KR20200026261A - 엑토인-생산 효모 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엑토인의 바이오-생산 분야에 관한 것이다. 이의 고도로 효율적인 합성 및 분비를 가능하게 하는 엑토인 제조 방법에 대한 요구가 당분야에 존재한다. 본 발명에서 제안하는 해법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 많은 변형을 포함하는 유전자 변형 효모의 사용이다.

Description

엑토인-생산 효모
본 발명은 엑토인의 바이오-생산 분야에 관한 것이다.
엑토인 (1, 4, 5, 6-테트라히드로-2-메틸-4-피리미딘카르복실산)은 자연계에서 호염성 유기체에 의해 자연적으로 생산되는 복소환 아미노산이다. 실제로, 염분이 있는 환경에서 살아남기 위해서, 이들 유기체는 삼투 균형추로서 작용하는 호환성 용질로서 엑토인을 생산한다.
엑토인은 실제로 또한 외부 환경, 예컨대 UV 방사선, 가열, 냉동 또는 화학제로부터의 수많은 공격으로 초래되는 변형뿐만 아니라, 건조로 인한 변성으로부터 핵산, 단백질, 세포막을 비롯하여 전체 세포를 보호할 수 있다 (예를 들어 [Lentzen G et al. Appl Microbiol Biot. 2006;72:623-34], 및 [Graf R et al. Clin Dermatol. 2008;26:326-33] 참조). 그리하여 피부 관리용 화장품에 사용된다.
게다가 엑토인은 단백질 안정제, 화장품 첨가제, PCR 증강제 및 미생물용 건조 보호제로서 흥미로운 것으로 확인되었다.
이들 유리한 성질 덕분에, 엑토인은 특히 호염성 박테리아 예컨대 할로모나스 엘롱가타 (Halomonas elongata)를 사용한 박테리아 과정을 통해서 점점 더 생산되고 있다. 그러나, 이들 방법은 높은 염 농도를 필요로 하여서 과정을 복잡하게 하고 장비의 중요한 부식을 고려하여 관련된 비용의 증가를 초래한다.
뿐만 아니라, 박테리아 및 효모의 생합성 경로를 통한 엑토인과 같은 필수 아미노산의 생산은 NADPH의 형태로 상당량의 환원력을 요구한다. 그러나, 이들 미생물, 특히 효모에서 글루코스의 주요 대사 경로는 NADH만을 생산하는 발효가 후속되는 해당작용이다. 그러므로, 미생물 내에서 허용가능한 NADPH/NADH 균형의 유지는, 복잡할지라도, 생존 재조합 미생물을 유지시키면서 엑토인의 바이오-생산을 최적화하는데 필수적이다.
따라서, 고도로 효율적인 이의 생산 및 분비를 가능하게 하는 추가의 엑토인 제조 방법에 대한 요구가 여전히 당분야에 존재한다.
따라서 본 발명은 엑토인-생산 재조합 효모에 관한 것으로서, 이의 게놈에서,
(A) (i) 아스파토키나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
(ii) 아스파테이트 키나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(B) 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및/또는 조효소로서 NAD 및 NADP 둘 모두를 사용할 수 있는 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(C) 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(D) (i) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(ii) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(iii) 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(E) 엑토인 신타제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(F) (i) 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 결실 및/또는 단절되었고/되었거나,
(ii) 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 핵산은 독립적으로
- 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
- 약 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
- 탈안정화된 형태이다.
내포된 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 재조합 효모는 증가된 엑토인 생산성을 갖는다.
상기 유리한 성질은 이하 본 명세서에 기술된 추가적인 변형을 갖는 효모를 또한 재조합시켜서 더욱 증가시킬 수 있다.
엑토인-생산 재조합 효모는 결과적으로 유리하게 이하 본 명세서에 기술된 바와 같은 엑토인의 제조를 위한 방법에서 사용할 수 있거나 또는 엑토인의 제조에 서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 엑토인의 제조를 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a) 본 발명의 재조합 효모를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양 배지로부터 엑토인을 회수하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 배양 배지는 적어도 탄소원, 바람직하게 글루코스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원을 포함한다.
본 발명은 또한 엑토인의 제조를 위한 본 발명에 따른 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.
본 발명자는 부모 미생물과 비교하여, 특히 부모 효모와 비교하여, 증가된 엑토인 생산 능력을 갖는, 유전자 변형 미생물, 특히, 유전자 변형 효모를 고려한다.
이들 유전자 변형 효모를 포함한, 이들 유전자 변형 미생물이 본 명세서 전반에서 기술된다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 효모를 의미한다. 미생물은 "억셉터" 미생물에 통합시키려는 유전자 엘리먼트를 제공하여 이러한 외래 유전자 엘리먼트가 발현되어지거나 또는 유전자 구성체 또는 단백질 발현을 위한 도구로서 사용된다면 "도너"일 수 있다. 본 발명의 미생물은 엑토인의 생합성을 위한 유전자를 발현하는 효모 중에서 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전자 변형 미생물" 또는 "재조합 효모" 또는 "유전자 변형 효모"는 유전자 변형되거나 또는 유전자 조작된 효모를 의미한다. 이들 용어의 일반적인 의미에 따라서, 본 발명의 미생물이 자연계에 존재하지 않고 자연계에 존재하는 동등한 미생물 유래의 유전자 엘리먼트의 도입 또는 결실 또는 변형을 통해서 변형된 것을 의미한다. 직접 돌연변이유발법 및 특별한 선택압 하의 진화를 조합하여 새로운 물질대사 경로의 개발 및 진화를 강제하여 변형될 수도 있다 (예를 들어, WO　2004/076659 참조).
미생물은 숙주 미생물에서 그들 발현을 허용하는 모든 엘리먼트를 갖는 미생물에 외생성 유전자들이 도입된다면 그 외생성 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 미생물은 내생성 유전자의 발현 수준을 조절하도록 변형될 수 있다. 외생성 DNA를 갖는 효모와 같은 미생물의 변형 또는 "형질전환"은 당업자에게는 통상의 작업이다. 특히, 본 발명에 따른 미생물의 유전자 변형, 보다 특히 본 명세서에 정의된 유전자 변형(들)은 DiCarlo 등 (Nucl. Acids Res., vol. 41, No. 7, 2013: 4336-4343)에 기술된 바와 같은 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
용어 "내생성 유전자"는 유전자가 임의의 유전자 변형 전 미생물, 야생형 균주에 존재하였음을 의미한다. 내생성 유전자은 내생성 조절 엘리먼트에 추가로, 또는 그를 대체하여 이종성 서열을 도입시키거나, 또는 염색체로 유전자의 하나 이상의 보충 카피 또는 플라스미드를 도입시켜 과발현될 수 있다. 내생성 유전자는 또한 그들 발현 및/또는 활성을 조절하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 유전자 생성물을 변형시키기 위해 코딩 서열에 도입될 수 있거나 또는 이종성 서열은 내생성 조절 엘리먼트에 추가하여 또는 그를 대체하여 도입될 수 있다. 내생성 유전자의 조절은 유전자 생성물의 활성의 증강 및/또는 상향조절, 또는 대안적으로 내생성 유전자 생성물의 활성의 약화 및/또는 하향조절을 일으킬 수 있다. 내생성 유전자의 발현을 증강시키는 다른 방식은 염색체에 유전자의 하나 이상의 보충 카피 또는 플라스미드를 도입시키는 것이다.
용어 "외생성 유전자"는 유전자가 당업자에게 충분히 공지된 방법을 통해서, 미생물에 도입된 한편, 그 유전자가 야생형 미생물에서 천연 발생되지 않는 것을 의미한다. 미생물은 이들 유전자가 숙주 미생물에서 그들 발현을 허용하는 모든 엘리먼트를 갖는 미생물에 도입되면 외생성 유전자를 발현할 수 있다. 외생성 DNA로 미생물의 형질전환은 당업자에게 통상의 작업이다. 외생성 유전자는 숙주 염색체에 통합될 수 있거나, 또는 플라스미드 또는 벡터로부터 염색체 외에서 발현될 수 있다. 세포 내에서 그들의 복제 기원 및 그들의 카피수가 상이한 다양한 플라스미드는 모두 당분야에 공지되어 있다. 외생성 유전자의 서열은 숙주 미생물에서 이의 발현을 위해 적합화될 수 있다. 실제로, 당업자는 코돈 용법 편향성의 개념 및 추론되는 단백질의 변형없이 특정한 코돈 용법 편향성에 대해 핵산 서열을 적합화시키는 방법을 알고 있다.
용어 "이종성 유전자"는 유전자가 이를 발현하는 수령체 미생물과 상이한 미생물 종으로부터 유래된다는 것을 의미한다. 이것은 유전자가 미생물에서 천연 발생되지 않는 것임을 의미한다.
본 출원에서, 모든 유전자는 그들의 공통 명칭 및 그들의 뉴클레오티드 서열, 및 발생하는 경우에, 그들 아미노산 서열을 참조하여 언급된다. 기지 유전자의 수탁 번호로 제공되는 기준을 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 균등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 통상의 작업은 유리하게 다른 미생물로부터 유래된 유전자와의 서열 정렬을 수행하고, 다른 유기체 내 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 축퇴성 프로브를 디자인하여 결정될 수 있는 공통 서열을 사용해 수행된다.
당업자는 내생성 유전자의 발현을 조절, 특히 상향조절 또는 하향조절하기 위한 상이한 수단을 알고있다. 예를 들어, 내생성 유전자의 발현을 증강시키거나, 또는 내생성 유전자를 과발현시키는 방식은 염색체에 유전자의 하나 이상의 보충 카피 또는 플라스미드를 도입시키는 것이다.
다른 방식은 유전자의 내생성 프로모터를 보다 강력 프로모터로 대체시키는 것이다. 이들 프로모터는 상동성일 수 있거나 또는 이종성일 수 있다. 본 발명에서 특히 흥미로운 프로모터는 본 명세서의 다른 곳에 보다 상세하게 기술된다.
핵산 발현 구성체는 5' 및/또는 3' 인식 서열 및/또는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
용어 "과발현"은 유전자 또는 효소의 발현이 비변형 미생물과 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 효소의 발현 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시켜 수득된다. 유전자의 발현 증가는 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 과발현시키고자 하는 핵산 상류에 강력 프로모터의 제공 또는 프로모터, 특히 강력 프로모터와 종결인자 사이에 상기 핵산의 다수의 카피의 도입을 특히 언급할 수 있다.
용어 "과소발현"은 유전자 또는 효소의 발현이 비변형 미생물과 비교하여 감소되는 것을 의미한다. 효소의 발현 감소는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시켜 수득된다. 유전자의 발현 감소는 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 과소발현시키고자 하는 핵산 상류에 약 프로모터의 제공을 특히 언급할 수 있다. 부모 효소에 비해서 덜 활성적인 상기 효소의 변이체 또는 부모 효소에 비해 세포에서 보다 신속하게 분해되는 상기 효소의 변이체를 코딩하는 핵산의 제공을 또한 언급할 수 있다. 상기 부모 효소에 비해 보다 신속하게 분해되는 부모 효소의 변이체는 degron-태그화 효소를 포괄한다. 또한 관심 유전자의 전사 활성인자의 발현 감소를 언급할 수 있다.
용어 "유도성 프로모터"는 다음의 조건 하에서 그 활성이 유도, 즉 증가되는 프로모터를 칭하는데 사용된다:
- 하나 이상의 특정한 대사산물(들)의 존재 하. 배지 중 대사산물 농도가 높아질수록, 프로모터 활성은 더 강해진다. 또는
- 하나 이상의 대사산물(들)의 저농도 존재 하, 또는 부재 하. 이들 대사산물은 그 증가된 존재가 프로모터의 활성을 유도하는 것과는 상이하다. 배지 중 대사산물 농도가 낮아질수록, 프로모터 활성은 더 강해진다.
용어 "억제성 프로모터"는 다음의 조건 하에서 그 활성이 억제, 즉 감소되는 프로모터를 칭하는데 사용된다:
- 하나 이상의 특정한 대사산물(들)의 존재 하. 배지 중 대사산물 농도가 높아질수록, 프로모터 활성은 약해진다. 또는
- 하나 이상의 대사산물(들)의 저농도 존재 하 또는 부재 하. 이들 대사산물은 그의 증가된 존재가 프로모터의 활성을 억제하는 것과는 상이하다. 배지 중 대사산물 농도가 낮아질 수록, 프로모터 활성은 약해진다.
