KR20190122232A - 망막층간분리증의 비인간 동물 모델 - Google Patents

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수잔나 브리지스
야준 탕
양 리우
징타이 카오
카멜로 로마노
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

망막층간분리증에 대한 동물 모델로서 사용하기에 적합한 비인간 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 비인간 동물은 망막층간 단백질-1 유전자좌에서의 파괴를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제공된 비인간 동물은 돌연변이 망막층간 단백질-1 유전자를 특징으로 한다. 비인간 동물은, 일부 구현예에서, 망막층간분리증과 관련된 하나 이상의 증상 또는 표현형의 발생을 포함하는 표현형을 갖는 것으로 기술될 수 있다. 망막층간분리증 또는 안구 관련 질환, 장애 또는 병태를 예방하거나, 지연시키거나 치료하는 데 사용될 수 있는 치료 후보물질을 식별하는 방법이 또한 제공된다.

Description

망막층간분리증의 비인간 동물 모델
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2017년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/463,872호 및 2017년 10월 24일에 출원된 미국 가출원 제62/576,256호의 우선권의 이익을 주장하며, 동 문헌의 내용 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
참조에 의한 서열 목록의 통합
2018년 2월 5일자로 생성되어, EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 35518_10328WO01_SequenceListing.txt의 파일명을 가진 117 KB의 ASCII 텍스트 파일 형태의 서열 목록이 참조로써 본원에 통합된다.
세계 보건 기구(WHO)는 전 세계적으로 시각적인 장애를 가진 사람은 약 1억 8천만 명이고, 이 중 아동 실명이 원인인 사람들을 합치면 거의 6백만 명에 달할 것으로 추산하고 있다(Blindness: Vision 2020, The Global Initiative for the Elimination of Avoidable Blindness, 세계 보건 기구 백서 213호, 2000년 개정). 망막층간 단백질-1(Rs1) 유전자에서의 돌연변이에 의해 초래되는 X-염색체 관련 유아기 망막층간분리증(XLRS)은, 망막 내층이 분리되어 시력이 심각하게 상실되는 것을 특징으로 하는 남아(male children)의 조기 발병성 황반 변성이다. 현재 치료 옵션은 광학 장치(예: 돋보기), 비광학 장치(예: 작업등, 독서대 등) 및 전자 장치와 같은 저시력 보조 수단으로 제한되어 있다.
본 개시는 망막층간분리증(예: X-염색체 관련 망막층간분리증)의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있는 새로운 치료제 및, 일부 구현예에서는, 치료 처방을 식별하고 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템을 제공하기 위해, 비인간 동물을 조작하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 생체내 시스템은 안구-관련 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하기 위한 새로운 치료제를 식별하고 개발하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 생체내 시스템은 시력 상실과 연관된 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하기 위한 새로운 치료제를 식별하고 개발하는 데에도 사용될 수 있다. 제공된 비인간 동물은, 일부 구현예에서는, 숙주 RS1 폴리펩티드가 발현되거나 생산되지 않도록 Rs1 유전자 내에 파괴를 포함하고/하거나, 달리 기능적으로 침묵화된 Rs1 유전자를 포함하며, 예를 들어, 망막의 구조 및/또는 기능을 회복 및/또는 개선하는 치료제의 식별 및 개발에 사용하기에 바람직하다. 비인간 동물로서, 변이체 또는 돌연변이체 RS1 폴리펩티드가 조작된 변이체 또는 돌연변이체 Rs1 유전자로부터 생산되도록 조작된 변이체 또는 돌연변이체 Rs1 유전자를 포함하는 비인간 동물도 제공되는데, 제공된 비인간 동물은, 예를 들어, 망막의 구조 및/또는 기능을 회복 및/또는 개선하는 치료제의 식별 및 개발에 사용하기에 바람직하다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 망막층간분리증에 대한 개선된 생체내 시스템(또는 모델)을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 눈-관련 질환, 장애 및/또는 병태에 대한 개선된 생체내 시스템(또는 모델)을 제공한다.
일부 구현예에서, 망막층간분리증에 대한 동물 모델로서 사용하기에 바람직한 비인간 동물이 제공된다.
다양한 구현예에서, 제공된 비인간 동물은 Rs1 유전자에서의 파괴(예: 코딩 영역 전체 또는 일부의 결실) 또는 돌연변이(예: 코딩 서열에서 하나 이상의 점 돌연변이)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는 파괴 또는 돌연변이를 포함하는 비인간 동물의 하나 이상의 망막에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는 비인간 동물에서 다음의 표현형들 중 하나 이상을 형성하거나, 발생시키거나, 나타나게 한다: 망막층간분리증-유사 표현형(예를 들어, 내부 망막 층의 분리, 망막 퇴화, 및 시력 감소); 황반 또는 망막의 분리; 시력 저하; 망막 섬유증; 및 망막 착색, 그리고, 특정 구현예에서, 표현형은 야생형 비인간 동물과 비교하여 내부 망막 내 낭포 구조체의 발생, 및 ERG b- 및 a-파 반응의 감소를 포함하는데, 이는 광수용기(photoreceptor) 세포의 상실로 이어진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는 비인간 동물에서 망막의 기능적 및 형태학적 표현형이 조기에 (예를 들어, 출생일에 또는 출생 후 15, 18, 21, 24 또는 27일 이내에) 나타나도록 한다. 일부 구현예에서, 망막의 조기 발병성 기능적 결함은, 야생형 비인간 동물과 비교하여, (i) 암-순응(dark-adapted) 및 명-순응(light-adapted) ERG 분석에서 a-파에 대해 상대적인 b-파의 감소(부의 ERG로 나타남); (ii) ERG b-파의 최대 반응 값 및 감도 값의 감소; (iii) ERG a-파의 최대 반응 값의 감소; 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 조합으로 반영될 수 있다. 일부 구현예에서, 망막의 조기 발병성 형태학적 결함은 야생형 비인간 동물과 비교하여, 분리(schisis), 더 넓은 타원체 구역(ellipsoid zone, EZ), 더 얇은 외망막, 또는 이들의 조합으로 반영될 수 있다.
일부 구현예에서, 비인간 Rs1 유전자에서의 파괴(예: 결실) 또는 돌연변이는 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자의 파괴 또는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 비인간 Rs1 내인성 유전자에서의 파괴(예: 결실)는 (일부 특정 구현예에서는 리포터 유전자를 포함하는) 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자 내로 핵산 서열을 삽입하는 것에 의해 일어난다. 일부 구현예에서, 파괴(disruption)는 내인성 Rs1 유전자의 전체적 또는 부분적 결실이거나 이를 포함하며, 이는 유전자 산물(예: mRNA 또는 폴리펩티드)의 발현 또는 생산을 차단한다. 일부 구현예에서, 비인간 Rs1 유전자에서의 돌연변이(예: 점 돌연변이)는, 일부 특정 구현예에서는 합성 엑손(예: 점 돌연변이를 포함하는 합성 엑손)을 포함하는 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자 내로 핵산 서열을 삽입하는 것에 의해 일어난다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 Rs1 유전자에서의 하나 이상의 점 돌연변이이거나 이를 포함하는데, 이는 야생형 RS1 폴리펩티드와 비교해 기능이 감소되었거나 변경된 변이체 RS1 폴리펩티드를 발현시키며; 일부 특정 구현예에서, 비인간 동물에서의 변이체 RS1 폴리펩티드의 수준은 야생형 비인간 동물에서의 야생형 RS1 폴리펩티드의 수준보다 적다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 변이체 RS1 폴리펩티드는 야생형 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 비인간 동물은 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 내인성 Rs1 유전자좌에 위치하고; 다른 구현예에서는, 조작된 Rs1 유전자가 상이한 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 이종 Rs1 유전자(예: 인간 Rs1 유전자)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 이종 RS1 폴리펩티드를 전체적으로 또는 부분적으로 암호화하는 유전 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 이종 폴리펩티드의 디스코이딘 도메인(discoidin domain)을 암호화하는 유전 물질을 포함하는데, 디스코이딘 도메인은 야생형 또는 부모 이종 RS1 폴리펩티드와 비교해 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 야생형 또는 부모 Rs1 유전자(예를 들어, 내인성 또는 상동체)와 비교해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는데, 이는 변이체 RS1 폴리펩티드를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 설치류 RS1 폴리펩티드의 디스코이딘 도메인을 암호화하는 유전 물질을 포함하는데, 디스코이딘 도메인은 야생형 또는 부모 설치류 RS1 폴리펩티드와 비교해 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 이종 RS1 폴리펩티드의 디스코이딘 도메인을 암호화하는 유전 물질을 포함하는데, 디스코이딘 도메인은 야생형 또는 부모 이종 RS1 폴리펩티드와 비교해 아미노산 치환을 함유하며; 예를 들어, 조작된 Rs1 유전자는 인간 RS1 폴리펩티드의 디스코이딘 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 디스코이딘 도메인은 야생형 인간 RS1 폴리펩티드와 비교해 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 Rs1 유전자에 의해 암호화된 RS1 폴리펩티드의 디스코이딘 도메인은 야생형 또는 부모 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 조작된 Rs1 유전자는 아미노산 치환(예: 변이체 RS1 폴리펩티드)을 포함하는 디스코이딘 도메인을 특징으로 하는 RS1 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물로서, 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부가 결실된 게놈을 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, 결실은 Rs1 유전자좌로부터 만들어진 기능적 RS1 폴리펩티드를 결여시킨다. 일부 구현예에서, 결실은 적어도 엑손 2~3의 결실이다. 일부 특정 구현예에서, 결실은 엑손 1 및 엑손 2~3 중 적어도 일부분의 결실이다. 일부 구현예에서, 결실은 시작(ATG) 코돈의 바로 3'에서 엑손 3의 마지막 6개의 뉴클레오티드까지 (그 중간의 것들을 포함해) 걸치는 내인성 Rs1 유전자의 뉴클레오티드의 결실이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결실을 포함하는 Rs1 유전자좌는 리포터 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자는 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, Rs1 프로모터는 내인성 Rs1 프로모터(예를 들어, 결실을 포함하는 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 프로모터)이다. 일부 구현예에서, Rs1 프로모터는 이종 Rs1 프로모터이다.
일부 구현예에서, Rs1 유전자좌는 엑손 1 및 엑손 2~3의 일부가 결여되어 있으며(또는 이들의 결실을 포함하고), 예를 들어, 시작(ATG) 코돈의 바로 3'에서 엑손 2를 지나 엑손 3의 마지막 6개의 뉴클레오티드까지의 뉴클레오티드가 결여되어 있으며, Rs1 유전자좌의 시작(ATG) 코돈에 프레임 내(in-frame) 융합되는 리포터 유전자 코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 리포터 유전자 코딩 서열(예를 들어, lacZ 유전자의 코딩 서열)은 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나 이에 의해 전사 조절된다.
일부 구현예에서, 리포터 유전자는 lacZ 유전자이다. 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP(eGFP), 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(eYFP), 청색 형광 단백질(BFP), 강화된 청색 형광 단백질(eBFP), DsRed 및 MmGFP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자의 발현 패턴은 Rs1 유전자(예를 들어, Rs1 유전자좌에 있는 야생형 Rs1 유전자)의 발현 패턴과 유사하다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자의 발현은 야생형 또는 부모 RS1 폴리펩티드의 발현 패턴과 유사하다.
일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 비인간 동물이 제공되며, 조작된 Rs1 유전자는 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 야생형 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화한다. 야생형 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드는 본원에서 변이체 또는 돌연변이체 RS1 폴리펩티드로도 지칭된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 아미노산 치환은, 예를 들어, 본원에 기술된 비인간 동물의 소포체에서 국소화된 변이체(또는 돌연변이체) RS1 폴리펩티드의 응집을 야기할 수 있는 단백질의 미스폴딩(misfolding)으로 인해, 비인간 동물에서 기능적 RS1 폴리펩티드가 생산되는 것을 차단하거나 생산되는 수준을 유의하게 감소시키고, 이황화 결합된 서브유닛 조립체를 손상시키며, 단백질 분비 프로세스의 일부로서 ER의 막 내에 삽입될 RS1 폴리펩티드를 불능화시킨다.
일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 신호 서열에서 아미노산 치환, 예를 들어, 프롤린이나 친수성 잔기 또는 하전된 잔기와 소수성 잔기의 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 디스코이딘 도메인의 측면에 위치하는 영역, 즉 RS1 영역 및 RS1 폴리펩티드의 C-말단 분절에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 38, 40, 59 및 223으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 시스테인의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 C59S 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 디스코이딘 도메인에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 63, 83, 110, 142 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 비-시스테인 잔기와 시스테인의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 디스코이딘 도메인에서 시스테인과 비-시스테인 잔기의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 치환은 R141C 치환이다. 일부 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 디스코이딘 도메인에서 비-하전된 잔기와 하전된 잔기의 치환, 하전된 잔기와 비-하전된 잔기의 치환, 또는 역 하전된(reversely charged) 잔기와 하전된 잔기의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 디스코이딘 도메인에서 프롤린의 삽입 또는 제거에 의한 (즉, 프롤린 잔기를 또 다른 잔기로 치환하거나, 그 반대에 의한) 치환을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 변이체 RS1 폴리펩티드는 디스코이딘 도메인에서 극성 잔기의 삽입 또는 제거에 의한 (즉, 극성 잔기를 비-극성 잔기로 치환하거나, 그 반대에 의한) 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물로서, 아미노산 치환을 포함하고, 일부 특정 구현예에서는 C59S 또는 R141C 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 엑손 3에서 점 돌연변이를 포함하고, C59S 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하며; 일부 특정 구현예에서는, 엑손 3에서의 점 돌연변이는 TGT에서 AGT로의 코돈 변화이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 엑손 5에서 점 돌연변이를 포함하고, R141C 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하며; 일부 특정 구현예에서는, 엑손 5에서의 점 돌연변이는 CGC에서 TGC로의 코돈 변화이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 비-인간 동물은 수컷 동물이다. X 염색체 상의 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 유전자에서 파괴 또는 돌연변이를 포함하는 수컷 동물은 파괴 또는 돌연변이에 대해 반접합성(hemizygous)인 것으로 또한 이해된다.
일부 구현예에서, 제공된 비인간 동물은 암컷 동물이다. 일부 구현예에서, 암컷 비인간 동물은 본원에 기술된 바와 같은 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 유전자에서의 결실에 대해 동형접합성(homozygous)이거나 이형접합성(heterozygous)이다. 일부 구현예에서, 암컷 비인간 동물은, 일부 구현예에서는 내인성 Rs1 유전자좌에 있는, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 (또는 돌연변이체) Rs1 유전자에 대해 동형접합성이거나 이형접합성이다.
일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 하나 이상의 선택 마커(selection markers)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 재조합효소 유전자 및 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 선택 마커를 추가로 포함하며, 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 절제를 유도하도록 배향된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 loxP, lox511, lox2272, lox2372, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, Dre, rox, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 효소 유전자는 Cre, Flp(예: Flpe, Flpo), 및 Dre로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 특정 구현예에서, 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 lox (예: loxP) 부위이며, 및 재조합효소 유전자는 Cre 재조합 효소를 암호화한다.
일부 구현예에서, 재조합효소 유전자는, 분화된 세포에서 재조합효소 유전자의 발현을 유도하지만 미분화 세포에서는 재조합효소 유전자의 발현을 유도하지 않는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합효소 유전자는 전사적으로 유능하고 발달 조절되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합효소 유전자의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로타민(Prot; 예를 들어, Prot1 또는 Prot5), Blimp1, Blimp1(1 kb 단편), Blimp1(2 kb 단편), Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 및 Pax3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합효소 유전자의 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 30, 서열번호 31, 또는 서열번호 32이거나 이를 포함한다. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 재조합효소 유전자의 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택성 마커는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(neoR), 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제(hygR), 퓨로마이신-N-아세틸트랜스퍼라아제(puroR), 블라스티딘 S 디아미나아제(bsrR), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(gpt), 및 단순 포진 바이러스 티미딘키나아제(HSV-tk)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 선택성 마커는 UBc 프로모터, Ubi 프로모터, hCMV 프로모터, mCMV 프로모터, CAGGS 프로모터, EF1 프로모터, pgk1 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 및 ROSA26 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 의해 전사 조절된다. 일부 특정 구현예에서, 선택성 마커는 neoR 또는 hygR이며, Ubi 프로모터에 의해 전사 조절된다.
일부 구현예에서, 제공된 비인간 동물은 망막층간분리증의 (또는 이와 관련된) 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태를 발생시킨다.
일부 구현예에서, 단리된 비인간 세포 또는 조직이 제공되며, 이들의 게놈은 (i) 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자에서 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나, (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자(일부 구현예에서는 조작된 Rs1 유전자가 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식 세포, 단핵구 및 T 세포로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 세포는 눈 또는 망막의 세포 유형으로부터 유래되거나 이와 관련된다. 일부 특정 구현예에서, 세포는 안구 신경절 세포(ganglion cell), 양극 세포(bipolar cell), 무축삭 세포(amacrine cell), 수평 세포(horizontal cell), 원뿔체 세포(cone cell), 간상 세포(rod cell) 또는 망막 색소 상피 세포(retinal pigment epithelial cell)이다. 일부 구현예에서, 조직은 지방, 방광, 뇌, 가슴, 골수, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난자, 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 특정 구현예에서, 안구 조직은 공막(sclera), 맥락막(choroid) 또는 망막(retina)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 단리된 비인간 세포 또는 조직으로부터 만들어지거나, 생성되거나, 생산되거나, 수득된 불멸화 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포가 제공되며, 이의 게놈은 (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자에서 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나, (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자(일부 구현예에서는 조작된 Rs1 유전자가 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 설치류 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고, 129 계통, C57BL 계통 또는 이의 혼합체로부터 유래한다. 일부 특정 구현예에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고, 129 계통 및 C57BL 계통의 혼합체이다. 일부 특정 구현예에서, 설치류 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이며, Crb1 rd8 돌연변이가 없는 게놈을 가진 (즉, 야생형 Crbs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진) C57BL 계통으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 ES 세포는 서열번호 23, 서열번호 26, 및 서열번호 28 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 ES 세포는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39 및 서열번호 40 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물을 만들기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 배아 줄기 세포의 용도가 제공된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 ES 세포는 마우스 ES 세포이며; (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자에서 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나, (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자(일부 구현예에서는 조작된 Rs1 유전자가 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함)를 포함하는 마우스를 만드는 데 사용된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 ES 세포는 랫트 ES 세포이며, 이는 (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자에서 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나, (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자(일부 구현예에서는 조작된 Rs1 유전자가 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함)를 포함하는 랫트를 만드는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 ES 세포로부터 만들어지거나, 생산되거나, 수득된 비인간 ES가 제공된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아는 설치류 배아이고; 일부 구현예에서는, 마우스 배아이며; 일부 구현예에서는, 랫트 배아이다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 비인간 배아는 서열번호 25, 서열번호 27 또는 서열번호 29를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 비인간 배아는 서열번호 35, 서열번호 38 또는 서열번호 41을 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물을 만들기 위한 본원에 기술된 비인간 배아의 용도가 제공된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아는 마우스 배아이며, 이는 (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자에서 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나, (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자(일부 구현예에서는 조작된 Rs1 유전자가 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함)를 포함하는 마우스를 만드는 데 사용된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아는 랫트 배아이며, 이는 (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자에서 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나, (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자(일부 구현예에서는 조작된 Rs1 유전자가 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함)를 포함하는 랫트를 만드는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물, 단리된 비인간 세포 또는 조직, 불멸화 세포, 비인간 ES 세포, 또는 비인간 배아를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 치료 또는 진단을 위한 약물(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 질병, 질환 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 약물(예: 항체 또는 그의 항원 결합 단편)의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물, 또는 표적화 벡터가 제공된다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물 또는 표적화 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자(또는 유전자좌)를 전체적으로 또는 부분적으로 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물, 또는 표적화 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자(또는 유전자좌)를 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 DNA 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 설치류 Rs1 유전자좌에 있는 설치류 Rs1 유전자에 통합될 핵산 서열로서 설치류 Rs1 유전자좌에서의 뉴클레오티드 서열에 상동인 5' 뉴클레오티드 서열 및 3' 뉴클레오티드 서열이 측면에 위치한 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공되는데, 핵산 서열이 Rs1 유전자에 통합되면 (i) 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부가 결실되거나, (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자가 생성된다. 일부 구현예에서, 통합될 핵산 서열은 리포터 유전자를 포함하며, 핵산 서열이 통합되면 엑손 1 및 엑손 2~3의 일부가 결실된다. 일부 구현예에서, 통합될 핵산 서열은, 핵산 서열이 설치류 Rs1 유전자에 통합되는 것에 의해 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자가 생성되도록, 돌연변이체 Rs1 엑손을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물 또는 표적화 벡터는 서열번호 23, 서열번호 26, 및 서열 번호 28 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물 또는 표적화 벡터는 서열번호 33과 서열번호 35, 서열번호 36과 서열번호 37, 또는 서열번호 39와 서열번호 40을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물 또는 표적화 벡터는 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물 또는 표적화 벡터는 하나 이상의 부위 특이적 재조합 부위(예: loxP, Frt, 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 제공된 핵산 작제물 또는 표적화 벡터는 도면에 예시되어 있다.
일부 구현예에서, 비인간 ES 세포, 비인간 세포, 비인간 배아 및/또는 비인간 동물을 만들기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 작제물 또는 표적화 벡터의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, 비인간 동물을 만드는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자의 코딩 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, (ii) 아미노산 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하기 위해 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자의 엑손이 돌연변이되도록, 내인성 배아 줄기 세포의 게놈 내로 핵산 서열을 도입하는 단계(핵산 서열은 Rs1 유전자좌에서의 서열에 상동인 폴리뉴클레오티드를 포함함); (b) (a) 단계에서 유전자 변형된 비인간 배아 줄기 세포를 수득하는 단계; 및 (c) (b) 단계의 유전자 변형된 비인간 배아 줄기 세포를 사용하여 비인간 동물을 생성하는 단계를 포함한다.
비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, Rs1 유전자의 엑손 3은 C59S 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 특정 구현예에서, Rs1 유전자의 엑손 3은 C59S 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이되며, Rs1 유전자의 인트론 2에서 25 bp의 결실이 이루어지고 Rs1 유전자의 인트론 3에서 28 bp의 결실이 이루어진다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, Rs1 유전자의 엑손 5는 R141C 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, Rs1 유전자의 엑손 5는 R141C 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이되며, Rs1 유전자의 인트론 4에서 10 bp의 결실이 이루어지고 Rs1 유전자의 인트론 5에서 29 bp의 결실이 이루어진다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, Rs1 유전자좌에서의 코딩 서열의 엑손 1 및 엑손 2~3의 일부가 결실된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 특정 구현예에서, Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 유전자의 13,716 bp가 결실된다.
비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 선택 마커를 추가로 포함한다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위를 추가로 포함한다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 핵산 서열은 재조합효소 유전자, 및 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 선택 마커를 추가로 포함하며, 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 절제를 유도하도록 배향된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 핵산 서열은 선택 마커의 하류에 있는 리포터 유전자를 추가로 포함한다.
비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 재조합효소 유전자는, 분화된 세포에서 재조합효소 유전자의 발현을 유도하지만 미분화 세포에서는 재조합효소 유전자의 발현을 유도하지 않는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 재조합효소 유전자는 전사적으로 유능하고 발달 조절되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 결실에 대해 동형접합체이거나, 돌연변이 Rs1 유전자에 대해 동형접합체인 비인간 동물이 생성되도록 (c) 단계에서 생성된 비인간 동물을 번식시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물을 만드는 방법이 제공되며, 상기 방법은 변형된 게놈이 (i) 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실, 또는 (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하도록 비인간 동물 게놈을 변형시키는 단계(일부 구현예에서, 조작된 Rs1 유전자는 내인성 Rs1 유전자좌에 존재함); 및 변형된 게놈을 포함하는 비인간 동물을 만드는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물 게놈은 배아 줄기(ES) 세포를 사용하여 변형되고(즉, ES 세포의 게놈이 변형됨), 변형된 게놈을 갖는 ES 세포는 변형된 게놈을 포함하는 비인간 동물을 만드는 데 사용된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 게놈은 C59S 또는 R141C 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하도록 변형된다. 비인간 동물을 만드는 방법의 일부 구현예에서, 게놈은 Rs1 유전자좌에서의 코딩 서열 중 엑손 1 및 엑손 2~3의 적어도 일부의 결실을 포함하도록 변형되고; 일부 특정 구현예에서는, Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 유전자에서 13,716 bp의 결실을 포함하도록 변형된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 만들어지거나, 생성되거나, 생산되거나, 수득되거나 수득될 수 있는 비인간 동물이 제공된다.
