KR20190112101A - 종양 조직을 위한 바이오 센서 및 종양 치료제, 종양 진단제를 위한 바이오 센서를 위한 선택적 방출 시스템 - Google Patents

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하이코 짐머만
하겐 본 브리센
안드레 슐츠
린다 엘버스키르흐
실비아 바그너
벤자민 피셔
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프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우
유니버시타트 데스 사를란데스
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Abstract

본 발명은 종양 조직을 위한 센서 및 표적 종양 치료 및 진단을 위한 치료/진단제의 국소 방출 시스템에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 종양 치료제 및/또는 종양 진단제를 위한 담체 매트릭스로 사용될 수 있는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔, 특히 알지네이트 겔에 관한 것으로, 상기 겔은 종양 세포 또는 종양 조직에 의해 생성되는 자극, 특히 라이실 옥시다제(LOX) 하에 불안정화될 수 있고, 상기 종양 치료제 및/또는 종양 진단제가 방출될 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 혼입된 종양 치료제 또는 종양 진단제 및 임의적으로 추가적인 리포터 물질을 갖는 양이온 안정화된 생체 고분자 겔을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명과 관련된 일 양태는 환자의 체내에서 종양 특이적 생성물의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물이 투여된 환자의 혈액, 소변, 대변과 같은 생리학적 샘플이 검출되어야 할 종양 특이적 물질과의 접촉으로 인한 겔의 불안정화 후에 방출되는 리포터 물질의 존재 및 양에 대하여 검사되고, 임의적으로 기준값과 비교되는 것을 특징으로 한다.

Description

종양 조직을 위한 바이오 센서 및 종양 치료제, 종양 진단제를 위한 바이오 센서를 위한 선택적 방출 시스템
본 발명은 그 중에서도 종양 조직을 위한 센서 및 표적 종양 치료를 위한 치료제의 국소 방출 시스템에 관한 것이다.
이미 알려진 종양 검출 방법으로는 혈액 및 소변과 같은 체액에서 종양 마커에 대한 실험실 테스트뿐만 아니라 컴퓨터 단층 촬영, 양전자 방출 단층 촬영, 섬광조영술, 초음파 검사 및 내시경 검사와 같은 이미지 생성 방법이 있다. 그러나 의심되는 대상이 암세포를 포함하고 있는지 여부는 세포 및 조직 샘풀에 근거해야만 확실하게 결정될 수 있다. 이는 샘플의 번거로운 수술적 제거(생체 검사, 펑크)와 관련이 있다.
종양 조직에서 종양 치료제의 표적 방출을 위한 약학적 조성물 및 제제 또한 공지되어 있다. 그러나 여전히 건강한 조직으로부터 종양 조직의 구별의 신뢰성 문제 및 부작용과 환자에 대한 신체 손상으로 인한 문제가 있다.
따라서, 본 발명의 기초가 되는 목적은 종양 조직을 국소적이고 특이적으로 확인할 수 있는 수단 또는 특정 종양 조직에서 종양 치료제를 특이적/선택적으로 방출시키기 위한 수단을 제공하는 것이다.
상기 목적은 제 1항에 따른 양이온-안정화된 생체 고분자 겔 또는 청구항 제 13항에 따른 약학적 조성물, 및 청구항 제 17항에 따른 검출 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태 및 바람직한 실시예는 다른 청구항에 개시되어 있다.
본 발명은 종양 치료제, 종양 진단제 및 리포터 물질 등을 포함하는 다양한 물질이 특정한 외부 자극 하에 불안정화되고 혼입된 물질을 방출할 수 있는 양이온-안정화된 담체 매트릭스에 혼입될 수 있고, 추가적으로 종양 조직으로부터 적절한 자극이 생성 및 분비될 수 있다는 사실에 기초한다.
이에 대응하여 본 발명의 일 양태는 종양 치료제 및/또는 종양 진단제의 담체 매트릭스로 사용될 수 있는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔과 관련된 것으로, 상기 생체 고분자 겔은 종양 세포 또는 종양 조직에서 생성된 자극의 존재 하에 불안정화될 수 있고, 종양 치료제 및 종양 진단제가 방출될 수 있다.