본 명세서에서 사용되는, "degron-태그화" 효소는 (i) 유비퀴틴-비의존적 분해 또는 (ii) 유비퀴틴-의존적 분해일 수 있는, 분해를 상기 효소에 대해 야기시키게 되는 파괴 신호로서 작용하는 첨가된 단백질-분해 신호 아미노산 서열을 포함하는 효소를 의미한다. 당분야에서 "degron"이라고도 하는 상기 첨가된 단백질-분해 신호는 파괴 신호로서 작용하는 아미노산 서열을 포괄하고, 상기 아미노산 서열은 표적화 단백질 분해를 야기시키는 전달가능한 분해 신호로 이루어진다. Degron은 충분히 공지된 N-말단 규칙에 따라서 표적 단백질 분해를 야기시키는 전달가능한 N-말단 아미노산인 "N-degron"을 포괄한다 (Bachmair et al., 1986, Science, Vol. 234 (4773): 179-186). N-degron의 불안정한 속성은 아세틸화 또는 아르기닐화 변형되는 경향이 있어서 궁극적으로 유비퀴틴화 및 분해를 초래하는, 이의 제1 아미노산에 의한 것이다. 일반적으로, degron은 표적화 단백질 분해를 보장하도록 적어도 2개 성분: (i) 표적 분해 인식 태그, 예컨대 폴리-유비퀴틴 태그 및(ii) 분해 인식 태그에 밀접해 있는 비구조화된 아미노산 서열을 필요로 한다. 단백질 degron-태그화, 특히 본 명세서에서 효소의 degron-태그화를 위해서, 당업자는 Yu 등 (2015, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204), Cho 등 (2010, Genes & Development, Vol. 24: 438-442), 또는 Fortmann 등 (2015, J Mol Biol, Vol. 427 (17): 2748-2756), Ravid 등 (2008, Nat Rev Mol Cell Biol, Vol. 9(9): 679-690) 및 Hochstrasser (1996, Annu Rev Genet, Vol. 30: 405-439)를 참조할 수 있다.
효소의 "활성"은 용어 "기능"과 상호교환적으로 사용되고, 본 발명의 문맥에서, 바람직한 반응을 촉매하는 효소의 능력을 표시한다.
용어 효소의 "감소된 활성" 또는 "약화된 활성"은 아미노산 서열의 돌연변이로 수득된 단백질의 감소된 특이적 촉매 활성 및/또는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 또는 상응하는 동족 유전자의 결실 또는 또한 단백질의 degron-태그화로 수득된 세포 내 단백질의 감소된 농도를 의미한다.
용어 효소의 "증강된 활성"은 예를 들어 효소를 코딩하는 유전자의 과발현에 의해 수득되는, 효소의 증가된 특이적 촉매 활성, 및/또는 세포 내 효소의 증가된 분량/이용가능성을 의미한다.
용어 "인코딩" 또는 "코딩"은 전사 및 번역 기전을 통해서, 폴리뉴클레오티드가 아미노산 서열을 생성시키는 과정을 의미한다.
본 발명에서 고려되는 효소(들)를 코딩하는 유전자(들)는 외생성일 수 있거나 또는 내생성일 수 있다.
유전자의 "약화"는 유전자가 비변형 미생물에 비해서 더 낮은 속도로 발현되는 것을 의미한다. 약화는 당업자에게 공지된 수단 및 방법으로 획득될 수 있고 상동성 재조합으로 수득된 유전자 결실, 유전자로 외부 엘리먼트의 삽입에 의한 유전자 약화 또는 약 프로모터 하에서 유전자 발현을 함유한다. 당업자는 상이한 강도를 나타내는 다양한 프로모터 및 어떤 프로모터가 약한 유전자 발현에 사용되는 것인가를 알고 있다.
본 발명에서 제공되는 방법은 바람직하게 염색체 상의 특이적 위치로 이종성 뉴클레오티드 서열의 안정한 도입 또는 유전자 변형 미생물 세포에서 하나 이상의 표적 유전자의 기능적 파괴를 위해 하나 이상의 염색체 통합 구성체의 사용이 요구된다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자의 파괴는 관련 기능성 단백질의 발현을 방지한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자의 파괴 결과로 파괴된 유전자로부터 비기능성 단백질의 발현이 야기된다.
본 발명의 실시에서 가변적일 수 있는 염색체 통합 구성체의 매개변수는 제한없이 상동성 서열의 길이; 상동성 서열의 뉴클레오티드 서열; 통합 서열의 길이; 통합 서열의 뉴클레오티드 서열; 및 표적 유전자좌의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 상동성 서열의 길이에 대한 유효 범위는 20 내지 5,000개 염기쌍, 우선적으로 50 내지 100개 염기쌍이다. 특정한 실시형태에서, 각각의 상동성 서열의 길이는 약 50개 염기쌍이다. 유전자 표적화에 필요한 상동성 길이에 관한 추가 정보는 [D. Burke et al., Methods in Yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)]를 참조한다.
일부 실시형태에서, (a) 상기 언급된 DNA 구성체(들)를 삽입시키고자 하는 파괴된 유전자(들)는 유리하게 형질전환된 미생물 세포의 선별에 유용한 하나 이상의 선별가능한 마커를 포함한다. 바람직하게, 상기 선별가능한 마커(들)는 본 발명에 따른 DNA 구성체(들)에 포함된다.
일부 실시형태에서, 선별가능한 마커는 항생제 내성 마커이다. 항생제 내성 마커의 예시적인 예는 제한없이 NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<R>, 및 SH BLE 유전자 생성물을 포함한다. 에스. 노르세이 (S. noursei) 유래 NAT 1 유전자 생성물은 노르세오트리신에 대한 내성을 부여하고; 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 AURl-C 유전자 생성물은 아우에로바시딘 A (AbA)에 대한 내성을 부여하고; 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia) 유래 HPH 유전자 생성물은 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하고; 이. 콜라이 (E. coli)의 DSDA 유전자 생성물은 세포가 단독 질소원으로서 D-세린 존재 플레이트 상에서 성장가능하게 하고; Tn903 트랜스포존의 KAN<R> 유전자는 G418에 대한 내성을 부여하고; 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 (Streptoalloteichus hindustanus)의 SH BLE 유전자 생성물은 제오신 (브레오마이신)에 대한 내성을 부여한다.
일부 실시형태에서, 항생제 내성 마커는 본 발명의 유전자 변형 미생물 세포가 단리된 후에 결실된다. 당업자는 특별한 유전자 상황에서 적합한 마커를 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 선별가능한 마커는 유전자 변형 미생물 세포에서 영양요구성 (예를 들어, 영양분의 영양요구성)을 구제한다. 이러한 실시형태에서, 부모 미생물 세포는 아미노산 또는 뉴클레오티드 생합성 경로에서 기능하는 하나 이상의 유전자 생성물, 예컨대, 예를 들어, 효모에서 HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2, 및 URA3 유전자 생성물에 기능적 파괴를 포함하여서, 부모 미생물 세포가 하나 이상의 영양분 보충없이 배지에서 성장할 수 없게 한다 (영양요구성 표현형). 영양요구성 표현형은 파괴된 유전자 생성물의 기능적 카피 (NB:　유전자의 기능적 카피는 가까운 종, 예컨대 클루베로마이세스 (Kluveromyces), 칸디다 (Candida) 등으로부터 기원할 수 있음)를 코딩하는 염색체 통합으로 형질전환시켜 구제할 수 있고, 생성된 유전자 변형 미생물 세포는 부모 미생물 세포의 영양요구성 표현형의 상실을 기반으로 선별될 수 있다.
프로모터 서열, 코딩 서열 (예를 들어, 효소 코딩 서열), 또는 종결인자 서열을 포함하는 각각의 핵산 서열의 경우, 기준 서열은 본 명세서에 기술되어 있다. 본 설명은 또한 기준 핵산 서열과, 특별한 백분율의 핵산 동일성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
각각 또는 관심 아미노산 서열의 경우, 기준 서열이 본 명세서에 기술되어 있다. 본 설명은 또한 기준 아미노산 서열과, 특별한 백분율의 아미노산 동일성을 갖는, 아미노산 서열 (예를 들어, 효소 아미노산 서열)을 포괄한다.
분명한 이유로, 모든 본 설명에서, 각각 고려되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성에 부응하는 특별한 핵산 서열 또는 특별한 아미노산 서열은 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 단백질 (또는 효소)의 수득을 더욱 야기시켜야 한다. 본 명세서에서 사용시, 2개 핵산 서열 또는 2개 아미노산 서열 간 "동일성의 백분율"은 비교창을 통해 최적으로 정렬된 양쪽 서열을 비교하여 결정된다.
따라서 비교창에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 비율은 양쪽 서열 간 최적 정렬을 수득하기 위해서 기준 서열 (첨가 또는 이들 결실을 포함하지 않음)과 비교시 첨가 또는 결실 (예를 들어, "갭")을 포함할 수 있다.
동일성 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 동일한 아미노산 잔기가 양쪽 비교 서열에 대해 언급될 수 있는 위치의 개수를 결정하고 나서, 양쪽 핵산 염기 또는 양쪽 아미노산 잔기 간에 동일성이 관찰될 수 있는 위치의 개수를 비교창의 모든 위치 개수로 나눈 후에, 2개 서열 간 뉴클레오티드 동일성의 백분율 또는 2개 서열 간 아미노산 동일성의 백분율을 수득하기 위해 그 결과에 100을 곱하여 계산된다.
서열 최적 정렬의 비교는 기지의 알고리즘을 사용하여 컴퓨터를 통해 수행될 수 있다.
가장 바람직하게, 서열 동일성 백분율은 CLUSTAL W 소프트웨어 (버전 1.82)와 다음과 같이 설정된 매개변수를 사용하여 결정된다: (1) CPU 방식=ClustalW mp; (2) 정렬="전체"; (3) 출력 포맷="개수로 정렬"; (4) 출력 순서="정렬됨"; (5) 색상 정렬="안함"; (6) KTUP (글자 크기)="디폴트"; (7) 창 길이="디폴트"; (8) 점수 유형="백분율"; (9) TOPDIAG="디폴트"; (10) PAIRGAP="디폴트"; (11) 계통수/계통수 유형="없음"; (12) 매트릭스="디폴트"; (13) 갭 개방="디폴트"; (14) 종료 갭="디폴트"; (15) 갭 연장="디폴트"; (16) 갭 거리="디폴트"; (17) 계통수 유형="분기도" 및 (18) 계통수 그래프 거리="숨김".
"발효" 또는 "배양"은 일반적으로 적어도 하나의 단순 탄소원, 및 필요하면 보조 기질을 함유하는, 배양되는 미생물에 적합화된 적절한 배양 배지가 존재하는 발효기에서 수행된다.
본 명세서에 개시된 미생물은 옥살로아세테이트로부터 생성물의 생산을 위한 발효 배지에서 성장될 수 있다. 엑토인의 최대 생산을 위해서, 생산 숙주로서 사용되는 미생물 균주는 바람직하게 높은 탄수화물 이용률을 갖는다. 이들 특징은 돌연변이유발법 및 선별, 유전자 조작에 의해 부여될 수 있거나, 또는 자연적일 수 있다. 본 발명의 세포를 위한 발효 배지, 또는 "배양 배지"는 적어도 약 10 g/L의 글루코스를 함유할 수 있다. 추가적인 탄소 기질은 제한없이 모노사카라이드 예컨대 프룩토스, 만노스, 자일로스 및 아라비노스; 올리고사카라이드 예컨대 락토스, 말토스, 갈락토스, 또는 수크로스; 폴리사카라이드 예컨대 전분 또는 셀룰로스 또는 이의 혼합물 및 재생 공급원료 예컨대 유장 침투 옥수수 침지액, 사탕무 당밀, 및 보리 맥아 유래의 미정제 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 탄소 기질은 글리세롤을 포함할 수 있다.
그러한 이유로, 본 발명에서 이용되는 탄소의 공급원은 광범위하게 다양한 탄소 함유 기질을 포괄할 수 있고 유기체의 선택에 의해서만 제한될 것이라는 것을 고려한다.
상기 언급된 모든 탄소 기질 및 이의 혼합물이 본 발명에서 적합한 것으로 고려되지만, 바람직한 탄소 기질은 글루코스, 프룩토스, 및 수크로스, 또는 C5 당을 사용하도록 변형된 미생물의 경우 C5 당 예컨대 자일로스 및/또는 아라비노스와 이들의 혼합물이고, 보다 특히 글루코스이다.
바람직한 탄소 기질은 글루코스이다.
적절한 탄소원 이외에도, 발효 배지는 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 완충제, 및 바람직한 생성물의 생산에 필요한 효소 경로의 촉진 및 배양물의 성장에 적합한, 당업자에게 공지된, 다른 성분을 함유할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 재조합 미생물의 성장에 적합한 추가의 유전자 변형이 고려될 수 있다.
용어 "호기성 조건"은 호기성 또는 통성 혐기성 미생물이 최종 전자 억셉터로서 2-산소를 사용하는데 충분한 배양 배지 중 산소의 농도를 의미한다.
"미호기성 조건"은 산소의 농도가 공기 중의 농도 미만, 즉 최대 6% O2의 산소 농도인 배양 배지를 의미한다.
"적절한 배양 배지"는 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 또는 유리한 영양분 예컨대 탄소원 또는 탄소 기질, 질소원, 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 나이트레이트 및 암모늄 포스페이트; 인 공급원, 예를 들어, 모노포타슘 포스페이트 또는 디포타슘 포스페이트; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망간 염을 비롯하여; 성장 인자 예컨대 아미노산, 비타민, 성장 프로모터 등을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 의미한다. 본 발명에 따른 용어 "탄소원" 또는 "탄소 기질" 또는 "탄소의 공급원"은 헥소스 (예컨대 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 디사카라이드 (예컨대 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 당밀, 전분 또는 이의 유도체, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 이의 조합을 포함하는, 미생물의 정상 성장을 지원하기 위해 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미한다.
본 발명에 따라 도입된 유전자 변형의 일반 특성
- 유전자는 다음의 2개 종류의 상호 배타적이지 않은 변형에 의해 과발현된다:
·강력 프로모터 제어 하에 배치; 및/또는
·고려되는 유전자의 다수 카피의 삽입.
