KR20200025968A - 폐선암종 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 성별 특이적 바이오 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐선암종 환자의 성별에 따른 생존률 및 무병 생존률 예후 예측 진단용 마커에 관한 것으로, 폐선암종 환자에게서, 본 발명의 유전자의 변이와 환자의 성별 그리고, 생존률, 또는 본 발명의 유전자의 변이와 폐선암종의 재발율이 각각 연관성이 있으므로, 폐선암종 환자의 성별에 따른 예후를 예측하는데 본 발명의 유전자들의 변이체를 마커로서 사용할 수 있다.

Description

폐선암종 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 성별 특이적 바이오 마커{Gender-specific biomarker for the diagnosis and treatment strategy of lung adenocarcinoma}

본 발명은 폐선암종 환자에서의 성별에 의존한 예후 진단용 마커, 이를 포함하는 폐선암종 환자에서의 성별에 의존한 예후 진단용 키트, 및 폐선암종 환자에서의 성별에 의존한 예후 진단용 마커를 이용하여 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 폐암 바이오 마커에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 폐선암종 환자의 성별에 따른 생존 여부에 차이에 기반하여 폐암의 감별 진단, 치료 전략 결정 또는, 예후 판정을 위한 성별 특이적 (Gender-specific) 마커에 관한 것이다. 폐암은 미국에서 남녀 각각 전립선암과 유방암에 이어 발생률 2위를 차지하고 있으며, 현재까지 미국의 암으로 인한 사망 중 1위 에 해당한다. 2000년대 초반 국내 암환자별 사망원인 중 1위가 암으로서 그 중 위암이 23.5%로 1위이며, 폐암은 2위로 16%에 달하는 것으로 보고되었다. 폐암은 사망률이 가장 높은 암 종으로서 2014년 우리나라에서만 17,000여명이 폐암으로 사망하여 전체 암으로 인한 사망 중 28%에 달했다. 20년 사이 폐암 환자는 증가하는 양상이 나타났으며, 폐선암종에 대한 성별을 감별하고, 그에 따라 생존 여부의 예후 예측을 해낼 수 있는 바이오 마커로 폐선암종에 대한 보고는 아직 알려지지 않았다. 폐선암종의 경우 여성에게 오히려 높게 발병하는 경향을 보이며, 폐암 환자에서 생존 유무 및 성별의 구분에 따른 생존률의 구분은 환자의 치료와 생존에 많은 영향을 미친다. 그러나, 현재까지 폐암 환자의 생존률과 연관성에 대해서는 별로 알려지지 않았다. 인간 폐선암종의 검출 또는 진단에 사용되는 마커로서, 인간의 전체 게놈 중 염색체 부위 5q21.3, 7p11.2, 9q34.11, 10p11.22, 11p13, 11p15.1, 11p15.4, 12p13.31, 16p13.12, 16q22.1, 17q11.2 및 21q22.11로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염색체 부위(특허문헌 1)가 개시되어 있다. 폐선암종을 비롯한 암을 진단하기 위한 마커가 개발되고 있으나, 폐선암종 환자의 성별에 의존한 생존 가능성에 예후까지 측정할 수 있는 마커에 대해서는 아직까지 연구가 이루어지지 않은 실정이다. 본 발명자는 폐선암종을 진단하거나, 폐선암종 환자의 성별에 따른 각기 다른 치료제를 발굴하여 치료적 전략을 설계하기 위해서, 폐선암종 환자에서의 성별에 의존한 예후를 진단할 수 있는 마커의 개발의 필요성에 착안하여 폐선암종 환자에서 발견되는 유전자변이와 환자의 성별에 따른 생존률 및 사망과의 연관성에 대해서 연구하였다.

한국 등록특허 제1064561호

폐선암종 환자에 대한 적합한 치료적 전략을 적용하기 위해서는, 폐선암종 환자의 성별 및 생존률과 무병생존률의 예후를 예측할 수 있는 마커의 개발이 필요하다. 본 발명은 폐선암종 환자의 성별에 관한 예후를 진단할 수 있는 마커를 제공하는 것을 과제로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 AIFM1, AMER1, ARL13B, BEND2, DEUP1, FMR1, MCF2, MED12, NRP1, PCDH11Y, PDGFRB, PRSS55, SMG5 및 TMCO4로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 폐선암종의 성별에 따른, 예후 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 폐선암종 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 상기 폐선암종의 예후 진단용 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 결과로부터 돌연변이 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

폐선암종 환자에서, 본 발명에서 발굴한 유전자 AIFM1, AMER1, ARL13B, BEND2, DEUP1, FMR1, MCF2, MED12, NRP1, PCDH11Y, PDGFRB, PRSS55, SMG5 및 TMCO4 로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 변이와 환자의 성별 유무 및 생존률, 또는, 상기 유전자의 변이와 폐선암종의 재발율이 각각 연관성이 있으므로, 폐선암종 환자의 예후를 예측하는데 본 발명의 유전자들의 변이체를 마커로서 사용할 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또, 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1 은 14가지 유전자의 네트워크에 관한 것이다.
도 2 내지 도 15는 AIFM1, AMER1, ARL13B, BEND2, DEUP1, FMR1, MCF2, MED12, NRP1, PCDH11Y, PDGFRB, PRSS55, SMG5 및 TMCO4 각각의 유전자에 대해서, 해당 유전자에 돌연변이가 있는 폐선암종 환자(적색)와 해당 유전자에 돌연변이가 없는 폐선암종 환자(청색)의 총 생존률 또는 무병 생존률을 대비한 그래프이다.

본 명세서에 있어서, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 폐선암종 환자에서 성별에 따른 생존률 및 무병생존률 특이적 돌연변이 유전자, 및 이들 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트

본 발명의 일 측면은 AIFM1(Gene bank accession number: NM_001130846.3), AMER1(Gene bank accession number: NM_152424.3), ARL13B(Gene bank accession number: NM_001174150.1), BEND2(Gene bank accession number: NM_001184767.1), DEUP1(Gene bank accession number: NM_181645.3), FMR1(Gene bank accession number: NM_001185075.1),MCF2(Gene bank accession number: NM_001099855.1), MED12(Gene bank accession number: NM_005120.2), NRP1(Gene bank accession number: NM_001024628.2), PCDH11Y(Gene bank accession number: NM_001278619.1), PDGFRB(Gene bank accession number: NM_002609.3), PRSS55(Gene bank accession number: NM_001197020.1), SMG5(Gene bank accession number: NM_015327.2) 및 TMCO4(Gene bank accession number: NM_181719.4)로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 폐선암종의 성별 및 생존 관련 예후 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 한 구현 예에서, 하기의 유전자의 돌연변이 중에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 폐선암종의 성별 및 생존 관련 예후 진단용 키트를 제공한다:

서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내는 AIFM1를 암호화하는 유전자의 돌연변이,

서열번호 2의 아미노산 서열로 나타내는 AMER1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타내는 ARL13B를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 4의 아미노산 서열로 나타내는 BEND2를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 5의 아미노산 서열로 나타내는 DEUP1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 6의 아미노산 서열로 나타내는 FMR1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 7의 아미노산 서열로 나타내는 MCF2를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 8의 아미노산 서열로 나타내는 MED12를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 9의 아미노산 서열로 나타내는 NRP1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 10의 아미노산 서열로 나타내는 PCDH11Y를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 11의 아미노산 서열로 나타내는 PDGFRB를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 12의 아미노산 서열로 나타내는 PRSS55를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 13의 아미노산 서열로 나타내는 SMG5를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 서열번호 14의 아미노산 서열로 나타내는 TMCO4를 암호화하는 유전자의 돌연변이 본 발명에서 용어,‘진단' 은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 암의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 유전자의 돌연변이를 이용하는 경우, 개체의 시료로부터 돌연변이 여부를 확인함으로써 해당 개체의 암의 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 예후가 좋을 것인지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다. 본 발명에서 용어 ‘예후’란 암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 재발, 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 암-기인성 사망 또는, 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 폐선암종의 성별에 의존한 예후와 생존률을 예측하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 폐선암종 환자의 성별, 무병생존률 또는, 생존률을 예측하는 것이다. 본 발명에서 용어‘암'은 이상 세포의 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환 부류의 임의의 일원을 포함한다. 상기 용어는, 악성, 양성, 연조직 또는 고형 중 어느 것으로 특징지어지든, 모든 알려진 암 및 신생물 상태, 및 전이 전/후의 암을 포함하는 모든 시기 및 등급의 암을 포함한다. 본 발명에서 용어 ‘유전자’ 및 이의 변형물은 폴리펩티드 사슬 생성에 관여한 DNA 조각을 포함하며; 이는 코딩 부위 이전 및 이후의 부위, 예를 들면 프로모터 및 3'-미번역 부위를 각각 포함할 뿐 아니라, 개별적인 코딩 단편(엑손) 사이의 개입 서열(인트론)을 포함한다. 상기 유전자의 돌연변이는 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들면, 절단형(truncating) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이(또는 과오 돌연변이), 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이, 인프레임(in-frame) 돌연변이(또는 해독틀내 돌연변이), 스플라이스 돌연변이 및 스플라이스 사이트(splice_region) 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 가질 수 있다. 상기 프레임 시프트 돌연변이는 프레임 시프트 삽입(frame shift insert, FS ins) 돌연변이 및 프레임 시프트 결실 돌연변이(frame shift delete, FS del) 중 적어도 하나일 수 있다. 상기 인-프레임 돌연변이는 인-프레임 삽입(in-frame insertion, IF ins) 돌연변이 및 인-프레임 결실(in-frame delete, IF del) 돌연변이 중 적어도 하나일 수 있다. 폴리펩티드 서열에서의 돌연변이와 관련하여 용어 "X#Y"는 본 기술 분야에서 자명하게 인식되는 것으로, 여기서 "#"은 폴리펩티드의 아미노산 번호와 관련하여 돌연변이 위치를 나타내고, "X"는 야생형 아미노산 서열의 그 위치에서 발견되는 아미노산을 나타내며, "Y"는 그 위치에서의 돌연변이체 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, AIFM1 폴리펩티드와 관련하여 표기 " A318S"는 야생형 AIFM1 서열의 아미노산 번호 318에는 알라닌이 존재하고, 알라닌이 돌연변이체 AIFM1 서열에서 세린으로 대체되었음을 나타낸다.상기 유전자들의 돌연변이는 하기와 같다:

서열번호 1로 나타내는 AIFM1의 아미노산 서열에서, A318S, Y347F, F39L, G138V 및 L191M로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;고, 서열번호 2로 나타내는 AMER1의 아미노산 서열에서, G435V, G780V, E395D, R21S, E263Q, V663M, G818W, A588D, P212S, G80V 및 Y471C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이의 표기 방식은, 아미노산 종류(아미노산 위치)아미노산 종류fs*(아미노산 위치에서 하류 방향으로 정지 코돈까지의 뉴클레오티드 개수)이다(프레임 시프트 삽입 돌연변이, 프레임 시프트 결실 돌연변이 모두 동일한 표기 방식이며, 이하에서는 설명을 생략함) N466Ifs*75 중 적어도 하나인 프레임 시프트 결실(frame shift delete, FS del) 돌연변이; 넌센스 돌연변이에서 *는 해당 아미노산 위치에서의 아미노산 합성이 종료된 것을 나타낸다(이하에서는 설명을 생략함); E617* 및 G874* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이; 서열번호 3으로 나타내는 ARL13B의 아미노산 서열에서, S56L 및 E296V로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 4로 나타내는 BEND2의 아미노산 서열에서, T594I, R264L, G66V, G225A, A547E, A640P, P789L, I670K 및 Y147C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;

