KR20190108189A - 자스모네이트 화합물의 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20190108189A
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cyclodextrin
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KR1020197026840A
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조세 이. 페르 페레이라 로페즈
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나노케어 테크놀로지스 인코퍼레이티드
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Abstract

이 공개 문헌에는 나노 전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 및 이의 약제학적 조성물뿐만 아니라 이의 혈관신생과 관련된 또는 NF-κB 관련된 장애를 치료하거나 예방하는 용도에 대해 기술한다. 또한, 나노 전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물 및 이의 조성물을 제조하는 방법도 기술한다.

Description

자스모네이트 화합물의 조성물 및 이의 용도{COMPOSITIONS OF JASMONATE COMPOUNDS AND METHODS OF USE}
관련 출원
본원은 2011년 9월 16일자에 출원된 미국 가출원 제61/535,836호, 2011년 11월 4일자에 출원된 미국 가출원 제61/555,690호, 2012년 2월 24일자에 출원된 미국 가출원 제61/603,042, 2012년 3월 6일자에 출원된 미국 가출원 제61/607,318호, 2012년 3월 19일자에 출원된 미국 가출원 제61/612,774호, 2012년 2월 27일자에 출원된 국제 출원번호 PCT/IB2012/000364에 대한 우선권을 주장한다.
상기 각각의 출원 전문 내용은 참조문헌으로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 다양한 질환과 장애의 치료 및 예방에 유용한 자스모네이트 화합물(예를 들어, 나노전달(nanocarried) 또는 마이크로전달되는(microcarried) 자스모네이트 화합물)의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
자스모네이트 화합물 또는 자스모네이트는 사이클로펜타논 링을 특징으로 하고, 스트레스 상황에 처한 식물에 의해 생산된 식물 스트레스 호르몬으로 알려져 있다. 자스모네이트의 예로는, 자스몬산(JA), 메틸 자스모네이트(MJ, 및 시스-/트랜스-자스몬(예를 들어, U.S. 특허 6,469,061 및 WO 2007/066337 참조). MJ 및 JA 모두 종양 세포에 대해 효과적이고 선택적으로 나타났다(예를 들어, Flescher, Anti-Cancer Drugs 2005, 16:901-916 및 US 2002/0173470 참조). 그러나, 생체 내(in vivo)에 투여되면 자스모네이트는 보통 예를 들어, 에스터레이즈에 의해 대사되어, 표적 암세포에 도달되기 전에 없어지므로 항암제로서는 별로 흥미롭지 않았다.
본 발명은, 부분적으로, 신생혈관 생성과 관련된 질환 및 염증 질환과 같은 다양한 질환을 치료 또는 예방에 적용하기 위하여, 나노전달 또는 마이크로전달되는 자스모네이트, 특히, 나노전달 또는 마이크로전달되는 메틸 다이하이드로자스모네이트(MDJ, 또한 메틸 2-(3-옥소-2-펜틸사이클로펜틸)아세테이트로 알려짐)를 제공한다. 상기 MDJ의 화학식은 다음과 같다.
Figure pat00001
하나의 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 용매 및 메틸 다이하이드로자스모네이트(MDJ)를 함유하는 다수의 나노전달체 및/또는 마이크로전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 나노전달체 및/또는 마이크로전달체는 사이클로덱스트린 또는 덴드리머, 또는 리포좀으로 형성되거나, 인지질 외층에 의해 둘러싸인 콜레스테릴 에스터 코어를 포함하는 합성 나노에멀젼 입자(LDEs)이며; 상기 나노전달체는 1 나노미터(nm) 내지 1000 nm(예를 들어, 1-900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1-200 nm, 1-100 nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-50 nm, 1-30 nm, 또는 1-10 nm)의 크기 범위를 가지고; 상기 마이크로전달체는 1 마이크론 내지 50 마이크론(예를 들어, 1 마이크론 내지 약 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1.5 마이크론)의 크기 범위를 가지며,상기 약제학적 조성물은 1nM 내지 1 M(예를 들어, 1 nM 내지 10 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 1 μM , 1 nM 내지 10 μM , 1 nM 내지 100 μM, 100 μM 내지 l mM, 100 μM 내지 lO mM, 100 μM 내지 lOO μM, 또는 100 mM 내지 1 M)의 MDJ 농도를 가진다.
상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 다음 특징을 가질 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 1 nM 내지 10-100 μM(예를 들어, 1 nM 내지 10 nM; 10 nM 내지 100 nM; 100 nM 내지 1μM; 1μM 내지 10 μM; 또는 10μM 내지 100 μM), 또는 100 μM 내지 1 mM(예를 들어, 100 μM 내지 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 또는 900 μM), 또는 100 μM 내지 10 mM(예를 들어, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 또는 900 μM 내지 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 또는 10 mM), 또는 100 μM 내지 100 mM(예를 들어, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 900 μM, 또는 1 mM 내지 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM), 또는 10 μM 내지 1 mM(예를 들어, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 또는 90 mM 내지 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM 또는 1 mM), 또는 1-100 mM(예를 들어, 1-10 mM, 1-20 mM, 1-30 mM, 1-40 mM, 1-50 mM, 1-60 mM, 1-70 mM, 1-80 mM, 또는 1-90 mM), 또는 100 mM 내지 1 M(예를 들어, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 내지 1M)의 MDJ 농도를 가진다.
상기 나노전달체는 사이클로덱스트린으로 형성되고, 3 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 3.5-11 nm, 10-20 nm, 10-30 nm, 10-40 nm, 10-50 nm, 10-60 nm, 10-70 nm, 10-80 nm, 10-90 nm, 20-30 nm, 20-40 nm, 20-50 nm, 20-60 nm, 20-70 nm, 20-80 nm, 20-90 nm, 30-40 nm, 30-50 nm, 30-60 nm, 30-70 nm, 30-80 nm, 30-90 nm, 40-50 nm, 40-60 nm, 40-70 nm, 40-80 nm, 40-90 nm, 또는 50-60 nm, 50-70 nm, 50-80 nm, 50-90 nm, 또는 50-100 nm의 크기 범위를 가진다.
상기 나노전달체는 리포좀 또는 LDEs이고, 30 nm 내지 500 nm, 예를 들어, 50 nm-110 nm, 30 nm 내지 50 nm, 30 nm 내지 100 nm, 30 nm 내지 150 nm, 30 nm 내지 200 nm, 30 nm 내지 250 nm 30 nm 내지 300 nm, 30 nm 내지 350 nm, 30 nm 내지 400 nm, 또는 30 nm 내지 450 nm의 크기 범위를 가진다.
상기 나노전달체는 리포좀 또는 LDEs이고, 약 2 μm 내지 30 μm(예를 들어, 2-5 μm, 2-10 μm, 2-15 μm, 2-20 μm, 또는 2-25 μm), 약 5 μm 내지 20 μm(예를 들어, 5-7.5 μm, 5-10 μm, 5-12.5 μm, 5-15 μm, 또는 5-17.5 μm), 또는 약 10 μm의 크기 범위를 가진다. 추가로, MDJ의 농도는 10-100 mM 내지 100 mM(예를 들어, 50-100 mM 또는 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 또는 900 mM 내지 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 또는 10 mM 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM) 또는 100 mM 내지 1M(예를 들어, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 내지 1 M)의 범위를 가진다.
상기 나노전달체는 덴드리머로 형성되고, 1 nm 내지 500 nm(예를 들어, 2-10 nm, 2-20 nm, 2-50 nm, 2-100 nm, 2-150 nm, 2-200 nm, 2-250 nm, 2-300 nm, 2-350 nm, 2-400 nm, 2-450 nm, 10-100 nm, 10-200 nm, 10-300 nm, 10-400 nm, 10-500 nm, 50-100 nm, 50-200 nm, 50-300 nm, 50-400 nm, 50-500 nm, 100-300 nm, 100-500 nm, 200-500 nm, 300-500 nm, 또는 400-500 nm)의 크기 범위를 가진다.
상기 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM)이다.
상기 MDJ의 농도는 1 nM 내지 10-100 μM (예를 들어, 1 nM 내지 10 nM, 10 nM 내지 100 nM, 100 nM 내지 1 μM , 1 μM 내지 10 μM, 또는 10 μM 내지 100 μM), 10-100 μM 내지 100 mM(예를 들어, 50-100 μM 또는 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 또는 900 μM 내지 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 또는 10 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM), 또는 100 mM 내지 1M(예를 들어, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 내지 1M)의 범위를 가진다. 예를 들면, 상기 MDJ의 농도는 100 μM 내지 1 mM 또는 50 nM 내지 70 nM이다.
상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 추가로 2-아미노에틸 다이하이드로젠 포스페이트(또는 포스포에탄올아민), 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알(또는 시트랄), 메틸 살리실레이트 또는 아브시스산, 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알은 시스- 또는 트랜스이소머일 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물이다.
다른 하나의 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 용매 및 자스모네이트 화합물을 함유하는 다수의 나노전달체 및/또는 마이크로전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 상기 나노전달체 및/또는 마이크로전달체는 사이클로덱스트린 또는 덴드리머, 또는 리포좀으로 형성되거나, 인지질층에 의해 둘러싸인 콜레스테릴 에스터 코어를 포함하는 합성 나노에멀젼 입자(LDEs)이다. 상기 나노전달체는 1 나노미터(nm) 내지 1000 nm(예를 들어, 1-900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1-200 nm, 1-100 nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-50 nm, 1-30 nm, 또는 1-10 nm)의 크기 범위를 가지고; 상기 마이크로전달체는 1 마이크론 내지 50 마이크론(예를 들어, 1 마이크론 내지 약 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1.5 마이크론)의 크기 범위를 가지며; 상기 약제학적 조성물은 1nM 내지 1 M(예를 들어, 1 nM 내지 10 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 10 μM, 1 nM 내지 100 μM, 100 μM 내지 l mM, 100 μM 내지 lO mM, 100 μM 내지 lOO mM, 또는 100 mM 내지 1 M)의 자스모네이트 화합물 농도를 가진다.
상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 다음 특징을 가질 수 있다.
상기 자스모네이트 화합물은 자스몬산, 7-이소-자스몬산, 9,10-다이하이드로자스몬산, 9,10-다이하이드로-이소자스몬산, 2,3-다이디하이드로자스몬산, 3,4-다이디하이드로자스몬산, 3,7-다이디하이드로자스몬산, 4,5-다이디하이드로자스몬산, 4,5-다이디하이드로-7-이소자스몬산, 쿠쿠르브산(cucurbic acid), 6-에피-쿠쿠르브산, 6-에피-쿠쿠르브산-락톤, 12-하이드록시-자스몬산, 12-하이드록시-자스몬산-락톤, 11-하이드록시-자스몬산, 8-하이드록시-자스몬산, 호모-자스몬산, 다이호모-자스몬산, 11-하이드록시-다이호모-자스몬산, 8-하이드록시-다이호모-자스몬산, 투베론산, 투베론산-O-β-글루코피라노사이드, 쿠쿠르브산-O-β-글루코피라노사이드, 5,6-다이디하이드로-자스몬산, 6,7-다이디하이드로-자스몬산, 7,8-다이디하이드로-자스몬산, 시스-자스몬, 다이하이드로자스몬 및 이의 저급 알킬 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 약제학적 조성물은 1 nM 내지 1 μM(예를 들어, 1, 2 , 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 또는 9 nM 내지 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 950 nM), 또는 1 nM 내지 100 μM(예를 들어, 1 nM 내지 10 nM, 10 nM to 100 nM, 100 nM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 또는 10 μM 내지 100 μM), 또는 1 nM 내지 1 mM (예를 들어, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM, 50 μM, 또는 100 μM 내지 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 또는 내지 900 μM), 또는 10 μM 내지 100 mM(예를 들어, 50 μM 또는 90 μM 내지 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM,10 mM, 20 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 또는 내지 90 mM), 또는 100 μM 내지 1 mM(예를 들어, 100 μM 내지 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 또는 900 μM), 또는 100 μM 내지 10 mM(예를 들어, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 또는 900 μM 내지 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 또는 10 mM), 또는 100 μM 내지 100 mM(예를 들어, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 900 μM, 또는 1 mM 내지 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM), 또는 10 μM 내지 1 mM(예를 들어, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 또는 90 μM 내지 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 또는 1 mM), 또는 1-100 mM(예를 들어, 1-10 mM, 1-20 mM, 1-30 mM, 1-40 mM, 1-50 mM, 1-60 mM, 1-70 mM, 1-80 mM, 또는 1-90 mM), 또는 100 mM 내지 1 M(예를 들어, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 내지 1M)의 자스모네이트 화합물 농도 범위를 가진다.
상기 나노전달체는 사이클로덱스트린으로 형성되고, 3 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 3.5-11 nm, 10-20 nm, 10-30 nm, 10-40 nm, 10-50 nm, 10-60 nm, 10-70 nm, 10-80 nm, 10-90 nm, 20-30 nm, 20-40 nm, 20-50 nm, 20-60 nm, 20-70 nm, 20-80 nm, 20-90 nm, 30-40 nm, 30-50 nm, 30-60 nm, 30-70 nm, 30-80 nm, 30-90 nm, 40-50 nm, 40-60 nm, 40-70 nm, 40-80 nm, 40-90 nm, 또는 50-60 nm, 50-70 nm, 50-80 nm, 50-90 nm, 또는 50-100 nm의 크기 범위를 가진다.
상기 나노전달체는 LDEs이고, 30 nm 내지 500 nm, 예를 들어, 50 nm-110 nm, 30 nm 내지 50 nm, 30 nm 내지 100 nm, 30 nm 내지 150 nm, 30 nm 내지 200 nm, 30 nm 내지 250 nm, 30 nm 내지 300 nm, 30 nm 내지 350 nm, 30 nm 내지 400 nm, 또는 30 nm 내지 450 nm의 크기 범위를 가진다.
상기 마이크로전달체는 리포좀 또는 LDEs이고, 약 2 ㎛ 내지 30 ㎛(예를 들어, 2-5 ㎛, 2-10 ㎛, 2-15 ㎛, 2-20 ㎛, 또는 2-25 ㎛), 약 5 ㎛ 내지 20 ㎛(예를 들어, 5-7.5 ㎛, 5-10 ㎛, 5-12.5 ㎛, 5-15 ㎛, 또는 5-17.5 ㎛), 또는 약 10 ㎛의 크기 범위를 가진다. 추가로, 상기 자스모네이트 화합물은 MDJ이고, 상기 MDJ의 농도는 100 mM 내지 1M(예를 들어, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 내지 1M)의 범위를 가진다.
상기 나노전달체는 덴드리머로 형성되고, 2 nm 내지 500 nm(예를 들어, 2-10 nm, 2-20 nm, 2-50 nm, 2-100 nm, 2-150 nm, 2-200 nm, 2-250 nm, 2-300 nm, 2-350 nm, 2-400 nm, 2-450 nm, 10-100 nm, 10-200 nm, 10-300 nm, 10-400 nm, 10-500 nm, 50-100 nm, 50-200 nm, 50-300 nm, 50-400 nm, 50-500 nm, 100-300 nm, 100-500 nm, 200-500 nm 300-500 nm, 또는 400-500 nm)의 크기 범위를 가진다.
상기 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM)이다.
상기 자스모네이트 화합물은 MDJ이고, 상기 MDJ의 농도는 1 nM 내지 10-100 μM, 10-100 μM 내지 100 mM, 또는 100 mM 내지 1M, 예를 들어, 100 μM 내지 1 mM 또는 50 nM 내지 70 nM의 범위를 가진다.
상기 자스모네이트 화합물은 MJ이고, 상기 MJ의 농도는 1 nM 내지 1 μM, 10-100 μM 내지 100 mM, 또는 100 mM 내지 1M, 예를 들어, 100 μM 내지 1 mM 또는 50 nM 내지 70 nM의 범위를 가진다.
상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 추가로 2-아미노에틸 다이하이드로젠 포스페이트(또는 포스포에탄올아민), 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알(또는 시트랄), 메틸 살릭실레이트 또는 아브시스산, 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알은 시스- 또는 트랜스이소머일 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물이다. 여기에 기술된 상기 화합물은 추가로 하나 이상의 비-자스모네이트 화합물(자스모네이트 화합물이 아닌 화합물), 예를 들면, 2-아미노에틸 다이하이드로젠 포스페이트(또는 포스포에탄올아민), 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알(또는 시트랄), 메틸 살릭실레이트 또는 아브시스산, 천연 아미노산류, Ca2+, Zn2+, 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 여기에 기술된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 또는 이의 약제학적 조성물의 암 또는 염증 질환(예를 들어, 염증성 장 질환, 급성 피부염, 골반 염증성 질환, 또는 편도선염)과 같은 신생혈관 생성과 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위한 용도를 설명한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 여기에 기술된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 또는 이의 약제학적 조성물의 바이러스, 세균 또는 곰팡이 감염과 같은 NF-κB 관련 장애의 치료 또는 예방을 위한 용도를 설명한다.
추가로, 본 발명은 여기에 기술된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 또는 이의 약제학적 조성물의 시험관내 또는 생체 내 암세포 성장을 억제하기 위한 용도를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 암 세포주는 다음을 포함한다: UACC62 - 흑색종, MCF7 - 암 내성, NCIADR -다약제내성 유방암, 7860 - 신장암, NC1460 - 폐암, PC03 - 전립선암 내성, OVCAR03- 난소암, HT29 - 대장암, K562 - 백혈병, TCP-1003 (트리플-네거티브 유방암 패널 3), Caco-2- 대장암, 간엽 형상이나 루미날 형태를 공유하는 18 트리플-네거티브 유방암 세포주의 패널; 유방암 세포주 HCC38 (ATCC® 번호: CRL-2314™) 및 MCF7 (ATCC® 번호: HTB-22™); 전립선 선암 세포주 PC-3 (ATCC® 번호: CRL-1435™); 전립선암 세포주 VCaP(ATCC® 번호: CRL-2876™); 전립선암 세포주 22Rvl (ATCC® 번호: CRL-2505™); 전립선암 세포주 DU 145 (ATCC® 번호: HTB-81™); 전립선암 세포주 LNCaP 클론 FGC (ATCC® 번호: CRL-1740™); 백혈병 세포주 MOLT-4(ATCC® 번호: CLR-1582™); 백혈병(AML) 세포주 KG-1 (ATCC® 번호: CCL-246™); 백혈병(CML) 세포주 K-562 (ATCC® 번호: CCL-243™); 백혈병 인간 세포주 CCRF-CEM (ATCC® 번호: CCL-119™); CLL 백혈병 세포주 Hs 505.T (ATCC® 번호: CRL-7306™); Jurkat 세포주(백혈병, ATCC® 번호: TIB-156™); Molm 세포주(백혈병, 예를 들어, Molm-13, Molm-14, Molm-16, Molm-17, 및 Molm-18), Nomo 세포주(백혈병, 예를 들어., NOMO-1) 및 라스 돌연변이 세포.
여기에 기술된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 또는 이의 약제학적 조성물은 다음과 같은 장점을 가진다. 그들은 생체 내에서 건강한 세포에 대한 독성이 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서, 전립선암, 유방암, 흑색종, 대장암, 백혈병과 같은 암의 범위에서 생체 내 및/또는 시험관내 항암 활성을 보여준다.
그들 새로운 작용 메커니즘은 전립선암에 대해 확립된 다른 약물 요법을 보완할 수 있다. 예를 들면, 진행성 질환(advanced diseases)에 대해, 본 발명의 조성물은 부작용을 가지는 공격적인 요법의 사용을 줄일 수 있고, 국부 질환에 대해, 본 발명의 조성물은 호르몬 요법에 대한 민감도의 효능을 연장하고, 전이성 질환으로의 진행을 지연시킬 수 있다.
본 발명은 여기에 기술된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 또는 이의 약제학적 조성물을 합성하는 방법을 또한 기술한다.
자스모네이트는 인간 암 세포의 미토콘드리아에서 직접적이고 선택적으로 작용하는 잠재적인 항암제로 밝혀졌다(예를 들어, Rotem et al., Cancer Res 2005; 65:1984-1993; Costantini et al., JNCI 2000; 90:1042-1053 참조). 자스모네이트류 및 그들의 합성 유도체 중 일부는, 시험관내 및 생체 내에서 항암 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 자스모네이트는 EL-4 림프종을 갖고 있는 마우스의 수명을 증가시켰고, MJ는 화학 내성 B-림프종 세포에서 활성을 나타내며, 예비 데이터는 MJ가 세포사멸 경로를 통해 세포 독성을 나타내는 것을 제시하였다(예를 들어, Flescher, Cancer Lett. 2007; 245(1-2):1-10; Fingrut et al., Br J Pharmacol. 2005; 146(6): 800-808; Fingrut et al., Leukemia, 2002; 16:608-616. 참조). 자스모네이트의 항암 활성을 설명하는 작용 메커니즘이 제안되었다(id., 및 도 37 참조). 그러나, 이러한 항암제의 새로운 부류가 직면하고 있는 주요 문제는 생체 내에 화합물을 투여하는 어려움이다. 생체 내에 투여되는 경우 자스모네이트는 보통 예를 들어, 에스터레이즈에 의해 대사되어, 에스터가 되고, 표적 암세포에 도달되기 전에 없어지므로 항암제로서는 별로 흥미롭지 않았다.
