KR20200021521A - 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20200021521A
KR20200021521A KR1020207002337A KR20207002337A KR20200021521A KR 20200021521 A KR20200021521 A KR 20200021521A KR 1020207002337 A KR1020207002337 A KR 1020207002337A KR 20207002337 A KR20207002337 A KR 20207002337A KR 20200021521 A KR20200021521 A KR 20200021521A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pharmaceutical composition
growth factor
fibroblast growth
sodium
bfgf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020207002337A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102480402B1 (ko
Inventor
하이저우 팡
페이민 다이
보 양
신지 왕
전흥 왕
말콤 기암
치 쉐
잉루오 시옹
Original Assignee
주하이 에섹스 바이오-파머슈티컬 코., 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주하이 에섹스 바이오-파머슈티컬 코., 엘티디. filed Critical 주하이 에섹스 바이오-파머슈티컬 코., 엘티디.
Publication of KR20200021521A publication Critical patent/KR20200021521A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102480402B1 publication Critical patent/KR102480402B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)의 돌연변이된 핵산 분자, rh-bFGF의 약학적 조성물, 및 그의 용도를 제공한다.

Description

재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물
본 발명은 DNA 재조합 및 바이오의약품 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (recombinant human-basic fibroblast growth factor: rh-bFGF)를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자, rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물, 및 안구 건조 (dry eye) 치료를 위한 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
안구 건조는 어떠한 원인으로 인해 키네틱스 (kinetics) 또는 눈물 질의 이상으로 눈물막 안정성이 저하되고, 눈의 불편함 및/또는 건성각막결막염 (keratoconjunctivitis sicca)으로도 알려져 있는 안구 표면 조직 병변을 수반하는 다양한 질환에 대한 일반적인 용어이다.
눈물막 액체 눈물의 생성 감소, 비정상적인 점액 분비 및 마이봄선 기능장애와 같은 다양한 원인으로 눈물막 성분의 절대적 및 상대적 부족, 안구 표면에서 눈물의 비정상적인 분포 및 눈물 증발이 증가하는 경우, 안구 건조가 발생할 수 있다.
일반적인 증상은 안구 건조, 쉽게 피곤함, 안구 가려움, 이물감 (foreign body sensation), 작열감 (burning sensation), 증점성 분비 (thick secretions), 바람에 대한 공포 (fear of wind), 눈부심 (photophobia), 외부 자극에 대한 민감성을 포함하며; 때로 눈이 너무 건조하고, 기본 눈물이 충분하지 않아서, 반사성 눈물 분비 (reflexive tear secretion)를 자극하여 빈번한 유루 (lachrymation)를 야기하며; 심각한 경우에, 눈이 충혈되고, 붓고, 각질화되며 (keratinized), 각막 상피는 필라멘트가 부착된 상태에서 파열될 것이다. 이러한 손상은 각막결막 병변을 유발할 수 있고, 장기적으로 시력에 영향을 준다.
오늘날, 안구 건조 환자의 수는 증가하고 있다. 현재, 소듐 히알루로네이트 점안액, 폴리비닐 알콜 점안액, 폴리에틸렌 글리콜 점안액 등과 같은 상업적으로 입수가능한 제품이 안구 건조 증상을 완화시킬 수 있지만, 인공 눈물로서만 작용할 수 있다. 천연 눈물은 구성이 복잡하고, 천연 눈물막의 3층 구조의 완전성 (integrity)이 효과적인 기능을 구현하기 위한 기초이므로, 천연 눈물은 인공 눈물로 완전히 대체될 수 없다.
또한, 현재 상업적으로 입수할 수 있는 제품에는 보존제가 함유되어 있으며, 보존제-함유 약물을 장기간 사용하면 안구 표면에 손상을 유발하고, 안구 표면 질환이 더 심각해 질 수 있다.
현재 안구 건조 치료를 위해 bFGF를 사용하는 제품은 없으며, 안구 건조 치료를 위한 인간 유래의 bFGF는 보고된 바가 없다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 돌연변이된 핵산 분자에 의해 코딩된 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 헤파린 소듐 또는 인간 혈청 알부민 (human serum albumin: HSA)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 안정화제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 상기 약학적 조성물에는 보존제가 없다.
일 양상에서, 본 발명은 안구 건조를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 pET-30a(+) 플라스미드의 구조를 나타내는 다이아그램이다.
도 2는 rh-bFGF의 웨스턴 블롯 (Western Blot)의 결과를 나타낸다.
도 3은 고성능 액체 크로마토그래피로 검출된 rh-bFGF의 순도를 나타낸다.
도 4는 rh-bFGF 온전한 단백질의 분자 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 cDNA 서열 및 네이티브 인간 bFGF의 아미노산 서열 및 돌연변이된 인간 bFGF의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 6은 rh-bFGF 인 비트로 활성 분석을 위한 4-파라미터 피팅 곡선 (4-parameter fitting curve)을 나타내며, 여기서 C는 EC50 값이다.
도 7은 고온 스트레스 (hot stress) 조건하에 rh-bFGF의 순도 변화에 대한 히스티딘, 글리신 및 아르기닌을 포함하는 상이한 아미노산, 및 Tween의 효과를 나타내며, 여기서 95% 선은 rh-bFGF 스톡 용액의 순도에 대한 품질 표준을 나타내고; 스톡 용액에 대해 95% 미만의 순도는 순도가 부적격인 것을 의미한다.
도 8은 고온 스트레스 조건하에 rh-bFGF의 순도 변화에 대한 HSA의 효과를 나타낸다.
도 9는 알칼리로 화상을 입은 New Zealand 토끼의 안구 건조 모델에서 눈물 분비에 대한 상이한 농도의 rh-bFGF 점안액의 효과를 나타낸다. 기호 "*" 또는 "**"는 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05 또는 p<0.01).
도 10은 알칼리로 화상을 입은 New Zealand 토끼의 안구 건조 모델에서 눈물막의 파괴 시간 (break-up time)에 대한 상이한 농도의 rh-bFGF 점안액의 효과를 나타낸다. 기호 "*" 또는 "**"는 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.05 또는 p<0.01).
일 양상에서, 본 발명자들은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 처음으로 개발하였다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 헤파린 소듐 또는 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 안정화제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이와 관련하여, 상기 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 및 안정화제가 특정 안정한 조합을 구성하는 것을 예상치 못하게 발견하였다.