일부 실시예에서, 비인간 동물에서 망막층간분리증(또는 안구와 관련된 질환, 장애 또는 병태)의 치료를 위한 치료제를 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) (i) Rs1 유전자좌에 있는 내인성 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실, 또는 (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 비인간 동물에게 하나 이상의 제제를 투여하는 단계(조작된 Rs1 유전자는 일부 구현예에서는 내인성 Rs1 유전자좌에 있음); (b) 하나 이상의 제제가 망막층간분리증(또는 안구와 관련된 질환, 장애 또는 병태)와 관련된 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태에 대해 효과를 갖는지 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 분석을 수행하는 단계; 및 (c) 망막층간분리증(또는 안구와 관련된 질환, 장애 또는 병태)과 관련된 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태에 대해 효과를 갖는 하나 이상의 제제를 치료제로서 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, Rs1 유전자의 시작(ATG) 코돈에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 게놈을 가진 비인간 동물이 제공되는데, 리포터 유전자는 Rs1 유전자의 엑손 1 및 엑손 2~3의 일부를 대체하여 위치되어, Rs1 유전자 서열 중 13,716 bp를 결실시킨다.
일부 구현예에서, TGT에서 AGT로의 점 돌연변이가 엑손 3에 존재하고, 인트론 2에서 25 bp가 결실되고, 인트론 3에서 28 bp가 결실되는 것을 특징으로 하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 비인간 동물이 제공되는데, 조작된 Rs1 유전자는 C59S 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, CGC에서 TGC로의 점 돌연변이가 엑손 5에 존재하고, 인트론 4에서 10 bp가 결실되고, 인트론 5에서 29 bp가 결실되는 것을 특징으로 하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 비인간 동물이 제공되는데, 조작된 Rs1 유전자는 R141C 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 망막층간분리증의 비인간 동물 모델이 제공되는데, 비인간 동물은 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 발현하거나 생산한다.
일부 구현예에서, 망막층간분리증의 비인간 동물 모델이 제공되며, 비인간 동물은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 갖는다.
일부 구현예에서, 망막층간분리증의 비인간 동물 모델이 제공되며, 비인간 동물은 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자에서의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하는 게놈을 갖는다.
일부 구현예에서, 망막층간분리증의 비인간 동물 모델이 제공되는데, 망막층간분리증의 상기 비인간 동물 모델은 (i) 본원에 기술된 바와 같은 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가지거나, (ii) 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자(또는 유전자좌)에서 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하는 게놈을 가지거나, (iii) 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제공하여 수득된 것이다.
일부 구현예에서, 치료 또는 진단을 위한 약물의 제조 및/또는 개발에 사용하기 위해 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포가 제공한다.
일부 구현예에서, 질병, 질환 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 약제(medicament)의 제조에 사용하기 위해 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포가 제공한다.
일부 구현예에서, 의료용으로 사용하기 위한 약물 또는 백신의 제조 및/또는 개발에 있어서 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포의 용도, 예컨대 약제로서의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, 망막층간분리증에 대한 유전자 치료 약물의 제조 및/또는 개발에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포의 용도가 제공한다.
일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 망막층간분리증이다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 안구 관련 질환, 장애 또는 병태이거나, Rs1의 기능 및/또는 활성의 결실로부터 발생한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표현형은 기준 또는 대조군과 비교되어 기술된다. 다양한 구현예에서, 기준 또는 대조군은 본원에 기술된 바와 같은 변형 또는 본원에 기술된 바와 상이한 변형을 가지거나 변형을 가지지 않는 비인간 동물(즉, 야생형 비인간 동물)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물은 설치류이고; 일부 구현예에서는, 마우스이며; 일부 구현예에서는, 랫트이다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 마우스는 129 균주, BALB/C 균주, C57BL/6 균주, 및 혼합 129xC57BL/6 균주로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 일부 특정 구현예에서, C57BL/6균주이다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작업된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 시 필요한 수수료를 납부하면 특허청에서 제공될 것이다.
다음의 도면들로 구성된 본원에 포함된 도면은 단지 예시를 위한 것이며 한정하기 위한 것이 아니다.
도 1 비인간(예: 마우스) 망막층간 단백질-1(Rs1) 유전자 (상단) 및 유전자 산물(하단)의 구성도를 도시한 것으로, 축척에 비례하지는 않는다. 상단: 엑손의 번호는 각 엑손의 아래에 표시되어 있고, 미번역 영역(흰 박스) 및 코딩 서열(수직 사선)도 표시되어 있다. 하단: 리더 서열(LS), Rs1 도메인(Rs1), 디스코이딘 도메인(DD) 및 C 말단 영역(CT)이 선택된 시스테인 및 질병 결합 미스센스 돌연변이의 위치와 함께 표시되어 있다(Wu, W.W.H. 등의 2003, J. Biol. Chem. 278(30):28139-146의 도 1을 수정한 것임).
도 2는 실시예 1에 기술된 바와 같이 설치류에서 Rs1 유전자의 결실을 생성하기 위한 예시적인 표적화 벡터의 도해를 도시한 것으로, 축척에 비례하지는 않는다. lacZ 리포터 유전자는 마우스 Rs1 시작 (ATG) 코돈에 작동 가능하게 연결된 상태로 엑손 1에 삽입되어 마우스 Rs1 유전자좌의 엑손 1의 나머지 부분을 포함하여 엑손 3의 마지막 6개의 뉴클레오티드까지를 결실시킨다(13,716 bp 결실). Rs1-lacZ-SDC 표적화 벡터는 자체 결실 약물 선택 카세트(예: loxP 서열이 측면에 위치한 네오마이신 내성 유전자; 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조)를 함유한다. 상동성 재조합 시, 표적화 벡터에 함유된 서열은 도시된 바와 같이 내인성 쥣과 Rs1 유전자좌의 엑손 1~3을 대신해 삽입된다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거되는데, 다시 말해, 전술한 바와 같은 Rs1 유전자좌에서 파괴를 함유하는 생식계열 세포를 갖는 마우스로부터 유래된 자손이 발달 도중에 분화된 세포로부터 선택성 마커를 제거하게 된다. 후속하는 엑손(수직 사선)의 번호가 각 엑손의 위에 표시되어 있으며, 미번역 영역(흰색 박스) 및 코딩 서열(검은색 사선)도 표시되어 있다. lacZ: β-갈락토시다아제(galactosidase) 유전자; Cre: Cre 재조합효소 유전자; Neo: 네오마이신 내성 유전자.
도 3은 쥣과 Rs1 유전자의 게놈 구조도로서, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 예시적인 파괴(예: 엑손 1~3의 결실 13,716 bp)을 도시한 것이며, 축척에 비례하지는 않는다. 엑손(검은색 사선)의 번호는 각 엑손의 위에 표시되어 있고, 미번역 영역(흰 박스)도 표시되어 있다. 실시예 1에 기술된 스크리닝 분석에 사용된 프로브의 대략적인 위치(즉, Rs1KOmTU, Rs1KOmTD)는 두꺼운 수직 사선으로 표시되어 있다.
도 4는 실시예 1에서 기술된 바와 같은 예시적인 파괴된 쥣과 Rs1 유전자의 도해를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. 마우스 Rs1 유전자좌의 엑손 1~3의 결실(13,716 bp 결실)은 마우스 Rs1 시작 (ATG) 코돈에 작동 가능하게 연결된 lacZ 리포터 유전자의 삽입에 기인하는 것으로 도시되어 있다. 엑손(수직 사선)의 번호는 각 엑손의 위에 표시되어 있고, 미번역 영역(흰색 박스) 및 나머지 코딩 서열(빗금 사각형)도 표시되어 있다. 선택된 뉴클레오티드 접합부 위치는 각각의 접합부 아래에 선으로 표기되어 있고, 서열번호가 표시되어 있다.
도 5는 실시예 1에 기술된 바와 같이 설치류(예: 마우스)에서 돌연변이체 Rs1 유전자를 생성하기 위한 표적화 벡터의 도해를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. 보존적 엑손(수직 사선)의 번호는 각 엑손의 위 아래에 표시되어 있다. 엑손 3에서의 예시적인 점 돌연변이(C59S; TGT에서 AGT로의 돌연변이)는 상동성 재조합에 의한 합성 DNA 단편 및 카세트 요소의 삽입에 의한 것으로 엑손 3 위에 표시되어 있다. Rs1C59S-SDC 표적화 벡터는 자체 결실 약물 선택 카세트(예: loxP 서열이 측면에 위치한 히그로마이신 내성 유전자; 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조)를 함유한다. 상동성 재조합 시, 표적화 벡터에 함유된 합성 DNA 단편은 도시된 바와 같이 내인성 쥣과 Rs1 유전자좌의 엑손 3을 대신해 삽입된다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거되는데, 다시 말해, 전술한 바와 같은 Rs1 유전자좌에서 파괴를 함유하는 생식계열 세포를 갖는 마우스로부터 유래된 자손이 발달 도중에 분화된 세포로부터 선택성 마커를 제거하게 된다. 선택된 뉴클레오티드 접합부 위치는 각각의 접합부 아래에 선으로 표기되어 있고, 서열번호가 표시되어 있다.
도 6은 마우스 Rs1 유전자의 엑손 3의 확대도, 및 도 5에 도시된 (실시예 1도 참조함) 돌연변이체 Rs1 유전자의 설계에 대한 도해를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. 표적화된 점 돌연변이(C59S)와 주변 인트론을 갖는 엑손 3(검은 직사각형)은 TAQMANβ 분석에 적합하도록 설계된 2개의 작은 결실과 함께 도시되어 있다. 상동성 재조합에 의해 표적화 벡터를 통합하면, C59S 치환을 갖고 돌연변이체 Rs1 유전자 내의 주변 인트론에서 2개의 작은 결실(25 bp 및 28 bp)을 갖는 RS1 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 엑손 3이 생성된다. 실시예 1에 기술된 스크리닝 분석에 사용된 프로브의 대략적인 위치(즉, Rs1-C59SmTU 및 Rs1-C59SmTD)는 두꺼운 수직 사선으로 표시되어 있다.
도 7은 실시예 1에서 기술된 표적화 벡터 내에 함유된 카세트의 재조합효소 매개 절제 이후 생성된 설치류(예: 마우스)에서의 Rs1 유전자의 확대도를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. Rs1 유전자 산물에서 C59S 치환을 초래하는 점 돌연변이를 갖는 엑손 3이 잔여 loxP 부위와 함께 도시되어 있다. 카세트의 재조합효소 매개 절제 후에 남은 뉴클레오티드 접합부의 위치는 접합부 아래에 선으로 표기되어 있고 서열 번호로 표시되어 있다.
도 8은 실시예 1에 기술된 바와 같이 설치류(예: 마우스)에서 돌연변이체 Rs1 유전자를 생성하기 위한 표적화 벡터의 도해를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. 보존적 엑손(수직 사선)의 번호는 각 엑손의 위 아래에 표시되어 있다. 엑손 5에서의 예시적인 점 돌연변이(R141C; CGC에서 TGC로의 돌연변이)는 상동성 재조합에 의한 합성 DNA 단편 및 카세트 요소의 삽입에 의한 것으로 엑손 5 위에 표시되어 있다. Rs1R141C-SDC 표적화 벡터는 자체 결실 약물 선택 카세트(예: loxP 서열이 측면에 위치한 히그로마이신 내성 유전자; 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조)를 함유한다. 상동성 재조합 시, 표적화 벡터에 함유된 합성 DNA 단편은 도시된 바와 같이 내인성 쥣과 Rs1 유전자좌의 엑손 5를 대신해 삽입된다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거되는데, 다시 말해, 전술한 바와 같은 Rs1 유전자좌에서 파괴를 함유하는 생식계열 세포를 갖는 마우스로부터 유래된 자손이 발달 도중에 분화된 세포로부터 선택성 마커를 제거하게 된다. 선택된 뉴클레오티드 접합부 위치는 각각의 접합부 아래에 선으로 표기되어 있고, 서열번호가 표시되어 있다.
도 9는 마우스 Rs1 유전자의 엑손 5의 확대도, 및 도 8에 도시된 (실시예 1도 참조함) 돌연변이체 Rs1 유전자의 설계에 대한 도해를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. 표적화된 점 돌연변이(R141C)와 주변 인트론을 갖는 엑손 5(검은 직사각형)는 TAQMANβ 분석에 적합하도록 설계된 2개의 작은 결실과 함께 도시되어 있다. 상동성 재조합에 의해 표적화 벡터를 통합하면, R141C 치환을 갖고 돌연변이체 Rs1 유전자 내의 주변 인트론에서 2개의 작은 결실(10 bp 및 29 bp)을 갖는 RS1 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 엑손 5가 생성된다. 실시예 1에 기술된 스크리닝 분석에 사용된 프로브의 대략적인 위치(즉, Rs1-R141CmTU 및 Rs1-R141CmTD)는 두꺼운 수직 사선으로 표시되어 있다.
도 10은 실시예 1에서 기술된 표적화 벡터 내에 함유된 카세트의 재조합효소 매개 절제 이후 생성된 설치류(예: 마우스)에서의 Rs1 유전자의 확대도를 도시한 것으로서, 축척에 비례하지는 않는다. Rs1 유전자 산물에서 R141C 치환을 초래하는 점 돌연변이를 갖는 엑손 5가 잔여 loxP 부위와 함께 도시되어 있다. 카세트의 재조합효소 매개 절제 후에 남은 뉴클레오티드 접합부의 위치는 접합부 아래에 선으로 표기되어 있고 서열 번호로 표시되어 있다.
도 11a~11c는 Rs1 널(Rs1 KO) 및 Rs1 돌연변이체(Rs1 C59S, Rs1 R141C) 동물의 망막 내에서 Rs1 mRNA 및 단백질 발현의 분포를 lacZ 발현, RNASCOPEβ 및 면역조직화학(IHC)에 의해 도시한 것이다. A, Rs1 KO 동물의 ONL 및 광수용기에서 정의 X-gal 신호를 보여주는 lacZ 염색. B, 야생형(WT) 동물에서의 내인성 Rs1 mRNA의 발현을 보여주는, RNASCOPEβ를 통한 Rs1 mRNA의 발현. Rs1 KO 동물의 망막에서는 Rs1 mRNA가 검출되지 않았다. C, WT 동물의 모든 망막 층에서의 RS1 단백질 분포를 보여주는 IHC. RS1 단백질 발현은 Rs1 KO 동물에서 검출되지 않았고, Rs1 C59S 및 Rs1 R141C 동물의 ONL과 IS에 RS1 단백질 발현은 Rs1KO 동물에서 검출되지 않았고, Rs1C59S 및 Rs1R141C 동물의 ONL과 IS에 한정되지 않았다(GCL, ganglion cell layer: 신경절 세포층; IPL, inner plexiform layer: 내망상층; INL, inner nuclear layer: 내핵층; OPL, outer plexiform layer: 외망상층; ONL, outer nuclear layer: 외핵층; IS, inner segments: 내절; RPE, retinal pigment epithelium: 망막 세포 상피). Rs1: 적색; DAPI: 청색.
도 12a~12d는 Rs1 널(Rs1 KO) 및 Rs1 돌연변이체(Rs1 C59S, Rs1 R141C) 동물의 망막에서의 RS1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석에 의해 도시한 것이다. A, Rs1 KO 및 C57BL/6-유래 수컷 계통에서의 RS1 발현을 보여주는, 환원 조건 하의 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯. B, 야생형(WT) 및 Rs1 C59S 수컷 동물에서의 RS1 발현을 보여주는, 환원 조건 하의 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯. C, 야생형(WT) 및 Rs1 R141C 수컷 동물에서의 RS1 발현을 보여주는, 환원 조건 하의 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯. D, 야생형(WT), Rs1 KO, Rs1 C59S 및 Rs1 R141C 수컷 동물에서의 RS1 단백질 수준을 보여주는 ELISA 분석. 야생형 한배 새끼와 비교해 Rs1 돌연변이체 동물에서의 RS1 단백질 발현 백분율은 각각의 막대 위에 표시되어 있다. D, 웨스턴 블롯과 ELISA 분석에서, Rs1 녹아웃 암컷 동물의 망막에서의 RS1 단백질 발현. KO: 동형접합성 Rs1 녹아웃(Rs1 -/- ); HET: 이형접합성 Rs1 녹아웃(Rs1 -/+ ). RS1 HET 암컷 동물은 야생형("WT") 수컷 및 암컷 동물과 유사한 양의 RS1 단백질을 가졌다.
도 13a~13d는 Rs1 널(Rs1 KO) 및 Rs1 돌연변이체(Rs1 C59S, Rs1 R141C) 동물의 망막에서의 병리학적 변화를 조직학적, IHC 및 광간섭 단층촬영(OCT) 분석에 의해 도시한 것이다. A, 조직학적 검사로 Rs1 KO, Rs1 C59S 및 Rs1 R141C 수컷 동물에서, INL 내의 공동 및 갈라짐(적색 삼각형), INL 및 OPL의 전반적인 해체(disorganization), ONL의 박화(수직 적색 이중 화살표) 및/또는 내절/외절(수직 적색 선)의 얇아짐(thinning)을 동반하는 광수용기의 퇴행을 나타냄. B, 망막-특이적 세포 마커(GFAP, glial fibrillary acidic protein - 신경아교섬유질 산성 단백질, 및 비멘틴(vimentin))를 사용하여 IHC로 Rs1 KO 수컷 동물에서 INL(*표는 활성화된 뮐러 세포를 나타냄)의 신경아교증(gliosis)을 밝혀 냄. C, 스펙트랄리스 히델버그(Spectralis Heidelberg) 광 간섭 단층촬영(OCT)을 사용하는 생체내 영상촬영에 의해 Rs1 KO, Rs1 C59S 및 Rs1 R141C 암컷 동물에서 망막층간분리증 및 광수용기 퇴행을 관찰함. D, 이형접합성 RS1 녹아웃 암컷(Rs1 -/+) ("Het")에서는 분리(schisis)가 관찰되지 않은 반면, 동형접합성 RS1 녹아웃 암컷(Rs1 -/-) ("KO")는 반 KO 수컷과 일치하는 표현형을 가짐.
도 14a~d는 20주령의 동물에서 암-순응(DA-) 및 명-순응(LA-) 전장 망막전위도(electroretinograms, ERG)에 의한 외망막 기능에 대한 분석을 보여준다. A, 암-순응 조건 하에 야생형(WT), Rs1 KO (KO), Rs1 C59S (C59S) 및 Rs1 R141C (R141C) 수컷 동물로부터 획득한 대표적인 ERG. B, 명-순응 조건 하에 야생형(WT), Rs1 KO (KO), Rs1 C59S (C59S) 및 Rs1 R141C (R141C) 수컷 동물로부터 획득한 대표적인 ERG. C, 자극 휘도의 함수로서 도시된, 암-순응 및 명-순응 ERG의 주요 구성 요소의 대표적인 진폭. 데이터 포인트는 6마리의 암컷 동물을 대상으로 한 평균(± SD)을 나타낸다. 야생형과 비교하면, Rs1 KO, Rs1 C59S 및 Rs1 R141C (R141C) 수컷 동물의 a-파와 b-파 둘 다는 진폭이 감소되었다. 자극 휘도(A 및 B)는 가장 왼쪽 파형 그래프의 왼쪽에 표기되어 있다. D, 암-순응 및 명-순응 조건 하에 야생형(Rs1 +/+ ), 동형접합성 녹아웃(Rs1 -/-) 및 이형접합성 녹아웃(Rs1 -/+) 암컷 동물로부터 획득한 대표적인 ERG. 담체(이형접합성) 암컷의 ERG는 모든 조건 하에서 WT 대조군과 일치하였다. 비교하면, 동형접합성 녹아웃 암컷의 ERG 표현형은 부의 파형 및 감소된 진폭의 a-파를 갖는 반접합성 녹아웃 수컷의 것과 유사하였다.
도 15는 Rs1 KO 마우스에서 망막의 조기 발병성 표현형을 조사하기 위해 실시예 4에 기술된 연구에 대한 예시적인 설계를 보여준다.
Figure pct00001
Rs1 (-/Y) 또는 Rs1 (+/Y) 마우스와
Figure pct00002
Rs1 (+/-) 마우스를 교배하여 Rs1 KO 마우스 (Rs1 (-/Y) 또는 Rs1 (-/-)), 및 Rs1 WT 마우스 (Rs1 (+/Y) 또는 Rs1 (+/+))를 수득하였다. ERG는 생후 15, 18, 21 및 24일차에 수행하였고, 각각의 마우스는 6일 간격으로 2회 이하의 ERG 또는 OCT를 거쳤다.
도 16a~16f는 Rs1 KO 마우스의 조기 발병성 표현형을 ERG 및 OCT 분석에서 도시한 것이다. 외망막 기능은 암-순응(DA-)(A 및 D) 및 명-순응(LA-)(B 및 E) 전장 ERG에 의해 평가하였는데, a-파에 비해 b-파가 감소한 것으로 나타나며, 결과적으로는 모든 시점에서 부의 ERG가 나타났다(정량 데이터는 도시되지 않음). 망막층간분리증 표현형은 관찰 시간 과정 전체에 걸쳐(P15~P24) 존재하였다(C 및 F, 황색 삼각형으로 표시됨).
도 17a~17b는 시간 경과에 따른 Rs1 KO 마우스 및 야생형(WT) 마우스의 ERG 파라미터 변화를 보여준다(Naka-Rushton 분석). WT 대조군과 비교하면, 생후 15일차(P15)의 Rs1 KO 마우스에서는 a-파 및 b-파 모두의 Rmax 값이 더 낮았으며; 생후 15일차의 Rs1 KO 마우스에서는 DA-ERG의 b-파 및 LA-ERG의 b-파의 Rmax 및 감도 값 모두가 크게 감소하였다. 시간이 지날수록 Rmax 값은 지속적으로 감소하였지만, 감도 값은 Rs1 KO 및 WT 마우스에서 비슷하였다.
도 18은 시간 경과에 따른 OCT 이미지의 변화를 보여준다. 생후 15일차에는 INL 및 OPL(별표)에서 현저한 분리 및 ELM의 증거가 관찰되지 않았는데, 이는 시점이 경과할수록 완화되는 경향을 보이는 것이었다. Rs1 KO의 망막 내 타원체 구역(EZ)은 전체 기간에 걸쳐 WT보다 더 넓었다.
도 19a~19c는 정량적 OCT 분석의 결과를 보여준다. WT 마우스에서 망막(외망막 포함)은 발생 기간(C) 동안 약간 얇아졌다. Rs1 KO 마우스에서의 망막(A 및 B)은 더 얇아졌는데, 이는 주로 분리의 완화와 관련된 것이었으며, Rs1 KO 망막 내의 외망막은 기간(C) 동안 WT보다 더 얇았다.
도 20은 마우스, 랫트 및 인간 RS1 폴리펩티드의 정렬을 보여준다. 신호 서열은 밑줄이 그어져 있다. 서열이 상이한 위치는 "*"에 의해 식별된다.
정의
파괴(disruption): 일부 구현예에서, 파괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 대체, 과오 돌연변이 또는 틀 이동 또는 이들의 임의의 조합을 달성하거나 나타낼 수 있다. 삽입은 전체 유전자 또는 유전자의 단편, 예를 들어, 내인성 서열(예: 이종 서열) 이외의 기원일 수 있는 엑손의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물(예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 단백질)의 발현 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 산물(예: 암호화된 폴리펩티드)의 서열을 바꿀 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 산물(예를 들어, 암호화된 단백질)을 절단하거나 단편화할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 산물을 확장할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 손상은 융합 폴리펩티드의 조립을 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 영향을 미칠 수 있지만 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에는 영향을 미칠 수 있지만 수준에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 유의한 효과를 가지지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에 유의한 효과를 가지지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준 또는 활성에 유의한 효과를 가지지 않을 수 있다.
비인간 동물(non-human animal ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 인간이 아닌 임의의 척추 동물 유기체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 원구류, 경골어, 연골 어류(예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유동물, 및 새이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유류이다. 일부 구현예에서, 비인간 포유류는 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
실질적 상동(substantial homology ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열이 상응하는 위치에 상동성 잔기를 함유하는 경우, 이들은 "실질적 상동성"인 것으로 일반적으로 간주된다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안적으로, 상동성 잔기는 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특성을 갖는 동일하지 않은 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 바와 같이, 특정 아미노산은 일반적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로서 분류된다. 하나의 아미노산이 동일한 유형의 다른 것으로 치환되는 것은 흔히 "상동성" 치환으로 간주될 수 있다. 일반적인 아미노산 분류가 아래에 요약되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은, 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭 BLAST 및 PSI-BLAST와 같이 상업적 컴퓨터 프로그램에서 사용할 수 있는 것들을 포함하여, 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 Altschul, S. F. 외, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S. F. 외, 1997, Methods in Enzymology; Altschul, S. F. 외, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D., 및 B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 외 (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998에 기술되어 있다. 상동성 서열을 확인하는 것 외에도, 전술된 프로그램은 일반적으로 상동성의 정도에 대한 지표를 제공한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열의 상응하는 잔기의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 잔기의 관련 구간에 걸쳐 상동성인 경우 이들은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 잔기이다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열을 따라 인접 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 전체 서열을 따라 불연속 잔기, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 이의 부분의 접힌 형태에 의해 한데 모인 인접하지 않은 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 잔기이다.