서열번호 5로 나타내는 DEUP1의 아미노산 서열에서, C303* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;고, G301A 및 Q94R로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 6로 나타내는 FMR1의 아미노산 서열에서, E144* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;고, H556L, E257V, E331Q, C141F, K148N 및 G536M로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 7로 나타내는 MCF2의 아미노산 서열에서, X96_splice(X 염색체 138713553 위치에서 C가 A로 치환) 인 스플라이스 돌연변이;거나, G481V, L163M, A359S, Q639H, V196E, P32N, D772Y, R304H 및 A609S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; Y521* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이; 서열번호 8로 나타내는 MED12의 아미노산 서열에서, E1421* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;이거나 H179Dfs*42 중 적어도 하나인 프레임 시프트 결실(frame shift delete, FS del) 돌연변이;고 V1119=(X 염색체 70348450 위치에서 아미노산 발린의 1119번 위치에 발린에서 C가 A로 치환) 인 스플라이스 돌연변이;고 H769N, A511S, P1826L, V1588M, R764Q, H1178R, Y979H, L807V, M523I, R815L, R356W, E227Q, R931P 및 G1448W로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;

서열번호 9로 나타내는 NRP1의 아미노산 서열에서, N544S, T629S, S656C 및 G440R로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;

서열번호 10로 나타내는 PCDH11Y의 아미노산 서열에서, H116D, D980N, I445F 및 A452D로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;

서열번호 11로 나타내는 PDGFRB의 아미노산 서열에서, V51F, H393P, D153H, Q646H, K645T 및 G734W로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 12로 나타내는 PRSS55의 아미노산 서열에서, E90* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;이거나 E75Q 및 L337V로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 13로 나타내는 SMG5의 아미노산 서열에서, M853L, K154N, Q846L, V157L 및 Y74H로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 14로 나타내는 TMCO4의 아미노산 서열에서, R178Q, G560W, Q545L 및 R135K로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;

상기 유전자의 돌연변이를 이용하여 폐선암종의 성별 및 생존률과 무병생존률의 예후를 진단하기 위한 분석 방법으로 RT-PCR, 직접 핵산 서열분석 방법, 마이크로 어레이가 사용될 수 있으며, 본 발명의 유전자의 돌연변이를 이용하여 돌연변이의 존재를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 적용할 수 있다. 한 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 엄격한 조건 하에 각 유전자의 돌연변이의 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 항-(각 유전자의 돌연변이) 항체 또는 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 핵산 프로브는 검출가능하게 표지된다. 또 다른 실시양태에서, 표지는 면역형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 아비딘/비오틴, 콜로이드성 금 입자, 착색 입자 및 자기 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 방사성면역 검정, 웨스턴블롯 검정, 면역형광 검정, 효소면역 검정, 면역침전 검정, 화학발광 검정, 면역조직화학 검정, 도트 블롯 검정, 슬롯 블롯 검정 또는 유동 세포측정 검정에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 RT-PCR에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 핵산 서열분석에 의해 결정된다.

본 발명에서 용어 ‘폴리뉴클레오티드’는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 본 연구소에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수도 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도된 용어와 같은 ‘폴리뉴클레오티드’이다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 바와 같은 용어 ‘폴리뉴클레오티드’에 포함된다. 일반적으로, 용어 ‘폴리뉴클레오티드’는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 비롯한 다양한 방법에 의해, 그리고 세포 및 유기체 내의 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다.

상기 돌연변이를 검출할 수 있는, 즉, 폐선암종의 성별 및 생존률과 무병생존률 예후 진단용 프라이머 세트는 하기와 같다:

AIFM1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

AMER1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83 및 서열번호 84로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

ARL13B의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91 및 서열번호 92로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

BEND2의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 및 서열번호 114로 나타내는 염기서열 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 세트;

DEUP1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119 및 서열번호 120로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

FMR1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135 및 서열번호 136로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

MCF2의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 137, 서열번호 138, 서열번호 139, 서열번호 140, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 153, 서열번호 154, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 157, 서열번호 158, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 161, 서열번호 162, 서열번호 163, 서열번호 164 및 서열번호 165로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

MED12의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169, 서열번호 170, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183, 서열번호 184, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191, 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197, 서열번호 198, 서열번호 199, 서열번호 200, 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203, 서열번호 204, 서열번호 205, 서열번호 206, 서열번호 207, 서열번호 208, 서열번호 209, 서열번호 210, 서열번호 211, 서열번호 212, 서열번호 213, 서열번호 214, 서열번호 215, 서열번호 216, 서열번호 217, 서열번호 218, 서열번호 219, 서열번호 220, 서열번호 221 및 서열번호 222로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

NRP1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 223, 서열번호 224, 서열번호 225, 서열번호 226, 서열번호 227, 서열번호 228, 서열번호 229 및 서열번호 230로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

PCDH11Y의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 231, 서열번호 232, 서열번호 233, 서열번호 234, 서열번호 235, 서열번호 236, 서열번호 237 및 서열번호 238로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

PDGFRB의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244, 서열번호 245, 서열번호 246, 서열번호 247, 서열번호 248, 서열번호 249, 서열번호 250, 서열번호 251, 서열번호 252, 서열번호 253, 서열번호 254, 서열번호 255, 서열번호 256, 서열번호 257, 서열번호 258, 서열번호 259, 서열번호 260, 서열번호 261, 서열번호 262 및 서열번호 263로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

PRSS55의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 264, 서열번호 265, 서열번호 266, 서열번호 267, 서열번호 268, 서열번호 269 및 서열번호 270로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

SMG5의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 271, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 276, 서열번호 277, 서열번호 278, 서열번호 279, 서열번호 280 및 서열번호 281로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

TMCO4의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 282, 서열번호 283, 서열번호 284, 서열번호 285, 서열번호 286, 서열번호 287, 서열번호 288, 서열번호 289, 서열번호 290 및 서열번호 291로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

상기와 같이 제작된 본 발명의 키트는 기존의 일반적인 유전자의 돌연변이 검색 방법에 비하여 시간과 비용이 절감되어 매우 경제적이다. SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism), PTT(Protein Truncation Test), 클로닝(cloning), 직접 염기서열 분석(direct sequencing) 등과 같은 기존의 유전자 돌연변이 검색 방법을 이용하여 한 유전자를 모두 검사하려면 평균적으로 수 일 내지 수개월이 소요된다. 또한, 차세대 염기서열분석법(next generation sequencing: NGS)을 통해서 유전자의 돌연변이를 검사할 수 있지만 비용이 높다는 문제점이 있었다. 돌연변이를 SSCP, 클로닝, 직접 염기 서열 분석, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 등의 기존 분석방법에 의해 검사하는 경우 검사 완료까지 약 한달 가량이 소요되는 반면, 본 발명의 키트를 이용하면 시료 DNA가 준비되어 있을 경우 약 10 내지 11시간 내에 결과를 얻을 수 있고, 칩 하나에 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트가 함께 집적되어 있기 때문에 기존의 방법에 비해 시간뿐만 아니라 비용까지 절감할 수 있다. 기존의 방법에 비해 매 실험 당 평균 절반 이하의 시약비가 소모되므로 연구자의 인건비까지 감안하였을 때 더욱 큰 비용의 절감 효과를 기대할 수 있게 된다.

2. 성별과 생존률 및 무병생존률 특이적 돌연변이 유전자를 이용한 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법

본 발명의 다른 측면은 폐선암종 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 청구항 1의 폐선암종의 예후 진단용 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 결과로부터 돌연변이 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기‘폐선암종의 성별에 따른 생존률과 무병생존률 예후 진단용 키트’에 대한 설명은 ‘ 1. 폐선암종 환자에서 성별에 따른 생존률 및 무병생존률 특이적 돌연변이 유전자, 및 이들 돌연변이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트 ’에 기재한 바와 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다.

본 연구소에서 사용되는 용어 ‘샘플'은 환자로부터 수득한 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구(예를 들어 말초 혈액 단핵구), 유관액, 복수, 늑막 유출물(pleural efflux), 수유관액(nipple aspirate), 림프액(예를 들어 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변(즉, 배설물), 가래, 기관지 세척액, 눈물, 미세 바늘 흡인물(예를 들어 무작위 유선 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 샘플(예를 들어 종양 조직) 예컨대 종양 생검(예를 들어 천자 생검) 또는, 림프절(예를 들어 감시 (sentinel) 림프절 생검), 조직 샘플(예를 들어 종양 조직), 예를 들면 종양의 수술적 절제, 및 이의 세포 추출물을 포함한다. 일부 구현 예에서, 샘플은 전혈 또는 이의 일부 성분, 예를 들면 혈장, 혈청 또는, 세포 펠렛이다. 다른 구현 예에서, 샘플은 당 업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 전혈 또는 이의 세포 분획물로부터 고형 종양의 순환 세포를 단리함으로써 수득된다. 다른 구현 예에서, 샘플은 예를 들어 대장암과 같은 고형 종양으로 부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 샘플이다.

특정 구현 예에서, 샘플은 폐선암 혹은 각종 암을 갖는 대상으로부터 수득한 동결 조직으로부터 제조된 종양 용해물 또는 추출물이다.

용어 ‘환자’는 통상 인간을 포함할 뿐 아니라 다른 동물, 예를 들어 다른 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포함할 수 있다.

상기 방법은 폐선암종 환자의 총 생존률 또는 무병 생존률을 예측할 수 있다.

본 발명에서 용어 ‘총 생존률(overall survival)’은 질환, 예컨대 암으로 진단되거나 그에 대해 치료된 후 한정된 시간 동안 살아 있는 환자를 기재하는 임상적 종점을 포함하며, 암의 재발 여부에 관계 없이 생존하는 가능성을 의미한다.

본 발명에서 용어 ‘무병생존률(disease-free survival, DFS)’는 특정 질환(예를 들어 암)에 대한 치료 후 질환이 재발한 환자가 생존하는 기간을 포함한다.

본 발명은 폐선암종 환자의 샘플에서 본 발명의 유전자의 돌연변이의 존재를 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체가 암에 대해 어떤 예후와 성별을 가지는지를 확인할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 예후가 좋다고 알려진 돌연변이가 존재하지 않는 대조군의 개체의 총 생존률 또는, 무병 생존률을 비교함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에서 예후가 좋다고 알려진 개체란 암이 발병한 후에 전이, 재발, 사망 등의 이력이 없는 개체를 의미한다.

암이 의심되는 개체의 샘플이란 암 또는, 종양이 이미 발생하였거나 발생할 것으로 예상되는 개체 또는 조직의 시료로써, 그 예후를 진단하고자 하는 대상 시료를 의미한다.