일 양상에서, 상기 약학적 조성물에는 보존제가 없다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는, 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 돌연변이된 핵산 분자에 의해 코딩된 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 양상에서, 상기 부형제는 버퍼 시스템 (buffer system), 증점제, 안정화제, 중화제, 습윤제 및 유사물을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
일 양상에서, 본 발명은 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 헤파린 소듐 또는 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 안정화제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 상기 부형제는 버퍼 시스템을 포함한다. 상기 버퍼 시스템은 소듐 디히드로겐 포스페이트-디소듐 히드로겐 포스페이트, 시트르산-디소듐 히드로겐 포스페이트 또는 붕산-붕사 (boric acid-borax)를 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 일 양상에서, 상기 버퍼 시스템은 소듐 디히드로겐 포스페이트-디소듐 히드로겐 포스페이트이다. 일 양상에서, 상기 버퍼 시스템은 시트르산-디소듐 히드로겐 포스페이트이다.
일 양상에서, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트가 버퍼 시스템으로 사용되는 경우, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트는 각각 0.25mg/mL-1.25mg/mL 및 1.25mg/mL-3.75mg/mL의 농도로 존재한다.
일 양상에서, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트가 버퍼 시스템으로 사용되는 경우, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트는 각각 0.2-2.5 mg/mL 및 0.5-5.0 mg/mL 및 0.5-5.0 mg/mL의 농도로 존재한다.
일 양상에서, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트가 버퍼 시스템으로 사용되는 경우, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트는 각각 0.425mg/mL 및 2.50mg/mL의 농도로 존재한다.
일 양상에서, 상기 부형제는 증점제를 포함한다. 상기 증점제는 폴리비닐 알콜, 소듐 히알루로네이트, 메틸 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히프로멜로스, 폴록사머 (poloxamer) 또는 카르보머 증점제를 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 일 양상에서, 상기 증점제는 폴리비닐 알콜이다. 일 양상에서, 상기 증점제는 카르보머이다. 일 양상에서, 상기 카르보머는 예컨대 일련의 카르보머 940, 카르보머 934, 카르보머 974, 카르보머 980 등, 바람직하게는 카르보머 980 시리즈이다.
일 양상에서, 상기 증점제는 전형적으로 0.1-20.0mg/mL의 농도로 존재한다. 일 양상에서, 상기 증점제는 전형적으로 5.0-15.0 mg/mL, 예컨대 5.0 mg/mL, 6.0 mg/mL, 7.0 mg/mL, 8.0 mg/mL, 9.0 mg/mL, 10.0 mg/mL, 11.0 mg/mL, 12.0 mg/mL, 13.0 mg/mL 및 14.0 mg/mL의 농도로 존재한다.
일 양상에서, 폴리비닐 알콜이 증점제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 폴리비닐 알콜의 양은 전형적으로 5.0 mg/mL, 6.0 mg/mL, 7.0 mg/mL, 8.0 mg/mL, 9.0 mg/mL, 10.0 mg/mL이다.
일 양상에서, 카르보머가 증점제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 카르보머의 양은 전형적으로 5.0 mg/mL, 6.0 mg/mL, 7.0 mg/mL, 8.0 mg/mL, 9.0 mg/mL, 10.0 mg/mL이다.
일 양상에서, 상기 부형제는 안정화제를 포함한다. 이러한 안정화제는 헤파린 소듐, 인간 혈청 알부민 (HSA), 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 또는 이의 2 이상의 조합을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 일 양상에서, 상기 안정화제는 헤파린 소듐 및 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일 양상에서, 상기 안정화제는 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일 양상에서, 상기 안정화제는 글리신이다. 일 양상에서, 상기 안정화제는 히스티딘이다. 일 양상에서, 상기 안정화제는 아르기닌이다. 일 양상에서, 상기 안정화제는 Tween, 예컨대 Tween-20이다.
일 양상에서, 헤파린 소듐 및 인간 혈청 알부민이 안정화제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 헤파린 소듐의 양은 전형적으로 0.1-100 μg/mL, 예컨대 0.25-75.0 μg/mL, 예컨대 0.25-5.0 μg/mL, 25.0-75.0 μg/mL, 예컨대 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 25 μg/mL, 30 μg/mL, 35 μg/mL, 40 μg/mL, 45 μg/mL, 50 μg/mL, 55 μg/mL, 60 μg/mL, 70 μg/mL, 또는 75 μg/mL이며; 상기 조성물 중 인간 혈청 알부민의 양은 전형적으로 0.01-10.0 mg/mL, 예컨대 0.03-10.0 mg/mL, 0.025-0.375 mg/mL, 0.1-0.375 mg/mL, 예컨대 0.1 mg/mL, 0.15 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.25 mg/mL 또는 0.3 mg/mL이다.
일 양상에서, 인간 혈청 알부민이 안정화제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 인간 혈청 알부민의 양은 전형적으로 0.01-10.0 mg/mL, 예컨대 0.03-10.0 mg/mL이다.
일 양상에서, 글리신, 히스티딘 또는 아르기닌이 안정화제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 글리신, 히스티딘 또는 아르기닌의 양은 전형적으로 2%-5% (w/v), 예컨대 2%, 3%, 4% 또는 5%이다.
일 양상에서, 상기 부형제는 중화제를 포함한다. 상기 중화제는 트리에탄올아민, 소듐 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 소듐 카르보네이트, 소듐 히드로겐 카르보네이트, 포타슘 히드로겐 카르보네이트 또는 붕사를 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 일 양상에서, 상기 중화제는 트리에탄올아민이다.
일 양상에서, 상기 중화제는 전형적으로 1.25-12.5 mg/mL, 예컨대 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL 또는 10 mg/mL의 농도로 존재한다. 일 양상에서, 트리에탄올아민이 중화제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 트리에탄올아민의 양은 전형적으로 5-12.5 mg/mL, 예컨대 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL 또는 10 mg/mL이다.
일 양상에서, 상기 부형제는 습윤제를 포함한다. 상기 습윤제는 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그의 혼합물을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
일 양상에서, 상기 습윤제는 전형적으로 0.1-50.0 mg/mL의 농도로 존재한다. 일 양상에서, 글리세롤이 습윤제로 사용되는 경우, 상기 조성물 중 글리세린의 양은 전형적으로 12.5-50.0 mg/mL, 예컨대 12.5-25.0mg/mL, 25.0-50.0 mg/mL, 예컨대 25.0mg/mL이다.
일 양상에서, 상기 조성물은 pH 약 6.0-8.0, 예컨대 pH 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0 또는 이들 사이의 임의의 범위로 정의된 pH로 완충된다.
일 양상에서, 본 발명은 안구 건조를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 안구 건조 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 안구 건조 치료를 위한 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 또한 안구 건조 치료용 약제 제조에 있어서 조성물의 용도를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명의 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 다양한 투여 경로로, 예컨대 결막 (conjunctiva) 투여와 같은 안구 투여로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 제형, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 복합 에멀젼, 점적제 (drop), 겔, 스프레이, 점안액, 안연고 (ophthalmic ointment), 또는 안 로션 (ophthalmic lotion) 및 주사로 투여될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명의 약학적 조성물은 안과용 약학적 조성물이다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 점안액 또는 겔의 형태이다.
