KR20190006702A

KR20190006702A - 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료의 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료

Info

Publication number: KR20190006702A
Application number: KR1020170087726A
Authority: KR
Inventors: 이정호; 문광현; 임소연; 정경옥; 이상천; 최유진; 정재희; 양해동; 김상기; 김세호; 박병용
Original assignee: 재단법인 순창군건강장수연구소; 임실치즈축산업협동조합; 재단법인 임실치즈앤식품연구소
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2019-01-21

Abstract

본 발명은 모과, 박하, 산수유를 혼합하여 열수 추출하여 수득한 혼합추출물을 주성분하여 식물혼합추출물을 제조하고, 상기 식물혼합추출물을 여과하고, 상기 식물혼합추출물에 부원료를 첨가하여 음료를 제조한 후 살균처리하여 제조되는 기능성음료 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료에 관한 것이다.

Description

모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료의 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료{Method for manufacturing the functional beverage containing Chaenomeles sinensis Koehne, Mentha arvensis var and Cornus officinalis sieb and the functional beverage prepared therefrom}

본 발명은 모과, 박하, 산수유를 혼합한 후 열수 추출하여 수득한 혼합추출물을 주성분하여 식물혼합추출물을 제조하고, 상기 식물혼합추출물을 여과하고, 상기 식물혼합추출물에 부원료를 첨가하여 음료를 제조한 후 살균처리하여 제조되는 기능성음료 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료에 관한 것이다.

본 발명은 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료의 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료에 관한 발명으로서,

본 발명과 관련하여 대한민국 등록특허 10-0972116(등록일자 2010.07.19)의 '생약 발효물의 제조 방법, 이에 의해 제조된 생약 발효물 및 이를 포함하는 식품'와,

대한민국 등록특허 10-1557096(등록일자 2015.09.24)의 '해양 심층수로부터 차 음료제조용수를 생산하는 방법과 이를 차 음료제조에 이용하는 방법'와,

대한민국 등록특허 10-1564357(등록일자 2015.10.23)의 '한방 발효 음료 제조 방법'에 대한 기술이 개시된 바 있다.

더욱 구체적으로는, 상기 대한민국 등록특허 10-0972116는 생약류, 곡류, 두류, 조류 또는 이의 혼합물을 사상균을 이용하여 생약의 섬유질과 생리활성물질의 유효성분을 식품으로 효과적으로 이용하고자 하는 기술에 관한 것이고,

상기 대한민국 등록특허 10-1557096는 해양 심층수로부터 차 음료제조용수를 생산하는 방법과 이를 차 음료제조에 이용하는 방법에 관한 발명으로서, 해양 심층수의 탈염수를 차 음료제조에서 용수로 이용하여 위생적으로 안전한 차 음료 제조에 관한 기술이며,

상기 대한민국 등록특허 10-1564357는 십전대보탕, 쌍화탕, 총명탕을 포함한 공지의 한방 처방전에 따라 처방된 한방 처방전에 해당하는 한약 재료들을 이용하여 발효과정을 거쳐 제조하는 한방발효 음료 기술에 관한 것이다.

그러나 상기 등록특허들에 개시되어 있는 기술들은 본 발명에서 제시하고자 하는 모과, 박하, 산수유를 혼합하여 열수 추출한 혼합추출물을 주성분으로 하는 기능성음료와는 기술 구성 및 효과적인 면에서 차이가 있으며, 상기 등록특허들로부터 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성이 우수한 기능성 음료 제조 기술을 도출해내기는 어렵다.

대한민국 등록특허 10-0972116(등록일자 2010.07.19) 대한민국 등록특허 10-1557096(등록일자 2015.09.24) 대한민국 등록특허 10-1564357(등록일자 2015.10.23)

본 발명은 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성이 우수한 기능성 음료를 제공하고자 하는 것으로서,

모과, 박하, 산수유를 혼합하여 열수 추출하여 수득한 혼합추출물을 주성분하여 식물혼합추출물을 제조하고, 상기 식물혼합추출물을 여과하고, 상기 식물혼합추출물에 부원료를 첨가하여 음료를 제조한 후 살균처리하여 제조되는 기능성음료 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료를 제공하고자 하는 것을 발명의 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 모과, 박하, 산수유를 혼합한 천연혼합물과 물을 1:9~12 중량비율로 혼합한 후, 85~95℃에서 2~3시간 동안 열수 추출하여 식물혼합추출물을 제조하는 단계와,

상기 식물혼합추출물을 여과하는 단계와,

상기 식물혼합추출물을 액상과당, 사과농축액, 구연산삼나트륨, 비타민 C 및 정제수와 혼합하여 음료를 제조하는 단계와,

상기 음료를 80~85℃에서 20~40분 동안 살균처리하는 단계를 거쳐 이루어지는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료제조방법을 제공한다.