본 발명에 적합한 양이온-안정화된 생체 고분자 겔은 전형적으로 충분히 높은 양이온, 전형적으로 Cu2+ 이온, Zn2+ 이온, Ca2+ 이온 또는 이들의 조합과 같은 2가 양이온 농도 하에서 겔 형성 성분을 가교 결합/겔화함으로써 형성될 수 있으며, 상기 겔은 상기 겔로부터 양이온의 일부 또는 전부가 제거되면 불안정화되며, 예를 들어 액화될 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 매우 많은, 심지어 모든 유형의 종양에서 분비되는 라이실 옥시다제 효소(LOX)가 Cu2+이온에 대한 높은 친화성을 가지므로, 구리 이온-안정화된 생체 고분자 겔, 예를 들어, 알지네이트 겔은 LOX의 존재 하에 구리 이온이 제거되고, 혼입된 물질을 방출하게 된다는 것을 발견하였다.
한편, 종양 조직에 의한 LOX의 증가된 발현의 결과로, 겔에 혼입된 종양 치료제는 종양 조직에서 특이적으로 방출될 수 있고, 다른 한편으로는 겔의 불안정화 및 리포터 물질의 방출은 LOX의 존재를 나타내므로, 이는 종양 조직의 존재를 의미한다.
본 발명에 따른 양이온-안정화 겔의 경우, 추가 성분에 의해 공-안정화가 가능하다. 이러한 공-안정화는 예를 들어, a) 하나 이상의 양이온 부류, 예를 들어 Cu2+ 및 Ca2+, 와의 이온성 가교결합, b) 1개 이상의 이중 결합을 갖는 단량체의 중합에 의한 공유 가교 결합 및/ 또는 1개 이상의 작용기, 예를 들어 알데히드, 를 갖는 단량체의 중축합에 의해 영향을 받을 수 있다.
또한 본 발명에 따른 양이온-안정화 겔은 임의적으로 추가적인 구조 형성 성분, 특히 단량체 및/또는 가교제 성분을 가질 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 추가 성분은 안정화 양이온, 하나 이상의 이중결합을 갖는 단량체 및 하나 이상의 작용기를 갖는 단량체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 양이온-안정화 겔에 대한 구체적인 실시예에서 적어도 하나의 성분, 특히 단량체 또는 중합체 성분은, 화학적으로 개질될 수 있으며, 예를 들어 사이드 작용기와 결합될 수 있다. 상기 사이드 작용기는 예를 들어, 아미드(amide), 에스터(ester) 및 설페이트(sulphate)의 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 양이온-안정화된 생체 고분자 겔은 바람직하게는 각각 알지네이트 겔 또는 알지네이트 매트릭스이다.
상기 생체 고분자 알지네이트의 특징 및 겔화 특성은 다양한 변수를 통해 직접 조절될 수 있다. 알지네이트 단량체의 조절 가능한 구조적 특성의 결과 및 중합체, 가교제 및/또는 유체 농도 변화의 결과로서, 예를 들어 기계적 안정성과 같은 전형적인 겔 속성이 영향을 받을 수 있다. 혼합물 및/또는 공중합, 물질 또는 세포 내포물 및 알지네이트 및/또는 그의 매트릭스 표면에 대한 공유 결합 반응을 포함하는 화학적 변형은 어떠한 문제 없이 추가적으로 가능하다.
더욱 특정한 양태에서, 양이온-안정화된 알지네이트 겔은 1mM 내지 500mM, 바람직하게는 1mM 내지 100mM의 농도로 Cu2+이온을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 겔의 제조에 사용되는 알지네이트 용액의 점도는 1~100 또는 1~50mPas의 점도를 가진다. 그러나 상기 점도는 더욱 클 수 있다.
상기 점도는 약 15mPas보다 큰 것이 바람직하고, 예를 들어 16~50mPas의 범위일 수 있으나, 여기에 제한되는 것은 아니다.
하나의 양태에서, 고점도 알지네이트(예를 들어, 약 0.65% w/v) 용액이 바람직하게 사용될 수 있다. 이 경우에, 상기 점성은 바람직하게는 15mPas보다 클 수 있다.