- 모든 게놈 변형은 공지된 유전자 조작 기술에 따라 효모에 삽입된다:
- 본 발명에 따라 효모 게놈에 도입되는 유전자 구성체에 포함되는 연속적인 유전자는 다음의 구조를 갖는다:
Prom1-ORF1-term1-ORF2-유전자2-term2 - .../... -Promn-ORFn-termn, 여기서
- Prom1은 코딩 서열 ORF1의 발현을 조절하는 서열이고,
- ORF1은 바람직한 단백질 PROT1, 특히 바람직한 효소 PROT1을 코딩하는 핵산 서열이고,
- Term1은 전사 복합체로부터 mRNA를 방출시키는 과정을 촉발하는 신호를 새롭게 합성된 mRNA에 제공하여 전사 종결을 매개하는 전사 종결인자 서열이고,
- "1", "2", .../... "n"은 동일한 ORF (Open Reading Frame), 프로모터 또는 종결인자를 설명할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 유전자의 순서는 중요하지 않다. "n"은 일반적으로 5 내지 20 범위의 정수이다. 이들 구성체는 제어된 위치에서 효모 염색체 중 하나에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 삽입 부위는 삽입된 구성체의 기능성이나, 또는 최종 유전자 변형 효모의 생존능에 필수적이지 않다.
- 효모가 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아일 때, 효모 게놈에 도입되고 사카로마이세스 세레비지아 이외의 다른 유기체로부터 기원하는 유전자는 일반적으로 "트랜스코딩" (일반적으로 코돈-최적화)되는데, 이것은 이들 유전자가 에스. 세레비지아에서 발현을 위한 최적 코돈 용법으로 합성된다는 것을 의미한다. 에스. 세레비지아 유래 일부 유전자의 뉴클레오티드 서열 (단백질 서열 아님)은 또한 상기 유전자의 내생성 카피와의 재조합을 최소화하기 위해 변형 ("트랜스코딩")되었다.
- 유전자는 효모 유전자 조작에서 사용되는 표준 절차를 통해서 결실될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결실의 표적이 되는 유전자는 상기 기술된 유전자 구성체 중 하나의 삽입에 의해 단절될 수 있거나, 또는 대안적으로, 결실의 표적이 되는 유전자는 뉴클레오티드의 짧은 스트렛치로 대체된다.
- 유전자 발현의 하향 조절은 유전자의 내생성 카피를 파괴하고, 이것을 약 프로모터 제어 하의 ORF 카피로 대체하여 수득될 수 있다. 약 프로모터의 목록 및 서열은 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다.
- 유전자는 (필요하다면) 유전자의 내생성 카피를 결실시키고 유도성 또는 억제성 프로모터 제어 하의 ORF의 신규 카피를 배치하여 "유도성 또는 억제성"으로 만들 수 있다. 유도성 또는 억제성 프로모터는 환경 상태 또는 외부 자극의 변화 시에 활성이 조절 또는 제어, 즉 증가 또는 감소되는 프로모터이다. 유도 또는 억제는 무생물적 인자 예컨대 관심 유기체에 천연적으로 존재하지 않는 화학적 화합물, 빛, 산소 수준, 고온 또는 저온에 의한 유도 또는 억제를 포괄하여, 인공적으로 제어될 수 있다. 유도성 또는 억제성 프로모터의 목록 및 서열은 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다.
- 본 명세서의 다른 곳에 이미 명시된 바와 같이, 단백질은 Yu 등이 2015에 설명한 "degron" 기술 (Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204)을 사용한 탈안정화를 통해서 과소발현될 수 있다. 간략하게 이 기술은 분해의 표적이 되는 변형을 단백질 서열에 도입시키는 것으로 이루어진다. 이것은 N-말단 규칙으로 공지된 원리에 따른 오직 2개의 처음 아미노산, 또는 유비퀴틴-프로테오솜 분해 경로로 전체 단백질을 표적화하는 거대 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모
본 발명자는 엑토인을 생산하는 증가된 능력을 갖는 재조합 미생물, 특히 재조합 효모를 구상하였다.
본 발명은 증가된 엑토인 생산성을 갖는 재조합 효모에 관한 것이고, 여기서 증가된 엑토인 생산은 유전자 조작 방법을 통해서, 이의 게놈에 도입된 다수의 변경을 통해 수득된다.
본 발명은 엑토인-생산 재조합 효모에 관한 것이고, 이의 게놈에서,
(A) (i) 아스파토키나제 HOM3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
(ii) 아스파테이트 키나제 AK를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(B) 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제 HOM2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및/또는 조효소로서 NAD 및 NADP 둘 모두를 사용할 수 있는 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제 HOM2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(C) 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 EctB를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(D) (i) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(ii) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(iii) 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 EctA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(E) 엑토인 신타제 EctC를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
(F) (i) 호모세린 디히드로게나제 HOM6을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 결실되었고/되었거나,
(ii) 호모세린 디히드로게나제 HOM6을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 핵산은 독립적으로
- 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
- 약 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
- 탈안정화된 형태이다.
본 발명자는 효모 세포에 의한 엑토인의 증가된 생산은 이들 효모 세포의 게놈으로 다수의 유전자 변경을 도입시켜 도달될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 명세서에서 완전히 기술되는 바와 같이, 상기 다수의 유전자 변경은 일정 유전자의 과발현, 일정 다른 유전자의 제어 발현을 비롯하여, 추가의 다른 유전자의 억제 또는 결실을 포괄한다.
효모 세포에 의한 증가된 엑토인 생산은 후속된 인공적으로 변형된 물질대사 경로가 주로 엑토인 생산을 향하도록 지정하기 위해, 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA의 물질대사를 최적화시키는 한편 동시에 최종 유전자 변형 효모 세포의 최적 생존능을 유지시킴으로써 본 발명자들에 의해 달성되었다.
오랜 연구 기간 이후에, 본 발명자들은 효모 세포에 의한 높은 엑토인 생산은 연속적인 중간 대사산물 포스포-아스파틸 및 아스파틸-세미알데히드로의 옥살로아세테이트의 전환을 증가시키고, 추가적으로 엑토인으로의 아스파틸-세미알데히드의 전환을 증강시키면서, 특히 최종 재조합 효모 세포의 양호한 생존능을 허용하는 산화 환원 상태, 보다 특히 적합화된 NADH/NADPH 균형을 유지하여 수득된다는 것을 밝혀내었다. 이러한 마지막 요점은 필수적이고 본 발명자들에게는 본 연구 작업 전반에서 상당한 도전을 의미한다.
본 발명에 따라 제안된 해법은 예상치 않게, 적은 환원력의 소비, NADPH에 비해 NADH 형태로 환원력의 소비, 및/또는 NADPH 대신 NADH의 생산을 통해 엑토인-생산 전반에서 효모 세포 중 생존 NADH/NADPH 평형을 유지시키는 것을 가능하게 한다.
본 명세서에서 상세하게 개시된 바와 같이, 최종 재조합 효모 세포는 (i) 아스파토키나제-코딩 유전자 (HOM3) 및/또는 (ii) 아스파테이트 키나제-코딩 유전자 (AK), 특히 아스파테이트 키나제-코딩 유전자 (AK)의 과발현 및/또는 제어 발현, 바람직하게 아스파테이트 키나제 유전자 (AK)의 과발현을 실시하도록 유전자 변형된다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 효모는 아스파틸-세미알데히드 생산을 위한 중간 대사산물 포스포-아스파틸의 최적 사용을 위한 추가의 유전자 변형을 포함하고, 상기 추가의 유전자 변형은 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제-코딩 유전자 (HOM2) 및/또는 조효소로서 NADH 및 NADPH 둘 모두를 사용할 수 있는 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 유전자의 과발현 및/또는 제어 발현을 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 재조합 효모는 엑토인 생산을 위한 중간체 아스파틸-세미알데히드의 최적 사용을 위한 추가의 유전자 변형을 포함하고, 상기 추가의 유전자 변형은 (i) 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 유전자 (EctB)의 과발현 및/또는 제어 발현, (ii) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자 (MET2; METX) 및/또는 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 유전자 (EctA)의 과발현 및/또는 제어 발현, (iii) 엑토인 신타제 유전자 (EctC)의 과발현 및/또는 제어 발현, 및 (iv) 호모세린 디히드로게나제 유전자 (HOM6)의 과소발현 및/또는 제어 발현을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 일부 실시형태에서, 상기 효모는 아스파테이트 생산을 위한 중간 대사산물 옥살로아세테이트의 최적 사용을 위해 추가의 유전자 변형을 포함하고, 상기 추가의 유전자 변형은 (i) 아스파테이트 트랜스아미나제 유전자 (AAT2)의 과발현 및/또는 제어 발현 및/또는 (ii) 옥소-글루타레이트를 글루타메이트로 전환시키는 글루타메이트 디히드로게나제 유전자 (GDH)의 과발현 및/또는 제어 발현을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 일부 실시형태에서, 상기 효모는 생산된 엑토인의 최적 분비를 위해 추가의 유전자 변형을 포함하고, 상기 추가의 유전자 변형은 (i) 일반 아미노산 퍼미아제 유전자 (AGP3)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (ii) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 유전자 (BAP3)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (iii) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 유전자 (BAP2)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (iv) 일반 아미노산 퍼미아제 유전자 (GAP1)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (v) 고친화성 글루타민 퍼미아제 유전자 (GNP1)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (vi) 일반 아미노산 퍼미아제 유전자 (AGP1)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (vii) 저친화성 메티오닌 퍼미아제 유전자 (MUP3; MUP1)의 과소발현 및/또는 제어 발현, (viii) 가능한 수송체 유전자 (AQR1)의 과발현 및/또는 제어 발현 및/또는 (ix) 폴리아민 수송체 1 유전자 (TPO1)의 과발현 및/또는 제어 발현을 포함한다.
특정 실시형태에서, 일반 아미노산 퍼미아제, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2, 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1, 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1, 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1, 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3 및 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 독립적으로, 효모, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지아 유래 핵산이다.
본 발명에 따른 재조합 효모는 상기 기술된 유전자 변형을 함유하지 않는 부모 효모에 비해 더 높은 수율로 엑토인을 생산한다.
본 발명에 따른 재조합 효모는 NADPH 보다는 NADH를 이용하는 효소, 예컨대 적절한 글루타메이트 디히드로게나제 또는 적절한 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제의 발현을 촉진하도록 유전자 조작되었다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 일부 실시형태에서, 과발현되는 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 강력 프로모터 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 배치된 에스. 세레비지아 내생성 유전자로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 바람직하게 에스. 세레비지아 HOM2 유전자에 의해 코딩된다.
일부 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 가장 바람직하게는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, NAD 및 NADP 둘 모두를 사용하는 돌연변이된 HOM2 단백질을 코딩하는 유전자인, 에스. 세레비지아 HOM2 유전자의 변이체에 의해 코딩된다. 이러한 유전자 변이체는 예를 들어 실시예에 예시되어 있고 HOM2-2라고 한다. 이것은 하기에 논의되는 바와 같이 돌연변이된 에스. 세레비지아 HOM2 유전자에 상응한다.
조효소로서 NADP에 대한 HOM2의 높은 선택성을 완화시키고 NAD에 대한 효소의 친화성을 증강시키기 위해서 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 변이체 중 몇몇 아미노산 잔기를 목표로 하는 돌연변이의 성질은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어 [Faehnle, C. R. et al., Journal of Molecular Biology 1055-1068 (2005)]에서 확인할 수 있다. 특히, 뉴클레오티드 GAG에 의한 뉴클레오티드 서열의 위치 115 내지 117의 뉴클레오티드 TCT의 치환에 상응하는 S39에서 E39로의 돌연변이를 언급할 수 있다.
당업자에게 충분히 공지된 아미노산의 명명법에 따라서, S는 세린을 나타내고 E는 글루탐산을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 아스파토키나제는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 가장 바람직하게는 에스. 세레비지아 HOM3 유전자에 의해 코딩된다.
아스파토키나제-코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 일부 실시형태에서, 아스파토키나제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 아스파토키나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 아스파토키나제 및 아스파토키나제-코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 아스파토키나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 상기 하나 이상의 카피는 아스파토키나제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시형태에 추가하여 또는 그 대안으로서, 적어도 하나의 아스파토키나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
이들 실시형태에서, 아스파토키나제-코딩 유전자의 제어 발현은 천연 효모 아스파토키나제 오픈 리딩 프레임의 위치에, 유도성 조절 서열, 예컨대 유도성 또는 억제성 프로모터를 삽입시켜, 이 게놈 위치에서 효모 게놈에 처음에 존재한 내생성 프로모터를 치환시켜 수득될 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자들은 아스파토키나제-코딩 유전자의 과발현으로, 포스포-아스파틸이라고도 하는 아스파틸 포스페이트 (아스파틸-P)로의 아스파테이트의 전환의 제어 수준이 수득되어, 본 발명에 따른 재조합 효모의 높은 생존능 수준에 기여할 것이라고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 아스파토키나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
일부 바람직한 실시형태에서, 상기 아스파토키나제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지아 유래의 HOM3 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아스파토키나제-코딩 유전자는 강력 프로모터 pCCW12 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pCUP-1-1의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 아스파토키나제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, HOM6 유전자 내 및/또는 SAM3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
아스파테이트 키나제-코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
상기 기술된 바와 같이 아스파토키나제의 과발현 및/또는 제어 발현에 추가하여 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 재조합 효모는 아스파테이트 키나제-코딩 유전자의 과발현 및/또는 제어 발현을 포함하도록 될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트 키나제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 아스파테이트 키나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 아스파테이트 키나제 및 아스파테이트 키나제-코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 아스파테이트 키나제-코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 아스파테이트 키나제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시형태에 추가하여 또는 이의 대안으로서, 적어도 하나의 아스파테이트 키나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 본 발명자는 아스파테이트 키나제-코딩 유전자의 제어 발현, 아스파틸 포스페이트 (아스파틸-P)로의 아스파테이트의 전환의 제어된 수준이 수득되어 본 발명에 따른 재조합 효모의 높은 수준의 생존능에 기여할 것이라고 믿는다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아스파테이트 키나제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래 AK 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아스파테이트 키나제-코딩 유전자는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU7의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 아스파테이트 키나제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, TRP1 유전자 내에 삽입될 수 있다.
