접 ELISA 방법으로 재조합 MERS-RBD 단백질에 대한 항체의 역가를 측정하였다. 재조합 MERS-RBD 단백질에 대한 항체 역가가 1 이상인 웰을 선택하여 2 차 스크리닝에 사용하였다. 2 차 스크리닝에서 확보한 세포배양액에서 재조합 MERS-RBD 단백질에 대한 항체 역가를 간접 ELISA 방법으로 측정하였고 역가가 높고 세포의 상태가 지속적으로 좋은 웰의 세포를 선택하여 세포주 확보를 위한 배양에 이용하였다. 2 차 스크리닝을 통해 선별된 웰의 세포를 96-웰 플레이트에 1 세포/웰이 되도록 희석하여 분주하고 배양하여 재조합 MERS-RBD 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 5 종의 하이브리도마 세포주 (C1F2, 2F9, D2G2, D4E3, 1E9)를 선별하였다.
실시예 10: 단일클론항체 생산 및 정제
하이브리도마 세포주 (5 x 106 세포/ml)를 BALB/c 마우스의 복강에 1 ml씩 주사하고 10 일 후 복수를 채취하였다. 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 상층액을 회수하여 복수로부터 항체를 분리 정제하였다. 복수를 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) 완충용액으로 투석하여 버퍼를 교환하고 Protein A/G가 결합된 컬럼에 흡착시켰다. PBS로 컬럼을 세척하여 흡착하지 않은 물질을 제거하고 100 mM 글리세린 용액 (pH 2.8)으로 Protein A/G에 결합된 항체를 용출시켰다. 용출된 항체는 1 M Tris 용액 (pH 9.0)을 용출액의 1/10 부피로 첨가하여 pH를 중화시켜주었다. 정제한 항체를 PBS 완충용액으로 투석하고 원심분리 튜브로 농축한 후 UV 스펙트로미터를 이용하여 단백질을 정량하였다.
실시예 11: 재조합 MERS - RBD 단백질에 대한 단일클론 항체의 경합 능 (binding activity) 측정
정제한 단일클론 항체의 재조합 MERS-RBD 단백질에 대한 결합능을 간접 ELISA 방법으로 확인하였다. 재조합 MERS-RBD 단백질을 0.05 M 탄산염-중탄산염 (carbonate-bicarbonate) 완충용액 (pH 9.7)에 1 ㎍/ml 농도로 희석하고 96-웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 분주한 후 4 ℃에서 밤새 반응하여 코팅하였다. PBST (0.05 % Tween-20 함유 PBS) 용액으로 3 회 세척하고 10 ㎍/ml부터 1 ng/ml까지 1/10 씩 연속으로 희석한 단일클론 항체를 웰 당 100 ㎕씩 분주한 후 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 그 다음 PBST 용액으로 3 회 세척 후 HRP (horse radish peroxidase)가 접합된 항-마우스 IgG 항체를 1/7,000 배 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. PBST 용액으로 3 회 세척 후 기질 (TMB) 용액을 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 효소반응을 유도하였다. 상온에서 5 분간 반응을 유지시킨 후 50 ㎕의 1 N H2SO4 용액을 첨가하여 반응을 중단시키고 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하여 발색반응의 정도를 확인하였다. 그 결과, 5 종의 하이브리도마 세포주 (C1F2, 2F9, D2G2, D4E3, 1E9)에서 분리 정제된 단일클론 항체는 모두 재조합 MERS-RBD 단백질에 대해 높은 결합능력을 지니는 것으로 확인되었다 (도 5).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY Boreda biotech <120> A method for producing MERS antigen using Drosophila melanogaster S2 <130> P17-041-KHU <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-RBD wild-type sequence <400> 1 caggctgaag gtgttgaatg tgatttttca cctcttctgt ctggcacacc tcctcaggtt 60 tataatttca agcgtttggt ttttaccaat tgcaattata atcttaccaa attgctttca 120 cttttttctg tgaatgattt tacttgtagt caaatatctc cagcagcaat tgctagcaac 180 tgttattctt cactgatttt ggattatttt tcatacccac ttagtatgaa atccgatctc 240 agtgttagtt ctgctggtcc aatatcccag tttaattata aacagtcctt ttctaatccc 300 acatgtttga ttttagcgac tgttcctcat aaccttacta ctattactaa gcctcttaag 360 tacagctata ttaacaagtg ctctcgtctt ctttctgatg atcgtactga agtacctcag 420 ttagtgaacg ctaatcaata ctcaccctgt gtatccattc tcccatccac tgtgtgggaa 480 gacggtgatt attataggaa acaactatct ccacttgaag gtggtggctg gcttgttgct 540 agtggctcaa ctgttgccat gactgagcaa ttacagatgg gctttggtat tacagttcaa 600 tatggtacag acaccaatag tgtttgcccc aagctt 636 <210> 2 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-RBD modified sequence <400> 2 caggctgaag gtgttgagtg cgatttcagt cctctcctta gcggtacgcc tccacaagtt 60 tacaacttca agcgtctcgt gttcaccaac tgcaactaca acctgaccaa gctcctctcg 120 ctcttcagcg tgaacgactt cacgtgctcg caaatcagcc cagcagctat cgccagtaac 180 tgctacagtt cgcttatcct ggactacttc tcgtacccgc tgagtatgaa gtccgacctg 240 agtgtgagca gcgccggtcc aatatcccag tttaactaca agcagtcctt tagcaatccc 300 acgtgcctga tcctggcgac ggtaccgcac aatttgacca ccataaccaa accgctgaag 360 tacagctaca ttaataagtg ctcccgcctg ctgtccgacg atcgaaccga ggtgccgcaa 420 cttgtaaatg ccaatcagta ttcgccctgt gtgtccattc tgccctccac tgtgtgggag 480 gatggagatt attatcggaa acagctgtcc cccttggagg gaggaggctg gttggtggcg 540 agcggctcga cagtcgccat gactgaacag ttgcagatgg gctttggcat tacagtccag 600 tatggcactg atacaaattc ggtctgtccc aaattg 636

