KR20200007778A - 혈장 중 형광 화합물을 제조 및 분석하는 방법 - Google Patents

혈장 중 형광 화합물을 제조 및 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본원에 개시된 것은 환자의 혈장 중 형광 화합물의 농도를 분석하는 방법이다. 상기 방법은 혈장 샘플을 환자로부터 수집하는 단계, 상기 샘플을 용매로 희석시키고, 상기 희석된 샘플을 HPLC에 의해 분석하는 단계를 포함한다. 상기 샘플은 샘플 제조(sample preparation) 동안에 건조(dry down)될 필요가 없고, 또한 내부 표준이 필요하지도 않다.

Description

혈장 중 형광 화합물을 제조 및 분석하는 방법
관련출원의 상호참조
본 출원은 2017년 11월 20일자 미국 가출원 일련번호 제62/588,606호를 우선권으로 주장하며, 이의 전체 기재내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.
본 발명의 분야는 일반적으로 혈장 중 형광 화합물의 검출 및 정량(quantification)에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 출원은 환자의 혈장 중 (2R,2'R)-2,2'-((3,6-디아미노피라진-2,5-디카르보닐)비스(아잔디일))비스(3-히드록시프로판산) [(2R,2'R)-2,2'-((3,6-diaminopyrazine-2,5-dicarbonyl)bis(azanediyl))bis(3-hydroxypropanoic acid)]을 분석 및 정량하는 방법에 관한 것이다.
임상시험 동안에 및 임상시험 후에, 환자의 혈장 중 저분자 의약품(small molecule pharmaceutical)의 분석이 빈번하게 요구된다. 임상시험 동안에, 약물의 정확한 용량을 입증하여 효능을 최적화하고, 부작용을 최소화시키는 것이 필요하다. 일부 사례에서, 너무 적은 약물 (즉, 최소의 효능 및 치료학적 효과)은 너무 많은 약물 (즉, 부작용)만큼 해로울 수 있다.
신장 사구체 여과율(renal glomerular filtration rate, GFR)은 환자에서의 신기능(renal function)의 가장 신뢰할 수 있는 척도로서 널리 채택된다. 이와 같이, 급성 또는 만성 신기능 장애(kidney impairment)로 인한 신기능을 평가하기 위한 GFR의 정확한 실시간 측정에 대한 의학적 필요성이 존재한다. 신기능의 평가에 있어서, 현재의 통상적인 임상 임상시험은 혈청 크레아티닌 수준(serum creatinine level) 및 이의 24시간 제거율 (24 hour clearance rate)을 측정하여, Ferguson 및 Waikar 또는 Inker 외의 GFR 방정식 (GFR equation)에 기초한, 추정된 GFR (estimated GFR, eGFR)을 획득한다. 그러나, 이 방법론은 샘플을 처리하기 위한 적합한 실험실에 필요한 시간으로 인해, 시간이 지연되는 동안에 정확한 감도 및 정확성이 부족하다. 또한, 결과가 나이, 수화(hydration), 근육량(muscle mass), 및 식단 등을 비롯한 인자에 따라서 상당히 변한다.
도 1에 나타낸 이오헥솔(iohexol)[옴니파큐®(Omnipaque®)]을 비롯한 외인성 GFR 추적자 제제 (Exogenous GFR tracer agent)는 타당한(valid) GFR 평가를 제공한다. 이오헥솔은 환자의 기관에서 대사 또는 저류(pooling)되지 않는다. 이의 분포는 모세관 (capillary)을 가로지르는 단순 농도 구배(simple concentration gradient)를 따르고, 세뇨관 분비(tubular renal secretion) 또는 재흡수(reabsorption) 없이, 단순 사구체 여과(simple glomerular filtration)에 의해 완전히 제거된다. GFR 측정에 이오헥솔을 사용하기 위해, 혈액 샘플은 환자로부터 다중 시점(multiple time point)에서 수집된 후에, 주의 깊은 실험실 분석(careful laboratory analysis)이 수행된다. GFR 값은 WinNonlin PK/PD 모델링 및 시뮬레이션 소프트웨어(WinNonlin PK/PD Modeling and Simulation Software)를 이용한 데이터의 PK 분석을 통해 측정된다. 이는 의료인 및 실험실 직원에게 현저한 부담을 지우는 노동 집약형 과정(labor intensive process)이다. 또한, 추후에 필요한 실험실 분석에 더하여, 다중 샘플이 수 시간마다 수집되어야 하기 때문에, 증가된 시간이 소모된다.
만성 신장병(Chronic Kidney Disease, CKD)은 시간에 따른 신기능의 점진적인 상실을 특징으로 하는 의학적 질환이다. 이는 신장을 손상시키고, 개체의 혈류로부터 노폐물(waste product)을 적절히 제거하는 신장의 능력을 감소시키는 질환을 포함한다. CKD로부터 비롯된 합병증은 고혈압, 빈혈(anemia) [낮은 혈구 계수(low blood count)], 약골(weak bone), 좋지 못한 영양 건강(poor nutritional health), 신경 손상(nerve damage) 및 심장병의 증가된 위험을 포함한다. 국립 신장 재단(National Kidney Foundation)에 따르면, CKD의 모든 사례 중 약 2/3는 당뇨병(diabetes) 또는 고혈압(hypertension)에 의해 야기된다. 가족력에 더하여, 신장병에 대한 다른 위험 인자는 나이, 인종(ethnicity), 고혈압, 및 당뇨병을 포함한다. GFR은 신기능의 수준을 측정하고 환자의 CKD의 단계를 평가하기 위한 최선의 테스트이다.
GFR은 CKD의 단계를 결정하는 신기능의 수준을 측정하기 위한 중요한 테스트이다. 아래에 나타낸 대로, 환자에서의 GFR이 낮을수록, CKD는 더욱 심각해진다.
[표]
Figure pct00001
많은 노력이 실시간으로 경피를 통해(transdermally) 검출될 수 있는 외인성 형광 제제(exogenous fluorescent agent)를 찾는 것을 겨냥해왔다. US 제9,480,687호, US 제9,114,160호, US 제8,722,685호, US 제8,115,000호 및 US 제8,778,309호를 이에 대한 이들의 교시를 위해 참고한다 (이들 문헌 각각은 이들의 전체 기재내용이 본원에 참고로 포함되어 있음). 많은 다른 저분자에 더하여, 우수한 광-물리학적 특성(photo-physical property) 및 다른 화학 및 물리학적 특징을 보이는 형광 화합물인 MB-102가 합성되었다.
도 1에 나타낸 (2R,2'R)-2,2'-((3,6-디아미노피라진-2,5-디카르보닐)비스(아잔디일)) 비스(3-히드록시프로판산)인, MB-102는 실시간 GFR 측정을 위해 개발중인 형광 제제이다. 이는 434 nm에서 여기되는 경우에, 556 nm에서 강력한 형광 신호를 방출하고, 현재 인간에서 임상시험 중이다. 현저하게는, 환자의 혈류에서 순환하는 MB-102의 양 및 MB-102가 신장 여과(renal filtration)에 의해 제거되는 속도가 경피를 통해 실시간으로 측정될 수 있다. 이는 의료진에게 환자에서의 신기능의 실시간 평가를 제공하면서, 시간 소모가 큰 샘플 수집 및 실험실 분석에 대한 필요성을 없앤다. 이와 같이, 환자의 혈장 또는 혈류에서 MB-102의 양을 정량하는데 이용되는 방법의 정확성을 검증(validation)하기 위한 필요성이 존재한다.
대개, 혈장 샘플의 실험실 분석은 단백질 침전(protein precipitation), 증발(evaporation) 및 건조 후에, HPLC와의 상용성이 있는 용매에서의 재구성(reconstitution)을 수반한다. 이는 노동 집약형 과정이며, 결과가 획득되기 전에 필요한 시간을 연장시킨다. 단백질 침전법에 대한 다른 결점은 정확한 결과를 확증하기 위한 샘플 중 내부 표준(internal standard)에 대한 필요성이다. 이들 단계는 분석에 필요한 시간을 연장시키고, 에러 가능성(opportunity for error)을 생성시킨다. 따라서, 분석에 필요한 시간을 단축시키는 것과 에러 가능성을 감소시키는 것 모두에 대한 필요성이 존재한다.
한 측면에서, 본원에 개시되는 것은 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 방법이다. 상기 방법은 혈장 샘플을 수집하는 단계, 상기 혈장 샘플을 적어도 하나의 용매로 희석시키는 단계, 및 상기 희석된 샘플을 HPLC에 의해 분석하여 상기 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 혈장 샘플은 HPLC 분석 전에 건조되지 않고, 내부 표준(internal standard)이 상기 샘플에 더해지지 않는다.
다른 측면에서, 본원에 개시되는 것은 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 방법이다. 상기 방법은 혈장 샘플을 환자로부터 수집하는 단계, 상기 샘플에 적어도 하나의 용매를 추가하여 혈장 단백질이 침전되도록 하는 단계, 침전된 혈장 단백질을 상기 샘플로부터 제거하는 단계; 및 침전된 혈장 단백질이 제거된 샘플을 HPLC에 의해 분석하여 상기 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 샘플은 HPLC 분석 전에 건조되지 않고, 내부 표준(internal standard)이 상기 샘플에 더해지지 않는다.
도 1은 MB-102 및 이오헥솔의 구조를 도시한다.
도 2는 대조 블랭크(control blank) (1% 혈장/PBS)와 1% 혈장/PBS 중 3.3 ng/mL의 MB-102의 HPLC 크로마토그램 (HPLC chromatogram)의 오버레이(overlay)이다.
도 3a 및 도 3b는 두 개의 상이한 샘플에 대한 1% 혈장/PBS 중 0.4 ng/mL의 MB-102의 신호/노이즈(signal/noise), USP 테일링 팩터(USP Tailing Factor), 및 USP 평판 계수(USP plate count)를 도시한다.
도 4는 1X PBS로 스파이킹된(spiked) MB-102의 피크 순도(peak purity)이다.
도 5는 표준 샘플 제조(standard sample preparation) 후의 혈장 샘플 중 MB-102의 피크 순도이다.