본 발명은 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트의 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 의약품 사용에 적합한 것을 의미하는 "약제학적" 조성물인 것으로 의도된다. 따라서, 여기에 사용된 용어 "조성물"은 "약제학적"이 명백히 기재되지 않은 경우에도 약제학적 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 생체 내 표적 세포에 도달하기 전에 자스모네이트의 분해에 대한 안정성을 제공한다. 본 발명은 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트, 특히, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MDJ가 항-신생혈관 활성을 나타낸다는 예기치않은 발견에 일부 기반을 둔다. 또한, 본 발명은 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MDJ가 정상 세포와 혈관에 독성이 거의 없으며, 나노전달되는 MJ 보다 암세포에 대해 더 효과적, 예를 들어, 적어도 103 이상 더 효과적이라는 예기치않은 발견에 일부 기반을 둔다. 본 발명은 또한, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트, 특히, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MDJ 또는 MJ가 상이한 투여량 또는 농도에 따라 항-신생혈관 활성 또는 신생혈관 활성 중 하나를 나타낸다는 예기치않은 발견에 일부 기반을 둔다. 예를 들면, 1 nM 내지 약 10-100 μM의 낮은 농도에서는, 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MDJ가 신생혈관 생성 효과를 나타내는 반면에, 100 μM 보다 큰 농도에서는, 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MDJ가 항-신생혈관 생성 효과를 나타낸다. MJ의 경우, 1 nM 내지 약 1 μM의 낮은 농도에서는, 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MJ가 신생혈관 생성 효과를 나타내는 반면에, 1 μM 보다 큰(예를 들어, 2 μM 또는 5 μM 보다 큰) 농도에서는, 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 MDJ가 항-신생혈관 생성 효과를 나타낸다.
상기 예기치 않은 발견은 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트가 새롭고 유망한 표적 항암 요법으로 사용되는 것을 제안한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "a," "an" 및 "the"는 문맥 상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 그러므로, 예를 들면, "자스모네이트 화합물"에 대한 참조는 단일 자스모네이트뿐만 아니라 이의 전구 약물, 에스터, 염, 대사체를 포함하는 2 이상의 상이한 자스모네이트의 조합 또는 혼합물까지도 포함할 수 있다.
여기에 사용된 어구 "예를 들면", "예를 들어", "~과 같은", 또는 "~을 포함하는"는 보다 일반적인 청구 대상을 더욱 명확히 하는 예로 소개하는 것을 의미한다. 이러한 예는 오로지 발명을 이해하기 위한 보조 수단으로 제공되며, 어떠한 방식으로도 한정을 의미하지 않는다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에서, 다음 용어는 하기에 설명되는 정의에 따라 사용될 것이다.
여기에 사용된 어구 "함유하는", "형성된/구성된", "포함하는" "화학식을 가지는" 또는 "구조를 가지는"은 제한되도록 의미하지 않으며, 문맥상 달리 명시하지 않는 한 용어 "포함"이 보통 사용되는 것과 동일한 방식으로 사용된다.
여기에 사용된 용어 "나노전달체"는 표적 세포, 조직, 또는 기관에 활성 성분(예를 들어, 약물)을 운반 및 전달하기에 적합한 담체 또는 비히클을 의미하고, 상기 비히클은 약 1 나노미터(nm) 내지 약 1000 nm의 크기 범위를 가진다. 여기에 사용된 용어 "마이크로전달체"는 표적 세포, 조직, 또는 기관에 활성 성분(예를 들어, 약물)을 운반 및 전달하기에 적합한 담체 또는 비히클을 의미하고, 상기 비히클은 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론의 크기 범위를 가진다. 하나의 구현예에서, 마이크로전달체는 나노전달체의 클러스터로 형성되며, 예를 들면, LDE 나노전달체의 클러스터로 형성된 LDE 마이크로전달체이다. 바람직하게, 상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 약제학적으로 허용가능한 담체이다.
여기에 사용된 용어 "나노전달/마이크로전달되는 화합물" 또는 용어 "화합물을 포함하는 나노전달체/마이크로전달체"는 화합물과 연결 또는 결합된 나노전달체/마이크로전달체의 복합체를 의미한다. 상기 연결 또는 결합은 화학 결합(예를 들어, 공유 결합), 수소 결합, 반데르바알스 힘, 쿨롱 상호 작용 등을 통해 만들어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 화합물은 나노전달체/마이크로전달체 내로 캡슐화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 부분적으로 나노전달체/마이크로전달체 내로 캡슐화되거나 나노전달체/마이크로전달체의 표면(예를 들어, 나노전달체/마이크로전달체 표면의 일부 또는 상기 표면에 접한 바깥면)에 캡슐화된다.
용어 "에멀젼"은 첫 번째 액체가 정상적으로 비혼합되면서, 두 번째 액체(연속 상)에 분산된 첫 번째 액체(분산 상)의 작은 구체 또는 입자의 현탁액을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "나노에멀젼"은 약 1 nm 내지 약 50 μm(예를 들어, 1nm-50μm, 1nm-40μm, 1nm-30μm, 1nm-20μm, lnm-1Oμm, lnm-5000nm, lnm-4000nm, lnm-3000nm, l-2000nm, 1-1000 nm, l-900nm, l-800nm, l-700nm, l-600nm, 1-500 nm, l-400nm, l-300nm, l-200nm, 1-150 nm, 1-lOOnm, l-90nm, l-80nm, l-70nm, l-60nm, l-50nm, l-40nm, l-30nm, l-20nm, 1-lOnm, l-5nm, 50-100 nm, 3-150 nm, 또는 3-20 nm)의 크기 범위의 분산된 입자를 가지는 에멀젼을 의미한다. 나노에멀젼은 분산 상의 작은 크기로 인해 투명해 보이는 경향이 있다.
용어 "LDE"는 조성과 거동에서 저밀도 리포단백질(LDL)과 닮은 나노에멀젼 입자를 의미한다. 예를 들면, 일단 순환계로 도입되면 다양한 혈장 단백질(예를 들어, apoE)이 LDE 입자의 표면 위로 흡수되고, 이들은 이후 LDE를 LDL 수용체(LDLR)를 발현하는 세포로 향하게 한다. LDE는 단백질이 없으며, 일반적으로 인지질 단층에 의해 둘러싸인 콜레스테릴 에스터 코어로 구성된다. LDE 및 이의 제조에 대한 상세한 설명은, 예를 들어 Ginsburg et al. (1982), J Biol Chem 257: 8216-8227; Maranhao et al. (1993), Lipids 28: 691-696; 및 Favero et al. (2010), Biol Res 43: 439-444을 참조할 수 있다. 여기에 사용된 용어 "LDE"는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 리포좀 유사 나노전달체 또는 마이크로전달체의 한 예로 언급된다. 다른 적합한 리포좀 유사 나노전달체 및/또는 마이크로전달체의 결정은 당업자의 일반적인 수준 내에서 이루어진다.
용어 "콜레스테릴 에스터"는 콜레스테롤의 에스터를 의미한다. 예를 들면, 에스터 결합은 지방산의 카르복실레이트기와 콜레스테롤의 하이드록실기 사이에 형성된다. 콜레스테릴 에스터의 예로는 콜레스테릴 올레에이트, 콜레스테릴 네르보네이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "인지질"은 지질 이중층을 형성할 수 있으면서 모든 세포막의 주요 구성 요소인 지질의 부류를 의미한다. 대부분 인지질은 다이글리세라이드, 포스페이트기 및 콜린과 같은 간단한 유기 분자를 포함한다. 상기 규칙의 한 가지 예외는 핑고마이엘린으로, 이는 글리세롤 대신 스핑고신으로부터 유도된다. 인지질의 예로는 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 및 포스포이노시타이드(예를 들어, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 포스파티딜이노시톨 바이스포스페이트 및 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트)와 같은 글리세로포스포리피드가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
여기에 언급된 화합물은 비방향족 이중 결합 및 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있다. 그러므로, 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상 이성질체, 각각의 부분 입체 이성질체, 부분 입체 이성질체 혼합물, 및 시스- 또는 트랜스- 이성질체 형태로 나타날 수 있다. 이러한 모든 이성질체 형태가 고려된다. 예를 들면, 여기에 기술된 자스모네이트 화합물은 비대칭 탄소에 근거하고, 광학적으로 순수한, 임의의 모든 각종 광학 이성질체, 다양한 광학 이성질체의 임의의 혼합물, 또는 라세미체를 포함한다. MDJ의 입체 이성질체는, 예를 들어, (lR,2R)-다이하이드로메틸자스모네이트, (1R,2S)-다이하이드로메틸자스모네이트, (lS,2R)-다이하이드로메틸자스모네이트, 및 (1S,2S)-다이하이드로메틸자스모네이트를 포함한다. 메틸 자스모네이트의 이성질체의 예로, 시스- 또는 트랜스-(lR,2R)-메틸 자스모네이트, 시스- 또는 트랜스-(lR,2S)-메틸 자스모네이트, 시스- 또는 트랜스-(lS,2R)-메틸 자스모네이트, 및 시스- 또는 트랜스-(lS,2S)-메틸 자스모네이트를 포함한다.
본 발명은 본 화합물에서 발생하는 원자의 모든 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다. 동위원소는 같은 원자 번호에 다른 질량수를 갖는 원자를 포함한다. 일반적인 예로, 그리고 제한 없이, 수소의 동위 원소는 삼중 수소 및 중수소를 포함하고, 탄소의 동위 원소는 C-13 및 C-14를 포함한다
여기에 사용된 용어 "알킬"은 반드시 그렇지는 않지만 일반적으로 1 내지 약 24 개의 탄소 원자를 포함하는 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소기(예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 옥틸, 데실 등 뿐만 아니라, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등의 사이클로알킬기)를 의미한다. 일반적으로, 여기에 기술된 알킬기는 반드시 그렇지는 않지만 일반적으로 1 내지 약 18 개의 탄소 원자를 포함할 수 있으며, 이러한 그룹은 1 내지 약 12 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 상기 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 탄소 원자를 가지는 알킬기를 의미한다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한, 자스모네이트 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체, 예를 들어, 여기에 기술된 나노전달체/마이크로전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 나노전달체는 사이클로덱스트린으로 형성된다. 사이클로덱스트린(CDs)은 a-l,4-C-0-C 체인에 의해 연결된 D-L(+)-글루코오스 단위로 형성된 사이클릭 올리고사카라이드이다. CDs는 효소 전환에 의해 전분에서 생산된다. 본래의 CDs는 글루코오스 단위의 수에 의해 정의되며, 예를 들면, α-, β-, 및 γ-CDs는 각각 6, 7, 및 8 글루코오스 단위로 구성된다. 본 발명에 적합한 CDs는 예를 들어, WO 2010/006392, US 2008/044364, 및 EP 392608에 기술되어 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물로 사용된 나노전달체/마이크로전달체는 LDEs이다. 특히, 본 발명에 사용된 LDE는 포스파티딜콜린, 올레산, 콜레스테롤, 및 트리올레인을 포함한다. 다른 리포좀 유사 전달체를 또한 사용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물로 사용되는 나노전달체는 PAMAM와 같은 덴드리머로 형성된다. 하기 표는 세대 함수로 PAMAM 덴드리머의 크기를 나타낸다. 덴드리머의 예들은 예를 들어, WO 2010/006392에 기술되어 있다.
Figure pat00002
또 다른 구현예에서, 상기 나노전달체/마이크로전달체는 리포좀(바이러스성 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포에 표적된 리포좀을 포함)이다. 본 발명의 화합물을 위한 리포좀 제제는 적어도 하나 이상의 폴리머, 오일, 적어도 하나 이상의 계면활성제 및 용매를 포함한다. 당업자는 적합한 폴리머(들), 오일(들), 계면활성제(들) 및/또는 용매(들)가 리포좀 제제에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 리포좀 제제는 당분야의 기술 내에서 결정한다. 리포좀 제제에 대한 예시적인 폴리머는 예를 들면, 폴리카프로락톤, PHB - 폴리하이드록시부티레이트, PMMA-폴리(메틸 메타크릴레이트), 키토산 및 β-사이클로덱스트린을 포함한다. 오일 상에 사용되는 예시적인 오일은 예를 들면, 이소데실 올레에이트, 미네랄 오일 및 EMU 오일을 포함한다. 예시적인 계면활성제는 예를 들면, 소르비탄 모노스테아레이트, 레시틴(콩 레시틴과 같은) 및 폴리소르베이트 80을 포함한다. 레시틴은 천연 및/또는 합성 레시틴 및/또는 이의 혼합물일 수 있다. 리포좀 제제에 사용되는 용매는 아세톤, 에탄올 및 초순수를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 리포좀의 비제한적인 예로는 콩 또는 계란 포스파티딜콜린(레시틴)으로 형성된 리포좀이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,522,811호에서 설명한 바와 같이, 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 그러므로, 정확한 리포좀 제제의 선택은 치료 중인 암에 의해 영향을 받을 것이다. 특정 리포좀 제제는 다른 암보다 몇몇 암에 더 잘 작용할 것이다.
하나의 구현예에서, 상기 나노전달체의 크기는 1 nm 내지 1000 nm, 예를 들어, 900-lOOO nm, 1-900 nm, 1-800 nm, 1-700 nm, 1-600 nm, 1-500 nm, 1-400 nm, 1-300 nm, 1-200 nm, 1-150 nm, 1-lOO nm, 1-90 nm, 1-80 nm, 1-70 nm, 1-60 nm, 1-50 nm, 1-40 nm, 1-30 nm, 1-20 nm, 1-lO nm, 1-5 nm, 2-300 nm, 20-200 nm, 50-150 nm, 또는 3.5-11 nm의 범위를 가진다.
하나의 구현예에서, 상기 마이크로전달체의 크기는 2 ㎛ 내지 50 ㎛, 예를 들어, 2-5 ㎛, 2-10 ㎛, 2-15 ㎛, 2-20 ㎛, 2-25 ㎛, 2-30 ㎛, 2-40 ㎛, 2-50 ㎛, 5-20 ㎛, 5-10 ㎛, 또는 7.5-10 ㎛의 범위를 가진다.
하나의 구현예에서, 상기 약제학적 조성물에서 자스모네이트 화합물은 자스몬산, 7-이소-자스몬산, 9,10-다이하이드로자스몬산, 9,10-다이하이드로-이소자스몬산, 2,3-다이디하이드로자스몬산, 3,4-다이디하이드로자스몬산, 3,7-다이디하이드로자스몬산, 4,5-다이디하이드로자스몬산, 4,5-다이디하이드로-7-이소자스몬산, 쿠쿠르브산(cucurbic acid), 6-에피-쿠쿠르브산, 6-에피-쿠쿠르브산-락톤, 12-하이드록시-자스몬산, 12-하이드록시-자스몬산-락톤, 11-하이드록시-자스몬산, 8-하이드록시-자스몬산, 호모-자스몬산, 다이호모-자스몬산, 11-하이드록시-다이호모-자스몬산, 8-하이드록시-다이호모-자스몬산, 투베론산, 투베론산-O-β-글루코피라노사이드, 쿠쿠르브산-O-β-글루코피라노사이드, 5,6-다이디하이드로-자스몬산, 6,7-다이디하이드로-자스몬산, 7,8-다이디하이드로-자스몬산, 시스-자스몬, 다이하이드로자스몬 및 이의 저급 알킬 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 메틸 다이하이드로자스모네이트를 포함한다. 본 발명에 적합한 자스모네이트 화합물의 다른 예는 예를 들어, WO 02/080890 및 Gfeller et al. Sci. Signal. 2010, Vol. 3, Issue 109, pp. cm3에서 찾을 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 1 nM 내지 100 mM, 예를 들어, 1 nM 내지 99 mM, 1 nM 내지 90 mM, 1 nM 내지 80 mM, 1 nM 내지 70 mM, 1 nM 내지 60 mM, 1 nM 내지 50 mM, 1 nM 내지 40 mM, 1 nM 내지 30 mM, 1 nM 내지 20 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 nM 내지 5 mM, 1 nM 내지 1 mM, 1 nM 내지 900 μM, 1 nM 내지 800 μM, 1 nM 내지 700 μM, 1 nM 내지 600 μM, 1 nM 내지 500 μM, 1 nM 내지 400 μM, 1 nM 내지 300 μM, 1 nM 내지 200 μM, 1 nM 내지 100 μM, 1 nM 내지 90 μM, 1 nM 내지 80 μM, 1 nM 내지 70 μM, 1 nM 내지 60 μM, 1 nM 내지 50 μM, 1 nM 내지 40 μM, 1 nM 내지 30 μM, 1 nM 내지 20 μM, 1 nM 내지 10 μM, 1 nM 내지 5 μM, 1 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 900 nM, 1 nM 내지 800 nM, 1 nM 내지 700 nM, 1 nM 내지 600 nM, 1 nM to 500 nM, 1 nM 내지 400 nM, 1 nM 내지 300 nM, 1 nM 내지 200 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 nM 내지 90 nM, 1 nM 내지 80 nM, 1 nM 내지 70 nM, 1 nM 내지 60 nM, 1 nM 내지 50 nM, 1 nM 내지 40 nM, 1 nM 내지 30 nM, 1 nM 내지 20 nM, 1 nM 내지 10 nM, 1 nM 내지 5 nM, 1 nM 내지 1 mM, 100 nM 내지 1 mM, 100 nM 내지 100 mM, 1-100 mM, 10-50 mM, 20-30 mM, 100 mM 내지 10 mM, 100 mM 내지 100 mM, 1-100 mM, 1-100 nM, 및 59-64 nM 범위의 자스모네이트 화합물(예를 들어, MDJ) 농도를 가진다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 100 mM 내지 1M, 예를 들어, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 내지 1M, 100 mM 내지 1M, 200 mM 내지 750 mM, 또는 약 0.8-1 M 범위의 자스모네이트 화합물(예를 들어, MDJ) 농도를 가진다.
하나의 구현예에서, 상기 조성물이 백혈병 치료에 사용되는 경우, 자스모네이트 화합물(예를 들어, MDJ) 농도는 100 μM 내지 5 mM, 100 μM 내지 4 mM, 100 μM 내지 3 mM, 100 μM 내지 2 mM, 100 μM 내지 1 mM, 100 μM 내지 0.5 mM, 0.01 mM 내지 약 2 mM, 또는 약 1 mM, 10 μM 내지 5 mM, 10 μM 내지 4 mM, 10 μM 내지 3 mM, 또는 10 μM 내지 2 mM의 범위를 가진다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물이 고형암 치료에 사용되는 경우, 자스모네이트 화합물(예를 들어, MDJ) 농도는 1 nM 내지 1M(예를 들어, 1 nM 내지 0.5 M, 1 nM 내지 0.1 M, 1 nM 내지 50 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 nM 내지 5 mM, 10 nM 내지 1 M, 또는 1 nM 내지 약 1 mM, 또는 1 μM 내지 1 M, 또는 1-1000 nM, 1-500 nM, 1- 250 nM, 약 1-100 nM, 1-50 nM, 1-10 nM, 또는 1-5 nM)의 범위를 가진다.
상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 자스모네이트 화합물 외에 추가로 비-자스모네이트 분자 또는 이온을 포함할 수 있다. 예를 들면, 2-아미노에틸 다이하이드로젠 포스페이트(또는 포스포에탄올아민), 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알(또는 시트랄), 메틸 살릭실레이트 또는 아브시스산, 천연 아미노산류, Ca2+, Zn2+, 또는 이의 유도체 또는 유사체이다. 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알은 시스- 또는 트랜스이소머일 수 있다. 이러한 비-자스모네이트 분자 또는 이온은 자스모네이트 화합물 또는 나노/마이크로전달체와 연결 또는 결합될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 비-자스모네이트 화합물은 자스모네이트 화합물과 동일한 나노/마이크로전달체에 포함될 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 비-자스모네이트 화합물은 자스모네이트 화합물과는 다른 나노/마이크로전달체에 포함되고, 이 두 전달체는 동시에 투여될 수 있다. 상기 연결 또는 결합은 화학 결합(예를 들어, 공유 결합), 수소 결합, 반데르발스 힘, 쿨롱 상호 작용 등을 통해 만들어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 비-자스모네이트 화합물은 나노전달체/마이크로전달체로 캡슐화된다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 부분적으로 나노전달체/마이크로전달체 내로 캡슐화되거나 나노전달체/마이크로전달체의 표면(예를 들어, 나노전달체/마이크로전달체 표면의 일부 또는 상기 표면에 접한 바깥면)에 캡슐화된다.
하나의 구현예에서, 상기 나노전달 또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물(예를 들어, MJ 또는 MDJ)은 합성적으로 개질, 예를 들어, 시트랄 및/또는 포스포릴에탄올아민 분자와 공유 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 반응은 자스모네이트 화합물의 임의의 카르보닐기, 예를 들어, 자스모네이트 화합물(예를 들어, MJ 또는 MDJ)의 사이클로펜틸 링 상의 케톤(E1) 또는 자스모네이트 화합물의 에스터(E2)의 카르보닐기와 수행될 수 있다. 자스모네이트의 케톤(또는 에스터 기)과 포스포릴에탄올아민의 아민기(R1) 간의 반응은 이민 또는 반아미날(또는 아미드)의 형성을 초래할 수 있다. 자스모네이트와 시트랄 간의 반응 수율은 환원된 시트랄 화합물("R2")를 형성하는 시트랄의 알데히드기를 우선 환원시킴으로써 또는 R3을 형성하는 이중 결합을 수화(C-6)함으로써 개선될 수 있다. 이러한 예비 단계에서 케탈 또는 에스터를 형성하는 자스모네이트 화합물의 케톤(El)과 반응하거나 새로운 에스터를 형성하는 자스모네이트 화합물의 에스터(E2)기와 반응할 수 있는 하이드록실기를 R2 또는 R3 내에 생성한다.
이 화합물들, 즉, 자스모네이트(예를 들어, MJ 또는 MDJ), 포스포릴에탄올아민 Rl, 시트랄, R2, 및 R3 간의 반응은 다음의 생성물을 만들 수 있다. 상기 생성물은 R1-(E1)MJ(E2)-R2; R2-(E1)MJ(E2)-R1; R1-(E1)MJ(E2)-R3; R3-(E1)MJ(E2)-R1; R2-(E1)MJ(E2)-R3; R3-(E1)MJ(E2)-R2와 같은 혼합물뿐만 아니라 R1-(E1)MJ; R1-(E2)MJ; R1-(E1)MJ(E2)- Rl; R2-(E1)MJ; R2-(E2)MJ; R2-(E1)MJ(E2)-R2; R3-(E1)MJ; R3-(E2)MJ; R3-(E1)MJ(E2)-R3을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 메틸 자스모네이트의 15개 유도체 분자는 상술한 방법에 의해 합성되었다.