아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제-코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 및 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시형태에 추가하여 또는 그의 대안으로서, 적어도 하나의 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 과발현이 아스파틸-세미알데히드로의 중간 대사산물 아스파틸 포스페이트 (아스파틸-P)의 전환을 증강시킬 수 있다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
일부 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 아스파틸 포스페이트 (아스파틸-P)의 아스파틸-세미알데히드로의 전환을 촉매하기 위해 NADH 또는 NADPH 둘 모두를 사용하는 효소 변이체일 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 상기 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 -코딩 유전자는 사카로마이세스 세레비지아 유래의 HOM2 유전자이거나, 또는 대안적으로 본 명세서의 실시예에 표시되고 이전에 기술된 바와 같이 NADH 및 NADPH 둘 모두를 이용하는 HOM2의 변이체이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제-코딩 유전자는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU5 또는 강력 프로모터 pCCW12의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, HIS3 유전자 내, 및/또는 MUP3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 및 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시예에 추가적으로 또는 그 대안으로서, 적어도 하나의 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 과발현이 중간 대사산물 아스파틸-세미알데히드의 2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 증강시킬 수 있다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래 EctB 유전자, 또는 할로모나스 엘롱가타 (Halomonas elongata) (때때로 크로모할로박터 살렉시겐스 (Chromohalobacter salexigens)라고도 함) 유래 EctB 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 유전자는 강력 프로모터 pCCW12 및/또는 강력 프로모터 pTDH3의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, HOM6 유전자 내 및/또는 SAM3 유전자 내 및/또는 MUP3 유전자 내 및/또는 URA3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 -코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입하여 수득된다. 본 발명에 포괄되는 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 및 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 -코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시예에 추가로 또는 그의 대안으로서, 적어도 하나의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 -코딩 유전자는 효모 세포에 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제의 과발현이 허용되어 결과적으로 아세틸-CoA의 존재 하에서, 중간 대사산물 2,4-디아미노부티레이트의 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 전환 수준을 증가시킨다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지아 유래의 MET2 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 유래 METX 유전자이다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 사카로마이세스 세레비지아 유래의 MET2 유전자인 적어도 하나의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자 및 코리네박테리움 글루타미컴 유래 METX 유전자인 적어도 하나의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 다수 카피가 존재하면 상기 유전자의 각 카피에 대해 독립적으로 강력 프로모터 pPDC1 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU6의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, SAM3 유전자 내 및/또는 HIS3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 및 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 추가로 또는 그의 대안으로서, 적어도 하나의 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 효모에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 과발현이 허용되어, 결과적으로 아세틸-CoA의 존재 하에서, 중간 대사산물 2,4-디아미노부티레이트의 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 전환 수준을 증가시킨다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 할로모나스 엘롱가타 (때때로 크로모할로박터 살렉시겐스라고도 함) 유래 EctA 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 강력 프로모터 pPDC1의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이 LYP1 유전자 내 및/또는 MUP3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 이의 게놈에 다음을 포함한다:
- 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고, 바람직하게는 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있는 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 적어도 하나의 핵산; 및
- 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고, 바람직하게는 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있는 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 EctA를 코딩하는 적어도 하나의 핵산.
엑토인 신타제 -코딩 유전자 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 엑토인 신타제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 엑토인 신타제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 엑토인 신타제 및 엑토인 신타제-코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 엑토인 신타제 코딩 서열을 코딩하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 엑토인 신타제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시형태에 추가로 또는 그의 대안으로서, 적어도 하나의 엑토인 신타제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 엑토인 신타제의 과발현을 허용하여, 결과적으로 중간 대사산물 아세틸-2,4-디아미노부티레이트의 엑토인으로의 전환 수준을 증가시킨다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 엑토인 신타제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 엑토인 신타제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 할로모나스 엘롱가타 유래 EctC 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 엑토인 신타제-코딩 유전자는 강력 프로모터 pTDH3 및/또는 강력 프로모터 pTEF1의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 엑토인 신타제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, LYP1 유전자 내 및/또는 MUP3 유전자 내 및/또는 URA3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
호모세린 디히드로게나제의 결실 또는 과소발현
본 발명에 따른 재조합 효모는 다음과 같은 게놈을 갖는다고 더욱 정의된다:
(i) 호모세린 디히드로게나제 HOM6을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산이 결실 및/또는 단절되었고/되었거나,
(ii) 호모세린 디히드로게나제 HOM6을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 핵산은 독립적으로
- 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
- 약 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
- 탈안정화된 형태이다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 호모세린 디히드로게나제 유전자의 과소 발현이 호모세린으로의 이의 전환을 통해 생산된 아스파틸-세미알데히드의 소비를 감소시킴으로써 재조합 효모에 의한 2,4-디아미노부티레이트 생산을 증가시킬 것이라고 믿는다.
일부 실시형태에서, 호모세린 디히드로게나제의 과소발현은 예를 들어 이 유전자의 발현을 억제성 조절 서열, 예컨대 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 배치시킴으로써 조건적으로 만들어 질 수 있다.
유전자 발현의 억제, 표적 유전자의 단절 또는 표적 유전자의 결실을 위한 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
호모세린 디히드로게나제 과소발현은 탈안정화된 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 핵산의 삽입을 포괄한다. 탈안정화된 호모세린 디히드로게나제는 부모 호모세린 디히드로게나제에 비해 효모 세포 내에서 더 신속하게 분해되는 호모세린 디히드로게나제의 변이체이다 .
바람직한 실시형태에서, 탈안정화된 호모세린 디히드로게나제는 degron-태그화 호모세린 디히드로게나제 단백질로 이루어진다.
예를 들어, 호모세린 디히드로게나제 유전자는 loxP, 또는 예를 들어 URA3.Kl-loxP에 의해 단절될 수 있고, 그에 따라 결실된다 (불활성화될 수 있다고 할 수 있음).
대안적으로 출원된 실시예에 예시된 바와 같이, 관심 유전자를 포함하는 카세트에 의해 단절될 수 있다.
아스파토키나제 (HOM3)
아스파토키나제 효소는 ATP의 존재 하에서 L-아스파테이트의 4-포스포-L-아스파테이트로의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지아의 게놈에 의해 코딩되는 아스파토키나제는 HOM3이라고 할 수 있다.
아스파토키나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Stadtman 등이 기술한 방법 (1961, J Biol Chem, Vol. 236 (7): 2033-2038)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 아스파토키나제는 n° EC 2.7.2.4의 EC 번호를 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에 따라서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원한 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원한 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게 바실러스 서브틸리스 및 효모로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 다른 바람직한 실시형태에서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 1의 핵산과 적어도 25%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수있다. SEQ　ID　NO: 1의 핵산은 역시 HOM3이라고 할 수 있는 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 아스파토키나제를 코딩한다.
이 서열과 관련된 동일한 속성의 생물학적 활성은 ATP 존재 하에서 L-아스파테이트의 4-포스포-L-아스파테이트로의 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
사카로마이세스 세레비지아 유래 아스파토키나제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP010972, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 2를 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 25%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 아쿠아마리나 아틀란티카 (Aquamarina atlantica)로부터 기원된 아스파토키나제는 SEQ ID NO: 2의 아스파토키나제와 25%의 아미노산 동일성을 갖는다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 ATP의 존재 하에서 L-아스파테이트의 4-포스포-L-아스파테이트로의 전환을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 아스파토키나제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세하게 정의되는 바와 같이, 상기 아스파토키나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3' 위치에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 아스파토키나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 아스파토키나제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 아스파토키나제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에 아스파토키나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 아스파토키나제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내 아스파토키나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
아스파테이트 키나제 (AK)
아스파테이트 키나제 효소는 ATP의 존재 하에서 L-아스파테이트의 4-포스포-L-아스파테이트로의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 바실러스 서브틸리스의 게놈에 의해 코딩되는 아스파테이트 키나제는 AK라고 할 수 있다.
아스파테이트 키나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속하고 아스파토키나제에 대해 이전에 표시한 것과 동일하다.
바람직한 실시형태에 따라서, 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 및 효모로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 다른 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NC_000964.3에 개시된 것을 언급할 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 3의 핵산과 적어도 25%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. SEQ ID NO: 3의 핵산은 AK라고도 할 수 있는, 바실러스 서브틸리스로부터 기원하는 아스파테이트 키나제를 코딩한다.
이 서열과 관련하여 동일 속성의 생물학적 활성은 ATP의 존재 하에서 L-아스파테이트의 4-포스포-L-아스파테이트로의 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
바실러스 서브틸리스 유래 아스파테이트 키나제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_389558.2, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 4를 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 25%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 아쿠아마리나 아틀란티카로부터 기원된 아스파테이트 키나제는 SEQ ID NO: 4의 아스파토키나제와 25%의 아미노산 동일성을 갖는다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 ATP의 존재 하에서 L-아스파테이트의 4-포스포-L-아스파테이트로의 전환을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 25% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 아스파테이트 키나제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세히 정의되는 바와 같이, 상기 아스파테이트 키나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3' 위치에 존재하는, 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 명세서의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 아스파테이트 키나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 아스파테이트 키나제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 아스파테이트 키나제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에서 아스파테이트 키나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 아스파테이트 키나제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내에서 아스파테이트 키나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 (HOM2)
아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 L-아스파틸-4-포스페이트의 환원적 탈인산화에 의한 L-아스파테이트-세미알데히드의 NADPH-의존적 형성을 촉매하는 것으로 당분야에 공지된 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지아의 게놈에 의해 코딩되는 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 HOM2라고 할 수 있다.
아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
본 명세서에서 바람직한 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 EC 번호 1.2.1.11을 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에 따라서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에 따라서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산은 사카로마이세스 세레비지아 유래 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 변이체 또는 돌연변이체일 수 있고, 여기서 상기 변이체 효소 또는 상기 돌연변이체 효소는 반응의 촉매를 위해 NADH 또는 NADPH 둘 모두를 사용한다. 이러한 변이체 또는 돌연변이체 효소는 당분야에 공지되어 있고 본 내용에서 앞서 설명되어 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 기준 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산과 적어도 27%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산(들)일 수 있다. SEQ　ID　NO: 5 및 SEQ ID NO: 6의 핵산은 집합적으로 본 명세서에서 HOM2라고 할 수 있는, 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩한다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 L-아스파틸-4-포스페이트의 환원적 탈인산화에 의한 L-아스파테이트-세미알데히드의 NADPH-의존적 형성을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 27% 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80% 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
사카로마이세스 세레비지아 유래 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP010442, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 7을 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 7의 아미노산 서열과 적어도 27%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 락토바실러스 와사트첸시스 (Lactobacillus wasatchensis)로부터 기원된 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 SEQ ID NO: 7의 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제와 27%의 아미노산 동일성을 갖는다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 L-아스파틸-4-포스페이트의 환원적 탈인산화에 의한 L-아스파테이트-세미알데히드의 NADPH-의존적 형성을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 27%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세히 정의되는 바와 같이, 상기 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3' 위치에 존재하는, 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가 실시형태에서, 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내에 아스파테이트-세미알데히드 디히드로게나제 -코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 (EctB)
디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 효소는 글루타메이트의 존재 하에 아스파틸 세미알데히드의 2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 할로모나스 엘롱가타의 게놈에 의해 코딩되는 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제는 EctB 또는 EctB.He라고 할 수 있다.
디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, p91-99]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제는 n° 2.6.1.76의 EC 번호를 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게 박테리아로부터 선택되는 유기체, 특히 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 할로모나스 엘롱가타 (Halomonas elongata), 또는 스포로카르시나 뉴요켄시스 (Sporocarcina newyorkensisn), 및 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사 또는 할로모나스 엘롱가타로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9의 핵산과 적어도 35%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 글루타메이트의 존재 하에 아스파틸 세미알데히드의 2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 35%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
할로모나스 엘롱가타 유래 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 아미노산 서열의 경우에, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 WP_013332345.1, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11을 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 35%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 글루타메이트의 존재 하에 아스파틸 세미알데히드의 2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 35% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세히 정의되는 바와 같이, 상기 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3'에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내에서 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 (MET2; METX)
호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 효소는 CoA 및 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 아세틸-CoA 및 2,4-디아미노부티레이트 간 반응을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지아의 게놈에 의해 코딩되는 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제는 MET2라고 할 수 있다.