도 6은 GMP 위탁 실험실(GMP contract lab)에서 테스트된 환자로부터 수득된 혈장 중 MB-102 대(versus) 내부 평가 (in-house evaluation)에서 테스트된 이의 상관관계(correlation)의 그래프이다.
도 7은 임상시험으로부터의 12명의 환자에 대한 MB-102의 약동학 분석(pharmacokinetic analysis)이다.
도 8a, 8b, 및 8c는 임상시험에서 세 명의 환자에 대한 MB-102 및 이오헥솔의 제거율을 비교하는 그래프이다.
도 9는 직접 희석(direct dilution) 또는 단백질 침전을 이용하여 테스트된 혈장 중 MB-102의 상관관계의 그래프이다.
도 10은 내부에서 테스트된 샘플 대(versus) GMP 위탁 실험실에 테스트된 샘플에 대해서 집적 희석에 의해 테스트된 혈장 중 MB-102 농도의 상관관계의 그래프이다.
도 11은 직접 희석에 의해 테스트된 용혈(hemolysis)을 보이는 혈장 샘플(50 mg/dL 내지 100 mg/dL의 헤모글로빈 수준) 중 MB-102 농도와 단백질 침전에 의해 테스트된 이의 상관관계의 그래프이다.
도 12는 직접 희석에 의해 테스트된 용혈을 보이는 혈장 샘플(100 mg/dL 내지 250 mg/dL의 헤모글로빈 수준) 중 MB-120 농도와 단백질 침전에 의해 테스트된 이의 상관관계의 그래프이다.
본원에 개시되는 것은 형광 화합물을 필요로 하는 환자에서 형광 화합물의 농도를 모니터링하는 방법이다. 상기 방법은 혈장 샘플을 수집하는 단계, 상기 혈장 샘플을 적어도 하나의 용매로 희석시키는 단계, 및 상기 희석된 샘플을 고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC)에 의해 분석하는 단계를 포함한다. 중요한 것은, 샘플이 분석 전에 건조되지 않고, 또한 샘플 제조 동안에 추가된 내부 표준을 갖지 않는다는 것이다.
일부 양태에서, 형광 화합물은 본원의 다른 부분에 개시된 화학식 I의 화합물이다. 바람직하게는, 화합물은 (2R,2'R)-2,2'-((3,6-디아미노피라진-2,5-디카르보닐)비스(아잔디일))비스(3-히드록시프로판산) (MB-102), 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이며, 아래에 제시된다:
[화학식]
Figure pct00002
다른 양태에서, 혈장 샘플은 환자로부터 혈액 샘플을 수집함으로써 제조되고, 혈장은 당해분야에 공지된 방법을 이용하여 수집된다. 혈장은 인간 환자, 동물, 또는 시험관내 연구로부터 수집될 수 있다. 혈장이 수집될 수 있는 동물의 예시는 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 염소, 원숭이, 랫트 및 마우스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 혈장은 인간 환자로부터 수집된다. 혈장은 형광 화합물에 대해 즉시 분석될 수 있거나, 또는 혈장은 추후 기간에서의 분석을 위해 보관될 수 있다. 혈장 샘플이 추후 기간에서의 분석을 위해 보관되는 경우에, 샘플 보관은 분해(decomposition)를 최소화하기 위해 수행된다. 보관의 한 방법은 샘플을 -80°C 이하의 온도에서 동결하는 것이다. 샘플 분해를 예방하는, 당해분야에서 공인된 다른 보관 방법은 본원에서 허용가능하며, 본원에 포함된다.
HPLC 분석 이전에, 샘플은 적어도 하나의 용매로 희석된다. 용매는 수성 또는 유기용매일 수 있다. 일부 측면에서, 수성 용매는 염수(saline)이다. 일부 측면에서, 하나보다 많은 용매가 이용될 것이다. 각각의 용매는 수성 또는 비-수성일 수 있고, 다른 용매와 독립적으로 선택된다.
일부 측면에서, 수성 용매는 인산염, 아세트산염, 중탄산염, 탄산염, 포름산염, 글루콘산염, 젖산염, 시트르산염, 술폰산염, 암모늄, 구아니디늄, HEPES, 카코딜산염, Tris, tris-HCl, 말레산염, 붕산염, 글리시네이트, 숙신산염, PIPES 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 버퍼의 형태이다. 바람직하게는, 수성 용매는 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline, PBS)이다.
적합한 비-수성 용매는 메탄올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 헥산, 클로로포름, DMF, DMSO, 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 부탄올, 사염화 탄소, 디에틸렌 글리콜, 디에틸 에테르, DME, 에틸렌 글리콜, 메틸렌 클로라이드, 니트로메탄, 석유 에테르, 프로판올, 피리딘, 톨루엔, MTBE, 트리에틸아민, 크실렌, 및 벤젠을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 유기 용매는 물과 혼화성(miscible)이다. 더욱 바람직하게는, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 DMSO이다. 한 양태에서, 유기 용매는 메탄올이다.
버퍼의 pH는 HPLC 용매 시스템과 상용성이 있을 것이고(compatible), HPLC 분석의 수행에 필요한 기간 내에서 혈장 샘플의 분해를 야기하지 않을 것이다. 일부 측면에서, pH는 약 2 내지 12일 것이다. 다른 측면에서, 수성 용매의 pH는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12일 것이다. 이 맥락에서 이용된, pH에 대한 "약(about)"은 ±0.5 단위를 의미한다. 또 다른 측면에서, 수성 샘플의 pH는 대략 생리학적 pH (physiological pH)이고, 약 7.0 내지 7.4이다.
혈장 중 형광 화합물의 농도가 HPLC에 의해 용이하게 분석되도록, 혈장 샘플과 용매의 희석이 수행될 것이다. 당해분야에 공지된 대로, 분석물의 농도가 너무 높은 경우에, 이는 컬럼과 검출기를 과부화시킬 수 있다(overloading). 이는 피크 테일링(peak tailing) 및 정량과 식별에서 에러를 야기할 수 있는 분석물의 체류 시간(retention time)의 변화를 야기할 수 있다. 분석물의 농도가 너무 낮은 경우에, 신호를 기초선 노이즈(baseline noise)에서 잃을 수 있고(lost), 신호가 적절히 검출되지 않을 수 있다. 본원에 개시된 방법이 정확한 결과를 제공하기 위해, 두 상황이 모두 회피되어야 한다. 이는 분석될 샘플에 드물지 않아서, 단지 분석물의 농도가 너무 높다는 것을 측정할 뿐이다. 이러한 경우에, 샘플은 다시 희석되어, 재분석된다. 일부 측면에서, 혈장 샘플은 용매로, 1:1 v/v 비율 (샘플:용매)로 희석된다. 다른 측면에서, 희석 비율은 1:(0.1-100) v/v이다. 또 다른 측면에서, 희석 비율은 (0.1-100):1 v/v이다. 또 다른 측면에서, 희석 비율 (v/v)은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 또는 1:1000이다.
본원에 개시된 환자의 혈장 중 형광 화합물의 농도를 측정하는 방법의 또 다른 측면에서, 상기 방법은 환자로부터 혈장 샘플을 수집하는 단계, 적어도 하나의 용매를 상기 샘플에 추가하여 단백질이 침전되도록 하는 단계, 침전된 단백질을 상기 샘플로부터 제거하는 단계, 및 침전된 혈장 단백질이 제거된 샘플을 HPLC에 의해 분석하는 단계를 포함한다. 중요한 것은, 샘플이 분석 전에 건조되지도 않고, 또한 샘플 제조 동안에 내부 표준이 추가되지도 않는다는 것이다.
형광 화합물은 형광 염료(fluorescent dye)일 수 있다. 본 개시의 형광 염료는 약 350 nm 이상의 가시 스펙트럼(visible spectrum) 또는 근-적외 (near-infrared, NIR) 스펙트럼 내에 모두 속하는 흡수 파장, 여기 파장(excitation wavelength), 및 방출 파장을 갖는 경향이 있다. 가시광선 및 NIR 광선은 조직을 손상시킬 가능성이 없기 때문에, 이는 진단 절차에 이롭다. 약 350 nm이상의 파장을 갖는 광선은 조직을 투과하는 경향이 있으므로, 약 350 nm 미만인 UV 파장을 이용하여 도달가능하지 않을 수 있는 관심 있는 조직에서 수행될 진단 절차를 허용한다. 적합한 형광 염료는 다음을 포함한다: 아크리딘(acridine), 아크리돈(acridone), 안트라센(anthracene), 안트라사이클린(anthracyline), 안트라퀴논(anthraquinone), 아자아줄렌(azaazulene), 아조 아줄렌(azo azulene), 벤젠, 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofuran), 벤조인도카르보시아닌(benzoindocarbocyanine), 벤조인돌(benzoindole), 벤조티오펜(benzothiophene), 카바졸(carbazole), 쿠마린(coumarin), 시아닌(cyanine), 디벤조퓨란(dibenzofuran), 디벤조티오펜(dibenzothiophene), 디피롤로 염료(dipyrrolo dye), 플라본(flavone), 플루오레세인(fluorescein), 이미다졸(imidazole), 인도카르보시아닌(indocarbocyanine), 인도시아닌(indocyanine), 인돌(indole), 이소인돌(isoindole), 이소퀴놀린(isoquinoline), 나프타세네디온(naphthacenedione), 나프탈렌(naphthalene), 나프토퀴논(naphthoquinone), 페난트렌(phenanthrene), 페난트리딘(phenanthridine), 페난트리딘(phenanthridine), 페노셀레나진(phenoselenazine), 페노티아진(phenothiazine), 페녹사진(phenoxazine), 페닐크산텐(phenylxanthene), 폴리플루오로벤젠(polyfluorobenzene), 퓨린(purine), 피라진(pyrazine), 피라졸(pyrazole), 피리딘, 피리미돈(pyrimidone), 피롤(pyrrole), 퀀텀 닷(quantum dot), 퀴놀린(quinoline), 퀴놀론(quinolone), 로다민(rhodamine), 스쿠아레인(squaraine), 테트라센(tetracene), 티오펜(thiophene), 트리페닐 메탄 염료(triphenyl methane dye), 크산텐(xanthene), 잔톤(xanthone), 및 이들의 유도체.