본 발명의 약학적 조성물의 이점은 rh-bFGF 및 안정화제 예컨대 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 헤파린 소듐 또는 인간 혈청 알부민 (HSA)이 예상치 않게 특정 안정한 조합을 구성한다는 것이다. 구체적으로, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 헤파린 소듐 또는 인간 혈청 알부민 (HSA)은 rh-bFGF의 안정성을 유의하게 향상시켰다. 또한, 본 발명의 인간화 bFGF는 비-인간 유래 bFGF보다 면역학적으로 더 안전하다.
본 발명은 하기 비-제한적인 예를 참고하여 추가적으로 설명된다.
실시예
실시예 1. 핵산 돌연변이
네이티브 인간 bFGF를 코딩하는 cDNA 서열 (서열 번호: 4)을 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않고 돌연변이시켰고, 3개의 돌연변이된 cDNA 서열을 디자인 및 합성하였다 (각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 나타낸 돌연변이된 cDNA 서열 1, 서열 2 및 서열 3):
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 2. 원핵생물 발현 및 단백질 특성규명
2.1 발현 및 정제
사용된 발현 벡터는 pET-30a(+)이고 (도 1 참조), Merk KgsA co. (Cat. No. 69909-3)로부터 구입하였다. 상기 벡터는 T7 프로모터, T7 전사 개시 부위, His 태그, 코딩 서열, S 태그 코딩 서열, 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site: MCS), T7 종결인자, 락토스 코딩 서열, kan 저항 코딩 서열, 및 pBR322 레플리콘 (replicon) 및 f1 레플리콘을 갖는다. 상기 MCS는 제한 부위 Xho I, Not I, Eag I, HindIII, Sal I, Sac I, EcoR I, BamH I, EcoR V, Nco I, Kpn I, Bgl II, Nsp V 및 Nde I을 포함한다.
클로닝을 용이하게 하기 위해, NdeI 제한 부위를 서열 1 (서열 번호: 1)의 개시 코돈의 업스트림에 디자인하고, HindIII 제한 부위를 종결인자 부근에 디자인하였다. 480bp 서열은 화학적 방법을 통한 유전자 합성에 의해 달성되었다. 상기 서열은 NdeI 및 HindIII으로 이중-소화되고 (double-digested), 그 다음에 동일한 이중-소화된 발현 벡터 pET-30a(+)로 삽입하여 5724bp 재조합 플라스미드를 수득하고, 이는 DH5α (TaKaRa, 9057)로 열충격 방법에 의해 형질전환하고, 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 모노클론을 선별하고, 정확한 형질전환체를 NdeI 및 HindIII 이중 소화에 의해 스크리닝하였다. 상기 형질전환체의 정확성 (correctness)은 시퀀싱으로 다시 검증하였다.
다른 실시예에서, pET-28a(+), pET-23c(+) 또는 pET-15b 또는 유사물이 상기 pET-30a(+) 벡터 대신에 사용될 수 있다.
단백질 서열을 함유하는 원핵생물 발현 벡터를 E. 콜리 (E. coli) BL21 (DE3)로 형질전환하고, 가용성 인간 bFGF의 발현을 박테리아 배양 온도, 유도 온도, pH 범위, 글루코스 농도 및 유도제 농도를 조정하여 유도하였다. 상기 박테리아는 세척 및 중공 파이버 (hollow fiber)를 통해 여과하여 수집하고; 발효된 박테리아는 고압 균질화를 사용하고 저온에서 유지하여 파괴하며; 적절한 양의 비이온성 계면활성제를 부가한 후에, 상등액을 저온 고속 원심분리에 의해 수집하고, 펠렛 (pellet)은 버렸다.
정제는 약양이온 교환 (weak cation exchange), 헤파린 친화도 크로마토그래피 또는 유사물과 같은 과정을 사용하여 수행하고, 메르캅토에탄올, DTT 또는 유사물과 같은 보호제의 적절한 양을 정제 중에 부가하였다. 상기 시료를 상기 절차로 정제한 후에, 그의 순도는 95% 이상이었다. 상기 실험으로부터 약 600 mg의 재조합 인간 bFGF 단백질이 박테리아 100 g에 대해 제조될 수 있고, 현저하게 높은 발현이 달성되었음을 확인하였다.
2.2 순도 및 분자량 검출 및 시퀀싱
15% SDS-PAGE 전기영동에 의해 수득된 인간 bFGF 단백질이 대략 18.5 KD의 단일 밴드인 것으로 나타났다 (도 2 참조). C8 역상 컬럼을 갖춘 고성능 액체 크로마토그래피의 검출 결과로부터 본 발명에서 수득된 인간 bFGF의 순도는 95% 이상임을 나타내었다 (도 3 참조).
"초-고해상도, 초-고정확도, 초-고감도" Exactive Plus EMR을 사용하여 정확한 분자량을 결정하고, 6개의 성분 (성분 1, 4, 5 비율은 기본적으로 >10%, 표 1)은 rh-bFGF 스톡 용액의 4개의 배치 (batches)에서 검출되었다. 성분 4는 주요 성분이고, 평균 분자량은 17121.02 Da이며; 배치간 (inter-batch) RSD%는 0.0007이고, 이론값으로부터의 편차는 ≤41 ppm이며, 상대 비율 (피크 세기로 산출)은 70.7%-79.0%이다.
시험 시료의 정확한 분자량을 위한 HPLC - Exactive Plus EMR 질량 분석
성분 배치 실험값 ( Da ) 이론값 (Da) 편차 (ppm) 상대 비율 ( % ) 평균 RSD%
1 스톡 배치 II 17049.21 17049.34△ 8 5.2 17049.40 0.0019
스톡 배치 III 17049.77 25 12.6
물리-화학적 표준 17049.20 8 9.8
4 스톡 배치 I 17120.87 17120.42* 26 79.0 17121.02 0.0007
스톡 배치 II 17121.13 41 76.6
스톡 배치 III 17120.98 33 70.7
물리-화학적 표준 17121.08 39 78.5
5 스톡 배치 I 17137.23 17136.42□ 47 13.4 17137.34 0.0009
스톡 배치 II 17137.27 50 13.4
스톡 배치 III 17137.51 64 10.6
또한, 재조합으로 제조된 인간 bFGF 단백질의 아미노산 서열을 분석하고, 이는 그의 아미노산 서열이 네이티브 인간 bFGF의 아미노산 서열과 동일함을 확인하였다 (도 5 참조).
2.3 생물학적 활성 분석
balb/c3T3 세포를 사용하여 인 비트로 활성에 대해 시료를 시험하였다. 세포 증식은 MTT 분석에 의해 판단되었다. 상기 결과로부터 수득된 인간 bFGF에 의한 balb/c3T3 세포의 증식을 촉진하는 효과는 bFGF 활성 표준 (NISCB)에 의한 것과 일치함으로 보여주었다 (도 6 참조).