호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게는 Shuzo Yamagata가 기술한 방법 (1987, The Journal of Bacteriology, Vol. 169(8): 3458-3463)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 n° EC 2.3.1.31의 EC 번호를 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미컴 및 효모로부터 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 다른 바람직한 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
특정한 실시형태에 따라서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 핵산은 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 해모필리우스 인플루엔자 (Haemophilius influenza), 스트렙토마이세스 라벤둘라에 (Streptomyces lavendulae), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia) 및 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 박테리아 유래 핵산이다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 12의 핵산과 적어도 27%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%, 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. SEQ　ID　NO: 12의 핵산은 MET2라고도 할 수 있는, 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩한다. 코리네박테리움 글루타미컴으로부터 기원된 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 일반적으로 METX라고 한다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 CoA 및 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 아세틸-CoA 및 2,4-디아미노부티레이트 간 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 27%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
사카로마이세스 세레비지아 유래 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP014122, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 13을 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 13의 아미노산 서열과 적어도 27%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 아쿠아마리나 아틀란티카로부터 기원된 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 SEQ ID NO: 13의 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제와 27% 아미노산 동일성을 갖는다.
이 서열과 관련하여 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 CoA 및 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 아세틸-CoA 및 2,4-디아미노부티레이트 간 반응을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 27%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세히 정의하는 바와 같이, 상기 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3' 위치에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 -코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내에 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 -코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 (EctA)
디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 효소는 아세틸-CoA의 존재 하에 2,4-디아미노부티레이트의 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 할로모나스 엘롱가타의 게놈에 의해 코딩되는 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제는 EctA 또는 EctA.He라고 할 수 있다.
디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, p91-99]를 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제는 n° 2.3.1.178의 EC 번호를 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 박테리아로부터 선택된 유기체, 특히 크로모할로박터 살렉시겐스, 슈도모나스 애루지노사, 타우레아 (Thaurea) sp.28 또는 할로모나스 엘롱가타로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 14의 핵산과 적어도 30%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이와 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 아세틸-CoA의 존재 하에 2,4-디아미노부티레이트의 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 30%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
할로모나스 엘롱가타 유래 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 WP_035409657.1, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 15를 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 30%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이 서열과 관련하여 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 아세틸-CoA의 존재 하에 2,4-디아미노부티레이트의 아세틸-2,4-디아미노부티레이트로의 전환을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 30%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세히 정의되는 바와 같이, 상기 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3'에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에서 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제 -코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
역시 추가의 실시형태에서, 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내에서 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
엑토인 신타제 (EctC)
엑토인 신타제 효소는 아세틸-2,4-디아미노부티레이트의 엑토인으로의 전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 할로모나스 엘롱가타의 게놈에 의해 코딩되는 엑토인 신타제는 EctC 또는 EctC.He라고 할 수 있다.
엑토인 신타제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, p91-99]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 엑토인 신타제는 n°4.2.1.108의 EC 번호를 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 엑토인 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑토인 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑토인 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 박테리아로부터 선택된 유기체, 특히 슈도모나스 애루지노사, 할로모나스 엘롱가타 또는 마이코코커스 루테우스 (Micrococcus luteus)로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 엑토인 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 16의 핵산과 적어도 35%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 아세틸-2,4-디아미노부티레이트의 엑토인으로의 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 35%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
할로모나스 엘롱가타 유래 엑토인 신타제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 WP_013332346, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 17을 언급할 수 있다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 엑토인 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 적어도 35%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 아세틸-2,4-디아미노부티레이트의 엑토인으로의 전환을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 35%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 엑토인 신타제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 더욱 상술되는 바와 같이, 상기 엑토인 신타제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3'에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 엑토인 신타제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시형태에서, 엑토인 신타제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 엑토인 신타제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈 내에 엑토인 신타제-코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 엑토인 신타제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈 내에 엑토인 신타제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
호모세린 디히드로게나제 (HOM6)
호모세린 디히드로게나제 효소는 NAD 또는 NADP의 존재 하에, L-호모세린의 L-아스파테이트 4-세미알데히드로의 전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지아의 게놈에 의해 코딩되는 호모세린 디히드로게나제는 HOM6일 수 있다.
호모세린 디히드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Calnyanto 등이 기술한 방법 (2006, Microbiology, Vol. 152: 105-112)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 호모세린 디히드로게나제는 n°1.1.1.3의 EC 번호를 갖는 효소이다.
바람직한 실시형태에서, 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
특정한 실시형태에 따라서, 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 18의 핵산일 수 있다. SEQ　ID　NO: 18의 핵산은 HOM6이라고도 할 수 있는, 사카로마이세스로부터 기원된 호모세린 디히드로게나제를 코딩한다.
사카로마이세스 세레비지아 유래 호모세린 디히드로게나제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 AJR75529 또는 NP012673, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 19를 언급할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 호모세린 디히드로게나제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 더욱 상세하게 정의하는 바와 같이, 상기 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3'에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시형태에서, 호모세린 디히드로게나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서, (a) 완전하게 또는 부분적으로 결실 또는 단절되거나, 또는 (b) 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하; 약 프로모터의 제어 하에 있고/있거나; 탈안정화된 형태이다.
엑토인-생산 재조합 효모의 특별한 실시형태
아스파테이트 트랜스아미나제 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
아스파테이트 트랜스아미나제 효소 (아스파테이트 아미노트랜스퍼라제라고도 알려짐)는 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트의 생산을 위해 L-아스파테이트 및 2-옥소글루타레이트의 반응을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지아의 게놈에 의해 코딩되는 아스파테이트 트랜스아미나제 효소는 AAT2라고 할 수 있다.
이들 실시형태에 따라서, 아스파테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 아스파테이트 트랜스아미나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 아스파테이트 트랜스아미나제 및 아스파테이트-트랜스아미나제-코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 아스파테이트 트랜스아미나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 아스파테이트 트랜스아미나제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시형태에 추가로 또는 대안으로서, 적어도 하나의 아스파테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 아스파테이트 트랜스아미나제의 과발현이 옥살로아세테이트의 아스파테이트로의 높은 수준의 전환을 유도시킬 수 있다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 아스파테이트 트랜스아미나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
아스파테이트 트랜스아미나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Yagi 등이 기술한 방법 (1982, Biochem, VOl. 92: 35-43)을 언급할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 아스파테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지아 유래 AAT2 유전자이다.
바람직한 실시형태에서, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제는 에이. 탈리아나 (A.Thaliana) AAT2-유전자에 의해 코딩된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아스파테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU1 또는 강력 프로모터 pADH1 또는 강력 프로모터 pPGK1의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, AAT2 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, CAN1 유전자 내 및/또는 GNP1 유전자 내 및/또는 MUP3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 아스파테이트 트랜스아미나제는 EC 번호 2.6.1.1로 공지되어 있다.
아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모 유기체, 및 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 아스파테이트 트랜스아미나제 또는 AAT2를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 20의 핵산 서열과 적어도 39%, 유리하게는 적어도 65%, 및 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트의 생산을 위한 L-아스파테이트 및 2-옥소글루타레이트의 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 39%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 SEQ　ID　NO: 20의 핵산 서열과 적어도 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 SEQ　ID　NO: 20의 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 SEQ　ID　NO: 20의 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
사카로마이세스 세레비지아 유래 아스파테이트 트랜스아미나제 AAT2의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP013127, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 21을 언급할 수 있다. 예시적으로, 이. 콜라이로부터 기원된 아스파테이트 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 21의 아스파테이트 트랜스아미나제 AAT2와 39%의 아미노산 동일성을 갖는다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 39%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이 서열과 관련된 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트의 생산을 위한 L-아스파테이트 및 2-옥소글루타레이트의 반응을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 39%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 SEQ　ID　NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 SEQ　ID　NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 SEQ　ID　NO: 21의 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 아스파테이트 트랜스아미나제의 발현 수준은 이하 본 명세서에서 보다 상세히 정의되는 바와 같이, 아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3'에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 아스파테이트 트랜스아미나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현된다.
일부 실시형태에서, 아스파테이트 트랜스아미나제의 과발현은 상기 재조합 효모 내에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 아스파테이트 트랜스아미나제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈에 아스파테이트 트랜스아미나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 아스파테이트 트랜스아미나제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈에 아스파테이트 트랜스아미나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
글루타메이트 디히드로게나제 과발현 및/또는 제어 발현
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 옥소-글루타레이트를 글루타메이트로 전환시키는 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산-코딩 유전자는 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은 옥소-글루타레이트를 글루타메이트로 전환시키는 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있도록 된다.
글루타메이트 디히드로게나제 효소 (NAD-특이적 글루타메이트 디히드로게나제라고도 함)는 L-글루타메이트의 생산을 위한 2-옥소글루타레이트의 형질전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 따라서, 글루타메이트 디히드로게나제는 NADH의 존재 하에서, 2-옥소글루타레이트의 L-글루타메이트로의 전환을 포함하는 화학 반응에 특이적으로 관여되는 효소이다.
이들 실시형태에 따라서, 글루타메이트 디히드로게나제 효소-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 글루타메이트 디히드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피를 삽입시켜 수득된다. 본 발명에 포괄되는 글루타메이트 디히드로게나제 및 글루타메이트 디히드로게나제 -코딩 유전자는 본 명세서의 다른 곳에 상술되어 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 상기 글루타메이트 디히드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 글루타메이트 디히드로게나제의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 이들 실시형태에 추가로 또는 그의 대안으로서, 적어도 하나의 글루타메이트 디히드로게나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능성인 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 글루타메이트 디히드로게나제의 과발현은 옥소글루타레이트를 글루타메이트로 전환시킴으로서, 동시에 NAD를 발생시킨다고 믿는다. 동일한 것이 적어도 하나의 글루타메이트 디히드로게나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있을 때 적용된다.
글루타메이트 디히드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Noor 및 Punekar가 기술한 방법 (2005, Microbiology, Vol. 151 : 1409-1419)을 언급할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 글루타메이트 디히드로게나제 -코딩 유전자는 NADPH 대신에 NADH를 사용하는 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하고, 보다 특히 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, 엔토디니움 카우다텀 (Entodinium caudatum) 유래 (GDH.Eca 또는 GDH2.Eca로서 표시됨) 또는 사카로마이세스 세레비지아 유래 (GDH2로서 표시됨)의 GDH 유전자이다. 특정 실시형태에서, 상기 글루타메이트 디히드로게나제 -코딩 유전자는 엔토디니움 카우다텀 유래 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩한다.
본 명세서에서 바람직한 글루타메이트 디히드로게나제는 특히 EC 번호 n° EC 1.4.1.2를 갖는 효소일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 글루타메이트 디히드로게나제 -코딩 유전자는 강력 프로모터 pTDH3 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pCUP1-1의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, 글루타메이트 디히드로게나제 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, HIS3 유전자 내 및/또는 MUP3 유전자 내에 삽입될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 엔토디니움 카우다텀, 바실러스 서브틸리스, 클로스트리디움 심비오시움 (Clostridium symbiosium)으로부터 선택된 유기체로부터 기원된 핵산(들)일 수 있다.
역시 바람직한 실시형태에 따라서, 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 22의 핵산 서열과 적어도 49%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. SEQ ID NO: 22의 핵산은 엔토디니움 카우다텀으로부터 기원된 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하고, 상기 핵산 서열은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아에서 이의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
이 서열과 관련하여 동일 속성의 생물학적 활성은 L-글루타메이트의 생산을 위한 2-옥소글루타레이트의 형질전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 49%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 SEQ　ID　NO: 22의 핵산 서열과 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 SEQ　ID　NO: 22의 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 핵산 서열은 SEQ　ID　NO: 22의 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 핵산 서열을 포괄한다.
엔토디니움 카우다텀 유래 글루타메이트 디히드로게나제의 아미노산 서열의 경우, 당업자는 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 AAF15393, 또는 본 명세서에 기술된 SEQ ID NO: 23을 언급할 수 있다. 예시적으로, 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) 로부터 기원된 글루타메이트 디히드로게나제는 SEQ ID NO: 23의 글루타메이트 디히드로게나제와 49%의 아미노산 동일성을 갖는다.
다른 특정한 실시형태에 따라서, 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 SEQ　ID　NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 49%, 유리하게는 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이와 관련하여 동일 속성의 생물학적 활성은 이전에 기술된 바와 같고, 즉 L-글루타메이트의 생산을 위한 2-옥소글루타레이트의 형질전환을 촉매하는 능력이다.
본 명세서에서 설명시, 기준 핵산 서열과 적어도 49%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 SEQ　ID　NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 SEQ　ID　NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
본 명세서에서 설명시, 기준 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 SEQ　ID　NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일 속성의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 포괄한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 글루타메이트 디히드로게나제의 발현 수준은 하기 본 명세서에서 더욱 상세히 정의되는 바와 같이, 상기 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3'에 존재하는 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
본 설명의 다른 곳에 명시된 바와 같이, 글루타메이트 디히드로게나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과발현된다.
일부 실시형태에서, 글루타메이트 디히드로게나제의 과발현은 상기 재조합 효모에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어로 인한 결과일 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 글루타메이트 디히드로게나제의 과발현은 상기 재조합 효모의 게놈에 글루타메이트 디히드로게나제-코딩 서열의 다수의 카피의 존재로 인한 결과일 수 있다.
여전히 추가의 실시형태에서, 글루타메이트 디히드로게나제의 과발현은 (i) 상기 재조합 효모에서 강력 프로모터에 의한 상응하는 유전자의 제어 및 (ii) 상기 재조합 효모의 게놈에 글루타메이트 디히드로게나제-코딩 서열의 다수 카피의 존재 둘 모두로 인한 결과일 수 있다.