상기 AIFM1, ARL13B, DEUP1, MED12, PDGFRB 및 PRSS55로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 생존률이 양호하지 않은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 있어서, AIFM1, ARL13B, DEUP1, MED12, PDGFRB 및 PRSS55로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자의 경우 해당 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 생존률이 낮았다(표 1 및 표 2 참조).

실시예에 있어서, NRP1, PCDH11Y, SMG5, TMCO4의 4개 유전자군에서 선택되는 유전자들에서 돌연변이가 확인되는 경우, 폐선암종 환자의 남성 환자에서 나타날 가능성이 매우 높으므로, 유전자의 돌연변이 여부를 확인함으로써 폐선암종 환자의 성별여부 판단에 필요한 정보를 얻을 수 있다.(표 1 및 표 2 참조).

실시예에 있어서, AIFM1, AMER1, BEND2, FMR1, MCF2의 5개 유전자군에서 선택되는 유전자들에서 돌연변이가 확인되는 경우, 폐선암종 환자의 여성 환자에서 나타날 가능성이 매우 높으므로, 유전자의 돌연변이 여부를 확인함으로써 폐선암종 환자의 성별여부 판단에 필요한 정보를 얻을 수 있다.(표 1 및 표 2 참조).

상기 AIFM1, ARL13B, DEUP1 및 MED12로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 폐선암종의 생존률이 낮은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 있어서, AIFM1, ARL13B, DEUP1 및 MED12로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자의 경우 해당 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 폐선암종의 생존률이 매우 낮았다(표 1 및 표 2 참조).

상기 ARL13B, MED12, PDGFRB 및 PRSS55로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 폐선암종의 재발율이 높은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 있어서, ARL13B, MED12, PDGFRB 및 PRSS55로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자의 경우 해당 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 폐선암종의 재발율이 높았다(표 1 및 표 2 참조).

이와 같이, 본 발명의 유전자의 돌연변이인 AIFM1, AMER1, ARL13B, BEND2, DEUP1, FMR1, MCF2, MED12, NRP1, PCDH11Y, PDGFRB, PRSS55, SMG5 및 TMCO4로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자의 돌연변이를 이용하여 암, 특히 폐선암종에 대한, 성별에 따른 예후를 진단가능하다는 내용에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 자세이 없었다. 또한, 각 유전자에서 총 생존률 또는 무병 생존률이 상이할 수 있는 점에 대해서도 보고된 바 없다. 본 발명자는 상기 유전자들의 변이체를 폐선암종 환자의 성별에 관련하여서, 또한, 생존률 및 무병생존률 예후를 진단할 수 있는 진단 표지자로 사용할 수 있는 점을 최초로 규명하였다.

본 발명의 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법은 폐선암종 환자의 성별에 따라서, 생존률을 높이거나, 또는, 재발율을 낮추는데 사용될 수 있다. 본 발명의 폐선암종의 예후 진단에 대한 방법을 통해, 폐선암종 환자의 생존률 또는, 재발율을 예측할 수 있으므로, 각 환자에 적합한 치료제 발굴뿐만 아니라, 치료법 선택에 있어 정보를 제공할 수 있어, 폐선암종에 관한 치료적 전략을 효율적으로 설계할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

유전 정보 및 임상 정보의 확보

먼저, 본 발명의 유전자들(AIFM1, AMER1, ARL13B, BEND2, DEUP1, FMR1, MCF2, MED12, NRP1, PCDH11Y, PDGFRB, PRSS55, SMG5 및 TMCO4)을 폐선암종 마커로서 활용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, TCGA(The Cancer Genome Atlas)로부터 유전 정보와 임상 정보가 모두 확보되어 있는 폐선암종 환자 485명의 데이터를 입수하여 분석에 이용하였다.

하기 표 1 및 표 2 에 각 유전자의 돌연변이 개수, 돌연변이율, 돌연변이 유형, 사이토밴드, 생존 사망에 대한 Fisher의 정확한 검정. 또한, 각 유전자의 돌연변이된 위치를 표 2 에 나타낸다. 총 생존 기간(overall survival kaplan-meier estimate) 및 무병 생존 기간(disease free survival kaplan-meier estimate)은 하기 실시예 2와 같이 카플란 마이어 생존 분석법(Spss 21, cbioportal)으로 구하였다. 총 생존 기간에서는 사건을 사망으로 정하고, 무병 생존 기간에서는 사건을 폐선암종의 재발로 정하였다. 상기 유전자들 각각에서의 돌연변이 발생이 폐선암종에 의한 사망 또는 폐선암종의 재발과 상호 관련성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 카플란 마이어 생존 분석법에서 얻어진 각 군의 사건 시간(event time)을 토대로 돌연변이 발생과 총 생존 기간의 연관성, 및 돌연변이 발생과 무병 생존 기간의 연관성을 로그순위 검정(log rank test)에 의해 확인하였다. 0.05 미만의 P-value를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

유전자	성별그룹		남자(%)	여자(%)	돌연변이 수	돌연변이 수/485 (%)	돌연변이 유형			Fisher’s 의 정확한 검정	유전자 위치(사이토밴드)
	남자	여자					트렁캐팅	미스센스	인프레임
AIFM1	0	5	0	1	5	0.0103	0	5	0	0.022	Xq26.1
AMER1	1	12	0.0769	0.9231	13	0.0268	3	10	0	0.004	Xq11.2
ARL13B	2	0	1	0	2	0.0041	0	2	0	0.219	3q11.1-q11.2
BEND2	0	9	0	1	9	0.0186	0	9	0	0.004	Xp22.13
DEUP1	3	0	1	0	3	0.0062	1	2	0	0.102	11q21
CD300LG	2	0	1	0	2	0.0041	0	2	0	0.219	17q21.31
CHD9	7	3	0.7	0.3	10	0.0206	0	10	0	0.201	16q12.2
CHRM3	7	2	0.7778	0.2222	9	0.0186	1	8	0	0.09	1q43
CHST8	1	1	0.5	0.5	2	0.0041	0	2	0	1	19q13.11
DMD	11	22	0.3333	0.6667	33	0.068	8	25	0	0.147	Xp21.2-p21.1
FARP2	3	0	1	0	3	0.0062	1	2	0	0.102	2q37.3
FLNA	2	8	0.2	0.8	10	0.0206	1	9	0	0.113	Xq28
FMR1	0	6	0	1	6	0.0124	1	5	0	0.032	Xq27.3
HAUS7	0	4	0	1	4	0.0082	0	4	0	0.127	Xq28
HTATSF1	1	7	0.125	0.875	8	0.0165	1	7	0	0.073	Xq26.3
L1CAM	5	10	0.3333	0.6667	15	0.0309	2	12	1	0.309	Xq28
L3MBTL4	2	0	1	0	2	0.0041	0	2	0	0.219	18p11.31
MACF1	11	4	0.7333	0.2667	15	0.0309	3	12	0	0.062	1p34.3
MCF2	1	10	0.0909	0.9091	11	0.0227	2	9	0	0.013	Xq27.1
MED12	4	11	0.2667	0.7333	15	0.0309	3	12	0	0.124	Xq13.1

유전자	성별그룹		남자(%)	여자(%)	돌연변이 수	돌연변이 수/485 (%)	돌연변이 유형			Fisher’s 의 정확한 검정	유전자 위치(사이토밴드)
	남자	여자					트렁캐팅	미스센스	인프레임
N4BP2	1	6	0.1429	0.8571	7	0.0144	1	6	0	0.128	4p14
NRP1	4	0	1	0	4	0.0082	0	4	0	0.047	10p11.22
NSD1	4	1	0.8	0.2	5	0.0103	1	4	0	0.191	5q35.3
PCDH11Y	4	0	1	0	4	0.0082	0	4	0	0.047	Yp11.2
CFAP221	3	0	1	0	3	0.0062	1	2	0	0.102	2q14.2
PDGFRB	5	1	0.8333	0.1667	6	0.0124	1	5	0	0.103	5q32
PHTF2	1	0	1	0	1	0.0021	1	0	0	0.468	7q11.23-q21.11
PLXNB3	1	5	0.1667	0.8333	6	0.0124	2	4	0	0.222	Xq28
PRIM2	1	4	0.2	0.8	5	0.0103	1	4	0	0.378	6p11.2
PRSS55	2	0	1	0	2	0.0041	1	1	0	0.219	8p23.1
PSG3	3	1	0.75	0.25	4	0.0082	0	4	0	0.344	19q13.2
PSMB11	1	0	1	0	1	0.0021	0	1	0	0.468	14q11.2
RAB3GAP2	6	1	0.8571	0.1429	7	0.0144	1	6	0	0.055	1q41
SMG5	5	0	1	0	5	0.0103	0	5	0	0.022	1q22
SV2A	6	2	0.75	0.25	8	0.0165	1	7	0	0.155	1q21.2
TAT	0	3	0	1	3	0.0062	0	3	0	0.252	16q22.2
TKTL1	2	5	0.2857	0.7143	7	0.0144	1	6	0	0.456	Xq28
TMCO4	4	0	1	0	4	0.0082	0	4	0	0.047	1p36.13
USP14	3	0	1	0	3	0.0062	0	3	0	0.102	18p11.32
WDR19	1	5	0.1667	0.8333	6	0.0124	1	5	0	0.222	4p14
WDR90	4	3	57.14%	42.86%	7	1.44%	2	5	0	0.711	16p13.3
WWC3	0	3	0.00%	100.00%	3	0.62%	0	3	0	0.252	Xp22.2
ZMYM3	0	4	0.00%	100.00%	4	0.82%	1	3	0	0.127	Xq13.1
ZNF134	2	0	100.00%	0.00%	2	0.41%	0	2	0	0.219	19q13.43