그리고 상기 기능성음료제조방법에 의해 제조된 것으로서,

모과 50~70wt%, 박하 10~30wt%, 산수유 10~30wt%의 혼합으로 조성된 천연혼합물로부터 추출된 100wt%의 식물혼합추출물 70~90wt%와,

액상과당 3~20wt%와,

사과 85~95wt%와, 저감미당 5~15wt%의 혼합으로 조성된 100wt%의 사과농축액 1~10wt%와,

구연산삼나트륨 0.01~0.05wt%와,

비타민 C 0.01~0.05wt%와,

정제수 5~10wt%의 혼합으로 조성되는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료를 제공한다.

본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료는 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성이 우수한 효과를 갖으며, 총 폴리페놀 함량 4.18±0.09 mg/mL, 총 플라보노이드 함량 0.14±0.01 mg/mL, 총 안토시아닌 함량 0.54±0.06 mg/mL 함유되어 있다.

도 1은 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료 제조 공정도.
도 2는 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료 제조를 위한 실제 제조과정을 보인 제조공정도.
도 3은 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료(액상차)의 실제 제품을 보인 사진으로서, 병 용기에 담긴 기능성 음료 제품과 파우치에 담긴 기능성 음료 제품의 예를 보인 사진.

이하, 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료의 제조방법 및 이로부터 제조된 기능성음료에 대해 구체적으로 살펴보도록 한다.

먼저 본 발명에 따른 기능성음료의 제조방법에 대해 살펴보도록 한다.

도 1은 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료 제조 공정도이다.

도 2는 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료 제조를 위한 실제 제조과정을 보인 제조공정도이다.

상기 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 기능성 음료는 모과, 박하, 산수유를 혼합한 천연혼합물과 물을 1:9~12 중량비율로 혼합한 후, 85~95℃에서 2~3시간 동안 열수 추출하여 식물혼합추출물을 제조하는 단계와,

상기 식물혼합추출물을 여과하는 단계와,

상기 음료를 80~85℃에서 20~40분 동안 살균처리하는 단계를 거쳐 제조한다.

상기 식물혼합추출물의 제조에 있어 천연혼합물과 물의 배합비를 1:9~12로 한정하는 이유는 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성 등 활성을 유지하기 위함이다.

상기 열수 추출 온도가 85℃ 미만인 경우에는 모과, 박하, 산수유에 함유된 기능성 물질의 완전히 추출되지 않는 문제가 있고, 95℃를 초과하게 되는 경우에는 박하에 함유된 기능성 물질인 로즈마리산(rosmarinic acid)이 휘발될 가능성이 있다. 따라서 상기 열수 추출 온도는 85~95℃의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.

상기 열수 추출시간은 모과의 기능성 성분인 프로토카테큐산(protocatechuic acid), 박하 기능성 성분 로즈마리산(rosmarinic acid), 산수유 기능성 성분 로가닌(loganin)이 2~3시간에 충분히 용출되는 결과에 기인하여 한정한 것으로서, 2~3시간 범위 내에 열수 추출하는 것이 바람직하다.

상기 식물혼합추출물의 여과는 구체적으로, 10μm의 하우징 필터를 통해 이루어진다.

상기 음료의 살균처리는 베리류의 고유한 맛에 나쁜 영향을 주지 않으면서 최적의 살균이 이루어질 수 있도록 80~85℃에서 20~40분 동안 살균하는 것이 바람직하다.

다음으로 상기 기능성음료의 제조방법을 통해 제조된 기능성음료에 대해 살펴보도록 한다.

본 발명에 따른 기능성음료는,

식물혼합추출물 70~90wt%와,

액상과당 3~20wt%와,

사과농축액 1~10wt%와,

구연산삼나트륨 0.01~0.05wt%와,

비타민 C 0.01~0.05wt%와,

정제수 5~10wt%의 혼합으로 조성된다.

상기 식물혼합추출물은 모과 50~70wt%, 산수유 10~30wt%, 박하 10~30wt%의 혼합물을 추출하여 조성한다.