실질적 동일성(substantial identity ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2개의 서열이 상응하는 위치에 동일한 잔기를 함유하는 경우, 이들은 "실질적으로 동일한" 것으로 일반적으로 간주된다. 당업계에서 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은, 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭 BLAST 및 PSI-BLAST와 같이 상업적 컴퓨터 프로그램에서 사용할 수 있는 것들을 포함하여, 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은 Altschul, S. F. 외, 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul S.F. 외의 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. 외의 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. and B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener 외 (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998에 기술되어 있다. 동일한 서열을 확인하는 것 외에도, 전술된 프로그램은 일반적으로 동일성의 정도에 대한 지표를 제공한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열의 상응하는 잔기의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 잔기의 관련 구간에 걸쳐 동일한 경우 이들은 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 잔기이다.
표적화 벡터(targeting vector ) 또는 표적화 작제물( targeting construct ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 표적 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 표적 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물에서의 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하며, 상동성 재조합을 통해 표적화 작제물 (및/또는 이에 포함된 서열)이 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내 위치에 통합되도록 한다. 부위 특이적 재조합효소 인식 부위(예: loxP 또는 Frt 부위)를 사용하는 재조합효소 매개 카세트 교환을 통해 세포, 조직 또는 동물의 위치를 표적으로 하는 표적 영역도 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 표적화 작제물은 특정 관심 핵산 서열이나 유전자(예: 리포터 유전자, 상동 유전자, 이종 유전자 또는 돌연변이 유전자), 선택 가능한 마커, 대조군 및/또는 조절 서열, 및 재조합 효소나 재조합유전성 폴리펩티드를 암호화하는 기타 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 작제물은 관심 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있으며, 관심 유전자는 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질과 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 전체적으로 또는 부분적으로 암호화한다. 일부 구현예에서, 표적화 작제물은 관심 돌연변이 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있으며, 관심 돌연변이 유전자는 내인성 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드와 유사한 기능을 갖는 변이체 폴리펩티드를 전체적으로 또는 부분적으로 암호화한다. 일부 구현예에서, 표적화 작제물은 리포터 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 포함할 수 있으며, 리포터 유전자는 당업계에 공지된 기술을 사용해 용이하게 식별되고/되거나 측정되는 폴리펩티드를 암호화한다.
변이체(variant ): 본원에서 사용되는 바와 같이, 기준 개체와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만, 기준 개체와 비교하여, 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 기준 개체와 구조적으로 상이한 개체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "변이체"는 기준 개체와 기능적으로도 상이하다. 예를 들어, "변이체 폴리펩티드"는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유 결합된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)에서의 하나 이상의 차이의 결과로서 기준 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%의 전체 서열 동일성을 보인다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 구현예에서, 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 가진다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 기준 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성의 수준의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 관심 폴리펩티드가 특정 위치에서 소수의 서열 변경을 제외하고 부모 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 경우, 관심 폴리펩티드는 부모 폴리펩티드 또는 기준 폴리펩티드의 "변이체"인 것으로 간주된다. 통상적으로, 모체와 비교해 변이체 내 잔기의 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 또는 2% 미만이 치환된다. 일부 구현예에서, "변이체"는 모체에 비해 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환된 잔기(들)를 가진다. 흔히, "변이체"는 매우 적은 수(예를 들어, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만)의 치환된 기능적 잔기(즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 가진다. 또한, "변이체"는 모체에 비해 통상적으로 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 첨가 또는 결실을 가지며, 흔히 첨가 또는 결실을 갖지 않는다. 또한, 임의의 첨가 또는 결실은, 통상적으로 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개 미만, 보통은 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2개 미만의 잔기이다. 일부 구현예에서, 부모 폴리펩티드 또는 기준 폴리펩티드는 자연계에서 발견되는 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특히 관심 폴리펩티드가 감염원 폴리펩티드인 경우, 관심 특정 폴리펩티드의 복수의 변이체는 자연에서 흔히 발견될 수 있다.
특정 구현예의 상세한 설명
망막층간 단백질-1(RS1) 폴리펩티드를 암호화하는 유전 물질에 파괴 또는 돌연변이(들)를 갖는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)와 같은 비인간 동물이 제공된다. 특히, Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부가 결실되어 RS1 폴리펩티드를 생산하지 못하는 돌연변이체 Rs1 유전자를 갖는 비인간 동물이 제공된다. 또한, 야생형 RS1 폴리펩티드(돌연변이가 없는 Rs1 유전자에 의해 암호화되는 RS1 폴리펩티드)와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 또는 돌연변이체 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체 Rs1 유전자를 생성하는 하나 이상의 돌연변이를 Rs1 유전자의 코딩 서열 내에 갖는 비인간 동물이 제공된다. 본원에 기술된 바와 같은 이러한 하나 이상의 아미노산 치환은 생산된 기능적 RS1 폴리펩티드를 제거하거나 현저하게 감소시키고, 비인간 동물에서 망막층간분리증(예: X-염색체 관련 망막층간분리증, XLRS)과 관련된 병리학적 및 기능적 특징을 형성시킨다. 따라서, 본원에 개시된 비인간 동물은 망막층간분리증의 치료 및/또는 완화를 위한 후보 치료제의 개발 및 식별에 특히 유용하다. 이러한 비인간 동물은 망막층간분리증의 치료 및/또는 완화를 위한 치료제(예를 들어, 유전자 요법)를 식별하고 개발하기 위한 세포 공급원을 제공한다. 또한, 이러한 비인간 동물은 안구 관련 질환, 장애 및 병태의 치료를 위한 치료제의 개발을 위한 유용한 동물 모델 시스템의 자원을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 수컷 동물이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 암컷 동물이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이(들)에 대한 이형접합체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이(들)에 대한 동형접합체이다.
본 개시의 다양한 양태는 다음의 섹션에서 상세히 설명된다. 이러한 섹션의 사용은 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 각각의 섹션은 본원에 기술된 하나 이상의 구현예에 적용될 수 있다. 본 출원에서, "또는(or)"의 사용은 달리 명시하지 않는 한 "및/또는(and/or)"을 의미한다.
망막층간 단백질-1 및 망막층간분리증
망막층간 단백질-1은, 염색체 Xp22.2 상에 위치된 6개의 엑손 및 5개의 인트론을 함유하는 약 32,4 kb 길이의 작은 유전자이며, 망막층간 단백질(Retinoschisin)로 불리는 224-아미노산 전구체 폴리펩티드로 번역되는 3,1 kb의 mRNA를 암호화한다. 망막층간 단백질은 4개의 상이한 도메인, 즉 세포 외부로 단백질의 전좌를 지시하는 N-말단 신호 서열(23개 아미노산); 고유 Rs1 도메인(39개 아미노산 길이의 긴/고도로 보존된 서열 모티프); 망막 세포 구조를 보존하고 적절한 시냅스 연결성(synaptic connectivity)을 확립하기 위해 RS1의 접착 기능에 기여하는 디스코이딘 도메인(157개 아미노산); 및 C 말단 분절(5개 아미노산)을 함유하는 모노머로서 발현된다.
망막층간 단백질은 소포체에서 조립되고 기능성 이황화-결합 호모-옥타머(Cys59-Cys223 이황화 결합에 의해 함께 연결된 8개의 서브유닛)로서 분비된다. 옥타머 내의 서브유닛은 추가로 Cys(40)-Cys(40) 이황화 결합에 의해 매개된 이량체로 구성된다. RS1은 이온력(ionic forces)에 의해 광수용기 내절 원형질막의 외소엽(outer leaflet)에 결합되고 세포-세포 상호작용 및 세포 부착에서 작용한다. RS1은 망막 내에서 발현되며, 주로 간상 내절 및 원뿔체 내절, 양극 세포, 및 송과선(pineal gland)에 의해 발현된다. 망막에서의 면역염색은 망막층간 단백질을 광수용기의 내절, 양극 세포, 및 내망상층과 외망상층으로 국한시킨다. 인간, 마우스, 랫트 및 토끼에는 높은 서열 상동성이 존재한다(마우스와 인간 사이에는 96% 동일하고 및 97.8% 유사함; 도 20도 참조).
망막층간분리증은 퇴행성, 유전적, 수축성 및 삼출성 형태로 분류된 심각한 안구 질환이다. 특히, 유전적 형태의 망막층간분리증인 X-염색체 관련 유아기 망막층간분리증(XLRS)은 시력 상실, 망막의 신경감각 층의 비정상적인 분리, 및 망막전이도(ERG)에서 b-파의 감소를 특징으로 하는 조기 발병성 황반 변성이다. XLRS는 망막층간 단백질-1(RS1) 유전자에서의 돌연변이에 의해 발생하며, 수컷에서만 질환을 유발하는 X-염색체 관련 열성 패턴으로 유전된다. RS1 유전자 산물에서의 돌연변이는 RS1 폴리펩티드를 전혀 갖지 않거나, 기능이 저하되었거나 전혀 기능을 갖지 않는 손상된 RS1 폴리펩티드를 생산한다. 200가지에 달하는 RS1 유전자의 돌연변이가 XLRS와 관련된 것으로 보고되었으며, 개체별로 매우 가변적인 표현형을 나타낸다(예: Kim, D.Y. 및 S. Mukai, 2013, Sem. Ophthalmol. 28(5-6):392-6에서 검토됨). 보고된 200가지에 달하는 돌연변이 중에서, 질환 유발 돌연변이의 약 40%는 넌센스 돌연변이 또는 프레임 시프트 돌연변이이며, 이들은 전장 폴리펩티드를 갖지 않을 것으로 예상된다. 그러나, 질환 유발 돌연변이의 약 50%(100/191)는 미스센스 돌연변이이며, 이는 전장 돌연변이 폴리펩티드가 생산될 수 있게 한다(Molday, R.S. 등의 Prog. Retin. Eye Res. 31:195-212 (2012년) 참조). 이들 돌연변이의 대부분(85/191)은 디스코이딘 도메인에서 발견되며, 기능적으로 불능화된 미스폴딩 폴리펩티드를 생성한다.
XLRS에 대한 다양한 표현형이 있다. 중심와(fovea)를 포함하는 낭포성 황반 병변은 XRLS의 특징적인 임상적 특징이다. 특히, "카트휠(cartwheel)" 또는 "스포크-휠(spoke-wheel)" 패턴을 갖는 중심와 분리(foveal schisis)는 기저부 검사(fundus exam)에서 특징적으로 발견되며(거의 100%의 사례에 존재함), 최대 50%의 환자에서 또는 망막 박리(retinal detachments)에서 주변부 분리가 발생할 수 있다. 주변부 분리(peripheral schisis)는, 지지되지 않는 교차 혈관으로부터의 잠재적 출혈을 동반하는 내엽(inner leaf)의 천공 및 열상으로 이어질 수 있다. 주변부의 추가적인 변화는 색소성 망막염(retinitis pigmentosa), 망막 섬유증(retinal fibrosis) 및 백색 비문증(white fleck)과 비슷한 착색(pigmentation), 및 유리체-망막 이영양증(vitreo-retinal dystrophy)을 포함한다. ERG는 현저한 b-파 감소를 나타내고, 일부 환자에서는 비정상적인 a-파를 나타내지만, 많은 경우, a-파는 정상이다.
XLRS의 임상 증상(clinical presentation)과 질환의 진행 과정은 가변적이며, 빠르게는 출생 시점에서 늦게는 학생기까지 가벼운 시각 증상(visual symptoms)만을 동반하는 것으로 나타난다. 이러한 가변성과 임상적 중증도는 유전자형과는 무관한 것으로 보이며, 암컷 보균자에게는 증상이 없다. 현재는, 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(SD-OCT)이 이러한 질환에 대한 주요 진단 기법인 반면, 기존의 관리 옵션은 저시력 보조제로 제한되어 있다. 보고된 작은 연구들에서, 탄산 탈수효소 억제제(CAI, 국소 및 경구용, 녹내장에 사용 승인됨)는 치료된 안구의 약 50%에서 시력을 개선하는 것으로 나타났다.
돌연변이체 또는 조작된 Rs1 유전자를 갖는 비인간 동물
XLRS의 이해에서는 상당한 진전을 이루었지만, XLRS의 정확한 메커니즘의 많은 부분은 알려지지 않고 있다. 본 개시는, 현재 확립된 시스템에 존재하지 않는 고유한 유전 구조에 의존하는 XLRS용 치료제를 생성하고 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템을 생성하는 것에 기초한다. 따라서, 본 개시는 XLRS용 치료제를 생성하고 개발하기 위한 개선된 생체내 시스템이 설치류(예: 마우스)와 같은 비인간 동물에서 내인성 Rs1 유전자좌에서의 유전자 변화(genetic alterations)를 생성하는 것에 의해 제공될 수 있다는 인식에 기초한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 본 개시는 무엇보다도, 인간 XLRS 질환 표현형을 반복하는 Rs1-결핍 비인간 동물 및 Rs1-조작(예, 돌연변이체 Rs1) 비인간 동물(예: 마우스와 같은 설치류 동물)을 생성하는 예시적인 전략을 구체적으로 입증한다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 함이 없이, 본원에 기술된 전략은 다른 Rs1-결핍 비인간 동물 및/또는 Rs1-조작 비인간 동물을 원하는대로 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Rs1-조작 비인간 동물은 아래의 실시예 섹션에 기술된 것들 이외의 돌연변이, 또는 돌연변이의 조합을 함유하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하도록 생성될 수 있다. 내인성 Rs1 유전자 내로 조작될 수 있는 예시적인 돌연변이는 X-염색체 관련 망막층간분리증 서열 변이 데이터베이스(RETINOSCHISISDB
Figure pct00005
)에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 비인간 동물은 내인성 Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 유전자의 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 게놈에 가지며, 이는 비인간 동물에서 생산되고 있는 기능적 RS1 폴리펩티드를 결여시킨다. 일부 구현예에서, 결실은 Rs1 유전자의 적어도 엑손 2~3을 포함한다. 엑손 2는 RS1 폴리펩티드의 아미노산 18~26을 암호화한다(아미노산 18~23은 신호 서열의 마지막 5개 아미노산임). 엑손 3은 RS1 폴리펩티드의 아미노산 27~61을 암호화한다. 일부 구현예에서, 결실은 Rs1 유전자의 엑손 1의 적어도 일부 및 엑손 2~3을 포함한다. 예를 들어, ATG 시작 코돈의 바로 3'에서 시작해 엑손 1의 3' 말단까지이면서 RS1 폴리펩티드의 아미노산 2~17을 암호화하는 엑손 1의 부분이 결실에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 결실은 Rs1 유전자의 엑손 1 내의 ATG 시작 코돈 바로 다음부터 시작해서 엑손 2를 포함하고, 엑손 3의 3' 말단까지, 또는 엑손 3의 3' 말단에 있는 6개의 뉴클레오티드까지인 인접 게놈 단편의 결실이다.
Rs1 유전자좌가 Rs1 유전자의 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 갖는 구현예 중 일부에서, Rs1 유전자좌는 리포터 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자는 Rs1 프로모터, 예를 들어, Rs1 유전자의 코딩 서열의 전체 또는 일부의 결실을 갖는 Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자좌는 Rs1 유전자의 엑손 1의 ATG 시작 코돈 바로 다음부터 시작해서 엑손 3의 3' 말단까지인 (또는 엑손 3의 3' 말단에 있는 6개의 뉴클레오티드까지인) 인접 게놈 단편의 결실을 가지며, 리포터 유전자의 코딩 서열은 Rs1 유전자의 ATG 시작 코돈에 프레임 내 융합된다. 리포터 유전자가 Rs1 유전자좌에 있는 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 결과, 리포터 유전자의 발현 패턴은 Rs1 유전자의 발현 패턴과 유사하다. 본원에서 사용하기에 적합한 리포터 유전자는, 예를 들어, lacZ, 및 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP(eGFP), 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(eYFP), 청색 형광 단백질(BFP), 강화된 청색 형광 단백질(eBFP), DsRed 및 MmGFP와 같은 리포터 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 비인간 동물은 Rs1 유전자 (예를 들어, 내인성 Rs1 유전자 또는 이종 Rs1 유전자)의 코딩 서열에 하나 이상의 점 돌연변이를 가지며, 이는 (점 돌연변이가 없는 Rs1 유전자에 의해 암호화된) 야생형 RS1 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 RS1 폴리펩티드, 예를 들어, 야생형 설치류 RS1 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체 설치류(예: 마우스 또는 랫트) RS1 폴리펩티드, 또는 야생형 인간 RS1 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 인간 RS1 폴리펩티드를 생성한다.
본원에 기술된 아미노산 치환은 Rs1 돌연변이체 대립유전자(결실 또는 점 돌연변이를 갖는 Rs1 유전자)로부터 생산된 기능적 RS1 폴리펩티드를 제거하거나 이의 수준을 현저하게 감소시킨다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 폴리펩티드의 미스폴딩, 손상된 서브유닛 또는 올리고머 조립체의 결과, 생산된 기능적 RS1 폴리펩티드의 제거 또는 이의 수준의 상당한 감소를 초래할 수 있고, 폴리펩티드가 단백질 분비 프로세스의 일부로서 ER의 막 내로 삽입될 수 없게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 신호 서열에서의 치환이며, 이는 아미노산 치환을 갖는 변이체 RS1 폴리펩티드가 분비를 위해 ER의 막 내로 삽입될 수 없게 한다. 예를 들어, 신호 서열 내의 소수성 잔기가 프롤린으로 치환되거나 친수성/하전된 잔기로 치환되면, 신호 서열이 ER 막 내로의 삽입에 필요한 α-나선 이차 구조를 받아들이는 것을 방지할 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 L13의 치환(예를 들어, L13P)이다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 디스코이딘 도메인의 측면에 위치한 영역, 즉 아미노산 24~62 및 (아미노산 220~224로 이루어진) C-말단 분절로 이루어진 Rs1 영역에서의 아미노산 치환이다. 특정 구현예에서, 치환은 위치 38, 40, 42, 59 또는 223에서 시스테인이 비-시스테인 잔기, 예를 들어, Ser, Arg, Trp, Tyr 또는 Gly로 치환되는 것이다. C40은 C40-C40 이황화-결합 이량체의 형성을 담당하며, C59 및 C223은 RS1 이량체를 옥타머로 조립할 수 있도록 이황화 분자간 결합을 형성한다. 따라서, 40, 59 또는 223에서 Cys의 치환이 단백질 접힘 및 분비에 미치는 효과는 제한될 수 있지만, 여전히, 이러한 치환을 포함하는 돌연변이체 RS1 폴리펩티드가 세포 접착 단백질로서는 작용할 수 없게 한다. 일부 구현예에서, 위치 40, 59 또는 223에서의 시스테인은 Ser, Arg, Trp, Tyr 또는 Gly 로 치환된 것이다. 치환의 특정 예는 C38S, C40S, C42S, C59S, C223S, C223R 및 C223Y를 포함한다.
다른 구현예에서, 아미노산 치환은 아미노산 63~219로 구성된, RS1 폴리펩티드의 디스코이딘 도메인에서의 치환이다.
일부 구현예에서, 디스코이딘 도메인에서의 치환은 디스코이딘 도메인 내 5개의 Cys 잔기, 즉 C63, C83, C110, C142, 및 C219 중 하나가 치환되는 것이다. Cys63과 Cys219, 및 Cys110-Cys142는 단백질 접힘에 중요한 2개의 분자내 이황화 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, 위치 63, 83, 110, 142 또는 219 중 하나에 있는 시스테인은 비-시스테인 잔기, 예를 들어, Ser, Arg, Trp, Tyr 또는 Gly로 치환된 것이다. 치환의 특정 예는 C63S, C83S, C110S, C110Y, C142S, C142R, C142W, C219S, C219R, C219W 및 C219G를 포함한다.
일부 구현예에서, 디스코이딘 도메인에서의 치환은 이황화 결합의 형성에 직접적으로 관여하지는 않지만 단백질 접힘, 디스코이딘 도메인의 형성 또는 안정성, 및/또는 인접한 서브유닛들 간의 분자간 상호작용에 중요한 아미노산 잔기의 치환이다. 이러한 잔기의 예로는, 고도로 보존된, 용매 비접근성 핵심 잔기(solvent inaccessible core residues), 예컨대 E72, G109, E146, R182, 및 P203, 뿐만 아니라 R141 및 D143를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 치환은 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 대체하는 것이며, 이는 티올 교환에 영향을 미칠 수 있다(예: W92C, W96C, R141C, R182C, R200C, P203C, 및 R209C). 일부 다른 특정 구현예에서, 치환은 아미노산 잔기의 전하를 제거 또는 역전시키거나, 티올 잔기에 영향을 미치지 않으면서 비-하전된 잔기를 하전된 잔기로 대체함으로써 단백질 전하에 영향을 미치는 것이다(예: E72K, W96R, R102W, R102Q, G109E, G109R, R141H, D143V, N179D 및 R213W). 다른 구현예에서, 치환은 Pro 잔기의 삽입 또는 제거에 의해 형태 안정성에 영향을 미칠 수 있는 것이다(예: S73P, L127P, P192S, P192T, P193S 및 P203L). 또 다른 구현예에서, 치환은 극성 잔기의 삽입 또는 제거에 의해(즉, 소수성 잔기를 극성 잔기로 대체하거나, 극성 잔기를 소수성 잔기로 대체하는 것에 의해) 소수성 코어에 영향을 줄 수 있는 것이다(예: I136T 및 N163Y).
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 하나 이상의 점 돌연변이를 Rs1 유전자 내에 포함하는데, 이는 암호화된 RS1 폴리펩티드에서 시스테인[Cys, C]을 세린[Ser, S]으로 치환시키거나, 아르기닌[Arg, R]을 시스테인[Cys, C]으로 치환시킨다. 일부 특정 구현예에서, 치환은 C59S 치환이다. 일부 특정 구현예에서, 치환은 R141C 치환이다.
일부 구현예에서, Rs1 유전자 내에 파괴 또는 돌연변이를 포함하거나, 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 이종 종(예: 인간) 유래의 유전 물질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 돌연변이체 인간 Rs1 유전자인 조작된 Rs1 유전자를 포함하되, 돌연변이체 인간 Rs1 유전자는 본원에서 전술한 치환(예: C59S 치환 또는 R141C 치환)을 포함하는 인간 RS1 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은, 본원에서 전술한 치환(예: C59S 치환 또는 R141C 치환)을 포함하는 인간 RS1 폴리펩티드가 발현되도록 비인간 동물의 게놈에 무작위 삽입되는 돌연변이체 Rs1 유전자를 포함한다.
망막층간 단백질-1 서열
예시적인 인간 및 비인간 Rs1 서열은 서열번호 1~22에 제시되어 있고 표 1에 요약되어 있다.
lacZ 리포터 유전자, 마우스 프로타민 1 프로모터에 의해 전사 조절되는 Cre 재조합효소 유전자 및 loxP 부위가 측면에 위치하고 유비퀴틴 프로모터에 의해 전사 조절되는 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 비인간(예를 들어, 마우스) Rs1 대립유전자의 파괴에 사용되는 예시적인 자가 결실 카세트는 서열번호 23에 제시되어 있다(8,202 bp). 　
비인간(예를 들어, 마우스) Rs1 대립유전자의 예시적인 결실(내인성 설치류 Rs1 유전자좌로부터 결실된 엑손 1~3의 서열)은 서열번호 24에 제시되어 있다(13,716 bp). 　
선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후에 파괴된 생쥐(Mus musculus) Rs1 대립유전자의 예시적인 부분은 서열번호 25에 제시되어 있다. 　
자가 결실 히그로마이신 선택 카세트를 포함하는 C59S 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 비인간(예: 마우스) Rs1 대립유전자의 예시적인 부분은 서열번호 26에 제시되어 있다. 　
선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후, C59S 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 비인간(예: 마우스) Rs1 대립유전자의 예시적인 부분은 서열번호 27에 제시되어 있다. 　
자가 결실 히그로마이신 선택 카세트를 포함하는 R141C 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 비인간(예: 마우스) Rs1 대립유전자의 예시적인 부분은 서열번호 28에 제시되어 있다. 　
선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후, R141C 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 비인간(예: 마우스) Rs1 대립유전자의 예시적인 부분은 서열번호 29에 제시되어 있다.
서열 번호 설명 특징
1 Mus musculus(생쥐) Rs1 mRNA (NCBI 기준 서열 NM_011302) 길이: 5855 nt
코딩 영역: nt. 174~848
엑손 1~6: nt 1~225, 226~251, 252~357, 358~499, 500~695, 696~5840.
2 Mus musculus Rs1 아미노산 (NCBI 기준 서열 NP_035432) 길이: 224 aa신호 서열: aa 1~23
3 Rattus norvegicus(시궁쥐) Rs1 mRNA (NCBI 기준 서열 NM_001104643) 길이: 675 nt코딩 영역: nt 1~675
4 Rattus norvegicus Rs1 아미노산 (NCBI 기준 서열 NP_001098113) 길이: 224 aa신호 서열: aa 1~21
5 Macaca mulatta(히말라야 원숭이) RS1 mRNA (NCBI 기준 서열 NM_001194911) 길이: 994 nt코딩 영역: nt. 42~716
6 Macaca mulatta RS1 아미노산 (NCBI 기준 서열 NP_001181840 길이: 224 aa신호 서열: aa 1~21
7 Homo sapiens(사람) RS1 mRNA (NCBI 기준 서열 NM_000330) 길이: 3039 nt코딩 영역: 36~710
엑손 1~6: 1~87, 88~113, 114~219, 220~360, 361~557, 558~3025.
