KR20190032009A - 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물 - Google Patents

스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물에 대한 것으로, 상기 조성물은 소태아혈청 대신 스피룰리나를 포함하면서도 줄기세포의 배양 및 분화 효과가 우수하여, 줄기세포의 배양 및 분화를 위한 무혈청 배지의 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물 {Composition of media for culture or differentiation of stem cells comprising spirulina}
본 발명은 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물에 대한 것이다.
세포배양은 오늘날 분자생물학, 면역학을 비롯한 의학 분야의 연구에 가장 기본적이고 중요한 실험 기법이다. 현재까지 사용되고 있는 동물세포 배양법은 성장을 위하여 반드시 세포배양배지에 혈청을 공급해 주어야 하며, 가장 널리 사용되는 혈청으로 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 있다. 또한, 성체 줄기세포의 배양 및 분화 유도시에도 소태아혈청을 함유하는 배지에 여러 종류의 분화 유도 인자들을 첨가하여 사용해왔다.
그러나, 상기 배지를 이용한 줄기세포의 배양과정에서 소태아혈청을 포함한 동물유래 단백질원을 사용함으로써 임상적용을 위한 줄기세포 치료제의 개발시 종간 오염성 등의 안정성 문제를 배제하기가 어렵다. 또한, 소태아혈청의 제조과정은 임신한 어미 소의 자궁에서 소태아를 적출하여 혈청을 분리하므로 필연적으로 윤리적인 문제가 발생할 수밖에 없고, 미국 FDA 및 유럽연합의 EMEA(European Medicines Agency)를 비롯한 국제사회는 소태아혈청의 사용 자제와 대체제의 개발을 권고하고 있는 실정이다. 나아가, 소태아혈청에 의한 광우병 전파 위험성에 대한 논란 역시 여전히 해결되지 않은 상황이다.
소태아혈청을 대체하는 세포배양배지의 연구가 활발히 이루어진 결과, 국내공개특허 제10-2013-0006123호에서는 양수줄기세포의 효과적인 증식이 가능한 무혈청 배지인 MesemCult-XF 배지를 개발하였고, 미국 뉴저지 대학교의 Arati A.Inamdar 교수팀은 세포치료제로 사용하기 위한 임상등급의 중간엽 줄기세포를 생산하기 위해 세포 성장첨가제로 사용하는 혈장 및 혈소판 융해물(platelet lysate)을 개발하였다. (Inamdar et al. journal of regenerative medicine & tissue engineering 2013)
그러나, 현재까지 개발된 무혈청배지의 경우 적용 가능한 세포주가 매우 한정적이고, 배양을 위한 세포주의 적응 과정이 어려우며 세포분열 및 성장속도가 느릴 뿐만 아니라, 소태아혈청 대신 세포배양에 필수적인 각종 호르몬 및 성장인자의 추가적인 첨가가 필요해 사용자의 번거로움을 초래하는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 줄기세포 배양 배지를 대체할 수 있는 새로운 배지에 관하여 연구를 계속하던 중, 스피룰리나(spirulina)를 포함하는 배지에서 줄기세포의 배양 및 분화가 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
국내공개특허 제10-2013-0006123호
Inamdar et al. journal of regenerative medicine & tissue engineering 2013
본 발명의 목적은 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 수행하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "스피룰리나(spirulina)"는 아프리카의 챠드 호수 및 멕시코의 텍스코코 호수와 같은 열대지역 알칼리성 호수의 수면에서 왕성하게 자생하는 극히 작은 조류에 속하는 미생물이다. 스피룰리나의 세포는 다량의 클로로필과 피코시아닌의 색소를 포함하고 있어 청남색을 띠므로 남조류(blue-green algae)로 분류되기도 하였으나, 최근 남조류의 구조가 밝혀짐에 따라 스피룰리나를 청 남세 균류(blue-green bacteria)로 분류하고 있다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 스피룰리나는 분말 또는 추출물 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 스피룰리나의 건조분말을 효소, 초음파 및 고온고압 처리하여 파쇄한 뒤 원심분리된 액상의 추출물일 수 있다.