상기 식물혼합추출물은 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, SOD 효소 활성, 마우스 복강대식세포를 이용하여 세포독성 실험결과를 바탕으로 모과, 산수유, 박하의 배합량을 결정한 것이다.

상기 식물혼합추출물은 기능성 음료의 전체 중량에 대해 70~90wt%의 범위 내로 한정하는 것으로서, 그 사용량이 70wt% 미만인 경우에는 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성의 효과가 떨어질 수 있고, 90wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요이상의 사용으로 인해 제조단가의 상승 문제가 있으므로, 상기 식물혼합추출물의 사용량은 기능성음료 전체 중량에 대해 70~90wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.

상기 액상과당의 사용량이 3wt% 미만인 경우에는 적정 당도를 유지하기 어렵고, 20wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 기능성 음료의 맛에 나쁜 영향을 미칠 수 있으므로, 상기 액상과당의 사용량은 기능성음료 전체 중량에 대해 3~20wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.

상기 사과농축액은 사과 85~95wt%와, 저감미당 5~15wt%의 혼합으로 조성되는 것을 사용한다.

상기 구연산삼나트륨의 사용량이 0.01wt% 미만인 경우에는 기능성 음료의 색상 선명도가 다소 떨어질 수 있고, 0.05wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 무의미하므로, 상기 구연산삼나트륨의 사용량은 기능성음료 전체 중량에 대해 0.01~0.05wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.

상기 비타민 C는 항산화 기능을 갖는 것으로서, 그 사용량이 0.01wt% 미만인 경우에는 항산화 기능을 제대로 발휘하기 어렵고, 0.05wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 무의미하므로, 상기 비타민 C의 사용량은 기능성음료 전체 중량에 대해 0.01~0.05wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.

상기 정제수의 사용량이 5wt% 미만인 경우에는 음료 성분의 균일배합이 제대로 이루어지지 않는 문제가 있고, 10wt%를 초과하게 되는 경우에는 너무 많은 양의 정제수가 사용되어 음료의 맛과 품질이 떨어질 우려가 있으므로, 상기 정제수의 사용량은 기능성음료 전체 중량에 대해 5~10wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명에 따른 기능성 음료를 구성하는 주성분 및 이를 이용하여 제조한 기능성 음료의 효과적인 측면을 실험을 통해 살펴보도록 한다.

1. 항스트레스 효능 평가

(1) 실험재료

모과(Chaenomeles sinensis Koehne) - 모과의 이명(한약명)은 목과(木瓜) 또는 목과(木果)라고도 한다. 유기산이 함유되어 소화효소 분비를 촉진하여 소화기능을 좋게 한다. 비타민 C 등이 다량 함유되어 피로를 회복시키고 신진대사를 촉진시켜 준다. 폐 기능을 강화시켜 가래를 삭히고 기침을 멎게 하므로 만성 기관지염, 감기, 폐렴 등에 치료약으로 사용한다. 모과는 신맛이 강한데 한의학에서 신맛은 간을 좋게 하여 근육을 강화시켜 주고, 혈액순환을 개선시켜 근육과 관절의 마비를 없애고 근육경련, 관절통, 신경통 등에 효과가 있다. 비장을 강화시켜 설사를 없애주고 구토를 멈추게 한다. 약리효과는 항산화, 항균, 항암, 소염 등이며, 약리작용은 기능 보호 및 강화, 급성 세균성 이질, 간염, 관절염, 구토 소화불량, 신경통, 감기, 기관지염, 폐렴 등에 효과가 있다. 성분은 사과산, 시트르산 등의 유기산, 탄닌, 나이신, 비타민 A,B,C, 과당, 칼슘, 칼륨, 철분 등이다.

박하(Mentha arvensis var) - 박하의 약성은 맵고 시원한 성미를 가지고 있다. 한의학적 약리작용은 매운맛으로 발산하고 시원한 성질로 열을 내려준다. 향기가 있어 인후부를 좋게 하고 머리와 눈을 맑게 한다. 간을 강화시켜 가슴이 답답한 것과 두통을 없애준다. 항산화, 항균, 소염, 해열, 건위, 담즙분비 촉진, 중추신경 흥분 등의 약리효과가 있으며, 감기로 인한 발열, 두통, 눈의 충혈, 인후염, 편도선염, 피부가려움증, 간장질환, 복통, 설사, 구토 등에 치료효과가 있다. 주요성분은 menthol(약 77-78%), menthone, camphene, limonene, isomenthone, pinine, menthenone 등이 함유되어 있다.