8 Homo sapiens RS1 아미노산 (NCBI 기준 서열 NP_000321) 길이: 224 aa신호 서열: aa 1~23
9 Canis lupus familiaris(개) Rs1 mRNA (NCBI 기준 서열 XM_548882) 길이: 2061 nt
코딩 영역: nt 89~763
10 Canis lupus familiaris Rs1 아미노산 (NCBI 기준 서열 XP_548882)
 길이: 224 aa
11 Sus scrofa(멧돼지) Rs1 mRNA(NCBI 기준 서열 XM_013985956) 길이: 1772 nt
코딩 영역: nt 295~969
12 Sus scrofa Rs1 아미노산 (NCBI 기준 서열 XP_013841410) 길이: 224 aa
13 Bos taurus(소) Rs1 mRNA (NCBI 기준 서열 XM_010822174) 길이: 899 nt
코딩 영역: nt. 45~719
14 Bos taurus Rs1 아미노산 (NCBI 기준 서열 XP_010820476) 길이: 224 aa
15 Ovis aries(양) RS1 mRNA (NCBI 기준 서열 XM_012106316) 길이: 1604 nt
코딩 영역: nt 702~1337
16 Ovis aries(양) RS1 아미노산 (NCBI 기준 서열 XP_011961706)
 길이: 211 aa
17 Felis catus(고양이) RS1 mRNA (NCBI 기준 서열 XM_019823621) 길이: 4553 nt코딩 영역: nt. 59-733
18 Felis catus(고양이) RS1 아미노산 (NCBI 기준 서열 XP_019679180) 길이: 224 aa
19 Equus caballus(말) RS1 mRNA (NCBI 기준 서열 XM_001491183) 길이: 1193 nt코딩 영역: nt. 1~675
20 Equus caballus RS1 아미노산(NCBI 기준 서열 XP_001491233) 길이: 224 aa
21 Oryctolagus cuniculus(굴토끼) RS1 mRNA (NCBI 기준 서열 NM_001109823) 길이: 675 nt
코딩 영역: nt. 1~675
22 Oryctolagus cuniculus RS1 아미노산(NCBI 기준 서열 NP_001103293) 길이: 224 aa신호 서열: aa 1~21
23 lacZ 리포터 유전자, 마우스 프로타민 1 프로모터에 의해 전사 조절되는 Cre 재조합효소 유전자 및 loxP 부위가 측면에 위치하고 유비퀴틴 프로모터에 의해 전사 조절되는 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 비인간(예를 들어, 마우스) Rs1 대립유전자의 파괴에 사용되는 예시적인 자가 결실 카세트. 길이: 8,202 bploxP 부위: nt. 3431~3464 및 8163~8196
24 마우스 Rs1 대립유전자(엑손 1의 일부 및 엑손 2~3 포함)의 예시적인 결실 길이: 13,716 bp
25 선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후, 파괴된 생쥐 Rs1 대립유전자의 예시적인 부분. 길이: 3670 nt
마우스 서열: nt 1~100 및 3571~3670
lacZ 및 잔여 클로닝 부위: nt. 101~3570
loxP 서열: nt. 3531~3564
26 자가 결실 히그로마이신 선택 카세트를 포함하는 C59S 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 마우스 Rs1 대립유전자의 예시적인 부분 길이: 5987 nt마우스 서열: nt. 1~755 및 5788~5987
돌연변이된 코돈: nt. 572~574
엑손 3: nt. 476~581
표적화 벡터 서열: nt. 756~5787
27 선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후, C59S 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 마우스 Rs1 대립유전자의 예시적인 부분 길이: nt 1033 nt마우스 서열: nt. 1~755 및 834~1033
돌연변이된 코돈: nt. 572~574
엑손 3: nt. 476~581
표적화 벡터 서열: nt. 756~833
28 자가 결실 히그로마이신 선택 카세트를 포함하는 R141C 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이체 마우스 Rs1 대립유전자의 예시적인 부분 길이: 5629 nt마우스 서열: nt. 1~497 및 5530~5629
돌연변이된 코돈: nt. 278~280
엑손 5: nt. 184~379
표적화 벡터 서열: nt. 498~5529.
29 선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후, R141C 아미노산 치환을 암호화하는 마우스 Rs1 대립유전자의 예시적인 부분 길이: 675 nt마우스 서열: nt. 1~497
돌연변이된 코돈: nt. 278~280
엑손 5: nt. 184~379
표적화 벡터 서열: nt. 498~675.
30 프로타민 1(Prm1) 프로모터
31 Blimp1 프로모터 1 kb
32 Blimp1 프로모터 2 kb
33~41 실시예 1에 기술된 돌연변이체 Rs1 대립유전자에서의 접합 서열
42~59 실시예 1에 기술된 프라이머 및 프로브 서열
비인간 동물의 생산
본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자에서 파괴 또는 돌연변이(들)을 갖는 비인간 동물의 생산을 위한 DNA 작제물, 표적화 벡터 및 방법이 본원에 제공된다.
녹아웃 동물(예: Rs1 KO)에 대한 표적화 벡터를 제작하는 데 DNA 서열이 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자 또는 돌연변이체 (또는 조작된) Rs1 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자(예: 삽입 핵산)가 적절한 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 분자를 복제하기 위해 벡터에, 바람직하게는 DNA 벡터에 삽입된다.
폴리뉴클레오티드 분자(또는 삽입 핵산)는 표적 유전자좌 또는 유전자에 통합하고자 하는 DNA의 세그먼트를 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입 핵산은 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입 핵산은 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 발현 카세트는 관심 뉴클레오티드, 선택 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리포터 유전자를, 일부 특정 구현예에서는 발현에 영향을 미치는 다양한 조절 성분(예: 프로모터, 인핸서 등)과 함께 포함한다. 사실상, 임의의 관심 폴리뉴클레오티드가 삽입 핵산 내에 함유되어 표적 게놈 유전자좌에서 통합될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 관심 폴리뉴클레오티드가 표적화된 Rs1 유전자(또는 유전자좌)에 통합될 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 삽입 핵산에 함유된 관심 폴리뉴클레오티드는 리포터를 암호화한다. 일부 구현예에서, 삽입 핵산에 함유된 관심 폴리뉴클레오티드는 이종, 변이체 또는 이종 변이체 RS1 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 삽입 핵산에 함유된 관심 폴리뉴클레오티드는 선택성 마커 및/또는 재조합 효소를 암호화한다.
일부 구현예에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 부위 특이적 재조합 부위(예: loxP, Frt 등)가 측면에 위치하거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 재조합 부위는 리포터를 암호화하는 DNA 분절, 선택성 마커를 암호화하는 DNA 분절, 재조합 효소를 암호화하는 DNA 분절, 및 이들의 조합의 측면에 위치한다. 삽입 핵산 내에 포함될 수 있는 선택 마커, 리포터 유전자 및 재조합 효소 유전자를 포함하는 예시적인 관심 폴리뉴클레오티드가 본원에 기술된다.
크기에 따라, Rs1 유전자 또는 RS1 암호화 서열은 상업적 공급자로부터 입수 가능한 cDNA 공급원으로부터 직접 클로닝되거나 GenBank로부터 이용 가능한 공개된 서열에 기초하여 가상 환경에서(in silico) 설계될 수 있다(상기 참조). 대안적으로, 박테리아 인공 염색체(BAC) 라이브러리에 의해 관심 유전자(예: 설치류 또는 이종 Rs1 유전자)로부터 Rs1 서열이 제공될 수 있다. BAC 라이브러리에는 100~150 kb의 평균 삽입체 크기가 포함되며, 300 kb 크기의 삽입체가 수용될 수 있다(Shizuya, H. 외, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:8794-7; Swiatek, P.J. and T. Gridley, 1993, Genes Dev. 7:2071-84; Kim, U.J. 외, 1996, Genomics 34:213-8; 참조로서 본원에 통합됨). 예를 들어, 인간 및 마우스 유전자 BAC 라이브러리가 구축되었고 상업적으로 이용 가능하다(예: Invitrogen, 캘리포니아 칼즈배드). 또한, 게놈 BAC 라이브러리는 전사 조절 영역을 비롯하여 설치류 또는 이종 Rs1 서열의 공급원 역할을 할 수 있다.
대안적으로, 설치류 또는 이종 Rs1 서열은 효모 인공 염색체(YAC)로부터 단리되고, 클로닝되고/되거나 전달될 수 있다. 전체 설치류 또는 이종 Rs1 유전자가 하나 또는 여러 개의 YAC 내에서 클로닝되어 이에 포함될 수 있다. 다수의 YAC가 사용되고 중첩된 상동성의 영역을 포함하는 경우, 이들은 효모 숙주 계통 내에서 재조합되어 전체 유전자좌를 나타내는 단일 구조체를 생성할 수 있다. 당 업계에 공지된 방법 및/또는 본원에 설명된 방법에 의해 구조체를 배아 줄기 세포 또는 배아에 도입하는 것을 돕기 위해, 레트로피팅(retrofitting)에 의해 포유류 선택 카세트로 YAC 아암을 추가로 변형시킬 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 Rs1 서열을 함유하는 표적화 벡터 또는 DNA 작제물은, 일부 구현예에서, 유전자 변형 비인간 동물에서의 발현을 위해 비인간 조절 서열(예: 설치류 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 야생형 또는 부모 설치류 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 설치류 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Rs1 게놈 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 서열을 함유하는 DNA 작제물 또는 표적화 벡터는, 설치류 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 야생형 또는 부모 설치류 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환(예: C59S 또는 R141C)을 포함하는 변이체 설치류 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 설치류 Rs1 게놈 서열을 포함한다. 바람직한 아미노산 치환의 예는 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 DNA 작제물에 포함된 설치류 및/또는 이종 서열은 자연에서 발견되는 설치류 및/또는 이종 서열(예: 게놈 서열)과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 대안적으로, 이러한 서열은 인공적(예: 합성)이거나 사람의 손에 의해 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, Rs1 서열은 합성에 의한 것이며, 자연에서 발견된 설치류 또는 이종 Rs1 유전자에서 발견되는 서열 또는 서열들을 포함한다. 일부 구현예에서, Rs1 서열은 설치류 또는 이종 Rs1 유전자와 자연적으로 결합된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rs1 서열은 설치류 또는 이종 Rs1 유전자와 자연적으로 결합되지 않은 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rs1 서열은 비인간 동물에서의 발현에 최적화된 서열을 포함한다. 추가 서열이 본원에 기술된 돌연변이체 (또는 변이체) Rs1 유전자의 발현을 최적화하는 데 유용한 경우, 이러한 서열은 기존의 서열을 프로브로서 사용하여 클로닝될 수 있다. 돌연변이체 Rs1 유전자 또는 RS1 암호화 서열의 발현을 최대화하는 데 필요한 추가 서열은 원하는 결과에 따라 게놈 서열이나 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다.
DNA 작제물이나 표적화 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용해 제작될 수 있다. 예를 들어, DNA 구조체는 더 큰 플라스미드의 일부로서 제작될 수 있다. 이러한 제작은 당업계에 공지된 바와 같은 효율적인 방식으로 정확한 구조체의 클로닝 및 선택을 가능하게 한다. 본원에 기술된 바와 같은 서열을 함유하는 DNA 단편은, 원하는 동물로의 통합을 위해 이들이 잔여 플라스미드로부터 쉽게 단리될 수 있도록 플라스미드 상의 편리한 제한 부위(restriction sites) 사이에 위치될 수 있다. 플라스미드, DNA 작제물 및/또는 표적화 벡터의 제작 및 숙주 기관의 형질변환에 사용된 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템 및 일반적인 재조합 절차에 관해서는, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2 판, 편집자 Sambrook, J. 외, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989를 참조한다.
전술한 바와 같이, 파괴되었거나 조작된 Rs1 유전자를 함유하는 비인간 동물에 대한 표적화 벡터에 사용하기 위한 예시적인 비인간 Rs1 핵산 및 아미노산 서열은 위에 제공되어 있다. 다른 비인간 Rs1 서열 또한 GenBank 데이터베이스에서 확인할 수 있다. Rs1 표적화 벡터는, 일부 구현예에서, 유전자 이식된 비인간 동물의 게놈에 삽입하기 위한 리포터 유전자를 암호화하는 DNA 서열, 선택성 마커, 재조합 효소 유전자(또는 이들의 조합) 및 비인간 Rs1 서열(즉, 표적 영역의 인접 서열)을 포함한다. 일 실시예에서, 결실 시작 점은, 삽입 핵산이 내인성 조절 서열(예: 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있도록 시작 코돈의 바로 하류(3')로 설정될 수 있다. 도 2~4는, 시작 코돈을 제외한 쥣과 Rs1 유전자의 암호화 서열의 일부(예: 엑손 1~3)를 표적화 결실시키고, G418-내성 배아 줄기(ES) 세포 콜로니의 선택을 위해 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 암호화하는 lacZ 유전자 및 네오마이신 포스포트란스퍼라아제(Neo)를 암호화하는 약물 선택 카세트 유래의 서열을 함유하는 카세트로 치환하기 위한 예시적인 방법 및 표적화 벡터를 도시한다. 또한, 표적화 벡터는 ES-세포 특이적 마이크로 RNA(miRNA) 또는 생식 세포 특이적 프로모터(예: 프로타민 1 프로모터; Prot-Cre-SV40)에 의해 조절되는 재조합 효소(예: Cre)를 암호화하는 서열을 포함한다. 네오마이신 선택 카세트 및 Cre 재조합효소 암호화 서열의 측면에는 네오마이신 선택 카세트의 Cre-매개 절제를 발달 의존 방식으로 가능하게 하는 (즉, 전술한 파괴된 Rs1 유전자를 함유하는 생식 세포를 가진 설치류 유래의 자손이 발달 도중에 선택성 마커를 제거하게 하는) loxP 재조합효소 인식 부위가 위치한다(참조: 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호, 제8,354,389호, 제8,946,505호, 및 제8,946,504호; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 이는, 무엇보다도, 네오마이신 선택 카세트가 분화된 세포 또는 생식 세포로부터 자동적으로 절제되도록 한다. 따라서, 표현형 분석 이전에 네오마이신 선택 카세트는 쥣과 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 lacZ 리포터 유전자(마우스 Rs1 시작 코돈에 융합됨)만을 남기고 제거된다 (도 4).
본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물을 생성하는 방법에는 자가 결실 선택 카세트 기술이 사용된다(참조: 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호. 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 이러한 기술의 사용은 비인간 동물의 게놈 내에 약물 내성 클론의 선택을 용이하게 하는 선택 카세트의 존재로 인한 단점을 피할 수 있게 한다. 이러한 자가 결실 선택 카세트 기술은, 일부 구현예에서는, 재조합효소 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 표적화 벡터 내에 포함하는 것을 특징으로 한다. 프로모터는, 미분화 세포(즉, ES 세포)에 한정된 프로모터 활성으로 인해 프로모터가 재조합효소 유전자의 발현을 발달 의존적 방식으로 조절하도록 전사적으로 유능하다(전사 유능성에 대해서는, 예를 들어, Ram, R. 및 E. Meshorer의 Genes Dev. 23:2793-98 (2009년); Xu, J. 등의 Genes Dev. 23:2824-38 (2009년)을 또한 참조한다). 결과적으로, 재조합효소 폴리펩티드는 ES 세포의 분화(발달)가 시작된 후에만 발현된다. 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터가 통합된 ES 세포는 재조합효소 유전자의 발현을 조절하는 (즉, 재조합효소 유전자에 작동 가능하게 연결된) 프로모터의 비활성으로 인해 선택 카세트를 보유하지만, 일단 ES 세포가 재조합효소 발현 개시에 의해 분화하기 시작하면 선택 카세트의 절단을 촉진한다. 따라서, 설계에 의해, 게놈 내에 표적화 벡터를 함유하는 ES 세포로부터 발생하는 자손은 조기 발달 단계에서 재조합효소를 발현하며, 선택성 마커는 선택 카세트의 측면에 위치하는 부위 특이적 재조합효소 인식 부위에 대한 재조합효소 폴리펩티드의 작용에 의해 매개된 분화(발달)가 이루어지면 절단된다.
미분화 ES 세포 내에서 비활성인 적합한 프로모터가 본원에서 제공된다. 이러한 프로모터를 재조합효소 유전자에 작동 가능하게 연결하는 것은 발현을 가능하게 하는데, 구체적으로는 분화가 이루어질 때 발현이 일어나게 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 표적화 벡터는, 발현 시에 재조합효소 폴리펩티드가 선택성 마커의 절제(즉, 결실)를 유도하도록, 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 선택 마커의 측면에 평행하게 배향되도록 설계된다. 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는, 재조합효소 폴리펩티드가 발현 시 선택성 마커의 역전을 유도하도록 선택 마커의 측면에 역전된 배향으로 배치될 수도 있다. 일부 선택성 마커의 경우, 역전은 불활성화에 충분할 수 있다. 그러나, 선택성 마커가 완전히 제거되는 것이 바람직할 수도 있다. 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 선택 카세트의 측면에 평행한 배향으로 위치하는 경우, 분화된 세포에서 재조합효소 폴리펩티드가 발현되면 세포가 선택성 마커를 게놈으로부터 절단하게 된다. 분화된 세포가 선택된 상태로 유지되는 경우, 이들은 선택성 마커가 게놈으로부터 결실됨으로 인해 사멸하게 된다. 이러한 방식으로, 미분화 ES 세포가 숙주 배아에 대한 공여자 세포로서 추후에 사용되도록 배양물 내에서 유지되고 풍부화된다.
본원에 기술된 바와 같이, Rs1 유전자의 파괴는 Rs1 유전자 또는 이의 일부를 삽입 핵산으로 교체하는 것 또는 삽입 핵산을 이에 삽입/첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입 핵산은 리포터 유전자를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 리포터 유전자는 내인성 Rs1 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 위치된다. 이러한 변형은 내인성 Rs1 프로모터에 의해 유도되는 리포터 세포의 발현을 가능하게 한다. 대안적으로, 리포터 유전자는 내인성 Rs1 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 배치되지 않고, 또 다른 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
다양한 리포터 유전자(또는 검출 가능한 모이어티)가 본원에 기술된 표적화 벡터에 사용될 수 있다. 예시적인 리포터 유전자는, 예를 들어, β-갈락토시다아제(암호화된 lacZ 유전자), 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP), MmGFP, 청색 형광 단백질(BFP), 강화된 청색 형광 단백질(eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(eYFP), 에머랄드(Emerald), CyPet, 홍색 형광 단백질(CFP), 진청색(Cerulean), T-Sapphire, 루시퍼라제(luciferase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 방법은, β-갈락토시다아제를 암호화하는 lacZ 리포터 유전자를 사용하는 표적화 벡터의 작제를 입증하지만, 본 개시를 읽음으로써 당업자는 본원에 기술된 비인간 동물이 리포터 유전자의 부재 중에 생성되거나 당업계에 알려진 임의의 리포터 유전자를 사용해 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Rs1 표적화 벡터는, 일부 구현예에서, 유전자 이식된 비인간 동물의 게놈에 삽입하기 위한 돌연변이체 Rs1 유전자, 선택성 마커와 재조합 효소, 및 비인간 Rs1 서열(즉, 표적 영역의 측면 서열)을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 돌연변이 Rs1 유전자 또는 RS1-암호화 서열에 의해 원하는 RS1 폴리펩티드(예: 변이체 RS1 폴리펩티드)가 암호화되도록 하나 이상의 돌연변이가 (가령, 부위 지향적 돌연변이 유발에 의해) Rs1 유전자 또는 RS1-암호화 서열(예: 엑손)에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 Rs1 서열은 원하는대로 내인성 조절 서열(예: 프로모터)이나 구성 프로모터(constitutive promoter)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 도 5~7 및 8~10은 쥣과 Rs1 유전자의 엑손에 (예를 들어, 엑손 3 및 5의 각각에) 하나 이상의 선택된 점 돌연변이를 만들고, 돌연변이체 배아 줄기(ES) 세포 콜로니를 선택하기 위해 히그로마이신(Hyg)를 암호화하는 약물 선택 마커를 함유하는 카세트로 주변 인트론에 작은 결실을 만들기 위한 2개의 예시적인 표적화 벡터를 도시한다. 실시예 섹션에서 기술되는 바와 같이, 각각의 점 돌연변이를 위해 주변 마우스 Rs1 인트론에 도입된 작은 결실은 돌연변이체 (또는 변이체) ES 세포 콜로니의 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었다. 도 5 및 8에 도시된 바와 같이, 표적화 벡터는 ES-세포 특이적 miRNA 또는 생식 세포 특이적 프로모터(예: 프로타민 1 프로모터; Prot-Cre-SV40)에 의해 조절되는 재조합효소(예: Cre)를 암호화하는 서열도 각각 포함하였다. 히그로마이신 선택 카세트 및 Cre 재조합효소 암호화 서열은 히그로마이신 선택 카세트의 Cre-매개된 절제를 발달 의존 방식으로 (예를 들어, 전술한 돌연변이체 (또는 변이체) Rs1 유전자를 함유하는 생식 세포를 가진 설치류 유래의 자손이 발달 도중에 선택성 마커를 제거하게 되는 방식으로) 가능하게 하는 loxP 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한다(참조: 미국 특허 번호 제8,697,851호, 제8,518,392호, 제8,354,389호, 제8,946,505호, 및 제8,946,504호. 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 이는, 무엇보다도, 히그로마이신 선택 카세트가 분화된 세포 또는 생식 세포로부터 자동적으로 절제되도록 한다. 따라서, 히그로마이신 선택 카세트는 쥣과 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 돌연변이 Rs1 엑손들만을 남기고 표현형 분석 이전에 제거된다(도 7 및 10).
Rs1 표적화 벡터는, 일부 구현예에서, 전술한 바와 같은 돌연변이체 (또는 변이체) Rs1에 상응하는 DNA 서열을 포함할 수 있는데, 상기 돌연변이체 (또는 변이체) Rs1 유전자는 이종 Rs1 유전자 또는 이종 RS1 암호화 서열을 포함한다. 적합한 이종 Rs1 서열은 본원에서 제공되며, 아래의 실시예 섹션에서 예시된 서열로 치환될 수 있다. 이러한 이종 서열은 야생형 또는 부모 이종 RS1 폴리펩티드 서열과 비교해 아미노산 치환을 암호화하는 점 돌연변이를 포함하도록 조작될 수도 있다.
경우에 따라, 리포터 폴리펩티드(및/또는 선택성 마커, 및/또는 재조합효소)를 전체적 또는 부분적으로 암호화하거나 RS1 폴리펩티드(예: 변이체 RS1 폴리펩티드)를 암호화하는 유전 물질 또는 폴리뉴클레오티드 서열(들)의 코딩 영역은 비인간 동물에서의 발현에 최적화된 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다(예: 미국 특허 제5,670,356호 및 제5,874,304호 참조). 코돈 최적화된 서열은 합성 서열이고, 바람직하게는 코돈 최적화되지 않은 모 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 동일한 폴리펩티드(또는 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 전장 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 리포터 폴리펩티드(예: lacZ)를 암호화하는 유전 물질의 코딩 영역은, 특정한 세포 유형(예를 들어, 설치류 세포)에 대한 코돈 사용을 최적화하기 위해 변경된 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 RS1 폴리펩티드(예: 변이체 RS1 폴리펩티드)를 전체적 또는 부분적으로 암호화하는 유전 물질의 코딩 영역은, 특정한 세포 유형(예를 들어, 설치류 세포)에 대해 코돈 사용을 최적화하도록 변경된 서열을 포함할 수 있다. 한 가지 예를 들자면, 비인간 동물(예: 설치류)의 게놈에 삽입될 리포터 또는 돌연변이 Rs1 유전자의 코돈은 비인간 동물의 세포에서의 발현에 최적화될 수 있다. 이러한 서열은 코돈 최적화 서열로서 기술될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자에 파괴 또는 돌연변이를 포함하는 비인간 동물을 만들기 위한 조성물 및 방법이 제공되며, 이에는 Rs1 프로모터와 같은 Rs1 조절 서열의 조절 하에 리포터 유전자를 발현하는 비인간 동물, 및 Rs1 프로모터와 같은 Rs1 조절 서열의 조절 하에 변이체 RS1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 만들기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 프로모터(예: 내인성 Rs1 프로모터)와 같은 내인성 조절 서열의 조절 하에 리포터 유전자 또는 변이체 RS1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 만들기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은, Rs1 유전자의 코딩 서열의 일부가 전체적으로 또는 부분적으로 결실되도록, 리포터 유전자(예: lacZ; 도 2~4 참조)를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터를 비인간 동물의 게놈에 삽입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 Rs1 유전자의 엑손 1~3이 결실되도록 비인간 동물의 게놈에 표적화 벡터를 삽입하는 단계를 포함한다.