일부 양태에서, 형광 화합물은 본원의 다른 부분에 개시된 화학식 I의 화합물이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 (2R,2'R)-2,2'-((3,6-디아미노피라진-2,5-디카르보닐)비스(아잔디일))비스(3-히드록시프로판산) ("MB-102"), 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이며, 아래에 제시된다:
[화학식]
Figure pct00003
일부 양태에서, 혈장 샘플은 환자로부터 혈액 샘플을 수집함으로써 제조되고, 혈장은 당해분야에 공지된 방법을 이용해 분리된다. 혈장은 형광 화합물에 대해서 즉시 분석될 수 있거나, 또는 혈장은 다른 시간에서의 분석을 위해 보관될 수 있다. 혈장 샘플이 추후 기간에서의 분석을 위해 보관되는 경우에, 샘플 보관은 분해(decomposition) 및 파손(breakdown)을 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 보관의 한 방법은 샘플을 -80°C 이하의 온도에서 동결시키는 것이다. 샘플 분해를 예방하는 당해분야에서 공인된 다른 보관 방법은 본원에서 허용가능하고, 본원에 포함된다.
일부 양태에서, 추가되어 단백질의 침전을 야기하는 용매는 메탄올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 헥산, 클로로포름, DMF, DMSO, 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 부탄올, 사염화 탄소, 디에틸렌 글리콜, 디에틸 에테르, DME, 에틸렌 글리콜, 메틸렌 클로라이드, 니트로메탄, 석유 에테르, 프로판올, 피리딘, 톨루엔, MTBE, 트리에틸아민, 크실렌, 및 벤젠으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 용매이다. 일부 측면에서, 하나 보다 많은 용매가 이용된다. 각각의 용매는 수성 또는 비-수성일 수 있고, 다른 용매에 독립적으로 선택된다.
침전된 단백질의 제거는 당해분야에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 여과 및 원심분리가 본원에 포함된 두 방법이다.
침전된 단백질의 제거 후에, 샘플은 직접적으로 분석되거나, 또는 샘플은 추가의 용매로 희석될 수 있다. 희석에 이용된 용매는 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다. 일부 양태에서, 수성 용매는 염수(saline)이다. 다른 양태에서, 수성 용매는 인산염, 아세트산염, 중탄산염, 탄산염, 포름산염, 글루콘산염, 젖산염, 시트르산염, 술폰산염, 암모늄, 구아니디늄, HEPES, 카코딜산염, Tris, tris-HCl, 말레산염, 붕산염, 글리시네이트, 숙신산염, PIPES 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 버퍼이다. 바람직하게는, 수성 용매는 인산염 완충 식염수이다.
수성 용매 시스템의 pH는 HPLC 용매 시스템과 상용성일 것이고, HPLC 분석을 수행하는 데 필요한 시간 내에 혈장 샘플의 분해를 야기하지 않을 것이다. 일부 측면에서, pH는 약 2 내지 12일 것이다. 다른 측면에서, 수성 용매의 pH는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12일 것이다. 이 맥락에서 이용된, pH에 대한 "약(about)"은 ±0.5 단위를 의미한다. 또 다른 측면에서, 수성 샘플의 pH는 7.0 내지 7.4의, 대략 생리학적 pH이다.
또 다른 측면에서, 분석전에 샘플의 희석에 이용된 용매는 유기, 비-수성 용매이다. 적합한 유기, 비-수성 용매는 다음을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 메탄올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 헥산, 클로로포름, DMF, DMSO, 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 부탄올, 사염화 탄소, 디에틸렌 글리콜, 디에틸 에테르, DME, 에틸렌 글리콜, 메틸렌 클로라이드, 니트로메탄, 석유 에테르, 프로판올, 피리딘, 톨루엔, MTBE, 트리에틸아민, 크실렌, 및 벤젠. 바람직하게는, 유기 용매는 물과 혼화성(miscible)이다. 가장 바람직하게는, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 DMSO이다. 한 양태에서, 유기 용매는 메탄올이다.
또 다른 측면에서, 샘플의 희석에 이용된 용매는 본원에 개시된 수성 및 유기 용매의 임의의 가능한 혼합물로부터 선택된 적어도 두 종의 상이한 용매를 포함한다. 또한, HPLC가 분석에 이용되기 때문에, 용매 시스템이 분석물 검출을 방해하지 않도록, 용매 시스템이 선택된다.
HPLC 분석을 위한 단백질의 침전 및/또는 샘플의 제조에 이용되는 용매의 양은 샘플에 따라 변할 것이다. 본원의 다른 부분에서 논의된 대로, 필요한 용매의 양은 HPLC가 적합한 결과를 제공하도록 조정될 것이다. 다음의 방법을 이용하여, 두 번의 희석이 일어날 수 있다: a) 단백질 침전의 야기를 위한 용매의 추가, 및 b) 단백질 침전물의 제거 후에, 상청액으로의 용매의 추가. 이 방법에서, 이들 두 단계에 추가된 용매의 합산된 양(combined amount)은 HPLC 분석에서 분석물의 농도에 영향을 끼칠 것이다. 혈장 샘플에 추가된 용매의 합산된 양은, 분석물 농도가 너무 높거나 너무 낮지 않도록 할 것이다. 일부 측면에서, 혈장 샘플은 용매로, 1:1 v/v 비율 (샘플:용매)로 희석되는데, 이 비율은 두 희석 모두에서 용매의 합산된 부피에 대한 샘플의 비율을 의미한다. 또 다른 측면에서, 희석 비율은 1:(0.1-100) v/v이다. 또 다른 측면에서, 희석 비율은 (0.1-100):1 v/v이다. 또 다른 측면에서, 희석 비율(v/v)은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 또는 1:1000이다. 두 희석에서 이용된 용매의 비율은 서로에 대해 비례하는 (0.1 - 100):(100 - 0.1) v/v일 수 있다. 일부 측면에서, 단백질 침전을 위한 희석 단계만 존재할 수 있다. 단백질 침전 후의 샘플의 농도는, 추가의 희석이 필요하지 않을 수 있다.
당해분야에 공지된 대로, 혈액 샘플이 환자로부터 수집되는 경우에 혈액 용혈이 문제가 될 수 있다. 어려운 표본 수집, 불안정한 라인 (unsecure line), 오염, 부적절한 바늘 크기, 부적절한 튜브 혼합(improper tube mixing), 부정확하게 채워진 샘플 튜브 및 샘플 보관을 비롯한, 혈액 용혈의 많은 원인이 존재한다. 수집된 샘플 중 임의의 혈액 용핼은 혈장에 대해서 수행되는 분석을 방해할 수 있다. 용혈은 용혈된 적혈구 세포의 내용물을 갖는 혈장의 오염으로 인해, 많은 상이한 유형의 분석에서 부정확한 실험실 테스트 결과를 야기하는 것으로 알려져 있다. 용혈 후에, 헤모글로빈이 샘플의 혈장 또는 혈청으로 방출된다. 용혈의 한 통상적인 징후는 환자의 혈장 또는 혈청에서의 색상 변화이다. 혈장 또는 혈청 중 헤모글로빈의 양의 대략적인 추정 - 따라서 용혈의 존재 또는 부재 - 이 http://blog.fisherbioservices.com/avoiding-hemolysis-in-blood-sample-collection-and-processing에서 찾은 색상 차트를 이용하여 가시적으로 수행될 수 있으며, 이의 교시가 참고로 포함되어 있다. 용혈의 다른 징후는 광산란(light scattering)을 야기하는 적혈구 세포의 감소로 인한, 혈액 샘플의 혼탁함(cloudiness)의 감소이다.
일부 측면에서, 환자의 혈장 중 형광 화합물의 농도를 측정하는 방법이 적어도 일부의 용혈이 발생한 샘플에 적용된다. 또 다른 측면에서, 환자의 혈장 중 MB-102의 농도를 측정하는 방법이 부분적이거나 또는 완전한 용혈이 발생한 혈장 샘플에 적용된다.
본원에 개시된 일부 양태에서, 형광 화합물은 하기 화학식 I의 피라진 분자, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
[화학식 I]
Figure pct00004
상기 화학식 I에서,
X1 및 X2 각각은 독립적으로 -CO2R1, -CONR1R2, -CO(AA) 또는 -CONH(PS)이고; Y1 및 Y2 각각은 -NR1R2 및 하기 화학식 II로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
[화학식 II]
Figure pct00005
상기 화학식 II에서,
Z1은 단일 결합, -CR1R2-, -O-, -NR1-, -NCOR1-, -S-, -SO-, 또는 -SO2-이고; R1 내지 R2 각각은 H, -CH2(CHOH)aH, -CH2(CHOH)aCH3, -CH2(CHOH)aCO2H, -(CHCO2H)aCO2H, -(CH2CH2O)cH, -(CH2CH2O)cCH3, -(CH2)aSO3H, -(CH2)aSO3 -, -(CH2)aSO2H, -(CH2)aSO2 -, -(CH2)aNHSO3H, -(CH2)aNHSO3 -, -(CH2)aNHSO2H, -(CH2)aNHSO2 -,-(CH2)aPO4H3, -(CH2)aPO4H2 -, -(CH2)aPO4H2 -, -(CH2)aPO4 3 -, -(CH2)aPO3H2, -(CH2)aPO3H-, 및 -(CH2)aPO3 2 -로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; AA는 펩티드 또는 아미드 결합에 의해 함께 연결된, 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 사슬이며, 각각의 AA는 서로 동일하거나 상이할 수 있고; PS는 글리코시드 결합(glycosidic linkage)에 의해 연결된 하나 이상의 단당류 유닛(monosaccharide unit)을 포함하는 설페이트화 다당류 사슬 (sulfated polysaccharide chain) 또는 비-설페이트화 다당류 사슬(non-sulfated polysaccharide chain)이고; 'a'는 1 내지 10 사이의 수이며, 'c'는 1 내지 100 사이의 수이고, 'm'과 'n'은 각각 독립적으로 숫자 1 내지 3 사이의 수이다. 일부 측면에서, X1과 X2 중 적어도 하나는 -CO(PS) 또는 -CO(AA)이다. 또 다른 측면에서, X1과 X2 모두가 -CO(AA)이다.