최근 줄기세포의 배양에 사용되는 소태아혈청의 대체 배지에 대한 연구의 필요성이 지속적으로 대두됨에 따라 무혈청 배지에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 다만, 무혈청 배지의 경우 적용 세포주에 대한 제한성, 세포배양의 어려움 및 고비용 등의 문제점이 해결되지 않아 연구에 적용하기 힘든 한계를 여전히 나타낸다. 본 발명자들은 연구가 전무한 해양 생물 소재를 활용해 무혈청 배지를 연구한 결과, 줄기세포 배양 및 분화 배지에 있어서 소태아혈청 대신 스피룰리나를 사용하였음에도 우수한 배양 및 분화 효과를 나타냄을 최초로 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 용어, "줄기세포(stem cell)"는 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가 증식 능력을 갖추고 있는 세포로서, 성체줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있고, 구체적으로 본 발명의 배지 조성물에 의해 배양 및 분화가 촉진되는 줄기세포의 종류로는 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC), 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로 치주인대줄기세포 또는 지방유래줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC)"는 치아와 잇몸뼈 사이의 인대 조직에 존재하는 줄기세포로서, 치과교정술 목적으로 발치되는 소구치 또는 매복된 제3대구치의 발치 동안에 얻을 수 있는 중간엽 줄기세포의 한 유형이다. 상기 치주인대줄기세포는 특이적 환경 하에서 골형성, 백악질 형성, 지방생성, 연골형성, 신경형성 및 콜라겐-형성 세포로 분화될 수 있는 고증식성 세포이다.
본 발명에서 용어, "치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC)"는 치아 내부의 중심부에 있는 연조직성 고유조직인 치수에 존재하는 줄기세포로서, 인간의 발치한 치아의 치수로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC)"는 적혈구, 백혈구, 혈소판과 같은 혈액세포를 만드는 조직 또는 기관인 골수로부터 유래된 줄기세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, "지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방 유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래성체줄기세포(adipose derived adult stem cells)와 동일 또는 동등한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 줄기세포의 성장, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당분야에서 사용되는 줄기세포의 배양 및 분화에 적절한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 해당분야의 기술적 수준에서 배지의 종류와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 구체적으로 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium, CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 송분을 포함한다. 상기 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 또는 이들의 2 이상의 혼합물 등의 항생제를 포함할 수 있다.
스피룰리나를 이용하여 줄기세포의 배양 및 분화를 가능하게 하고자 하는 본 발명의 목적상, 배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이, 줄기세포 배지에 스피룰리나를 포함하여 사용할 수 있다. 이 때, 스피룰리나를 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 배양 및 분화 유도 물질과 함께 사용하는 등 다양한 응용이 가능하다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 배지 조성물은 줄기세포의 계대배양이 가능하다.
본 발명에서 용어, "계대"는 세포, 구체적으로 줄기세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법에서, 배양용기를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 의미한다. 한 차례 배양용기 교체 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대라고 한다. 본 발명에서 상기 계대는 세대와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 배지 조성물을 사용시 치주인대줄기세포, 치수유래줄기세포, 골수유래줄기세포 및 지방유래줄기세포를 1세대부터 10세대, 즉 1계대부터 10계대까지 정상적인 배양 및 분화가 가능함을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 배지 조성물은 줄기세포의 분화능을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 용어, "분화능"는 줄기세포가 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 근육 세포 또는 신경 세포 등으로 세포의 구조나 기능이 특수화될 수 있는 능력으로서, 본 발명에서의 분화능은 줄기세포의 골분화능일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 배지 조성물은 줄기세포의 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 용어, "알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)"는 석회화의 지표로 사용되는 유기인산에스테르에서 무기인산을 방출하는 효소를 의미한다.
상기 골분화능을 촉진하기 위한 배지 조성물은 β-글리세로포스페이트, 덱사메타손 및 아스코르브산을 포함하는 골형성 유도물질 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배지 조성물은 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 배지 조성물에 포함되는 소태아혈청과 스피룰리나의 중량비(소태아혈청:스피룰리나)는 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 또는 0:10 일 수 있다. 구체적으로, 소태아혈청과 스피룰리나의 중량비(소태아혈청:스피룰리나)는 9:1 내지 4:6일 수 있고, 보다 구체적으로 9:1일 수 있다.
일 예로, 치주인대줄기세포의 배양 및 분화를 위한 배지 조성물의 소태아혈청과 스피룰리나의 중량비(소태아혈청:스피룰리나)는 9:1 내지 3:7일 수 있고, 구체적으로 9:1 내지 7:3일 수 있다.