실시예 3. 약학적 조성물의 제조
약학적 조성물 1:
재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 2500-10000 IU;
인간 혈청 알부민 0.025-0.375 mg/mL;
증점제 5.0-15.0 mg/mL;
소듐 클로라이드 5.0-12.5 mg/mL;
헤파린 소듐 0.25-5.0 μg/mL;
소듐 디히드로겐 포스페이트 0.25-1.25 mg/mL;
디소듐 히드로겐 포스페이트 1.25-3.75 mg/mL.
1. 버퍼 시스템은 상기 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트, 또는 붕산-붕사 버퍼 시스템, 시트르산-디소듐 히드로겐 포스페이트 버퍼 시스템 또는 유사물일 수 있다. 바람직하게, 상기 약학적 조성물의 pH는 6.5 내지 7.5이다.
2. 증점제는 폴리비닐 알콜, 소듐 히알루로네이트, 히프로멜로스, 폴록사머, 또는 유사물, 바람직하게는 폴리비닐 알콜이다.
3. 제조 절차:
(1) 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해시키고, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 헤파린 소듐, 소듐 클로라이드, 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해시키고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액들을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 고정된 부피까지 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉 (blowing), 충전 (filling) 및 밀봉 (sealing)의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
약학적 조성물 2:
재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 2500-10000 IU;
인간 혈청 알부민 0.1-0.375 mg/mL;
헤파린 소듐 25.0-75.0 μg/mL;
카르보머 1.25-12.5 mg/mL;
중화제 1.25-12.5 mg/mL;
글리세롤 12.5-50 mg/mL.
1. 카르보머는 일련의 카르보머 940, 카르보머 934, 카르보머 974, 카르보머 980 등, 바람직하게는 카르보머 980 시리즈이다;
2. 중화제는 소듐 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 포타슘 히드로겐 카르보네이트, 붕사 및 트리에탄올아민, 바람직하게는 트리에탄올아민이다.
3. 제조 절차:
(1) 카르보머를 적당한 양의 주사용 수 중에 분산하고, 균일하게 교반하고, 그 다음에 밤새 팽윤시켜서, 사용 준비하였다;
(2) 트리에탄올아민을 상기 카르보머 분산액에 부가하고, 투명하고 균일한 겔 베이스로 교반하고, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브하고, 멸균이 완료된 후에 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(3) 글리세롤, 인간 혈청 알부민, 헤파린 소듐 및 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자를 적당한 양의 실온의 주사용 수로 부가하고, 균일하게 교반하고, 그 다음에 멸균 조건하에 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통과시키고, 상기 단계 (2)의 겔 베이스와 혼합하고, 그 다음에 정량화하고 균일하게 교반하였다;
(4) 멸균 겔을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4g인, 최종 제품을 수득하였다.
약학적 조성물 3:
재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 1000-9000　IU
인간 혈청 알부민 0.01-5.0 mg/mL;
증점제 0.1-20.0 mg/mL;
소듐 디히드로겐 포스페이트 0.2-2.5 mg/mL;
디소듐 히드로겐 포스페이트 0.5-5.0 mg/mL;
소듐 클로라이드 1.0-5.0 mg/mL;
습윤제 0.1-50.0 mg/mL.
1. 버퍼 염 시스템은 상기 소듐 디히드로겐 포스페이트 및 디소듐 히드로겐 포스페이트, 또는 붕산-붕사 버퍼 시스템, 시트르산-디소듐 히드로겐 포스페이트 버퍼 시스템 또는 유사물일 수 있고; 바람직하게, 상기 pH는 6.5 내지 7.5이다.
2. 증점제는 폴리비닐 알콜, 소듐 히알루로네이트, 히프로멜로스, 폴록사머, 또는 유사물, 바람직하게는 폴리비닐 알콜이다. 습윤제는 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그의 혼합물이다.
3. 제조 절차:
(1) 증점제 및 소듐 클로라이드를 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해시키고, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브하였다;
(2) 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 인간 혈청 알부민, 습윤제, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 및 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해시켰다;
(3) 상기 단계 (2)의 활성제 용액을 0.22 μm의 미세다공성 필터 멤브레인을 통해 여과하고, 그 다음에 상기 단계 (1)에서 수득된 활성제 용액과 혼합하고, 주사용 수로 최대 1 mL로 만들었다;
(4) 상기 단계 (3)에서 수득된 활성제 용액을 정균제 (bacteriostatic agent)를 함유하지 않는 패키징 용기로 충전하고, 상기 용기의 부피가 0.4 g/조각의 범위인, 최종 제품을 수득하였다.
또한, 하기 약학적 조성물 (표 2 참조)을 또한 제조하였다. 이들 중에, 점안액은 100 ml로 제조하고, 외용 겔은 100 g으로 제조하였다.