관심 화합물의 이출
본 발명에 따른 재조합 효모의 추가 실시형태에서, 생산된 엑토인의 효모 세포 밖으로의 이출은 (i) 효모 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 과소발현, (ii) 아미노산 엑스포터 단백질을 코딩하는 유전자의 과소발현, 또는 (iii) 효모 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 과소발현 및 아미노산 엑스포터 단백질을 코딩하는 유전자의 과소발현 둘 모두에 의해 증강될 수 있다.
퍼미아제-코딩 유전자(들)의 과소발현
하기에 기술되는 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과소발현될 수 있는 퍼미아제-코딩 유전자는 AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 및 MUP1을 포괄한다.
AGP1은 사카로마이세스 세레비지아 유래 일반 아미노산 퍼미아제 1이다. AGP 1의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_009905를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001178671을 언급할 수 있다.
AGP3은 사카로마이세스 세레비지아 유래의 일반 아미노산 퍼미아제 3이다. AGP3의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_116600을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001179912를 언급할 수 있다.
BAP3은 사카로마이세스 세레비지아 유래의 발린 아미노산 퍼미아제이다. BAP3의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_010331을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001180354를 언급할 수 있다.
BAP2는 사카로마이세스 세레비지아 유래의 Leu/Val/Ile 아미노산 퍼미아제이다. BAP2의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_009624를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001178416을 언급할 수 있다.
GAP1은 사카로마이세스 세레비지아 유래의 일반 아미노산 퍼미아제이다. GAP1의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_012965.3을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001179829를 언급할 수 있다.
GNP1은 사카로마이세스 세레비지아 유래의 고친화성 글루타민 퍼미아제이다. GNP1의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_010796을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001180816을 언급할 수 있다.
MUP3은 사카로마이세스 세레비지아 유래의 저친화성 메티오닌 퍼미아제이다. MUP3의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_011827을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001179116을 언급할 수 있다.
MUP1은 사카로마이세스 세레비지아 유래의 저친화성 메티오닌 퍼미아제이다. MUP의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_011569를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001181184를 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 일부 실시형태에서, 상기 재조합 효모는 AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 및 MUP1 퍼미아제를 포함하는, 퍼미아제를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 과소발현을 갖는 것으로 더욱 정의된다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은 하기 변형 중 적어도 하나가 수행되었다:
(A) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP3을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 일반 아미노산 퍼미아제 AGP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(B) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(C) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2를 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(D) 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(E) 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(F) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(G) 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(H) 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
(i) 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
(ii) 탈안정화된 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고/되었거나;
(I) 가능한 수송체 AQR1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나,
(J) 폴리아민 수송체 1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현된다.
특정 실시형태에서, 이들 변형 중 적어도 2개, 특히 적어도 3개가 수행되었다.
임의의 특정 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 임의의 퍼미아제 유전자의 과소발현이 효모 세포 밖으로, 예를 들어 배양 배지로 생산된 엑토인의 배출을 증가시키는 것이라고 믿는다.
퍼미아제와 관련하여, 이들 유전자 중 하나 이상의 과소발현은 예를 들어 상기 하나 이상의 퍼미아제 유전자의 단절 또는 결실에 의한 그들 발현의 완전한 억제를 포괄한다.
일부 실시형태에서, 퍼미아제-코딩 유전자의 과소발현은 예를 들어 억제성 조절 서열, 예컨대 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 이 유전자의 발현을 배치시킴으로써 조건적으로 만들 수 있다.
유전자 발현의 억제, 표적 유전자의 단절, 또는 표적 유전자의 결실을 위한 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
퍼미아제 유전자와 관련하여, 과소발현은 또한 탈안정화된 퍼미아제 단백질을 코딩하는 핵산의 삽입 또는 탈안정화된 퍼미아제 단백질을 코딩하는 핵산의 삽입, 또는 둘 모두를 포괄한다.
탈안정화된 퍼미아제는 부모 퍼미아제에 비해 효모 세포 내에서 보다 신속하게 분해되는 퍼미아제의 변이체이다.
바람직한 실시형태에서, 탈안정화된 퍼미아제는 degron-태그화 퍼미아제 단백질로 이루어진다.
실시예에 예시된 바와 같이, AGP3 유전자, BAP3 유전자, GAP1 유전자, GNP1 유전자 및 MUP3 유전자는 loxP에 의해 단절될 수 있고 그에 따라 결실된다.
아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자(들)의 과발현
하기에 기술된 바와 같이, 본 명세서에 따른 재조합 효모에서 과발현될 수 있는 엑스포터 단백질-코딩 유전자는 AQR1 및 TPO1을 포괄한다.
AQR1은 사카로마이세스 세레비지아 유래 수송체이다. AQR1의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_014334를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001182903을 언급할 수 있다.
TPO1은 사카로마이세스 세레비지아 유래 폴리아민 수송체이다. TPO1의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_013072를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001181848을 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 바람직한 실시형태에서, 수송체-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 상기 수송체 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 추가 카피를 삽입시켜 수득된다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 수송체-코딩 유전자의 과발현이 효모 세포 밖으로, 예를 들어 배양 배지로 생산된 엑토인의 배출을 증가시킬 것이라고 믿는다.
일부 실시형태에서, 수송체-코딩 유전자의 과발현은 효모 게놈의 선택된 위치(들)에, 수송체 유전자 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 추가 카피를 삽입시켜 수득된다. 이들 실시형태의 일부에서, 상기 수송체 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 상기 수송체의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
일부 다른 실시형태에서, 수송체 -코딩 유전자의 하나의 카피가 효모 게놈의 선택된 위치에 삽입된다. 이들 다른 실시형태에서, 상기 수송체 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 하나 이상의 카피는 상기 수송체의 강력한 발현을 허용하는 조절 서열, 예컨대 효모 세포에서 기능성인 강력 프로모터를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자 AQR1은 강력 프로모터 pTEF3의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, AQR1 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, PYK1 유전자 내에 삽입될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자 TPO1은 강력한 유도성 또는 억제성 프로모터 pSAM4 또는 강력한 항상성 프로모터 pTEF1의 제어 하에 배치된다.
TPO1-1은 TPO1 대신에 사용될 수 있다. TPO1-1은 리신 10, 49, 86, 143, 144 및 145이 아르기닌으로 치환된 인공 대립유전자이다.
본 발명자는 이들 변형이 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통한 분해로부터 TPO1을 보호하여 안정화시킨다고 믿는다.
바람직한 실시형태에서, 상기 아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자 TPO1은 강력 프로모터 pTEF3의 제어 하에 배치된다.
예시적으로, TPO1 유전자는 본 명세서의 실시예에 표시된 바와 같이, PYK1 유전자 내에 삽입될 수 있다.
추가로 증가된 엑토인 생산의 관점에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 추가의 유전자 변형을 포함할 수 있어서, 그들이 대량으로 중간체 생산물 옥살로아세테이트를 생산하게 된다. 이들 선택적 유전자 변화는 하기 본 명세서에 기술된다.
엑토인-생산 재조합 효모의 추가 실시형태
본 발명에 따른 재조합 효모의 일부 실시형태에 따라서, 엑토인의 생산은 중간 대사산물 옥살로아세테이트의 증가된 생산을 야기시키는 조건에 상기 재조합 효모를 배치시켜 더 증가시킬 수 있다.
옥살로아세테이트의 증가된 생산을 야기시키는 조건에 상기 재조합 효모의 배치는 효모 게놈에 추가의 유전자 변형을 도입시켜 수행될 수 있다.
본 발명자는 최적으로 증가된 엑토인 생산이 하기에 기술되는, 엑토인-생산 재조합 효모에 추가의 유전자 변화를 도입시켜 도달될 수 있다는 것을 발견하였다.
엑토인-생산 재조합 효모의 제1 추가 실시형태
본 발명에 따른 엑토인-생산 재조합 효모의 이들 제1 추가 실시형태에 따라서, 재조합 효모의 추가의 유전자 조작은 중간 생성물 포스포에놀-피루베이트 (PEP)의 생산 증가를 목적으로 수행된다.
임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 엑토인-생산 재조합 효모에 도입된 추가의 유전자 변화가 (i) NADPH의 과생산을 야기하고, (ii) 포스포에놀 피루베이트의 각각 옥살로아세테이트 및 피루베이트로의 제어 및 균형 전환을 야기하며, (iii) 피루베이트의 에탄올로의 감소된 전환 및 포스포에놀 피루베이트의 옥살로아세테이트로의 전환으로 재지정을 야기시킨다고 믿는다.
본 발명에 따른 엑토인-생산 재조합 효모에 유전자 조작으로 도입된 이들 추가의 유전자 변화는 하기에 보다 상세히 명시된다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 글루코스-6-포스페이트-1-디히드로게나제 (MET19 또는 ZWF1라고도 함) 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 디카복실레이팅 1 (GND1이라고도 함)을 과발현하도록 도입된다. 임의의 특정한 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 MET19 및 GND1의 과발현이 NADPH 생산의 증가를 야기시킨다고 믿는다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 포스포에놀피루베이트 카복실라제 (PEPC 또는 PPC라고 함) 및/또는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 [ATP] (PCK1 또는 PEPCK라고도 함)를 과발현시키도록 도입된다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 피루베이트 키나제 1 (PYK1 또는 CDC19라고도 함) 및 피루베이트 키나제 2 (PYK2라고도 함)를 과소발현하도록 도입된다. 이들 실시형태의 일부에서, PYK2 유전자는 과소발현되기 보다는 결실될 수 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 바람직하게 결실에 의해 불활성화된다. 피루베이트 디카복실라제-코딩 유전자는 각각 PDC1, PDC5 및 PDC6이라고 명명된 것들을 포함한다. 이들 실시형태의 일부에 따라서, PDC1 및/또는 PDC6 유전자는 바람직하게 단절 또는 결실에 의해 불활성화되는 반면, 다른 피루베이트 디카복실라제-코딩 유전자 PDC5는 비변경된 채로 남거나, 또는 이의 발현이 약 프로모터에 의해 제어되어 감소된다.
이들 실시형태의 일부에서, 재조합 효모의 알콜 디히드로게나제 활성은 하나 이상의 알콜 디히드로게나제-코딩 유전자의 발현을 변경시켜 감소된다. 이들 실시형태의 일부에서, ADH1의 발현은 약 프로모터의 제어 하에 유전자를 배치시키거나 또는 탈안정화된 ADH1 효소를 생산시켜 감소된다. 이들 실시형태의 일부에서, ADH3, ADH4 및 ADH5 중 하나 이상은 바람직하게 단절 또는 결실에 의해 불활성화될 수 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 외생성 아세틸 디히드로게나제-코딩 유전자 (MHPF라고도 함)는 효모 게놈에 도입될 수 있고 과발현될 수 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 외생성 아세테이트 키나제-코딩 유전자 (ACKA라고도 함)는 효모 게놈에 도입될 수 있고 과발현될 수 있다.
이들 실시형태의 일부에서, 외생성 포스페이트 아세틸 트랜스퍼라제-코딩 유전자 (PTA라고도 함)는 효모 게놈에 도입될 수 있고 과발현될 수 있다.
글루코스-6-포스페이트-1-디히드로게나제
글루코스-6-포스페이트-1-디히드로게나제 효소는 NADP의 NADPH로의 환원을 수반하는, D-글루코스 6-포스페이트가 6-포스포-D-글루코노-1,5-락톤이 되는 것을 촉매한다고 당분야에서 설명되는 단백질이다.
글루코스-6-포스페이트-1-디히드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게는 [Kuby, S. et al. (1966) Dehydrogenase and Oxidases Methods in Enzymology 9, 116-117]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 글루코스-6-포스페이트-1-디히드로게나제는 n° 1.1.1.49의 EC 번호를 갖는 효소이다.
글루코스-6-포스페이트-1-디히드로게나제 (MET19라고도 함)의 아미노산 서열 경우에, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_014158.1을 언급할수 있다. 핵산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001183079.1을 언급할 수 있다.
6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 디카르복실레이팅 1
6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 디카르복실레이팅 1 효소는 NADP의 NADPH로의 환원을 수반하는, 6-포스포글루코네이트의 리불로스 5-포스페이트 및 CO2로의 산화적 디카르복실화를 촉매하기 위한것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 디카르복실레이팅 1의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [He W. et al. (2007) BMC Structural Biology, 7:38]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 디카르복실레이팅 1은 n°1.1.1.44의 EC 번호를 갖는 효소이다.
6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 디카르복실레이팅 1 (GND1이라고 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_012053을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001179314를 언급할 수 있다.
피루베이트 키나제 1
피루베이트 키나제 1 효소는 ATP의 존재 하에 피루베이트의 포스포에놀피루베이트로의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
피루베이트 키나제 1의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여 당업자는 유리하게 Susan-resiga 및 Nowak가 기술한 방법 (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 키나제 1은 n° 2.7.1.40의 EC 번호를 갖는 효소이다.
피루베이트 키나제 1 (PYK1이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_009362를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001178183을 언급할 수 있다.
피루베이트 키나제 2
피루베이트 키나제 2 효소는 ATP의 존재 하에서 피루베이트의 포스포에놀피루베이트로의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다. 피루베이트 키나제 2는 해당작용 흐름 수준이 매우 낮은 조건 하에서 효모 세포에 의해 사용될 수 있다.
피루베이트 키나제 2의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Susan-resiga 및 Nowak가 기술한 방법 (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 키나제 2는 n°2.7.1.40의 EC 번호를 갖는 효소이다.