일 예로, 치수유래줄기세포의 배양 및 분화를 위한 배지 조성물의 소태아혈청과 스피룰리나의 중량비(소태아혈청:스피룰리나)는 9:1 내지 3:7일 수 있고, 구체적으로 9:1 내지 6:4일 수 있다.
일 예로, 골수유래줄기세포의 배양 및 분화를 위한 배지 조성물의 소태아혈청과 스피룰리나의 중량비(소태아혈청:스피룰리나)는 9:1 내지 2:8일 수 있고, 구체적으로 9:1일 수 있다.
일 예로, 지방유래줄기세포의 배양 및 분화를 위한 배지 조성물의 소태아혈청과 스피룰리나의 중량비(소태아혈청:스피룰리나)는 9:1 내지 4:6일 수 있고, 구체적으로 9:1 내지 7:3일 수 있다.
본 발명의 스피룰리나를 포함하는 배지 조성물은 줄기세포 배양 및 분화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 소태아혈청을 대신할 수 있는 줄기세포 배양 및 분화용 배지로 사용될 수 있다.
도 1은 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치주인대줄기세포(PDLSC)의 10세대까지의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 2는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치수유래줄기세포(DPSC)의 10세대까지의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 3은 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 골수유래줄기세포(BMSC)의 10세대까지의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 4는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 지방유래줄기세포(ADSC)의 10세대까지의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 5는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치주인대줄기세포(PDLSC)의 10세대까지의 표현형을 나타낸 도이다.
도 6는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치수유래줄기세포(DPSC)의 10세대까지의 표현형을 나타낸 도이다.
도 7은 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 골수유래줄기세포(BMSC)의 10세대까지의 표현형을 나타낸 도이다.
도 8은 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 지방유래줄기세포(ADSC)의 10세대까지의 표현형을 나타낸 도이다.
도 9는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치주인대줄기세포(PDLSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 10은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치수유래줄기세포(DPSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 11은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 골수유래줄기세포(BMSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 12는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 지방유래줄기세포(ADSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 13은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치주인대줄기세포(PDLSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 측정한 그래프이다.
도 14는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치수유래줄기세포(DPSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 측정한 그래프이다.
도 15는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 골수유래줄기세포(BMSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 측정한 그래프이다.
도 16은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 지방유래줄기세포(ADSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 측정한 그래프이다.
도 17은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치주인대줄기세포(PDLSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화 정도를 비교한 그래프이다.
도 18은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치주인대줄기세포(PDLSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화가 일어난 줄기세포를 표시한 도이다.
도 19는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치수유래줄기세포(DPSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화 정도를 비교한 그래프이다.
도 20은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 치수유래줄기세포(DPSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화가 일어난 줄기세포를 표시한 도이다.
도 21은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 골수유래줄기세포(BMSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화 정도를 비교한 그래프이다.
도 22는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 골수유래줄기세포(BMSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화가 일어난 줄기세포를 표시한 도이다.
도 23은 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 지방유래줄기세포(ADSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화 정도를 비교한 그래프이다.
도 24는 골 분화 유도 물질을 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(SACCS)의 대체 비율에 따른 지방유래줄기세포(ADSC)의 1세대, 5세대 및 10세대에서의 석회화가 일어난 줄기세포를 표시한 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 줄기세포 생존율
줄기세포 배양배지에 있어서 대표적인 배지 조성인 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)의 대체 가능 여부를 확인하기 위하여, 스피룰리나를 포함하는 스피룰리나 동물 세포 배양액(spirulina animal cell culture solution, SACCS)이 포함된 배지에 줄기세포를 배양하여 세대별 세포생존율을 측정하였다. 상기 스피룰리나 동물 세포 배양액은 한국해양과학기술원으로부터 공급받았다. 상기 SACCS에 포함된 스피룰리나 추출물은 스피룰리나의 건조분말을 효소, 초음파 및 고농고압 처리하여 파쇄한 뒤, 원심분리하여 제조하였다.
세포생존율 실험에는 주식회사 세포바이오에서 구입한 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC) 및 론자(Lonza)에서 구입한 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)를 사용하였다.