산수유(Cornus officinalis sieb) - 산수유의 약성은 따뜻하고 신맛을 가지고 있어 간과 신장을 강화시켜 준다. 자양강장 효능이 있어 남성의 정력을 유지하는데 효능이 있고, 허리무릎 통증, 여성의 월경과다 등에 효능이 있다. 약리작용은 간과 신장 강화, 면역기능 조절, 혈당강하, 항산화, 항균, 소염 등이며, 고혈압, 두통, 해열, 어지럼증, 귀울림, 요통, 소아 야뇨증 등에 효과가 있다. 주요성분은 cornin, morroniside, loganin, saponin, 사과산, 주석산 등이 함유되어 있다.

(2) 실험방법

1) 추출 및 농축

기능성 음료의 제조를 위하여 각 시료(모과, 박하, 산수유)의 산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, SOD 효소 활성, 마우스 복강대식세포를 이용한 세포독성의 기능성을 측정한 후 각 시료를 배합하여 기능성 음료를 제조하였다. 각 시료의 기능성을 측정하기 위하여 시료를 (주)옴니허브에서 구입하여 외부형태를 검증한 후 실험에 사용하였다. 시료는 동결건조기를 이용하여 완전 건조시킨 후 믹서기를 이용하여 분말을 만들고, 100 mesh 체로 거른 후 추출하였다. 분말화 시킨 시료에 추출용매를 가한 후 추출하여 여과지로 자연 여과시켰다. 여과한 시료 추출액은 진공회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 30 mL 이하로 농축하였다. 농축된 시료액을 동결건조기를 이용하여 동결건조시킨 후 막자사발로 분말을 만들어 냉동보관하여 실험에 사용하였다.

2) DPPH 라디칼 소거활성

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 시료를 농도별로 희석(250, 500, 1000 μg/mL)하여 100 μL씩 well에 첨가하고, 200 μM-DPPH 용액 100 μL씩 넣고 빛을 차단하여 상온에서 30분 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거활성(%) = [100-(^sampleAbs-^blankAbs)/^controlAbs×100]

*blank: 시료를 녹인 용액 (DPPH 불포함)

*control: DPPH에 시료를 녹인 용액

3) ABTS 라디칼 소거활성

ABTS (2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디칼 소거능은 7.4 mM-ABTS를 2.45 mM-과황산칼륨(K₂S₂O₈)에 녹이고, 빛을 차단하여 상온에서 16시간 반응시켜 ABTS 라디칼 양이온(ABTS·+)를 형성시키고, 실험 직전에 ABTS 용액을 732 nm에서 흡광도가 0.7이 되도록 인산완충용액(phosphate-buffered saline; pH7.4)를 이용하여 희석하였다. 96-well에 농도별(250, 500, 1000 μg/mL)로 희석한 시료액 10 μL과 흡광도 값이 0.7로 희석된 ABTS 용액 190 μL를 넣고 빛을 차단하여 상온에서 10분 반응시킨 후, 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디칼 소거활성(%) = (1-^sampleAbs/^controlAbs)×100

*control: 시료를 녹인 용매

4) 과산화물제거효소 활성(SOD activity)

과산화물제거효소(Superoxide dismutase) 활성은 분석용 키트(SOD Assay Kit-WST, Sigma-Aldrich, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 과산화물제거효소활성이 니트로블루테트라졸륨(Nitroblue tetrazolium)의 환원을 저해하는 능력을 검정하는 photochemical nitroblue tetrazolium 측정법을 사용하였다. 반응액은 50 mM 탄산완충용액(carbonic buffer, pH 10.2), 0.1 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 0.1 mM 잔틴(Xanthine), 0.025 mM 니트로블루테트라졸륨(Nitroblue tetrazolium)로 하였으며, 니트로블루테트라졸륨 환원 저해율을 흡광도 450 nm에서 측정하였다.