"약제학적 조성물"은 대상체에 투여하기에 적합한 형태로, 본 발명의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물을 포함하는 제제이다. 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 벌크 또는 단위 투여 형태이다. 단위 투여 형태는 예를 들어, 캡슐, IV 백, 정제, 에어로졸 흡입기에 단일 펌프 또는 바이알을 포함하는 임의의 다양한 형태이다. 조성물의 단위 투여량에서 활성 성분의 양(예를 들어, 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 이성질체의 제제)은 유효량이고 관련된 특정 치료에 따라 변화된다. 당업자는 환자의 연령 및 상태에 따라 투여량을 변화시킬 필요가 종종 있음을 인식할 것이다. 투여량은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 경구, 폐, 직장, 비경구, 경피, 피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 흡입, 구강, 설하, 흉막 내, 경막 내, 비강 내 등을 포함하는 다양한 경로로 고려된다. 본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여용 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물은 약제학적으로 허용되는 전달체(예를 들어, 나노전달체/마이크로전달체)를 멸균 조건 하에서 혼합하고, 필요한 보존제, 완충제 또는 압축가스와 혼합된다.
여기에 사용된 어구 "약제학적으로 허용가능한"은 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/리스크 비율에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 담체 및/또는 투여 형태를 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체 또는 용매"는 생물학적으로나 그렇지 않거나 일반적으로 안전하고, 비독성인 약제학적 조성물을 제조하기에 유용한 부형제, 담체, 용매를 의미하고, 인간 약제학적 용도뿐만 아니라 수의학적 용도에 허용가능한 부형제를 포함한다. 여기에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 하나 이상의 이러한 부형제 모두를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 호환되도록 제형화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들어, 정맥 내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 및 점막 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음과 같은 구성 요소를 포함할 수 있다:주사용 물과 같은 멸균 희석액, 식염수 용액, 불휘발유, 폴리에틸렌 글리콜류, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매들; 벤질 알콜 또는 페닐 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 소디움 바이설파이트와 같은 산화방지제, 에틸렌다이아민테트라아세트산과 같은 킬레이팅제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액, 및 소디움 클로라이드 또는 덱스트로오스와 같은 장력(tonicity) 조절제. pH는 염산 또는 수산화 나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구용 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 여러 용량의 유리 병에 담을 수 있다.
여기에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 확인된 질환 또는 증상을 치료, 개선, 또는 예방하거나, 검출가능한 치료 또는 억제 효과를 나타내도록 하는 약제의 양을 의미한다. 상기 효과는 당업계에 공지된 임의의 분석 방법에 의해 검출될 수 있다. 대상체에 대한 정확한 유효량은 대상체의 체중, 사이즈, 건강; 증상의 본질 및 정도; 및 투여를 위해 선택된 치료법 또는 치료법의 조합에 따라 달라질 것이다. 주어진 상황에 대한 치료학적 유효량은 임상의의 능력과 판단 내에 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 양태에서, 치료되는 질환 또는 증상은 바이러스성 감염이다.
임의의 화합물(예를 들어, 여기에 개시된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물)의 경우, 치료학적 유효량은 세포(예를 들어, 종양 세포) 배양 분석법, 또는 동물 모델, 보통 흰쥐, 마우스, 토끼, 개, 또는 돼지에서 초기에 측정될 수 있다. 상기 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 게다가, 이러한 정보는 인간에 투여하기에 유용한 복용량 및 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 치료/예방 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차, 예를 들어, ED50(대상체 50%에서 치료학적 유효량) 및 LD50(대상체 50%에서 치사량)에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 투여 비율은 치료 지수이며, LD50/ED50 비로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약제학적 조성물이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여 형태, 환자의 민감도 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변경될 수 있다.
투여량 및 투여는 활성제(들)의 충분한 수준을 제공하도록 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 인자로는 질병 상태의 심각성, 대상체의 일반 건강, 연령, 체중, 대상체의 성별, 다이어트, 시간 및 투여 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도, 및 치료에 대한 내성/반응을 포함한다. 지속형 약제학적 조성물은 특정 제제의 반감기 및 제거율에 따라 3 ~ 4일마다, 매주, 또는 2주에 한 번씩 투여할 수 있다.
본 발명의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 알려진, 예를 들어, 통상적인 혼합(mixing), 용해(dissolving), 과립화(granulating), 당제-결정(dragee-making), 가루화(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포괄(entrapping), 또는 동결 건조(lyophilizing) 과정에 의한 방식으로 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 부형제 및/또는 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물의 처리를 가능하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 물론, 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의존한다.
주사가능한 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥 내 투여의 경우, 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어 EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 포함한다. 모든 경우에, 상기 조성물은 멸균되어야 하며, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장의 조건 하에서 안정해야 하고, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 상기 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 활동의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들면, 당; a만니톨, 소르비톨, 소디움 클로라이드와 같은 폴리알코올;을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제물, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴으로써 이룰 수 있다.
멸균 주사 용액은 상기에서 열거된 성분 하나 또는 조합으로 적절한 용매에 필요량으로 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물을 도입시켜 제조할 수 있고, 필요한 경우 여과 멸균할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산 매체 및 상기에서 열거된 것에서 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클에 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조방법은 이전에 이의 멸균 여과된 용액으로부터 추가의 원하는 성분과 함께 활성 성분 분말을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 동봉 또는 정제로 압축할 수 있다. 경구 치료 투여 목적으로, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물은 부형제와 함께 포함되고 정제, 트로키제, 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 청결제용 유체 전달체를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 유체 전달체의 화합물은 경구에 적용하여, 스위시하고, 뱉거나 삼키도록 한다. 약제학적으로 허용가능한 결합제, 및/또는 보조제 물질은 상기 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키제 등은 임의의 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결정 셀룰로오스, 트라가칸스 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 스테아린산 마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드 이산화규소와 같은 활택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 향미제.
흡입 투여를 위해, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물은 적합한 압축가스, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 가스, 또는 네블라이저를 포함하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 경점막 또는 경피 방법으로 할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 예를 들면, 경점막 투여용, 세척제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물의 약제학적 조성물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 서방성 제제와 같이, 신체로부터 급속한 제거에 대해 화합물을 보호할 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드 라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산 등을 사용할 수 있다. 이러한 제제의 제조방법은 당업자에게 명백할 것이다. 재료도 알자 사 및 노바 제약회사에서 상업적으로 얻을 수 있다
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 경구 또는 비경 구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 여기에 사용된 투여 단위 형태는 치료 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 별개 단위를 의미한다; 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 얻도록 계산된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물의 예정된 양을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 설명서는 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 활성 화합물의 고유 특성 및 달성될 특정 치료 효과에 직접적으로 의존하고 지시된다.
상기 약제학적 조성물은 투여에 대한 지침과 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용된 자스모네이트 화합물은 이들의 염을 포함한다. 또한, 이들 형태 모두 발명의 청구 범위 내에서 고려된다.
여기에 사용된 "약제학적 허용가능한 염"은 모 화합물은 이의 산 또는 염기 염으로 개질된 본 발명의 화합물의 유도체를 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예로는 아민, 알칼리 등과 같은 염기성 잔기의 무기 또는 유기염 또는 카르복실산 등과 같은 산성 잔기의 유기염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은 종래의 비독성 염, 또는 예를 들면, 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 제4급 암모늄염을 포함한다. 예를 들면, 종래의 비독성 염은 2-아세톡시벤조산, 2-히드록시에탄 술폰산, 아세트산, 아스코르브산, 벤젠 술폰산, 벤조산, 바이카본산, 카본산, 시트르산, 에데트산 에탄 디술폰산, 1,2-에탄 술폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글루콜산, 글리콜리아르사닐산, 헥실레소르킨산, 하이드라밤산, 하이드로브롬산, 하이드로클로르산, 하이드로아이오드산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프톨산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우릴 술폰산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 술폰산, 나프실산, 니트르산, 옥살산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 포스포르산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리사이클산, 스테아르산, 수바세트산, 숙신산, 술팜산, 술파닐산, 술푸르산, 탄닌산, 타르타르산, 톨루엔 술폰산, 및 흔히 발생하는 아민산, 예를 들어 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 아르기닌 등으로부터 선택된 무기 및 유기산으로부터 유도된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용가능한 염의 다른 예로는 헥사노익산, 사이클로펜탄 프로피온산, 피루브산, 말론산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸바이사이클로-[2.2.2]-옥트-2-엔-l-카르복실산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3차 부틸아세트산, 무콘산 등을 포함한다. 또한, 본 발명은 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 알루미늄 이온에 의해 대체되거나; 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민, 디에틸아민, 디에틸아미노에탄올, 에틸렌디아민, 이미다졸, 리신, 아르기닌, 모르폴린, 2-하이드록시에틸모르폴린, 디벤질에틸렌디아민, 트리메틸아민, 피페리딘, 피롤리딘, 벤질아민, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 등과 같은 유기염기와 조정될 때 형성되는 염을 포함한다.
약제학적으로 허용가능한 염에 대한 모든 참조는 여기에 정의된 바와 같이, 동일한 염의 용매 부가 형태(용매화물) 또는 결정 형태(다형체)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 사용된 자스모네이트 화합물은 에스터, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 에스터로 제조할 수 있다. 예를 들면, 화합물의 카르복실산 기능기는 이에 상응하는 에스터, 예를 들어, 메틸, 에틸 또는 다른 에스터로 전환될 수 있다. 또한, 화합물의 알콜기는 이에 상응하는 에스터, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트 또는 다른 에스터로 전환될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용된 자스모네이트 화합물은, 또한 전구 약물, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 전구 약물로 제조될 수 있다. 용어 "프로-드럭" 및 "전구 약물"은 여기에 혼용되고, 생체 내에서 활성 모 약물을 방출하는 임의의 화합물을 의미한다. 전구 약물은 의약품의 수많은 바람직한 특성(예, 용해도, 생체 이용률, 제조 등)을 개선하도록 알려져 있으므로, 본 발명의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물은 전구 약물 형태로 전달될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 현재 청구된 화합물의 전구 약물, 이를 전달하는 방법 및 이를 함유하는 조성물을 포함하려는 것이다. "전구 약물"은 전구 약물이 대상체에 투여될 때 생체 내에서 본 발명의 활성 모 약물을 방출하는 임의의 공유결합된 담체를 포함하려는 것이다. 본 발명의 전구 약물은 일반적인 조작 또는 생체 내에서, 개질이 분해되는 방식으로 화합물에 존재하는 관능기를 개질함으로써 모 화합물로 제조된다. 전구 약물은 본 발명의 화합물을 포함하며, 히드록시, 아미노, 술프하이드릴, 카르복시 또는 카보닐기에 유리 하이드록실, 유리 아미노, 유리 술프하이드릴, 유리 카르복시 또는 유리 카보닐기 각각을 형성하기 위해 생체 내에서 분해될 수 있는 임의의 기와 결합된다.
전구 약물의 예로는 본 발명의 화합물에서, 하이드록시 기능기의 에스터(예, 아세테이트, 디알킬아미노아세테이트, 포르메이트, 포스페이트, 술페이트 및 벤조에이드 유도체)와 카바메이트(예, N,N-디메틸아미노카보닐), 카르복실 기능기의 에스터(예, 에틸 에스터, 모르폴리노에탄올 에스터), 아민 기능기의 N-아실 유도체(예, N-아세틸) N-마니쉬 염기, 시프 염기 및 엔아미논(enaminones), 케톤의 옥심, 아세탈, 케탈 및 엔올 에스터 및 알데하이드 기능기 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Bundegaard, H., Design of Prodrugs, pl-92, Elesevier, New York-Oxford (1985)를 참조하시오.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 사용된 자스모네이트 화합물은 이들의 대사물질(산 및/또는 염기 촉매로부터 얻은 대사물질, 예를 들어, 시스-자스몬산, 트랜스-자스몬산, 하이드록시메틸 시스-자스모네이트, 하이드록시메틸 트랜스-자스모네이트, 에스터 교환반응으로 얻은 락톤 등; 산화반응으로 얻은 대사물질, 예를 들어, 케토메틸 시스-자스모네이트, 케토-메틸 트랜스-자스모네이트, 하이드록시메틸 시스-자스모네이트, 하이드록시메틸 트랜스자스모네이트, 산화반응으로 얻은 디올, 산화반응으로 얻은 입체이성질체(예, 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체), 산화반응으로 얻은 에폭사이드 및 산화반응으로 얻은 락톤; 메틸 자스모네이트, 자스몬산 및 디하이드로메틸자스모네이트의 탈수 생성물; 및 수용체(예, AKR2 수용체 및 G-단백질 결합 수용체)와 함께 세포 내 과정, 예를 들어, 인산화(예, 키나제를 통해) 또는 다른 반응, 및 세포 소기관과의 상호작용을 통해 형성된 대사 물질)일 수 있다. MDJ 대사물질의 예로는 메틸 자스모네이트, 메틸 쿠쿠르베이트, 메틸 7-이소-자스모네이트, 2,3-다이디하이드로-MDJ, 3,4-다이디하이드로-MDJ, 3,7-다이디하이드로-MDJ, 4,5-다이디하이드로-MDJ, 12-하이드록시-MDJ, 11-하이드록시-MDJ, 8-하이드록시-MDJ, 메틸 투베로네이트, 12-O-글루코실-MDJ, 11-O-글루코실-MDJ, 12-O-글루코실-MJ, 11-O-글루코실-MJ, 7,8-다이디히드로-MDJ, 시스-자스몬, 다이하이드로자스몬, 메틸 살리실레이트, 및 아브시스산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
추가적으로 또는 대안적으로, 리놀레산(LA) 유래의 사이클로 펜탄온- 또는 사이클로펜텐온 기반의 화합물로부터 형성된 것과 같은 다른 자스모네이트 관련 화합물이 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, Annals of Botany 100: 681-697, 2007; and Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. 48:355-81를 참조하시오.
나노전달 및/또는 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스터, 전구 약물 또는 대사물질을 포함하는 약제학적 조성물은 경구, 비강, 경피, 폐, 흡입, 구강, 설하, 복막 내, 피하, 근육 내, 정맥 내, 직장, 늑막 내, 막 내와 비경구로 투여된다. 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 주사가능한 조성물이다. 당업자는 특정 투여 경로의 장점을 인식할 것이다.
투여 요법은 타입, 종, 연령, 체중, 성별 및 환자의 의학적 상태를 포함한 다양한 인자; 치료 상태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 특정 화합물 또는 사용된 이의 염에 따라 선택된다. 통상적으로 숙련된 의사나 수의사는 쉽게 결정하고, 상태의 진행을 예방, 대응 또는 저지하는데 필요한 약물의 유효량을 처방할 수 있다. 본 발명의 방법으로 사용될 수 있는 투여 요법은 매일, 매주 세 번(간헐적), 매주 두 번, 매주, 또는 14일 마다 투여하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 투여 요법은 매달 투여 또는 6~8주마다 투여하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 투여량은 치료 기간 동안 변경한다. 예를 들면, 저농도 범위(예를 들어, 100 μM 내지 5 mM, 100 μM 내지 4 mM, 100 μM 내지 3 mM, 100 μM 내지 2 mM, 100 μM 내지 1 mM, 0.01 mM 내지 약 2 mM, 또는 약 1 mM, 10 μM 내지 5 mM, 10 μM 내지 4 mM, 10 μM 내지 3 mM, 또는 10 μM 내지 2 mM)의 나노/마이크로-전달된 화합물이 투여되기 전, 나노/마이크로-전달체의 자스모네이트 화합물(예, MDJ)의 고농도 범위(1 mM 내지 1 M (예를 들어, 1-1000 mM, 1-900 mM, 1-800 mM, 1-700 mM, 1-600 mM, 1-500 mM, 1-400 mM, 1-300 mM, 1-200 mM, 1-100 mM, 1-50 mM, 1-40 mM, 1-30 mM, 1-20 mM, 1-10 mM, 100 mM 내지 1 M))로 처음에 3일 내지 7일 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물이 고형암 치료에 사용되는 경우, 암 치료용 자스모네이트 화합물(예를 들어, MDJ)의 농도는 1 nM 내지 1 M(예를 들어, 1 nM 내지 0.5M, 1 nM 내지 0.1M, 1 nM 내지 50 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 nM 내지 5 mM, 10 nM 내지 1M, 또는 1 nM 내지 약 1 mM, 또는 1 μM 내지 1 M, 또는 1-1000 nM, 1-500 nM, 1- 250 nM, 약 1-100 nM, 1-50 nM, 1-10 nM, 또는 1-5 nM)의 범위 내에 포함된다. 이 투약 요법은 다른 것보다 암의 특정 유형(예를 들면, 백혈병) 치료에 더 효과적일 수 있다. 대안적으로, 우선 저용량이 투여될 수 있고, 이어서 나노/마이크로전달되는 자스모네이트의 고용량이 투여될 수 있다.
본 발명의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물의 제형 및 투여 기술은 레밍턴(Remington): the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)에서 찾을 수 있다. 하나의 구현예에서, 여기에 기술된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 염, 전구 약물, 대사 물질, 또는 이의 에스터는, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 용매 또는 희석제와 함께 약제학적 제제에 사용된다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 불활성 고체 충전제 또는 희석제 및 멸균 수용액 또는 유기 용액을 포함한다. 상기 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물은 여기에 기술된 범위 내에서, 원하는 투여량을 제공하기에 충분한 양으로 약제학적 조성물에 존재할 것이다.
나노전달되거나 마이크로전달되는 자스모네이트의 합성 방법
여기에 기재된 나노전달되거나 마이크로전달되는 자스모네이트 화합물 및 그것의 조성물은 종래 기술 또는 여기에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
예를 들어, 사이클로덱스트린을 나노전달체로 사용할 때, 본 발명의 나노전달되는 화합물은 적당한 용액(예를 들어, 수용액), 바람직하게는 고온에서 사이클로덱스트린과 관심 있는 자스모네이트 화합물을 혼합하여 제조할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 형성된 나노전달체 또는 마이크로전달체는 사이클로덱스트린 1 몰당 약 1-100 몰(예를 들어, 1-90 몰, 1-80 몰, 1-60 몰, 1-50 몰, 1-40 몰, 1-30 몰, 1-20 몰, 1-10 몰, 또는 1-5 몰)의 자스모네이트 화합물을 포함한다. 보다 구체적인 설명은 예를 들어, US 2008/044364, EP392608 및 WO2007/145663에서 확인할 수 있다. 사이클로덱스트린 마이크로전달체는 사이클로덱스트린 나노전달체의 클러스터로 형성될 수 있다.
다른 예시에 관해서는, LDE(또는 리포좀)을 나노전달체 또는 마이크로전달체로 사용할 때, 본 발명의 나노전달되거나 마이크로전달되는 화합물은 실온 미만의 온도(예를 들어, 약 4℃)에서 적당한 용액(예를 들어, 수용액)에서, 미리 형성된 LDE(또는 리포좀)에서 관심 있는 자스모네이트 화합물을 인큐베이션하여 제조할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 형성된 나노전달체 또는 마이크로전달체는 LDE(또는 리포좀) 1몰당 약 1-100 몰(예를 들어, 1-90 몰, 1-80 몰, 1- 70 몰, 1-60 몰, 1-50 몰, 1-40 몰, 1-30 몰, 1-20 몰, 1-10 몰, 또는 1-5 몰)의 자스모네이트 화합물을 포함한다.
한 구체예에서, LDE 나노전달체는 다음과 같이 제조한다. 우선, 포스파티딜콜린(예를 들어, 40mg), 콜레스테릴 올리에이트(예를 들어, 20mg), 트리올레인(예를 들어, 1mg), 및 콜레스테롤(예를 들어, 0.5mg)로 구성된 지질 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 진공 건조하였다. 그리고 나서, 초음파 조사, 예를 들어, Branson 기기, 모델 450A(Ultrasound Arruda, Sao Paulo, Brazil)를 사용하여 125 와트 전력으로 3시간 동안, 질소 대기 하에서, 51-55℃의 온도 범위에서 0.01M Tris-HCl, pH 8.0에서 상기 지질의 에멀젼을 제조하였다. MDJ를 캡슐화하기 위해 고안된 직경 범위 또는 크기 범위로 LDE를 얻기 위해, 2단계의 원심분리(예를 들어, 초원심분리, Beckman rotor SW -41)에서 에멀젼을 정제하였다. 제1단계에서, 4℃에서 200,000g, 30분 동안 원심분리하여 얻은 튜브 상층 분획을 흡기(1mL)하여 제거하였다. 남아있는 현탁액에 포타슘 브로마이드(KBr)를 부가하고 1.21g/mL로 밀도로 조정하였다. 2차 원심분리 후(200,000×g, 2시간, 4℃), 흡기를 통해 튜브의 꼭대기에서 LDE를 회수할 수 있다. 과량의 KBr은 1000배 부피의 0.01M Tris HC1, pH 8를 2회 교환한 투석을 통해 제거한다. 마지막으로, 층류(laminar flow)에서 0.22mm의 기공도를 갖는 밀리포어 멤브레인(Millipore membrane) 여과에 의해 에멀젼을 살균하고, 30일까지 4℃에서 보관하였다. 현탁액에서 LDE 입자의 크기는 광 산란 및 현미경 측정에 의해 측정할 수 있다. 현탁액 내 LDE 입자의 표면 전위는 제타 전위 분석기 ZetaPALS 기기(Brookhaven Instruments Corporation)(Lima & Maranhao, 2004)에서 측정할 수 있다.