Gene	Accession Number	Protein Change	Mutation Type	Copy #	COSMIC	Chromosome	Start Pos	End Pos	Ref	Var
AIFM1	NM_001130846.3	A318S	Missense	ShallowDel		X	129272583	129272583	C	A
		Y347F	Missense	Diploid		X	129271088	129271088	T	A
		F39L	Missense	Diploid		X	129290567	129290567	G	T
		G138V	Missense	Gain		X	129281788	129281788	C	A
		L191M	Missense	Diploid		X	129281502	129281502	G	T
AMER1	NM_152424.3	E617*	Nonsense	ShallowDel	2	X	63411318	63411318	C	A
		G874*	Nonsense	Diploid		X	63410547	63410547	C	A
		N466Ifs*75	FS del	Diploid		X	63411772	63411772	G	-
		G435V	Missense	ShallowDel	1	X	63411863	63411863	C	A
		G780V	Missense	Diploid	1	X	63410828	63410828	C	A
		E395D	Missense	Diploid	1	X	63411982	63411982	C	A
		R21S	Missense	Gain	1	X	63413106	63413106	G	T
		E263Q	Missense	ShallowDel	1	X	63412380	63412380	C	G
		V663M	Missense	Diploid	1	X	63411180	63411180	C	T
		G818W	Missense	Gain		X	63410715	63410715	C	A
		A588D	Missense	Diploid	1	X	63411404	63411404	G	T
		P212S	Missense	Diploid	1	X	63412533	63412533	G	A
		G80V	Missense	ShallowDel	1	X	63412928	63412928	C	A
		Y471C	Missense	Diploid	1	X	63411755	63411755	T	C
ARL13B	NM_001174150.1	S56L	Missense	Gain		3	93722539	93722539	C	T
		E296V	Missense	Diploid		3	93761947	93761947	A	T
BEND2	NM_001184767.1	T594I	Missense	Diploid	2	X	18192350	18192350	G	A
		R264L	Missense	Gain	3	X	18221737	18221737	C	A
		G66V	Missense	Diploid	1	X	18234682	18234682	C	A
		G225A	Missense	Diploid	1	X	18221854	18221854	C	G
		A547E	Missense	Gain		X	18194204	18194204	G	T
		A640P	Missense	Diploid	1	X	18192213	18192213	C	G
		P789L	Missense	Diploid	1	X	18183163	18183163	G	A
		I670K	Missense	Gain	1	X	18189297	18189297	A	T
		Y147C	Missense	ShallowDel	1	X	18230737	18230737	T	C
DEUP1	NM_181645.3	C303*	Nonsense	Diploid	1	11	93118683	93118683	C	A
		G301A	Missense	Gain	1	11	93118676	93118676	G	C
		Q94R	Missense	Diploid	1	11	93090193	93090193	A	G
FMR1	NM_001185075.1	E144*	Nonsense	Diploid	1	X	147011477	147011477	G	T
		H556L	Missense	Diploid	1	X	147027066	147027066	A	T
		E257V	Missense	Gain	1	X	147014083	147014083	A	T
		E331Q	Missense	Diploid	2	X	147018985	147018985	G	C
		C141F	Missense	Diploid	1	X	147011469	147011469	G	T
		K148N	Missense	Gain	1	X	147011491	147011491	G	T
		G536M	Missense	Gain	1	X	147026523	147026524	GG	AT
MCF2	NM_001099855.1	G481V	Missense	Diploid	3	X	138689898	138689898	C	A
		L163M	Missense	ShallowDel	2	X	138708867	138708867	G	T
		Y521*	Nonsense	Diploid	1	X	138687138	138687138	A	C
		A359S	Missense	Diploid	1	X	138698557	138698557	C	A
		Q639H	Missense	Diploid	1	X	138680577	138680577	C	A
		V196E	Missense	Diploid	1	X	138708452	138708452	A	T
		P32N	Missense	Diploid	1	X	138714570	138714571	GG	TT
		D772Y	Missense	Diploid	2	X	138672050	138672050	C	A
		X96_splice	Splice	Diploid		X	138713553	138713553	C	A
		R304H	Missense	Diploid	2	X	138699760	138699760	C	T
		A609S	Missense	ShallowDel	2	X	138684576	138684576	C	A

Gene	Accession Number	Protein Change	Mutation Type	Copy #	COSMIC	Chromosome	Start Pos	End Pos	Ref	Var
MED12	NM_005120.2	E1421*	Nonsense	Gain	1	X	70352234	70352234	G	T
		H179Dfs*42	FS ins	Diploid		X	70339996	70339997	-	AG
		V1119=	Splice	Diploid		X	70348450	70348450	C	A
		H769N	Missense	Diploid	1	X	70345279	70345279	C	A
		A511S	Missense	Diploid	1	X	70342990	70342990	G	T
		P1826L	Missense	Diploid	1	X	70356805	70356805	C	T
		V1588M	Missense	Diploid	2	X	70354597	70354597	G	A
		R764Q	Missense	Diploid	1	X	70345265	70345265	G	A
		H1178R	Missense	Amp	1	X	70349021	70349021	A	G
		Y979H	Missense	Diploid	1	X	70347271	70347271	T	C
		L807V	Missense	Gain	1	X	70345560	70345560	T	G
		M523I	Missense	Gain	1	X	70343028	70343028	G	T
		R815L	Missense	Gain	2	X	70345907	70345907	G	T
		R356W	Missense	Diploid	1	X	70341631	70341631	C	T
		E227Q	Missense	Gain	1	X	70340946	70340946	G	C
		R931P	Missense	Diploid	1	X	70346925	70346925	G	C
		G1448W	Missense	Gain	1	X	70352315	70352315	G	T
NRP1	NM_001024628.2	N544S	Missense	Gain	1	10	33496628	33496628	T	C
		T629S	Missense	Diploid	1	10	33486617	33486617	T	A
		S656C	Missense	Diploid	1	10	33481304	33481304	G	C
		G440R	Missense	Gain	2	10	33502610	33502610	C	G
PCDH11Y	NM_001278619.1	H116D	Missense			Y	4925273	4925273	C	G
		D980N	Missense			Y	4968620	4968620	G	A
		I445F	Missense			Y	4967015	4967015	A	T
		A452D	Missense			Y	4967037	4967037	C	A
PDGFRB	NM_002609.3	V51F	Missense	Gain	1	5	149515331	149515331	C	A
		H393P	Missense	Diploid	1	5	149511607	149511607	T	G
		D153H	Missense	Gain	1	5	149514487	149514487	C	G
		Q646H	Missense	Diploid	1	5	149503898	149503898	T	A
		K645T	Missense	Diploid	1	5	149503902	149503902	T	G
		X211_splice	Splice	ShallowDel		5	149513572	149513572	C	A
		G734W	Missense	ShallowDel	1	5	149501587	149501587	C	A
PRSS55	NM_001197020.1	E75Q	Missense	Gain	1	8	10387085	10387085	G	C
		E90*	Nonsense	Diploid	1	8	10387130	10387130	G	T
		L337V	Missense	Diploid	1	8	10396253	10396253	C	G
SMG5	NM_015327.2	M853L	Missense	Gain	1	1	156222815	156222815	T	A
		K154N	Missense	Gain	2	1	156244470	156244470	C	G
		Q846L	Missense	Gain	1	1	156222835	156222835	T	A
		V157L	Missense	Gain	1	1	156244463	156244463	C	A
		Y74H	Missense	Diploid	1	1	156247793	156247793	A	G
TMCO4	NM_181719.4	R178Q	Missense	ShallowDel	1	1	20073736	20073736	C	T
		G560W	Missense	Diploid	1	1	20009760	20009760	C	A
		Q545L	Missense	Diploid	1	1	20009803	20009804	CT	AA
		R135K	Missense	ShallowDel	1	1	20082238	20082238	C	T

확인한 결과, 본 발명의 유전자에 돌연변이가 발생한 경우, P-value가 0.05 미만으로 총 생존률 또는 무병 생존률과 연관성이 있는 것으로 확인되었다. 한편으로는 AMER1, BEND2, FMR1, MCF2, NRP1, PCDH11Y, SMG5 및 TMCO4의 경우에는 폐선암종 환자에서 성별에 따른 돌연변이의 유의미가 있었던 유전자들(Fisher의 정확한 검정)이지만, 이들 유전자에서 돌연변이가 발생한 경우, P-value는 0.05 이상으로 총 생존률 또는 무병 생존률과 연관성이 없는 것으로 확인되었다.

이와 같이, 폐선암종 환자에서 특이적으로 돌연변이가 발생한 유전자라고 하더라도, 유전자에 따라서 해당 유전자의 돌연변이와 총 생존 기간의 상관관계, 또는 해당 유전자의 돌연변이와 무병 생존 기간의 상관관계가 다른 것을 알 수 있었다. 실시예 2에는 돌연변이와 총 생존/무병 생존 기간이 매우 유의한 상관관계가 있었던 본 발명의 유전자들의 생존 분석 결과를 나타낸다.

성별에 따른 생존 특이적 마커로서의 활용 가능성 확인

상기 실시예 1에서 확보된 485명의 대상 환자를 남자 환자(227명)과 여자 환자(258명)으로 분류하고, 비교 분석을 실시하였다. 전체 폐선암종 환자 485명 중에서 남자 환자는 227명으로 46.8%를 차지하였다. 실시예 1에서 확보한 임상 정보(사건(사망 또는 재발) 여부, 관측 시간)을 토대로 카플란 마이어 생존 분석법으로 총 생존 기간 또는 무병 생존 기간을 계산하였다. 실험군은 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 있는 경우(case with alterations in query gene)로 하였고, 대조군으로는 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 없는 경우(case without alterations in query gene)로 하였다. 각 유전자에 대한 생존 분석 결과를 도 2 내지 도 15에 나타낸다. 생존 기간 중앙값(median months survival)은 해당 군의 환자들의 생존 기간을 나열하였을 때 중앙에 위치하는 값을 의미한다. 카플란 마이어 생존 분석법에 의한 생존 곡선에서의 경사도는 생존 기간에 의해 결정된다.

그 결과, 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 있는 경우에 생존 기간 중앙값의 평균이 약 34개월이고, 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 없는 경우에 생존 기간 중앙값의 평균은 약 49개월로서, 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 있는 경우에 생존 기간 중앙값이 낮은 편에 속한다는 것을 알 수 있었다.

AIFM1는 도 2의 (A)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 AIFM1 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 35% 이상이 약 49개월 이상 생존한데 반해(청색), 상기 AIFM1 유전자에 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자는 폐선암종 환자의 75% 이상이 약 12개월이 되기 전에 사망하였으므로 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 생존률이 낮은 것으로 확인되었다(적색). 따라서, AIFM1 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 AIFM1 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다. (B)에 따르면 AIFM1 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 42% 이상이 36개월 이상 재발이 없었으나(청색), 총 무병 생존률에서 돌연변이가 발생한 환자에서 유의하게 짧았다(적색). 따라서, 상기 AIFM1 유전자의 돌연변이가 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다. 따라서, AIFM1 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 AIFM1 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 또는 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

또한, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.022로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

AMER1는 도 3의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.004로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

ARL13B는 도 4의 (A)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 ARL13B 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 36% 이상이 약 49개월 이상 생존한데 반해(청색), 상기 ARL13B 유전자에 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자는 폐선암종 환자의 50% 이상이 약 10개월이 되기 전에 사망하였으므로 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 생존률이 낮은 것으로 확인되었다(적색). 따라서, ARL13B 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 ARL13B 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다. (B)에 따르면 ARL13B 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 43% 이상이 36개월 이상 재발이 없었으나(청색), ARL13B 유전자에 돌연변이가 있으면 1개월이 못되어서 폐선암종 환자의 50% 이상에서 폐선암종이 재발하는 것으로 나타났다(적색). 따라서, 상기 ARL13B 유전자의 돌연변이가 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다. 따라서, ARL13B 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 ARL13B 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 또는 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

BEND2는 도 5의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.004로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

DEUP1는 도 6의 (A)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 DEUP1 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 35% 이상이 약 49개월 이상 생존한데 반해(청색), 상기 DEUP1 유전자에 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자는 폐선암종 환자의 100% 이상이 약 10개월이 되기 전에 사망하였으므로 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 생존률이 낮은 것으로 확인되었다(적색). 따라서, DEUP1 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 DEUP1 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

FMR1는 도 7의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.032로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

MCF2는 도 8의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.013로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

MED12는 도 9의 (A)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 MED12 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 34% 이상이 약 49개월 이상 생존한데 반해(청색), 상기 MED12 유전자에 돌연변이가 발생한 폐선암종 환자는 폐선암종 환자의 73% 이상이 약 29개월이 되기 전에 사망하였으므로 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자에 비해서 생존률이 낮은 것으로 확인되었다(적색). 따라서, MED12 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 MED12 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다. (B)에 따르면 MED12 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 41% 이상이 36개월 이상 재발이 없었으나(청색), MED12 유전자에 돌연변이가 있으면 13개월이 못되어서 폐선암종 환자의 82% 이상에서 폐선암종이 재발하는 것으로 나타났다(적색). 따라서, 상기 MED12 유전자의 돌연변이가 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다. 따라서, MED12 유전자에 돌연변이가 있을 때에 폐선암종에 의한 사망이나 재발 확률이 높아지므로 상기 MED12 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 생존률 또는 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

NRP1는 도 10의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.047로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

PCDH11Y는 도 11의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.047로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

PDGFRB는 도 12의 생존률의 의미는 없게 나왔으나, (B)에 따르면 PDGFRB 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 42% 이상이 약 36개월 이상 재발이 없었으나(청색), PDGFRB 유전자에 돌연변이가 있으면 약 13개월이 못되어서 폐선암종 환자의 50% 이상에서 폐선암종이 재발하는 것으로 나타났다(적색). 따라서, 상기 PDGFRB 유전자의 돌연변이가 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

PRSS55는 도 13의 생존률의 의미는 없게 나왔으나, (B)에 따르면 PRSS55 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 폐선암종 환자의 경우 42% 이상이 약 36개월 이상 재발이 없었으나(청색), PRSS55 유전자에 돌연변이가 있으면 약 7개월이 못되어서 폐선암종 환자의 100% 이상에서 폐선암종이 재발하는 것으로 나타났다(적색). 따라서, 상기 PRSS55 유전자의 돌연변이가 폐선암종의 재발 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

SMG5는 도 14의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.022로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다.