Figure pct00004
제조예 1:
(1) 1.0 g의 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해하고, 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 500000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 25mg의 인간 혈청 알부민, 2.5mg의 헤파린 소듐, 800mg의 소듐 클로라이드, 42.5mg의 소듐 디히드로겐 포스페이트, 및 250mg의 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해시키고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 100 mL로 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 2:
(1) 0.5 g의 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해하고, 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 500000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 20mg의 인간 혈청 알부민, 2.0mg의 헤파린 소듐, 800mg의 소듐 클로라이드, 42.5mg의 소듐 디히드로겐 포스페이트, 및 250mg의 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해하고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 100 mL로 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 3:
(1) 1.0 g의 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해하고, 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 420000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 20mg의 인간 혈청 알부민, 2.0mg의 헤파린 소듐, 800mg의 소듐 클로라이드, 42.5mg의 소듐 디히드로겐 포스페이트, 및 250mg의 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해하고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 100 mL로 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 4:
(1) 1.5 g의 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해하고, 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 420000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 10mg의 인간 혈청 알부민, 1.0mg의 헤파린 소듐, 800mg의 소듐 클로라이드, 42.5mg의 소듐 디히드로겐 포스페이트, 및 250mg의 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해하고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 100 mL로 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 5:
(1) 1.0 g의 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해하고, 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 420000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 20mg의 인간 혈청 알부민, 2.0mg의 헤파린 소듐, 800mg의 소듐 클로라이드, 370.6mg의 시트르산, 및 5.9g의 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해하고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 100 mL로 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 6:
(1) 1.0 g의 폴리비닐 알콜을 적당한 양의 주사용 수 중에 분산 및 용해하고, 오토클레이브하고, 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(2) 500000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 25mg의 인간 혈청 알부민, 2.5mg의 헤파린 소듐, 800mg의 소듐 클로라이드, 370.6mg의 시트르산, 및 5.9g의 디소듐 히드로겐 포스페이트를 적당한 양의 주사용 수 중에 용해하고, 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 멸균 여과하였다;
(3) 상기 단계 (1) 및 단계 (2)에서 수득된 용액을 멸균 조건하에 균일하게 혼합하고, 멸균된 주사용 수로 100 mL로 만들어서 수득하였다;
(4) 멸균 용액을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4mL인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 7:
(1) 0.80g의 카르보머 940을 칭량하고, 실온의 적당한 양의 주사용 수 중에 분산시키고, 60-120분 동안 교반하고, 밤새 팽윤시켜서, 사용 준비하였다;
(2) 0.60g의 트리에탄올아민을 카르보머 940 분산액에 부가하고, 투명하고 균일한 겔 베이스로 교반하고, 그 다음에 습윤 가열 멸균화 처리하고 (121℃, 30분), 멸균이 완료된 후에 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(3) 2.50g의 글리세롤, 30.0mg의 인간 혈청 알부민, 7.0mg의 헤파린 소듐, 및 450000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자를 실온의 적당한 양의 주사용 수로 부가하고, 균일하게 교반하고, 그 다음에 멸균 조건하에 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통과시키고, 상기 단계 (2)의 겔 베이스와 혼합하고, 그 다음에 정량화하고 균일하게 교반하였다;
(4) 멸균 겔을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4g인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 8:
(1) 0.60g의 카르보머 940을 칭량하고, 실온의 적당한 양의 주사용 수 중에 분산시키고, 60-120분 동안 교반하고, 밤새 팽윤시켜서, 사용 준비하였다;
(2) 0.50g의 트리에탄올아민을 카르보머 940 분산액에 부가하고, 투명하고 균일한 겔 베이스로 교반하고, 그 다음에 습윤 가열 멸균화 처리하고 (121℃, 30분), 멸균이 완료된 후에 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(3) 2.50g의 글리세롤, 30.0mg의 인간 혈청 알부민, 7.0mg의 헤파린 소듐, 및 420000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자를 실온의 적당한 양의 주사용 수로 부가하고, 균일하게 교반하고, 그 다음에 멸균 조건하에 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통과시키고, 상기 단계 (2)의 겔 베이스와 혼합하고, 그 다음에 정량화하고 균일하게 교반하였다;
(4) 멸균 겔을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4g인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 9:
(1) 0.60g의 카르보머 974를 칭량하고, 실온의 적당한 양의 주사용 수 중에 분산시키고, 60-120분 동안 교반하고, 밤새 팽윤시켜서, 사용 준비하였다;
(2) 0.50g의 트리에탄올아민을 카르보머 974 분산액에 부가하고, 투명하고 균일한 겔 베이스로 교반하고, 그 다음에 습윤 가열 멸균화 처리하고 (121℃, 30분), 멸균이 완료된 후에 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(3) 2.50g의 글리세롤, 30.0mg의 인간 혈청 알부민, 7.0mg의 헤파린 소듐, 및 450000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자를 실온의 적당한 양의 주사용 수로 부가하고, 균일하게 교반하고, 그 다음에 멸균 조건하에 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통과시키고, 상기 단계 (2)의 겔 베이스와 혼합하고, 그 다음에 정량화하고 균일하게 교반하였다;
(4) 멸균 겔을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4g인, 최종 제품을 수득하였다.
제조예 10:
(1) 0.50g의 카르보머 974를 칭량하고, 실온의 적당한 양의 주사용 수 중에 분산시키고, 60-120분 동안 교반하고, 밤새 팽윤시켜서, 사용 준비하였다;
(2) 0.50g의 트리에탄올아민을 카르보머 974 분산액에 부가하고, 투명하고 균일한 겔 베이스로 교반하고, 그 다음에 습윤 가열 멸균화 처리하고 (121℃, 30분), 멸균이 완료된 후에 실온으로 냉각하여, 사용 준비하였다;
(3) 2.50g의 글리세롤, 20.0mg의 인간 혈청 알부민, 5.0mg의 헤파린 소듐, 및 420000 IU의 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자를 실온의 적당한 양의 주사용 수로 부가하고, 균일하게 교반하고, 그 다음에 멸균 조건하에 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통과시키고, 상기 단계 (2)의 겔 베이스와 혼합하고, 그 다음에 정량화하고 균일하게 교반하였다;
(4) 멸균 겔을 블로잉, 충전 및 밀봉의 3-in-1 충전 기계를 사용하여 충전하고, 충전량이 0.4g인, 최종 제품을 수득하였다.
실시예 4. 안정성 연구
1) rh- bFGF 스톡 용액의 안정성에 대한 아미노산의 효과 연구
rh-bFGF 스톡 용액 자체는 본질적으로 불안정하고, 중합하여 실온에서 침전되는 경향이 있다. 따라서, 상이한 안정화제를 선택하여 사용하고, 주로 스톡 용액의 안정성에 대해 스크리닝하였다. 5% 및 2% 만니톨, 5% 및 2% 글리신, 및 2% 덱스트란을 선택하여 사용하고, 25℃ 환경에서 17일 동안 정치하였다. 단백질 농도를 0일, 7일 및 17일차에 각각 측정하고, 결과는 하기 표 3에 개시하였다.
안정화제의 스크리닝 시험에서 rh- bFGF 스톡 용액의 단백질 농도의 변화율
시료 0일차 7일차 17일차
안정화제 없음 100.00% 29.96% 13.63%
5% 만니톨 100.00% 49.80% 17.31%
2% 만니톨 100.00% 53.29% 15.66%
5% 글리신 100.00% 95.67% 86.26%
2% 글리신 100.00% 94.74% 82.73%
2% 덱스트란 100.00% 51.65% 16.20%
상기 결과로부터 5% 글리신은 단백질이 침전되는 것을 방지하는데 효과적임을 보여주었다. 17일 동안 열 파괴 조건 (thermal destructive condition) 하에 정치시킨 후에 86.26%의 단백질이 남아 있었다. 17일 후에, 글리신의 효과는 만니톨 및 덱스트란의 효과보다 유의하게 우수했고, 안정화제를 부가하지 않은 것은 단백질 13.6% 만이 남아 있었다.
2) rh- bFGF 스톡 용액의 안정성에 대한 히스티딘의 효과 연구
상이한 아미노산 (글리신, 히스티딘, 아르기닌) 및 Tween 20을 선택하여 사용하고, 스톡 용액의 안정성에 대해 추가적으로 스크리닝하고, 25℃ 환경에서 18시간 동안 정치하였다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.
상기 결과로부터 3% 히스티딘 및 0.03% Tween 20이 5% 글리신보다 rh-bFGF 스톡 용액의 안정성에 대해 보다 효과적이라는 것을 보여주었다. 단백질의 순도는 열 파괴 조건하에 18시간 동안 정치시킨 후에 여전히 85% 이상으로 유지될 수 있다. 히스티딘 및 Tween 20은 rh-bFGF를 보호하는데 글리신보다 우수하였다.