5) 마우스 복강대식세포 분리

수컷 C57BL/6 마우스 (6주령, 18-22 g)는 샘타코 (경기도 오산)에서 구입하였다. 마우스는 25℃온도에 표준 먹이와 식수를 자연식이를 통하여 사육하였으며, 실험 시작 7일 전부터 사육하여 안정화 기간을 가졌다. 4% 타이오글라이콜레이트(thioglycollate) 3mL을 복강주사 하고 3일 뒤, 희생시킨다. 복강에 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지 5mL을 채워준 뒤, 다시 뽑아낸다. 뽑아낸 체액을 1000 rpm, 5분간 원심분리하여 세포를 획득한 후, 24 well plate에 배양한다. 세포가 있는 24 well plate는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 들어있는 DMEM 배지하에 37 ℃ 온도 조건하에 배양한다.

6) 산화질소 생성 억제 활성

복강대식세포는 약물 (1, 10 μg/ml)을 전처리한 후, 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide) 1 μg/ml를 처리하여 산화질소 발현을 유도한다. 48시간 뒤 상층액을 채집한다. 배양 배지 내 산화질소 농도는 그리스(Griess) 발색 시스템을 이용하여 측정하였다.

7) 세포독성

복강대식세포는 약물 (1, 10 μg/ml)을 24시간 동안 처리하여 측정한다. 그 후, Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) 시약 5 mg/mL를 처리하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 배양한다. 상층액을 제거하고 불용성 포르마잔(formazan crystal)은 500μL 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 용해시킨다. 불용성 포르마잔(formazan crystal) 용해액의 흡광도는 효소면역분석기에 570nm의 흡광도로 측정한다.

2. 실험결과

1) 추출 및 농축

건조된 모과, 박하, 산수유 분말을 물 또는 80% 에탄올로 추출하였다. 산수유의 물과 80% 에탄올 추출물 수율이 47.7%, 48.7%로 가장 높게 나타났으며, 모과에서는 80% 에탄올 추출물(33.7%), 박하에서는 물 추출물(22.7%)에서 수율이 높았다.(표 1)

각 시료의 추출용액 및 수득률

시료	추출용액	시료량(g)	추출용액의 부피(mL)	추출량(g)	수득률(%)
모과	물(water)	30	600×2 (1,200mL)	8.6	28.7
모과	80% 에탄올	30	600×2 (1,200mL)	10.1	33.7
박하	물(water)	30	600×2 (1,200mL)	6.8	22.7
박하	80% 에탄올	30	600×2 (1,200mL)	6.6	22.7
산수유	물(water)	30	600×2 (1,200mL)	14.3	47.7
산수유	80% 에탄올	30	600×2 (1,200mL)	14.6	48.7

2) DPPH 라디칼 소거활성

각 소재의 물 추출물과 80% 에탄올 추출물에 대한 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 모과 80% 에탄올 추출물의 소거활성이 처리농도 250, 500, 1000 μg/mL에서 64.54%, 77.33%, 88.19%로 가장 높게 측정되었으며, 각 추출물의 처리농도에 비례하여 DPPH 라디칼 소거활성도 증가하였다. 각 추출 용매에 따른 활성은 물 추출물보다는 80% 에탄올 추출물에서 DPPH 라디칼 소거활성이 높았다.(표 2)

각 시료의 DPPH 라디칼 소거활성(%)

시료	추출물	처리농도(g/mL)
시료	추출물	250	500	1000
모과	물(water)	61.98±11.00	67.10±10.45	86.34±6.02
모과	80% 에탄올	64.54±8.67	77.33±7.91	88.19±4.22
박하	물(water)	38.54±2.82	48.76±2.52	62.86±8.49
박하	80% 에탄올	58.57±9.78	60.62±8.13	87.03±0.22
산수유	물(water)	36.40±3.15	50.60±8.01	53.58±3.35
산수유	80% 에탄올	42.49±4.44	70.52±9.75	80.90±10.57
아스코르브산 (Ascorbic acid) (㎍/mL)	control	43.55±3.75 (12.5 μg/mL)	63.85±7.39 (25 μg/mL)	90.46±2.40 (50 μg/mL)

3) ABTS 라디칼 소거활성

각 소재의 물 추출물과 80% 에탄올 추출물에 대한 ABTS 라디칼 소거활성은 농도 의존적으로 활성이 증가하였으며, 추출 용매에 따른 ABTS 라디칼 소거활성은 물 추출물보다는 80% 에탄올 추출물에서 활성이 높았다.(표 3)

각 시료의 ABTS 라디칼 소거활성(%)