TMCO4는 도 15의 생존률과 무병생존률의 의미는 없게 나왔으나, 표1 및 표2 와 같이 Fisher의 정확한 검정에서 성별에 따른 P-Value가 0.047로 유의하게(P-value<0.05)나타나므로 성별을 구분하는 마커로서 유의함을 알 수 있다. 상기 AMER1, BEND2, FMR1, MCF2, NRP1, PCDH11Y, SMG5 및 TMCO4는 도 3, 도 5, 도 7, 도 8, 도 10, 도 11, 도 14 과 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 총 생존률과 무병 생존률에서 돌연변이가 발생한 환자에서 유의하진 않았으나, 성별에 따른, Fisher의 정확한 검정에서 발현 빈도 수가 높음으로 인해, 성별을 예측할 수 있는 의미가 있는 것으로 나오므로, 상기 AMER1, BEND2, FMR1, MCF2, NRP1, PCDH11Y, SMG5 및 TMCO4 유전자의 돌연변이가 폐선암종 환자의 성별에 따른 예후 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

위 결과를 통해서, 폐선암종 환자 중 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 있는 경우 성별에 따른 예후 예측을 할 수 있거나, 생존률이 현저히 낮아지거나, 재발율이 증가하는 것을 알 수 있으므로, 본 발명의 유전자들에 돌연변이가 있는지 여부를 통해 폐선암종의 예후, 특히 성별에 따른 생존 여부 또는 재발 여부를 예측할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 2의 유전자의 돌연변이를 검출가능한 칩의 제작

실시예 2의 유전자의 돌연변이 검색을 위한 프라이머 세트는 https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf를 참고하여 Thermo fisher의 Ion AmpliSeq? Custom and Community Panels로 제작하였다. 돌연변이를 용이하게 검출하기 위해서, chip 종류를 선택하고 Depth를 높였다. 구체적으로 Ampliseq.com에 제작하고자 하는 패널 정보를 입력하고, 입력된 정보에 대해서 피드백을 받은 후, 관련 사항에 대해서 논의하여 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트가 탑재된 패널을 제작하였다. 표 5에 본 발명의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 나타낸다.