FBS 배지에 SACCS의 대체 비율을 달리하여 줄기세포 배양 배지를 제조하였다. 구체적으로, α-MEM 배양액(10%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신)에 FBS:SACCS의 비율을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 및 0:10으로 달리한 배지를 준비하였다. 상기 4종의 줄기세포를 96-웰에 웰당 3X103 세포/웰씩 분취하였다. 48시간 후 배양액을 완전히 제거한 다음 10% cell counting kit-8(CCK-8) 시약을 포함한 α-MEM 배양액을 처리하여 1시간 동안 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 그 후, 450 nm에서 세포 생존율을 측정하였다. 측정 결과는 다음과 같다:
<치주인대줄기세포(PDLSC)>
치주인대줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 모든 비율에서 대체가 가능하고, 2 내지 4세대까지는 F1:S9의 비율, 5세대에서는 F4:S6의 비율, 6세대에서는 F3:S7의 비율, 7 내지 9세대에서는 F6:S4의 비율 및 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 1 및 표 1).
PDLSC F10:S0 F9:S1 F8:S2 F7:S3 F6:S4 F5:S5 F4:S6 F3:S7 F2:S8 F1:S9 F0:S10
#1 100 108.6 111.7 113.5 105.8 106.2 111.8 116.6 115.5 117.0 101.7
#2 115.1 118.2 100.4 143.3 139.3 119.1 135.3 123.0 108.4 68.2
#3 110.0 144.6 159.7 127.7 153.1 139.9 136.0 147.9 132.4 68.1
#4 103.4 104.8 117.9 116.3 107.5 107.1 102.9 99.2 97.7 79.7
#5 110.3 102.9 124.8 104.1 107.5 106.7 92.9 85.8 85.8 56.3
#6 114.7 104.4 113.0 111.6 101.5 106.0 106.7 91.8 82.5 47.3
#7 98.3 124.8 119.3 125.3 123.5 105.7 98.0 91.2 84.7 X
#8 106.1 106.0 119.5 114.1 104.6 99.5 97.9 94.9 89.4 X
#9 111.5 112.5 111.0 115.7 99.2 97.6 86.5 78.4 76.7 X
#10 109.6 100.2 108.0 86.4 83.1 82.6 83.2 63.5 60.2 X
< 치수유래줄기세포 ( DPSC )>
치수유래줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 F2:S8의 비율까지 대체가 가능하고, 2세대에서는 F5:S5의 비율, 3 내지 8세대에서는 F4:S6의 비율 및 9 내지 10세대에서는 F6:S4의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 2 및 표 2).
DPSC F10:S0 F9:S1 F8:S2 F7:S3 F6:S4 F5:S5 F4:S6 F3:S7 F2:S8 F1:S9 F0:S10
#1 100 96.8 99.6 104.1 97.8 101.9 103.1 100.8 101.5 96.7 83.9
#2 103.0 115.1 106.9 115.8 107.7 89.2 82.2 81.8 89.4 83.9
#3 109.8 93.7 90.2 107.0 88.5 112.3 89.4 86.5 89.2 74.3
#4 102.7 117.7 98.7 97.2 117.5 113.6 84.4 79.0 76.0 68.7
#5 112.6 102.4 104.1 104.7 106.0 105.7 92.4 89.0 87.0 74.0
#6 107.4 112.4 113.4 108.7 111.0 122.0 90.3 83.0 67.7 60.3
#7 104.8 103.5 104.2 100.5 96.7 98.4 93.2 88.9 65.2 X
#8 104.4 113.2 114.4 103.7 102.0 100.6 96.6 84.2 X X
#9 107.0 101.0 104.0 98.7 94.0 89.4 75.7 69.4 X X
#10 118.2 110.1 107.1 105.2 95.5 88.5 84.0 62.3 X X
<골수유래줄기세포(BMSC)>
골수유래줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1) 내지 3세대에서는 F2:S8의 비율까지 대체가 가능하고, 4 내지 7세대에서는 F7:S3의 비율, 8세대에서는 F8:S2의 비율 및 9 내지 10세대에서는 F9:S1의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 3 및 표 3).