그러나, 대안적으로 약 1~5mPas(바람직하게는 2~3% w/v의 농도에서)의 점도를 갖는 저점도 알지네이트 또한 사용될 수 있다.
상기 양이온-안정화된 겔은 원칙적으로 이후에 방출될 원하는 물질, 예를 들어 치료제, 진단제, 리포터 물질의 혼입에 적합한 어떠한 형태로든 존재할 수 있다. 상기 겔은 바람직하게는 캡슐 또는 코팅의 형태로 존재한다.
상술한 바와 같이, 상기 자극은 바람직하게는 라이실 옥시다제(LOX)이지만, 종양의 또 다른 금속 의존성 분비물, 예를 들어 금속성 단백질 분해 효소, 특히 Zn 이온을 포함하는 금속성 단백질 분해 효소일 수 있다.
검출되거나 치료되는 종양은 원칙적으로 특별히 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로 소화기 종양, 특히 위암, 소장암, 대장암, 직장암 및 항문암, 을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 종양 치료제 또한 특별히 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 상기 종양 치료제는 수지상 세포, 알킬화제, 대사 길항 물질, 포도필로톡신(podophyllotoxin) 유도체, 국소이성질화 효소 I/II 억제제, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 면역 조절제, 저분자량 키나제(kinase) 억제제(sm-KIs), mTOR 억제제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
원하는 종양 치료제/진단제의 분자 크기가 상기 겔 매트릭스의 공극의 크기보다 작은 경우, 상기 종양 치료제/진단제는 공유 또는 비공유 상호작용 수단을 통해 입자, 중합체와 같은 큰 단위체에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 적어도 하나의 종양 치료제 및/또는 적어도 하나의 종양 진단제뿐만 아니라 담체 매트릭스로서 상술한 바와 같이 정의된 양이온-안정화된 생체 고분자 겔을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한 상기 약학적 조성물은 추가적으로 겔의 불안정화시 방출되는 적어도 하나의 검출 가능한 리포터 물질을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 구체적인 실시 양태에서, 상기 리포터 물질은 대변에서 복구될 수 있는 입자뿐만 아니라 염료, 형광 마커, 예를 들어 시아닌 염료, 소변을 염색하는 식용 색소, 예를 들어, 베타닌, 비타민 B, 메틸렌 블루; 를 포함하는 군에서 선택된다.
원하는 리포터 물질의 분자 크기가 상기 겔 매트릭스의 기공 크기보다 작은 경우, 상기 리포터 물질은 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 입자, 중합체와 같은 보다 큰 단위체에 결합시킬 수 있다.
상기 약학적 조성물은 바람직하게는 경구 또는 직장 투여용으로 제형화된다.
본 발명에 따른 방출 시스템 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 특별한 이점은 치료될 종양의 부위가 효과적인 치료를 위하여 정확히 알려질 필요가 없다는 사실에 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상술한 바와 같은 양이온-안정화된 생체고분자 겔과 종양 세포 또는 종양 조직을 접촉시키는 것을 포함하는, 라이실 옥시다제와 같은 종양 특이적 생성물의 존재 및 양을 검출하기 위한 방법, 특히 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상기 겔은 상기 종양 특이적 생성물의 존재 하에 상기 종양 특이적 생성물의 양에 의존하여 완전히 또는 부분적으로 불안정화되고, 불안정화의 정도가 검출될 수 있으며, 임의적으로 기준값과 비교될 수 있다.
상기 방법의 구체적인 실시 양태에 있어서, 상기 생체 고분자 겔은 겔의 불안정화시 방출되고 및/또는 겔의 불안정화 정도를 지시할 수 있는 검출 가능한 특성의 변화, 예를 들어 색 변화, 형광 방출 또는 흡수 파장의 변화 또는 형광 수명의 변화를 나타내는 적어도 하나의 리포터 물질, 예를 들어 염료 또는 형광 마커를 포함한다.