Fwd' primer	Rev' primer	Seq No.
GGGATCCCTCACCAGAACTAATCTCA	GAAGCTTGGAGAAGATTTCACGGG	15
CTGATCCTGCCAAACACATCTCT	CTTTCTAGTATTATTATCCTATGCCCCTTTTGG	16
TCCTGCCAAACACATCTCTGGG	TGCACACTAAATGCTGGGAGCAC	17
GGGTTCCTATAGAAGCGAAGTTTG	TCTTTTCAGGAGGATGCTTCCTAT	18
TTCCTATAGAAGCGAAGTTTGCCTTAG	GCTCCTTTACTTCTCTTCCTGTATTCC	19
GGCACTTAAGAGAAGGCTTTTTGA	TCATGATCTTTTCTGGAAGCTGAAA	20
GCTTCTTTATACACGCTGCTTTTCTAC	TGGGCAATAAGTCTTGTACAGTGC	21
GAATCCAGGACTCTTGCCCTTTG	TCATCCAGTCTGTTCTGTTGCTTTCA	22
GTACACAGTCAGTGGCAAAATCC	AAGATTCATCCAGTCTGTTCTGTTG	23
ACGCTTATCAGAGCCAAGTCATTT	AAGCTATGTCCTAGTACCAGTTCAG	24
GCTTATCAGAGCCAAGTCATTTAAGG	AGATTCATCCAGTCTGTTCTGTTGC	25
GAATCCAGGACTCTTGCCCTTTG	TCATCCAGTCTGTTCTGTTGCTTTCA	26
GTACACAGTCAGTGGCAAAATCC	AAGATTCATCCAGTCTGTTCTGTTG	27
TCTCTGTGCTTAGCTGAAGTTGATAG	GTCTGCAAGCATTTAGCTAATGTGAAT	28
CCAGTCTGGCTCGCTGCTTG	TGAGCCAGATGACAGCCTTGAGA	29
GGGAAATCTGAGAGGTCCCTGATA	GCTTATGGCAGGGAAGCCT	30
GGGTCTCTCGGACTTGAGTCT	GCCTATACTCGAGAGGCTTATGG	31
GCCATGAGCTTCCCAAGTGT	AACTTTGAGCCCTTTTTGTCCTC	32
GGGACTGTCTCGGCTCCATTC	CACCAGCAATGGGAACCTCTTTTC	33
TCGTCCTCCTCATCTGAATCTTCC	GCTACTATCACAAACATGCCTTCAAC	34
GGTCTCTGCAGTGTCGAGAG	CTACTATCACAAACATGCCTTCAACAA	35
GGGAGGACAAAAAGGGCTCAAAG	GGAGATGGCCTTGCCAGATGATG	36
AGACAATCCCTGCGGACAAG	CCAGTTAGGTCTTATCCTGGCCTA	37
CCAGGGCCTCACCTGAATC	ATATCTGTGGGAAACTGCCCAAAT	38
GGGAGGACAAAAAGGGCTCAAAG	GGAGATGGCCTTGCCAGATGATG	39
CCAGGGCCTCACCTGAATC	ATATCTGTGGGAAACTGCCCAAAT	40
GGTCACTCTGAGGAGTCAAAAGT	CCAAATGTATCCACGGCCCAA	41
GGGACTGTCTCGGCTCCATTC	CACCAGCAATGGGAACCTCTTTTC	42
GGCAGGCCTTGGTAGAATCG	GCAATGGGAACCTCTTTTCCAG	43
CAGCGATGTCAAAGGTCACCAT	CAGGAGAAGCCCGTCTTAGAGT	44
GCTCAGGGAGGTTTTGAGTGAAAG	ACCCTACTTATTCACCCCCTGAAG	45
GAGTGAAAGATGAGTCAGAGTCAGAG	CAGAGTGATGCCATGTTTGAGC	46
GGGAGGACAAAAAGGGCTCAAAG	GGAGATGGCCTTGCCAGATGATG	47
GGGATGGTAGCCCAGGTTCATA	CCTTGCCAGATGATGATGACGAG	48
GGATGGTAGCCCAGGTTCATATTG	ACAGTATGACAGACAGCATGGC	49
AGGTTCATATTGGGCCGTGGATAC	ACCAGAACCTTCTCCACCAGCTA	50
GCAGTTTCCCACAGATATTCTAAGTCAT	GTTCCTGCCTGGTGACCTAC	51
TGGCTCCAGCCACAGATGTCTTA	CTGGAAGCCTGAGGCTGCATTTC	52
CCCCTCCAAAGAAACTAGGCA	GGGAGTACCCGTGAACAAACAG	53
GGCAGTTTTCTTCAGCCTACCT	GTTATAACAGTGCCTGGAAGCCT	54
CCTTGTTCTTGGCTCCTTTTTCT	GCTGGACGTACCTCAGTTGTC	55
GTACTCCCAGAGGCTGCAGCT	TAATACCTCCCACAGCCAATAGCA	56
AGGTTCATATTGGGCCGTGGATAC	ACCAGAACCTTCTCCACCAGCTA	57
TGGGTTTACCTCTCCTGCTACT	AGAAAGGAAAATGCTAACCCCCAA	58
CTACTACCTTCTCCCCTGTTTCTG	AGAACCTTCTCCACCAGCTACT	59
CTCCTCTAGGCTACTGGCTTCA	CTCCCTGCCTTTGCCTGAGTTAC	60
CAGCGATGTCAAAGGTCACCAT	CAGGAGAAGCCCGTCTTAGAGT	61
TGGGAGATCCTCCAAAATTTGCTT	GCCCTTAGGCCCATCAGTG	62
CCAGTCTGGCTCGCTGCTTG	TGAGCCAGATGACAGCCTTGAGA	63
GGTAATTCCCCGGTGGGAAA	CCCGAGAGGTTCGTTGTAGAG	64
GGGAAATCTGAGAGGTCCCTGATA	GCTTATGGCAGGGAAGCCT	65
GGGACTGTCTCGGCTCCATTC	CACCAGCAATGGGAACCTCTTTTC	66
GGCAGGCCTTGGTAGAATCG	GCAATGGGAACCTCTTTTCCAG	67
GGCCTTGGTAGAATCGACTATGGTA	GGGAAGGCAAGTGTGAAGAGAA	68
GATCTTCATCATTGTGGAACTCAGGA	GCAGCTCTGACTCTGACTCAT	69
CCAGTCTGGCTCGCTGCTTG	TGAGCCAGATGACAGCCTTGAGA	70
GCCATGAGCTTCCCAAGTGT	AACTTTGAGCCCTTTTTGTCCTC	71
CCTGGCATAGGCTTCCCT	ACGGCTAGTGACCATCCAGAA	72
CTCCTCTAGGCTACTGGCTTCA	CTCCCTGCCTTTGCCTGAGTTAC	73
GCTGGTGGAGAAGGTTCTGGTG	GCCATGAAACTCTTTGGTGGCA	74
TTCTGGTGTTGGAGAAACTTTTGG	CCTCTATGCCCAAGCCAAAGA	75
CTTGGAAGGTCTCCTCAAAGCA	TTAGCAGTATCCGCCGTCAC	76
GCTGGTGGAGAAGGTTCTGGTG	GCCATGAAACTCTTTGGTGGCA	77
TGGCTCCAGCCACAGATGTCTTA	CTGGAAGCCTGAGGCTGCATTTC	78
GGAGAAGCCAGTTCCTTCACT	GTGGCAAGAAGGGTATCTGTACTC	79
TTCCTTCACTGACAACATCTTCAGG	GGACCAACCTCAGAGCCATC	80
GTTCTTCCTCTGTCTCCATTGCC	AGGTTATTATGACTCCACCACACCT	81
GGGAGGACAAAAAGGGCTCAAAG	GGAGATGGCCTTGCCAGATGATG	82
AGACAATCCCTGCGGACAAG	CCAGTTAGGTCTTATCCTGGCCTA	83
CCAGGGCCTCACCTGAATC	ATATCTGTGGGAAACTGCCCAAAT	84
TCTAGTTTGATATTCTGGCCTGTCC	AAGATGGTGACTTCAAACTTTCCTTGT	85
TGAATGCTAAATATTTCACTTGGGTGC	GGCCTCAGTAAATTAACAACTCCCA	86
CACTTGGGTGCTAAAATTTTAGTTGAA	AGCACTATAACAAGGCCTCAGTA	87
ATGTAGCTCCTACTGTTGGATTTTCAAA	CGTCCCTACATTTACAATGATGCTAACA	88
CACAGTGTCCTTGAAGTTACAGAATCC	TCATGGTAAATATGGCATTTGAAGACA	89
ATCCTGTTAAGGTATTTGATTTCCTCTCC	TGCCTCCTTATAATTTTCTACTAGTCCAAATTC	90
CCTGTTAAGGTATTTGATTTCCTCTCC	TCATGGAAAAACAGGTTAGGAACAA	91
TGGAGCATGAGCAAATAGAGACAC	TTGAAGACAGAAAAATATTGAAGTACTCGTTTG	92
GTGAGTCAGCAAAGAGCCACTT	AGGTGGTAGAGCACAGACATATTT	93
AACTCACTCCATGCTTCACCAG	GGGACTTTGTTTACGGATATGATTTTGTG	94
AATAACTAACACTAATTTGCATGAAGGGTGT	CAATGCTACTACAGCAGTACCTATGG	95
ACTAACACTAATTTGCATGAAGGGT	CCTGGATAGGTACAGTCTAGCAT	96
GTTATTTGCCAGACTGGATTCTCTTC	AGTCAGCAGCATGTCATGAACT	97
CCTGGGACTGTCTCACACAGAAC	AGGTAGCTTCCTCAAGAAACTGT	98
TTGCCGCCTGGAAAATTTGG	GGTAGCTTCCTCAAGAAACTGTTTATTTAATG	99
ACTAACACTAATTTGCATGAAGGGT	CCTGGATAGGTACAGTCTAGCAT	100
GTTATTTGCCAGACTGGATTCTCTTC	AGTCAGCAGCATGTCATGAACT	101
TGAGCCACCTTGTGCGACAT	CAATTCCCTTGGAAGAATGCTGAA	102
AAACATGCAGTGTGCTTTTGAAAGA	CTTTTCCCACCTGTGATTTGCATG	103
AAGAGACTGTGCCTCATGCTATC	AGCACCAAGAGCTCAATATTAGCTT	104
TACCAGAAATACAGTCCTGCCAGT	AAAGGATGAGAAGTAGAAAGAGAAGAAGTCA	105
GTGAGTCAGCAAAGAGCCACTT	AGGTGGTAGAGCACAGACATATTT	106
AACTCACTCCATGCTTCACCAG	GGGACTTTGTTTACGGATATGATTTTGTG	107
ATCTAAGTCAAAGCCATGGGTCACA	TGTCTTGGGTCTTTACCATCAGA	108
AATGTGATTCTACCTCCTTTATGAGCAG	GGTCTCAGTCGCTTCCAGC	109
TGACTCCTGCTCCAGCTCT	TGATTTCTCTGAGAAGTGATTTGCAAGTA	110
CAATTAGCCCTAAGAACCCAAATGC	AACCTCTCAAATTCTTGAGCCTAAC	111
CAGGCCATGCTTCAGATTGC	AGCCTAACAATTGAGAAAAATCAACGTTT	112
AGAAATACAGCAGAATGAAAAGAACAAAGAG	AGCATTCTGAGAGCATATCCGTATTAAG	113
ACAGCAGAATGAAAAGAACAAAGAGA	TGGACACAATGCCATCTCCTTA	114
AGACAGAACAAGCAAAGGACTAAAT	TGACTCAGTGTGACAGAAATATCCA	115
GTGAGTTACAGTCACGTGATGATCT	CCCACTAATTAACATGTTAATACAAAATAGACTTT	116
AGACAGAACAAGCAAAGGACTAAAT	TGACTCAGTGTGACAGAAATATCCA	117
GTGAGTTACAGTCACGTGATGATCT	CCCACTAATTAACATGTTAATACAAAATAGACTTT	118
ACTCTTGGTTTGGTACAGCCATTTT	TGTTTTTTGTTGTTGCTCACAGAAT	119
TTGTTCTTCTCTTTTGCACATTTTCTGATT	AACAGTTTAAAGTTAACACAACTCTACAGGTAA	120
AATCCATGATTCTTGTATGTGTAAATCTGC	GGCAATTGCCCCAGATGAATTAAA	121
CTTGTATGTGTAAATCTGCCTGCAT	AGAACCTAAGGAATTGTTAAGAAGCAG	122
TAGAGGGTGTGGGAATAAAGAACT	AAAATCATAGTGTGGCTGTCAAGGT	123
GGTGTGGGAATAAAGAACTTCCAGTAA	TCACATAAACTGGATTTGTAATCTTTGAACATG	124
TAATTTACATGGCTGGCCTAAATACAG	ACCCTCCAGTAAGAAAAAATGGAATT	125
ATGGCTGGCCTAAATACAGTTGTC	TGATACCCTCCAGTAAGAAAAAATGG	126
CAGCTTGCCTCGAGATTTCATG	CACTGCATCCTGATCCTAATAAAAGGG	127
TTGTCTAGCTTTCTTTTTGAAAGATTCTTTTAGC	GGCATTAGGTCCAACCCTTGA	128
TCTGCGTACAATTTGTATTCGGTAA	TGCAACCCCATTATTTTGTGTTTATG	129
TACCAAGGAAATTATGCCACCAAATTC	AAGTAGCCTACAAGTCTAACCAGAGAA	130
AATCCATGATTCTTGTATGTGTAAATCTGC	GGCAATTGCCCCAGATGAATTAAA	131
CTTGTATGTGTAAATCTGCCTGCAT	AGAACCTAAGGAATTGTTAAGAAGCAG	132
AATCCATGATTCTTGTATGTGTAAATCTGC	GGCAATTGCCCCAGATGAATTAAA	133
CTTGTATGTGTAAATCTGCCTGCAT	AGAACCTAAGGAATTGTTAAGAAGCAG	134
AAACGTCTCTGGAAGCTTCTGTT	TAGACCCACCAAGATGCTGAATTA	135
AACTCTCGATAGGAACTAATTCTGAAGC	GACAGCTGTTACAATTCACTTTGATTTCTTAAT	136
TCTAATCACATTGGCCTTGAACACT	CCTAGAATAAACTTAATTTGAGCTGGATCG	137
CATTGGCCTTGAACACTGAACCA	GGATCAGTTATGTCGTGTGTCTTTGA	138
ACTTCTTTAAAACATCCAAGCTATTGC	CTAGCTTGCCCCAGATCTTAGAAAA	139
GCCCATGACACTTGGTTCTACC	GGGCTTCTTGGATCTTCACAGC	140
ACACTTAACATATTGCAGCAAAAATGT	GAGGCTACAAATAGAGCACATGGT	141
AGAGTACTCACTTATTAATAGTTTGCCAGTC	CATAGTTGTATGCTCCCTTCCCATC	142
AGTACCTATCTTGTCTCCAAATCTGT	TTCAAAAAACTTCACCATCAAATCCC	143
TTCCAGGCTGCTCAAGAAAATGC	TACAAGCTACTCTGAAGGCCAAAGA	144
TCTGCCATGTTTCCAAAGAGAATGT	AACTTTGGGAAGTAGGAGATTTGAATTGA	145
GCCTTTCTCCAGTGATGCACAA	TGATTTTCTTACCAGGCTCGTCAA	146
CATCAAATTCATACTGCAGTGTTTCAGG	CCACTCACTTATTGGACAAATATGTTTTCTC	147
GCTTTCTGAGCATCTTCTTTAGACT	TTCTTGTCTTTAGCCATCATTAAGCA	148
AAATTCTGCCAAATCCAGCCTTC	CACACCTTTTAAGCATTCCACATC	149
TCATTGAGCCTACCTATTTCTAGTGCT	ATGAACACTTGGCATTTTCACAGG	150
AGGTTCATTTACATTTGCCTCCTTT	ACATTTTTGCTGCAATATGTTAAGTGT	151
CAAGGCAGGATTTCTCATGATTAAGGA	TGTCCAGACCACACTTATCTACATACT	152
GAATCGATTTCTTTTTCAAATGGTAGAAGTGAA	TCCTACCAGCTTTCTTCAACGAAC	153
AGAAGTGAAAGACTTTTGGGCATT	TTCGTACCAGAAGTGTTGCAAGGAT	154
AAAATCCTCCTGACTAAACCAAAATCCA	TGTTGGCCTTTTACTGGCTTTTATG	155
GTGGAAATTTTGAAATGCGACCAA	TGTTTAATGACTTCTGTGTTTGACTCA	156
ATTCGGGCTTTTGTATTTCAATGCAG	CTGCCCAAGAGAAATTCTGTTTCAC	157
TGAAAAATGAGGGCCCAGAAAGC	TAGGCGTTTTGGTTTCTGTGGAGAT	158
AGATTTAAAGGCTAACATGAAGAACTATAGGC	AATGGAGGGATGGCATGAAGG	159
TTCCAAAGCTATACCAGTCCCTGA	ACGTTACCTTTCTGATATTTTGGTTAATGAGA	160
TCCAAAGCTATACCAGTCCCTGACC	GCAGCCTGAAGAAGTAGACATCAAA	161
GCAAGGTGCTTCAGGCTAGCAG	CTAATGACATCACTGCTGCAGCTAA	162
AAGGTCCTGCTGAGTTGTATCC	CCTTCTTGCTCAAACATTTTGCTTCTTA	163
GGGAGGGTGGATTTGCTCTTTAAC	TTGGCAGCCTATTAGTTCATCGT	164
TGCACATGTAACGTACTTAAAGTAGAAAATGA	AGCCTTTCTTGATGGCAAAAGTCATA	165
CATCTCCGATCTCTCCTACCATCTG	CAGGTGCTGACCCTTCTCCAATTC	166
CCCTTAGGAGTTTATCTGCTGGTA	TGGGAGTCAACTTCCAACCTCAT	167
TGTGACCCTGTGTCCTCTGT	CTGCCTCTTCTCCTTTCTACCC	168
GGCTGAGTTTGCCTTCATGACC	CCCATGAAAGGGTCAACATGTCTC	169
AGGTACTGTTTCCTGTCCTTCAG	AATGCAAGAAACAAGCAGAAACAAG	170
CAAGTACCCTCCTATTCCCATATTAAGC	GCAGTACACCTGGTGTTAGGAG	171
GGGCACCATGATCCCGATAG	TGGCAGCACAGCGAATCAGA	172
GGGCAGAGATGAGAAGTTAATGGGTCT	GTAGTTCACCAGCATTAAGGAGTGA	173
CCCTAGGGTGAATGACATCGCA	CGCAGCAAGGTCTCCCACAG	174
CAGAATGGCTAGGAGTGCTTAAGG	AGCGAGTCATGAAAAGATAGGTCAC	175
GACCAGGGACAGAGTTCCGTAGA	GCATGGGAGAGAAGATGAGGTAAAG	176
TGAGTCATGGTGTCTGTCTGTTTTT	CCCACAGTGAACAATGAGAGGAT	177
GGGTTGGAGCTGTTCTGAGG	ACCTTCAAGATATCCTTGGTGATTTTCTT	178
GAGGATGTGGGTTGGGAAAGGGAA	GGGCTTACTGTGAGGTACCTAAGAA	179
GAAAGCAGCGAGATGATGCC	GTTTCAAAAGGACTAGAGCTCTCAGG	180
TAGTAAGGACATGTAGATCTAAGAGCC	CAGAACGCTTGCAGCTGACA	181
GAAGTCATGGTGAGGCATTGAAAG	ATGCCGACCAGAACGCTT	182
ATGATAGAGCCCAGTCTTTAGGAA	CCTCTACCCCATGCTTTTCACTT	183
CAGATGATGATGCTGTGGTGTCATT	TCCAGAAACTGCAGGAGGACATC	184
GTGGTGTCATTGCTATGTGAATGG	ACTCTGTTCTCACACCTTCAACTC	185
CAGCTCCTCTTTACCTCATTCTCC	CTAAACCCATGACGCCAGTCA	186
CCATTCAGCTACAACCCACTCA	GGAATGGCATCATCCTTTGGG	187
CGGCCCTTATGGTGTGACAGTG	TCTCTTGTGTCTCCCACCCTGAG	188
TCAGGCGTCCCAACTCAGATT	CATTGATGAGCACGCTCAGCAT	189
TAAGCACCTCTCCCTGCTTGTG	CAGACTGTCTGACTGGCGCTC	190
CTGAGGCCTTTTTCTATCTTCACCT	AGCCAGAAGCAAGTTCCTGAG	191
GGGTTGGAGCTGTTCTGAGG	ACCTTCAAGATATCCTTGGTGATTTTCTT	192
GAGGATGTGGGTTGGGAAAGGGAA	GGGCTTACTGTGAGGTACCTAAGAA	193
GAAAGCAGCGAGATGATGCC	GTTTCAAAAGGACTAGAGCTCTCAGG	194
CAGTTCTCTGCTCTACCTCGCTTTCA	CCAAAGGTCAGAGAGACCACCTTCA	195
TTCTCCTTTCACTTTACCTCATCTTCTCT	TCTACTGTTGGCTGGTTCAGATC	196
CCATGCCCCTGCCATACACTTG	GAGAAAGACTGTCCCTTGTAGTTTAGC	197
GCTGCTCAGGTGGGAAAAGA	CTACCCCTTACCTTCCACCTCT	198
GAATGGTATTTCCCAGAGGCTTGAA	CAAAACAGACTGGGCAGGAAAGGAA	199
GAGGATGTGGGTTGGGAAAGGGAA	GGGCTTACTGTGAGGTACCTAAGAA	200
CAGTCATGTCCCAATGTCCTGT	CAGACTATGTGGACCTTAAAGGAATATGTAC	201
GTCATGTCCCAATGTCCTGTCTCTT	GGAAGGCTTCAGGCCGGTTG	202
GAAGTCATGGTGAGGCATTGAAAG	ATGCCGACCAGAACGCTT	203
ATGATAGAGCCCAGTCTTTAGGAA	CCTCTACCCCATGCTTTTCACTT	204
CAGATGATGATGCTGTGGTGTCATT	TCCAGAAACTGCAGGAGGACATC	205
GTGGTGTCATTGCTATGTGAATGG	ACTCTGTTCTCACACCTTCAACTC	206
GTCATGTCCCAATGTCCTGTCTCTT	GGAAGGCTTCAGGCCGGTTG	207
CTCCCATAGCCTTCTCTCCATACC	GCTTAGGCCCACACCTGAG	208
TCCCATAGCCTTCTCTCCATACC	TATTCCATGAGGTCGAAGATGAACT	209
ATCCGCCCTGGAGAGGATGA	CCAAGAAACAACAACCTCCAAGCA	210
GGGAGTCTAAGAAGAATTTGAGGAAGA	GGGACTAACACCCCATTACCAAGA	211
GTGTGAGCAGTCACTCATCTCAT	ACCTGATTCTTCTCAGGCTATCTCT	212
CCAGCCAGTAGAAGGATATTCTAAGC	ACATGAACATGGCCAGCTTCT	213
AGCCAGTAGAAGGATATTCTAAGCAGA	TCCTCTCCAGGGCGGATCTTC	214
CCAGAATGGACTCAGATCATCACCA	TGTGAAGACACGACCATCAGAGC	215
ATGATGTAGAGGTGGCAATCCG	GTCTGTCCAGCATTCCATCCTATG	216
TAACGAGCCCTTCTATCCTGTGGTG	ACACAGCCTGCATGAAGAAGCAA	217
GAGCCCTTCTATCCTGTGGTG	GCATGATAGTGCCGCAGGA	218
ACACTACTAGCCTGTGCCTGT	CCTCCAAACAGATTCAAGCCTCT	219
CATCTCCGATCTCTCCTACCATCTG	CAGGTGCTGACCCTTCTCCAATTC	220
CCCTTAGGAGTTTATCTGCTGGTA	TGGGAGTCAACTTCCAACCTCAT	221
TGTGACCCTGTGTCCTCTGT	CTGCCTCTTCTCCTTTCTACCC	222
GAAAAGGGTAGGCAATTTGCAAAGG	AAATGCCATCTGTCACTTCTTAGAG	223
TGCATGGAAGAGGAAATTTAAAAACGC	ACAGTTGCTAAAAGGGAGCTCTG	224
GATGTGCTGCGTTTAAACAAAGTAT	GTGGTGAGCAAAATTGAAGGGAAAC	225
CTGTGTGGCATCTCTCCTTCTAG	TTTGCCTCTGATAGACATTTGTAAGCA	226
TGATTTGCCCTATGCTTCTCGC	CCCAATTTGACAGGCAGTCCAT	227
CATTAGAAACCCTCCCAGTAACACA	CCTTCCTGGAGATTTTATGTAAACCC	228
CAGTAACACAGCCTCGGAATCA	TTGTGACCCTAAATGATCAAATTTGCC	229
GATGATGCCCCTCACGATCTT	GCCCAGGAAATCATTTTACATTATCTGTTTC	230
ACAAACTGTCACAAGTGTTTGTTGTC	CAACAGCCGCTGGGAGAGTAT	231
GCGCTCGCATTGATCGTG	TCGTAGTTTTGAACTCCGTTTATGC	232
TTTTATGAAGTGGAGGTTGCCAT	TTTGTAAGTAGCAGGGCTAACCTCC	233
CCCCTAAGAACCTGCTGCTTAATG	TTGTTTTGATCCCTCTTTGAAGTCA	234
TGCTTCACAGATCATGAAATTCCTT	TGGAAGGTTTTCTGGGACATAGAAT	235
CAGTAATCAGTTCCTCCTGGAGAA	GGATCAGTTACAGTGATTAGTCCTACT	236
TGCTTCACAGATCATGAAATTCCTT	TGGAAGGTTTTCTGGGACATAGAAT	237
CAGTAATCAGTTCCTCCTGGAGAA	GGATCAGTTACAGTGATTAGTCCTACT	238
AACTAAAGCACTCTCTGGACTTCCC	AAGGACCTGAGGGCTGTGCATA	239
CCGTTTCCGCTCATCGGT	GGCCAGAGCTTGTCCTCAAT	240
AAAAGTATTCTCCCGTGTCTAGCC	AATGTCTCCAGCACCTTCGTT	241
GCTGAACCCGAGCAGGTC	GAAGCCCCTGTTTCCTGATGT	242
AGCAGGTCAGAACGAAGGTG	CTGTGCTCCTCAAGGACCTG	243
CATGGGTGGGTGGACAGTGC	GAGACTGTGGTAGGTTAGGATGGA	244
CATTGATCTGTAGCTGGAAGGAGA	CCTTTCCTGCTCCCCAGGTA	245
AGGGCTATTCCTCTGTGGAGGG	TGCCTTCTTTCTTACCCTGGCA	246
ATACTTGCCTCTGCTGAGCATCA	TCAGCTGCATTTCAACTTGTGACTT	247
TACTTGCCTCTGCTGAGCATC	CATGCCGAGTAACAGACCCA	248
ATCAGAATCCACCTCCCTGTCC	GATTTATTCACGGCTCCACTCCT	249
TCAAAGATACCAGAAAAGCCACGTT	CTCACGGAAATAACTGAGATCACCA	250
GGTCTGTTACTCGGCATGGAA	CCTGATTTATTCACGGCTCCACTC	251
CTGTTGTGCAAGGCCTGAGGG	AGGGTGGCCTGATGCTGATTTG	252
GCTCGGTACCTCCTTTGGTG	TTCCCCTCCTCAGAGTGTGG	253
CCCAACAGGTTGACCACGTT	GAGTCAGAATAGGCTCCTGTGG	254
CTGTTGTGCAAGGCCTGAGGG	AGGGTGGCCTGATGCTGATTTG	255
GCTCGGTACCTCCTTTGGTG	TTCCCCTCCTCAGAGTGTGG	256
CCCAACAGGTTGACCACGTT	GAGTCAGAATAGGCTCCTGTGG	257
CCCACTCTGCAGCAACAGGTT	CTGTACATAGATCTCCAGAGGGTACTT	258
CCTGGCCCCACATTACTTCTT	TCTAGCCCCCTACCCTATCC	259
TGTCCACTCGAAGTTGACCAC	GACCTAAGCCAATCTCTCTCTACCA	260
CCGGATCCATAAACAGGGCTTCC	TTGATCCACAGGCTTTCCTACTG	261
ATGTGAAGAGCATCAGCCTGTT	CAGGCTCTCCTGTGATGCTC	262
CCATGTAGTTGGAGGACTCGAT	CTCCTGTGATGCTCCTTTACCC	263
TGCTGAGCTCTGTGTAGACAAAATA	GCCATTCATGCCGACTGGATAC	264
CTGACTAAGTGTTTCCCCTTTTCCTT	GGGAGGCCCATGGTACTTAC	265
TGCTGAGCTCTGTGTAGACAAAATA	GCCATTCATGCCGACTGGATAC	266
CTGACTAAGTGTTTCCCCTTTTCCTT	GGGAGGCCCATGGTACTTAC	267
GGCTGAGGAATCTTCCATGAATG	ATTTCCATCCTTGAGCCCTGAGC	268
GATATACACCTCGTTGGTGAACTACAA	CCCTCGGTTGAAAGAATAGCCT	269
AGAGGGCAGGCCCTTCAATG	GCCACAGACAACAGTCACTGCC	270
AGGGCTCCCAAAGTTCTCTGAAAA	AGCCCCATAGAGCCACCTTGA	271
CATACTCTGTCTCCTTACCTCTCCAA	CCACCTTGAGCACCACTCTT	272
CCATGTAATGGGTGTTACCAACAA	TTGAAGCTCATCCCTTCCTCCTTTT	273
TGGGTGTTACCAACAACTGAAGC	GACTGGCCCTGGATTCTTAGTC	274
AGGGCTCCCAAAGTTCTCTGAAAA	AGCCCCATAGAGCCACCTTGA	275
CATACTCTGTCTCCTTACCTCTCCAA	CCACCTTGAGCACCACTCTT	276
CCATGTAATGGGTGTTACCAACAA	TTGAAGCTCATCCCTTCCTCCTTTT	277
TGGGTGTTACCAACAACTGAAGC	GACTGGCCCTGGATTCTTAGTC	278
TGACTCTCTTCCTCCTTCCCTAATCC	TCAAGCTTATGTTCCTGCACCCA	279
CCTACCTCCAACCATGTTCTGC	CAGTTCTTATGTCCCTGCTCCAA	280
AACCATGTTCTGCGCCCACTTTC	AGTCGGCCATACTGCATAATGAAG	281
TGCCTCCCATGGAAGTTTCTGA	CCATCAGTGGGCTCAAGGTGA	282
CTGCACTCTCCACTCTCACCCA	GCTTCTTCTGGGTCCATCTGTTTAAAG	283
ACTCTCCACTCTCACCCACA	TGTTTGAGGGTTGGTGTGGT	284
TGCCTCCCATGGAAGTTTCTGA	CCATCAGTGGGCTCAAGGTGA	285
CTGCACTCTCCACTCTCACCCA	GCTTCTTCTGGGTCCATCTGTTTAAAG	286
ACTCTCCACTCTCACCCACA	TGTTTGAGGGTTGGTGTGGT	287
GGAGGCCCCTTCAGACTGGT	CTGCCCCAAAAGGATCCAGATT	288
CAGACTGGTCCAGCCCTAC	TATGCCAAGCAGATGGATGCC	289
TGTTATCTGCAAAGTACACTGAAGTGG	TCAGTTACACTGCTAACATCACTGTTC	290
ATCTGCAAAGTACACTGAAGTGGAA	CCACCTTGCTTTTGCTGAATATTTT	291