BMSC F10:S0 F9:S1 F8:S2 F7:S3 F6:S4 F5:S5 F4:S6 F3:S7 F2:S8 F1:S9 F0:S10
#1 100 98.6 101.0 100.4 99.9 97.8 96.1 94.3 92.3 85.1 75.7
#2 113.7 111.6 108.2 105.0 112.9 111.7 113.8 108.1 94.7 81.8
#3 105.3 101.0 101.4 88.8 80.7 101.3 102.0 97.3 80.9 X
#4 93.1 87.7 87.3 71.5 63.2 76.7 76.7 67.2 59.3 X
#5 105.5 102.8 105.2 88.6 89.2 81.3 75.4 71.0 65.5 X
#6 95.8 101.5 97.8 64.7 53.7 57.1 52.0 47.7 47.9 X
#7 104.3 107.4 98.9 65.7 52.0 55.4 50.7 49.2 47.2 X
#8 117.7 105.0 92.5 X X X X X X X
#9 99.6 76.7 68.5 X X X X X X X
#10 100.3 79.9 83.0 X X X X X X X
< 지방유래줄기세포 ( ADSC )>
지방유래줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 F4:S6의 비율까지 대체가 가능하고, 2 내지 3세대에서는 F3:S7의 비율, 4세대에서는 F4:S6의 비율, 5세대에서는 F8:S2의 비율, 6세대에서는 F5:S5의 비율 및 7 내지 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 4 및 표 4).
ADSC F10:S0 F9:S1 F8:S2 F7:S3 F6:S4 F5:S5 F4:S6 F3:S7 F2:S8 F1:S9 F0:S10
#1 100 96.3 95.7 99.1 96.4 95.0 95.0 92.9 89.1 84.6 74.1
#2 87.7 84.3 81.9 74.2 73.3 83.5 87.1 78.4 67.2 62.7
#3 102.6 126.0 100.5 97.9 98.5 109.4 100.5 97.6 88.6 79.2
#4 94.5 97.2 97.4 84.6 82.6 94.2 83.2 83.0 79.2 72.4
#5 99.9 105.3 73.0 61.6 60.3 59.3 58.8 55.7 49.1 X
#6 107.1 113.6 102.7 98.3 98.3 80.5 81.2 86.6 59.5 X
#7 101.4 111.7 110.6 96.4 91.8 94.9 85.3 63.9 55.9 X
#8 107.5 104.9 97.9 90.0 90.8 90.9 84.6 X X X
#9 101.3 102.8 96.3 95.2 94.3 92.6 93.9 X X X
#10 103.9 102.9 104.5 103.4 96.4 95.1 92.2 X X X
실시예 2: 줄기세포의 형태학적 표현형 관찰
상기 실시예 1의 줄기세포 생존율 측정 전 현미경을 이용하여 형태학적 표현형을 관찰 및 촬영(original magnification X100) 하였으며, 그 결과는 다음과 같다:
<치주인대줄기세포(PDLSC)>
치주인대줄기세포의 세대별 형태학적 표현형을 관찰한 결과, 1세대(#1)에서는 모든 비율에서 방추제 모양의 세포형태가 나타나 모든 비율에서 대체가 가능하고, 2 내지 4세대에서는 F1:S9의 비율, 5세대에서는 F4:S6의 비율, 6세대에서는 F3:S7의 비율, 7 내지 9세대에서는 F6:S4의 비율 및 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 5). 한편, F0:S10의 경우 5세대부터 모든 치주인대줄기세포가 방추제 모양의 세포형태에서 원형으로 변화되어 대체가 불가능한 것으로 보였다. 결과적으로, 치주인대줄기세포는 세포 생존율과 동일하게 대조군 대비 30%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
<치수유래줄기세포(DPSC)>
치수유래줄기세포의 세대별 형태학적 표현형을 관찰한 결과, 1세대(#1)에서는 F10:S10 내지 F2:S8 비율에서 방추제 모양의 세포형태가 나타나 F2:S8의 비율까지 대체가 가능하고, 2세대에서는 F5:S5의 비율, 3 내지 5세대에서는 F4:S6의 비율, 6 내지 8세대에서는 F4:S6의 비율 및 9 내지 10세대에서는 F6:S4의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 6). 한편, F0:S10의 경우 6세대부터 모든 치주인대줄기세포가 방추제 모양의 세포형태에서 원형으로 변화되어 대체가 불가능한 것으로 보였다. 결과적으로, 치주인대줄기세포는 세포 생존율과 동일하게 대조군 대비 40%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
<골수유래줄기세포(BMSC)>
골수유래줄기세포의 세대별 형태학적 표현형을 관찰한 결과, 1세대(#1) 내지 3세대에서는 F10:S10 내지 F2:S8 비율에서 방추제 모양의 세포형태가 나타나 F2:S8의 비율까지 대체가 가능하고, 4 내지 7세대에서는 F7:S3의 비율, 8세대에서는 F8:S2의 비율 및 9 내지 10세대에서는 F9:S1의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 7). 한편, F0:S10의 경우 2세대부터 모든 치주인대줄기세포가 방추제 모양의 세포형태에서 원형으로 변화되어 대체가 불가능한 것으로 보였다. 결과적으로, 골수유래줄기세포는 세포 생존율과 동일하게 대조군 대비 10%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