한 구체예에서, 자스모네이트 화합물(예를 들어, MDJ)를 LDE 담체에 결합시키는 것은 다음과 같이 수행된다. 50mL의 MDJ의 에탄올 용액을 500mL의 LDE 에멀젼(상기 제조된 것과 같이)에 부가하여 3mg/mL의 MDJ 농도를 갖는 혼합물을 만들었다. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고 나서, 4℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션된 혼합물을 200mL의 멸균 버퍼(예를 들어, Tris-HCl, 0.01M)로 2회 투석하였다. 투석된 에멀젼은 LDE 담체 내에 캡슐화되거나 결합된 MDJ의 함량을 측정하기 위해 GC-MS를 사용하여 분석할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 나노에멀젼은 자스모네이트 화합물에 더하여, 고분자, 예컨대 평균 분자량(Mw)인 65,000인 고분자 폴리(ε-카프로락톤) 또는 PCL, 시트랄, 포스포릴에탄올아민, 소르비탄 모노스테아레이트(Span®60) 및 폴리솔베이트 80(Tween®80)에서 선택된 하나 이상의 성분으로 형성된다. 상기 에멀젼은 Fessi 등의 Drug Des Deliv 4(4): 295-302 (1989)에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다. 간단히 말해서, 오일/물(O/W) 에멀젼은 오일(예를 들어, 10.0g) 및 활성 화합물(예를 들어, MDJ) 단독 또는 물(예를 들어, 400mL)에서 0.05-0.50g 범위(담체 내 함유된 내부 성분들)의 혼합물에서 Ultra-Turrax homogenizer(IKA T10 basic Ultra-turrax®, Ika-Werke, Staufen, Germany)를 사용하여, 예를 들어, 15,000rpm, 예를 들어, 1분 동안 격렬히 교반하여 만든다. 그리고 나서, 예를 들어, 아세톤(400mL)에서 고분자(예를 들어, PCL, 0.2-2.0g)를 용해시켜 제조한 유기 용액을 적당한 자석 교반 하에서 연동 펌프를 사용하여 10%에서(PumpPro TPM 600 55RPM, Waton-Marlow, Wilmington, UK) O/W 에멀젼에 부었다. 10분 동안 교반한 후, 예를 들어, 물(200mL)에 1.0g의 Tween®80을 녹여 제조한 수용액을 또한 적당한 자석 교반 하에서 에멀젼에 부었다. 다시, 연동펌프를, 예를 들어 10%에서 사용하였다. 부가하는 것을 완료한 후, 반응 혼합물을 추가로 예를 들어, 10분 동안 교반할 수 있다. 마지막 단계에서, 유기 용매를 제거하고, 감압(예를 들어, R-21, Btichi, Switzerland 같은 회전증발농축기를 이용하여) 하에서 나노에멀젼의 부피를 예컨대 500mL로 농축하였다. 두 번째 단계, 즉, 에멀젼에 고분자 용액을 부가하는 것은 선택적이다.
나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물을 특성 규명하는 방법들은 반-경험적 접근을 이용하여 PERCHEM 소프트웨어에 적용된 이론적 정량적 구조 분석 관계(Qualitative Structure Analyses Relationship, QSAR)를 포함한다. 이러한 측면에서, QSAR는 자스몬산 또는 메틸 디하이드로자스모네이트 및 천연 사이클로덱스트린(CD)으로 형성된 나노전달되는 화합물의 안정성을 평가하기 위해 사용된다. 한 구체예에서, 계산은 0.1kcal의 rms(angstron.mol)-1로 Polak-Rabiere conjugued gradient를 이용한 AMI 반-경험적 방법으로 수행된다.
질적으로, ΔΗ(=Ebinding)의 측정은 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물(즉, 나노/마이크로전달체 및 자스모네이트 화합물 간의 조합 또는 결합)의 형성이 일어날 때 상기 시스템의 총 에너지의 최소를 반영한다.
그러므로, Ebinding으로 표시되는 반응 안정성은 형성된 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 화합물의 에너지와 나노/미세-전달체와 화합물의 에너지 간의 차이로부터 평가될 수 있다.
아래의 표 1은 자스몬산 또는 메틸 디하이드로자스모네이트 및 천연 CD 간의 조합에 대한 Ebinding 계산 결과를 보여준다.
[표 1]
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표 1에서 입증된 바와 같이, α-CD 및 메틸 디하이드로자스모네이트 간의 복합체를 제외하고, 모든 다른 나노전달되는 화합물은 안정하다. 또한, 자스모네이트 화합물 및 β-CD 간의 조합은 가장 안정한 나노전달되는 화합물을 생성한다.
치료 방법
본 발명은 장애, 비정상적인 혈관신생(angiogenesisi) (또는, "혈관신생-관련 장애")에 의해 영향을 받는 과정의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에 치료적으로 유효한 함량의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 전구 약물, 대사체, 용매화물, 또는 입체이성질체를 투여하는 것을 포함한다.
여기에서 사용된, "필요로 하는 대상체"는 비정상적인 혈관신생이 부분적으로 일어나는 장애를 가진 대상체, 또는 대체로 집단에 관련된 그러한 장애가 발달한 위험이 증가한 대상체이다. 필요로 하는 대상체는 전암성 조건을 가질 수 있다. 바람직하게는, 필요로 하는 대상체는 암을 가지고 있다. "대상체"는 포유동물을 포함한다. 포유동물은 예를 들어, 임의의 포유동물, 예컨대, 사람, 영장류, 조류, 마우스, 흰쥐, 가금류, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 낙타, 양, 또는 돼지일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 사람이다.
혈관신생-관련 장애의 한 예시는 암이다. 여기에 사용된, 용어 "암"은 혈액 종양 및/또는 악성 종양뿐만 아니라 고형암을 포함한다. 예시적인 암으로, 이에 제한하는 것은 아니나, 부신피질암종, AIDS-관련 암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 항문직장암, 항문관암, 맹장암, 소아 소뇌 성상세포종, 소아 대뇌 성상세포종, 기저세포 암종, 피부암(비-흑색종), 담도암, 간외담관암, 간내담관암, 방광암, 요로방광암(uringary bladder cancer), 골관절암, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종, 뇌암, 뇌종양, 뇌간부 신경교종, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막상부 원시 신경외배엽 종양, 시각로 시상하부교종, 유방암, 기관지 선종/유암종, 직장유암종, 위, 신경계 암, 신경계 림프종, 중추신경계 암, 중추신경계 림프종, 자궁경부암, 소아암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수성증식 장애, 대장암, 결장 직장암, 피부 T-세포 림프종, 림프 신생물, 균상식육종, Seziary 증후군, 자궁내막암, 식도암, 두개강외 생식세포종양, 고환외 생식세포종양, 원위부 담도암, 안암, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 담낭 및 담관암, 위암, 위장관 유암종, 위장관 간질 종양(GIST), 생식세포종양, 난소 생식세포종양, 임신성 융모 종양 신경교종, 두경부암, 간암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 안구암, 도세포 종양(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 신세포암, 신장암, 후두암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 입술 및 구강암, 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 소세포성 폐암, AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, Waldenstram 매크로글로불린혈증, 수질아세포종, 흑색종, 안구내(눈) 흑색종, 메켈세포암종, 악성 중피종, 중피종, 전이성 편평상피 경부암, 구강암, 혀의 암, 다발성 내분비선종증 증후군, 균상식육종, 골수이형성증후군, 골수형성이상/골수증식질환, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 만성골수성증식장애, 비인두암, 신경아세포종, 구강암(oral cancer), 구강암(oral cavity cancer), 구인두암, 난소암, 난소상피암, 난소 경계성 종양, 췌장암, 섬세포 췌장암, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 송과모세포종 및 천막상부 원시신경외배엽종, 뇌하수체 종양, 형질세포종양/ 다발성 골수종, 흉막폐아세포종, 전립선암(다발성 약물 내성 전립선암을 포함하여, 전립성 암종 또는 전립선 선암), 직장암, 신우뇨관, 이행세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종 종양의 유잉 패밀리, 카포시 육종, 연부조직 육종, 자궁암, 자궁 육종, 피부암(비-흑색종), 피부암(흑색종), 메켈 세포 피부 암종, 소장암, 연부조직 육종, 편평상피세포암종, 위암, 천막상부 원시신경외배엽종, 고환암, 식도암, 흉선종, 흉선종 및 흉선암종, 갑상선암, 신우와 요관 및 다른 비뇨기관의 이행세포암, 임신성 융모성 종양, 요도암, 자궁내막 자궁암, 자궁육종, 자궁체부암, 질암, 외음부암 및 윌름즈종양을 포함한다.
혈관신생-관련 장애의 다른 예시로, 안구내 장애(예를 들어, 노화-관련 황반변성 또는 안구 후부의 혈관신생-관련 장애), 심혈관 질환(예를 들어, 죽상경화증), 만성 염증(예를 들어, 류마티스 관절염 또는 크론병), 당뇨병(예를 들어, 당뇨망막병증), 건선, 자궁내막증 및 비만을 포함한다. 예를 들어, Pharmacological Reviews 52: 237 268, 2001를 참조할 것.
본 발명은 NF-κB-관련 장애, 예컨대, 바이러스, 세균 또는 곰팡이 감염의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적으로 유효한 함량의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 전구 약물, 대사체, 용매화물 또는 입체이성질체를 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
여기에 사용된, "치료하는" 또는 "치료"는 질환, 상태, 장애와 싸울 목적으로 환자를 관리 및 보호하는 것을 말하며, 본 발명의 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 전구 약물, 대사체, 용매화물을 증상 또는 질환, 상태 또는 장애의 합병증을 완화하거나, 질환, 상태 또는 장애를 제거하기 위해 투여하는 것을 포함한다.
또한, 나노전달 및/또는 마이크로전달되는 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 전구 약물, 대사체, 또는 용매화물은 질환, 상태 또는 장애를 예방하는데 이용될 수 있다. 여기에 사용된, "예방하는" 또는 "예방하다"는 질환, 상태 또는 장애의 증상 또는 합병증의 개시를 감소하거나 없애는 것을 말한다.
여기에서 사용된, 용어 "완화하다"는 질환의 징후 또는 증상의 심각성이 감소하는 과정을 말하는 것을 의미한다. 중요하게는, 징후 또는 증상은 제거되지 않고 완화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여는 징후 또는 증상의 제거를 초래하나, 제거가 필요한 것은 아니다. 유효한 투여량은 징후 또는 증상의 심각성을 감소할 것으로 예상된다. 예를 들어, 여러 위치에서 일어날 수 있는 암 같은 장애의 징후 또는 증상은 만약 암의 심각성이 여러 위치 중 적어도 하나에서 감소한다면 완화된다.
여기에서 언급된 모든 특허들, 특허 출원들, 및 특허 공개들은 그들의 전체를 참조하여 여기에서 포함되어 있다. 그러나, 명시적 정의를 포함하는 특허들, 특허 출원들, 또는 특허 공개들이 참조로 포함되어 있는 곳에서, 그 명시적 정의들은 그들이 발견되는 상기 포함된 특허, 특허 출원, 또는 특허 공개에는 적용되나 본 출원의 텍스트의 나머지, 특히 본 출원의 청구항들에는 발견되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 그것의 바람직한 특정 구체예들이 함께 기술되는 한편, 다음의 실시예뿐만 아니라 앞서 말한 설명을 예시하고자 하나 본 발명의 범위로 한정하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위에서 출발하지 않고서도 다양한 변화가 만들어질 것이고, 등가물이 치환될 수 있고 추가로 다른 양상들, 장점들 및 변형들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자들에게는 명백할 것으로 당업자에게 이해될 것이다.
여기에서 사용된 모든 퍼센트 및 비율은 달리 지적하지 않는다면, 중량에 의한 것이다. 본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 다른 실시예들로부터 명백하다. 제공된 실시예들은 본 발명을 실행하는데 유용한 다른 성분들과 방법들을 보여준다. 상기 실시예들은 청구된 발명으로 한정하지는 않는다. 본 명세서를 기반으로, 숙련가는 본 발명을 실행하는데 유용한 다른 성분들과 방법들을 동정하고 사용할 수 있다.
용어, "A-14" 및 "A14"는 도면에서 측정에 사용된 MDJ-나노전달체 복합체를 나타내기 위해 교환 가능하게 사용된다.
도 1: (A) LDE에서 MDJ의 크로마토그램; (B) LDE-전달된 MDJ(한 구체예, 리포좀-전달된 MDJ)의 주사 전자 현미경 이미지; (C) LDE-전달된 MDJ 및 아미노산의 주사 전자 현미경 이미지.
도 2: 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ(cyclodextrin-carried MDJ)(i.p.) 처리된 마우스 대장 종양에서 강력하고 균일하게 분포된 카스파제-3 발현.
도 3: MDJ-처리된(i.r.) 마우스에서 대장 암종의 상피에 피상적으로 제한되어 있는 이종 카스파제-3 발현.
도 4A-4O: (A) 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 마우스(GT) 및 대조군(GC)에서 종양 부피의 변화에 대한 도식도. 주목할 것은 처리된 동물 모두 종양 부피에서 현저한 감소를 나타냈다(B 및 C). 실험 말기에 대표적인 종양들의 거시적 관점. 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 동물 유래의 종양들은(B) 대조군 종양들(C)과 비교하여 좀 더 작았고, 창백하고 단단한 외부 층과 더 부드러운 핵을 나타냈다. 조직병리학에서 대조군(D)에서 보다 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 동물 유래의 종양들에서 훨씬 더 큰 괴사(N) 지역이 나타난다(E). 주목할 것은 괴사 지점들이 과염색성 신생 슈도팰리세이드(hyper chromatic neoplastic pseudopalisades), 이른바 "포이-괴사 지역(poi-necrotic areas)"(PN)의 집결 부분에 의해 둘러싸여 있다는 것이다. 대조군 종양세포들은 소혈관들(검은색 화살표)이 가까이 동반된 세포들의 망상구조의 척수(networking cords)(뚜렷한 경계선)로 조직된다(F 및 H). 도 4G에 나타난 바와 같이, 이 공간 조직은 혈액 세포 유출(흰색 화살표) 및 미세-출혈 지점과 더불어(도 4I), 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리된 동물들에서 심하게 분포되어 있다. CD34 양성 면역-염색된 세포들은 대조군 종양들의 스트로마에서 다수 존재하나(도 4J), GT 종양들은 CD34 염색된 세포들의 현저하고 통계적으로 유의한 수적 감소를 나타냈다(도 4K 및 4L). VEGF 면역-염색 결과, 대조군 종양들에서 종양 침습 전방 지역(IF)에서 혈관의 조직화된 망상구조가 나타났다(도 4M). GT 종양에서, IF 지역은 공간 조직의 현저한 붕괴와 더 작은 수의 양성 세포들을 나타냈다(도 4N). 정량 분석 결과, 그룹 GT에서 IF 및 PN 지역에서 VEGF 양성 세포의 수는 극적으로 감소한다(도 40). Mann-Whitney 테스트 (*p<0.01)
도 5A-5D: GT 및 CG 종양들에서 유전자 발현의 변화. 마이크로어레이 분석에서 밝혀진 바와 같이, 대조군 종양들과 비교하여, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 종양들에서 상향 및 하향-조절된 최초 유전자들의 목록. 또한, 두 그룹 간 적어도 2배 변화를 보여주는 유전자들의 발현 패턴을 보여준다.
도 6A-6E: 마이크로어레이 데이터의 도식도. 도 6A에서, 데이터 세트의 스캐터 플롯은 중심축(고유 벡터)을 따라 두 그룹 간의 유전자 분포를 보여준다. 분석된 유전자들은 색 디폴트로 나타낸 그들의 배수 변화 값을 포함하여 최소에서 최대 범위까지 분포되어 있다. 도 6B에서, 계층 클러스터링과 같이 클러스터링 알고리즘(K-Means)은 그들의 발현 프로파일의 유사도를 기반으로 병합된 가장 유사한 실체를 나타냈다. 단백질의 유전자 분류사를 보여주는 단백질의 관계는 Ingenuity 데이터베이스에 있다. 이들은 유색 심볼로 나타낸다(녹색 심볼은 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 후 좀 더 작은 유도를 갖는 단백질을 가리키고, 붉은색 심볼은 좀 더 큰 유도를 갖는 단백질을 가리킨다). 색깔의 강도는 유도 크기에서의 그룹 간 차이를 가리킨다. 연관이 있는 단백질들은 속이 빈 심볼로 나타낸다. 소수의 유색 단백질들만 연관이 있는 단백질을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어 있는 것은 아니다. 혈관신생에 관련된 인자들 중 어떤 것은 도 6C에서 그리고 일반 도면은 도 6D에서 도시될 수 있다. 도 6E에서 어떤 유전자 샘플의 경우 마이크로어레이 데이터와 qRP-PCR의 방법 간에 일치된 결과가 관찰될 수 있다.
도 7A-7T: NFκB, TGFβ, HIF-1 및 COX-2 발현. 도 7A-7C는 그룹 GC와 비교하여, 그룹 GT에서 웨스턴-블랏팅에 따라 NFκB (P105 및 P50)의 두 서브-개체의 현저한 감소를 보여준다. 더욱이, 사우스웨스턴 조직화학 분석 결과, 핵으로의 NFκB 전사는 그룹 GB와 비교하여(도 7D), 그룹 GT에서 거의 사라짐을 확인하였다(도 7E). 유일한 예외는 H&E 염색에서 보인 혈관 손상이 있는 지역에서 그룹 GT에서만 혈관에서 현저하고 높게 NFκB 염색이 있다는 것이다(도 7F). 주목할 것은 혈관 수가 작을 때, 이는 WB 분석에 따라 NFκB의 전체적인 정량 분석에 영향을 주지는 않을 것이라는 것이다. TGFβ 면역-염색은 GT와 비교하여(도 7I), 그룹 GC에서 외형 측정에 의해 확인된 것(도 7J)을 검은색 화살표로 경계 표시한 대로 주로 PN 지역에서 훨씬 더 강하게 보였다(도 7H). 또한, HIF-1 면역-염색은 GT와 비교하여(도 7M 및 7N), 그룹 GC에서, 외형 측정(도 7O)과 웨스턴 블랏팅 분석(도 7P 및 7Q)에 의해 확인된 것과 같이 주로 PN 지역에서 훨씬 더 강하게 보였다(도 7K 및 7L). COX-2 염색은 척수(cords)에서 조직된 많은 세포들과 함께, GC 종양들의 침습 전방에서 더 높은 농도의 표식된 세포들을 보여주며(도 7R), 또한, 그룹 GT에서 사라진 조직의 두드러진 조직 파괴가 발견된다(도 7S). 외형 측정 결과 종양의 핵을 제외하고, 그룹 GT에서 COX-2의 IHC 발현이 감소함을 확인하였다(도 7T). Mann-Whitney 테스트 (*p<0.01).
도 8A-8T: 줄기세포 마커들(CD133, Oct4 및 MT) 및 세포사멸 마커들(Tunel 및 카스파제-3). 도 8A-8F는 두 줄기 세포 마커들, Oct4 및 CD 133에 대한 IHC 염색의 유사한 패턴을 보여준다. 면역-염색은 GT와 비교하여(각각 도 B 및 F/G), 외형 측정에 의해 확인된 대로(각각 도 C 및 H), 그룹 GC, 주로 PN 지역에서 훨씬 더 강하게 보였다(각각 도 A 및 D/E). MT 면역-염색은 GT와 비교하여(도 L/M), 외형 측정에 의해 확인된 대로, 그룹 GC, 주로 IF 지역에서 훨씬 더 강하게 보였다(도 I/J). MT 염색은 또한 그룹 GT에서 세포 척수(cords)와 혈관의 중요한 조직 파괴를 보여주었다. 두 TUNEL 및 카스파제-3 염색은 그룹 GC와 비교하여(각각 도 O 및 R), 외형 측정 분석에 의해 확인된 대로(도 Q 및 T), GT 그룹에서 평가된 세 지역 모두에서 더 높은 세포사멸 수준을 보여주었다(각각 도 P 및 S). Mann-Whitney 테스트 (*p<0.01)
도 9: 암 진행을 펌핑함에 있어서 종양 저산소증과 종양 신호전달 시스템을 전환함에 있어서 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 역할에 대한 제안 모델.
도 10: MDJ 연속 희석하여 96-웰 플레이트에서 내피세포(HUVEC, 2×105 cells/well)의 성장에 대한 MDJ의 효과. 주축, 속이 빈 심볼: MTT 환원에 의해 측정된 세포독성. 4반복에서 측정된 대조군을 제외하고, 각 점은 독립적인 2반복에서 수행된 4회 값의 평균을 나타낸다. 미처리 대조군에서 측정된 값은 그래프에서 해당 오차 막대로 표시된다. 두 번째 축, 속이 찬 심볼: 세포 배양에서 계산된 폴딩 시간. 각 점은 3회 독립적인 실험들의 평균을 나타낸다.
도 11: MDJ을 연속 희석하여 96-웰 플레이트에서 쥐 흑색종 세포(B16-F10, 1×104 cells/well)의 성장에 대한 MDJ의 효과. 주축, 속이 빈 심볼: MTT 환원에 의해 측정된 세포독성. 4반복에서 측정된 대조군을 제외하고, 각 점은 독립적인 2반복에서 수행된 4회 측정치의 평균을 나타낸다. 미처리 대조군에서 측정된 값은 그래프에서 해당 오차 막대로 표시된다. 두 번째 축, 속이 찬 심볼: 세포 배양에서 계산된 폴딩 시간. 각 점은 3회 독립적인 실험들의 평균을 나타낸다.
도 12: 제어 조건(A 및 C) 또는 1mM MDJ에 60시간 노출 후(B 및 D) RPMI 배지에서 유리 슬라이드 위에서 밀집(confluence)하여 자란 내피세포(A 및 B) 또는 쥐 흑색종 B16F10(C 및 D)의 대표도.
도 13: 시험관내에서 18시간 노출 후 HUVEC에서 세포 주기에 대한 MDJ의 효과. 각 테스트에서 사용된 농도는 그림에서 보이며, 세포 주기 측정은 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 간단히 표지한 후 BD FACScalibur 기기에서 수행하였다. 아크리딘 오렌지를 이용한 염색은 세포사멸 과정에 대한 대조군으로 제공된다.
도 14: 96-웰 플레이트에서 MTT 환원 분석에 의해 측정된, 24 저-밀도 평판(HUVEC, 1×104 cells/well)에서 내피세포의 생존능에 대한 MDJ의 효과. 각 점은 4회 독립적인 실험에서 수행된 8회 측정치의 평균을 나타내고, 실선은 비교를 위해 노출되지 않은 대조군의 측정치를 나타낸다. 미토콘드리아에 대한 효과는 미토트랙커 레드(mitotracker Red)로 염색하고, 공초점 현미경 관찰을 통해 확인하였으며, 4시간 노출 시 이미 관찰할 수 있다(도 15 참조).