피루베이트 키나제 2 (PYK2라고도 함)의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_014992를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001183767을 언급할 수 있다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 1
피루베이트 디카복실라제 이소자임 1은 알콜 발효 동안 피루베이트의 아세트알데히드 및 이산화탄소로의 비산화적 전환에 관여되는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 1의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당분야의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Wang 등이 기술한 방법 (Biochemistry, 2001, 40:1755-1763)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 디카복실라제 이소자임 1은 n°4.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 1 (PDC1이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_013145를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001181931을 언급할 수 있다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 5
피루베이트 디카복실라제 이소자임 5는 알콜 발효 동안 아세트알데히드 및 이산화탄소로 피루베이트의 비산화적 전환에 관여되는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 5의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Wang 등이 기술한 방법 (Biochemistry, 2001, 40:1755-1763)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 디카복실라제 이소자임 5는 n°4.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 5 (PDC5라고도 함)의 아미노산 서열 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_013235를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001182021을 언급할 수 있다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 6
피루베이트 디카복실라제 이소자임 6은 알콜 발효 동안 아세트알데히드 및 이산화탄소로 피루베이트의 비산화적 전환에 관여되는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 5의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 Wang 등이 기술하는 방법 (Biochemistry, 2001, 40:1755-1763)을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 디카복실라제 이소자임 6은 n°4.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
피루베이트 디카복실라제 이소자임 6 (PDC6이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_013235를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001182021을 언급할 수 있다.
아세트알데히드 디히드로게나제
아세트알데히드 디히드로게나제는 NAD 및 조효소 A를 사용하여, 아세틸-CoA로 아세트알데히드의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
아세트알데히드 디히드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Fisher et al. (2013) Chemi. Biol. Interact. 202　70-77]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 아세트알데히드 디히드로게나제는 n°1.1.1.10의 EC 번호를 갖는 효소이다.
아세트알데히드 디히드로게나제 (MHPF라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_414885를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스에 수탁 번호 NC_000913.3으로 개시된 것을 언급할 수 있다.
아세테이트 키나제
아세테이트 키나제는 아세테이트 및 ATP로부터 아세틸 포스페이트의 형성을 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
아세테이트 키나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Sagers et al. J.Bacteriology (1961) 82　233-238]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
아세테이트 키나제 (ACKA라고도 함)의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_416799를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NC_000913.3으로 개시된 것을 언급할 수 있다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 아세틸-CoA 및 아세틸 포스페이트의 가역적인 상호전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Castano-Cerezo and Canovas, Microbial Cell Factories 2009, 8:54]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 n°2.3.1.8의 EC 번호를 갖는 효소이다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (PTA라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_416800을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NC_000913에 개시된 것을 언급할 수 있다.
알콜 디히드로게나제 1
알콜 디히드로게나제 1은 그들의 상응하는 알데히드로 1차 비분지형 알콜의 전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
알콜 디히드로게나제 1의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알콜 디히드로게나제 1은 n°1.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
알콜 디히드로게나제 1 (ADH1이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_014555를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001183340을 언급할 수 있다.
알콜 디히드로게나제 3
알콜 디히드로게나제 3은 그들의 상응하는 알데히드로 1차 비분지형 알콜의 전환을 촉매하기 위해 당분야에서 설명되는 단백질이다.
알콜 디히드로게나제 3의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알콜 디히드로게나제 3은 n°1.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
알콜 디히드로게나제 3 (ADH3이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_013800을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001182582를 언급할 수 있다.
알콜 디히드로게나제 4
알콜 디히드로게나제 4는 그들의 상응하는 알데히드로 1차 비분지형 알콜의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
알콜 디히드로게나제 4의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알콜 디히드로게나제 4는 n°1.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
알콜 디히드로게나제 4 (ADH4라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_011258을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001181122를 언급할 수 있다.
알콜 디히드로게나제 5
알콜 디히드로게나제 5는 그들의 상응하는 알데히드로 1차 비분지형 알콜의 전환을 촉매하는 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
알콜 디히드로게나제 5의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알콜 디히드로게나제 5는 n°1.1.1.1의 EC 번호를 갖는 효소이다.
알콜 디히드로게나제 5 (ADH5라고도 함)의 아미노산 서열의 경우 UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_009703을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_001178493을 언급할 수 있다.
엑토인-생산 재조합 효모의 제2의 추가 실시형태
본 발명에 따른 엑토인-생산 재조합 효모의 이들 추가 실시형태에 따라서, 재조합 효모의 추가적인 유전자 조작은 중간 생성물 포스포에놀-피루베이트 (PEP)의 생산 증가를 목적으로 수행된다.
임의의 특정 이론에 국한하고 싶지 않지만, 발명자는 엑토인-생산 재조합 효모에 도입된 추가의 유전자 변화가 (i) NADPH의 과생산을 야기하고, (ii) 각각 옥살로아세테이트 및 피루베이트로의 포스포에놀 피루베이트의 제어 및 균형 전환을 야기하고, (iii) 에탄올로의 피루베이트의 감소된 전환 및 옥살로아세테이트로의 포스포에놀 피루베이트의 전환으로의 재지정을 야기한다고 믿는다.
이러한 목적을 위해서, 발명자는 포스포에놀피루베이트로부터 출발하여 옥살로아세테이트의 생산으로 종결되는 완전히 새로운 신규한 물질대사 경로를 구상하였다.
본 발명에 따른 엑토인-생산 재조합 효모에 유전자 조작을 통해 도입된 이들 추가의 유전자 변화는 하기에 보다 상세히 명시된다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 피루베이트 키나제 1 (PYK1이라고도 함), 및 임의로 또한 피루베이트 키나제 2 (PYK2라고도 함)를 과소발현하도록 도입된다. 이들 실시형태의 일부에서, PYK1은 약 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 유전자를 배치시켜 과소발현될 수 있다. 이들 실시형태의 일부에서, PYK2는 예를 들어, 단절 또는 결실에 의해 불활성화될 수 있다. 이들 실시형태의 일부에서, PYK1 유전자는 과소발현되기 보다는 결실될 수 있다. 이들 실시형태의 일부에서, PYK1 유전자 및 PYK2 유전자는 과소발현되기 보다는 결실될 수 있다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 [ATP] (PCK 또는 PCKA 또는 PEPCK라고도 함)를, (i) 항상성 과발현 또는 (ii) 유도성 과발현에 의해 과발현하도록 도입된다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 세포질에서, 말레이트 디히드로게나제, 예컨대 퍼옥시좀 말레이트 디히드로게나제 (MDH3이라고도 함)를, (i) 항상성 과발현 또는 (ii) 유도성 과발현에 의해 과발현하도록 도입된다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 NADP-의존적 말산 효소 3 (ME3 또는 NADP-ME3이라고도 함)를, (i) 항상성 과발현 또는 (ii) 유도성 과발현에 의해 과발현하도록 도입된다.
이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 하나 이상의 알콜 디히드로게나제(들), 바람직하게는 알콜 디히드로게나제 1 (ADH1이라고도 함), 알콜 디히드로게나제 3 (ADH3이라고도 함), 알콜 디히드로게나제 4 (ADH4라고도 함) 및 알콜 디히드로게나제 5 (ADH5라고도 함)를 포함하는 군에서 선택되는 하나 이상의 알콜 디히드로게나제(들)의 발현을, 예를 들어 (i) 약 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 상응하는 코딩 서열을 배치시키거나, 또는 (ii) 상기 알콜 디히드로게나제(들)의 탈안정화된 형태의 생산에 의해서 감소시키도록 도입된다.
여전히 이들 실시형태에 따라서, 유전자 변화는 외생성 아세트알데히드 디히드로게나제 (MHPF라고도 함)를, (i) 항상성 과발현 또는 (ii) 유도성 과발현에 의해 과발현하도록 도입된다.
포스포에놀피루베이트 카복시키나제 (PPCK)
포스포에놀 카복시키나제 [ATP] 효소는 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 옥살로아세테이트 간 직접 포스포릴 전달을 통해 포스포에놀피루베이트로 옥살로아세테이트의 전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
포스포에놀 카복시키나제 [ATP]의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Bazaes S. et al. (2007) The Protein Journal, 26, 265-269] 및 [Mariet J. Van der Werf et al. (1997) Arch Microbiol 167: 332-342]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 포스포에놀 카복시키나제 [ATP]는 n°4.1.1.49의 EC 번호를 갖는 효소이다.
포스포에놀 카복시키나제 [ATP] (PCKA라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_417862를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NC_000913으로 개시된 것을 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 포스포에놀 카복시키나제는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 PPCK 예컨대 n°4.1.1.32의 EC 번호를 갖는 PEPCK로부터 선택될 수 있다.
말레이트 디히드로게나제
말레이트 디히드로게나제 효소는 NADH의 존재 하에서, 옥살로아세테이트로 말레이트의 전환을 촉매하기 위한 것으로 당분야에서 설명되는 단백질이다.
말레이트 디히드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다. 예를 들어, MAK196-1KT의 참조 번호 하에 "말레이트 디히드로게나제 어세이 키트"의 명칭으로 Sigma에서 판매하는 상업적 키트를 언급할 수 있다.
말레이트 디히드로게나제 (MDH3이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_010205를 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_00118037을 언급할 수 있다.
NADP-의존적 말산 효소 3
NADP-의존적 말산 효소 3 효소는 NADP의 존재 하에, 피루베이트로 말레이트의 전환을 촉매하기 위해 당분야에서 설명되는 단백질이다.
NADP-의존적 말산 효소 3의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당업자는 유리하게 [Gerrard-Wheeler et al. FEBS Journal 276 (2009) 5665-5677]에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 NADP-의존적 말산 효소 3은 n°1.1.1.40의 EC 번호를 갖는 효소이다.
NADP-의존적 말산 효소 3 (NADP-ME3 또는 ME3이라고도 함)의 아미노산 서열의 경우, UniProt 데이타베이스의 수탁 번호 NP_197960을 언급할 수 있다. 핵산 서열의 경우, NCBI 데이타베이스의 수탁 번호 NM_122489를 언급할 수 있다.
알콜 디히드로게나제 1, 알콜 디히드로게나제 3, 알콜 디히드로게나제 4, 알콜 디히드로게나제 5 및 아세트알데히드 디히드로게나제는 상기 본 명세서에서 언급한 바와 같다.
프로모터
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모를 수득하기 위해 유전자 조작된 관심 유전자의 발현은 사카로마이세스 세레비지아를 포함한, 효모 세포에서 기능성인 적절한 조절 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, (i) 항상성 강력 프로모터 (본 명세서에서 강력 프로모터라고 함), (ii) 항상성 약 프로모터 (본 명세서에서 약 프로모터라고 함) 및 (iii) 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는, 다양한 프로모터가 관심 코딩 서열의 바람직한 발현을 위해 사용될 수 있다. 상이한 배지 중에서 그들의 상대적 활성에 따른 효모 프로모터의 목록은 [Keren et al. (2013) Molecular Systems Biology 9:701]에서 확인할 수 있다.
소정 유전자의 항상성 과발현을 허용하는 프로모터는 문헌 [Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251]에서 확인할 수있다.
본 발명에서 보다 특히 흥미로운 강력 프로모터는 다음을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다:
· pTDH3 (SEQ ID NO: 24),
· pENO2 (SEQ ID NO: 25),
· pTEF KI (SEQ ID NO: 26),
· pTEF3 (SEQ ID NO: 27),
· pTEF1 (SEQ ID NO: 28),
· pADH1 (SEQ ID NO: 29),
· pGMP1 (SEQ ID NO: 30),
· pFBA1 (SEQ ID NO: 31),
· pPDC1 (SEQ ID NO: 32),
· pCCW12 (SEQ ID NO: 33), 및
· pGK1 (SEQ ID NO: 34).
특정한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 강력 프로모터는, 독립적으로, pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 및 pGK1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 보다 특히 흥미로운 약 프로모터는 다음을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다:
· pURA3 (SEQ ID NO: 36),
· pRPLA1 (SEQ ID NO: 37),
· pNUP57 (SEQ ID NO: 119), 및
· pGAP1 (SEQ ID NO: 120).
특정한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 약 프로모터는, 독립적으로, pURA3, pRPLA1, pNUP57 및 pGAP1로 이루어진 군으로부터 선택된다.
앞서 언급된 바와 같이, 유도성 또는 억제성 프로모터는 그의 활성이 생물 또는 무생물 인자의 존재 또는 부재, 및 상기 인자의 분량에 의해 제어되는 프로모터이다. 따라서, 일부 프로모터의 경우, 그들 활성은 특히 소정 인자의 분량이 증가하거나 또는 증가될 때 유도되고 그에 따라 증가될 것이며, 따라서, 이들 동일 프로모터의 활성은 상기 인자의 분량이 저하 또는 감소될 때 억제될 수 있고 그에 따라 감소될 수 있다. 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 본 발명의 재조합 효모의 배양 배지 중 상기 인자(들)의 분량은 당업자가 결정할 수 있으며 그에 따라 제어할 수 있다.
예를 들어, pSAM4 프로모터를 포함하는 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 배지 중 메티오닌의 분량 증가는 이 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 전사를 유도하게 되고 그에 따라 증가시킬 것이다. 반대로, 상기 배양 배지 중 메티오닌의 분량 감소는 이 프로모터 제어 하의 유전자의 전사의 억제를 야기시키게 되고, 그에 따라 감소시킬 것이다.