시료	추출물	처리농도(g/mL)
시료	추출물	250	500	1000
모과	물(water)	21.94±7.56	29.28±1.00	53.39±0.77
모과	80% 에탄올	17.78±0.93	33.73±0.57	62.50±0.53
박하	물(water)	5.59±0.71	10.38±0.59	20.17±0.42
박하	80% 에탄올	13.68±0.55	24.38±1.94	45.64±2.43
산수유	물(water)	4.21±1.23	8.65±0.85	18.22±0.62
산수유	80% 에탄올	5.15±1.21	10.36±0.50	20.91±0.75
아스코르브산 (Ascorbic acid) (㎍/mL)	control	6.73±1.35 (12.5 μg/mL)	14.16±0.22 (25 μg/mL)	29.99±0.47 (50 μg/mL)

4) 과산화물제거효소 활성(SOD activity)

모과, 박하, 산수유의 물 추출물을 이용하여 과산화물제거효소 활성도를 조사한 결과, 각 추출물의 처리 농도 1000 μg/mL에서 모과(70.5%), 산수유(69.6%), 박하(42.6%) 순으로 활성이 나타났다.(표 4)

각 시료의 과산화물제거효소 활성(%)

시료	추출물	처리농도(g/mL)
시료	추출물	250	500	1000
모과	물(water)	5.5	69.1	70.5
박하	물(water)	-	24.4	42.6
산수유	물(water)	48.2	64.3	69.6

5) 산화질소 생성 억제

복강대식세포를 이용한 산화질소 생성 억제 활성을 측정하기 위하여 복강대식세포 내 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide) 100 μg/mL을 처리하여 산화질소 생성을 유도시키고 각 소재 물 추출물을 농도(1, 10 μg/mL) 별로 4시간 동안 처리한 후, 그리스(Griess) 발색 시약을 사용하여 산화질소 생성 억제 활성을 측정하였다. 각 소재 물 추출물에서 산화질소 생성 억제 활성이 나타났으며, 처리 농도에 의존적으로 산화질소 생성량이 감소하였다.(표 5)

각 시료의 산화질소 생성 억제 활성(%)

시료	추출물	처리농도(g/mL)
		1	10
모과	물(water)	13.57 ±0.77	12.21 ±0.69
박하	물(water)	17.55 ±1.51	11.66 ±0.04
산수유	물(water)	12.88 ±0.24	12.89 ±0.96
Blank		10.83 ±0.34
LPS(Control)		39.38 ±2.80

6) 세포독성

마우스 복강대식세포를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 각 시료 물 추출물을 농도별(1, 10 μg/mL)로 24시간동안 처리한 후, 독성을 불용성 포르마잔(formazan crystal)의 흡광도를 측정하였다. 모든 소재 물 추출물의 세포독성을 비교군과 비교한 결과 독성에 거의 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.(표 6)

각 시료의 세포독성(%)

시료	추출물	처리농도(g/mL)
시료	추출물	1	10
모과	물(water)	94.29 ±0.70	97.10 ±5.03
박하	물(water)	95.04 ±3.22	84.68 ±2.97
산수유	물(water)	101.59 ±6.40	83.01 ±1.37
Blank		100±2.46

4. 일반성분 분석

모과, 박하, 산수유의 일반성분 분석 결과는 다음과 같다. 모과, 박하, 산수유의 열량은 372.16 Kcal/100g, 350.23 Kcal/100g, 344.94 Kcal/100g이고, 탄수화물은 86.43%, 75.38%, 80.83%, 조단백질은 2.92%, 9.23%, 3.29%, 조지방은 1.64%, 1.31%, 0.94%이다. 나트륨 함량은 12.45 mg/100g, 22.05 mg/100g, 39.78 mg/100g 이고, 포화지방산은 0.22 g/100g, 0.24 g/100g, 0.07 g/100g 이고, 트랜스지방산 및 콜레스테롤은 불검출 되었다.(표 7)

각 시료의 일반성분

성분	모과	박하	산수유
열량(Kcal/100g)	372.16	350.23	344.94
탄수화물(%)	86.43	75.38	80.83
조단백(%)	2.92	9.23	3.29
조지방(%)	1.64	1.31	0.94
나트륨(mg/100g)	12.45	22.05	39.78
당류(과당, 포도당, 설탕, 말토스, 락토스)(mg/g)	251.60	58.78	347.61
포화지방(g/100g)	0.22	0.24	0.07
트랜스지방(g/100g)	-	-	-
콜레스테롤(mg/100g)	-	-	-

5. 기능성 제품(액상차) 개발

모과, 박하, 산수유를 중량기준 6:2:2로 혼합하여 조성한 혼합물을 물로 95℃에서 2시간 30분 동안 가열 추출하여 혼합추출물을 제조한다.