Rs1 프로모터(예: 내인성 Rs1 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자를 삽입하면 게놈의 변형이 상대적으로 최소한으로 사용되고, 비인간 동물에서 Rs1-특이적 방식으로 리포터 폴리펩티드가 발현된다(예를 들어, 도 11 참조). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터를 포함하는 Rs1 유전자를 포함하고, 일부 특정 구현예에서는 도2 또는 4에 나타나는 표적화 벡터를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자는 리포터 유전자의 삽입으로 생성된 하나 이상의 (예: 제1 및 제2) 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자는 서열 번호 33과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 34와 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자는 서열 번호 33과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 34와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자는 서열 번호 33과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 35와 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자는 서열 번호 33과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 35와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자 또는 대립 유전자는 서열번호 23 또는 서열번호 25와 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자 또는 대립 유전자는 서열번호 23 또는 서열번호 25와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자 또는 대립유전자는 내인성 Rs1 유전자 또는 대립유전자의 13,716 bp의 결실을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 Rs1 유전자 또는 대립 유전자는 서열번호 24와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열이 결여된다.
상기 방법은 또한, Rs1 유전자의 코딩 서열의 일부(예: 엑손)가 변경되도록, 변이체 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터를 비인간 동물의 게놈에 전체적으로 또는 부분적으로 삽입하는 단계를 포함한다(도 5~7 및 8~10 참조). 일부 구현예에서, 상기 방법은 Rs1 유전자의 엑손이 변이체 RS1 폴리펩티드를 암호화하기 위해 돌연변이되도록, 비인간 동물의 게놈에 표적화 벡터를 삽입하는 단계를 포함한다.
Rs1 프로모터(예: 내인성 Rs1 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 돌연변이체 Rs1 유전자를 삽입하면 게놈의 변형이 상대적으로 최소한으로 사용되고, 야생형 비인간 동물에서 나타나는 RS1 폴리펩티드와 기능적 및 구조적으로 상이한 변이체 RS1 폴리펩티드가 비인간 동물에서 발현된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 세포는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터를 포함하는 Rs1 유전자를 포함하고, 일부 특정 구현예에서는 도5 또는 8에 나타나는 표적화 벡터를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터의 삽입으로 생성된 하나 이상의(예: 제1 및 제2) 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열 번호 36과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 37과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열 번호 36과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 37과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열번호 38과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 삽입 접합부를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열번호 38과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 돌연변이체 Rs1 유전자는, 돌연변이체 Rs1 유전자가 C59S 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 점 돌연변이를 포함하는 제3 엑손을 포함한다. 다양한 구현예에서, 돌연변이체 Rs1 유전자는, 돌연변이체 Rs1 유전자가 C59S 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 TGT에서 AGT로의 코돈 돌연변이를 포함하는 제3 엑손을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열 번호 39와 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 40과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열 번호 39와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제1 삽입 접합부 및 서열 번호 40과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 제2 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열번호 41과 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함하는 삽입 접합부를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는 서열번호 41과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 삽입 접합부를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는, 돌연변이체 Rs1 유전자가 R141C 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 점 돌연변이를 포함하는 제5 엑손을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자는, 돌연변이체 Rs1 유전자가 R141C 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 CGC에서 TGC로의 코돈 돌연변이를 포함하는 제5 엑손을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자 또는 대립 유전자는 서열번호 27, 또는 서열번호 29와 적어도 80%(예: 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상) 동일한 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자 또는 대립 유전자는 서열번호 27 또는 서열번호 29와 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
대안적으로, 다른 Rs1 유전자 또는 RS1-암호화 서열이 본원에 기술된 방법에 사용되어 본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 Rs1 유전자를 함유하는 게놈을 가진 비인간 동물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 이종 Rs1 유전자는 비인간 동물에 도입될 수 있으며, 상기 이종 Rs1 유전자는 본원에 기술된 바와 같은 변이체 RS1 폴리펩티드를 암호화한다(즉, 비인간 동물에서 망막층간분리증-유사 표현형을 확립하는 돌연변이를 포함함). 또 다른 예에서, 유전자 이식된 Rs1 유전자가 (예를 들어, 유전자 변형, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드와의 유전자 녹다운 등을 통해) 비인간 동물의 게놈 및 비기능적이 된 내인성 Rs1 유전자에 무작위로 삽입될 수 있다. 예시적인 대안적 Rs1 유전자 또는 RS1 암호화 서열이 본원에서 제공된다. 당업자는 본 개시를 읽음으로써 이러한 Rs1 유전자 또는 RS1-암호화 서열이 본원에 기술된 방법에 사용되어 비인간 동물을 생성시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기술된 표적화 벡터가 ES 세포에 도입되어, 본원 및 Frendewey, D., 등의 Methods Enzymol. 476:295-307(2010년)에 기술된 바와 같은 파괴된 또는 돌연변이체 Rs1 유전자를 포함하는 ES 클론에 대해 스크리닝될 수 있다. 　 다양한 숙주 배아가 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적화된 유전자 변형을 갖는 다능성(pluripotent) 및/또는 재생성(totipotent) 세포가 상응하는 기관으로부터 전 상실배기(pre-morula stage) 배아(예: 8세포 단계 배아)에 도입될 수 있다. 참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,576,259호, 제7,659,442호, 제7,294,754호, 및 미국 특허 출원 번호 제2008-0078000 A1호 (이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨). 다른 예에서, 공여자 ES 세포가 2세포 단계, 4세포 단계, 8세포 단계, 16세포 단계, 32세포 단계, 또는 64세포 단계에 숙주 배아에 이식될 수 있다. 숙주 배아는 배반포(blastocyst)일 수도 있고, 배반포 전 배아(pre-blastocyst embryo), 상실배전기 배아(pre-morula stage embryo), 상실배기 배아(morula stage embryo), 전기 상실배기 배아(uncompacted morula stage embryo), 또는 후기 상실배기 배아(compacted morula stage embryo)일 수 있다.
일부 구현예에서, 양성 ES 세포를 8세포 배아에 주입하여 lacZ 발현 프로파일링 또는 동형접합성 교배가 즉시 가능한 완전한 ES 세포 유래의 F0 세대 이형접합체 마우스를 생성하기 위해 VELOCIMOUSE® 방법(Poueymirou, W.T. 등의 Nat. Biotechnol. 25:91-99(2007년) 참조)이 적용될 수 있다. 파괴된 또는 돌연변이체 Rs1 유전자를 갖는 비인간 동물을 생성하는 예시적인 방법이 실시예 섹션에서 제공된다.
녹아웃(knockouts) 및 녹인(knock-ins)을 포함하여 유전자이식 비인간 동물을 생성하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다(예: Kitamura, D. 외의 1991, Nature 350:423-6; Komori, T. 외의 1993, Science 261:1171-5; Shinkai, Y. 외의 1993, Science 259:822-5; Mansour, S.L. 외의 1998, Nature 336:348-52; Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000; Valenzuela, D.M. 외의 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; Adams, N.C. 및 N.W. Gale, in Mammalian and Avian Transgenesis-New Approaches, ed. Lois, S.P.a.C., Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2006 참조). 예를 들어, 유전자이식 설치류의 생성은 내인성 설치류의 유전자좌를 손상시키고 (일부 구현예에서는, 내인성 설치류 유전자와 동일한 위치에 있는) 설치류 게놈에 리포터 유전자를 도입하거나, 내인성 설치류 유전자의 유전자좌를 변경하고 (일부 구현예에서는, 내인성 설치류 유전자와 동일한 위치에 있는) 설치류 게놈에 하나 이상의 돌연변이를 도입하여, 변이체 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
마우스 Rs1 유전자의 게놈 구성에 대한 개략도(축척에 비례하지는 않음)가 도 1에 제공된다. 리포터 유전자를 사용하여 마우스 Rs1 유전자의 코딩 서열의 일부를 결실시키기 위한 예시적인 표적화 벡터가 도 2에 제공된다. 도시된 바와 같이, 마우스 Rs1 유전자의 엑손 1~3을(엑손 1의 ATG 시작 코돈은 제외함) 함유하는 게놈 DNA가 결실되어, 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 자체 결실 약물 선택 카세트 및 리포터 유전자로 치환된다. 표적화 벡터는 재조합효소가 미분화 세포에서 발현되도록, 발달적으로 조절되는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 재조합효소 암호화 서열을 포함한다. 상동성 재조합 시, 내인성 마우스 Rs1 유전자의 엑손 1~3은 도시된 바와 같이 표적화 벡터에 함유된 서열에 의해 결실(또는 대체)되고, 도 4에 도시된 구조를 갖는 Rs1 유전자를 갖는 조작된 마우스는 마우스 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 lacZ 리포터 유전자(마우스 Rs1 시작 코돈에 융합됨)를 남겨두고 발달 도중에 네오마이신 카세트를 Cre-매개 절제함으로써 생성된다.
마우스 Rs1 유전자에 돌연변이(예를 들어, 치환 돌연변이)를 생성하기 위한 예시적인 표적화 벡터는 도 5~7 및 8~10에 제공되어 있다. 도시된 바와 같이, 돌연변이체 마우스 Rs1 유전자(즉, 엑손 3 또는 5에 점 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Rs1 유전자)는, 돌연변이 Rs1 엑손의 하류 및 Rs1 인트론 내에 위치한 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 자체 결실 약물 선택 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용해 생성된다(도 5 또는 8도 참조할 것). 표적화 벡터는 재조합효소가 미분화 세포에서 발현되도록 발달적으로 조절되는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 재조합효소 암호화 서열을 포함한다. 상동성 재조합 시, 내인성 마우스 Rs1 유전자의 하나의 엑손(및 주변 인트론)은 도시된 바와 같이 표적화 벡터에 함유된 서열에 의해 대체되며, 도 7 또는 10에 도시된 구조를 갖는 돌연변이체 Rs1 유전자를 갖는 조작된 마우스는 마우스 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 하나의 엑손에 점 돌연변이를 갖는 돌연변이체 Rs1 유전자, 및 인접 인트론(들) 내의 작은 결실들을 (고유한 loxP 부위와 함께) 남겨두고 발달 도중에 선택 카세트를 Cre 매개 절제함으로써 생성된다. 생성된 돌연변이체 Rs1 유전자는 아미노산 치환(예를 들어, C59S 또는 R141C)을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 각각 암호화한다.
본원에 기술된 표적화 벡터에 포함될 수 있는 예시적인 프로모터는 프로타민 1 (Prm1) 프로모터(예컨대, 서열번호 30에 제시된 것), Blimp1 프로모터 1 kb(예컨대, 서열번호 31에 제시된 것), 및 Blimp1 프로모터 2 kb(서열번호 32에 제시된 것)를 포함한다. 본원에 기술된 표적화 벡터에 사용될 수 있는 적합한 추가 프로모터는 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호(이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨)에 기술된 것들을 포함한다.
유전자 이식된 파운더(founder) 비인간 동물은, 그의 게놈 내 리포터 유전자의 존재 (또는 Rs1의 부재) 및/또는 비인간 동물의 조직이나 세포에서 리포터의 발현 (또는 RS1의 발현 결여), 또는 Rs1 코딩 서열(예: 엑손) 내 하나 이상의 점 돌연변이의 존재 및/또는 그의 게놈 내 비-암호화 Rs1 서열(예: 인트론)의 결실 및/또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에서 변이체 RS1 폴리펩티드의 발현 (또는 야생형 RS1 폴리펩티드의 발현 결여)에 기초하여 식별될 수 있다. 이어서, 유전자 이식된 파운더 비인간 동물은 리포터 유전자 또는 돌연변이체 Rs1 유전자를 가진 추가 비인간 동물과 교배시켜, 본원에 기술된 바와 같은 파괴된 또는 돌연변이체 Rs1 유전자의 하나 이상의 카피를 각각 갖는 일련의 비인간 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
유전자 이식된 비인간 동물은 이식 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, 삽입 핵산)의 발현을 조절하거나 지시할 수 있는 선택된 시스템을 함유하도록 생산될 수도 있다. 예시적인 시스템은 박테리오파지 P1의 Cre/loxP 재조합 효소 시스템(예를 들어, Lakso, M. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992년) 참조) 및 S. 세레비시아(S. cerevisiae)의 FLT/Frt 재조합효소 시스템(O'Gorman, S. 등의 Science 251:1351-1355 (1991년))을 포함한다. 이러한 동물은 "이중(double)" 유전자이식 동물을 작제를 통해, 예를 들어, 2가지의 유전자 이식 동물, 즉 선택된 폴리펩티드(예: 리포터, 또는 변이체 또는 이종 RS1 폴리펩티드)를 암호화하는 이식 유전자를 함유하는 한 가지와 재조합효소(예: Cre 재조합효소)를 암호화하는 이식 유전자를 함유하는 다른 한 가지를 교배시킴으로써 제공될 수 있다.
Rs1 유전자에서의 파괴나 돌연변이를 마우스에 사용하는 구현예들이 본원에서 집중적으로 논의되지만, 이러한 변형(또는 변경)을 Rs1 유전자좌에 포함하는 다른 비인간 동물도 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 비인간 동물은 내인성 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 리포터의 삽입을 특징으로 하는 Rs1 유전자에서의 파괴(예: Rs1 코딩 서열의 일부가 결실된 마우스), 또는 내인성 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 돌연변이체 Rs1 엑손 또는 엑손들(예: 하나 이상의 점 돌연변이를 함유하는 엑손)의 삽입을 특징으로 하는 Rs1 유전자에서의 돌연변이(예: 하나 이상의 Rs1 엑손에 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 마우스)를 포함한다. 이러한 비인간 동물은, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소(예: 젖소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류(예: 마모셋, 붉은털 원숭이) 등과 같은 포유 동물을 포함하여, 본원에 개시된 바와 같은 Rs1 유전자의 코딩 서열을 파괴하거나 돌연변이시키도록 유전적으로 변형될 수 있는 임의의 것들을 포함한다. 적절한 유전자 변형이 가능한 ES 세포를 쉽게 구할 수 없는 비인간 동물의 경우, 유전자 변형을 포함하여 비인간 동물을 제조하기 위한 다른 방법이 사용된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 비ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 다능성 세포)을 변형하는 단계 및 적합한 세포, 예를 들어, 핵이 없는 난모세포에 유전자 변형된 게놈을 전달하기 위해 체세포 핵 전달(SCNT)을 채용하는 단계, 및 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에 비-인간 동물에 잉태시키는 단계를 포함한다.
간단히 설명하자면, 핵전사를 위한 방법은: (1) 난모 세포를 탈핵하는 단계; (2) 탈핵된 난모 세포와 결합될 공여자 세포 또는 핵을 단리하는 단계; (3) 공여자 세포 또는 핵을 탈핵된 난모 세포에 삽입하여 재구성 세포를 형성시키는 단계; (4) 재구성 세포를 동물의 자궁에 이식하여 배아를 형성시키는 단계; 및 (5) 배아를 발달시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 난모 세포를 살아있는 동물의 난관(oviducts) 및/또는 난소(ovaries)에서 단리할 수도 있지만, 일반적으로는 죽은 동물로부터 수거한다. 탈핵에 앞서, 난모 세포는 당업자에게 공지된 다양한 배지에서 성숙될 수 있다. 난모 세포의 탈핵은 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 탈핵된 난모 세포에 공여자 세포 또는 핵을 삽입하여 재구성 세포를 형성시키는 것은 융합 이전에 투명대(zona pellucida) 밑에 공여자 세포를 미세 주입함으로써 일반적으로 달성된다. 융합은, 접촉/융합면에 걸쳐 DC 전기 펄스를 적용(전기 융합)시키거나, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합 촉진 화학물질에 세포를 노출시키거나, 센다이 바이러스(Sendai virus)와 같은 비활성화 바이러스를 통해 유도될 수 있다. 재구성 세포는 핵 공여자와 수여자 난모 세포의 융합 이전, 도중 및/또는 이후에 전기적 및/또는 비전기적 수단에 의해 일반적으로 활성화된다. 활성화 방법에는 전기 펄스, 화학적으로 유도된 충격, 정자에 의한 침투, 난모 세포에서 2가 양이온 레벨의 증가, 및 (키나아제 억제제를 통한) 난모 세포에서 세포 단백질의 인산화 감소가 포함된다. 활성화된 재구성 세포 또는 배아는 일반적으로 당업자에게 공지된 배지에서 배양된 후 동물의 자궁에 옮겨진다. 예시적인 참조 문헌: 미국 특허 번호 제7,612,250호; 미국 특허 출원 공개 번호 제2004-0177390 A1호 및 제2008-0092249 A1호; 및 국제 특허 출원 공개 번호 제WO 1999/005266 A2호 및 제WO 2008/017234 Al호 (이들 각각은 본원에 참조로서 통합됨).
비인간 동물 게놈(예: 돼지, 젖소, 설치류, 닭 등의 게놈)을 변형하는 방법은, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN), 전사 활성인자 유사 작동자 뉴클레아제(TALEN), 또는 Cas 단백질(즉, CRISPR/Cas 시스템)을 사용하여 게놈이 본원에 기술된 바와 같은 손상된 또는 돌연변이체 Rs1 유전자를 포함하도록 변형시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 비인간 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은, 예를 들어, 뛰는 쥐상과(Dipodoidea 또는 Muroidea) 아목의 작은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물은 설치류이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 설치류는 마우스, 랫트 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 설치류는 쥐상과 아목으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스 유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예: 햄스터, 미국 랫트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(진짜 마우스 및 랫트, 사막쥐, 가시쥐, 갈기쥐), 네소미스과(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 락 마우스(rock mice), 흰꼬리 랫트, 말라가시 랫트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예: 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae)(예: 두더쥐, 대나무쥐, 및 동북)로부터 선택된 과(family)로부터 유래한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 설치류는 진짜 마우스 또는 랫트(쥐상과), 사막쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mouse), 갈기쥐(crested rat)로부터 선택된다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스는 쥐상과의 구성원으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 설치류는 마우스와 랫트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물은 마우스이다.
일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An,C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10,C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 일부 특정 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어지는 군으로부터 선택된 129 계통이다(예: Festing 외, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. 외, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032 참조). 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 변형된 마우스는 전술한 129 계통 및 전술한 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스는 전술한 129 계통의 혼합체, 또는 전술한 BL/6 계통의 혼합체이다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스는 Crb1 rd8 돌연변이를 함유하지 않거나 결여된 (즉, 야생형 Crb1를 포함하는) 전술한 BL/6 계통의 혼합체이거나 이로부터 유래된다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 129 계통의 혼합체는 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스는 BALB 계통, 예를 들어 BALB/c 계통이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 마우스는 BALB 계통 및 전술한 다른 계통의 혼합체이다.
일부 구현예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 비인간 동물은 랫트이다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 랫트는 위스타 랫트(Wistar rat), LEA 계통, 스프래그 다울리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 랫트 계통은 위스타, LEA, 스프래그 다울리, 피셔, F344, F6, 및 아크 아구티로 이루어지는 군으로부터 선택된 2가지 이상 계통의 혼합체이다.
랫트 다능성 및/또는 재생성 세포는, 예를 들어, ACI 랫트 계통, 검은 아구티(Dark Agouti, DA) 랫트 계통, 위스타 랫트 계통, LEA 랫트 계통, 스프래그 다울리(SD) 랫트 계통, 또는 피셔 F344나 피셔 F6과 같은 피셔 랫트 계통을 포함하는 임의의 랫트 계통으로부터 유래될 수 있다. 랫트 다능성 및/또는 재생성 세포는 위에 인용된 하나 이상의 계통의 혼합체로부터 유래된 계통으로부터 수득될 수도 있다. 예를 들어, 랫트 다능성 및/또는 재생성 세포는 DA 균주 또는 ACI 균주로부터 유래될 수 있다. ACI 랫트 균주는 흰 배와 다리 및 RT1 av1 일배체형을 가진 검은 아구티를 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 계통은 Harlan Laboratories를 포함하는 다양한 공급원으로부터 이용이 가능한다. ACI 랫트 유래의 랫트 ES 세포주의 예는 ACI.G1 랫트 ES 세포이다. 검은 아구티(DA) 랫트 균주는 아구티 코트(coat) 및 RT1 av1 일배체형을 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하는 다양한 공급원으로부터 이용이 가능한다. DA 랫트 유래의 랫트 ES 세포주의 실시예는 DA.2B 랫트 ES 세포주 및 DA.2C 랫트 ES 세포주이다. 일부 경우에, 랫트 다능성 및/또는 재생성 세포는 동종 번식된 랫트 균주로부터 유래된다. 예시적 참조 문헌: 미국 특허 공개 번호 제2014-0235933 A1호(본원에 참조로서 통합됨). 랫트 ES 세포 및 유전적으로 변형된 랫트를 제조하는 방법 또한 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, US 2014/0235933 A1, US 2014/0310828 A1, Tong 등의 (2010) Nature 467:211-215, 및 Tong 등의 (2011) Nat Protoc. 6(6): doi:10.1038/nprot.2011.338을 참조한다(이들 모두는 참조로서 본원에 통합됨).
Rs1 유전자에 파괴 또는 돌연변이를 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는 기능 상실(loss-of-function)을 초래한다. 특히, 기능 상실 돌연변이는 RS1의 발현을 감소 또는 결여시키고/결여시키거나 RS1의 활성/기능을 감소시키거나 결여시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 기능 상실 돌연변이는 야생형 비인간 동물과 비교하여 하나 이상의 표현형을 초래한다. RS1의 발현은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 세포 또는 조직에서 RS1의 수준을 분석함으로써 직접적으로 측정될 수 있다.
일반적으로, RS1의 발현 및/또는 활성 수준이 동일한 파괴(예: 결실)를 포함하지 않는 적절한 대조군 세포 또는 비인간 동물에서의 RS1 수준보다 통계적으로 낮은 경우(p≤0.05), RS1의 발현 수준 및/또는 활성이 감소한다. 일부 구현예에서, RS1의 농도 및/또는 활성은 동일한 파괴(예: 결실)가 없는 대조군 세포 또는 비인간 동물에 비해 동형접합성 암컷 또는 반접합성 수컷 동물에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 감소한다.
다른 구현예에서, RS1의 발현 수준 및/또는 활성을 감소시키는 파괴 또는 돌연변이를 Rs1 유전자에 갖는 세포 또는 기관은, 서던 블롯 분석(Southern blot analysis), DNA 시퀀싱, PCR 분석, 또는 표현형 분석을 포함하되 이들로 한정되지 않는 방법을 사용해 선택된다. 이어서, 이러한 세포 또는 비인간 동물은 본원에 기술된 다양한 방법 및 조성물에 사용된다.
일부 구현예에서, 내인성 Rs1 유전자는 결실되지 않는다 (즉, 온전하게 유지된다). 일부 구현예에서, 내인성 Rs1 유전자는 변경, 파괴, 결실되거나 이종 서열(예: 리포터 유전자 암호화 서열)로 대체된다. 일부 구현예에서, 내인성 Rs1 유전자의 전부 또는 실질적으로 전부가 삽입 핵산으로 대체되는데; 일부 특정 구현예에서, 대체는 리포터 유전자가 Rs1 프로모터(예: 내인성 Rs1 프로모터)와 작동 가능하게 연결되도록, 내인성 Rs1 유전자의 코딩 서열 중 일부가 리포터 유전자(예: lacZ)로 대체되는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자의 일부(예: 이의 기능적 단편)는 내인성 비인간 Rs1 유전자에 삽입된다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자는 lacZ 유전자이다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자는 암컷 비인간 동물에서 내인성 Rs1 유전자의 2개의 카피 중 하나에 삽입되어, 리포터 유전자에 대해 이형접합성인 비인간 암컷 동물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자에 대해 동형접합성인 비인간 암컷 동물이 제공된다.
Rs1 유전자에 돌연변이(들)를 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자에서의 돌연변이는 변이체 RS1 폴리펩티드(예: 야생형 RS1 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드)를 발현시킨다. 변이체 RS1의 발현은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 세포 또는 조직에서의 변이체 RS1의 수준을 분석함으로써 직접적으로 측정될 수 있다.
다른 구현예에서, Rs1 유전자에 돌연변이(들)를 갖는 세포 또는 기관은, 서던 블롯 분석, DNA 시퀀싱, PCR 분석, 또는 표현형 분석을 포함하되 이들로 한정되는 않는 방법을 사용해 선택된다. 이어서, 이러한 세포 또는 비인간 동물은 본원에 기술된 다양한 방법 및 조성물에 사용된다.