제작된 프라이머 세트로 돌연변이 검출이 가능한지 확인하기 위해서, 실시예 2에서 확인된 유전자 돌연변이들과, 야생형 폐선암종 세포에서 유래한 시료를 대상으로 하여, 유전자 돌연변이 각각을 시료로 하고, 각 시료에 해당하는 프라이머 세트로 증폭시킨 후, 반응이 완료된 칩을 스캐너와 응용 프로그램을 이용하여 스캔하였고, 정량 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 실시예 3에서 제작한 프라이머 세트로 실시예 2의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있었다. 반면에, 대조군인 폐선암종 세포에서 유래한 시료에서는 돌연변이가 검출되지 않았다. 이와 같이 표 3의 프라이머 쌍을 이용하여 AIFM1, AMER1, ARL13B, BEND2, DEUP1, FMR1, MCF2, MED12, NRP1, PCDH11Y, PDGFRB, PRSS55, SMG5 및 TMCO4로 구성된 유전자 군에서 선택되는 유전자의 변이를 각각 검출가능 하므로, 상기 유전자들의 변이가 나타난 폐선암종 환자의 총 생존 기간, 무병 생존 기간을 예측할 수 있고, 이에 따라 치료 전략을 효율적으로 설계할 수 있다. 상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시 예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (7)