상기 혼합추출물을 주성분으로 하여 기능성 음료인 액상차를 제조하되, 그 구체적인 성분 및 배합비는 표 8과 같다.

상기 표 8의 원료를 사용하여 도 1 및 도 2에 도시된 제조공정도에 의해 HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point) 설비에서 제조한다. 그리고 완성된 시제품은 도 3과 같다. 도 3은 본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료(액상차)의 실제 제품을 보인 사진으로서, 병 용기에 담긴 기능성 음료 제품과 파우치에 담긴 기능성 음료 제품의 예를 보인 사진이다.

시제품의 영양성분을 분석한 결과는 표 9 및 표 10와 같다.

액상차의 원료 함량

원료명	배합비율(wt%)	비고
혼합추출물(국산, 건조물)	80.00	모과추출물 60wt%, 박하추출물 20wt%, 산수유추출물 20wt%의 혼합물로부터 추출
액상과당	9.00	-
사과농축액	3.00	사과(국산)90wt%, 저감미당10wt%
구연산삼나트륨	0.03	-
비타민 C	0.02	-
정제수	7.95	-
합계	100.00	-

액상차 영양성분(파우치)

1회 제공량 : 1포(70 ml)
일일섭취량당	함량	%영양소기준치
열량	31 kcal	-
나트륨	57 mg	3%
탄수화물 당류	7 g 6 g	2%
지방 포화지방 트랜스지방	0 g 0 g 0 g	0.0%
콜레스테롤	0 g	-
단백질	1 g 미만	0.4%
%영양소기준치 : 1일 영양소기준치에 대한 비율

액상차 영양성분(병)

1회 제공량 : 1병(300 ml)
일일섭취량당	함량	%영양소기준치
열량	134 kcal	-
나트륨	245 mg	12%
탄수화물 당류	31 g 25 g	10%
지방* 포화지방 트랜스지방	1.2 g 0 g 0 g	2%
콜레스테롤	0 g	-
단백질	1 g 미만	2%
%영양소기준치 : 1일 영양소기준치에 대한 비율

(표 10의 지방*는 전체 지방 함량을 나타낸 것으로서, 전체 지방 중 포화지방 및 트랜스지방 함량은 각각 0g 임.)

6. 액상차 제품에 대한 기능성 평가

(1) 실험방법

1) 총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 각각의 시료 100 uL에 증류수 750 uL와 Folin-Ciocalteau's phenol regent 500 uL, 35% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 100 uL를 순서대로 가한 다음 암소에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV/VIS spectrophotometer(UV-2450, Shimadzu Co., Japan)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 탄닌산(tannin acid)을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.

2) 총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량 각각의 시료 0.5 mL에 에탄올 1.5 mL, 10% 질산알루미늄 0.1 mL, 1 M 초산칼륨 0.1 mL, 증류수 2.8 mL을 순서대로 가하고 볼텍스 믹서로 혼합하여 실온에서 40분간 반응시키고 UV/VIS spectrophotometer(UV-2450, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이때 퀘르세틴(quercetin, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo, USA)을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.

3) 안토시아닌 함량분석

각각의 시료 10 g에 0.1% 염산을 함유하는 80% 메탄올 용액 50 mL로 24시간 동안 교반 추출하여 원심분리(3,000 rpm, 10 min)한 후 상등액을 50 ml로 정용한 것을 UV/VIS spectrophotometer(UV-2450, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 528nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질은 시아니딘(cyanidin)을 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 안토시아닌 함량을 구하였다.

4) DPPH 라디칼 소거활성

DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거활성은 농도별로 조제한 시료액 100 uL에 에탄올 200 uL를 가하고 2 × 10^-4 M DPPH용액 300 uL를 가한 후 5초간 볼텍스 믹서로 혼합하여 실온에서 30분간 반응시키고 ELISA reader(Synergy HT, Biotec., USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 에탄올을 첨가하여 실험하였다.

5) ABTS 라디칼 소거활성

ABTS (2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디칼 소거활성은 400 μg/mL 농도로 조제한 시료액 5 μL에 ABTS 라디칼 용액 195 μL를 첨가하여 7분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reade)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 시료 대신에 5 mM 인산 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline)를 첨가하여 실험하였다.