<지방유래줄기세포(ADSC)>
지방유래줄기세포의 세대별 형태학적 표현형을 관찰한 결과, 1세대(#1)에서는 F10:S10 내지 F4:S6 비율에서 방추제 모양의 세포형태가 나타나 F4:S6의 비율까지 대체가 가능하고, 2 내지 3세대에서는 F3:S7의 비율, 4세대에서는 F4:S6의 비율, 5세대에서는 F8:S2의 비율, 6세대에서는 F5:S5의 비율 및 7 내지 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 8). 한편, F0:S10의 경우 3세대부터 모든 치주인대줄기세포가 방추제 모양의 세포형태에서 원형으로 변화되어 대체가 불가능한 것으로 보였다. 결과적으로, 지방수유래줄기세포는 세포 생존율과 동일하게 대조군 대비 30%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
실시예 3: 줄기세포의 골분화능 유지
실시예 3-1: 분화 배지에서의 줄기세포 생존율
줄기세포의 분화를 위한 분화배지에 있어서, 대표적인 배지 조성인 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)의 대체 가능 여부를 확인하기 위하여, 줄기세포의 배양 후 분화배지를 처리하여 각 세대별로 세포 생존율을 측정하였다.
구체적으로, α-MEM 배양액(10%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신)에 FBS:SACCS의 비율을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 및 0:10으로 달리한 배지를 준비하였다. 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC), 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)의 줄기세포를 96-웰에 웰당 3X103 세포/웰씩 분취하였다. 48시간 후 세포의 부착을 확인하고, α-MEM 배양액(5%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 골 분화 유도 물질: 50 μg/ml 아스코르브산, 1 μM 덱사메타손, 및 3 mM β-글리세로포스페이트)을 포함하는 분화 배지를 처리하였다. 48시간 후 분화 배지를 완전히 제거한 다음 10% cell counting kit-8(CCK-8) 시약을 포함한 α-MEM 배양액을 처리하여 1시간 동안 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 그 후, 450 nm에서 세포 생존율을 측정하였다. 측정 결과는 다음과 같다:
<치주인대줄기세포(PDLSC)>
분화 배지 처리시 치주인대줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 F3:S7의 비율까지 대체가 가능하고, 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 9). 결과적으로 대조군 대비 30%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
<치수유래줄기세포(DPSC)>
분화 배지 처리시 치수유래줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 F4:S6의 비율까지 대체가 가능하고, 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 10). 결과적으로 대조군 대비 30%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
<골수유래줄기세포(BMSC)>
분화 배지 처리시 골수유래줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 F8:S2의 비율까지 대체가 가능하고, 10세대에서는 F9:S1의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 11). 결과적으로 대조군 대비 10%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
<지방유래줄기세포(ADSC)>
분화 배지 처리시 지방유래줄기세포의 세대별 세포 생존율 측정 결과, 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 1세대(#1)에서는 F5:S5의 비율까지 대체가 가능하고, 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 대체가 가능한 것을 확인하였다(도 12). 결과적으로 대조군 대비 10%까지 SACCS로 대체 가능함을 확인하였다.
실시예 3-2: 골분화 관련 효소 활성
알칼리성 인산가수분해효소, 즉 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)는 유기인산에스테르에서 무기인산을 방출하는 효소로 석회화의 지표로 알려져 있다. 따라서, 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC), 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)에서의 골분화 및 석회화 유도 효과를 확인하기 위해 알칼리성 인산가수분해효소의 활성 수준을 확인하였다.