(AA)는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 하나 이상의 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티드 사슬이다. 펩티드 사슬 (AA)은 단일 아미노산, 동종 폴리펩티드 사슬(homopolypeptide chain) 또는 이종 폴리펩티드 사슬(heteropolypeptide chain)일 수 있고, 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 양태에서, 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산은 α-아미노산이다. 또 다른 측면에서, α-아미노산은 D-α-아미노산 또는 L-α-아미노산이다. 둘 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 사슬에서, 각 아미노산은 측쇄의 구조 및 입체화학(stereochemistry)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 모든 측면에서 다른 아미노산(들)에 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 펩티드 사슬은 1 내지 100개의 아미노산(들), 1 내지 90개의 아미노산(들), 1 내지 80개의 아미노산(들), 1 내지 70개의 아미노산(들), 1 내지 60개의 아미노산(들), 1 내지 50개의 아미노산(들), 1 내지 40개의 아미노산(들), 1 내지 30개의 아미노산(들), 1 내지 20개의 아미노산(들), 또는 심지어 1 내지 10개의 아미노산(들)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 펩티드 사슬은 1 내지 100개의 α-아미노산(들), 1 내지 90개의 α-아미노산(들), 1 내지 80개의 α-아미노산(들), 1 내지 70개의 α-아미노산(들), 1 내지 60개의 α-아미노산(들), 1 내지 50개의 α-아미노산(들), 1 내지 40개의 α-아미노산(들), 1 내지 30개의 α-아미노산(들), 1 내지 20개의 α-아미노산(들), 또는 심지어 1 내지 10개의 α-아미노산(들)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 아미노산은 D-알라닌, D-아르기닌, D-아스파라긴, D-아스파르트산, D-시스테인, D-글루탐산, D-글루타민, 글리신, D-히스티딘, D-호모세린, D-이소류신, D-류신, D-리신, D-메티오닌, D-페닐알라닌, D-프롤린, D-세린, D-트레오닌, D-티로신, D-트립토판, 및 D-발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 펩티드 사슬 (AA)의 α-아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 호모세린, 리신, 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 펩티드 사슬 (AA)의 α-아미노산은 아스파르트산, 글루탐산, 호모세린, 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 펩티드 사슬 (AA)은 단일 아미노산 (예, D-아스파르트산 또는 D-세린)을 의미한다.
일부 양태에서, (AA)는 21개의 필수 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 아미노산이다. 다른 측면에서, AA는 D-아르기닌, D-아스파라긴, D-아스파르트산, D-글루타민, D-글루탐산, D-히스티딘, D-호모세린, D-리신, 및 D-세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, AA는 D-아스파르트산, 글리신, D-세린, 또는 D-티로신이다. 가장 바람직하게는, AA는 D-세린이다.
일부 양태에서, (AA)는 β-아미노산이다. β-아미노산의 예시는 다음을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: β-페닐알라닌, β-알라닌, 3-아미노-3-(3-브로모페닐)프로피온산, 3-아미노부탄산, 시스-2-아미노-3-사이클로펜텐-1-카르복시산, 트랜스-2-아미노-3-사이클로펜텐-1-카르복시산, 3-아미노이소뷰티르산, 3-아미노-2-페닐프로피온산, 3-아미노-4-(4-바이페닐)뷰티르산, 시스-3-아미노-사이클로헥산카르복시산, 트랜스-3-아미노-사이클로헥산카르복시산, 3-아미노-사이클로펜탄카르복시산, 3-아미노-2-히드록시-4-페닐뷰티르산, 2-(아미노메틸)페닐아세트산, 3-아미노-2-메틸프로피온산, 3-아미노-4-(2-나프틸)뷰티르산, 3-아미노-5-페닐펜탄산, 3-아미노-2-페닐프로피온산, 4-브로모-β-Phe-OH, 4-클로로-β-호모phe-OH, 4-클로로-β-Phe-OH, 2-시아노-β-호모phe-OH, 2-시아노-β-호모phe-OH, 4-시아노-β-호모phe-OH, 3-시아노-β-Phe-OH, 4-시아노-β-Phe-OH, 3,4-디메톡시-β-Phe-OH, γ,γ-디페닐β-호모ala-OH(γ,γ-diphenylβ-Homoala-OH), 4-플루오로-β-Phe-OH, β-Gln-OH, β-호모ala-OH, β-호모arg-OH, β-호모gln-OH, β-호모glu-OH, β-호모hyp-OH, β-호모leu-OH, β-호모lys-OH, β-호모met-OH, β2-호모페닐알라닌, β-호모phe-OH, β3-호모pro-OH, β-호모ser-OH, β-호모thr-OH, β-호모trp-OH, β-호모trp-OMe, β-호모tyr-OH, β-Leu-OH, β-Leu-OH, β-Lys(Z)-OH, 3-메톡시-β-Phe-OH, 3-메톡시-β-Phe-OH, 4-메톡시-β-Phe-OH, 4-메틸-β-호모phe-OH(4-methyl-β-Homophe-OH), 2-메틸-β-Phe-OH, 3-메틸-β-Phe-OH, 4-메틸-β-Phe-OH, β-Phe-OH, 4-(4-피리딜)-β-호모ala-OH, 2-(트리플루오로메틸)-β-호모phe-OH, 3-(트리플루오로메틸)-β-호모phe-OH, 4-(트리플루오로메틸)-β-호모phe-OH, 2-(트리플루오로메틸)-β-Phe-OH, 3-(트리플루오로메틸)-β-Phe-OH, 4-(트리플루오로메틸)-β-Phe-OH, β-Tyr-OH, 에틸 3-(벤질아미노)프로피오네이트, β-Ala-OH, 3-(아미노)-5-헥센산, 3-(아미노)-2-메틸프로피온산, 3-(아미노)-2-메틸프로피온산, 3-(아미노)-4-(2-나프틸)뷰티르산, 3,4-디플루오로-β-호모phe-OH, γ,γ-디페닐-β-호모ala-OH, 4-플루오로-β-호모phe-OH, β-gln-OH, β-호모ala-OH, β-호모arg-OH, β-호모gln-OH, β-호모glu-OH, β-호모hyp-OH, β-호모ile-OH, β-호모leu-OH, β-호모lys-OH, β-호모met-OH, β-호모phe-OH, β3-호모프롤린, β-호모thr-OH, β-호모trp-OH, β-호모tyr-OH, β-Leu-OH, 2-메틸-β-호모phe-OH, 3-메틸-β-호모phe-OH, β-Phe-OH, 4-(3-피리딜)-β-호모ala-OH, 3-(트리플루오로메틸)-β-호모phe-OH, β-글루탐산, β-호모알라닌, β-호모글루탐산, β-호모글루타민, β-호모히드록시프롤린, β-호모이소류신, β-호모류신, β-호모메티오닌, β-호모페닐알라닌, β-호모프롤린, β-호모세린, β-호모트레오닌, β-호모트립토판, β-호모티로신, β-류신, β-페닐알라닌, 피롤리딘-3-카르복시산 및 β-Dab-OH.
(PS)는 글리코시드 결합에 의해 연결된 하나 이상의 단당류 유닛을 포함하는 설페이트화 또는 비-설페이트화 다당류 사슬이다. 다당류 사슬 (PS)은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 다당류 사슬은 1 내지 100개의 단당류 유닛(들), 1 내지 90개의 단당류 유닛(들), 1 내지 80개의 단당류 유닛(들), 1 내지 70개의 단당류 유닛(들), 1 내지 60개의 단당류 유닛(들), 1 내지 50개의 단당류 유닛(들), 1 내지 40개의 단당류 유닛(들), 1 내지 30개의 단당류 유닛(들), 1 내지 20개의 단당류 유닛(들), 또는 심지어 1 내지 10개의 단당류 유닛(들)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 다당류 사슬 (PS)은 오탄당(pentose) 또는 육탄당(hexose) 단당류 유닛으로 이루어진 동종 다당류 사슬(homopolysaccharide chain)이다. 다른 양태에서, 다당류 사슬 (PS)은 하나의 오탄당 단당류 유닛 및 육탄당 단당류 유닛 또는 이들 모두로 이루어진 이종 다당류 사슬(heteropolysaccharide chain)이다. 일부 양태에서, 다당류 사슬 (PS)의 단당류 유닛은 포도당, 과당, 만노오스, 자일로스 및 리보오스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 다당류 사슬 (PS)은 단일 단당류 유닛 (예, 포도당 또는 과당)을 의미한다. 또 다른 측면에서, 다당류 사슬은 당(sugar)에 있는 하나 이상의 히드록시기(group)가 아민기에 의해 치환된 아미노 당(amino sugar)이다. 카르보닐기로의 연결은 아민기 또는 히드록시기를 통할 수 있다.
일부 양태에서, 화학식 I의 피라진 유도체에 대해서, Y1 또는 Y2 중 적어도 하나는 하기 화학식 II일 수 있다:
[화학식 II]
Figure pct00006
상기 화학식 II에서,
Z1은 단일 결합, -CR1R2-, -O-, -NR1-, -NCOR1-, -S-, -SO-, 또는 -SO2-이고; R1 내지 R2 각각은 H, -CH2(CHOH)aH, -CH2(CHOH)aCH3, -CH2(CHOH)aCO2H, -(CHCO2H)aCO2H, -(CH2CH2O)cH, -(CH2CH2O)cCH3, -(CH2)aSO3H, -(CH2)aNHSO3H, 및 -(CH2)aPO3H2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; a, c, 및 m은 본원의 다른 부분에 기술된 바와 같다.
또 다른 측면에서, Y1 및 Y2 중 적어도 하나는 NR1R2 이고, R1 내지 R2는 상기 기술된 바와 같다. 또 다른 측면에서, Y1 및 Y2는 -NR1R2이고, R1 내지 R2는 상기 기술된 바와 같다. 대안적으로는, R1 및 R2 모두가 H, -CH2(CHOH)aCH3, -(CH2)aSO3H, -(CH2)aNHSO3H, 및 -(CH2)aPO3H2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 또 다른 측면에서, R1 및 R2 모두가 수소이다.