Claims (13)

  1. 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계; 및
    상기 형질전환 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, MERS-RBD 항원의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MERS-RBD는 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 377-588 번째 아미노산으로 이루어진 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MERS-RBD를 코딩하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 단백질 분비 신호 (secretion signal) 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 세포를 배양한 배양 배지로부터 MERS-RBD 항원을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  6. 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 드로소필라 멜라노게스터 (Drosophila melanogaster) S2 세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
    상기 형질전환 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계;
    상기 형질전환 세포를 배양한 배양 배지로부터 MERS-RBD 항원을 회수하는 단계; 및
    상기 MERS-RBD 항원에 대한 단일클론항체를 생산하는 단계를 포함하는, MERS-RBD 항체의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 MERS-RBD는 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 377-588 번째 아미노산으로 이루어진 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 MERS-RBD를 코딩하는 핵산은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 발현 벡터는 단백질 분비 신호 (secretion signal) 서열을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 377-588 번째 아미노산으로 이루어진 메르스 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (MERS-RBD) 단편으로 구성된, 항원 단백질.
  11. 제10항의 항원 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 구성된 핵산 분자.
  12. 제11항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제12항의 벡터를 포함하는 형질전환 세포.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022038504A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Fusion proteins comprising sars-cov-2 spike protein or the receptor thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100485818B1 (ko) * 2002-08-26 2005-04-28 씨에스기계 주식회사 무인 교량점검차량

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120105751A (ko) * 2011-03-16 2012-09-26 경희대학교 산학협력단 곤충세포 (드로소필라 멜라노개스터 에스2 세포) 발현시스템을 이용한 재조합 인플루엔자 바이러스 백신소재 단백질 생산 방법
KR20160055164A (ko) * 2013-09-19 2016-05-17 노바백스, 인코포레이티드 면역원성 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (ΜＥＲＳ-ＣｏＶ) 조성물 및 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120105751A (ko) * 2011-03-16 2012-09-26 경희대학교 산학협력단 곤충세포 (드로소필라 멜라노개스터 에스2 세포) 발현시스템을 이용한 재조합 인플루엔자 바이러스 백신소재 단백질 생산 방법
KR20160055164A (ko) * 2013-09-19 2016-05-17 노바백스, 인코포레이티드 면역원성 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (ΜＥＲＳ-ＣｏＶ) 조성물 및 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lanying Du 등, PLOS one, Vol.8, Iss.12, e81587, p.1-9 (2013.12.)* *
NCBI Genbank accession no. AKL59401.1 (2015.09.02.)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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