(2) 실험결과

모과, 박하, 산수유를 활용하여 만든 제품에 대한 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 안토시아닌 함량을 분석한 결과(표 11) 4.18±0.09 mg/mL, 0.14±0.01 mg/mL, 0.54±0.06 mg/mL로 분석되었다.

개발한 액상차에 대한 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성을 분석한 결과(표 12, 13) 모두 농도 의존적으로 농도가 증가함에 따라 소거활성이 증가하는 것으로 나타났다. 액상차의 DPPH 라디칼 소거활성의 경우 100 ㎕/mL에서 85.3±0.2%의 소거활성을 보여 비타민 C 100 ㎍/mL 90.4±0.1보다는 낮았지만 우수하였다. ABTS 라디칼 소거활성도 100 ㎕/mL에서 61.8±8.1%의 소거활성을 보여 비타민 C 100 ㎍/mL 28.5±0.7% 보다 매우 우수하였다.

액상차의 총 폴리페놀(Total polyphenol), 총 플라보노이드(Total flavonoid ), 총 안토시아닌(Total anthocyanin) 함량

시료(Samples)	총 폴리페놀 (TAE mg/mL)	총 플라보노이드 (QUE mg/mL)	총 안토시아닌 (CYE mg/mL)
액상차(Liquid tea)	4.18±0.09	0.14±0.01	0.54±0.06

액상차의 DPPH 라디칼 소거활성(%)

	처리농도(g/mL)
시료(Samples)	5	10	50	100
액상차(Liquid tea)(㎕/mL)	35.3±0.7	63.2±1.3	84.1±0.2	85.3±0.2
아스코르브산 (Ascorbic acid) (㎍/mL)	8.4±1.1	21.7±2.3	87.2±0.3	90.4±0.1

액상차의 ABTS 라디칼 소거활성(%)

시료(Samples)	처리농도(g/mL)
시료(Samples)	5	10	50	100
액상차(Liquid tea)(㎕/mL)	3.7±0.4	8.5±0.3	38.9±3.4	61.8±8.1
아스코르브산 (Ascorbic acid) (㎍/mL)	1.5±0.3	2.6±0.4	15.3±0.1	28.5±0.7

본 발명에 따른 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료는 다산화질소 생성 억제 활성 및 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성이 우수한 효과를 갖는 것으로 산업상 이용가능성이 크다.

Claims

모과, 박하, 산수유를 혼합한 천연혼합물과 물을 1:9~12 중량비율로 혼합한 후, 85~95℃에서 2~3시간 동안 열수 추출하여 식물혼합추출물을 제조하는 단계와,
상기 식물혼합추출물을 여과하는 단계와,
상기 식물혼합추출물을 액상과당, 사과농축액, 구연산삼나트륨, 비타민 C 및 정제수와 혼합하여 음료를 제조하는 단계와,
상기 음료를 80~85℃에서 20~40분 동안 살균처리하는 단계를 거쳐 이루어지는 것임을 특징으로 하는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료제조방법.
청구항 1에 있어서,
천연혼합물은 모과 50~70wt%, 박하 10~30wt%, 산수유 10~30wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료제조방법.
청구항 1에 있어서,
음료는 식물혼합추출물 70~90wt%와, 액상과당 3~20wt%와, 사과농축액 1~10wt%와, 구연산삼나트륨 0.01~0.05wt%와, 비타민 C 0.01~0.05wt%, 정제수 5~10wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료제조방법.
청구항 3에 있어서,
사과농축액은 사과 85~95wt%와, 저감미당 5~15wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료제조방법.
모과, 박하, 산수유의 혼합으로 조성된 천연혼합물로부터 추출된 100wt%의 식물혼합추출물 70~90wt%와,
액상과당 3~20wt%와,
사과 85~95wt%와, 저감미당 5~15wt%의 혼합으로 조성된 100wt%의 사과농축액 1~10wt%와,
구연산삼나트륨 0.01~0.05wt%와,
비타민 C 0.01~0.05wt%와,
정제수 5~10wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료.
청구항 5에 있어서,
천연혼합물은 모과 50~70wt%, 박하 10~30wt%, 산수유 10~30wt%의 혼합으로 조성되는 것임을 특징으로 하는 모과, 박하, 산수유 함유 기능성음료.