상기 방법에서, 상기 겔의 완전 또는 부분적인 불안정화의 검출은 육안 관찰, 또는 분광기 또는 분광계적인 방법, 특히 가시광선 분광법, 형광 분광법, 시간-분해 형광 분광법, FRET 분광법 등의 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관련 양태는 환자 체내의 종양 특이적 물질의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로, 상술한 바와 같은 약학적 조성물이 투여된 환자의 혈액, 소변, 대변과 같은 생리학적 샘플이 검출되어야 할 종양 특이적 물질과의 접촉으로 인한 겔의 불안정화 후에 방출되는 리포터 물질의 존재 및 양에 대하여 검사되고, 임의적으로 기준값과 비교되는 것을 특징으로 한다. 방출량의 감소는 종양 치료가 성공했음을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 종양 조직을 국소적이고 특이적으로 확인할 수 있는 수 있으며, 특정 종양 조직에서 종양 치료제를 특이적/선택적으로 방출시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 센서 또는 선택적 방출 시스템의 원리를 개략적으로 도시한다.
도 2는 라이실 옥시다제를 첨가한 후 구리/알지네이트 매트릭스로부터 리포터 물질(FITC dextran)의 방출을 나타낸다.
도 3은 라이실 옥시다제의 첨가 후 구리/알지네이트 매트릭스의 기계적 안정성의 감소를 나타낸다.
실시예 1
알지네이트/구리 매트릭스의 제조
하기와 같은 반응물 및 파라미터를 사용하여 알지네이트/구리 매트릭스를 제조하였다.
- NaCl 용액
·증류수에서 0.9 % (w/v)
·삼투압농도(Osmolarity): 290-300 mOsmol
·pH: 7.0~7.5
·0.9% (w/v) NaCl 수용액에서 0.65 % (w/v)
·해조류로서 Lessonia trabeculata 및 Lessonia nigrescens 로부터 얻은 알지네이트를 1:1로 혼합
·점성 > 15 mPas
-CuSO4·5H2O 용액
·증류수에서 20 mM
·삼투압농도(Osmolarity): 290-300 mOsmol
상기 알지네이트 용액은 공개된 미국특허출원 제 2005-0158395 A1호(Device and method for producing a cross-linked substance, especially in the form of a microcapsule or layer, Ulrich Zimmermann, Heiko Zimmermann, 2003)에 기술된 바와 같이 Cu2+ 가교제(CuSO4·5H2O 용액 형태)로 가교되었다.
이 경우 전형적으로 직경이 30~1000 μm인 겔 입자 또는 겔 캡슐이 생성된다.
실시예 2
알지네이트/구리 매트릭스의 LOX-유도 불안정화 및 혼입된 리포터 물질의 방출
알지네이트/구리 매트릭스를 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 여기에, 형광 리포터 물질로서 몰질량이 150 kDa 또는 500 kDa인 FITC desxtran을 알지네이트 용액에 첨가하고, 상기 리포터 물질을 형성되는 겔에 직접 혼입시켰다.
알지네이트/구리 매트릭스의 불안정화 및 이에 따른 리포터 물질의 방출은 온도 37℃ 및 대기압에서 LOX를 첨가함으로써 수행되었다.
겔의 완전 또는 부분적인 불안정화 및 형광 리포터 물질의 방출은 VIS 분광법에 의해 수행되었다.
도 2는 리포터 물질인 FITC desxtran이 방출되는 실험의 시간 경과를 도시한다. LOX는 150분 후에 0.31 μM의 농도로 현탁액에 첨가되었다. 방출은 LOX 첨가 후 90분 뒤에 종료되었다.
실시예 3
알지네이트/구리 매트릭스의 LOX - 유도 불안정화 및 상기 매트릭스의 탄성 계수 측정을 통한 검출
표면 고정된 겔층으로서 알지네이트/구리 매트릭스를 실시예 1에 기재된 반응물 및 파라미터에 따라 제조하였다.
알지네이트/구리 매트릭스의 불안정화는 온도 37℃및 대기압에서 LOX를 첨가함으로써 수행되었다.
겔의 완전 또는 부분적인 불안정화는 매트릭스의 탄성 계수를 측정함으로써 검출되었다.
도 3은 라이실 옥시다제 첨가 후 구리/알지네이트 매트릭스의 기계적 안정성 감소를 나타낸다. 0.31 μM LOX로 30분간 배양한 후에, 겔의 안정성은 75% 감소하였다.