도 15: 미토트랙커 레드 형광 공초점 현미경(80× 확대 (40× + 2×디지털 줌)으로 측정한, 24-웰 플레이트에서 25 mm 유리 커버 슬립에 저-밀도 평판(plating)하여 4시간 노출 후 내피세포의 미토콘드리아 활성에 대한 MDJ의 효과. 모든 측정들에 대해 눈금 파라미터들을 유지하였다. 미토콘드리아의 형광 염색에 상응하는 밝기 측정은 표시된 지역과 비교하여 정량하였고, 이는 저농도의 MDJ에 24시간 노출된 세포에서 수 또는 미토콘드리아 활성에서의 증가가 있음을 시사한다. 1mM과 같거나 더 큰 농도는 표시 강도/지역에서 감소를 초래한다.
도 16: 공초점 현미경에서 미토트랙커 레드 형광으로 측정한(40×배율), 24-웰 플레이트에서 25 mm 유리 커버 슬립에 저-밀도 평판하여 24시간 노출 후 내피세포의 미토콘드리아 활성에 대한 MDJ의 효과. 모든 측정들에 대해 눈금 파라미터들을 유지하였고, 각 점은 6회 독립 실험들의 평균값이다. MDJ는 그들 자신의 계란 알부민에서 용액에 투여될 때 계란에 의해 상당히 저항을 받았다.
도 17: 생체 내 생존 연구에서 MDJ의 독성. 수정란은 계란 자체에서 제거된 5mL의 알부민 부피에서 100, 50, 10, 5㎕/계란(n = 5)의 용량으로 MDJ에 노출되었다. 대조군은 MDJ 없이 비히클에 노출되었다. 도면 내 설명에 제시된 농도는 60mL/계란의 부피를 가정하여 계산한 것이다.
도 18: 계란 한 개당 노출되지 않은 대조군(C), l㎕(B), 5㎕(A)에 상응하는 CAM 모델 COSES에서 혈관신생에 대한 알부민 첨가된 MDJ의 효과. 흑색종 세포의 존재는 계란의 생존을 감소하였다. MDJ는 부분적으로 이 생존을 회복시켰다. 모델에서 CAM의 결과는 흑색종 덩어리가 활성 기질의 작용 하에서 용량 의존적 퇴화를 겪음을 확인해주는 것이다.
도 19: B16F10 쥐 흑색종, 1×104 cells/well를 접종한 계란에서 생체 내 생존 연구에서 MDJ의 독성. 수정란은 계란 자체에서 제거된 5mL의 알부민 부피에서 100, 50, 10, 5㎕/계란(n = 5)의 용량으로 MDJ에 노출되었다. 대조군은 MDJ 없이 비히클에 노출되었다. 도면 내 설명에 제시된 농도는 60mL/계란의 부피를 가정하여 계산한 것이다.
도 20: CAM의 지역에서 흑색종의 성장에 대한 알부민 투여된 MDJ의 효과. 모든 샘플들은 B16F10 쥐 흑색종, 1×104 cells/well로 접종된 것이다. A 및 B는 5×확대된 이미지이고, C 및 D는 10×확대된 이미지이다. A 및 C, 미처리 대조군, B 및 D는 5㎕의 MDJ의 일회량이 처리된 것이다. 종양 성장은 혈관과 밀접하게 연관되어 있다. 흑색종은 혈관신생을 유도하고 CAM의 주요 혈관 가까이에서 자랐다.
도 21: CAM 지역에서 흑색종의 성장에 대한 알부민 투여된 MDJ의 효과. 샘플은 B16F10 쥐 흑색종, 1×104 cells/well로 접종된 것이다. A: 명시야에서 확대경을 입체적으로 3차원 이미지로 디지털화한 것, B: 암시야에서 얻은 동일 영역의 이미지. 10× 배율.
도 22: 96-웰 배양 플레이트에서 내피세포(HUVEC, l×lO4 cells/well) 또는 쥐 흑색종(B16F10, 1×104 cells/well)의 성장에 대한 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 효과. 각 점은 독립 2반복에서 수행된 3회 측정치의 평균을 나타낸 것이다.
도 23: MTT 테스트에서 측정되고, 24시간 노출 후 96-웰 배양 플레이트에서 내피세포(HUVEC, l×104 cells/well) 또는 쥐 흑색종(B16F10, l×104 cells/well)의 생존능에 대한 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 효과. 각 점은 독립 2반복에서 수행된 3회 측정치의 평균을 나타낸 것이다.
도 24: 혈관신생의 CAM 모델에서 혈관 성장에 대한 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 효과. A 및 B: 염색 없이 새로운 물질에서 만들어진 현미경 사진. Jena 현미경, 평행 캐패시터가 있는 조명. 8× 확대. B 및 D: 염색 없이 새로운 물질에서 만들어진 현미경 사진, Jena 현미경, 평행 캐패시터가 있는 조명, 32× 확대. 독립적인 실험에서 얻은 샘플. A 및 C: 미처리 대조군. B 및 D: 용량은 1μΜ MDJ과 동량으로 CAM에 적용하였다.
도 25: 인큐베이션 8일째에 B16F10 쥐 흑색종, l×104 cells/well를 접종한 CAM에서 혈관신생 모델에서 혈관 성장에 대한 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 효과. 염색 없이 새로운 물질에서 얻은 현미경 사진. Jena 현미경에서, 평행 캐패시터가 있는 조명, 32× 확대. A: 미처리 대조군. B: 1μΜ MDJ과 동량으로, 인큐베이션 11일째에 CAM에 적용된 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ을 처리한 샘플.
도 26: 9개의 암 세포주: UACC62, MCF7, NCIADR, 7860, NC1460, PC03, OVCAR03, 및 HT29, K562에서 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ(3-30 nm 크기 범위를 가짐)의 효과. X-축은 샘플의 총 부피를 기반으로 한 MDJ의 농도이다; 사용된 나노에멀젼에서 MDJ의 농도는 1 mM임.
도 27: 혈관신생 활성에 대한 나노전달체의 크기 효과; 나노전달체-전달된 MDJ의 농도는 1nM 내지 10-100mM이 되도록 사용됨.
도 28: 9개의 암세포주: UACC62, MCF7, NCIADR, 7860, NC1460, PC03, OVCAR03, 및 HT29, K562에서 콩 포스파티딜콜린 리포좀-전달된 MDJ(리포좀 크기: 50-120nm)의 효과. X-축은 샘플의 총 부피를 기반으로 한 MDJ의 농도임; 나노에멀젼에서 MDJ의 농도는 1mM임.
도 29: 미토트랙커 레드 형광 공초점 현미경에 의해 측정되고, 복합체와 세포들의 인큐베이션 8시간(하단 세 개의 패널) 후 UACC-62 세포의 미토콘드리아 활성에 대한 MDJ-콩 포스파티딜 리포좀의 효과. MDJ 농도는 10-3M이고, 복합체의 크기는 25nm 내지 200nm 범위임.
도 30: MTT 테스트에 의해 측정되고, 24시간 노출 후, 내피세포(HUVEC) 또는 쥐 흑색종(B16F10)의 생존능에 대한 MDJ-콩 포스파티딜 리포좀 나노전달체 복합체의 효과.
도 31: 나노에멀젼에서 MDJ 농도가 10-3M이 되도록 하여, MDJ-PAMAM 나노전달체 복합체의 항-혈관신생 효과. 상단 패널은 쥐 흑색종 (B16F10)의 종양 덩어리 형성과 종양이 자라도록 하기 위해 영양을 제공하는 새로운 혈관망의 형성을 명확하게 보여주나, 하단 패널에서는 복합체 처리 시 혈관망이 형성되지 않았다.
도 32: 샘플에서 MDJ 농도가 10-3M이 되도록 하여, UACC-62 세포에서 MDJ-LDE 나노전달체 복합체의 항-혈관신생 효과.
도 33: 샘플에서 MDJ 농도가 10-4M이 되도록 하여, UACC-62 세포에서 MDJ-콩 포스파티딜콜린 리포좀 나노전달체 복합체의 항-혈관신생 효과.
도 34: 백혈병 세포에 대한 MDJ-LDE 마이크로전달체 복합체(10㎛의 크기, MDJ 농도는 10-3 내지 10-1M이 됨)에 의해 활성화된 대식세포의 효과. A: 대식세포(어두운)에 의해 포집된 암세포(밝은)의 현미경 사진; B: 대식세포 내부에 소화되는 암세포의 현미경 사진.
도 35: 저 용량에서 나노전달체-MDJ의 생체 내 혈관신생 효과: 상단 2개의 이미지는 10μΜ의 MDJ 농도이고, 하단 3개의 이미지는 100nM의 MDJ 농도임.
도 36: 30μΜ의 농도에서 MDJ 및 나노전달체-MDJ의 생체 내 혈관신생 효과.
도 37: 암세포에 대한 자스모네이트 작용의 경로{Flescher, Cancer Lett. 2007; 245(1-2):1-10. 참조).
도 38: A: 물(대조군); B: 비어있는 나노입자; 및 C: MDJ를 전달하는 나노입자를 24시간 처리한 후 Jurkat 세포주(백혈병, ATCC® 번호: TIB-156™)의 역상 현미경 사진. 도 38C에서, 24시간 처리 후 거의 모든 세포들이 죽는다.
도 39: A: 물(대조군); B: 비어있는 나노입자; 및 C: MDJ를 전달하는 나노입자를 24시간 처리한 후 전립선암 세포주 VCaP(ATCC® 번호: CRL-2876™)의 역상 현미경 사진. 도 39C에서, 24시간 처리 후 거의 모든 세포들이 죽는다.
도 40: A: 물(대조군); B: 비어있는 나노입자; 및 C: MDJ를 전달하는 나노입자를 24시간 처리한 후 유방암 세포주 HCC38(ATCC® 번호: CRL-2314™)의 역상 현미경 사진. 도 40C에서, 24시간 처리 후 거의 모든 세포들이 죽는다.
도 41: A: 물(대조군); B: 비어있는 나노입자; 및 C: MDJ를 전달하는 나노입자를 24시간 처리한 후 전립선 암종 세포주 22Rvl(ATCC® 번호: CRL-2505™)의 역상 현미경 사진. 도 41C에서, 24시간 처리 후 60-70%의 세포들이 죽는다.
도 42: A: 물(대조군); B: 비어있는 나노입자; 및 C: MDJ를 전달하는 나노입자를 24시간 처리한 후 대식세포의 역상 현미경 사진.
도 43: 아연, 칼슘 또는 아미노산이 결합된 A-14와 접촉시킨 경우, 혈관의 파편화를 보여주는 이미지. 아연-결합된 A-14는 칼슘- 또는 아미노산-결합된 A-14와 비교하여 혈관 파편화에 대해 가장 유의적인 효과를 입증하였다. 1: 알라닌 결합된 A-14; 2: 은(argentine) 결합된 A-14; 0.5: 아연 결합된 A-14; 5: 칼슘 결합된 A-14 및 c: 대조군. 전달체는 리포좀이다.
도 44: 좌측 이미지: 거대한 양의 혈관, 혈관신생이 종양 세포 주변에 형성됨. 성장을 위해, 종양은 더 많은 양의 영양분과 산소가 요구됨. 그러한 요구로 인해, 혈관 복합체는 VEGF(Vascular Endothelial Grow Factor)가 종양에 의해 방출된 후 종양 내부/쪽으로 형성된다. 우측 이미지: 아미노산이 결합된 A-14를 처리한 후 대부분의 혈관 복합체가 사라졌다. 이 현상을 항-혈관신생으로 명명하며, 이들 혈관의 붕괴는 종양이 그것의 성장에 요구되는 영양분과 산소를 제공받지 못하도록 한다. 전달체는 리포좀이다.
도 45: 아미노산-결합된 A-14에 의해 내피세포의 붕괴를 보여주는 이미지. 전달체는 리포좀이다.
도 46: 아연-결합된 A-14에 의해 유방암에서 혈관 주변 항-혈관신생 효과를 보여주는 이미지. 전달체는 리포좀이다.
<실시예>
실시예 1: LDE-전달된 MDJ의 합성
우선, 40mg의 포스파티딜콜린, 20mg의 콜레스테롤 올리에이트, 1mg의 트리올레인, 및 0.5mg의 콜레스테롤로 구성된 지질 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 진공 건조하였다. 그리고 나서, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0에서 Branson 기기, 모델 450A(Ultrasound Arruda, Sao Paulo, Brazil)를 사용하여 125 와트 전력, 3시간, 질소 대기 하에서 51-55℃ 범위의 온도로 초음파 조사하여 지질 에멀젼을 제조하였다. MDJ를 캡슐화하기 위해 고안된 직경 범위 또는 크기 범위로 LDE를 얻기 위해, 에멀젼을 2 단계 원심분리 하여 정제하였다(예를 들어, 초원심분리, Beckman rotor SW -41). 첫 번째 단계에서, 200,000g, 30분, 4℃에서 원심분리하여 얻은 튜브 위쪽의 분획을 흡기(1mL)하여 제거하고 버렸다. 남아있는 현탁액에 포타슘 브로마이드(KBr)를 부가하여 1.21g/mL로 밀도를 조정하였다. 두 번째 원심분리 후(200,000×g, 2시간, 4℃), 흡기를 통해 튜브의 상부 분획에서 LDE를 회수하였다. 과량의 KBr을 1000 부피의 0.01M Tris HC1, pH 8를 2회 바꿔주면서 투석하여 제거하였다. 마지막으로, 에멀젼은 층류에서 0.22mm의 기공도를 갖는 밀리포어 멤브레인 여과를 통해 멸균하고, 30일까지 4℃에서 보관하였다. 현탁액에서 LDE 입자의 크기는 29-400nm에서 광 산란 및 현미경 측정에 의해 측정하였다. 현탁액에서 LDE 입자의 표면 전위는 제타 전위 분석기 ZetaPALS 기기(Brookhaven Instruments Corporation)(Lima & Maranhao, 2004)에서 대략 -5.43mV 및 -7.42mV 사이가 되도록 하여 측정하였다.
50mL의 MDJ의 에탄올 용액을 상기에서 제조된 500mL의 LDE 에멀젼에 부가하여 3mg/mL 농도의 MDJ를 갖는 혼합물을 만들었다. 상기 혼합물은 실온에서 15분간 교반하고 나서, 4℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 혼합물을 200mL의 멸균 0.01M Tris-HCl 버퍼로 2회 투석하였다. 투석된 에멀젼은 LDE 전달체에 결합되거나 내부에 캡슐화된 MDJ의 함량을 측정하기 위해 GC-MS를 사용하여 분석하였다. LDE 대 MDJ의 몰 비율은 1/10 및 1/5 사이인 것으로 측정되었다.
실시예 2: 콩 포스파티딜콜린 리포좀-전달된 MDJ 및 고분자-전달된 MDJ의 합성
(리포좀-전달된 MDJ)
뚜껑이 있는 투명한 병에 적당량의 비이온성 계면활성제 캐스터 오일 폴리옥시에틸렌-40-하이드로게네이티드(castor oil polyoxyethylene-40-Hydrogenated(ORPH)(EUMULGIN ® HRE 40) 및 콩 포스파티딜콜린(FS)(Epikuron ® 200)을 1:1의 몰 비율(ORPH/FS)로 부가하였다. 그리고 나서, 소듐 올리에이트 및 콜레스테롤을 1:5의 소듐 올리에이트/ORPH의 몰 비율을 기반으로 1:1의 몰 비율로 부가하였다. 이 혼합물을 0.22㎛ 멤브레인에 통과시켜 여과하였다. 여과된 용액을 멸균 병에 넣고 나서, 결과 나노에멀젼 1mL당 10mg의 농도가 되도록(이 함량은 나노에멀젼 1mL당 7mg - 21mg의 MDJ로 다양하게 할 수 있음) MDJ(96%, Sigma-Aldrich에서 구입)를 부가하였다. 휴식 기간(resting period)을 바꿔주면서 볼텍스 교반하여 균질의 나노에멀젼을 생성하였다. 특히, 멸균 병에서 혼합물을 Sonic ® Ultrasonic Liquid Processor(model XL2020TM 220 watts)를 사용하여 초음파 처리하고, 불연속적인 방식으로 실온에서 20분 동안 작동시켰다. 초음파 처리 후, 나노에멀젼은 10,000rpm에서 15분 동안 원심분리 하여 티타늄 로드 초음파파쇄기에서 방출된 폐기물을 폐기하였다. 결과 혼합물을 Tris-HCl 버퍼, pH 7.2(수용상)에서 투석시켰다. 나노에멀젼의 리포좀의 크기는 50-500nm인 것으로 측정되었다. 또한, 리포좀 대 MDJ의 몰 비율은 1/10 및 1/5 사이인 것으로 측정되었다.
(고분자-전달된 MDJ/시트랄/포스포릴에탄올아민)
평균 분자량이 65,000인 폴리(ε-카프로락톤), 소르비탄 모노스테아레이트(Span®60), 및 폴리솔베이트 80(Tween®80)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 얻었다. 사용된 모든 유기 용매는 J.T. Baker(Ecatepec, Mexico)에서 구입한 HPLC 등급이다. 초순수 물은 Milli-Q System(18ΜΩ)(Millipore Corporation, Bedford, MA, USA)에 따라 실험실에서 만들었다. 시트랄(3,7-dimethyl-2,6-octadienal), 포스포릴에탄올아민 및/또는 메틸 자스모네이트를 포함하는 나노입자는 다음과 같이 얻었다. 우선, 오일/물(O/W) 에멀젼을 오일(lO.Og) 및 활성 화합물, 단독 또는 Ultra-Turrax homogenizer(IKA T10 basic Ultra-turrax®, Ika-Werke, Staufen, Germany)를 사용하여 15,000rpm에서 1분간 물(400mL)에서 0.05-0.50g(내부 성분)의 범위의 혼합물로 격렬히 교반하여 만들었다. 두 번째 단계에서, 고분자(0.2-2.0g)를 아세톤(400mL)에 용해시켜 제조한 유기 용매를 연동 펌프를 10%(PumpPro TPM 600 55RPM, Waton-Marlow, Wilmington, UK)로 사용하여 적당한 자석 교반 하에서 에멀젼에 부었다. 또한 교반 10분 후, l.Og의 Tween®80를 물(200mL)에 용해시켜 제조한 수용액을 적당한 자석 교반 하에서 에멀젼에 부었다. 다시, 10%에서 연동 펌프가 사용되었다. 부가하는 것을 완료한 후, 반응 혼합물을 추가로 10분 동안 교반하였다. 마지막 단계에서, 유기 용매를 제거하고, 감압(R-21, Btichi, Switzerland) 하에서 나노입자 분산액의 부피를 500mL로 농축하였다. 첫 번째 단계에서 만든 O/W 에멀젼은 고분자 없이도 안정하였다. 몇 개의 다른 나노에멀젼을 제조하고 분석하였다.
시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 자스모네이트 화합물 중 단지 하나를 포함하는 고분자 없는 나노에멀젼;
시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 자스모네이트 화합물 중 어떤 2종의 혼합물을 포함하는 고분자 없는 나노에멀젼;
3종의 화합물, 즉, 시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 자스모네이트 화합물을 모두 포함하는 고분자 없는 나노에멀젼;
시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 자스모네이트 화합물 중 단지 하나를 포함하는 고분자 나노입자;
시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 자스모네이트 화합물 중 어떤 2종의 혼합물을 포함하는 고분자 나노입자;
3종의 화합물, 즉, 시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 자스모네이트 화합물을 모두 포함하는 고분자 나노입자;
나노에멀젼 모두 높은 절대 회수율(>90%), 봉입율(>85%) 및 모든 활성 화합물(시트랄, 포스포릴에틸렌아민 및 MJ 또는 MDJ 같은 자스모네이트 화합물)에 대한 콜로이드 안정성을 보여주었다.
실시예 3: 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 합성
MDJ-사이클로덱스트린 나노에멀젼은 메틸 디하이드로 자스모네이트의 수용액 또는 알코올 용액(1×10-3M - 1×10-2M)과 동량의 사이클로덱스트린을 포함하는 사이클로덱스트린 용액을 혼합하여 제조하였다. 결과 혼합물을 균질의 에멀젼이 얻어질때까지 교반하였다.
실시예 4: 마우스에서 화학적으로 유발된 대장종양의 치료를 위한 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 독성 연구 및 전임상 평가
상기 실시예 3에서 제조된 시클로덱스트-전달된 MDJ의 효과는 마우스 대장암 실험 모델에서 연구하였다. 종양 성장에 관련된 2개의 가장 중요한 사건들, 세포사멸 및 세포 증식을 조사하였다. 대장종양의 세포사멸과 증식 지수, 인접한 비-암성 조직 및 정상 대장 조직을 측정하였다. 세포사멸은 세포사멸 핵 계수법 및 카스파제-3 면역염색에 따라 정량했지만, 증식은 PCNA 면역염색에 따라 측정하였다.
시약 및 방법
동물들은 미국 NIH의 NRC 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 위원회의 가이드라인을 준수하였다. 마우스는 임의로 사료와 물을 섭취시켰고, 12시간, 명/암 주기 하에서 경재 베딩에서 사육하였다. 동물들은 실험 동안 매주 무게를 측정하였다. 모든 실험들은 USP 동물 윤리 위원회의 승인을 받았다.