구체적으로, α-MEM 배양액(10%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신)에 FBS:SACCS의 비율을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 및 0:10으로 달리한 배지를 준비하였다. 상기 4종의 줄기세포를 96-웰에 웰당 3X103 세포/웰씩 분취하였다. 48시간 후 80%의 세포밀도에 도달하였을 때, α-MEM 배양액(5%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 골 분화 유도 물질: 50 μg/ml 아스코르브산, 1 μM 덱사메타손, 및 3 mM β-글리세로포스페이트)으로 배지를 교환하였다. 7일 동안 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양한 뒤, 1X RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 파쇄시켰다. 13,000 rpm으로 10분간 원심분리기(centrifuge)로 돌려 단백질 상등액을 취하였다. 50 μL의 상등액에 200 μL의 pNP 용액(Sigma)을 넣어 30분간 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 반응시킨 후 450 nm에서 알칼리성 인산가수분해효소의 활성 수준을 측정하였다. 측정 결과는 다음과 같다:
<치주인대줄기세포(PDLSC)>
치주인대줄기세포의 세대별 최종 골분화 효소의 활성을 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F3:S7의 비율까지 33% 이상의 활성 증가를 나타내고, 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 12% 이상의 활성 증가를 나타냄을 확인하였다(도 13). 결과적으로 대조군 대비 30%까지 SACCS로 대체가 가능함을 확인하였다.
<치수유래줄기세포(DPSC)>
치수유래줄기세포의 세대별 최종 골분화 효소의 활성을 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F7:S3의 비율까지 11% 이상의 활성 증가를 나타내고, 10세대에서는 F8:S2의 비율까지 13% 이상의 활성 증가를 나타냄을 확인하였다(도 14). 결과적으로 대조군 대비 20%까지 SACCS로 대체가 가능함을 확인하였다.
<골수유래줄기세포(BMSC)>
골수유래줄기세포의 세대별 최종 골분화 효소의 활성을 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F8:S2의 비율까지 18% 이상의 활성 증가를 나타내고, 10세대에서는 F9:S1의 비율까지 40% 이상의 활성 증가를 나타냄을 확인하였다(도 15). 결과적으로 대조군 대비 10%까지 SACCS로 대체가 가능함을 확인하였다.
<지방유래줄기세포(ADSC)>
지방유래줄기세포의 세대별 최종 골분화 효소의 활성을 측정한 결과, 1세대(#1)와 10세대에서 모두 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F7:S3의 비율까지 18% 이상의 활성 증가를 나타냄을 확인하였다(도 16). 결과적으로 대조군 대비 30%까지 SACCS로 대체가 가능함을 확인하였다.
실시예 3-3: 칼슘 결절(calcium nodule) 형성 확인
줄기세포의 증식 후 골세포로의 분화가 이루어지면 칼슘 결절(calcium module)이 형성되는 것으로 알려져 있다. 따라서, SACCS 배양액으로 배양시 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC), 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)의 골분화능을 확인하기 위해 칼슘 결절의 수준을 확인하였다.
구체적으로, α-MEM 배양액(10%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신)에 FBS:SACCS의 비율을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 및 0:10으로 달리한 배지를 준비하였다. 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC), 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)의 줄기세포를 6-웰에 웰당 2.5X104 세포/웰씩 분취하였다. 48시간 후 60%의 세포밀도에 도달하였을 때, α-MEM 배양액(5%의 FBS:SACCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 골 분화 유도 물질: 50 μg/ml 아스코르브산, 1 μM 덱사메타손, 및 3 mM β-글리세로포스페이트)으로 배지를 교환하였다. 14일 동안 37 ℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양한 뒤, 알리자린 레드 용액(Alizarin red solution)으로 염색하여 현미경으로 석회화(calcification)을 확인하였다. 측정 결과는 다음과 같다:
<치주인대줄기세포(PDLSC)>
치주인대줄기세포의 세대별 석회화를 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F5:S5의 비율까지 35% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였고, 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 18% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였다(도 17 및 18).
<치수유래줄기세포(DPSC)>
치수유래줄기세포의 세대별 석회화를 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F7:S3의 비율까지 15% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였고, 10세대에서는 F8:S2의 비율까지 7% 이상의 활성 석회화 나타냄을 확인하였다(도 19 및 20).
<골수유래줄기세포(BMSC)>
골수유래줄기세포의 세대별 석회화를 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F8:S2의 비율까지 4% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였고, 10세대에서는 F9:S1의 비율까지 24% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였다(도 21 및 22).