일부 구현예에서, 내인성 Rs1 유전자는 돌연변이 Rs1 서열(예: 돌연변이체 RS1 암호화 서열의 전체 또는 부분)로 변경되거나 이와 대체된다. 일부 구현예에서, 내인성 Rs1 유전자의 전부 또는 실질적으로 전부가 삽입 핵산으로 대체되는데; 일부 특정 구현예에서, 치환은 돌연변이체 Rs1 엑손이 Rs1 프로모터(예를 들어, 내인성 Rs1 (프로모터) 및 기타 내인성 Rs1 엑손들과 작동 가능하게 연결되도록 내인성 Rs1 엑손(예를 들어, 엑손 3 또는 5)를 돌연변이체 Rs1 엑손(예를 들어, 합성 엑손 3 또는 합성 엑손 5)와 대체하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Rs1 엑손은 내인성 Rs1 유전자에 삽입되는데, 돌연변이체 Rs1 엑손은 하나 이상의 점 돌연변이를 함유하며; 일부 특정 구현예에서는 1개의 점 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Rs1 엑손은 암컷 비인간 동물에서의 내인성 Rs1 유전자의 2개의 카피 중 1개에 삽입되어, 돌연변이체 Rs1 엑손에 대해 이형접합성인 암컷 비인간 동물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 Rs1 엑손에 대해 동형접합성인 암컷 비인간 동물이 제공된다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 내인성 Rs1 유전자를 포함하는 비인간 동물은 결실 및/또는 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위(예: loxP)를 포함하는 하나 이상의 Rs1 인트론을 추가로 포함한다.
망막층간분리증의 비인간 동물 모델 및 이의 사용 방법
본원에 기술된 비인간 동물은 망막층간분리증을 위한 개선된 동물 모델을 제공한다. 특히, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은, 예를 들어 망막 퇴화로 인한 중심 시각 및 주변부 시각의 진행성 상실을 특징으로 하는, X-염색체 관련 망막층간분리증 질환 병리학에 대해 번역되는 개선된 동물 모델을 제공한다.
예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는 본원에 제공된 비인간 동물에서 다양한 증상(또는 표현형)을 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는, 출생 시 지극히 정상이지만 수령이 늘어날 때 (예를 들어 8주 후, 9주 후, 10주 후, 11주 후, 12주 후, 13주 후, 14주 후, 15주 후, 16주 후, 17주 후, 18주 후, 19주 후, 20주 후, 21주 후, 22주 후, 23주 후, 24주 후, 25주 후, 26주 후, 27주 후, 28주 후, 29주 후, 30주 후, 31주 후, 32주 후, 33주 후, 34주 후, 35주 후, 36주 후, 37주 후, 38주 후, 39주 후, 40주 후, 41주 후, 42주 후, 43주 후, 44주 후, 45주 후, 46주 후, 47주 후, 48주 후, 49주 후, 50주 후, 51주 후, 52주 후, 53주 후, 54주 후, 55주 후, 56주 후, 57주 후, 58주 후, 59주 후, 60주 후 등) 하나 이상의 증상을 나타내는 비인간 동물을 생성한다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자에서의 파괴 또는 돌연변이는 비인간 동물의 망막 중 하나 또는 둘 다에 대해 구조적 및/또는 기능적 이상을 초래한다. 일부 구현예에서, Rs1 유전자의 파괴는 망막층간분리증과 관련된 하나 이상의 증상(또는 표현형)을 나타내는 비인간 동물을 생성한다. 이러한 증상(또는 표현형)은, 예를 들어, 망막 중 하나 또는 둘 다가 2개의 층으로 분리되는 것, 비정상적인 망막 및/또는 황반 구조 또는 아키텍처, 중심와(황반의 중심) 내의 스포크형 스트리크(streak), 망막 중 하나 또는 둘 다가 2개의 층으로 분리되어 생성된 공간 내 블리스터(blister) 및/또는 혈관 파열의 존재, 망막 중 하나 또는 둘 다의 유리체 내로 혈액의 유출, 시력 상실 및/또는 장애, 실명, 망막 착색 및/또는 퇴화, 유리체의 퇴화 또는 망막으로부터의 분리, 및 망막 박리를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 증상 또는 표현형은 내망막 내 낭포 구조의 발생, 및 야생형 비인간 동물과 비교하여 ERG b- 및 a-파 반응의 감소를 포함하며, 이는 광수용기 세포의 상실로 이어진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 Rs1 유전자좌에서의 파괴 또는 돌연변이는 비인간 동물에서 망막의 기능적 및 형태학적 표현형이 조기에 (예를 들어, 출생일에 또는 출생 후 15, 18, 21, 24 또는 27일 이내에) 나타나도록 한다. 일부 구현예에서, 망막의 조기 발병성 기능적 결함은, 야생형 비인간 동물과 비교하여, (i) 암-순응(dark-adapted) 및 명-순응(light-adapted) ERG 분석에서 a-파에 대해 상대적인 b-파의 감소(부의 ERG로 나타남); (ii) ERG b-파의 최대 반응 값 및 감도 값의 감소; (iii) ERG a-파의 최대 반응 값의 감소; 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 조합으로 반영될 수 있다. 일부 구현예에서, 망막의 조기 발병성 형태학적 결함은 야생형 비인간 동물과 비교하여, 분리, 더 넓은 타원체 구역(EZ), 더 얇은 외망막, 또는 이들의 조합으로 반영될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 망막층간분리증(예: X-염색체 관련 망막층간분리증)의 치료를 위한 후보 치료제의 식별 및 개발을 위한 개선된 생체 내(in vivo) 시스템을 제공한다. 따라서, 적어도 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 X-염색체 관련 망막층간분리증 및/또는 안구 질환에 대한 개선된 동물 모델을 제공하고, 안구 관련 질환, 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 개발 및/또는 식별에 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 RS1의 발현이 없고 다양한 분석에 유용한 변이체 RS1 폴리펩티드를 발현하는 생물학적 물질(예: 세포)의 공급원 및 개선된 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 RS1 발현 및/또는 활성의 결핍과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 예방 및/또는 억제하는 치료법(예: 유전자 요법/대체)을 개발하는데 사용된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 변이체 RS1 폴리펩티드의 발현과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 예방 및/또는 억제하는 치료법을 개발하는데 사용된다. 변이체 RS1 폴리펩티드의 발현으로 인해, 본원에 기술된 비인간 동물은 망막의 구조 및 발달에 대한 기능적 결과를 알아내기 위한 다양한 분석법에 사용하기에 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 RS1 구조 및/또는 기능에 관여하는 분자를 스크리닝하기 위한 동물 모델을 제공한다.
본원에 기술된 비인간 동물은 망막 중 하나 또는 둘 다의 구조 및/또는 기능 퇴화에 기인하는 진행성 시력 상실의 치료, 예방 및/또는 억제를 위한 치료제를 식별하기 위한 생체 내 시스템도 제공한다. 일부 구현예에서, 치료제의 효과는 상기 치료제를 본원에 기술된 바와 같은 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 비인간 동물에게 투여함으로써 생체 내에서 결정된다.
본원에 기술된 비인간 동물은 안구 관련 질환, 장애 및 병태에 대한 개선된 동물 모델도 제공한다. 특히, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은 망막 중 하나 또는 둘 다의 신경감각 층에서 세포-대-세포 부착이 파괴되는 것을 특징으로 하는 병태에 대해 번역하는 개선된 동물 모델을 제공한다.
비인간 동물에게 시험 대상 치료제가 임의의 편리한 경로로, 예를 들어 정맥내 주사, 복강내 주사, 또는 유리체내 주사로 투여될 수 있다. 이러한 동물은 면역학적 연구에 포함되어, 치료제가 투여되지 않은 적절한 대조군 비인간 동물과 비교해 비인간 동물의 시력에 대한 치료제의 효과(예: 망막의 감각 신경 기능에 미치는 효과)를 결정할 수 있다. 동물 조직(예: 안구 조직)의 생검이나 해부학적 평가가 수행될 수도 있고/있거나 혈액 샘플이 수집될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 망막 중 하나 또는 둘 다에서 광수용기 기능을 회복시키는 후보 치료제(예: 항체)를 식별하고, 스크리닝하고/하거나 개발하는 데 사용된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 광수용기에 대한 Rs1 유전자 전달의 효능을 결정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 후보 망막 유전자 요법의 벡터 설계를 결정 및/또는 최적화하는데 사용된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 Rs1 유전자 요법 약물과 같은 후보 약물의 약동학적 프로파일을 결정하는 데 사용된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 비인간 동물 및 하나 이상의 대조군 비인간 동물 또는 기준 비인간 동물은 각각 하나 이상의 후보 약물(예: Rs1 유전자 요법 약물)의 다양한 투여량(예를 들어, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg 이상)에 노출된다. 후보 약물(예: Rs1 유전자 요법 약물)은 본원에 기술된 비인간 동물에서의 평가를 위해 비경구 및 비경구 이외의 투여 경로를 포함하는 임의의 바람직한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구 경로는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 문맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수내, 척추강내, 뇌심실내, 두개내, 흉막내 주입 경로 또는 다른 주입 경로를 포함한다. 비경구가 아닌 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 볼, 질내, 안내를 포함한다. 투여는 또한 연속적 주입, 국소 투여, 이식물(겔, 막 등)으로부터의 서방출, 및/또는 정맥내 주입일 수 있다. 혈액은 다양한 시점(예를 들어, 0시간차, 6시간차, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차, 6일차, 7일차, 8일차, 9일차, 10일차, 11일차, 또는 최대 30일차 또는 그 이상)에 비인간 동물로부터 단리된다. 본원에 기술된 비인간 동물로부터 수득한 샘플을 사용하여 투여된 약물의 약동학적 프로파일을 결정하기 위한 다양한 분석을 수행할 수 있으며, 이에는 총 IgG, 항약물 반응, 응집 반응 등을 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 Rs1 유전자 요법 약물과 같은 하나 이상의 후보 약물의 치료 효능을 결정하는 데 사용된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 비인간 동물 및 하나 이상의 대조군 또는 기준 비인간 동물은 각각 하나 이상의 후보 약물(예: Rs1 요법 약물)의 다양한 투여량(예: 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL, 1.0 mg/mL, 1.1 mg/mL, 1.2 mg/mL, 1.3 mg/mL, 1.4 mg/mL, 1.5 mg/mL, 1.6 mg/mL, 1.7 mg/mL, 1.8 mg/mL, 1.9 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.1 mg/mL, 2.2 mg/mL, 2.3 mg/mL, 2.4 mg/mL, 2.5 mg/mL, 2.6 mg/mL, 2.7 mg/mL, 2.8 mg/mL, 2.9 mg/mL, 3.0 mg/mL, 3.1 mg/mL, 3.2 mg/mL, 3.3 mg/mL, 3.4 mg/mL, 3.5 mg/mL, 3.6 mg/mL, 3.7 mg/mL, 3.8 mg/mL, 3.9 mg/mL, 4.0 mg/mL, 4.1 mg/mL, 4.2 mg/mL, 4.3 mg/mL, 4.4 mg/mL, 4.5 mg/mL, 4.6 mg/mL, 4.7 mg/mL, 4.8 mg/mL, 4.9 mg/mL 또는 5.0 mg/mL 이상)에 노출된다. 일부 구현예에서, 후보 약물(예: Rs1 유전자 요법 약물)은 본원에 기술된 비인간 동물의 출생 시 또는 출생 직후에 (예를 들어 출생 후 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 이내에) 동 비인간 동물에게 투여된다. 후보 약물(예: Rs1 유전자 요법 약물)은 바람직하게는 유리체내 경로(intravitreal route)를 통해 투여되지만, 비경구 및 비경구 이외의 투여 경로를 포함하는 임의의 바람직한 투여 경로(상기 참조)가 본원에 기술된 비인간 동물에서 평가될 수 있다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 후보 약물(예를 들어, Rs1 유전자 요법 약물)은 유리체내 경로를 통해 다양한 부피로 (예를 들어, 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 6mL, 7mL, 8mL, 9mL, 10mL, 11mL, 12mL, 13mL, 14mL, 15mL, 16mL, 17mL, 18mL, 19mL, 20mL, 21mL, 22mL, 23mL, 24mL, 25mL, 26mL, 27mL, 28mL, 29mL, 30mL, 31mL, 32mL, 33mL, 34mL, 35mL, 36mL, 37mL, 38mL, 39mL, 40mL, 41mL, 42mL, 43mL, 44mL, 45mL, 46mL, 47mL, 48mL, 49mL 또는 50mL 이상) 주입된다. 주입은 연속적으로, 또는 특정 시간 과정(예를 들어, 매주, 2주마다, 매월 등)에 따라 이뤄질 수 있다. 망막 기능 및/또는 시력은 다양한 시점에 (예를 들어, 0시간차, 6시간차, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차, 6일차, 7일차, 8일차, 9일차, 10일차, 11일차, 15일차, 18일차, 21일차, 24일차, 또는 최대 30일차 또는 그 이상) 당업계에 알려진 분석법 및/또는 본원에 기술된 분석법을 사용해 결정된다. RS1 기능 및/또는 RS1 의존적 프로세스에 대한 효과를 결정하기 위해, 본원에 기술된 비인간 동물 및 하나 이상의 대조군 또는 기준 비인간 동물에게 하나 이상의 후보 약물(예: Rs1 유전자 요법 약물)을 투여한 후 이들로부터 수확한 망막 및/또는 안배(eyecup) 상에서 다양한 기능적 및/또는 형태학적 분석이 수행될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물은, 안구에서의 세포 변화의 결과로서, Rs1 활성을 회복하는 치료 효과 및 망막의 구조 및/또는 기능에 미치는 영향을 측정하는 데 사용된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 이로부터 단리된 세포는 후보 약물(예를 들어, Rs1 유전자 요법 약물)에 노출되고, 후속 기간 경과 후, Rs1 의존적 프로세스(또는 상호작용)에 미치는 영향에 대해 분석된다.
본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 유래의 세포(예: 망막 세포)는 단리되어 필요에 따라 수시로(ad hoc basis) 사용되거나, 많은 세대에 걸쳐 배양물로 유지될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 유래의 세포는 (예컨대, 바이러스의 사용, 세포 융합 등을 통해) 불멸화되고 배양물 내에서 (예를 들어, 계대 배양물 내에서) 무기한으로 유지된다.
본원에 설명된 비-인간 동물은 약물 또는 백신의 분석 및 시험을 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 후보 약물 또는 백신이 본원에 설명된 하나 이상의 비-인간 동물에 전달된 다음, 약물 또는 백신에 대한 한 가지 이상의 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질환 또는 병태에 대한 효과 및/또는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 알아내기 위해 비-인간 동물의 모니터링이 이어질 수 있다. 안전성 프로파일을 결정하기 위해 사용되는 예시적인 방법은 약물 또는 백신의 독성, 최적 용량 농도, 효능, 및 가능한 위험 인자의 측정을 포함한다. 이러한 약물 또는 백신은 이러한 비인간 동물에서 개선되고/되거나 개발될 수 있다.
백신 효능은 여러 가지 방식으로 결정될 수 있다. 요약하자면, 본원에 기술된 비인간 동물을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 백신 접종한 다음 백신을 투여하거나, 이미 감염된 비인간 동물에 백신을 투여한다. 백신에 대한 비인간 동물(들)의 반응은, 비인간 동물(들) (또는 그로부터 단리된 세포)을 모니터링 하고/하거나 백신의 효능을 알아내기 위한 하나 이상의 검정을 수행함으로써 측정할 수 있다. 그리고 나서 백신에 대한 비인간 동물(들)의 반응은 당 기술분야에 공지된 및/또는 본원에 설명된 하나 이상의 방법을 사용하여 대조군 동물과 비교된다.
백신 효능은 바이러스 중화 분석에 의해 추가로 알아낼 수 있다. 요약하자면, 본원에 기술된 비인간 동물을 면역화시키고, 면역 후 다양한 일 차에 혈청을 수집한다. 혈청의 순차 희석액을 바이러스와 함께 사전 배양하는데, 그 동안 바이러스에 특이적인 혈청 내의 항체가 그것에 결합하게 된다. 그리고 나서, 바이러스/혈청 혼합물을 허용 세포에 가하여 플라크 분석 또는 미세중화 분석에 의해 감염성을 측정한다. 혈청 내의 항체가 바이러스를 중화시키는 경우, 대조군과 비교해 플라크가 더 적거나 상대 루시퍼라제 단위가 더 낮다.
본원에 기술된 비인간 동물은 약물(예: Rs1 유전자 전달 약물)의 약동학적 특성 및/또는 효능을 평가하기 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 약물이 본원에 기술된 하나 이상의 비인간 동물에게 전달되거나 투여된 후, 비인간 동물에 대한 약물의 효과를 알아내기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)에 대한 모니터링 또는 이에 대한 하나 이상의 분석 수행이 이어질 수 있다. 약동학적 특성은, 비인간 동물이 약물을 다양한 대사산물로 가공하는 방법(또는 독성 대사산물을 포함하되 이에 한정되지 않는 하나 이상의 약물 대사산물의 존재 여부의 검출), 약물 반감기, 투여 후 약물의 순환 레벨(예를 들어, 약물의 혈청 농도), 항약물 반응(예를 들어, 항약물 항체), 약물 흡수 및 분포, 투여 경로, 약물의 배출 및/또는 제거 경로를 포함하되 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 약물의 약동학적 및 약력학적 특성은 본원에 기술된 비인간 동물에서 또는 이의 사용을 통해 모니터링된다.
일부 구현예에서, 분석의 수행은 약물이 투여된 비인간 동물의 표현형 및/또는 유전자형에 대한 효과를 알아내는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 분석의 수행은 약물에 대한 로트별(lot-to-lot) 변이성(variability)을 알아내는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 분석의 수행은 본원에 기술된 비인간 동물과 기준 비인간 동물에 투여된 약물의 효과 간의 차이를 알아내는 것을 포함한다. 다양한 구현예에서, 기준 비인간 동물은 본원에 기술된 변형, 본원에 기술된 것과는 다른 변형을 가지거나 변형을 가지지 않을 수 있다(즉, 야생형 비인간 동물).
약물의 약동학적 특성을 평가하기 위한 비인간 동물에서 (또는 이로부터 단리된 세포에서 및/또는 이를 이용하여) 측정될 수 있는 예시적인 파라미터는 응집, 자가 소화, 세포 분열, 세포 사멸, 보체 매개 용혈, DNA 무결성, 약물 특이적 항체 역가, 약물 대사, 유전자 발현 어레이, 대사 활성, 미토콘드리아 활성, 산화적 스트레스, 식세포 작용, 단백질 생합성, 단백질 분해, 단백질 분비, 스트레스 반응, 표적 조직 약물 농도, 비 표적 조직 약물 농도, 전사 활성 등을 포함하되 이들로 한정되지 않는다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 약물의 약학적으로 유효한 용량을 알아내기 위해 사용된다.
키트
본 개시는, 적어도 하나의 비인간 동물, 비인간 세포, DNA 단편, 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 벡터가 들어있는 하나 이상의 용기를 포함하는 팩 또는 키트를 추가로 제공한다. 키트는 임의의 적용 가능한 방법(예: 연구 방법)에서 사용될 수 있다. 이러한 용기(들)에는 의약품 또는 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 양식으로 된 공지가 선택적으로 부착될 수 있으며, 공지에는 (a) 인간 투여용으로 제조, 사용 및 판매하는 것에 대한 기관의 승인 사항, (b) 사용 지침, 또는 둘 모두가 반영되거나, 둘 이상의 개체 간에 물질 및/또는 생물학적 산물(예: 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물 또는 비인간 동물 세포)의 이전을 규율하는 계약이 반영된다.
본 개시의 다른 특징은 예시적인 구현예에 대한 다음의 설명 과정에서 명백해질 것이며, 이들 구현예는 본 발명의 다른 특징의 예시를 위해 제공되고 이를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본 개시의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지를 설명하기 위해 제공되며, 발명자가 그들의 개시로서 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.
실시예 1. 조작된 망막층간 단백질-1 설치류 계통의 생성
본 실시예는 설치류의 망막층간 단백질-1(Rs1) 유전자좌에서 변형을 생성하기 위한 일련의 표적화 벡터를 작제하는 것을 예시한다. 특히, 본 실시예는 Rs1 유전자좌(즉, 널 대립유전자)에서 파괴를 생성하고 Rs1 유전자좌에서의 코딩 서열의 하나 이상의 엑손 내에 하나 이상의 점 돌연변이를 도입함으로써, 부모 RS1 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이체 Rs1 유전자를 생산하기 위한 표적화 벡터를 작제하는 것을 구체적으로 기술한다. 돌연변이체 대립유전자는, 점 돌연변이를 함유하는 단일 엑손을 포함하는 합성 DNA 단편을 사용하여 작제하였다(하기 참조). 후술하는 바와 같이, 마우스 상동성 박스(mouse homology boxes) 및 연결 QC(ligation QC)를 위해 시퀀싱 올리고뉴클레오티드(sequencing oligonucleotides)를 설계하였다. 히그로마이신 내성 유전자를 함유하는 자체 결실 카세트(SDC)를 클로닝하여 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론을 표적화하기 위한 공여자(donor)를 생성하였다. 각 점 돌연변이에 특이적인 2개의 별개 공여자를 PCR 및 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)에 의해 확인하였다. 공여자를 선형화하여 골격을 제거하고, 돌연변이체 Rs1 유전자를 생성하기 위해 설치류 Rs1 유전자를 함유하는 BAC 클론 DNA를 표적화하는 데 사용하였다. 변형된 BAC는 약물 선택, 상동성 접합부에 대한 PCR 및 생어 시퀀싱, PFG 전기영동, 및 일루미나 분석(Illumina analysis)에 의해 확인하였다.
요약하면, 널 대립유전자의 경우, 마우스 Rs1 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 배치된(즉 엑손 1의 ATG 코돈과 프레임 내에 있는) lacZ 리포터 작제물을 사용해 마우스 Rs1 유전자의 코딩 서열의 엑손 1~3을 결실시켰다(즉, 엑손 1 내의 ATG 코돈의 3'에서 시작해서 엑손 3의 3' 말단까지 13,716 bp가 결실됨). 전술한 바와 같이 내인성 마우스 Rs1 유전자좌에 파괴를 생성하기 위한 Rs1-lacZ-SDC 표적화 벡터를 제작하였다(예: 미국 특허 제6,586,251호; Valenzuela 등의 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; 및 Adams, N.C. 및 N.W. Gale, in Mammalian and Avian Transgenesis-New Approaches, 편집자 Lois, S.P.a.C., Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2006 참조). Rs1 널 대립유전자의 생성을 위한 예시적인 표적화 벡터(또는 DNA 작제물)는 도 2에 제시되어 있다.
요약하자면, 전술한 바와 같이 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 RP23-213O8 (인비트로젠, Invitrogen) 및 자체 결실 네오마이신 선택 카세트(lacZ-pA-ICeuI-loxP-mPrm1-Crei-SV40pA-hUb1-em7-Neo-PGKpA-loxP)를 사용해 Rs1-lacZ-SDC 표적화 벡터를 생성하였다(참조: 미국 특허 번호 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). Rs1-lacZ-SDC 표적화 벡터는 재조합 효소가 미분화 세포에서 발현되도록 발달적으로 조절되는 마우스 프로타민 1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Cre 재조합 효소 암호화 서열을 포함하였다. 상동성 재조합 시, 내인성 쥣과 Rs1 유전자의 엑손 1에서의 ATG 코돈의 3'에서 엑손 3의 3' 말단 이전의 마지막 6개의 뉴클레오티드까지의 뉴클레오티드를 포함하는 결실(13,716 bp)은 표적화 벡터에 함유된 서열(~8,202 bp)로 대체된다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거된다. 즉, 전술한 파괴된 Rs1 유전자를 함유하는 생식계열 세포를 가진 마우스 유래의 자손은 발달 도중에 선택성 마커를 분화된 세포로부터 제거하게 된다(참조: 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨).
제1 돌연변이체 대립유전자의 경우, C59S 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드가 생성된 돌연변이체 Rs1 유전자에 의해 암호화되도록, 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 RP23-213O8을 변형시켜 내인성 Rs1 유전자의 엑손 3에 (TGT에서 AGT로의) 점 돌연변이를 도입하였다(도 5). 양성 클론의 스크리닝을 용이하게 하기 위해 인트론 2 및 3에 추가의 결실(각각 25bp 및 28bp)을 만들었다(도 6). 점 돌연변이와 결실은 데 노보 DNA 합성(de novo DNA synthesis)에 의해 만들어진 합성 단편을 사용해 도입하였다(GenEscript, Piscataway, NJ 참조). 돌연변이체 엑손 3과 주변 인트론 서열(5' 및 3')을 포함하는 합성된 단편을 플라스미드 백본에 포함시키고 암피실린(ampicillin)으로 선택한 박테리아에서 증식시켰다. 히그로마이신 내성 유전자를 합성 단편에 연결시키고 제한 효소를 사용해 상동성 아암을 첨부하여 RP23-213O8 BAC와의 상동성 재조합을 위한 표적화 벡터를 생성하였다(도 5). 이어서, 생성된 변형된 RP23-213O8 BAC 클론을 ES 세포 내로 전기 천공하였다(하기 참조). Rs1C59S-SDC 표적화 벡터는, 재조합 효소가 미분화된 세포에서 발현되도록 발달적으로 조절되는 마우스 프로타민 1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 Cre 재조합효소 암호화 서열을 포함하였다(도 5; 및 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 상동성 재조합 시, 합성 돌연변이된 Rs1 엑손 3은 내인성 쥣과 Rs1 유전자좌의 엑손 3을 대신해 삽입되며, 주변 인트론(즉, 인트론 2 및 3)에서의 작은 결실은 표적화 벡터에 포함된 서열에 의해 만들어진다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거된다. 즉, 전술한 돌연변이된 Rs1 유전자를 함유하는 생식계열 세포를 가진 마우스 유래의 자손은 발달 도중에 선택 가능한 마커를 분화된 세포로부터 제거하게 된다(도 7; 및 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 주변 엑손, 인트론 및 미번역 영역(UTR)을 함유하는 내인성 DNA는 돌연변이 유발 및 선택 카세트에 의해 변경되지 않았다. 표적화 벡터의 서열 분석을 통해 돌연변이체 Rs1 유전자의 모든 엑손, 인트론, 스플라이싱 신호(splicing signal) 및 개방 해독틀(open reading frame)을 확인하였다.