가장 바람직하게는, 피라진은 하기 화학식, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
[화학식]
Figure pct00007
피라진 화합물의 임의의 측면에서, 하나 이상의 원자가 동일한 원소의 동위원소로 표지된(isotopically labelled) 원자로 대안적으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 수소 원자가 중수소 또는 삼중수소로 동위원소 표지될 수 있고; 탄소 원자가 13C 또는 14C로 동위원소 표지될 수 있으며; 질소 원자가 14N 또는 15N으로 동위원소 표지될 수 있다. 동위원소 표지는 안정한 동위원소일 수 있거나, 또는 불안정한 동위원소 (즉, 방사성)일 수 있다. 피라진 분자는 하나 이상의 동위원소 표지를 함유할 수 있다. 동위원소 표지는 부분적이거나 또는 완전할 수 있다. 예를 들어, 피라진 분자는 50% 중수소로 표지될 수 있어서, 질량 분석법 또는 다른 기법에 의해 용이하게 모니터링 될 수 있는 시그니처(signature)를 이 분자에 제공한다. 다른 예시로서, 피라진 분자는 삼중수소로 표지될 수 있어서, 당해분야에 공지된 기법을 이용하여 시험관내 및 생체 외(ex vivo ) 모두에서 모니터링될 수 있는 방사성 시그니처를 이 분자에 제공한다.
약제학적으로 허용가능한 염이 당해분야에 공지되어 있다. 본원의 임의의 측면에서, 피라진은 약제학적으로 허용가능함 염의 형태일 수 있다. 한정이 아닌 예시로서, 약제학적으로 허용가능한 염은 Berge 외, J. Pharm. Sci., 66(1), 1 (1977)에 의해 기술된 염을 포함하며, 이에 대한 이의 교시에 대해서 전체 기재내용이 참고로 본원에 포함된다. 염은 음이온 또는 양이온일 수 있다. 일부 양태에서, 약제학적으로 허용가능한 염에 대한 카운터 이온은 아세트산염, 벤젠술폰산염, 벤조산염, 베실산염(besylate), 중탄산염, 중타르타르산염(bitartrate), 브로마이드(bromide), 칼슘 에데테이트(calcium edetate), 캄실산염(camsylate), 탄산염, 클로라이드(chloride), 시트르산염, 디하이드로클로라이드(dihydrochloride), 에데트산염(edetate), 에디실산염(edisylate), 에스톨산염(estolate), 에실레이트(esylate), 푸마르산염(fumarate), 글루셉테이트(gluceptate), 글루콘산염, 글루탐산염(glutamate), 글리콜릴아르사닐레이트(glycollylarsanilate), 헥실레소르시네이트(hexylresorcinate), 하이드라바민(hydrabamine), 하이드로브로마이드(hydrobromide), 하이드로클로라이드(hydrochloride), 히드록시나프토에이트(hydroxynaphthoate), 아이오다이드(iodide), 이세티오네이트(isethionate), 젖산염, 락토바이오네이트(lactobionate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 만델산염(mandelate), 메실레이트(mesylate), 메틸브로마이드(methylbromide), 메틸니트레이트(methylnitrate), 메틸설페이트(methylsulfate), 뮤케이트(mucate), 나프실레이트(napsylate), 니트레이트(nitrate), 파모에이트(pamoate), 판토텐산염(pantothenate), 인산염, 이인산염(diphosphate), 폴리갈락투로네이트(polygalacturonate), 살리실산염(salicylate), 스테아르산염(stearate), 서브아세트산염(subacetate), 숙신산염, 설페이트, 탄닌산염(tannate), 타르타르산염(tartrate), 테오클레이트(teoclate), 트리에티오다이드(triethiodide), 아디페이트(adipate), 알긴산염(alginate), 아미노살리실산염(aminosalicylate), 안하이드로메틸렌시트레이트(anhydromethylenecitrate), 아레콜린(arecoline), 아스파르트산염(aspartate), 바이설페이트(bisulfate), 부틸브로마이드(butylbromide), 캄포레이트(camphorate), 디글루콘산염(digluconate), 디하이드로브로마이드(dihydrobromide), 디숙시네이트(disuccinate), 글리세로포스페이트(glycerophosphate), 제미설페이트(jemisulfate), 주드로플로라이드(judrofluoride), 주드로아이오다이드(judroiodide), 메틸렌비스(살리실레이트)[methylenebis(salicylate)], 나파디실레이트(napadisylate), 올살산염(oxalate), 펙티네이트(pectinate), 퍼설페이트(persulfate), 페닐에틸바르바르바이투레이트(phenylethylbarbarbiturate), 피크르산염(picrate), 프로피온산염(propionate), 티오시아네이트(thiocyanate), 토실레이트(tosylate), 운데카노에이트(undecanoate), 벤자틴(benzathine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 콜린(choline), 디에탄아민, 에틸렌디아민(ethylenediamine), 메글루민(meglumine), 프로카인(procaine), 베네타민(benethamine), 클레미졸(clemizole), 디에틸아민(diethylamine), 피페라진(piperazine), 트로메타민(tromethamine), 알루미늄(aluminum), 칼슘, 리튬, 마그네슘, 포타슘, 소듐 징크, 바륨 및 비스무트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 염을 형성할 수 있는 피라진 유도체 내 임의의 작용기가 당해분야에 공지된 방법을 이용하여 염을 형성하거나 또는 형성하지 않는다. 한정이 아닌 예시로서, 아민 하이드로클로라이드 염(amine hydrochloride salt)이 염산을 피라진에 추가함으로써 형성될 수 있다. 포스페이트 염(Phosphate salt)은 인산염 버퍼를 피라진에 추가함으로서 형성될 수 있다. 술폰산(sulfonic acid), 카르복시산, 또는 프로피온산 (phosphonic acid)을 비롯한, 존재하는 임의의 산성 작용성(acid functionality)은 적합한 염기로 탈양성자화(deprotonating)될 수 있고, 염이 형성된다. 대안적으로는, 아민기가 적절한 산으로 탈양성자화되어, 아민염을 형성할 수 있다. 염 형태는 일가로 하전(singly charged), 이가로 하전(doubly charged) 또는 심지어 삼가로 하전(triply charged)될 수 있고, 하나 보다 많은 카운터 이온이 존재하는 경우에, 각 카운터 이온은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
"피라진(pyrazine)", "피라진 유도체(pyrazine derivative)", "피라진 분자(pyrazine molecule)", "피라진 화합물(pyrazine compound)" 또는 "피라진 유사체(pyrazine analog)"에 대한 본원에서의 모든 언급은 화학식 I의 모든 화합물에 적용된다. 또한, 피라진에 대한 각 언급은 달리 특정히 명시하지 않는 한, 이의 모든 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 염 형태는 전하를 띠거나 전하를 띠지 않을 수 있고, 양성자화되어 적절한 양이온을 형성하거나, 또는 탈양성자화되어 적절한 음이온을 형성할 수 있다. 본원에 개시된 모든 측면 및 양태는 화학식 I의 화합물에 허용가능하고, 특정한 예시는 단지 실례(illustrative)이며, 본 개시의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일부 측면에서, 환자는 이들의 신장에 적어도 하나의 의학적 장애(medical impairment)를 갖는 것으로 의심되거나 또는 갖는 것으로 알려져 있고, 본원에 개시된 방법이 이용되어 환자에 존재하는 신장애(renal impairment) 또는 신장 결함(renal deficiency)의 수준을 결정하는 데 이용된다. 일부 측면에서, 환자는 110 미만, 90 미만, 60 미만, 30 미만, 또는 15 미만의 추정된 GFR (eGFR), 또는 이전에 측정된 GFR을 갖는다. 환자의 eGFR은 표준 의학 기법을 이용하여 측정되며, 이러한 방법은 당해분야에 공지되어 있다. 일부 측면에서, 환자는 이들의 신장에 의학적 문제점을 갖지 않거나 또는 갖는 것으로 의심되지 않을 것이다. GFR 모니터링은 환자의 일반적이거나 또는 통상적인 건강 평가의 일환으로서 또는 예비적 평가(precautionary assessment)로서 수행될 수 있다.
환자의 소변 중 단백질 농도의 증가는 신기능 장애 또는 결함의 일부 방식을 제안할 수 있기 때문에, 본원에 개시된 방법은 소변검사(urinalysis)가 단백질 수준의 증가를 나타내는 환자에게 적합하다. 일부 측면에서, 환자는 이들의 소변 중 증가된 수준의 단백질을 갖는데, 이는 표준 의학적 테스트[예, 요시험지 테스트(dipstick test)]에 의해 측정된다. 한정이 아닌 예시로서, 환자의 소변검사는 알부민의 증가, 크레아티닌의 증가, 혈액 요소 질소(blood urea nitrogen)의 증가(즉, BUN 테스트), 또는 이들의 임의의 조합을 보일 수 있다.
일부 측면에서, 환자는 이전에 적어도 단계 1의 CKD를 앓는 것으로 진단되었다. 다른 측면에서, 환자는 이전에 단계 2의 CKD, 단계 3의 CKD, 단계 4의 CKD 또는 단계 5의 CKD를 앓는 것으로 진단되었다. 또 다른 측면에서, 환자는 아직 CKD를 앓는 것으로 진단되지 않았으나, CKD와 관련된 하나 이상의 위험 인자를 가진다. 또 다른 측면에서, 환자는 CKD에 대한 공지된 위험 인자를 갖지 않는다.
[ 실시예 ]
( 2R,2'R )-2,2'-((3,6- 디아미노피라진 -2,5- 디카르보닐 ) 비스 -(아잔 디일 ))-비스(3-히드록시프로판산) ("MB-102")의 제조
두 임상시험에서 이용하기 위한 MB-102 API의 샘플을 GMP 표준에 따라서 제조 및 분석하였다. 다음의 절차가 대표적이다.