3) rh- bFGF 스톡 용액의 안정성에 대한 HSA의 효과 연구
HSA가 단백질 함량 측정을 방해할 수 있기 때문에, HSA를 갖거나 또는 갖지 않는 스톡 용액을 25℃ 환경에서 18시간 동안 정치시키고, 열-손상 처리 후에 단백질의 순도 변화를 고-해상도 크로마토그래피로 검출하였다. 결과는 도 8에 도시되어 있다.
상기 결과로부터 HSA는 rh-bFGF의 안정성을 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 지표로서 95% 순도의 변화율로, HSA를 함유하지 않는 시료는 스트레스 조건하에 4시간 동안만 유지될 수 있고, HSA를 부가한 후에 15시간까지 연장될 수 있다. HSA는 bFGF에 대해 우수한 단백질 보호제인 것으로 밝혀졌다.
실시예 5. 동물 안구 건조 모델에서 효능 연구
본 연구에서, New Zealand 토끼 안구 건조 모델을 선택하여 사용하고, 상기 모델의 임상 지표 (눈물 분비 및 눈물막 파괴 시간)를 관찰하고, 안구 건조용 약제의 임상적 치료 효과를 평가하였다. New Zealand 토끼를 네가티브 대조 그룹 (네가티브 대조군, 치료되지 않음), 모델 대조 그룹 (모델, 알칼리로 화상 처리하였지만 어떤 점안액도 부가되지 않음), 소듐 히알루로네이트 점안액에 의한 치료 그룹 (HA 그룹), 및 사용되는 제조예 3의 rh-bFGF 점안액의 농도에 따라 나눈 그룹 D (4.0 μg/mL), E (8.0 μg/mL), F (16.0 μg/mL) 및 G (32.0 μg/mL)로 나누었다. 상기 네가티브 대조 그룹은 그룹당 72마리의 토끼를 가지며, 나머지 그룹은 그룹당 8마리의 토끼를 가졌다. 투여량은 300 μl/eye/day이었다.
(1) 눈물 분비량 (양안)을 측정하는 방법 (페놀 레드 면사의 젖은 길이)
New Zealand 토끼의 눈물 분비는 Schirmer I 시험을 사용하여 측정하였다. 즉, 페놀 레드 면사를 안과용 집게로 고정하고, New Zealand 토끼의 외안각 (outer canthus)에 배치하였다. 60초 후에, 상기 페놀 레드 면사를 꺼내고, 젖은 길이를 측정하였다. 상기 페놀 레드 면사는 젖은 후에 빨갛게 되었고, 젖은 길이에 따라 안구 습윤도를 결정하였다. 실험 결과는 도 9에 도시되어 있다.
도 9에 도시된 바와 같이, 모델 대조 그룹에서 페놀 레드 면사의 젖은 길이는 모두 네가티브 대조군 안구에서의 것과 비교하여 유의하게 감소되었다. 투여 10일 차에, rh-bFGF 점안액들 D, E, F 및 G 그룹에서 페놀 레드 면사의 젖은 길이는 모두 모델 대조 그룹과 비교하여, 통계적으로 유의한 차이로 유의하게 더 길었다.
(2) 눈물막 파괴 시간 (양안)을 측정하는 방법:
2μl의 0.5% 소듐 플루오레세인 용액을 조정가능한 피펫을 사용하여 New Zealand 토끼 안구의 하부 안검 결막낭 (conjunctival sac)에 주입하였다. 일정한 힘으로 수동으로 몇 번 깜박인 후에, 토끼 안구를 일정한 힘으로 벌리고, 각막을 슬릿 램프 현미경 및 코발트 블루광으로 관찰하였다. 각막 그린 막 (corneal green film)에 흑색 영역이 나타나면, 눈물막은 파괴된 것으로 나타낸다. 3회의 측정치를 연속적으로 얻고, 평균값을 얻었다. 10초 미만의 눈물막 파괴 시간은 눈물막이 불안정하다는 것을 나타내고, 이는 눈물 중에 뮤신 (mucin) 부족에 의해 발생하는 KCS의 중요한 마커이며, 이는 결막의 술잔 세포 (goblet cells)가 심각하게 손상 또는 상실되어, 안구 건조가 발생하기 쉽다는 것을 시사한다. 실험 결과는 도 10에 도시되어 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, 모델 대조 그룹의 눈물막 파괴 시간은 모두 네가티브 대조군 안구와 비교하여, 투여 10일차에 네가티브 대조군 안구의 것보다 유의하게 짧았다. 투여 10일차에, rh-bFGF 점안액들 D, E, F 및 G 그룹의 눈물막 파괴 시간은 모두 모델 대조 그룹과 비교하여, 통계적으로 유의한 차이로 유의하게 연장되었다.
요약하면, 눈물 분비의 페놀 레드 면사의 결과로부터 본 발명의 점안액은 모델 동물의 눈물 분비량을 향상시킬 수 있음을 나타내고 (도 9 참조); 눈물막 파괴 시간 시험으로 안구 건조 모델에서 눈물막 파괴 시간이 유의하게 향상되었음을 나타내었다 (도 10 참조). 투여량의 증가로, rh-bFGF 점안액은 알칼리로 화상을 입은 New Zealand 토끼의 안구 건조 모델에서 유의하게 향상되었다.