제2 돌연변이체 대립유전자의 경우, R141C 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드가 생성된 돌연변이체 Rs1 유전자에 의해 암호화되도록, 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 RP23-213O8을 변형시켜 내인성 Rs1 유전자의 엑손 5에 (CGC에서 TGC로의) 점 돌연변이를 도입하였다(도 8). 특히, 전술한 R141C 점 돌연변이를 함유하는 합성 엑손 5는 양성 클론의 스크리닝을 용이하게 하기 위해 포함된 인트론 4 및 5에서의 추가적인 결실(각각 10 bp 및 29 bp)과 함께 야생형 엑손 5 대신에 삽입하였다(도 9). 합성 단편은 데 노보 DNA 합성에 의해 만들어진다(GenEscript, Piscataway, NJ). 돌연변이체 엑손 5와 주변 인트론 서열 (5' 및 3')이 포함된 합성된 단편을 플라스미드 백본에 포함시키고 암피실린으로 선택된 박테리아에서 증식시켰다. (loxP-mPrm1-Crei-pA-hUb1-em7-Hygro-pA-loxP, 5,032 bp를 사용해) 히그로마이신 내성 유전자를 포함한 카세트를 합성 단편에 연결시키고, 제한 효소를 사용하여 상동성 아암을 첨가하여 RP23-213O8 BAC와의 상동성 재조합을 위한 표적화 벡터를 생성하였다(도 8). 이어서, 생성된 변형된 RP23-213O8 BAC 클론을 ES 세포 내로 전기 천공하였다(하기 참조). Rs1R141C-SDC 표적화 벡터는, 재조합 효소가 미분화된 세포에서 발현되도록 발달적으로 조절되는 마우스 프로타민 1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 Cre 재조합 효소 암호화 서열을 포함하였다(도 8; 및 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 상동성 재조합 시, 합성 돌연변이된 Rs1 엑손 5는 내인성 쥣과 Rs1 유전자좌의 엑손 5를 대신해 삽입되며, 주변 인트론(즉, 인트론 4 및 5)에서의 작은 결실은 표적화 벡터에 포함된 서열에 의해 만들어진다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거된다. 즉, 전술한 돌연변이된 Rs1 유전자를 함유하는 생식계열 세포를 가진 마우스 유래의 자손은 발달 도중에 선택 가능한 마커를 분화된 세포로부터 제거하게 된다(도 10; 및 미국 특허 제8,697,851호, 제8,518,392호 및 제8,354,389호 참조; 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 주변 엑손, 인트론 및 미번역 영역(UTR)을 함유하는 내인성 DNA는 돌연변이 유발 및 선택 카세트에 의해 변경되지 않았다. 표적화 벡터의 서열 분석을 통해 돌연변이체 Rs1 유전자의 모든 엑손, 인트론, 스플라이싱 신호 및 개방 해독틀을 확인하였다.
각각의 표적화 벡터의 작제는 중합효소 연쇄 반응 및 서열 분석에 의해 확인한 다음, 이를 사용해 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 전기천공하여 널 및 돌연변이체 Rs1 유전자를 포함하는 변형된 ES 세포를 생성하였다. 전기천공에 사용된 마우스 ES 세포는 하이브리드 백그라운드로 유래의 것이다(50% 129/S6/SvEv/Tac, 50% C57BL/6NTac; Auerbach, W. 등의 (2000) Biotechniques 29(5):1024-8, 1030, 1032 참조). 전기천공 후 10일차에 약물 내성 클론을 골라내고, 내인성 Rs1 유전자 내에 적절하게 도입된 엑손 lacZ 리포터 유전자 또는 점 돌연변이를 검출한 프라이머/프로브 세트를 사용하여 전술한 바와 같이(Valenzuela 등의 전술한 문헌; Frendewey, D. 등의 2010, Methods Enzymol. 476:295-307 참조) 정확한 표적화를 위해 TAQMANβ 및 핵형분석에 의해 스크리닝하였다(표 1 및 도 3, 6 및 9). 양성 ES 세포 클론은 시퀀싱에 의해 확인하였다.
이어서, 표적화된 ES 세포를 전기 8-세포기의 Swiss Webster 배아에 주입하는 VELOCIMOUSE® 방법(예: 미국 특허 제7,294,754호; DeChiara, T.M. 등의 2010, Methods Enzymol. 476:285-94; DeChiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-24; Poueymirou 등의 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-9 참조)을 사용해 암컷 마우스를 이식하는데 양성 ES 세포 클론을 사용하여, 돌연변이체 Rs1 유전자에 대해 이형접합성인 건강한 완전 ES 세포 유래의 F0 세대 마우스를 생산하였다. C57BL/6N 마우스 계통은 망막 퇴화의 동물 모델을 형성하는 데 이들을 사용하는 것을 복잡하게 만드는 돌연변이(Crb1 rd8 )를 함유하는 것으로 보고되었다(예를 들어, Mattapallil, M.J. 등의 2012, Immunol. Microbiol. 53(6):2921-7; Mehalow, A.K. 등의 2003, Hum. Mol. Genet. 12:2179-89 참조). 이러한 돌연변이에 기인하는 임의의 가능한 복잡성을 피하기 위해 F0 세대 이형접합성 수컷을 C57Bl6/NTac Crbs1 암컷과 교배시킴으로써 이러한 돌연변이를 보정하였다. 그런 다음, 이러한 육종으로부터의 생성된 F1 이형접합체를 이종 교배시켜 표현형 분석을 위한 F2 세대 동형접합체 및 야생형 마우스를 생산하였다.
전술한 조작된 Rs1 마우스 계통을 생성한 결과 각각의 조작된 Rs1 유전자좌에서 고유한 뉴클레오티드 접합부가 생성되었다. 널 대립유전자의 경우, 상류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 내인성 마우스 Rs1 5' 서열 및 마우스 Rs1 ATG 코돈(괄호 안에 포함된 대문자이며, ATG 코돈은 대괄호로 표시됨)이 lacZ 코딩 서열(소문자)과 인접함을 나타낸다: (GCTCTCCACT TCACTTAGAT CTTGCTGTGA CCAAGGACAA GGAGAAA[ATG]) ggtaccgatt taaatgatcc agtggtcctg cagaggagag attgggagaa (서열번호 33). 하류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 카세트 서열(소문자이며, NheI 부위는 대괄호로 표시됨)이 엑손 3의 마지막 6개의 뉴클레오티드 및 마우스 Rs1 유전자의 인트론 4의 시작 부위(괄호 안의 대문자)와 인접함을 나타낸다: cagcccctag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat[gctagc] (TTCCAGGTGA GTGGCTCAAC GCCCTAGCAT TCCTCCTTCC AACTCTTAAT) (서열 번호 34). 선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후 하류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 나머지 lacZ 서열(소문자이며, ICeu-I, loxP 및 NheI 부위는 대괄호로 표시됨)이 마우스 Rs1 서열(괄호 안의 대문자)과 인접함을 나타낸다: atcccccggc tagagtttaa acactagaac tagtggatcc ccgggctcga [taactataac ggtcctaagg tagcga]ctcgac [ataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttat gctagc] (TTCCAGGTGA GTGGCTCAAC GCCCTAGCAT TCCTCCTTCC AACTCTTAAT) (서열 번호 35).
C59S 대립유전자의 경우, 상류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 내인성 마우스 Rs1 엑손 3 및 주변 인트론 서열(아래 괄호 안의 대문자이며, 엑손 3은 대괄호로 표시되고 돌연변이된 코돈은 굵은 글씨로 표시됨)이 삽입점에서의 카세트 서열(소문자이며, XhoI 부위는 대괄호로 표시되고 loxP 부위는 굵을 글씨로 표시됨)과 인접함을 나타낸다: (CTGGAGTGT ACCTTTGTTG ATAGAACACT TGTTTAGGAT TCGTGAAGGT AAACTGGGCA CCCATCTAGA AGCCCAGCAC TCAGAGGTGG AGACAGGAGG TCAGGAGTTC AACAAGGTCA TTCTCTGCTA CACAGTGAGT TTAAAATCGG CCTGGGATAC ACGAGAGAGA CCCTGTGTAA GAGCAGTAGC AGCAGCAAGA ACTCAAGCTG AAAAGGAACA TGCAGTGTAA GACAAAGGGC CACTGTGTGC ATAGAGCCAG CAACCTCACA CTGTAATGAA CGGGTCTGAC CTTTGCAAGT AAGCTTCTTG TGATGCTCTG GTTGAGCCTT TGACTACGAC TTTTGTGACT TGTGCTCCTC TGGATGCTTG CAG[GATGAGG GTGAGGACCC CTGGTACCAG AAAGCATGCA AGTGTGATTG CCAGGTAGGA GCCAATGCTC TGTGGTCTGC TGGAGCTACC TCCTTAGACA GTATTCCAG]G TGAGTGGCTC AACGCCCTAG CATTCCTCCT TCCAACTCTT AATCCCTCTG CTTTCTCTCA AGTTGGCTTG TGAGCTTCAC ATCTCACCGT GGCCACTGCT CCAACATTCT GTTCATTATC AAGTGCCAGG CTCTCTCCCT CCCTGGCTTG CCTGAGATGG TCAGGTAAGA CCC) [ctcgag] ataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatatgca tgccagtagc agcaccc (서열번호 36). 하류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 카세트 서열(소문자이며, I-CeuI 및 NheI 부위 모두는 대괄호로 표시되고, loxP 부위는 굵은 글씨로 표시됨)이 삽입점의 하류에서 마우스 Rs1 인트론 3 서열(아래 괄호 안의 대문자)과 인접함을 나타낸다: ttccatcaga cctcgacctg cagcccctag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagg [taactataac ggtcctaagg tagcga gctagc] (AGCGTGAGGG AAGTCCCTTC CTCTTAGGTA) (서열번호 37). 선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후 삽입점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 마우스 Rs1 엑손 3 서열 및 잔여 인트론 3 서열(대문자이며, 엑손 3은 대괄호로 표시됨)이 잔여 카세트 서열(아래 괄호 안의 소문자이며, XhoI, I-CeuI 및 NheI 부위는 대괄호로 표시되고 loxP 부위는 굵은 글씨로 표시됨)과 병치됨을 나타낸다: CTGGAGTGT ACCTTTGTTG ATAGAACACT TGTTTAGGAT TCGTGAAGGT AAACTGGGCA CCCATCTAGA AGCCCAGCAC TCAGAGGTGG AGACAGGAGG TCAGGAGTTC AACAAGGTCA TTCTCTGCTA CACAGTGAGT TTAAAATCGG CCTGGGATAC ACGAGAGAGA CCCTGTGTAA GAGCAGTAGC AGCAGCAAGA ACTCAAGCTG AAAAGGAACA TGCAGTGTAA GACAAAGGGC CACTGTGTGC ATAGAGCCAG CAACCTCACA CTGTAATGAA CGGGTCTGAC CTTTGCAAGT AAGCTTCTTG TGATGCTCTG GTTGAGCCTT TGACTACGAC TTTTGTGACT TGTGCTCCTC TGGATGCTTG CAG[GATGAGG GTGAGGACCC CTGGTACCAG AAAGCATGCA AGTGTGATTG CCAGGTAGGA GCCAATGCTC TGTGGTCTGC TGGAGCTACC TCCTTAGACA GTATTCCAG]G TGAGTGGCTC AACGCCCTAG CATTCCTCCT TCCAACTCTT AATCCCTCTG CTTTCTCTCA AGTTGGCTTG TGAGCTTCAC ATCTCACCGT GGCCACTGCT CCAACATTCT GTTCATTATC AAGTGCCAGG CTCTCTCCCT CCCTGGCTTG CCTGAGATGG TCAGGTAAGA CCC ([ctcgag] ataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttat gctagg//[taactataac ggtcctaagg tagcga gctagc] agcgtgaggg aagtcccttc ctcttaggta) (서열번호 38).
R141C 대립유전자의 경우, 상류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 내인성 마우스 Rs1 엑손 5 및 주변 인트론 서열(아래 괄호 안의 대문자이며, 엑손 5는 대괄호로 표시되고 돌연변이된 코돈은 굵은 글씨로 표시됨)이 삽입점에서의 카세트 서열(소문자이며, XhoI 부위는 대괄호로 표시되고 loxP 부위는 굵을 글씨로 표시됨)과 인접함을 나타낸다: (TCTTTCCTAA GGAAAAGAAT TAAGAGTCGG GCTATGTCTG AAGGCCCAGA TACCTCTTGA TGCTAGGTAA CCCTTCAAAA CTCAGCACCT GTTGGCTTTT TACAGACATA GATAAGAGGA TGGCTCCTGG TAATTTGGTG TGTTCCTGGC AG[GTGTGCTT GGCTTTCCAA GTATCAGGAC AGCAGCCAGT GGTTACAGAT AGATTTGAAG GAGATCAAGG TGATTTCGGG GATCCTGACC CAAGGATGCT GTGACATAGA CGAGTGGGTG ACCAAGTACA GTGTGCAGTA TAGGACTGAT GAGCGCCTGA ACTGGATCTA CTATAAGGAT CAGACCGGAA ACAATCGG]GT AAGTGGGGGT CACTCCGAGT CAGCTTCAGC TCACACTGCG GAGACACACT CCATCCCTAT GTTCCTGCTG TCCGCGTCTG TCTGAGCATT GACCCCTCTA CATGCTGGGT CATCTG) [ctcgag] ataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatatgca tgccagtagc agcaccc (서열번호 39). 하류 접합점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 카세트 서열(소문자이며, I-CeuI 및 NheI 부위 모두는 대괄호로 표시되고, loxP 부위는 굵은 글씨로 표시됨)이 삽입점의 하류에서 마우스 Rs1 인트론 5 서열(아래 괄호 안의 대문자)과 인접함을 나타낸다: ttccatcaga cctcgacctg cagcccctag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagg [taactataac ggtcctaagg tagcga gctagc] (TTTTCCAGAT GTGATCTGGG AGACTAGCAG) (서열번호 40). 선택 카세트의 재조합효소 매개 절제 후(인트론 5에 78 bp 남음) 삽입점 양단의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 이는 마우스 Rs1 서열(인트론 4, 엑손 5 및 인트론 5는 대문자임)을 잔여 카세트 서열(loxP 및 인트론 5에 남아 있는 클로닝 부위[78 bp]는 괄호 안의 소문자이며; XhoI, I-CeuI 및 NheI 부위는 대괄호로 표시되고, loxP 부위는 굵은 글씨로 표시됨)과 함께 나타낸다: TCTTTCCTAA GGAAAAGAAT TAAGAGTCGG GCTATGTCTG AAGGCCCAGA TACCTCTTGA TGCTAGGTAA CCCTTCAAAA CTCAGCACCT GTTGGCTTTT TACAGACATA GATAAGAGGA TGGCTCCTGG TAATTTGGTG TGTTCCTGGC AGGTGTGCTT GGCTTTCCAA GTATCAGGAC AGCAGCCAGT GGTTACAGAT AGATTTGAAG GAGATCAAGG TGATTTCGGG GATCCTGACC CAAGGATGCT GTGACATAGA CGAGTGGGTG ACCAAGTACA GTGTGCAGTA TAGGACTGAT GAGCGCCTGA ACTGGATCTA CTATAAGGAT CAGACCGGAA ACAATCGGGT AAGTGGGGGT CACTCCGAGT CAGCTTCAGC TCACACTGCG GAGACACACT CCATCCCTAT GTTCCTGCTG TCCGCGTCTG TCTGAGCATT GACCCCTCTA CATGCTGGGT CATCTG ([ctcgag] ataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgctagg [taactataac ggtcctaagg tagcga gctagc])TTTTCCAGAT GTGATCTGGG AGACTAGCAG (서열번호 41).
종합하면, 본 실시예는 조작된 Rs1 유전자좌를 포함하는 게놈을 가진 3가지 설치류(예: 마우스) 계통을 생성하는 것을 예시한다. 이러한 조작된 Rs1 설치류 계통은 망막층간분리증에 생물학 및 분자 메커니즘을 밝히고, 이러한 질환을 효과적으로 치료하거나 완화시키기 위한 치료제를 개발하기 위한 생체내 시스템을 제공한다.
TAQMAN® 분석을 위한 프라이머/프로브 세트
명칭 프라이머 서열 (5'-3')
Rs1-KOmTU 정방향 TGGGACAAGTGTAAATGAGGAC (서열번호 42)
역방향 AGTGGTGCTTGGCCTTATGC (서열번호 43)
프로브 TCCCAGGCAAATCAGGACAAAGGGTC (서열번호 44)
Rs1-KOmTD 정방향 GAGCCAGCAACCTCACAC (서열번호 45)
역방향 GCATCCAGAGGAGCACAAGTC (서열번호 46)
프로브 TGTAATGAACGGGTCTGACCTTTGCAA (서열번호 47)
Rs1-C59SmTU 정방향 TCGTGAAGGTCTTGATTTGATCCT (서열번호 48)
역방향 ACCTCCTGTCTCCACCTCTG (서열번호 49)
프로브 AAGCACCATGTAAACTGGGCACCC (서열번호 50)
Rs1-C59SmTD 정방향 CCCTGGCTTGCCTGAGATG (서열번호 51)
역방향 GGACTTCCCTCACGCTGAGTT (서열번호 52)
프로브 TCAGGTAAGACCCAATTGTCAATGCA (서열번호 53)
Rs1-R141CmTU 정방향 GAGTCGGGCTATGTCTGAAGG (서열번호 54)
역방향 GCCAACAGGTGCTGAGTTT (서열번호 55)
프로브 CCAGATTTGGGATGATACCTCTTGATGC (서열번호 56)
Rs1-R141CmTD 정방향 CCTCTACATGCTGGGTCATCTG (서열번호 57)
역방향 GGACTTCCCTCACGCTGAGTT (서열번호 58)
프로브 GACCCACATTCATTTACAAACTGC (서열번호 59)
실시예 2. 조작된 Rs1 설치류 계통의 특성 분석
본 실시예는 실시예 1에 따라 만들어진 조작된 Rs1 설치류 계통의 특성 분석을 기술한다. 특히, 본 실시예는 이러한 조작된 마우스의 망막 내에서 RS1 단백질의 국소화 및 분포를 보여준다. 또한, 모든 조작된 Rs1 계통에 대한 망막 구조가 기술된다.
LacZ 발현 프로파일링. 마우스에게 CO2를 흡입시켜 안락사시켰다. 안구를 적출하고, 4
Figure pct00006
에서 PBS(Electron Microscopy Sciences) 중의 4% 파라포름알데히드로 3시간 동안 고정시켰다. 1xPBS(ThermoFisher Sci.)로 3회 세척한 후, 해부 현미경 하에서 안구를 절개하였다. 앞 부분과 수정체를 제거하고; 안구의 나머지 부분(안배)은 HiStomark X-Gal 기재 세트(KPL)로 37
Figure pct00007
에서 천천히 회전시키면서 2일 동안 염색하였다. 염색한 후, 1xPBS로 안구를 꼼꼼히 헹군 다음 30% 수크로오스로 옮겨서 밤새 두었다. 안배를 Tissue-Tek® O.C.T. 화합물(VWR)에 포매시키고(embedded) 드라이 아이스 상에서 냉동시켰다. Superfrost® Plus 마이크로 슬라이드 상에서 20 μ의 냉동 절편(cryostat section)을 제조하였다. 절편을 실온에서 30분 동안 건조시킨 다음, 1xPBS로 3회 세척하여 O.C.T. 화합물을 제거하고, ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI (ThermoFisher Sci.)로 커버슬립을 덮었다. 수컷 마우스로부터의 대표적인 결과는 도 11a에 제시되어 있다.
Rs1 mRNA 발현. 실시예 1에 기술된 조작된 Rs1 마우스 계통에서의 Rs1 mRNA의 발현 패턴은 RNASCOPEβ를 제조업체의 사양(Advanced Cell Diagnostics)에 따라 사용하여 인 시튜(in situ) 혼성화(hybridization)에 의해 결정하였다. 요약하자면, 포르말린 또는 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정되고 파라핀 또는 O.C.T.로 포매된 마우스 안배를 5 내지 10 μm의 절편으로 절단하고 SUPERFROST® Plus 유리 슬라이드 상에 장착하였다. 절차는 10분 동안 실온에 두는 전처리 1(ACD, 320037)로 시작하였고, Oster Steamer(IHC World, LLC, 모델 5709)로 20분 동안 끓이는 전처리 2(ACD, 320043) 및 HyBeZ 오븐(ACD, 310010) 내에 30분 동안 40
Figure pct00008
로 두는 전처리 3(ACD, 320037)이 이어졌다. 추가의 DNase 처리 단계를 포함시켜, 염색체 DNA를 사용한 프로브 혼성화에 기인하는 잠재적인 백그라운드를 감소시켰다. 전처리 3 후에, 슬라이드를 물로 3회 세척하고, DNase I 용액(1x DNase I 완충액 중 50 u/ml, AM2224, Ambion)을 안구 조직에 첨가하여 40
Figure pct00009
에서 30분 배양하였다. 그런 다음, 슬라이드를 물로 5회 세척하고, RNASCOPEβ 프로브를 사용해 40
Figure pct00010
에서 2시간 동안 혼성화하였고, 제조사의 검정 프로토콜 중 나머지(ACD, 322360)를 증폭 1(Amplified 1) 단계에서 증폭 6 단계까지 구현하였다. RNASCOPEβ 세척 완충액(ACD, 310091)으로 매 단계마다 슬라이드를 2회 (실온에서 각각 2분씩) 세척하였다. 증폭 단계(Amplified step) 후, 빛이 없는 상태에서 슬라이드를 적색 작용액(Red working solution)(적색 B와 적색 A의 비율 1:60)으로 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 슬라이드를 물로 여러 차례 세척하고 현미경으로 관찰하여 신호를 검출하였다. 일부 실험에서, IHC 기술을 따랐고, 형광 신호는 오픈 필드 니콘 이클립스(open-field Nikon Eclipse) Ti-E 현미경을 사용하여 가시화시키고 캡쳐하였다. 수컷 마우스로부터의 대표적인 결과는 도 11b에 제시되어 있다.
RS1 단백질 발현. 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석에 의해 야생형 및 조작된 Rs1 설치류 망막의 다양한 층에서 단백질 발현 수준을 결정하였다. 수컷 마우스로부터의 대표적인 결과가 도 11c 및 도 12a 내지 도 12d에 제시되어 있으며; 암컷 동형접합성 KO(Rs1 -/- ) 및 Rs1 이형접합성 KO(Rs1- /+ ) 계통으로부터의 대표적인 결과는 도 12e에 제시되어 있다.
면역조직화학(IHC). 요약하자면, 동물에게 CO2를 흡입시켜 안락사시켰다. 안구를 적출하고, 4
Figure pct00011
에서 1xPBS(Electron Microscopy Sci.) 중의 4% PFA(Electron Microscopy Sciences)로 3시간 동안 고정시켰다. 1xPBS로 3회 세척한 후, 해부 현미경 하에서 안구를 절개하였다. 앞 절편과 수정체를 제거하고, 안구의 나머지 부분(안배)은 30% 수크로오스로 4
Figure pct00012
에서 밤새 배양하였다. 그런 다음, 안배를 TISSUE-TEK® O.C.T. 화합물(VWR)에 포매시키고 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시켰다. 면역형광 염색에 사용된 SUPERFROST® Plus 마이크로 슬라이드 상에서 10 μ의 냉동 절편을 제조하였다. 슬라이드 상의 절편을 액체 차단제(Liquid Blocker)인 Super Pap Pen(Electron Microscopy Sciences)으로 둘러싼 뒤 실온에서 30분 동안 공기 건조시켰다. 1xPBS 중의 5% 정상 염소 혈청(VectorLabs), 1% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich), 및 0.3% Triton-X 100(Sigma-Aldrich)으로 차단 용액(blocking solution)을 제조하였다. 1xPBS 중의 0.1% Tween 20(Amresco)으로 세척액을 제조하였다. 검정색 뚜껑이 달린 염색 용기에 슬라이드를 넣고, 1xPBS로 3회 세척하여 O.C.T 화합물을 제거하였다. 차단 용액을 슬라이드에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 놓아두었다. 차단 용액을 제거한 후, 1차 항체를 차단 용액 중에서 희석하고 4
Figure pct00013
에서 밤새 절편에 도포하였다. 2일차에, 세척액으로 슬라이드를 3회 세척하였다. 형광단이 접합된(fluorophore-conjugated) 2차 항체들을 1xPBS 중에서 1:1000으로 희석하고, (광퇴색을 방지하기 위해 암소에서) 실온에서 1시간 동안 절편에 도포하였다. 슬라이드를 1xPBS로 3회 세척하고 ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI (ThermoFisher Sci.)로 커버 슬립을 덮었다.