간단히 말해, Balb/c 마우스에 발암물질, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)를 직장내 점액주사하여 2주 동안 1주일에 2회씩(XX) 처리하고, 실험 시작 후 24주째에 희생시켰다. 실험 말기 전 10일째에, 그룹 A의 동물들(n=10)에는 매일 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ(1mM MDJ가 포함된 10㎕의 생리식염수)를 체중의 60g씩 i.p. 주사로 처리하였다. 그룹 B의 동물들(n=10)에는 동일한 투여량으로 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ를 직장내 점액주사하여 매일 처리하였다. 그룹 C(n=10)에는 MNNG와 매일 MDJ(100㎕의 생리식염수에 10%로 희석됨)를 i.p. 주사하여 처리하였다. 그룹 D의 동물들에는 MNNG와 매일 같은 투여량의 MDJ를 직장내 점액주사하여 처리하였다. 대조군 그룹 E에는 MNNG를 단독 처리하였다. 대조군 그룹 F 및 G에는 생리식염수와 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ를 각각 i.p. 및 i.r 처리하였다. 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 및 MDJ의 투여량은 선행 동물 파일럿 연구들을 기반으로 하였다.
대장을 수득하고, H&E를 위해 조직학적으로 가공하여 화학적으로 유도된 종양들의 조직병리학적 특징들을 연구하고, 세포사멸 지수를 기록하였다. 같은 처리 군에서 대장종양(T), 인접한 비-종양 부위(NT), 비-종양 흰쥐로부터 육안으로 정상 대장 점막(N)을 얻었다. 증식세포성항원(Proliferating cellular antigen, PCNA) 염색에 따라 세포 증식을 연구하고, 세포사멸체 계수 및 카스파제-3 염색 둘 다에 의한 세포의 세포사멸을 분석하기 위해 면역조직화학을 수행하였다. 결과로, PCNA 표지 지수(PCNA-Li), 세포사멸 지수(AI) 및 카스파제-3 표지 지수(카스파제-3-Li)를 나타내었다. 또한, 표준 혈액학 및 임상 화학 파라미터들을 모니터링 하였다.
세포사멸 지수의 측정
세포사멸은 세포사멸 핵 계수법에 의해 측정하였다. 헤마톡실린 및 에오신으로 섹션을 염색하여 섹션당 세포사멸 세포의 수를 평가하였다. 세포사멸 세포를 인식하는데 사용된 기준은 다음과 같다: 수축된 크기, 주변 조직들과의 접촉 손실(분류학적으로 기술된 할로(halo)를 형성하는 시간에서) 및 이미 기술된 핵 응축(Yu et al., Gut 2002, 51:480-484). 5개의 무작위 장소에서 적어도 1000개의 세포를 계수하여 세포사멸 특징들을 갖는 세포의 비율을 계산하였다(세포사멸 지수 또는 AI). 세포사멸 핵의 수는 30개 무작위로 선택된 지역에서 카스파제-3 면역 염색에 의해 얻은 결과들과 비교하였다. 세포사멸 핵의 수와 카스파제-3 결과 간의 강한 상관관계가 발견되었다(r = 0.83, P<0.001).
증식 지수의 측정
증식은 이미 기술된 대로 증식성 세포 핵 항원(PCNA)에 대한 면역 페록시다아제 염색으로 분석하였다. 간단히 말하자면, 각 표본 유래의 파라핀에 끼워져 있는 섹션을 시트레이트 버퍼에서 마이크로웨이브 항원 회복 후 PCNA 항체로 표지하였다. 음성 대조군은 1차 항체를 비-면역 혈청으로 대체하여 진행하였다. 슬라이드를 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Dako, Denmark)에서 디벨럽하고, 메이어 해마토실린(Mayer haematoxylin)으로 카운터-염색하였다. 증식 지수(PI)는 PGVA-양성 핵 대 계수된 총 핵의 비율 퍼센트로 나타내었다.
통계 분석
결과는 평균±SE로 나타내었다. 다른 처리 그룹 간의 비교는 Bonferroni의 다중 비교 테스트와 (analysis of variance) ANOVA에 따라 만들었다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계학적 계산은 SPSS 통계 소프트웨어 패키지(version 11.0, SPSS Inc.)를 사용하여 시행되었다.
결과
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 항종양 효과)
실험 그룹 C 및 H(즉, MDJ i.p.을 받은 것)는 초기 징후 또는 복막염으로 인해 제외하였다. MNNG 처리된 모든 마우스들은 대장종양을 발생하였으나, 대조군 그룹에 속하는 마우스 어느 것도 대장암을 발생하지 않았다. 대장암이 발생한 마우스당 종양의 평균 수(4.6)에 관해서는 그룹 간에 통계적으로 유의적인 차이는 없었다. 세포사멸 지수는 보통 그들의 인접한 비-종양 및 정상 대장조직보다 대장종양에서 더 높았다(P<0.005, ANOVA). 각 처리 그룹에서 Ai, 카스파제-Li 및 PCNA-Li 뿐만 아니라 종양의 평균 크기는 아래 표 2에 요약하였다.
[표 2]
Figure pat00004
요약하면, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리된 동물들에서 대장암종은 E 그룹과 비교하여 PCNA 염색으로 평가된 분열 지수에서 유의적인 감소(43%)를 나타냈다. 더욱이, 복강내(i.p.) 주사된 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ은 세포사멸 지수(세포사멸체 계수 및 카스파제-3 발현에 의해 평가됨)에서 현저한 3배 증가를 야기하였다. 이 그룹에서, 카스파제-3 발현은 종양에서 강력하고 균일하게 분포되어 있었다(도 2). 그러나, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ i.r. 및 MDJ i.r. 투여는 경미하게 그러나 상기 종양 마커들에서 유의적인 감소와 연관되나, 조직병리학적 분석은 카스파제-3 발현이 점막 상피에 피상적으로 제한됨을 보여주었다(도 3).
다른 조직학적 특징들은 그룹 A 및 B에서 종양들에 대해 면역 방어에서의 증가를 가리키고 있다(계수되지는 않았으나, 종양 주변 림프구의 두드러진 수적 증가로 인함).
MNNG-처리된 동물과 발암물질 MNNG 처리되지 않은 동물 둘 다에서 MDJ 및 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 처리는 정상 대장 점막과 종양에 인접한 점막에서 세포 증식과 세포사멸에서 어떠한 유의적인 변화는 서로 관련이 없었다.
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 독성 효과의 결여)
종양에서 및 행동적인 불안의 어떤 신호로부터 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 강력한 효과에도, 조직병리학적 분석 및 표준 혈액학과 임상 화학 파라미터 둘 다에서 뇌, 간, 비장, 신장, 위장관 및 골수 독성의 어떠한 징후도 관찰되지 않았다.
본 연구는 조직 샘플에서 세포사멸을 측정하는 간단하고 정량적인 기술로서 카스파제-3 활성의 형태적 측정을 이용하여 평가하였다. 친세포사멸 효소인 카스파제-3는 내재적 및 외재적 세포사멸 유도 경로를 위한 수렴 시점에서 활성화된다(Nakopoulou et al., Pathobiology 2001, 69:266-273). 본 연구는 그들의 항종양 효과를 이루는 메커니즘에 대한 더 많은 이해를 얻기 위해 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 및 MDJ 처리 후 마우스의 대장종양과 정상 점막에서 세포 카이네틱스 및 세포사멸 변화를 특성규명하고자 한다. MDJ는 그렇지 않으나, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 처리는 마우스에서 MNNG에 의해 유도된 대장종양의 더 작은 평균 크기와 연관되어 있음이 본 연구에서 입증된바 있다. 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ(i.p.)의 처리는 대장종양에서 증식의 경미한 억제를 초래하나, 그들의 인근 또는 멀리 떨어진 정상 조직에서는 그렇지 않음이 밝혀졌다. 더욱이, 이 처리는 세포사멸의 현저한 유도에만 또한, 종양에서만 연관되어 있고, 멀리 떨어진 대장 점막의 정상 부근에서는 그렇지 않음을 알 수 있었다. 흥미롭게도, MDJ-처리된 동물의 종양에서 더 높은 증식 지수가 발견되어, MDJ는 점막에 대해 귀찮은 자극이 될 것이고, 아마도 상피세포에 대한 세포독성 효과에서 말미암은 것임을 시사한다.
더불어, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리는 세포사멸의 현저한 유도 및 증식 억제 둘 다를 초래한다. 대조적으로, MDJ는 대장종양에서 세포 증식을 억제하지 않고, 세포사멸의 경미한 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 항종양 효과를 이루는 메커니즘이 MDJ-처리된 그룹에서 및 또한 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ(i.r.) 그룹에서 발견되지 않는 하나의 제공된 종양의 부분들 모두에 도달하는 그것의 능력에 더 연관될 것임을 시사한다. 중요하게도, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 억제 효과는 그들이 종양세포에서 세포사멸을 유도하나 나머지 비-종양세포는 영향을 받지 않는다는 의미에서 암-특이적임을 확인한바 있다.
본 연구에서 얻은 결과는 적어도 수행된 실험 조건에서 전신적으로 주사된 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 대장종양에 도달할 수 있고, 화학적으로 유도된 대장종양의 성장을 어떤 유의적인 부작용없이 감소할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 의한 암의 제거
본 실시예에서 기술된 연구는 실시예 3에서 만들어진 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 NOD-SCID 마우스에서 이종 이식 사람 Caco2 종양에서 두드러진 수축을 유도함을 보여주었다. 더욱이, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ는 혈관 붕괴를 유도하고, 혈관신생과 암줄기세포를 억제하였다. 마이크로어레이 분석은 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 NFκB, HIF-1 및 메탈로티오네인(metallothioneins)의 주요 억제와 함께 동시에 다양한 중요한 신호전달경로에 영향을 줌을 보여주었다. 결과는 정량적인 실시간 PCR, 웨스턴 블랏팅, 사우스웨스턴 조직화학 및 면역-조직화학에 의해 확인하였다.
수컷 NOD-SCID 마우스(6-8 주령)에 Caco2 사람 대장암 세포(100㎕의 PBS에 1.5×l06로 포함됨)를 피하주사하였다. 1주일 후, 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누었다. 4주 후, 만질 수 있는 정도의 종양(20-25mm2)이 생겼을 때, 그룹 GT에 100㎕의 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ를 하루에 한번, 4일 동안 복강 주사하고, 대조군 그룹에는 PBS를 투여하였다(그룹 GC). 종양 부피는 다음 식에 따라 계산하였다: 길이2×너비/2, 그리고, 종양은 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리 개시 후 5일째에 제거하였다. 기술된 대로, 종양에서 총 RNA를 얻고, 정량하여 RNA 양을 평가하였다. 유전자 발현 분석은 마이크로어레이 실험 프로토콜로 수행하였다(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA, containing approximately 40.000 probes) (Rizzatti et al., 2005). 정량적인 실시간 PCR(q- PCR)은 표적 유전자들, 사이클린 Dl, HIF-1, 메탈로티오네인 D3 및 VEGFA에 대해 수행하였다. 배수 변화는 2-ΔCt 방법을 사용하여 계산하였다. 웨스턴 블랏 분석(WB)은 HIF-1a(Novus biologicals) 및 NF-κB p-50(Santa Cruz Biotechnology, CA)에 대해 수행하였다. β-튜불린(clone KMX-1 1:3000, Millipore)는 로딩 대조군으로 사용하였다. 사우스웨스턴 조직화학 분석(SW)은 종양 조직 준비에서 NF-κB의 인 시츄 검출을 위해 수행하였다. H&E 섹션은 조직병리학적 분석을 위해 사용하였다. 면역조직화학(IHC)은 PCNA, 사이클린 Dl; 카스파제-3, CD31, VEGF, CD34, COX-2, TGFβ, HIF-1, CD133, Oct4 및 MT에 대해 수행하였다. TUNEL 분석을 또한 수행하였다. 그룹 표시를 볼 수 없는 두 명의 조사자들이 독립적으로 샘플을 평가하였다. 염색된 세포들과 미세혈관 밀도를 기록하였다. 데이터는 통계 프로그램 GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, California, USA)을 사용하여 분석하였고, 이 분석은Mann-Whitney 테스트에 의해 수행되었다. P<0.05의 확률은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
또한, 종양 성장을 촉진하고 종래 암 치료에 대해 주요 내성 시스템을 보유하기 위해 각각 밀접하게 관련되고 최근 고려되고 있는 종양 미세환경, 혈관신생 및 암줄기세포(CSCs)에 영향을 줄 수 있는 지를 확인하고자 하였다. 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트에 의해 수행되었다.
여기에서 보여주는 연구의 가장 주목할만한 결과는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 의해 유도된 종양 수축의 두드러진 효과이나, 대조군 동물(GC)에서 종양들은 실험기간 내에 유의적인 성장을 나타낸다는 것이다(P<0.01)(도 4A). 육안으로, 대조군 종양과 비교하여, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 동물들에서 종양들은 희미하고 단단한 외부 층과 더 연한 핵을 나타내어(도 4B 및 4C), 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리는 종양 혈액 관류에서의 감소를 초래함을 시사한다.
이종 이식 종양들의 해마톡실린 및 에오신(H&E) 분석은 5개 타입의 조직에서 두드러진 혈관질과 분열을 나타냈다: (1) 거의 분화되지 않는 것으로 보이고, 호염기성 및 빈약한 세포질과 더불어 과염색성인, 타원 세포들에 대해 둥근 집단이 있는 종양 핵; (2) 응고성 출혈 괴사의 초점; (3) 괴사 초점을 둘러싸는 신생 슈도팰리세이드(pseudopalisades), 이른바, "주변-괴사 지역(peri-necrotic areas)" (PN), (4) 종양 경계에서 침습 전방, 및 (5) 빔에서는 모여 있고, 종양 핵과 주변 둘 다에서는 퍼져있는 보통 방추형 세포로 이루어진 기질 요소들(도 4J).
마이크로어레이 분석은 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 다양한 중요한 신호전달 경로들에 동시에 영향을 미침을 보여주었다(도 6A 및 6B). 어레이에서 40,000 개의 유전자들 중에서, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리는 2016개의 유전자의 상향조절과 1305개의 유전자의 하향조절을 초래하였다(2-26.3 배). 아직 기능이 알려지지 않은 새로운 유전자들뿐만 아니라 마스터 전사 인자들이 바뀌었다. 미처리된 것들과 비교하여, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 동물들의 종양에서 2배 이상 상향 또는 하향조절된 주요 유전자들은 도 2에 요약하였다. Ingenuity 경로 분석 시스템을 이용하여 발현이 바뀐 가장 중요한 유전자들을 비교하고 그들의 유전자 산물들의 관계에 따라 그들을 분류할 때, 매우 연관된 네트워크가 나타났다(도 6C 및 6D). 마이크로어레이 결과와 qPCR 간의 불일치는 발견되지 않았다(도 6E).
흥미롭게도, 예를 들어, PPAR과 같이 항암 효과와 연관있다고 알려진 다양한 유전자들은 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 종양들에서 상향조절된 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 종양 성장과 연관되어 있는 어떤 중요한 유전자들, 예컨대, NFκB, VEGF, AKT, HIF-1 및 Hox는 하향조절된 것으로 밝혀졌다. 유전자 발현 변화는 혈관신생, 염증, 세포사멸, 매트릭스 메탈로프로테아제, 세포 증식, 대사 및 약물 내성에 관련된 많은 경로들을 포함하고 있다.
사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 의한 종양 유전자 발현에서의 변화의 전체 범위는 여기에 기재할 수 없으나, 혈관신생과 암줄기세포에 관련된 메커니즘에 연관된 어떤 가장 중요한 결과의 가장 흥미있는 부분은 형태적 데이터와 함께 나타낼 것이다.
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 항-혈관신생 효과)
사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 그룹은 대조군 그룹 GC에서 발견된 것(p<0.01)보다 284% 더 큰 출혈성 종양 괴사 지역을 나타냈다(각각 도 4D 및 4E). 더욱이, 종양 괴사는 주변에 종양 외부로부터 보다는 오히려 종양의 핵으로부터 주로 명백히 발생하여(도 4E), 혈관신생이 억제될 뿐만 아니라 혈관 붕괴 현상이 일어날 것임을 시사한다. 게다가, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ은 내피세포(EC) 조립을 세포내강화로 손상시키고, 혈관을 조직하여(도 4F 및 4H), 무질서한 혈관 성장의 형성, 맹관(cul de sac)에서 많은 모세관 말단을 갖는 명백하게 기능장애인 혈관을 다량 형성하였다(도 4G 및 41). 이들 관찰들은 부화계란에서 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 의해 혈관 밀도의 감소와 정상 혈관보다 더 약하고 덜 조직된 새로운 혈관의 버딩에 대한 선행 결과와 일치한다(Braz J Biol. 2010; 70:443-449).
SW는 GT 종양들에서 NFκB에 대한 특이 염색으로 세포 손상에 대한 단순한 반응성 신호전달을 대표하는 혈관 수의 특이적인 증가를 보여주었다(485%; p<0.01)(도 7F). 이는 또한 GT 그룹에서 세포사멸 마커인 카스파제-3에 대해 양성적으로 염색된 큰 수의 미세혈관의 관찰과 긴밀히 결부되어 있다. 더욱이, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 마우스의 종양들은 대조군 마우스의 것보다 더 적은 VEGF 및 CD31-양성 염색된 미세혈관을 포함하고 있어, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 종양 혈관신생을 억제할 수 있다는 견해와 일치한다(도 4N, 4M 및 40).
더욱이, GT는 골수 오리진으로부터 내피전구세포의 마커인 CD34에 대해 양성인 세포의 유의적인 수적 감소를 나타냈다(도 4 J, 4K 및 4L). 이 결과는 CD34(+) 미성숙 골수세포(iMCs)의 모집과 관련된 CCRI(CCL9/15 수용체)의 하향조절의 MA 관찰을 확증하는 것이다. Ccrl의 결핍은 마우스 간에서 종양 성장을 극적으로 억제한다(Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2010; 13063-13068).
마이크로어레이는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리가 핵에서 mRNA TKB1(NAK)의 고 발현에 의해 강력하게 된 mRNA IkB(2,599)의 상향조절에 따라 p65/RelA(Fc -2,524)에 대해 작용하는 SAT3 및 NF-κB 경로를 하향조절하였음을 보여주었다. WB 및 SW 분석 둘 다 NFκB의 수준이 유의적으로 감소함을 확인함으로써 마이크로어레이 결과를 확증하였다(도 8). NFκB와 Stat3 둘 다 VEGF 및 다른 전-혈관신생 인자들을 증가시켜 암 진행 시 염증과 혈관신생 간의 관계를 통제하는 주요 전사 인자들인 것으로 간주된다(Curr Mol Med. 2010; 10:369-373).
TGFBR1 및 TGFBR2는 상향-조절되어 있고, TGFβ는 이 분석에서 하향-조절되어 있는 것으로 밝혀졌다. MA 분석에서 TGFβ의 하향 조절은 qPCR 및 IHC에 의해 확인되었다(도 7H, 71 및 7J). TGFR의 조절은 SMAD 복합체의 조절(SMAD2의 활성화 및 SMAD3의 억제), 그리고, E2F7의 활성화 및 E2F6과 E2F4의 억제에서의 부분적인 변화에 관련될 것이다. 이는 사이클린-C의 하향조절뿐만 아니라 사이클린-B2 및 CDK2AP1의 상향조절과 연관되어 있다. TGFβ는 다른 메커니즘들 중에서 혈관신생 촉진을 통해 암 진행을 초래한다(Tian et al. Transforming growth factor- f3 and the hallmarks of cancer. Cell Signal. 2010).
저산소증 신호전달경로의 주요 매개체인 Hypoxia Inducible Factor 1(HIF-1)의 하향조절(Fc -2.464) 뿐만 아니라 서브유닛 억제제(HIFl AN, FC 3.713) mRNA HIFl의 현저한 하향조절이 관찰되었다. APEX1(Fc -2.387)의 하향조절은 HIFla의 더 낮은 존재와 관련이 있을 것이며, 또한, MMP2(Fc -3.108) 및 MMP14(Fc 3.890) 같은 매트릭스 메탈로펩티데이즈 복합체의 감소된 전사와 관련이 있을 것이다. HIFl의 억제는 탐지할 수 없는 mRNA VEGF 발현과 더 낮은 혈관신생 유도와 관련이 있을 것이다(FEBS J. 2009: 509-518). WB 및 IHC 분석(도 7K, 7L, 7N, 7M, 70)은 마이크로어레이 및 qPCR 결과를 확인시켜 줌을 관찰되었다.
아마도 핵에서 탐지할 수 없는 mRNA STAT5 존재와 관련이 있을 PPARa 발현(Fc 7.007)에서 중요한 증가가 발견되었다. mRNA PPAR-감마 발현에서의 결핍은 아마도 c-Fos 및 c-Jun과 같은 전사 인자들의 부재와 관련이 있을 것이며, 이는 탐지하 수 없는 COX-2 mRNA 존재에 책임이 있을 것이며, IHC에 의한 COX-2 발현의 급격한 감소에 따른 것일 것이다(도 7P, 7Q 및 7R). PPARa의 활성화는 CD36 e ABCA1, ABCA2 및 ABCA 10의 상향조절과 연관이 있을 것이다. 이 신호전달경로는 혈관신생의 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 억제를 위한 하나 이상의 메커니즘을 지원한다. 왜냐하면, PPARs 길항제들은 항-혈관신생 반응의 강력한 매개체이며, PPAR 항진제는 암 치료 시 필연적인 옵션으로 현재 본 연구에서 포함된다(PPAR Res. 2010; 81:4609).
그리하여, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 혈관 붕괴 및 항-혈관신생 효과가 다수의 경로들을 표적으로 하는 것은 항-혈관신생 치료에서 한 추세라는 제안에 따른 것이다. 왜냐하면, 신호전달경로를 차단하는 것이 매우 효과적인 것은 아니고, 종양세포는 항-혈관신생 약물에 대해 내성을 유발하고 및/또는 다른 혈관신생 메커니즘을 이용할 것이기 때문이다(CA Cancer J Clin. 2010; 60:222-243).
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 및 암줄기세포)
암줄기세포(CSM)는 종양 기원의 주요 소스이며(J Pathol. 1999; 187: 61-81), 종양 덩어리를 포함하는 더 분화된 세포와 비교하여 세포재생과 세포독성 제제 및 방사선 치료에 의한 세포사멸 유도에 대해 내성이 증가되어 있다(Curr Med Chem. 2008; 3171-3184). 그리하여, CSCs에 대한 치료적 접근들은 현재 임상에서 암 치료를 개선하기 위한 관련 전략들을 대표하는 것으로 사료된다(Curr Med Chem. 2008; 3171-3184; J Clin Invest. 2010; 120: 41-50).