본 발명의 일부 특징이 본원에 개시되고 예시되었지만, 다양한 수정, 대체, 변경 및 등가물이 당업자에 의해 나타날 것이다. 그러므로, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 정신 및 범위에 속하는 이러한 모든 수정 및 변경을 포함하는 것으로 의도된 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ZHUHAI ESSEX BIO-PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Recombinant Human-Basic Fibroblast Growth Factor (rh-bFGF) and Pharmaceutical Composition Comprising rh-bFGF <130> FPCH17160102P <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 atggctgctg gttcgattac gacgctgccg gctctgccgg aagatggtgg ttcaggtgca 60 tttccgccgg gtcactttaa ggatccgaaa cgtctgtatt gcaagaacgg cggctttttc 120 ctgcgcattc atccggatgg ccgtgtcgac ggtgtgcgcg aaaaaagcga tccgcacatt 180 aagctgcagc tgcaagcaga agaacgtggc gtggttagca tcaaaggtgt ttgtgcgaac 240 cgttacctgg ccatgaaaga agatggccgc ctgctggcta gtaagtgcgt caccgacgaa 300 tgctttttct ttgaacgtct ggaatccaac aattataata cctaccgtag ccgcaaatat 360 acgtcttggt atgtggccct gaaacgcacg ggccagtata agctgggttc caaaacgggt 420 ccgggtcaaa aagccattct gttcctgccg atgtccgcaa aatcataa 468 <210> 2 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 atggctgctg gttctatcac caccctgccg gctctgccgg aagacggtgg ttctggtgct 60 ttcccgccgg gtcacttcaa agacccgaaa cgtctgtact gcaaaaacgg tggtttcttc 120 ctgcgtatcc acccggacgg tcgtgttgac ggtgttcgtg aaaaatctga cccgcacatc 180 aaactgcagc tgcaggctga agaacgtggt gttgtttcta tcaaaggtgt ttgcgctaac 240 cgttacctgg ctatgaaaga agacggtcgt ctgctggctt ctaaatgcgt taccgacgaa 300 tgcttcttct tcgaacgtct ggaatctaac aactacaaca cctaccgttc tcgtaaatac 360 acctcttggt acgttgctct gaaacgtacc ggtcagtaca aactgggttc taaaaccggt 420 ccgggtcaga aagctatcct gttcctgccg atgtctgcta aatcttaa 468 <210> 3 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 atggcagccg gtagcatcac caccctgccg gccctgccgg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgccgg gccacttcaa ggacccgaag cgtctgtact gcaaaaacgg tggcttcttc 120 ctgcgcatcc acccggacgg ccgtgttgac ggtgtccgtg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctgcaac tgcaagcaga agagcgtggt gttgtgtcta tcaaaggtgt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggtcgt ctgctggctt ctaaatgtgt taccgatgag 300 tgtttctttt ttgaacgtct ggaatctaac aactacaaca cttaccgttc tcgtaaatac 360 acctcttggt atgtggcact gaaacgtact ggtcagtata aactgggttc caaaaccggt 420 cctggtcaga aagctatcct gtttctgcca atgtctgcta agagctaa 468 <210> 4 <211> 468 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 4 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctga 468 <210> 5 <211> 155 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 5 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 6 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 ctgcgcatcc acccggacgg ccgtgttgac ggtgtccgtg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctgcaac tgcaagcaga agagcgtggt gttgtgtcta tcaaaggtgt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggtcgt ctgctggctt ctaaatgtgt taccgatgag 300 tgtttctttt ttgaacgtct ggaatctaac aactacaaca cttaccgttc tcgtaaatac 360 acctcttggt atgtggcact gaaacgtact ggtcagtata aactgggttc caaaaccggt 420 cctggtcaga aagctatcct gtttctgcca atgtctgcta agagctaa 468 <210> 4 <211> 468 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 4 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60 ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120 ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180 aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240 cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300 tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360 accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420 cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctga 468 <210> 5 <211> 155 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 5 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 <210> 6 <211> 155 <212> PRT <213> 인공서열 <400> 6 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys 85 90 95 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155

Claims (17)

  1. 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (recombinant human-basic fibroblast growth factor)를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 서열은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3에 나타낸 것인 돌연변이된 핵산 분자.
  3. 청구항 1 또는 2의 돌연변이된 핵산 분자에 의해 코딩된 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자.
  4. 청구항 3의 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자, 및 글리신, 히스티딘, 아르기닌, Tween, 헤파린 소듐 또는 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 안정화제를 포함하는 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 안정화제는 글리신인 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 안정화제는 히스티딘인 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 4 내지 6에 있어서, 상기 부형제는 소듐 디히드로겐 포스페이트-디소듐 히드로겐 포스페이트, 시트르산-디소듐 히드로겐 포스페이트 또는 붕산-붕사로 구성된 그룹으로부터 선택된 버퍼 시스템 (buffer system)을 추가적으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 4 내지 7에 있어서, 상기 부형제는 폴리비닐 알콜, 소듐 히알루로네이트, 메틸 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히프로멜로스, 폴록사머 또는 카르보머로 구성된 그룹으로부터 선택된 증점제를 추가적으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  9. 청구항 4 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부형제는 트리에탄올아민, 소듐 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 소듐 카르보네이트, 소듐 히드로겐 카르보네이트, 포타슘 히드로겐 카르보네이트 또는 붕사로 구성된 그룹으로부터 선택된 중화제를 추가적으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 4 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부형제는 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 습윤제를 추가적으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 4 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, pH 6.0 내지 8.0으로 완충되는 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 4 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 점안액 또는 겔 형태의 안과용 조성물인 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 4에 있어서, 하기를 포함하는 것인 약학적 조성물:
    재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 2500-10000 IU;
    인간 혈청 알부민 0.025-0.375 mg/mL;
    증점제 5.0-15.0 mg/mL;
    소듐 클로라이드 5.0-12.5 mg/mL;
    헤파린 소듐 0.25-5.0 μg/mL;
    소듐 디히드로겐 포스페이트 0.25-1.25 mg/mL;
    디소듐 히드로겐 포스페이트 1.25-3.75 mg/mL.
  14. 청구항 4에 있어서, 하기를 포함하는 것인 약학적 조성물:
    재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 2500-10000 IU;
    인간 혈청 알부민 0.1-0.375mg/mL;
    헤파린 소듐 25.0-75.0 μg/mL;
    카르보머 1.25-12.5 mg/mL;
    중화제 1.25-12.5 mg/mL;
    글리세롤 12.5-50 mg/mL.
  15. 청구항 4에 있어서, 하기를 포함하는 것인 약학적 조성물:
    재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 1000-9000　IU
    인간 혈청 알부민 0.01-5.0 mg/mL;
    증점제 0.1-20.0mg/mL;
    소듐 디히드로겐 포스페이트 0.2-2.5 mg/mL;
    디소듐 히드로겐 포스페이트 0.5-5.0 mg/mL;
    소듐 클로라이드 1.0-5.0 mg/mL;
    습윤제 0.1-50.0 mg/mL.
  16. 안구 건조 (dry eye)를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 4 내지 15 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 4 내지 15 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자를 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
KR1020207002337A 2017-06-23 2017-06-23 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물 Active KR102480402B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2017/089823 WO2018232750A1 (zh) 2017-06-23 2017-06-23 重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)以及包含rh-bFGF的药物组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200021521A true KR20200021521A (ko) 2020-02-28
KR102480402B1 KR102480402B1 (ko) 2022-12-22

Family

ID=64735425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207002337A Active KR102480402B1 (ko) 2017-06-23 2017-06-23 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11254723B2 (ko)
EP (1) EP3643784A4 (ko)
JP (1) JP7044870B2 (ko)
KR (1) KR102480402B1 (ko)
CN (1) CN111315886A (ko)
MY (1) MY194351A (ko)
SG (1) SG11201912799SA (ko)
WO (1) WO2018232750A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019013210A (es) 2017-05-05 2020-07-20 Trefoil Therapeutics Inc Factores de crecimiento recombinantes modificados de fibroblastos y usos terapéuticos de los mismos.