ELISA. 요약하자면, 절개 현미경 아래에서 마우스 망막을 단리하고, Omini 균질화기가 구비된 금속 비드 튜브 내에서 칵테일 프로테아제 억제제를 사용하여 망막당 100 μl의 RIPA 완충액 중에서 균질화시켰다. 단백질 농도를 BCA 키트로 결정한 다음, 사용할 때까지 -80
Figure pct00014
에서 보관하였다(ELISA, 웨스턴 블롯). ELISA 플레이트(NUNC)를 RS1 표준 단백질(Novus Biologicals, 0~40 ng/ml) 및 총 망막 단백질 샘플(PBS 중 1:2000 희석물)로 4
Figure pct00015
에서 밤새 3회 코팅하였다. T-TBS 용액(T-TBS 완충액, TBS 용액 중 0.05% Tween20)으로 플레이트를 3회 세척한 후, 차단 완충액(1% BSA, TBS 중 5% 염소 혈청)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 3회 세척한 후, 항RS1 다클론 항체(Novus Biologicals USA, 차단 완충액 중 1:4000)를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양한 다음, 비오틴-접합 염소 항마우스 항체(Jackson Lab, 1:5000) 및 Strepavidin-HRP(Thermo, 1:200)를 첨가하고, 빛이 없는 상태에서 기질 작용액(R&D systems)을 마지막으로 첨가하였다. 2N Hcl에 의해 반응을 중단시켰다. SpectrAmax Plus 시스템(Molecular Devices)을 사용해 광학 밀도(OD)를 기록하였다.
웨스턴 블롯. 단백질 분리를 위해 4% SDS를 함유하는 샘플 완충액(Nupage LDS 샘플 버퍼, Thermo) 중에서 4~12% 비스-트리스 겔 상에 10~20 μg의 총 망막 단백질을 첨가한 다음, 니트로셀룰로오스 막(0.45 μm 기공 크기, Invitrogen)으로 옮기고, 이어서 SuperBlock T20(TBS, Thermo)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 블롯(blot)을 항RS1 항체(Novus Biologicals USA, 1:4000)와 함께 실온에서 2시간 동안, 또는 4
Figure pct00016
에서 밤새 배양하였다. 항RS1 항체와 함께 배양한 후, HRP 접합된 항마우스 다클론 항체(Cell Signaling)를 실온에서 1시간 동안 1:5000으로 첨가하였다. SuperSignal West Pico chemiluminescence(Thermo)를 사용하여 C-Dogit Blot 스캐너(Li-Cor)에 의해 단백질 밴드(protein band)를 가시화시키고 영상을 촬영하였다.
조직학. 요약하자면, 동물에게 CO2를 흡입시켜 안락사시켰다. 안구를 적출하여 Davidson 고정제(Electron Microscopy Sciences)로 1시간 동안 실온에서 고정시키고, Tissue Processing Embedding Cassettes(Electron Microscopy Sciences)에 옮겨서 실온에서 5분 동안 수돗물로 세척하였다. 인산 완충액(Electron Microscopy Sciences) 중의 10% 중성 완충 포르말린(Neutral Buffered Formalin)으로 카세트를 고정하였다. 포매를 위해 에탄올의 연속 희석, 3회의 크실렌 교환 및 2회의 파라핀 교환을 통해 안구를 처리하였다. 5 μ의 파라핀 절편을 SUPERFROST® Plus 마이크로 슬라이드(VWR) 상에서 제조하고, 제조업체의 사양(Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining (Regressive) Ricca Chemical Company)에 따라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 수컷 마우스로부터의 대표적인 결과는 도 13a~13b에 제시되어 있다.
종합하면, 본 실시예는 X-염색체 관련 망막층간분리증과 관련된 질환 표현형의 전형적인 병리학적 특징이 실시예 1에 따라 만들어진 조작된 Rs1 설치류 계통에서 반복되었음을 입증한다. 따라서, 이러한 조작된 설치류 계통은 치료제(예: 실험적 유전자 요법)의 평가 및 개발에 유용하다.
실시예 3. 조작된 Rs1 설치류 계통의 기능적 및 형태학적 분석
본 실시예는 실시예 1에 따라 만들어진 조작된 Rs1 설치류 계통의 망막 표현형의 특성 분석을 기술한다. 특히, 실시예 1에서 만들어진 널 및 돌연변이체 Rs1 설치류 계통에서의 외망막 기능을 암-순응(DA-) 및 명-순응(LA-) 전장 망막전이도(ERG)에 의해 평가하였다. 망막 구조도 광 간섭 단층촬영(OCT)에 의해 평가하였다. 수컷 마우스로부터의 대표적인 결과가 도 13c 및 도 14a~14c에 제시되어 있으며; 암컷 동형접합성 KO(Rs1 -/- ) 및 이형접합성 KO(Rs1 -/+ ) 계통으로부터의 대표적인 결과는 도 13d 및 14d에 제시되어 있다.
광 간섭 단층촬영(OCT). 요약하자면, 생존 중 안과 검사(in-life ophthalmic examinations)를 지정된 시점에 히델베르그 스펙트랄리스 HRA + OCT 시스템(Heidelberg Engineering, 미국 매사추세츠주 프랭클린)을 사용해 수행하였다. 동물에게 케타민(120 mg/kg) 및 자일라진(5 mg/kg)을 복강내 투여하여 마취시켰다. 0.5% 트로피카마이드 안과용액(Tropicamide ophthalmic solution, Bausch & Lomb, 뉴욕 로체스터)을 사용해 동공을 확장시켰다. 중심부 및 선택된 사반부(일반적으로 비강 상측 및 관자 상측)로부터 적외선 안저 영상을 촬영한 다음, 망막 형태 평가를 위한 일련의 61개의 측방향 광학 스캔 영상을 획득하였다.
망막전이도검사(ERG). 요약하자면, 동물을 밤새 암-순응시키고 마취시킨 뒤(케타민: 80 mg/kg; 자일라진: 16 mg/kg), 점안액(1% 트로피카마이드; 2.5% 페닐레프린 HCl)을 사용해 동공을 확장시키고, 점안액(1% 프로파라카인 HCl)을 사용해 각막 표면을 마취시켰다. 바늘 전극을 기준(뺨) 및 접지(꼬리)로서 사용하였고, 1% 카르복시메틸셀룰로오스로 습윤된 스테인리스 스틸 전극을 사용하여 ERG를 기록하였다. 스트로브 플래시 자극을 암-순응 안구에 적용하고, 적어도 5분의 명 순응(light adaptation) 후에 정상 적응 필드(20 cd/m2)를 중첩시켰다. 자극 범위는 -3.6 내지 2.1 log cd s/m2이었다. 반응을 증폭시키고(0.03~1000 Hz) LKC(Gaithersburg, 메릴랜드주)의 UTAS E-3000 신호 평균화 시스템을 사용하여 저장하였다. 예비-자극 베이스라인으로부터 플래시 발생 후 8 ms에 a-파의 진폭을 측정한 반면, b-파 진폭은 a-파 저점에서 b-파 피크까지 측정하였다.
종합하자면, 본 실시예는 본원에 기술된 조작된 Rs1 설치류 계통에서 나타난 표현형이 X-염색체 관련 망막층간분리증 환자에서 관찰된 것을 복제한다는 것을 입증한다. 또한, 이러한 표현형에서의 변동성은 유전자 돌연변이의 성질과 상관된다. 본 명세서는 망막층간분리증의 비인간 동물 모델을 생성하는 것을 구체적으로 보여준다. 내망막 내 낭포 구조의 발생 및 ERG b- 및 a-파 반응의 특징적 감소 후 광수용기 세포의 상실을 포함하는 X-염색체 관련 망막층간분리증과 전형적으로 관련된 병리학적 및 기능적 특징이 본원에 기술된 3개의 조작된 Rs1 설치류 계통 모두에서 반복되었다. 이러한 조작된 계통은 망막 구조의 세포 해체의 근간이 되는 분자 메커니즘을 더 이해하는 데 유용하며, X-염색체 관련 유아기 망막층간분리증의 치료를 위한 유전자 요법의 개발에 적합한 생체 내 시스템을 제공한다.
실시예 4. Rs1 KO 마우스에서 망막의 조기 발병성 표현형.
본 실시예는 실시예 1에 기술된 Rs1 녹아웃(KO) 마우스에서 망막의 조기 발병성 기능적 및 형태적 표현형을 조사하기 위해 수행된 실험을 기술한다.
Rs1 KO 마우스 및 야생형(WT) 한 배 새끼의 망막을 출생 후 15~24일 사이에 3일 간격으로 (P15, P18, P21 및 P24) 검사하였다(도 15). 외망막의 기능은 암-순응(DA-) 및 명-순응(LA-) 전장 ERG에 의해 평가하였다. ERG a-파 및 b-파 진폭을 Naka-Rushton 등식으로 분석하여, 최대 반응(R max ) 및 감도(K) 파라미터를 산출했다. 망막 구조도 광 간섭 단층촬영(OCT)에 의해 평가하였다.
수컷 마우스로부터의 결과는 도 16a 내지 19c에 도시되어 있다. 암-순응 및 명-순응 ERG로 평가한 외망막의 기능은 모든 시점에서 a-파에 비해 b-파가 상대적으로 감소하였음을 나타냈으며, 망막층간분리증 표현형은 관찰 시간 과정 전체에 걸쳐(P15~P24) 존재하였다. Rs1 KO 망막은 또한 광수용기의 조기 손상을 나타냈는데, 구체적으로는, a-파 진폭의 감소, EZ의 확장, 및 더 얇아진 외망막(ONL+PRL)을 나타냈다. Rs1 KO 망막에서, b-파의 변화는 진폭 및 민감도 모두에서 a-파보다 컸으며, 이는 Rs1 결실이 시냅스에 조기에 영향을 미쳤음을 나타낸다.
이러한 관찰은 망막층간 단백질이 초기 망막 발달 중에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> NON-HUMAN ANIMAL MODELS OF RETINOSCHISIS <130> 35518 (10328WO01) <150> 62/463,872 <151> 2017-02-27 <150> 62/576,256 <151> 2017-10-24 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5855 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 aacaatacct ccccagactg cttgttgagg caggggacta tgtggcttaa ttggatgggg 60 gctgagtgaa agacctaaga actaaatgaa ataagatgct taagttaatc gcctgctcct 120 atgccagctc tccacttcac ttagatcttg ctgtgaccaa ggacaaggag aaaatgccac 180 acaagattga aggcttcttc ttgttacttc tctttggcta tgaagccaca ttgggattgt 240 catcgacaga ggatgagggt gaggacccct ggtaccagaa agcatgcaag tgtgattgcc 300 aggtaggagc caatgctctg tggtctgctg gagctacctc cttagactgt attccagaat 360 gcccatatca caagcccctg ggtttcgagt caggggaggt cacgccagat cagatcactt 420 gctccaaccc agagcagtat gtgggctggt attcctcatg gacagcaaac aaggcccgac 480 tcaacagtca aggttttggg tgtgcttggc tttccaagta tcaggacagc agccagtggt 540 tacagataga tttgaaggag atcaaggtga tttcggggat cctgacccaa ggacgctgtg 600 acatagacga 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gacccctcta catgctgggt catctgctcg agataacttc 480 gtataatgta tgctatacga agttatgcta ggtaactata acggtcctaa ggtagcgagc 540 tagcttttcc agatgtgatc tgggagacta gcag 574 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 tgggacaagt gtaaatgagg ac 22 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 agtggtgctt ggccttatgc 20 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 tcccaggcaa atcaggacaa agggtc 26 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 gagccagcaa cctcacac 18 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 gcatccagag gagcacaagt c 21 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 tgtaatgaac gggtctgacc tttgcaa 27 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 tcgtgaaggt cttgatttga tcct 24 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 acctcctgtc tccacctctg 20 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 aagcaccatg taaactgggc accc 24 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 ccctggcttg cctgagatg 19 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 52 ggacttccct cacgctgagt t 21 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 53 tcaggtaaga cccaattgtc aatgca 26 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 54 gagtcgggct atgtctgaag g 21 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 55 gccaacaggt gctgagttt 19 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 56 ccagatttgg gatgatacct cttgatgc 28 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 57 cctctacatg ctgggtcatc tg 22 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 58 ggacttccct cacgctgagt t 21 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 59 gacccacatt catttacaaa ctgc 24

Claims (79)

  1. 설치류로서, 내인성 설치류 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 망막층간 단백질-1(Rs1) 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 그의 게놈에 포함하는, 설치류.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결실은 상기 Rs1 유전자좌로부터 생산된 기능적 RS1 폴리펩티드를 결여시키는 것인, 설치류.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결실은 적어도 엑손 2~3의 결실인, 설치류.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결실은 엑손 1 및 엑손 2~3의 적어도 일부의 결실인, 설치류.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Rs1 유전자좌는 리포터 유전자를 포함하는, 설치류.
  6. 제5항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 설치류.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Rs1 프로모터는 내인성 프로모터인, 설치류.
  8. 제2항에 있어서, 상기 Rs1 유전자좌는 엑손 1의 ATG 시작 코돈의 바로 3'부터 코딩 부분이 결여되어 있고, 엑손 2~3이 결여되어 있으며, Rs1 유전자의 시작(ATG) 코돈에 프레임 내(in-frame) 융합되는 리포터 유전자 코딩 서열을 포함하는, 설치류.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 lacZ이거나, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP(eGFP), 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 황색 형광 단백질(eYFP), 청색 형광 단백질(BFP), 강화된 청색 형광 단백질(eBFP), DsRed 및 MmGFP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자인, 설치류.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현 패턴은 야생형 비인간 동물에서의 내인성 설치류 Rs1 유전자좌에 있는 야생형 설치류 Rs1 유전자의 발현 패턴과 유사한, 설치류.
  11. 제1항에 있어서, 상기 설치류는 수컷 설치류인, 설치류.
  12. 제1항에 있어서, 상기 설치류는 암컷 설치류인, 설치류.
  13. 제12항에 있어서, 상기 설치류는 상기 결실에 대해 동형접합체(homozygous)인, 설치류.
  14. 제12항에 있어서, 상기 설치류는 상기 결실에 대해 이형접합체(heterozygous)인, 설치류.
  15. 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 설치류로서, 조작된 Rs1 유전자는 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하고, 야생형 RS1 폴리펩티드와 비교해 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는, 설치류.
  16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 신호 서열에서의 치환인, 설치류.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 소수성 잔기가 프롤린으로 치환되거나 친수성 또는 하전된 잔기로 치환되는 것인, 설치류.
  18. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 디스코이딘 도메인의 측면에 위치하는 C-말단 분절 또는 RS1 영역에서의 치환인, 설치류.
  19. 제18항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 38, 40, 59 및 223으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 시스테인의 치환인, 설치류.
  20. 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 C59S 치환인, 설치류.
  21. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 디스코이딘 도메인에서의 치환인, 설치류.
  22. 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 63, 83, 110, 142 및 219로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 시스테인의 치환인, 설치류.
  23. 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 상기 디스코이딘 도메인에서 비-시스테인이 시스테인으로 치환되는 것인, 설치류.
  24. 제23항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 R141C 치환인, 설치류.
  25. 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 디스코이딘 도메인에서 하전된 잔기가 비-하전된 잔기로 치환되는 것, 비-하전된 잔기가 하전된 잔기로 치환되는 것, 또는 하전된 잔기가 역 하전된 잔기로 치환되는 것인, 설치류.
  26. 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 디스코이딘 도메인에서 프롤린의 삽입 또는 제거에 의한 치환인, 설치류.
  27. 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 디스코이딘 도메인에서 극성 잔기의 삽입 또는 제거에 의한 치환인, 설치류.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 Rs1 유전자는 하나 이상의 선택 마커를 추가로 포함하는, 설치류.
  29. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 Rs1 유전자는 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위를 추가로 포함하는, 설치류.
  30. 제29항에 있어서, 상기 조작된 Rs1 유전자는 재조합효소 유전자, 및 상기 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 선택 마커를 추가로 포함하되, 상기 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 절제를 유도하도록 배향되는, 설치류.
  31. 제30항에 있어서, 상기 재조합효소 유전자는, 분화된 세포에서 상기 재조합효소 유전자의 발현을 유도하지만 미분화 세포에서는 상기 재조합효소 유전자의 발현을 유도하지 않는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 설치류.
  32. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 30, 서열 번호 31, 또는 서열 번호 32이거나 이를 포함하는, 설치류.
  33. 제15항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 Rs1 유전자는 내인성 설치류 Rs1 유전자좌에 있는, 설치류.
  34. 제33항에 있어서, 상기 점 돌연변이는 상기 내인성 설치류의 Rs1 유전자좌에 있는 상기 내인성 설치류 Rs1 유전자의 엑손 내에 있는, 설치류.
  35. 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 수컷 설치류인, 설치류.
  36. 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 암컷 설치류인, 설치류.
  37. 제36항에 있어서, 상기 설치류는 상기 조작된 Rs1 유전자에 대해 동형접합체인, 설치류.
  38. 제36항에 있어서, 상기 설치류는 상기 조작된 Rs1 유전자에 대해 이형접합체인, 설치류.
  39. C59S 또는 R141C 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 발현하는 설치류.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 망막층간분리증의 하나 이상의 증상을 발생시키되, 선택적으로는 출생 후 15, 18, 21 또는 24일까지 발생시키는, 설치류.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 랫트 또는 마우스인, 설치류.
  42. 단리된 설치류 세포 또는 조직으로서, 이의 게놈은
    (i) 내인성 설치류 Rs1 유전자좌 내의 내인성 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나,
    (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하며 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는, 단리된 설치류 세포 또는 조직.
  43. 제42항의 상기 단리된 설치류 세포로부터 만들어진 불멸화 세포.
  44. 설치류 배아 줄기(ES) 세포로서, 이의 게놈은
    (i) 내인성 설치류 Rs1 유전자좌 내의 내인성 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나,
    (ii) 하나 이상의 점 돌연변이를 엑손에 포함하며 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는, 설치류 배아 줄기(ES) 세포.
  45. 제44항의 상기 배아 줄기 세포로부터 생성된 설치류 배아.
  46. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 상기 설치류, 제42항의 상기 단리된 설치류 세포, 제43항의 상기 불멸화 세포, 제44항의 상기 설치류 배아 줄기 세포, 또는 제45항의 상기 설치류 배아를 포함하는 키트.
  47. 유전자 변형 설치류를 만드는 방법으로서, 상기 방법은
    설치류 게놈을 변형시키되, 상기 변형된 게놈이
    (i) 내인성 설치류 Rs1 유전자좌 내의 내인성 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나,
    (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하도록 변형시키는 단계; 및
    상기 변형된 게놈을 포함하는 유전자 변형 설치류를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 설치류 게놈은
    (a) 핵산 서열을 설치류 ES 세포의 게놈에 도입하여, (i)의 상기 결실 또는 (ii)의 상기 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 게놈을 가진 유전자 변형 설치류 ES 세포를 획득하는 단계; 및
    (b) (a) 단계의 상기 유전자 변형 설치류 ES 세포를 사용해 설치류를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 변형되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 조작된 Rs1 유전자는 내인성 설치류 Rs1 유전자좌에 있는 내인성 설치류 Rs1 유전자의 엑손에 점 돌연변이를 생성하는, 상기 설치류 ES 세포 내로의 상기 핵산 서열의 도입에 의해 생성되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 내인성 설치류 Rs1 유전자의 엑손 3은 C59S 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이되는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 내인성 설치류 Rs1 유전자의 엑손 5는 R141C 치환을 포함하는 RS1 폴리펩티드를 암호화하도록 돌연변이되는, 방법.
  52. 제48항에 있어서, 상기 결실은 상기 Rs1 유전자좌에 있는 상기 Rs1 유전자의 코딩 서열의 엑손 1 및 엑손 2~3의 일부가 결실되는 것인, 방법.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 하나 이상의 선택 마커를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 핵산 서열은 재조합효소 유전자, 및 상기 하나 이상의 부위 특이적 재조합효소 인식 부위가 측면에 위치한 선택 마커를 추가로 포함하되, 상기 부위 특이적 재조합효소 인식 부위는 절제를 유도하도록 배향되는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 핵산 서열은 상기 선택 마커의 하류에 있는 리포터 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 재조합효소 유전자는 발달 조절되는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 30, 서열 번호 31, 또는 서열 번호 32이거나 이를 포함하는, 방법.
  59. 제52항에 있어서, 상기 결실을 포함하는 상기 Rs1 유전자좌는 리포터 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 설치류 Rs1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 설치류 Rs1 프로모터는 상기 Rs1 유전자좌에 있는 상기 내인성 Rs1 프로모터인, 방법.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실은 엑손 1 내의 상기 ATG 시작 코돈 바로 다음부터 시작하여 상기 Rs1 유전자의 엑손 3의 엑손 3의 마지막 6개의 뉴클레오티드까지의 결실이며, 상기 리포터 유전자의 상기 코딩 서열은 상기 Rs1 유전자의 엑손 1 내의 상기 시작(ATG) 코돈에 프레임 내(in-frame) 융합되는, 방법.
  63. 제56항 또는 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 lacZ이거나 루시퍼라아제, GFP, eGFP, CFP, YFP, eYFP, BFP, eBFP, DsRed, 및 MmGFP로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 유전자인, 방법.
  64. 제56항 또는 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현 패턴은 내인성 설치류 Rs1 유전자좌에 있는 야생형 설치류 Rs1 유전자의 발현 패턴과 유사한, 방법.
  65. 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 수컷 설치류인, 방법.
  66. 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 암컷 설치류인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 설치류는 상기 조작된 Rs1 유전자의 상기 결실에 대해 동형접합체인, 방법.
  68. 제47항 내지 제67항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 설치류.
  69. 설치류에서 망막층간분리증의 치료를 위한 치료제를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 하나 이상의 제제를 설치류에게 투여하되, 상기 설치류의 게놈은
    (i) 내인성 설치류 Rs1 유전자좌 내의 내인성 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나,
    (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 것인, 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 제제가 망막층간분리증과 관련된 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태에 대해 효과가 있는지 여부를 결정하기 위한 하나 이상의 분석을 수행하는 단계; 및
    (c) 망막층간분리증과 관련된 상기 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태에 효과가 있는 상기 하나 이상의 제제를 치료제로서 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 설치류에서 안구와 연관된 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 치료제를 식별하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 하나 이상의 제제를 설치류에게 투여하되, 상기 설치류의 게놈은
    (i) 내인성 설치류 Rs1 유전자좌 내의 내인성 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부의 결실을 포함하거나,
    (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는 것인, 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 제제가 안구와 관련된 질환, 장애 또는 병태와 관련된 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태에 대해 효과가 있는지 여부를 결정하기 위한 하나 이상의 분석을 수행하는 단계; 및
    (c) 안구와 관련된 상기 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태와 관련된 상기 하나 이상의 징후, 증상 및/또는 병태에 효과가 있는 상기 하나 이상의 제제를 치료제로서 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 설치류의 게놈은 C59S 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는, 방법.
  72. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 설치류의 게놈은 R141C 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자를 포함하는, 방법.
  73. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 설치류의 게놈은 내인성 설치류 Rs1 유전자좌 내에 있는 내인성 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열의 엑손 1 및 엑손 2~3의 적어도 일부의 결실을 포함하는, 방법.
  74. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 출생 시 또는 출생 직후에 상기 설치류에 투여되는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 하나 이상의 분석은 출생 후 15~24일차에 수행되는, 방법.
  76. 제47항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 랫트 또는 마우스인, 방법.
  77. 핵산 작제물로서,
    설치류 Rs1 유전자좌에 있는 설치류 Rs1 유전자에 통합될 핵산 서열로서, 설치류 Rs1 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열에 상동인 5' 뉴클레오티드 서열 및 3' 뉴클레오티드 서열이 측면에 위치한 핵산 서열을 포함하되, 상기 핵산 서열이 상기 설치류 Rs1 유전자에 통합되면
    (i) 설치류 Rs1 유전자의 코딩 서열의 전체 또는 일부가 결실되거나,
    (ii) 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자가 생성되는, 핵산 작제물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 핵산 서열은 리포터 유전자를 포함하며, 상기 핵산 서열이 통합되면 엑손 1 및 엑손 2~3의 일부가 결실되는, 핵산 작제물.
  79. 제77항에 있어서, 상기 핵산 서열은, 상기 핵산 서열이 상기 설치류 Rs1 유전자에 통합되는 것에 의해 아미노산 치환을 갖는 RS1 폴리펩티드를 암호화하는 조작된 Rs1 유전자가 생성되도록, 돌연변이체 Rs1 엑손을 포함하는, 핵산 작제물.
KR1020197027972A 2017-02-27 2018-02-26 망막층간분리증의 비인간 동물 모델 Withdrawn KR20190122232A (ko)

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