단계 1: 디벤질 2,2'-((3,6- 디아미노피라진 -2,5- 디카르보닐 )- 비스(아잔디일)) (2R,2'R)-비스(3-히드록시프로파노에이트)의 형성
Figure pct00008
크라이젠 어댑터(Claisen adapter) 및 투입 깔때기 (addition funnel)가 장착된 500 mL 둥근-바닥 플라스크에 D-세린 벤질 에스테르 하이드로클로라이드 (24.33 g, 105.0 mmol)를 채웠고, 무수 DMF (300 mL)를 캐뉼라(cannula)에 의해 추가했다. 용액을 얼음-배쓰(ice-bath)에서 냉각시켰고, N2 분위기하에서 15분 동안 교반시켰다. DIPEA (19.16 mL, 110.0 mmol)를 투입 깔때기를 통해 30분 주기 동안 적가한 후에, 추가 30분 주기 동안 적가하였고, 냉각 배쓰(cooling bath)을 치운 후에, 이산(diacid) (9.91 g, 50.0 mmol)을 한번에(in one portion) 추가하였다. 브릭-레드색상(brick-red)의 현탁액을 30분 동안 교반시켰고, HOBt·H2O (17.61 g, 115.0 mmol)를 한번에 추가하였다. 15분 후에, 반응 플라스크를 얼음-배쓰에서 냉각시켰고, EDC·HCl (22.05 g, 115.0 mmol)을 15분 동안 나누어(in portions) 추가하였다. 생성되는 현탁액이 실온으로 천천히 승온되도록 하였고, N2 하에서 밤새 교반시켰다(ca. 17 h).
어두운 색상의 용액(dark solution)을 고진공(high vacuum) (배쓰 온도 60°C)하에서 시럽 잔류물(syrupy residue)로 농축시켰는데, EtOAc와 밀리-Q H2O(milli-Q H2O) (각각 400 mL)사이에서 분배되었다. 층을 분리시켰고, 수성층을 EtOAc로 추출했다 (3 x 200 mL). 합쳐진 EtOAc 추출물을 0.50 M KHSO4, 포화 NaHCO3, H2O 및 브라인 (각각 250 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 감압하에서 용매를 제거하여 23.7 g의 오렌지 색상의 고체를 수득하였다. 조생성물(crude product)을 CHCl3:MeOH 구배(gradient)를 이용한 실리카겔 상에서의 플래시 크로마토그래피(flash chromatography)에 의해 정제하여, 비스-아미드 (19.6 g, 71%)를 오렌지 색상의 고체로 수득하였다: Rf = 0.45 [CHCl3:MeOH (9:1, v/v)]. 1H NMR (DMSO-d6) δ 8.56 (d, J = 8.0 Hz, 2H, D2O로 교환 가능함(exchangeable)), 7.40 - 7.33 (m, 10H), 6.76 (s, 4H, D2O로 교환 가능함), 5.37 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 5.20 (m, 4H), 4.66-4.63 (dt, J = 8.0, 4.0 Hz, 2H), 3.97 - 3.93 (m, 2H), 3.81 - 3.77 (m, 2H). 13C NMR (DMSO-d6) δ 170.1, 164.9, 146.4, 135.8, 128.4, 128.0, 127.6, 125.9, 66.2, 61.1, 54.4; RP-LC/MS (ESI) m/z 553.3 (M+H)+ (Rt = 4.44 min, 5-95% B/6 min). Calc. for C26H28N6O8: C, 56.52; H, 5.11; N, 15.21. Found: C, 56.39; H, 5.11; N, 14.99.
단계 2: ( 2R,2'R )-2,2'-((3,6- 디아미노피라진 -2,5- 디카르보닐 ) 비스 -(아잔디일))-비스(3-히드록시프로판산)의 형성
단계 1에서 수득된 비스아미드 (7.74 g, 14.0 mmol)를 EtOH:H2O (560 mL; 3:1 v/v) 중 10% Pd/C (0.774 g)의 존재하에 수소화시켰다(hydrogenating). 반응 혼합물을 아르곤(argon)으로 퍼징했고(purging), 실온에서, 5.5시간 동안 수소 분위기하에서 교반시켰다 [느린 버블링(slow bubbling)]. 반응 혼합물을 Ar으로 재차 퍼징했고, 촉매를 셀라이트(Celite) 상에서의 여과에 의해 제거했다. 베드(bed)를 EtOH:H2O (400 mL; 1:1 v/v)로 세척했고, 합쳐진 여과물을 진공에서(in vacuo ) 농축시켰다. 생성물을 고진공하에서 건조시켰다. 잔류물을 CH3CN으로 트리터레이팅하여(triturating) MB-102 (4.89 g, 94%)를 오렌지 색상의 파우더로 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ 8.46 (d, J = 8.3 Hz, 2H, D2O와 교환 가능함), 6.78 (br s, 4H, D2O와 교환 가능함), 4.48 - 4.45 (dt, J = 8.1, 3.9 Hz, 2H), 3.88 (dd, J = 11.1, 3.9 Hz, 2H), 3.74 (dd, J = 11.1, 3.7 Hz, 2H). 13C NMR (DMSO-d6) δ 171.6, 164.7, 146.4, 125.9, 61.2, 54.3. RPLC/MS (ESI) m/z 373.2 (M + H)+ (Rt = 2.86 min, 5-95% B/6 min). Anal. Calc. for C12H16N6O8: C, 38.71; H, 4.33; N, 22.57. Found: C, 38.44; H, 4.51: N, 22.33.
직접 희석 분석용 샘플의 제조
직접 희석에 의한 샘플 제조에 대해서, 낮은 수준, 중간 수준, 및 높은 수준의 MB-102에서의 품질 대조군(quality control) 및 0.4, 1.0, 2.0, 4.0, 10.0, 16.0, 40.0, 100.0, 200.0, 400.0 ng/mL를 함유하는 교정 표준(calibration standard)을 검증 연구(validation study) 또는 샘플 분석의 날에 PBS 중 1% 인간 혈장에 제조하였다. 임상 연구에서 이용된 MB-102 투여 용액(dosing solution) (18.6 mg/mL)을 먼저 PBS 중 1% 인간 혈장으로 1/100 희석하여 186 μg/mL MB-102의 저장 용액(stock solution)을 수득하였다. 이 저장 용액을 PBS 중 1% 인간 혈장으로 더 희석하여, 교정 표준의 제조를 위한 2000 ng/mL MB-102의 교정 표준 작업 스톡(calibration standard working stock)을 형성했다. 또한, QC 작업 스톡(300 ng/mL)을 186 μg/mL MB-102 스톡으로부터, PBS 중 1% 혈장과의 희석에 의해 제조했다. 낮은 수준, 중간 수준, 및 높은 수준의 품질 대조군을 이 QC 작업 스톡으로부터, PBS 중 1% 인간 혈장과의 희석에 의해 제조했다.
단백질 침전 분석용 샘플의 제조
단백질 침전에 의한 샘플 제조에 대해서, 낮은 수준, 중간 수준, 및 높은 수준의 MB-102에서의 품질 대조군 및 0.4, 1.0, 2.0, 4.0, 10.0, 16.0, 40.0, 100.0, 200.0, 400.0 ng/mL를 함유하는 교정 표준을 다음과 같이 제조하였다. 1X PBS 중 10000배 농도의 MB-102를 각 표준 및 QC에 대해서 제조했다. 이들 저장 용액을 혈장으로 1/100 희석하여 99% 혈장/1% PBS 중 MB-102의 작업 교정 표준(working calibration standard) 및 QC를 제조하였다. 이들 작업 표준 및 QC 200μL를 600 μL의 바이알(vial)로 분취하여, 사용하기 전까지 -80°C에 보관하였다. 동일한 HPLC법을 이용하여, 이들 작업 교정 표준 및 QC를 알려지지 않은 샘플의 분석에 대해서 자격을 부여했고(qualifying), 이에 대해 인증했다(certifying).
환자 샘플의 분석
혈장 샘플을 두 임상 연구로부터 수득했다. 모든 혈장 샘플은 분석 전까지 -80°C에서 보관했다.
직접 희석에 의해 분석되는 샘플에 대해서, 10 μL의 혈장 샘플 (실온으로 해동시켰고, 완전히 혼합합)을 990 μL의 1X PBS로 희석시켰고, 약 10분 동안 완전히 혼합시켰으며, 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리시켰다. 이를 HPLC에 의해 직접적으로 분석했다.
단백질 침전에 의해 분석되는 샘플에 대해서, 50 μL의 혈장 (실온으로 해동시켰고, 완전히 혼합함)을 4.5%의 1X PBS (v/v)를 함유하는 200 μL의 메탄올로 희석시켰고, 적어도 10초 동안 혼합하였으며, >4000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켰다. 전체 상청액을 제2의 용기로 옮겼다. 이로부터, 50 μL의 상청액을 950 μL의 1X PBS와 혼합했다. 샘플을 혼합하여 HPLC에 의해 분석했다. 이 절차를 이용하면, 혈장 단백질 침전 후의 상청액의 건조(dry-down) 과정이 제거된다. 단백질 침전법에서 통상적으로 이용되는 내부 표준이 필요하지 않도록, HPLC 분석을 위해 상청액의 일부를 1X PBS으로 직접 희석시켰다.
HPLC 분석
분석들을 컬럼 히터(column heater), 샘플 히터/쿨러(sample heater/cooler), 진공 탈가스기(vacuum degasser), 오토 샘플러(autosampler), 형광 검출기(fluorescence detector), 및 이원 구배(binary gradient)를 전달할 수 있는 펌프가 탑재된, 워터스(Waters) 사의 액퀴티 UPLC H 클래스 크로마토그래피 시스템 (Acquity UPLC H Class Chromatography System) 상에서 수행하였다. HPLC 분석용 컬럼(analytical column), 페노메넥스(Phenomenex) 사의 Luna C18 (2), 4.6 x 250 mm, 5 μm, 100Å (페노메넥스 사, 카탈로그 번호 00G-4252-E0, S/N H15-133556), 및 시큐리티 가드 카트리지 C18 (Security Guard Cartridge C18), 4 x 3 mm ID, 5 μm (페노메넥스 사, 카탈로그 번호 KJ0-4282)를 분석에 이용했다. UPLC 시스템이 탑재된 워터스 사의 임파워 3 소프트웨어 (Empower 3 software)를 검정 설정, 분석 모니터링, 및 데이터 처리에 이용했다. 두 이동상(mobile phase) - 이동상 A: 수(water) 중 0.1% 트리플루오로아세트산 [피셔 사, 옵티마 ® 그레이드(Fisher, Optima® Grade)] 및 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (피셔 사이언티픽 사, 옵티마® 그레이드) - 을 이용했다. 컬럼 온도는 30°C에 설정했고, 오토 샘플러 온도는 5°C에 설정했으며, 여기 파장(excitation wavelength)은 434 nm에 설정했고, 검출/방출 파장은 556 nm에 설정했다. 계수 속도(counting rate)는 5점/초(point/sec)에 설정했고; PMT 게인(PMT gain)은 50에 설정했으며; 유세포 온도(flow cell temperature)는 주위(ambient) 온도였고; 주입 부피는 10 μL였다. MB-102는 약 3.6분에서 아래에 나타낸 구배를 이용하여 용출된다.