CN116710568A (zh) * 2020-06-26 2023-09-05 特里福伊尔治疗公司 重组修饰成纤维细胞生长因子及其治疗用途
CN111647089A (zh) * 2020-06-30 2020-09-11 安徽九川生物科技有限公司 一种重组类人弹性蛋白及其组合物
TWI865835B (zh) * 2020-11-16 2024-12-11 雅祥生技醫藥股份有限公司 穩定的酸性纖維母細胞生長因子組合物
CN113274486A (zh) * 2021-04-15 2021-08-20 上海腾瑞制药股份有限公司 一种稳定的酸性成纤维细胞生长因子制剂及其制备方法和应用
CN116392441B (zh) * 2023-04-21 2023-11-28 上海腾瑞制药股份有限公司 一种酸性成纤维细胞生长因子滴眼液制剂
CN116889545B (zh) * 2023-06-27 2023-12-29 上海腾瑞制药股份有限公司 一种重组人酸性成纤维细胞生长因子凝胶剂及其制备工艺
CN117447580B (zh) * 2023-12-18 2024-04-30 朗肽生物制药股份有限公司 一种碱性成纤维细胞生长因子改构蛋白在护肤产品中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1448510A (zh) * 2002-04-04 2003-10-15 北京三元基因工程有限公司 一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的高效表达
US7811786B1 (en) * 2004-05-06 2010-10-12 Daewoong Co., Ltd. Preparation method for the production of active and soluble proteins in prokaryotes and polycistronic vectors therefor
CN104606666A (zh) * 2015-02-12 2015-05-13 珠海亿胜生物制药有限公司 重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01291797A (ja) * 1987-06-26 1989-11-24 Progen Biotechnik Gmbh 成長因子をコードする合成遺伝子
CN1634567A (zh) 2004-09-28 2005-07-06 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 一种含有碱性成纤维生长因子凝胶剂的制备工艺及配方
CN1733294A (zh) * 2005-08-10 2006-02-15 南海朗肽制药有限公司 一种重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂及其制备方法
US20070185014A1 (en) 2006-02-09 2007-08-09 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Methods and compositions for modulating conjunctival goblet cells
JP5553832B2 (ja) 2009-07-24 2014-07-16 泰彦 田畑 角膜内皮細胞増殖促進剤
CN101658491B (zh) 2009-09-24 2011-04-13 哈尔滨医科大学 一种治疗角膜碱烧伤的羊膜滴眼液
CN101947309B (zh) * 2010-04-12 2012-09-19 南海朗肽制药有限公司 人碱性成纤维细胞生长因子滴眼液及其制备方法
US20110300097A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Al-Qahtani Ahmed H Method And Composition For The Treatment Of Moderate To Severe Keratoconjunctivitis Sicca
CN102389392B (zh) 2011-11-02 2012-10-24 珠海亿胜生物制药有限公司 重组牛碱性成纤维细胞生长因子眼用凝胶
CN103667329A (zh) * 2012-09-17 2014-03-26 北京双鹭药业股份有限公司 一种高效制备重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法
GB2510407A (en) 2013-02-04 2014-08-06 Kalvista Pharmaceuticals Ltd Aqueous suspensions of kallikrein inhibitors for parenteral administration
US20160120693A1 (en) 2013-05-08 2016-05-05 Optometric Technology Group Eye Care Devices and Methods
CN104984326A (zh) 2015-07-14 2015-10-21 珠海亿胜生物制药有限公司 不含抑菌剂的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂及其制备方法
CN106038350A (zh) 2016-05-31 2016-10-26 南海朗肽制药有限公司 一种复合生长因子护肤凝胶及其制备方法
CN107320716B (zh) 2017-06-27 2019-03-05 珠海亿胜生物制药有限公司 碱性成纤维细胞生长因子囊泡及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1448510A (zh) * 2002-04-04 2003-10-15 北京三元基因工程有限公司 一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的高效表达
US7811786B1 (en) * 2004-05-06 2010-10-12 Daewoong Co., Ltd. Preparation method for the production of active and soluble proteins in prokaryotes and polycistronic vectors therefor
CN104606666A (zh) * 2015-02-12 2015-05-13 珠海亿胜生物制药有限公司 重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI GenBank Accession No.KJ751549.1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111315886A (zh) 2020-06-19
JP7044870B2 (ja) 2022-03-30
KR102480402B1 (ko) 2022-12-22
MY194351A (en) 2022-11-29
SG11201912799SA (en) 2020-01-30
EP3643784A4 (en) 2021-05-05
EP3643784A1 (en) 2020-04-29
US11254723B2 (en) 2022-02-22
JP2020533015A (ja) 2020-11-19
US20200157164A1 (en) 2020-05-21
WO2018232750A1 (zh) 2018-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102480402B1 (ko) 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF) 및 rh-bFGF를 포함하는 약학적 조성물
JP4635340B2 (ja) Ｈｇｆ凍結乾燥製剤
CN114671941B (zh) 神经生长因子突变体
CN102791283A (zh) 转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用
CN106459222A (zh) Mic‑1融合蛋白及其用途
KR102428209B1 (ko) 가용성 재조합 인간-염기성 섬유아세포 성장 인자 (rh-bFGF)를 제조하는 방법
DE69530404T2 (de) Analogen des keratinozytenwachstumfaktors
CN102336812B (zh) 一种具有抑制血管生成活性的多肽
US20230272023A1 (en) Ngf variants, production, compositions, and therapeutic uses
CN104861058B (zh) 一类新的具有神经保护功能的多肽
CN104371003B (zh) 预防和治疗炎症的小分子多肽及其应用
HK40031774A (en) Recombinant human-basic fibroblast growth factor (rh-bfgf) and pharmaceutical composition comprising rh-bfgf
HK40027218B (en) Method for producing soluble recombinant human-basic fibroblast growth factor (rh-bfgf)
CN103992376B (zh) 一种抑制新生血管的小肽及其应用
CN104926933B (zh) Endostatin突变体、Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物以及它们的应用
CN105017406B (zh) 一类新的具有神经保护功能的多肽
CN104004057B (zh) 一类抑制新生血管的小肽及其应用
CN104341489A (zh) 一类新的抑制新生血管的多肽及其应用
HK40027218A (en) Method for producing soluble recombinant human-basic fibroblast growth factor (rh-bfgf)
WO2019237633A1 (zh) 含有重组人溶菌酶和重组人表皮生长因子的新型人工泪液
CN111195349B (zh) 一种代谢调节融合蛋白的冻干粉制剂
WO2022204331A1 (en) Compositions comprising branched kgf-2 derived peptides and methods for use in ocular treatment
CN103992377B (zh) 一种抑制新生血管的小肽及其应用
US8933031B2 (en) Polypeptide inhibiting angiogenesis and application thereof
JP2023517459A (ja) 眼科用医薬組成物及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U12-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

U11 Full renewal or maintenance fee paid

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-4-4-U10-U11-OTH-PR1001 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

Year of fee payment: 4