1. AIFM1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, AMER1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, ARL13B를 암호화하는 유전자의 돌연변이, BEND2를 암호화하는 유전자의 돌연변이, DEUP1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, FMR1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, MCF2를 암호화하는 유전자의 돌연변이, MED12를 암호화하는 유전자의 돌연변이, NRP1를 암호화하는 유전자의 돌연변이, PCDH11Y를 암호화하는 유전자의 돌연변이, PDGFRB를 암호화하는 유전자의 돌연변이, PRSS55를 암호화하는 유전자의 돌연변이, SMG5를 암호화하는 유전자의 돌연변이, TMCO4를 암호화하는 유전자의 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 폐선암종의 성별에 의존한 생존률 및 무병생존률과 예후 예측 진단용 키트.
2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1로 나타내는 AIFM1의 아미노산 서열에서, A318S, Y347F, F39L, G138V 및 L191M로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;고, 서열번호 2로 나타내는 AMER1의 아미노산 서열에서, G435V, G780V, E395D, R21S, E263Q, V663M, G818W, A588D, P212S, G80V 및 Y471C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이의 표기 방식은, 아미노산 종류(아미노산 위치)아미노산 종류fs*(아미노산 위치에서 하류 방향으로 정지 코돈까지의 뉴클레오티드 개수)이다(프레임 시프트 삽입 돌연변이, 프레임 시프트 결실 돌연변이 모두 동일한 표기 방식이며, 이하에서는 설명을 생략함) N466Ifs*75 중 적어도 하나인 프레임 시프트 결실(frame shift delete, FS del) 돌연변이; 넌센스 돌연변이에서 *는 해당 아미노산 위치에서의 아미노산 합성이 종료된 것을 나타낸다(이하에서는 설명을 생략함); E617* 및 G874* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이; 서열번호 3으로 나타내는 ARL13B의 아미노산 서열에서, S56L 및 E296V로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 4로 나타내는 BEND2의 아미노산 서열에서, T594I, R264L, G66V, G225A, A547E, A640P, P789L, I670K 및 Y147C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;
   서열번호 5로 나타내는 DEUP1의 아미노산 서열에서, C303* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;고, G301A 및 Q94R로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 6로 나타내는 FMR1의 아미노산 서열에서, E144* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;고, H556L, E257V, E331Q, C141F, K148N 및 G536M로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 7로 나타내는 MCF2의 아미노산 서열에서, X96_splice(X 염색체 138713553 위치에서 C가 A로 치환) 인 스플라이스 돌연변이;거나, G481V, L163M, A359S, Q639H, V196E, P32N, D772Y, R304H 및 A609S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; Y521* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이; 서열번호 8로 나타내는 MED12의 아미노산 서열에서, E1421* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;이거나 H179Dfs*42 중 적어도 하나인 프레임 시프트 결실(frame shift delete, FS del) 돌연변이;고 V1119=(X 염색체 70348450 위치에서 아미노산 발린의 1119번 위치에 발린에서 C가 A로 치환) 인 스플라이스 돌연변이;고 H769N, A511S, P1826L, V1588M, R764Q, H1178R, Y979H, L807V, M523I, R815L, R356W, E227Q, R931P 및 G1448W로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;
   서열번호 9로 나타내는 NRP1의 아미노산 서열에서, N544S, T629S, S656C 및 G440R로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;
   서열번호 10로 나타내는 PCDH11Y의 아미노산 서열에서, H116D, D980N, I445F 및 A452D로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;
   서열번호 11로 나타내는 PDGFRB의 아미노산 서열에서, V51F, H393P, D153H, Q646H, K645T 및 G734W로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 12로 나타내는 PRSS55의 아미노산 서열에서, E90* 중 적어도 하나인 넌센스 돌연변이;이거나 E75Q 및 L337V로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 13로 나타내는 SMG5의 아미노산 서열에서, M853L, K154N, Q846L, V157L 및 Y74H로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이; 서열번호 14로 나타내는 TMCO4의 아미노산 서열에서, R178Q, G560W, Q545L 및 R135K로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이;로부터 선택되는 적어도 하나의 폐선암종의 예후 진단을 위한 프라이머 세트를 포함하는 폐선암종의 성별에 의존한 생존률 및 무병생존률과 예후 예측 진단용 키트.
3. 청구항 1에 있어서, AIFM1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   AMER1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83 및 서열번호 84로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   ARL13B의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91 및 서열번호 92로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   BEND2의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 및 서열번호 114로 나타내는 염기서열 쌍 중 적어도 하나의 프라이머 세트;
   DEUP1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119 및 서열번호 120로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   FMR1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135 및 서열번호 136로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   MCF2의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 137, 서열번호 138, 서열번호 139, 서열번호 140, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 150, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 153, 서열번호 154, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 157, 서열번호 158, 서열번호 159, 서열번호 160, 서열번호 161, 서열번호 162, 서열번호 163, 서열번호 164 및 서열번호 165로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   MED12의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169, 서열번호 170, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183, 서열번호 184, 서열번호 185, 서열번호 186, 서열번호 187, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191, 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197, 서열번호 198, 서열번호 199, 서열번호 200, 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203, 서열번호 204, 서열번호 205, 서열번호 206, 서열번호 207, 서열번호 208, 서열번호 209, 서열번호 210, 서열번호 211, 서열번호 212, 서열번호 213, 서열번호 214, 서열번호 215, 서열번호 216, 서열번호 217, 서열번호 218, 서열번호 219, 서열번호 220, 서열번호 221 및 서열번호 222로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   NRP1의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 223, 서열번호 224, 서열번호 225, 서열번호 226, 서열번호 227, 서열번호 228, 서열번호 229 및 서열번호 230로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   PCDH11Y의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 231, 서열번호 232, 서열번호 233, 서열번호 234, 서열번호 235, 서열번호 236, 서열번호 237 및 서열번호 238로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   PDGFRB의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 239, 서열번호 240, 서열번호 241, 서열번호 242, 서열번호 243, 서열번호 244, 서열번호 245, 서열번호 246, 서열번호 247, 서열번호 248, 서열번호 249, 서열번호 250, 서열번호 251, 서열번호 252, 서열번호 253, 서열번호 254, 서열번호 255, 서열번호 256, 서열번호 257, 서열번호 258, 서열번호 259, 서열번호 260, 서열번호 261, 서열번호 262 및 서열번호 263로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   PRSS55의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 264, 서열번호 265, 서열번호 266, 서열번호 267, 서열번호 268, 서열번호 269 및 서열번호 270로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   SMG5의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 271, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 276, 서열번호 277, 서열번호 278, 서열번호 279, 서열번호 280 및 서열번호 281로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;
   TMCO4의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 282, 서열번호 283, 서열번호 284, 서열번호 285, 서열번호 286, 서열번호 287, 서열번호 288, 서열번호 289, 서열번호 290 및 서열번호 291로 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;로부터 선택되는 적어도 하나의 폐선암종의 예후 진단을 위한 프라이머 세트를 포함하는 폐선암종의 성별에 의존한 생존률 및 무병생존률과 예후 예측 진단용 키트.
4. 폐선암종 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 청구항 1의 폐선암종의 성별에 의존한 생존률 및 무병생존률과 예후 예측 진단용 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 결과로부터 돌연변이 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 폐선암종의 성별에 따른 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 방법은 폐선암종 환자의 성별 판별 및 총 생존률 또는 무병 생존률을 예측하는 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 AIFM1, ARL13B, DEUP1 및 MED12로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 생존률 및 무병생존률이 양호하지 않은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
7. 청구항 5에 있어서, 상기 ARL13B, MED12, PDGFRB 및 PRSS55로 구성된 유전자 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 돌연변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 폐선암종의 재발율이 높은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는 폐선암종의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.

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