[표]
Figure pct00009
방법 검증
본원에 기술된 샘플 제조 및 HPLC 방법을 이용하여, 검증 연구(validation study)를 수행하여, 정밀성(precision), 정확성, 선형성(linearity), 재현성(reproducibility), 혈장 및 샘플 용액 안정성, 동결-해동 안정성(freeze-thaw stability), 최소 정량 한계(lowest limits of quantitation), 및 특이도를 측정하였다. 허용 기준(acceptance criterion)은 ±20%에 설정된 최소 정량 한계 (lowest limit of quantitation, LLOQ)에서 예외인, 정상치(normal value)로부터 ±15%의 데이터 편차 (data deviation)였다. 샘플을 내부(in-house) 및 GMP 위탁 실험실 모두에서 분석하여, 방법의 타당성 (validity) 및 결과의 정확성 모두를 보장한다.
특이도(Specificity) 및 선택성(Selectivity)
MB-102와의 혈장 성분의 간섭(interference) 및 분석을 블랭크 샘플의 크로마토그램을 MB-102로 스파이킹된 샘플의 크로마토그램과 비교함으로써 조사했다. LLQ가 블랭크 샘플에 대해서 적어도 10배의 노이즈 수준인 것으로 측정된 반면, LLOD는 블랭크 샘플에 대한 적어도 3배의 노이즈 수준인 것으로 측정되었다.
정확성 및 정밀성
1% 혈장/PBS 중 MB-102의 다섯 농도 수준에서의 샘플 제조의 레플리케이트(replicate) 3개를 제조하였고, 이를 정확성 측정에 대해 분석하였다. 기구 주입(instrument injection)의 정밀성 측정에 대해서, 200 ng/mL의 샘플을 10회 주입하여, 반복된 주입이 매우 정밀하다는 것을 보장하였다.
회수 (recovery)
회수를 세 개의 상이한 MB-102의 농도에서 혈장 샘플 대조군을 MB-102로 스파이킹된 혈장 샘플과 비교함으로써 측정했다. 스파이킹된 샘플로부터 회수된 MB-102의 백분율은 회수 % (% of recovery)로 측정되었다.
혈장 샘플 안정성 및 혈장 용액 안정성
혈장 샘플의 장기간 보관(-80°C에서 동결) 및 혈장 용액의 단기간 보관 (광노출이 있는/없는 벤치 탑 주변 온도, 및 2-8°C)에 대한 샘플 핸들링 동안의 MB-102 안정성을 평가하였다. 혈장 샘플을 3회의 동결/해동 사이클(-80°C 내지 실온)에 대해서 테스트했다. 광노출이 있는/없는 실온에서, 2-8°C에서, 및 오토-샘플러 온도 (5°C)에서의 혈장 용액 중 MB-102의 안정성을 24시간 및 48시간의 시간 간격 동안에 평가했다.
결과
도 2는 블랭크 대조군 (1% 혈장/PBS)과의 MB-102 (1% 혈장/PBS 중 3.3 ng/mL)의 HPLC 크로마토그램의 오버레이를 도시한다. 556 nm에서 MB-102로부터 방출된 형광 파장을 정량(quantitation)을 위해 모니터링했다. 샘플 용액 중 1%의 혈장 단백질은 검출 또는 정량하기 위한 MB-102를 간섭하는 약 3.62분에서 용출된 피크를 갖지 않는다.
방법 검증
방법 검증 연구의 결과가 표 1에서 요약된다. MB-102 표준 교정은 1/X의 가중치를 갖는 선형 회귀(linear regression)를 이용하여, 0.9997의 R2을 수반하는, 0.4 ng/mL 내지 400 ng/mL의 농도에 대해서 세 크기 정도(three orders of magnitude)를 넘는 매우 좋은 선형 감응(linear response)을 나타냈다. 0.4 ng/mL에서의 LLOQ는 15.18의 신호/노이즈 비율, 1.072의 USP 테일링, 및 39934의 USP 평판 계수를 가지며, 이는 도 3a에서 제시된다. 개선된 신호/노이즈 비율 (19.48)이 기구의 추가의 개량(refining)으로 획득되었다 (도 3b).
[표 1. 방법 검증 연구의 결과]
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
검정 정밀성 (assay precision)은 우수했는데, 99.2%의 회수, 0.45%의 RSD, 및 연구된 모든 조건에 대해서 95.7% 내지 101.2%의 회수에 이르는 정확성 나타냈다. 3회의 동결/해동 사이클은 혈장이 -80°C에서 매우 안정하다는 것을 나타낸다. 또한, 광(light)이 없는, 최대 48시간 동안에 4°C 및 실온에서 저장된 샘플 용액 안정성은 매우 안정하다. 용액이 광과 함께 실온에서 48시간 동안 보관된 경우에, MB-102의 소량의 분해 (~ 1 - 2%)가 존재한다. 세 농도의 스파이크 회수(spike recovery) 모두가 스파이킹된 양의 ±15% 이내였다. 알려지지 않은 샘플에 대해서 3.62분에 용출된 MB-102 피크의 순도를 측정하기 위해, 혈장 샘플을 단백질 침전시켰고, 상청액을 건조시켰으며(drying down), PBS로 재구성했다(reconstituting). 445 nm에서 모니터링된 (PDA 모드에서) HPLC 크로마토그램이 생성되었다. PBS 중 스파이킹된 샘플로부터의 MB-102 PDA 피크 순도를 임상시험으로부터 수집된 혈장 샘플의 피크 순도와 비교했다. 도 4 및 도 5에 제시된 결과는 임상시험으로부터 비롯된, 445 nm에서 흡수하는 3.62분에 용출된 MB-102 피크가 순수하다는 것을 나타냈다.
환자로부터 수득된 샘플의 분석
경피를 통한 형광 감작(transdermal fluorescence sensing)을 통해 신기능을 모니터링하기 위한 MB-102의 유용성을 평가하는 임상연구의 서포트(support)로서, 혈장 샘플을 각 연구 참가자의 0, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480, 600, 및 720분에서 수집된 혈액 샘플로부터 제조하였다. 전체 임상시험의 혈장 샘플의 검증 및 분석을 위해, 이 방법은 GMP 인증된 생물분석 실험실(GMP certified bioanalytical lab)로 이관되었다. GMP 실험실로부터 획득된 결과를 내부 테스트로부터 획득된 결과와 비교하여, 정확성 및 재현성을 보장하였다.
동일한 연구의 12명의 참가자로부터 수득된 혈장 샘플을 내부에서 이용하여 GMP 실험실 결과를 검증하였다. 내부 및 GMP 실험실에서 획득된 이들 대상체로부터의 결과의 비교는 도 6에 제시된다. 상관관계의 선형 회귀는 0.9903의 R2과 함께 1.018의 기울기 나타낸다. 이들 12명의 대상체로부터의 약동학 분석이 도 7에 제시되며, MB-102의 제거율이 환자들 사이에서 변하는 것을 나타낸다.
이 연구에서 참조 마커(reference marker)로서 이오헥솔이 MB-102과 함께 공동-투여되었기 때문에, 세 명의 대상체에 대한 MB-102 및 이오헥솔의 약동학의 비교가 도 8a, 8b 및 8c에서 도시된다. 이 도면들에 제시된 대로, MB-102의 제거율은 여기에 도시된 각 대상체에 대한 이오헥솔의 제거율과 평행하다. 그러므로, MB-102는 GFR 측정에 대해서 이오헥솔에 유사하게 수행할 수 있다.
도 6에 나타낸 1.0177의 상관관계의 보다 나은 이해를 위해, 내부에서 수행된 측정 대(versus) GMP 위탁 연구실에서 수행된 측정을 비교하는 경우에, HPLC 분석을 위한 단백질 침전에 의한 혈장 샘플 제조의 통상적인 방법을 조사하였다. 동일한 12명의 대상체로부터 수득된 혈장 샘플을 변형된 단백질 침전법(modified protein precipitation method)을 이용하여 분석하였다. 직접 희석법(direction dilution method)에 의해 측정된 MB-102 vs 단백질 침전법에 의해 측정된 MB-102의 상관관계 플롯(correlation plot)이 도 9에 제시된다. 1.0074의 상관관계 기울기(correlation slope) 및 0.9944의 R2를 수반하는 결과는 직접 희석법에 의해 제조된 혈장 중 MB-102 함유량을 분석하는 것의 타당성을 강력하게 지지한다. 단백질 침전에 의한 혈장 샘플의 제조는 시간 소모가 크며, 추가의 실험 장비의 설치를 필요로 한다. 1X PBS 중 1/100 직접 희석에 의한 혈장 샘플의 제조는 용이하고, 빠르며, 정밀하고, 정확하다.
단백질 침전법을 이용하여, 59명의 대상체의 임상시험으로부터 수득된 혈장 샘플을 분석하였다. 결과를 직접 희석법을 이용한 GMP 실험실로부터 획득된 결과와 비교하였다. 데이터의 이들 두 세트의 상관관계 플롯(correlation plot)이 도 10에 도시된다. 1.0153의 상관관계 기울기가 0.9941의 R2과 함께 획득되었다. 등분산(equal variance)을 가정하는 두 표본 t-검정 (two sample t-test)을 이용하여 이 데이터로부터 획득된 p-값 (0.579 > 0.05)은 페어(pair)의 평균이 통계학적으로 상이하지 않다는 것을 나타낸다.