<지방유래줄기세포(ADSC)>
지방유래줄기세포의 세대별 석회화를 측정한 결과, 1세대(#1)에서는 대조군(FBS:SACCS=10:0, F10:S0) 대비 F7:S3의 비율까지 20% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였고, 10세대에서는 F7:S3의 비율까지 15% 이상의 석회화 증가를 나타냄을 확인하였다(도 23 및 24).

Claims (10)

  1. 스피룰리나를 포함하는 줄기세포 배양 및 분화용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC), 치수유래줄기세포(dental pulp stec cell, DPSC), 골수유래줄기세포(bone marrow-derived stem cell, BMSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 치주인대줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC) 및 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell, ADSC)인, 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 줄기세포의 계대배양이 가능한, 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 줄기세포의 분화능을 촉진하는, 배지 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 분화능은 골분화능인, 배지 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배지 조성물은 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 촉진하는, 배지 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 추가로 포함하는, 배지 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 스피룰리나는 소태아혈청(FBS) 대비 9:1 내지 4:6 중량비(소태아혈청:스피룰리나)인, 배지 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 스피룰리나는 소태아혈청(FBS) 대비 9:1 중량비(소태아혈청:스피룰리나)인, 배지 조성물.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004114A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 浙江优牙生物科技有限公司 一种牙髓干细胞的无血清培养基
KR20220099837A (ko) * 2021-01-07 2022-07-14 (주)엔케이바이오텍 스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 엑소좀 생산 방법
KR20220099836A (ko) * 2021-01-07 2022-07-14 (주)엔케이바이오텍 스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 시크리톰 생산 방법
KR20220158611A (ko) * 2021-05-24 2022-12-01 한국해양과학기술원 배양육 생산용 근육세포 배양용 배지 조성물, 이의 제조방법 및 세포 생산 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20250002859A1 (en) * 2021-11-25 2025-01-02 Chung-Ang University Industry-Academic Cooperation Foundation Method for producing cultured meat by utilizing fbs substitute derived from butchery by-products

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0049632A2 (en) * 1980-10-06 1982-04-14 Chlorella Industry Co., Ltd Cell culture method
JPS62179384A (ja) * 1986-02-04 1987-08-06 Toa Nenryo Kogyo Kk 細胞培養用ゲルの製造方法
US20080085330A1 (en) * 2005-05-02 2008-04-10 Cyndy Davis Sanberg Compounds for stimulating stem cell proliferation including spirulina
KR20130006123A (ko) 2011-07-08 2013-01-16 경북대학교병원 인간 양수줄기세포 배양배지 및 이를 이용한 양수줄기세포 배양방법
KR20170140762A (ko) * 2016-06-10 2017-12-21 한국해양과학기술원 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0049632A2 (en) * 1980-10-06 1982-04-14 Chlorella Industry Co., Ltd Cell culture method
JPS62179384A (ja) * 1986-02-04 1987-08-06 Toa Nenryo Kogyo Kk 細胞培養用ゲルの製造方法
US20080085330A1 (en) * 2005-05-02 2008-04-10 Cyndy Davis Sanberg Compounds for stimulating stem cell proliferation including spirulina
KR20130006123A (ko) 2011-07-08 2013-01-16 경북대학교병원 인간 양수줄기세포 배양배지 및 이를 이용한 양수줄기세포 배양방법
KR20170140762A (ko) * 2016-06-10 2017-12-21 한국해양과학기술원 남조류 스피룰리나 추출물을 함유하는 세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 세포의 배양방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Inamdar et al. journal of regenerative medicine & tissue engineering 2013
Mar Drugs. 15(8): 237 (2017.08.) 2018101102* *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004114A (zh) * 2019-04-02 2019-07-12 浙江优牙生物科技有限公司 一种牙髓干细胞的无血清培养基
KR20220099837A (ko) * 2021-01-07 2022-07-14 (주)엔케이바이오텍 스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 엑소좀 생산 방법
KR20220099836A (ko) * 2021-01-07 2022-07-14 (주)엔케이바이오텍 스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 시크리톰 생산 방법
KR20220158611A (ko) * 2021-05-24 2022-12-01 한국해양과학기술원 배양육 생산용 근육세포 배양용 배지 조성물, 이의 제조방법 및 세포 생산 방법

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