환자들에서 낮은 생존과 관련된 종양줄기세포의 3개의 분류학적 마커들이 본 연구에서 사용되었다: CD133, Oct4 및 메탈로티오네인(J Pathol. 2000; 191:306-312; Ann Surg Oncol. 2009; 16:3488-3498; World J. Surg. 2002; 26:726-731; Mutat Res. 2003; 533:201-209). 대조군 종양에서, 사용된 3개의 줄기세포 마커들이 PN 지역, 종양의 침습 전방에서 주로 발견됨을 관찰한바 있다(도 8 A 내지 8N). PN 지역은 또한 HIF-1 염색이 더 강한 곳이다. 아마도, PN 지역은 저산소 환경을 포함하는 경향이 더 많고, 저산소증은 HIF-1 알파를 활성화하여 암줄기세포로의 그들의 변형을 촉진하며, 그들의 분화를 억제하여 CD133-양성세포의 자기-재생 활성을 향상시킨다(Oncogene 2009; 45:, 3949-3959). 흥미롭게도, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ은 CSCs의 현저한 수적 감소와 연관이 있는 것으로 관찰되었다. 그럼에도, 이 결과를 뒷받침하는 메커니즘은 전적으로 설명이 필요한 채로 남아있다. 혈관 변화로 말미암은 직접적인 세포 괴사는 그것에 대한 주요 메커니즘일 수 있다는 것은 설득력이 없다. 왜냐하면, CSCs는 저산소 조건에서 상당히 내성이 있기 때문이다.
대조군 종양들은 주변-괴사 지역(peri-necrotic areas, PN)에서 둥근 메탈로티오네인-과발현하는 세포(MTOEC)를 다수 보여주며, 종양 경계을 따라 방추형 MTOEC는 서로연결한 척수로 조직되고, 신생 혈관과 밀접하게 연관되어 있다(도 8I,J, L, N 및 M). 본 연구에서, 마이크로어레이 분석은 MT 발현에서 qPCR 및 IHC에 의해 확인된 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-관련된 감소를 보여주었다. 더욱이, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ는 또한 MTOEC의 출현과 공간 조직을 강하게 억제하였다(도 8I 내지 8N). 이는 혈관신생에 중요하고 부정적으로 영향을 미칠 것이다. 왜냐하면, MT는 혈관신생 과정에서 주요 조절 기능들을 가지고 있기 때문이다(J Cereb Blood Flow Metab. 2000; 20:1174-1189).
CSCs와 내피세포 간에 신호전달의 주요 교환이 있고(Nat Rev Cancer 2007; 7:733-736), 어떤 종양들에서 CSCs는 우선적으로 종양 혈관에 인접한 특정 지대에 있거나, 아니면 그들이 순응해 왔던 초라하게 흩뿌려진 저산소 지역에서 만들어진다(Nature 2006; 441:1075-1079). CSCs 스스로 혈관신생 인자들을 생성할 것이며, 자기-재생 및 장기간 성장을 유지하기 위해 스스로 맥관구조에 의해 생성된 인자들에 의존하게 된다(Nat Rev Cancer 2010; 2:138-146). 이러한 이유로, 활성산소종이 p38-MAPK-매개된 증식을 유도하여 CSCs 고갈을 초래하기 때문에 산화적 스트레스로부터 그들을 보호하기 위해 CSCs가 저산소 틈새를 필요로 함을 고려하여 CSCs와 그들의 미세환경을 표적으로 하는 새로운 암 치료법들이 최근에 제안되어 왔다(Nat Rev Cancer 2010; 2:138-146; Curr. Opin. Hematol .2008; 522- 528). 이 결과를 기반으로 하여, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 이러한 타입의 치료에 적합할 것으로 추천받을 수 있다. 왜냐하면, 혈관에 연계된 CSCs의 수적 감소와 관련될 뿐만 아니라 CSCs 틈새를 교란하면서 MTOEC와 신생혈관의 공간 조직을 붕괴하기 때문이다. CSCs의 표현형과 생물학적 거동이 뒤집히거나, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 같은 다발성-신호전달 분자의 작용에 의해 전환되는 것은 상상할 수 없는 것으로 추정되었다.
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 및 세포사멸 유도)
2개의 잘 알려진 세포사멸 마커들, 즉, TUNEL 기술 및 카스파제-3에 의해 보여주는 바와 같이, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 마우스에서 종양들은 대조군 보다 더 많은 세포사멸 세포를 포함하고 있었다(도 8O 내지 8T). 이 결과는 아마도 이들 지역에서 NFκB 및 HIF-1억제와 관련이 있을 것이다. 왜냐하면 두 인자들은 세포사멸의 강력한 억제제들이기 때문이다. 또한, 이는 이들 영역에서 CSCs의 수적 감소와 연관이 있을 것이다. PCNA 염색을 숙고해볼 때, 사이클린 Dl 발현의 증가에도 증식 지수는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 처리에 의해 유의적으로 영향을 받지는 않았다(P=0.14).
생존/항-세포사멸 경로의 활성화는 암세포의 공통된 특징이며, 세포독성 제제에 대한 내성과 연관이 있다. 또한 약물 처리에 대한 세포성 반응에서 관련된 생존 경로는 주로 성장 인자들에 의해 활성화된 신호전달을 매개하고, 세포 증식, 대사, 세포사멸 및 혈관신생을 포함한 중요한 과정들의 조절에서 역할을 담당하는 PI3K/Akt 및 Ras/MAPK이다. 우리의 연구에서, AKT 복합체(Fc - 2,021 ; ΡΚΒα, ΡΚΒβ, RAC, RACa, PKB/AKT)의 높은 하향조절과 더불어 mRNA AKTl도 하향조절되었다(Fc -2,021). p65/ReIA 활성화에 대한 조절을 추진하면서 아마도 GAB 복합체 (GABl 1,511 및 GAB2 1,569)의 활성화로 말미암아 PI3K 복합체(PIK3AP1 -1,856; PIK3C3 1,549)의 경미한 하향조절이 연관되어 응하게 된다. FGFRL1 및 FGFR1의 상향-조절, PIK3AP1 및 FGF13의 억제는 FGFR3에 이어 PI4K2A의 활성화와 연관이 있었다. 전적으로 이들 조절들은 아마도 GAB 복합체(GABl 1,511 및 GAB2 1,569)의 활성화 및 주로 복합체 AIFM2 및 AIFM3에 의해 촉진된 카스파제 2 및 9의 발현 억제 감소에 의해 P13K 복합체(PIK3AP1 -1,856; PIK3C3 1,549)에서의 하향-조절과 관련될 것이. Wnt는 Wnt5A의 현저한 억제와 더불어 WIF1에 의해 하향-조절되었다.
더욱이, MAPK 복합체의 중요한 하향조절 또한 주로 MAP2Kl(Fc -3,155), MAPKAPK2(Fc -2,501), MAPK12(Fc -2,245), MAP4K3(Fc -2,153), MAP4K5(Fc -2,149) 및 MAPK14(Fc -2,082)에서 관찰되었다. 사이클린 복합체는 NF-κB 복합체 조절에 의존할지도 모른 결과들을 나타냈다. 그리하여, D3, Al 및 B2(Fc 3,775; 1,528 및 1,676) 같은 사이클린 복합체는 사이클린 C의 하향조절(Fc -1727)에도 불구하고 상향조절되었다. 동시에, 억제제 복합체들은 사이클린 활성화에 직접적인 균형을 주어 pl9 INK4D(Fc 1,871) 및 pl5 INK4B(1,523)처럼 활성화되었다. 이는 mRNA 카스파제 3 점수가 변하지 않음에도, mRNA BID(Fc 1,505)의 상향조절뿐만 아니라 tBID 및 BIM 증가에 비례한 13c 1 XL(Fc -1,601)의 감소, 마지막으로 카스파제 9(2,6343) 및 카스파제 2(1,530)의 높은 상향조절이 수반되었다. SCID 마우스는 면역결핍성이기 때문에, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 의한 종양 억제 및 세포사멸 유도는 숙주 면역 기능과 유력한 항-혈관신생 결과 또는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 직접적인 종양세포 치사 효과를 요구하지 않는다.
이는 단기간 실험이었기 때문에, 치료에 대한 종양 방어 시스템을 평가하는 것이 가능하지 않았다. 그럼에도, MT, ABCB4 및 HSP70 (HSPA1A) (Anticancer Res. 2005; 2661-2668; Mol Cell 2009;15-27) 같은, 화학요법에 대한 내성과 관련된 어떤 가장 주목할만한 유전자들은 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ-처리된 종양들이 치료에 대한 중요한 내성을 나타내지 않게 할 가능성을 크게 한다.
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 및 종양 조직 조직화)
종양 조직들은 보통 완전히 무질서하고, 난잡하게 되는 것으로 여겨졌다. 그럼에도, 최근에, 악성 종양들이 다른 생물학적 시스템에서 알려진 적응 거동과 유사하게 진화한 다세포성 집단 패턴을 발생할 수 있는 복잡한 동적이고 스스로 조직하는 생체시스템을 나타낸다는 반박이 있어 왔다. 이는 환경 조건들과 악성 종양들의 침습 동안 집단적인 세포 이동이 흔히 있다는 늘어나는 증거와 같이 집단적인 의사 결정의 총괄적인 감지를 포함한다(BioEssays 2009; 31:190-197). 그리하여, 다른, 개념상의 새로운 전략이 제안되어 왔고, 세포 무리의 정보 과정을 "방해하는" 쪽으로 조정하게 될 것이다. 즉, 만약 세포-세포 연락이 중단되거나 치료적으로 적어도 심하게 방해를 받는다면, 아마 틀림없이 시스템 전체가 느려지게 될 것이다. 대조군에서, 종양세포들이 주로 침습 전방에서 보통 척수에 스스로 배열되어(선처럼), 망상 척수 네트워크를 형성하면서 혈관 근처 및 주변의 유사한 구조들과 연락하는 것이 관찰된바 있다(도 4F 및 4H). 흥미롭게도, 종양 조직의 "조직 파괴"는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 효과 때문인 것으로 밝혀졌다. GT 그룹에서, 종양세포는 매우 빈번하게 척수 조직을 상실하고, 미세혈관은 뒤틀리거나 끊어지게 되며, 조직 세포 조직화의 중요한 상실을 특징으로 하는 적혈구 세포의 누출이 나타났다(도 4G 및 4I). 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ는 또한 조직적인 종양 신호전달 시스템을 끊으며, 이는 추가적인 조사가 필요함을 시사한다. 흥미롭게도, 마이크로어레이 분석은 어떤 암에서 높게 발현되는 밀착연접(tight junction) 구조의 트랜스멤브레인인 클라우딘-4(CLDN4); eIF4E 억제에 대한 종양 조직의 민감성 때문에 암에 대해 치명적인 급소(Achilles' heel)가 되도록 한다고 간주하여 온 EIF4E(Cancer Res. 2008; 631-634); 최근에, 전이 형성에 기여할 수도 있는 새로운 세포 점착 분자 세트에 포함된 DSC2(데스모솜 단백질){Cancer Res. 2008; 68:6092- 6099); 종양세포 증식과 침습에서 역할을 담당하는 매트릭스 메틸로프로티네이즈, MMP13(Oncol Rep. 2010; 1241-1247); 및 정통적 WNT 신호전달경로의 활성화를 억제하고 암 성장을 반박할 증가된 발현을 갖는 Wnt-5a(Br J Cancer. 2009; 209-214) 같이, 조직의 구조적 조직화에 연관된 어떤 중요한 유전자들의 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 의한 하향조절을 보여주었다(Cancer Sci. 2009; 1623-1630).
결론적으로, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 항-암 효과는 단일 표적 치료 패러다임에 의해 설명될 수 없는 것이 명백한 것 같다. 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 효과를 이해하기 위해, 도 9에 나타난 바와 같이, 생존에 대한 싸움에서 그들의 유전자 반응들을 적응시키는 다-세포성 유기체처럼 종양에 대한 포괄적인 관점이 필요하다. 이 적응에서 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 효과는 암 치료에서 새로운 패러다임에 대한 시각을 탈피할 것이다. JA는 유전자 조절자이다. 백만 년 동안 식물 진화 종들에서 이례적으로 보존되어 있고, 생물 공격자들의 엄청난 범위에 대해 성장과 방어 반응 간의 복잡한 균형을 조절하는데 작동하여 빠르게 변화하는 환경들에서 식물 적응을 최적화한다(Curr Opin Plant Biol. 2008; 11:428-435).
도 9에서, 검은색 화살표는 신호 전달된 저산소증을 표시한다; 파란색 커트 라인은 신호 전달된 저산소증의 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 차단을 표시한다; 그리고, 파란색 화살표는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 유도를 표시한다. 성장하는 조직의 요구와 혈관 공급 간의 조화 부족은 어떤 종양 지역들에서 산소 공급의 부족을 초래한다. 유축형 환경에서 머물러 있는 가장 영향을 받는 것들은 결국 조직 괴사를 나타낸다. 이들 괴사 초점을 둘러싸고, 생존 신호전달의 강력한 활성화를 통해 세포가 적응하고 생존하도록 할 산소의 덜 집중적인 부족인 저산소증을 가지는 주변-괴사 영역(peri-necrotic regions, PNA)이 있다. 그리하여, 우리는 이 영역이 NFκB, HIF-1, TGFβ, COX-2의 고 발현을 나타냄을 관찰하였다. 이들 분자들의 높은 수준은 차례로 또한 조직 성장을 촉진하는 성장 인자들을 방출하고, 세포사멸을 감소하며 혈관신생을 촉진하는 줄기세포 표현형을 활성화한다. 이러한 이유로, 감소된 세포사멸 지수를 갖는(TUNEL 및 카스파제-3에 의해) 고전적인 암줄기세포 마커: CD133, Oct4 및 MT에 대해 양성인 세포들의 높은 수를 발견하였다. 그래서, PNAs는 종양 성장과 저산소증에 대한 내성을 촉진하고 치료하는 신호전달 공장으로서 일한다.
CSCs는 또한 침습 전방(IF) 영역에서 축적되고, 혈관과 가까운 근접 거리로 이동하여 이웃하는 조직 침습을 지원한다. CSCs와 내피세포의 가까운 근접 거리는 종양 가장자리에서 파라크린 신호전달 네트워크를 세운다. 이 파트너쉽은 CSCs에 의한 촉진의 결과와 종양 신생 혈관에 의해 제공된 상대적으로 쉬운 혈액 공급으로 종양세포 침습성을 증가시킨다.
이 이론적 모델에서, 놀목식(normoxic) 영역에서 종양세포의 종양 핵은 줄기세포와 조직 성장 인자들이 적은 상당히 완화된 대사 및 성장에 머물러 있다. 이들 세포들은 예비군 타입을 제공한다. 그들 중 어떤 것들은 저산소증 또는 다른 공격이 그들에게 도달하는 경우 CSCs 표현형으로 전환될 것이나, 그들 중 대다수는 종양 발달에서만 서서히 증식하여 공간을 채울 것이다.
사이클로덱스트린-전달되는 MDJ는 혈관신생을 차단하고, 존재하는 혈관을 붕괴하고, 저산소증을 증가시켜 종양 생존 및 성장을 위한 신호(HIF-1, NFκB, MT, MAPK, 줄기세포 인자들)를 유발한다. 그럼에도, 이는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 대부분의 이들 주요 신호전달 시스템을 적어도 동시에 억제한다는 사실에 의해 회피된다. 그리하여, 종양은 증가된 저산소 상태에 반응할 수 없고, 큰 괴사 지역은 종양이 거의 제거될 때까지 종양 수축을 위한 최적 조건을 제공하면서 점차 종양 조직을 대체한다.
사이클로덱스트린-전달되는 MDJ이 종양과 접촉하게 될 때, 혈관신생을 억제하고 세포사멸과 혈관 붕괴를 유도할 뿐만 아니라 그들이 저산소증과 조직 손상을 나타낼 때 종양들에 의해 활성화되는 주요 생존 신호전달 시스템을 억제한다. 그리하여, 우리는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ가 종양 맥관구조에 직접적인 영향을 초래하여 괴사의 광대한 지역 형성을 유발하고, 이는 종양 방어 신호전달 시스템의 억제와 연합되어 있음을 관찰하였다.
CSCs의 수적 감소는 적어도 두 가지 주요 결과를 초래한다. 첫째, 종양은 아마도 촉진 인자들의 그것의 주요 소스를 상실할 것이다. 둘째, CSCs는 암 치료와 저산소증에 훨씬 더 내성이 있기 때문에, 종양이 첫 번째 영향으로부터 회복하지 못하고 치료에 대해 내성을 발생시킬 가능성이 크다.
실시예 6: 시험관내 혈관신생 분석과 생체 내 병아리 융모요막(CAM) 측정
사용된 세포주: 사람 탯줄 내피(HUVEC) 유래의 비-종양 세포 및 흑색종, B16F10 쥐 종양의 종양세포. HUVECs는 FCF-USP의 임상 독성 분석부, Dra. Dulcinea Saes Parra Abdalla로부터 제공받았고, B16F10 쥐 흑색종 세포는 UFSCar의 생리 분자 생물학부, Marcia Cominetti 교수로부터 제공받았다. 두 균주들은 10% 소태아혈청(fetal calf serum)이 부가된 RPMI에서 성장되었다. 두 세포 타입들의 형태적 관찰은 공통된 메커니즘을 제안하였다. 혈관신생에 대한 효과의 예비 조사는 또한 HUVEC를 사용하여 시험관내에서 이루어졌다. 측정은 공초점 현미경(Mitotracker Red)에 의한 미토콘드리아 활성의 유세포 분석(프로피디움 아이오다이드 및 아크리딘 오렌지) 평가에 의해 세포 주기를 연구하기 위해 착수되었고, HUVEC에 의한 VEGF 및 PGE2 생산 측정을 위해 상업적인 항체들로 ELISA에 의해 세포 배양 상등액을 수행하였다.
계란을 사용한 실험을 위해, 온도 조절된 인큐베이터에서 제어된 온도 및 습도에서 배양된 야생 들닭(Gallus gallus)의 계란 흰자를 사용하였다. 계란을 놓는 기라겜(giragem)이 있거나 없게 하여 인큐베이션하였다. 껍질(bark)의 상단 표면에 있는 표시는 이 과정을 제어하는 데 사용하였다. 70% 에탄올에 적신 탈지면으로 계란껍질을 주의 깊게 세척한 후 인큐베이션 4일째에 계란을 열었다. 오프닝(opening)은 그들이 부화되고, 플라스틱 홀더 상에 받치고, 위쪽 표면에 표시된 곳과 같은 위치에서 계란을 유지하면서 층류에서 수행하였다. 실험 과정은 20세기 전반에 발행된 프로젝트에 맞게 변경하고 다듬었다. 이 방법에 대한 설명이 전개되어 있다.
오프닝은 끝이 뾰족하고 굽은 수술용 작은 가위, 핀셋 정밀 수술, 투명 테이프, 폐기용 용기, 파스퇴르 피펫, 일회용 바늘 및 주사기, 플라스틱 또는 계란용 마분지를 사용하여 수행하였다.
첫 번째 연습은 껍질 아래에서 한 지역을 얻을 수 있게 계란을 열기 위해 수행하였다. pDesta 길, 창문 위쪽 표면을 개방하면 관찰 위치에서 남아있는 계란의 내용물을 넘치게 하지 않고서도 할 수 있다. 계란의 에어 챔버를 통해 서서히 주입되고, 개시 각이 45인, 바늘 BD 25×8이 결합된 3mL 주사기를 대략 석션으로부터 알부민만을 충분히 수집하는 위치까지 사용하였다. 크래킹을 피하면서 주의 깊게 천공하였다. 난황이나 공기 같이 두꺼운 알부민의 제거를 피하거나, 난황의 제거는 배아를 탈선하게 할 수 있고, 배아 생존을 위태롭게 하면서 그것이 돌아오게 할 수 있는 공기를 제거한다.
최저로 유지하고 배아 없이 계란을 오프닝할 수 있게 각 계란에서 난황낭으로 옮긴 대략 5mL의 알부민을 껍질에 부착시켜 눈에 보이도록 하였다. 바늘 삽입 구멍을 막을 정도의 수 밀리리터를 남겨두고, 알부민을 적당한 용기에 버렸다. 알코올을 그 부위에 똑똑 떨어뜨려 침전된 자체의 계란 알부민으로 상기 구멍을 막았다. 누수를 억제하기 위한 관리 및 주의는 부화장의 오염 위험을 최소화하는데 중요하다. 필요하다면, 그 부위에 멤브레인이 관찰될 때까지 하나 이상의 알부민 방울을 구멍에 바르고 여기에 알코올을 똑똑 떨어뜨릴 수 있다.
끝이 뾰족하고 굽은 가위를 사용하여, 계란에 열을 가하는 면의 가장 높은 부분인 그라파이트 표지의 옆에 주의 깊게 계란껍질에 구멍을 뚫었다. 구멍을 뚫은 후, 크랙이 생기는 것을 피하면서 문자 "U"의 형태로 베인 자리가 형성될 때까지 껍질을 서서히 절단하였다. 마지막으로, 코트의 시작 지점에서 도입되는데 사용된 클램프는 제거하고, 창문 형성을 완성한다. 이 단계에서 배아 손상을 피하기 위해 가위의 도입과 조작을 관리하였다. 배아가 매우 미숙할 때, 껍질이 더 단단하고, 관찰하기가 더 어렵다. 더욱이, 더 성숙한 배아는 계란껍질에 붙어있는 최대 그리고 대부분의 CAM을 갖고 있어 상기 과정 동안 손상 위험이 증가한다. 계란 오프닝의 이상적인 시간은 인큐베이션 4일로 표준화되었다. 이 시기 동안, 손상에 따른 손실이 일어나는 것을 피하고 계란껍질에서 열린 창은 동맥과 정맥의 특징적인 배열을 갖는 CAM의 배 밖의 조직과 배아를 쉽게 관찰할 수 있게 한다.