용혈을 보이는 혈액 샘플의 분석
본원에 개시된 방법의 전개 동안에, 혈장 중 MB-102 정량에 대한 용혈의 효과를 조사했다. 혈액 수집 및 혈장 제조 동안에 용혈을 최소화하는 임상 프로토콜(Clinical protocol)을 시험 현장(trial site)에서 임상의(clinician)에게 전달하여 이들과 논의하였으나, 59명의 대상체의 모든 혈장 샘플 중에서, 어느 정도의 용혈을 갖는 몇몇 샘플들이 언급되었다. 임상연구로부터 받은 혈장 샘플의 90% 초과가 50 mg/dL 이하의 헤모글로빈 함량을 가졌다. 몇몇의 혈장 샘플은 약 100 내지 250 mg/dL의 헤모글로빈 함량을 가졌다. 이들 샘플의 MB-102 농도를 직접 희석법 및 단백질 침전법을 이용하여 비교했다. 도 11의 결과는 50 mg/dL 내지 100 mg/dL의 헤모글로빈 함량을 갖는 샘플에 대한 것이다. 상관관계 곡선의 기울기 (1.0194)는 도 10에 제시된 상관관계 곡선의 기울기 (1.0153)와 비교되는 경우에, MB-102 정량에 대한 영향이 최소임을 나타냈다.
도 12의 결과는 100 mg/dL 내지 250 mg/dL의 헤모글로빈 함량을 보이는 샘플이다. 상관관계 곡선의 기울기 (1.1107)는 도 10에 제시된 상관관계 곡선의 기울기 (1.0153)와 비교되는 경우에, MB-102 정량에 대한 영향을 나타낸다. 이들 4개의 혈장 샘플이 4명의 상이한 대상체로부터, 샘플 수집의 상이한 시점에서 수득되었기 때문에, 제거율의 결정에 대한 이들의 영향 - 따라서 GFR - 은 유의하지 않을 것이다.
이들 연구로부터 획득된 데이터는 형광 검출을 이용한 직접 희석법 및 단백질 침전법 모두가 정밀하고 정확하며, 인간 혈장 중 MB-102의 검정에 적합하다는 것을 나타낸다.

Claims (20)

  1. 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은
    혈장 샘플을 수집하는 단계;
    상기 혈장 샘플을 적어도 하나의 용매로 희석시키는 단계; 및
    상기 희석된 샘플을 HPLC에 의해 분석하여 상기 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 단계;를 포함하되,
    상기 혈장 샘플은 HPLC 분석 전에 건조되지 않고, 내부 표준(internal standard)이 상기 샘플에 더해지지 않는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 형광 화합물은 하기 화학식 I의 화합물이거나, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
    화학식 I
    Figure pct00013

    상기 화학식 I에서,
    X1 및 X2 각각은 독립적으로 -CO2R1, -CONR1R2, -CO(AA) 또는 -CONH(PS)이고;
    Y1 및 Y2 각각은 -NR1R2 및 하기 화학식 II로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    화학식 II
    Figure pct00014

    상기 화학식 II에서,
    Z1은 단일 결합, -CR1R2-, -O-, -NR1-, -NCOR1-, -S-, -SO-, 또는 -SO2-이고,
    R1 내지 R2 각각은 H, -CH2(CHOH)aH, -CH2(CHOH)aCH3, -CH2(CHOH)aCO2H, -(CHCO2H)aCO2H, -(CH2CH2O)cH, -(CH2CH2O)cCH3, -(CH2)aSO3H, -(CH2)aSO3 -, -(CH2)aSO2H, -(CH2)aSO2 -, -(CH2)aNHSO3H, -(CH2)aNHSO3 -, -(CH2)aNHSO2H, -(CH2)aNHSO2 -, -(CH2)aPO4H3, -(CH2)aPO4H2 -, -(CH2)aPO4H2 -, -(CH2)aPO4 3 -, -(CH2)aPO3H2, -(CH2)aPO3H-, 및 -(CH2)aPO3 2 -로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    AA는 펩티드 또는 아미드 결합에 의해 함께 연결된, 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 사슬이며, 각각의 AA는 서로 동일하거나 상이할 수 있고;
    PS는 글리코시드 결합(glycosidic linkage)에 의해 연결된 하나 이상의 단당류 유닛(monosaccharide unit)을 포함하는 설페이트화 다당류 사슬 (sulfated polysaccharide chain) 또는 비-설페이트화 다당류 사슬(non-sulfated polysaccharide chain)이며;
    'a'는 1 내지 10 사이의 수이고, 'c'는 1 내지 100 사이의 수이며, 'm'과 'n' 각각은 독립적으로 숫자 1 내지 3 사이의 수이다.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 III, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
    화학식 III
    Figure pct00015

  4. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 용매는 수성 용매, 비-수성 용매 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 용매는 PBS인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혈장 샘플은 혈액 용혈(blood hemolysis)의 징후(sign)를 보이는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  7. 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은
    혈장 샘플을 수집하는 단계;
    상기 샘플에 적어도 하나의 용매를 추가하여 혈장 단백질이 침전되도록 하는 단계;
    침전된 혈장 단백질을 상기 샘플로부터 제거하는 단계; 및
    침전된 혈장 단백질이 제거된 샘플을 HPLC에 의해 분석하여 상기 혈장 중 형광 화합물의 양을 측정하는 단계;를 포함하되,
    상기 샘플은 HPLC 분석 전에 건조되지 않고, 내부 표준(internal standard)이 상기 샘플에 더해지지 않는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 침전된 혈장 단백질을 제거하는 단계는 상기 샘플을 원심분리시키는 단계를 포함하고,
    상기 원심분리된 샘플은 상청액과 펠렛을 가지며,
    상기 상청액은 HPLC 분석 전에 적어도 하나의 용매로 희석되는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 용매는 메탄올, PBS 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 형광 화합물은 하기 화학식 I의 화합물이거나, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
    화학식 I
    Figure pct00016

    상기 화학식 I에서,
    X1 및 X2 각각은 독립적으로 -CO2R1, -CONR1R2, -CO(AA) 또는 -CONH(PS)이고;
    Y1 및 Y2 각각은 -NR1R2 및 하기 화학식 II로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    화학식 II
    Figure pct00017

    상기 화학식 II에서,
    Z1은 단일 결합, -CR1R2-, -O-, -NR1-, -NCOR1-, -S-, -SO-, 또는 -SO2-이고,
    R1 내지 R2 각각은 H, -CH2(CHOH)aH, -CH2(CHOH)aCH3, -CH2(CHOH)aCO2H, -(CHCO2H)aCO2H, -(CH2CH2O)cH, -(CH2CH2O)cCH3, -(CH2)aSO3H, -(CH2)aSO3 -, -(CH2)aSO2H, -(CH2)aSO2 -, -(CH2)aNHSO3H, -(CH2)aNHSO3 -, -(CH2)aNHSO2H, -(CH2)aNHSO2 -,-(CH2)aPO4H3, -(CH2)aPO4H2 -, -(CH2)aPO4H2 -, -(CH2)aPO4 3 -, -(CH2)aPO3H2, -(CH2)aPO3H-, 및 -(CH2)aPO3 2 -로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    AA는 펩티드 또는 아미드 결합에 의해 함께 연결된, 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 사슬이며, 각각의 AA는 서로 동일하거나 상이할 수 있고;
    PS는 글리코시드 결합(glycosidic linkage)에 의해 연결된 하나 이상의 단당류 유닛(monosaccharide unit)을 포함하는 설페이트화 다당류 사슬 (sulfated polysaccharide chain) 또는 비-설페이트화 다당류 사슬(non-sulfated polysaccharide chain)이고;
    'a'는 1 내지 10 사이의 수이며, 'c'는 1 내지 100 사이의 수이고, 'm'과 'n' 각각은 독립적으로 숫자 1 내지 3 사이의 수이다.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 III, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
    화학식 III
    Figure pct00018

  12. 제7항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 용매는 수성 용매, 비-수성 용매 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 수성 용매는 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)이고, 상기 비-수성 용매는 메탄올인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 혈장 샘플은 혈액 용혈의 징후를 보이는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 혈장은 인간, 동물 또는 시험관내 연구(in vitro study)로부터 수득되는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 용매는 인산염(phosphate), 아세트산염(acetate), 중탄산염(bicarbonate), 탄산염(carbonate), 포름산염(formate), 글루콘산염(gluconate), 젖산염(lactate), 시트르산염(citrate), 술폰산염(sulfonate), 암모늄(ammonium), 구아니디늄(guanidinium), HEPES, 카코딜산염(cacodylate), Tris, tris-HCl, 말레산염(maleate), 붕산염(borate), 글리시네이트(glycinate), 숙신산염(succinate), PIPES 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 수성 버퍼(aqueous buffer)인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 용매는 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), DMF, DMSO, 아세트산(acetic acid), 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile), 부탄올(butanol), 사염화 탄소(carbon tetrachloride), 디에틸렌 글리콜(diethylene glycol), 디에틸 에테르(diethyl ether), DME, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 니트로메탄(nitromethane), 석유 에테르(petroleum ether), 프로판올(propanol), 피리딘(pyridine), 톨루엔(toluene), MTBE, 트리에틸아민(triethylamine), 크실렌(xylene), 및 벤젠(benzene)으로 이루어진 군으로부터 선택된 비-수성 용매인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  18. 제7항에 있어서,
    상기 혈장은 인간, 동물 또는 시험관내 연구로부터 수득되는 것인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  19. 제7항에 있어서,
    상기 용매는 인산염, 아세트산염, 중탄산염, 탄산염, 포름산염, 글루콘산염, 젖산염, 시트르산염, 술폰산염, 암모늄, 구아니디늄, HEPES, 카코딜산염, Tris, tris-HCl, 말레산염, 붕산염, 글리시네이트, 숙신산염, PIPES 및 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 수성 버퍼인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
  20. 제7항에 있어서,
    상기 용매는 메탄올, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 헥산, 클로로포름, DMF, DMSO, 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 부탄올, 사염화 탄소, 디에틸렌 글리콜, 디에틸 에테르, DME, 에틸렌 글리콜, 메틸렌 클로라이드, 니트로메탄, 석유 에테르, 프로판올, 피리딘, 톨루엔, MTBE, 트리에틸아민, 크실렌, 및 벤젠으로 이루어진 군으로부터 선택된 비-수성 용매인, 형광 화합물의 양을 측정하는 방법.
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