Claims (20)

  1. 종양 치료제 및/또는 종양 진단제의 담체 매트릭스로 사용하기 위한 양이온-안정화된 생체 고분자 겔로서,
    상기 겔은 종양 세포 또는 종양 조직에 의해 생성된 자극 하에 불안정화되며, 종양 치료제 및/또는 종양 진단제가 방출될 수 있는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 자극은 라이실 옥시다제(LOX), 또는 금속성 단백질 분해효소, 특히 Zn 이온을 포함하는 금속성 단백질 분해효소인 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 종양은 소화기 종양, 특히 위암, 소장암, 대장암, 직장암, 항문암, 을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 치료제는 수지상 세포, 알킬화제, 대사 길항 물질, 포도필로톡신(podophyllotoxin) 유도체, 국소이성질화효소 I/II 억제제, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 면역 조절제, 저분자량 키나제(kinase) 억제제(sm-KIs), mTOR 억제제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화 양이온은 Cu2+ 양이온, Zn2+ 양이온, Ca2+ 양이온 또는 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 겔은 알지네이트 겔인 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 생체 고분자 겔.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 알지네이트 겔은 Cu2+ 이온을 1mM 내지 500mM, 바람직하게는 1mM 내지 100mM의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 겔.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 겔은 추가적인 구조 형성 성분, 특히 단량체 및/또는 가교제 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 겔.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 추가적인 성분은 안정화 양이온, 하나 이상의 이중결합을 갖는 단량체 및 하나 이상의 작용기를 갖는 단량체의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 겔.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 성분, 특히 단량제 또는 중합체 성분은, 화학적으로 개질, 예를 들어 사이드 작용기와 결합되는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 겔.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 사이드 작용기는 아미드(amide), 에스터(ester) 및 설페이트(sulphate)의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 겔.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 겔은 캡슐 또는 코팅의 형태인 것을 특징으로 하는 양이온-안정화된 겔.
  13. 적어도 하나의 종양 치료제 및/또는 적어도 하나의 종양 진단제뿐만 아니라 담체 매트릭스로서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 양이온-안정화된 생체 고분자 겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    겔의 불안정화시 방출되는 적어도 하나의 검출 가능한 리포터 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 리포터 물질은 대변에서 복구될 수 있는 입자뿐만 아니라 염료, 형광 마커, 예를 들어 시아닌 염료, 소변을 염색하는 식용 색소(예를 들어, 베타닌, 비타민 B, 메틸렌 블루); 를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구 또는 직장 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  17. 종양 특이적 생성물, 특히 라이실 옥시다제의 존재 및 양을 검출하기 위한 시험관내 방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 양이온-안정화된 생체고분자 겔과 종양 세포 또는 종양 조직을 접촉시키는 것을 포함하며,
    상기 겔은 상기 종양 특이적 생성물의 존재 하에 상기 종양 특이적 생성물의 양에 의존하여 완전히 또는 부분적으로 불안정화되며,
    불안정화의 정도가 검출되며 임의적으로 기준값과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 생체 고분자 겔은 겔의 불안정화시 방출되고 및/또는 겔의 불안정화 정도를 지시할 수 있는 검출 가능한 특성의 변화, 예를 들어 색 변화, 형광 방출 또는 흡수 파장의 변화 또는 형광 수명의 변화를 나타내는 적어도 하나의 리포터 물질, 예를 들어 염료 또는 형광 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 상기 겔의 완전 또는 부분적인 불안정화의 검출은 육안 관찰, 또는 분광법 또는 분광계적인 방법, 특히 가시광선 분광법, 형광 분광법, 시간-분해 형광 분광법, FRET 분광법 등의 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 환자 체내의 종양 특이적 물질의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 시험관 내 방법에 있어서,
    제 14항 또는 제 15항에 따른 약학적 조성물이 투여된 환자의 혈액, 소변, 대변과 같은 생리학적 샘플이 검출되어야 할 종양 특이적 물질과의 접촉으로 인한 겔의 불안정화 후에 방출되는 리포터 물질의 존재 및 양에 대하여 검사되고, 임의적으로 기준값과 비교되는 것을 특징으로 하는 방법.
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