상기 창은 배아를 보호하기 위해 투명 테이프 조각으로 덮어두었다. 계란은 인큐베이션 온도로 되돌렸다. 인공부화기의 일시적 중단은 최소여야 한다. 왜냐하면, 수명의 이 시기에서, 배아는 스스로 열을 생산할 능력이 없기 때문이다. 적당한 발생은 온도와 습도의 환경 조건에 달려있다.
창문의 열기 및 닫기 후 모든 계란을 초기 조건과 동일한 인큐베이터에 정치하고, 대체로 7일간 추가로 유지하였다. 이 간격에서, 혈관신생 테스트 또는 생체 내에서 종양 성장에 대한 연구를 수행하였다. 종양세포가 접종된 계란에서 혈관신생 관찰은 사실상 혈관신생의 같은 테스트 모델을 따른다. 순수 MDJ(cis/trans 96% 순수, Sigma에서 구입) 또는 상기 실시예 3에서 만든 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에의 노출은 14일까지 인큐베이터에 남아있는 계란을 사용하여 8일째에 수행되었다. 흑색종 세포의 접종은 8일째에 순수 MDJ 또는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ를 받은 계란에서 수행하였고, 남아있는 계란은 14일까지 인큐베이션하였다. 프로토콜의 전개 동안, 접종 및 처리 시간을 조정하였다. 수집 동안 그리고 이미지를 얻기 위한 관리는 모든 실험에서 표준화하였다.
각 테스트에서 규정된 기간 끝에, 인큐베이터에서 계란을 치우고 적어도 30분 동안 배아의 심장 박동이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 냉장고에서 차게 식혔다. 이 현상을 확인한 후, 테이프를 떼어내고, 소량의 4%의 포름알데히드를 CAM에 똑똑 떨어뜨렸다. 고정근은 20분 동안 유지하였다. 그 후 멤브레인을 회수하고, 새롭게 가공하였다. 혈관 함량의 적당한 보존에 의존하여 얻은 이미지의 품질은 사용하지 않거나 염료 주사와 대비하였다.
간단한 고정 후, 겉껍질을 깨뜨리고, 불활성 배아를 페트리 디쉬에 정치하였다. 주 혈관은 배아의 복부에서 삽입 지점 근처에 면사를 사용하여 3중 매듭으로 묶었다. 그리고 나서, 다른 조직들에서 CAM을 분리하고, 차가운 생리식염수로 빠르게 세척하여 난황 폐기물을 제거하고, 최소량의 유체를 사용하여 멤브레인에서 거품, 크랙 또는 접힘이 형성되지 않도록 하여 현미경 슬라이드에 펼쳐놓았다. 형성된 액체 필름에 거품이 형성되지 않도록 멤브레인 위에 현미경 커버 슬립을 덮은 후 관찰하였다. 명시야 하에서 관찰하기 위해 필터 없이, 약간 확대하면서 확대경을 조정하였다(일반적으로, 어떤 예시에서 구체적인 관찰을 위해 2×에서 5× 내지 10×로 확대하였다). 이미지는 각 테스트의 경우 같은 조건과 조절 가능한 조명, 그림자 및 화이트 밸런스를 유지하면서 Nikon SMZ1800 stereomicroscopy Magnifier에 부착된 DS-Ul 카메라를 위한 프로그램 ACT-2U를 사용하여 고해상도에서 캡쳐 후 TIFF 파일로 스캔하였다. 각 실험에서, 이미지는 분석 물질의 이미지를 표준화하기 위해 조명과 색 보정이 유지된 펀드(fund)에서 캡쳐하였다. 암시야 이미지를 위해 보정이 반복되고, 같은 보정을 확대하였다.
같은 샘플의 각 영역은 구체적인 더 나은 관찰을 위해 명시야와 암시야에서 영상화되었다. 혈관 망상의 성장은 명시야 2개의 이미지에서 이미지를 가공하여 프로그램 Image J로 분석하였다. 비록 이 가능성이 또한 연구된바 있으나, 정량적인 결과의 수집이 가능한 기술은 명시야와 암시야의 이미지를 결합한 측정에 의존하지 않는다. 본 연구는 자체 수집의 정제 및 물질의 예비 가공을 안내하는 것이 중요하였다. 그리고 나서, 2개의 이미지를 조립하기 위해 가능한 한 간단한 분석 알고리즘으로 대체하였다. 2개의 이미지에서 배경 이미지로 정상화된 명시야의 가공 이미지를 위한 과정은 정제되고 표준화된바 있다. Image J를 위한 플러그인이 개발되어, 이진화의 임계값의 단일 보정 동안, 결과 이미지의 연속적인 관찰이 가능하다. 이 일반적인 알고리즘 가공에 따라 각 전체 테스트를 분석하고, 이미지의 각 배치에 대한 이원화 임계값 세트를 가공하고 연속적으로 분석하였다.
정량적 분석 및 부가적인 문서 조사를 위해, 32×250× 확대로, 광학 현미경 대물(objective) Jenamed에 결합된 Canon PowerShot A640 카메라를 사용하여 이미지를 얻었다.
대표적인 접종물은 10mL 미만의 배양 배지 부피에서 2×104 세포/계란으로 있다. 흑색종 성장은 확대경과 현미경을 사용하여 CAM에서 색소침착된 덩어리 형성에 대한 시각적 검사가 동반되었다. 확대경을 이용한 암시야 이미지에서 불투명체의 관찰은 색소가 여전히 거의 보이지 않을 때조차 종양세포 성장의 위치를 명시하였다. 현미경 하에서, 세포는 티오닌(Thionin) 또는 0.1% 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 고정되지 않은 물질을 염색한 후에도 관찰되었다. 두 염료의 경우, 산 알코올을 이용한 분화가 정상 조직 대비 개선되었고, 슬라이드의 파일을 허용하였다. 이 방식에서 염색된 물질의 정량적 분석은 수행하지 않았다. 왜냐하면, 여태까지는, 알코올을 이용한 물질의 탈수는 혈관 직경을 변화시키고, 얻어진 염색 패턴은 재현성과 대조하기에 적당한 품질을 보여주지 않았기 때문이다.
그리고 나서, 세포 배양에서 테스트 된 MDJ 및 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 용량을 60mL/계란의 고정 부피로 간주한 계란 모델에 합쳤다.
사용된 계란은 샘플링에 의해 측정되고, 10% 이하의 표준편차를 갖도록 테스팅 기간 내내 60mL의 평균 부피를 유지하였다. 처리는 테스트의 목적에 따라 다른 방식으로 수행하였다. 실현 가능성 연구를 위해, 계란을 개방하기 전 인큐베이션 3일에 옮긴 알부민에서 처리를 수행하고, 용액 준비일까지 37℃에서 유지하고, 같은 바늘 구멍으로 그 계란에 돌려주었다. 유압 증가와 그것의 관외 유출을 피하기 위해 새로운 부피를 제거하기 전에 7일째에 계란에 알부민을 다시 도입하였다. 생존능의 테스트는 10일까지 모니터링 하였다. 항종양 효과 연구를 위해, 인큐베이션 11일째에 CAM 상에 일회량을 처리하였다. CAM에 대한 처리의 실현 가능성은 알부민 처리의 생존능과 비교하였다.
생체 내에서 혈관신생에 대한 효과는 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ의 항종양 작용에서 새로운 프로파일을 나타냈다.
MDJ는 배양 시 흑색종 세포와 HUVEC에서 독성이 있음이 입증되었다. 세포 배양에서, 활성 물질은 매우 유사한 농도에서 항-혈관신생 및 항암 효과를 발휘함을 발견하였다. 각 세포 타입에 대한 독성 농도를 매우 명확하게 동정하는 것이 가능하였다(도 10 및 11). 독성 테스트에서(MTT), 보존된 미토콘드리아의 활성으로 인한 염료의 환원은 1mM MDJ 미만의 농도에서 일정한 값으로 유지되었다. 이 거동은 밀집한 HUVEC의 세포 배양에서 매우 재현가능하였다. 성장 곡선은 또한 약 20시간의 일정 폴딩 시간(folding time)에서 1mM 이하의 농도에서 보여주었다. 더 높은 농도에서, 미토콘드리아 활성은 위태롭고, 폴딩 시간은 무한대로 된다. 즉, 세포는 분열을 멈추고 죽었다. 쥐 흑색종의 배양에서, 결과는 매우 유사하였고, 독성 농도도 매우 근접했다.
독성 농도에서, MDJ는 두 세포 타입의 세포 형태를 바꾸어 다핵의 자이언트 세포와 배큐올 슈도인클루소스(vacuoles pseudoinclusoes)의 형성을 야기한다.
MDJ의 형태에 대한 효과는 세포사멸 및 자가 소화 작용의 유도는 종양세포뿐만 아니라 내피세포에서도 일어날 수 있어 유세포 분석에 따라 HUVEC의 세포 주기의 좀더 구체적인 연구를 야기함을 시사한다(도 13). 새로운 결과는 내피세포와 종양 간에 공유된 독성 표적에 대한 가설을 재확인하는 것이다(도 13 및 표 3).
추가로, 혈관 생장 인자, VEGF에 대한 효과가 확인되었다.
[표 3]
Figure pat00005
배양 시 내피세포의 미토콘드리아는 MDJ 존재 하에서 활성화를 보여주었다. 이 효과는 저밀도 평판에서 MTT에 대한 반응에서 가장 명백하였다(도 14). 고밀도 평판(2×105 cells/mL)에서는 아니고 이들 조건(l×104 cells/mL) 하에서, HUVEC에서 PGE2 생성이 증가하지 않았다. PGE2의 생성은 보통 이들 세포를 밀집시키나, MDJ의 간접적인 효과를 매개할 수 있다.
내피세포 증식에 대한 독성 효과는 CAM 모델에서 시험관내 및 생체 내에서 확인되었다.
흑색종 세포는 계란의 생존을 감소시켰다. MDJ는 부분적으로 이 생존을 회복시켰다. 모델에서 CAM의 결과는 흑색종 덩어리가 활성 물질의 작용 하에서 용량-의존적인 퇴화를 진행함을 확인하였다.
(사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 대한 테스트)
시험관내에서 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ에 대한 테스트는 HUVEC 및 B16F10에 대한 활성 화합물의 세포독성이 유지되고, 이는 훨씬 더 낮은 용량에서 일어남을 입증하고 있다(도 22). 제형에 사용된 것들과 같은 농도에서 비히클을 불활성화하고, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ 또한 ME1001 사람 암세포주 및 조직에서 테스트 하였다. 유사한 세포독성이 관찰되었다.
그리고 나서, 사이클로덱스트린-전달되는 MDJ를 생체 내 모델에서 테스트 하였다. 첫 번째 연구 결과, 혈관 구조에 대한 활성 물질의 용량의 감소, 그리고, 흑색종의 존재에서 보호 효과를 확인하였다.
실시예 7: 실시예 2의 리포좀-전달된 MDJ를 사용한 시험관내 항-세포 성장 분석 및 생체 내 항-혈관신생 실험
실시예 2에서 제조된 리포좀-전달된 MDJ는 9개의 암세포주에서 테스트 하였다: UACC62 - 흑색종, MCF7 - 암 내성, NCIADR - 다약제내성 유방암, 7860 - 신장암, NC1460 - 폐암, PC03 - 전립선암 내성, OVCAR03 - 난소암, HT29 - 대장암, K562 - 백혈병. 이들 세포주에 실시예 2에서 만든 나노에멀젼을 MDJ 농도별로 처리하였다. 도 26에 나타난 바와 같이, CD-전달된 MDJ는 용량-의존적인 방식으로 종양 성장을 억제하였다. 도 27은 생체 내에서 항-혈관신생 활성에 대한 나노전달체의 크기 효과를 보여준다. 보다 구체적으로, 100-nm 나노전달체를 포함하는 나노에멀젼은 50-nm 나노전달체를 포함하는 나노에멀젼 보다 더 좋은 활성을 나타냈다.
추가로, 도 28에서 입증된 바와 같이, 리포좀-전달된 MDJ는 리포좀의 크기가 100nm 미만일 때 향상된 항-세포 성장 활성을 보여주었다.
실시예 8: 시험관내 항-세포성장 분석
[본 실시예는 하바드 연구를 설명하는 문헌을 기반으로 하였다]
나노전달되는 MDJ(여기서, 나노전달체는 CD, 리포좀, 또는 LDE임)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 다음 11개의 세포주(3개의 백혈병, 2개의 유방암, 1개의 대식세포, 그리고 5개의 전립선암)에서 테스트하였다. 세포는 ATCC에서 제시한 각각의 성장 배지(10% 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신이 부가된 RPMI-1640, DMEM, EMEM 또는 F12-k 배지)에서 성장되었다. 세포주에 대한 구체적인 설명은 아래 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure pat00006
나노전달되는 MDJ 제형은 Milli-Q 물에 녹이고, 실온에서 보관하였다. 사용하기 전에, 오염을 피하기 위해 0.22㎛ 필터를 사용하여 상기 제형을 정제하였다.
각 세포주에서 3×106개의 세포를 6-웰 플레이트의 3개의 웰에 똑같이 분주하고, 오버나이트 동안 성장시켰다. 다음날, 1μΜ MDJ를 포함하는 나노전달되는 MDJ 제형을 하나의 웰에 부가하는 한편, 같은 농도의 빈 나노전달체(또는 나노입자)를 두 번째 웰에 부가하고, 세포를 포함하는 세 번째 웰에는 약물 또는 빈 나노전달체나노전달체래대로 유지하였다("대조군"). 상기 제형의 세포사멸 효과는 처리 후 6시간, 12시간 및 24시간째에 역상 현미경에서 관찰하였다.
나노전달되는 MDJ는 테스트 된 암세포주에서 세포사멸 현상의 큰 효과를 보여주었다. 세포사멸 효과는 테스트 한 세포주 모두에서 관찰되었고, MDJ 처리 6시간 후에 시작하여 24시간 후에 피크에 도달하였다. 어떤 암세포주, 예컨대, TIB-512, CRL-2876 및 CRL-2314는 24시간 후 완전히 또는 거의 완전히 죽었으나(도 38-40 참조), 다른 것들은 평균 60-70%의 세포 죽음을 보여주었다(도 41 참조). 나머지 세포들은 전-세포사멸 시기에 있었다. 분자가 단지 암세포를 표적으로 하는 작용을 나타내므로, 나노-전달체는 암세포로의 효과적인 약물 전달체임을 시사한다. 단지 빈 나노입자를 갖는 대조군 세포들은 세포사멸이 거의 없음을 보여주었다.
와버그 가설(Warburg Hypothesis)로 알려져 있듯이 암세포는 건강한 세포와 비교하여 에너지를 생산하는 방식이 다르다. 이 가설에서, 암세포를 위한 에너지를 생산하는 미토콘드리아는 건강한 세포가 사용하는 산화적 경로 대신에 비-산화적 경로를 이용한다. MJ는 암세포의 미토콘드리아에서 변칙적으로 이를 표적으로 하고, 다른 프로테아제와 카스파제 뿐만 아니라 시토크롬 C의 방출을 유발한다고 보고되어 있다. MJ는 Hep 3B 간암 세포에서 분리한 미토콘드리아에서 팽창을 유도할 수 있으나, 3T3 비-변형된 세포 또는 정상 림프구에서 분리한 미토콘드리아에서는 그렇지 않았다. 시토크롬 C의 방출은 미토콘드리아 막 투과성 변이, 막의 탈분극, 삼투적 팽창을 초래하여 세포사멸을 이끈다. 표 4에 나열된 대식세포주는 비-변형된 세포로 본 연구에서 사용되었고, 세포사멸의 효과가 널리 관찰되지 않았다(도 42 참조).
출원인에 의해 수행된 연구들은 나노전달되는 MDJ가 전사, 번역 및 p53과 별개로 그것의 세포독성 효과를 나타냄을 시사하였다(미도시됨). MDJ 단독에 대한 선행 연구들(미공개됨)은 시험관내에서 유사한 결과를 보여주나, 상기 약물은 생체 내에서 매우 빠르게 분해되어 효과를 보기 위해서는 매우 높은 용량을 필요로 하였다. 나노입자 내에 상기 분자를 캡슐화하여, MDJ는 생체 내에서 분해되지 않으며, 매우 낮은 용량, 예를 들어, 분자 그대로 사용한 것보다 1000배 미만으로 암세포에 처리 시 매우 효과적임을 보여주었다.
등가물
본 발명은 그것의 정신 또는 필수적인 특징들에서 벗어나지 않는 다른 특정 형태로 구체화될 수 있다. 그러므로, 상술한 구체예들은 여기에 기재된 본 발명에 한정하기보다는 모든 설명에 도움이 되는 양상들로 고려되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상술한 설명에 의해서 보다는 오히려 덧붙인 청구항들에 의해 표현되며, 의미 범위 내에 있는 모든 변화와 청구항들의 등가물의 범위는 여기에 포함되는 것을 의미한다.

Claims (26)

  1. 약제학적으로 허용가능한 용매 및 메틸 다이하이드로자스모네이트(MDJ)를 함유하는 다수의 나노전달체 또는 마이크로전달체를 포함하는 약제학적 조성물:
    상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 사이클로덱스트린 또는 덴드리머로 형성되거나 인지질층에 의해 둘러싸인 콜레스테릴 에스터 코어를 포함하는 합성 나노에멀젼 입자(LDEs)이며;
    상기 나노전달체는 1 나노미터(nm) 내지 500 nm의 크기 범위를 가지고; 또는
    상기 마이크로전달체는 1 마이크론 내지 100 마이크론의 크기 범위를 가지며;
    상기 약제학적 조성물은 1nM 내지 1 M의 MDJ 농도를 가진다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노전달체는 사이클로덱스트린으로 형성되고, 3 nm 내지 100 nm의 크기 범위를 가지는 약제학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 사이클로덱스트린 나노전달체는 3.5 nm 내지 11 nm의 크기 범위를 가지는 약제학적 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 사이클로덱스트린 나노전달체는 50 nm 내지 100 nm의 크기 범위를 가지는 약제학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노전달체는 LDEs이고, 30 nm 내지 500 nm의 크기 범위를 가지는 약제학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 LDEs는 50 nm 내지 110 nm의 크기 범위를 가지는 약제학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노전달체는 덴드리머로 형성되고, 2 nm 내지 500 nm의 크기 범위를 가지는 약제학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 덴드리머는 폴리아미도아민(PAMAM)인 약제학적 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MDJ의 농도는 1nM 내지 100 μM의 범위인 약제학적 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MDJ의 농도는 10μM 내지 100 mM의 범위인 약제학적 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MDJ의 농도는 100 mM 내지 1 M의 범위인 약제학적 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 추가로 2-아미노에틸 다이하이드로젠 포스페이트, 3,7-다이메틸-2,6-옥타디엔알, 메틸 살릭실레이트 또는 아브시스산을 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제학적으로 허용가능한 용매는 물, 알콜 또는 이의 혼합물인 약제학적 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 추가로 비-자스모네이트 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 약제학적으로 허용가능한 용매 및 자스모네이트 화합물을 함유하는 다수의 나노전달체 또는 마이크로전달체를 포함하는 약제학적 조성물:
    상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 사이클로덱스트린 또는 덴드리머로 형성되거나 인지질층에 의해 둘러싸인 콜레스테릴 에스터 코어를 포함하는 합성 나노에멀젼 입자(LDEs)이며;
    상기 나노전달체는 1 나노미터(nm) 내지 500 nm의 크기 범위를 가지고; 또는
    상기 마이크로전달체는 1 마이크론 내지 50 마이크론의 크기 범위를 가지며;
    상기 약제학적 조성물은 1nM 내지 1 M의 자스모네이트 화합물 농도를 가진다.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 자스모네이트 화합물은 자스몬산, 7-이소-자스몬산, 9,10-다이하이드로자스몬산, 9,10-다이하이드로-이소자스몬산, 2,3-다이디하이드로자스몬산, 3,4-다이디하이드로자스몬산, 3,7-다이디하이드로자스몬산, 4,5-다이디하이드로자스몬산, 4,5-다이디하이드로-7-이소자스몬산, 쿠쿠르브산(cucurbic acid), 6-에피-쿠쿠르브산, 6-에피-쿠쿠르브산-락톤, 12-하이드록시-자스몬산, 12-하이드록시-자스몬산-락톤, 11-하이드록시-자스몬산, 8-하이드록시-자스몬산, 호모-자스몬산, 다이호모-자스몬산, 11-하이드록시-다이호모-자스몬산, 8-하이드록시-다이호모-자스몬산, 투베론산, 투베론산-O-β-글루코피라노사이드, 쿠쿠르브산-O-β-글루코피라노사이드, 5,6-다이디하이드로-자스몬산, 6,7-다이디하이드로-자스몬산, 7,8-다이디하이드로-자스몬산, 시스-자스몬, 다이하이드로자스몬 및 이의 저급 알킬 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 약제학적 조성물.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 자스모네이트 화합물은 메틸 자스모네이트이고, 1 nM 내지 1 μM의 농도를 가지는 약제학적 조성물.
  18. 제 15 항에 있어서,
    상기 자스모네이트 화합물은 메틸 자스모네이트이고, 1 μM 내지 100 mM의 농도를 가지는 약제학적 조성물.
  19. 제 15 항에 있어서,
    상기 나노전달체 또는 마이크로전달체는 추가로 비-자스모네이트 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 유효량 투여를 포함하는 신생혈관 생성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 신생혈관 생성과 관련된 질환은 암인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 암은 백혈병, 대장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 간암, 피부암, 난소암, 흑색종 또는 육종인 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    상기 신생혈관 생성과 관련된 질환은 염증 질환인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 염증 질환은 염증성 장 질환인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 유효량 투여를 포함하는 NF-κB 관련 장애를 치료하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 NF-κB 관련 장애는 바이러스, 세균 또는 곰팡이 감염인 방법.
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