다른 예에서, pCTR1 프로모터를 포함하는 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 배지 중 구리의 분량 증가는 이 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 전사를 억제하게 되고 그에 따라 감소시킬 것이다. 반대로, 상기 배양 배지 중 구리의 분량 감소는 이 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 전사의 유도를 야기시키게 되고, 그리하여 증가시킬 것이다.
이러한 이유로, 다음의 프로모터는 본 명세서에서 "유도성 또는 억제성 프로모터"라고 언급된다.
제1 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터 및 트레오닌 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있고, 특히 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· pSAM4 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 38),
· pCUP1-1 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 39),
· pCUP1.cgla - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 40),
· pCUP1.sba - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 41),
· pACU1 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 42),
· pACU2 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 43),
· pACU3p - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 44),
· pACU4p - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 45),
· pACU5 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 46),
· pACU6 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 47),
· pACU7 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 48),
· pACU8 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 49),
· pACU9 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 50),
· pACU10p - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 51),
· pACU11 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO:52),
· pACU12 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 53),
· pACU13 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 54),
· pACU14 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 55),
· pACU15 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 56),
· pGAL/CUP1p - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 57),
· pCRS5 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 58), 및
· pCHA1 - 트레오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 59).
이 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 특히, 독립적으로, pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, 및 pCHA1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 이들 프로모터의 활성은 상기에 언급된 바와 같이, 메티오닌, 구리 또는 트레오닌의 증가된 존재에 의해 유도되고, 그들 활성은 메티오닌, 구리 또는 트레오닌의 분량이 감소될 때, 저하, 즉 억제된다.
제2 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 리신 유도성 또는 억제성 프로모터 및 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있고, 특히 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
· pCTR1 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 60),
· pCTR3 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 61),
· pCUR1 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 62),
· pCUR2 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 63),
· pCUR3 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 64),
· pCUR4 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 65),
· pCUR5p - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 66),
· pCUR6 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 67),
· pCUR7 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 68),
· pCUR8 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 69),
· pCUR9 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 70),
· pCUR10 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 71),
· pCUR11 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 72),
· pCUR12 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 73),
· pCUR13 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 74),
· pCUR14 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 75),
· pCUR15 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 76),
· pCUR16 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 77),
· pCUR17 - 구리 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 78),
· pLYS1 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 79),
· pLYS4 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 80),
· pLYS9 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 81),
· pLYR1p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 82),
· pLYR2p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 83),
· pLYR3p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 84),
· pLYR4p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 85),
· pLYR5p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 86),
· pLYR6p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 87),
· pLYR7p - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 88),
· pLYR8 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 89),
· pLYR9 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 90),
· pLYR10 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 91),
· pLYR11 - 리신 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 92),
· pMET17 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 93),
· pMET6 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 94),
· pMET14 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 95),
· pMET3 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 96),
· pSAM1 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 97),
· pSAM2 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 98),
· pMDH2 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 35),
· pJEN1 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 118),
· pICL1 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 119),
· pADH2 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 120), 및
· pMLS1 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (SEQ ID NO: 121).
특정한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는, 독립적으로, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 및 pMLS1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서 이들 프로모터의 활성은 상기에 언급된 바와 같이, 메티오닌, 구리, 리신 또는 글루코스의 증가된 존재에 의해 억제되고, 그들 활성은 메티오닌, 구리, 리신 또는 글루코스의 분량이 감소될 때 증가, 즉 유도된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 글루코스 유도성 또는 억제성 프로모터, 리신 유도성 또는 억제성 프로모터, 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터 및 트레오닌 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
보다 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는, 독립적으로, pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 및 pMLS1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
보다 특히, 동일하거나 또는 상이한, 상기 프로모터는 바람직하게 SEQ　ID　NO: 24 내지 98 및 116-121과 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산의 서열을 특징으로 할 수 있다.
[Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58]에 기술된 바와 같은 합성 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 강, 약, 및 유도성 또는 억제성 프로모터는 사카로마이세테스 강 유래의 임의 유기체로부터 기원할 수 있고, 특히, 독립적으로 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 불라르디 (Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 카스텔리 (Saccharomyces castelii), 사카로마이세스 바야너스 (Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 아르보리콜라 (Saccharomyces arboricola), 사카로마이세스 쿠드리아브제비 (Saccharomyces kudriavzevii), 아쉬비아 고시피 (Ashbya gossypii), 클루베로마이세스 락티스 (Kluveromyces lactis), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 데바리오마이세스 카스텔리 (Debaryomyces castelii), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolitica) 및 사이버린드네라 자디니 (Cyberlindnera jadinii)로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체로부터 기원할 수 있다.
본 발명의 강, 약, 및 유도성 또는 억제성 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아, 사카로마이세스 카스텔리, 사카로마이세스 바야너스, 사카로마이세스 아르보리콜라, 사카로마이세스 쿠드리아브제비 및 클루베로마이세스 락티스로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원될 수 있다.
종결인자
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모를 수득하기 위해 유전자 조작된 관심 유전자의 발현은 사카로마이세스 세레비지아를 포함하여, 효모에서 기능성인 적절한 전사 종결인자 서열을 포함한다.
동일하거나 또는 상이한, 상기 전사 종결인자는 문헌 [Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347]에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 보다 특히 흥미로운 종결인자는 다음을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다:
· 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 이소자임 2를 코딩하는 유전자 유래 tTDH2 (TDH2 유전자 = 서열 SEQ ID NO: 99),
· tCYC1 (= 서열 SEQ ID NO: 100),
· tTDH3 (= 서열 SEQ ID NO: 101), 및
· 알콜 디히드로게나제를 코딩하는 유전자 유래 tADH1 (ADH1 유전자 = 서열 SEQ ID NO: 102),
· 알콜 디히드로게나제를 코딩하는 유전자 유래 tADH2 (ADH2 유전자 = 서열 SEQ ID NO: 103),
· 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 유래 tTPI1 (TPI1　유전자 = 서열 SEQ ID NO: 104),
· O-아세틸 호모세린-O-아세틸 세린 술프히드릴라제를 코딩하는 유전자 유래 tMET17 (Met17 유전자 = 서열 SEQ ID NO: 105),
· 에놀라제 II를 코딩하는 유전자 유래 tENO2 (ENO2 유전자 = 서열 SEQ　ID　NO: 106),
· tMET3 (= 서열 SEQ ID NO: 107), 및
· 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 유전자 유래 tPGK1 (PGK1　유전자 = 서열 SEQ ID NO: 108),
· tDIT1 (= 서열 SEQ ID NO: 109)
· tRPL3 (= 서열 SEQ ID NO: 110)
· tRPL41B (= 서열 SEQ ID NO: 111)
· tRPL15A (= 서열 SEQ ID NO: 112)
· tIDP1 (= 서열 SEQ ID NO: 113).
보다 특히, 동일하거나 또는 상이한, 상기 종결인자는 바람직하게 서열 SEQ　ID　NO: 99 내지 113와 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산의 서열을 특징으로 할 수 있다.
재조합 효모
일반적으로, 효모는 신속하게 성장할 수 있고 박테리아와 비교하여 더 높은 밀도로 배양될 수 있으며, 산업 환경에서 무균 환경을 필요로 하지 않는다. 뿐만아니라, 효모 세포는 박테리아 세포와 비교하여 배양 배지로부터 보다 쉽게 분리할 수 있어서, 생성물 추출 및 정제 과정을 상당히 단순하게 할 수 있다.
우선적으로, 본 발명의 효모는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 칸디다 (Candida), 아시비아 (Ashbya), 덱케라 (Dekkera), 피키아 (Pichia)(한세눌라 (Hansenula)), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 클라비스포라 (Clavispora), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 야로위아 (Yarrowia), 지고사카로마이세스 (Zigosaccharomyces), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 토룰라스포라 (Torulaspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 브레타노마이세스 (Brettanomycces), 크립토코커스 (Cryptococcus) 또는 말라세지아 (Malassezia) 속 중에서 선택될 수 있다.
보다 우선적으로, 효모는 사카로마이세스, 덱케라, 스키조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 토룰라스포라, 지고사카로마이세스 또는 브레타노마이세스 속의 크랩트리 양성 효모일 수 있다.
보다 우선적으로, 효모는 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 불라르디 (Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 도우글라시 (Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 바야너스 (Saccharomyces bayanus), 지고사카로마이세스 바일리 (Zigosaccharomyces bailii), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 덱케라 브루셀렌시스 (Dekkera brucelensis), 데케라 인테르메디아 (Dekkera intermedia), 브레타노마이세스 쿠스테르시 (Brettanomycces custersii), 브레타노마이세스 인테르메디우스 (Brettanomycces intermedius), 클루이베로마이세스 써모톨레렌스 (Kluyveromyces themotolerens), 토룰라스포라 글로보사 (Torulaspora globosa) 또는 토룰라스포라 글라브라타 (Torulaspora glabrata)의 종으로부터 선택될 수 있다.
보다 우선적으로, 재조합 효모는 사카로마이세스 속, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아 종에 속할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모는 본 명세서에 개시된 것들로부터 선택된 적어도 하나의 DNA 구성체(들)의 삽입에 의해 감소되는 피루베이트 디카복실라제 활성을 갖는다.
유전자 내에 특별한 DNA 구성체를 삽입시키기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다. 관련 방법은 이하 본 명세서의 실시예에서 더욱 상세히 기술한다.
배양 조건
본 발명은 또한 엑토인의 제조를 위한, 상기 정의된 바와 같은 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 엑토인의 제조 방법에 관한 것으로서, 방법은
- 이전에 기술된 바와 같은 재조합 미생물을 제공하고, 재조합 미생물을 탄소원을 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 단계, 및
- 엑토인을 회수하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 미생물은 적절한 배양 배지 중에서, 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도, 바람직하게 27℃ 내지 34℃ 범위의 온도에서 성장된다.
본 발명에 따른 재조합 효모가 에스. 세레비지아 종에 속할 때, 온도는 적절한 배양 배지에서, 유리하게 27℃ 내지 34℃ 범위일 수 있다.
효모에 적합한 성장 배지는 일반적으로 상업적으로 제조된 배지 예컨대 효모 질소 염기, 암모늄 술페이트 및 탄소/에너지원으로서 덱스트로스를 포함하는 액체배지 또는 YPD 배지, 최대 성장을 위한 최적 비율의 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스의 블렌드가 있다. 다른 제한 또는 합성 성장 배지가 역시 사용될 수 있고 특정한 미생물의 성장을 위한 적절한 배지는 미생물 또는 발효 과학의 당업자가 알게 될 것이다.
용어 "적절한 배양 배지"는 상기에 정의되어 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모를 위해 공지된 배양 배지의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 다음의 공개물 [D. Burke et al., Methods in Yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)]에 제시되어있다.
발효에 적합한 pH 범위는 pH 3.0 내지 pH 7.5일 수 있고, 초기 조건으로서 pH 4.5 내지 pH 6.5가 바람직하다.
발효는 호기성 조건 또는 미호기성 조건 하에서 수행될 수 있다.
발효 배지 중 생성물의 양은 당분야에 공지된 다수의 방법들, 예를 들어 고성능 액상 크로마토그래피 (HPLC) 또는 가스 크로마토그래피 (GC)를 사용해 결정될 수 있다.
본 방법은 회분식 발효 방법을 적용할 수 있다. 고전적인 회분식 발효는 배지의 조성물이 발효의 시작시에 설정되어 발효 동안 인공적 변경을 겪지않는 폐쇄형 시스템이다. 따라서, 발효의 시작 시에, 배지는 바람직한 유기체 또는 유기체들로 접종되고, 발효는 시스템에 아무것도 첨가하지 않고 일어나게 허용한다. 그러나, 전형적으로, "회분식" 발효는 탄소원의 첨가에 대해 회분식이고 종종 온도, pH 및 산소 농도와 같은 인자의 제어가 시도된다. 회분식 시스템에서, 시스템의 대사산물 및 생물량 조성물은 발효가 중지되는 시점까지 끊임없이 변화된다. 회분식 배양물 내에서, 세포는 정적 지연기를 통해서 고성장의 대수기 및 최종적으로 성장률이 저하 또는 중단되는 정체기까지 진행된다. 미처리되면, 정체기의 세포는 궁극적으로 사멸될 것이다. 대수기의 세포는 일반적으로 최종 생성물 또는 중간체의 대량 생산을 담당한다.
유가식 시스템이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 유가식 시스템은 탄소원 기질이 발효가 진행되면서 증분량으로 첨가되는 것을 제외하고 전형적인 회분식 시스템과 유사하다. 유가식 시스템은 이화산물 억제 (예를 들어, 글루코스 억제)가 세포의 물질대사를 억제하는 경향이 있을 때, 그리고 배지 중에 제한된 양으로 기질을 갖는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도의 측정은 어렵고, 그러므로 pH, 용존 산소 및 폐가스 예컨대 CO2의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화를 기반으로 평가된다.
발효는 당분야에서 일반적이고 충분히 공지되어 있으며 그 예는 본 명세서에 참조로 편입된 [Sunderland et al., (1992)]에서 확인할 수 있다. 본 발명은 회분식 방식으로 수행되지만, 방법은 연속 발효에 적합화되는 것을 고려한다.
연속 발효는 한정된 배양 배지가 생물반응기에 연속적으로 첨가되고 동일량의 조건화 배지는 프로세싱을 위해 동시에 제거되는 개방형 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로 배양물을 일정하게 고밀도로 유지시키고 여기서 세포는 주로 대수기 성장된다.
연속 발효는 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의수의 인자의 조절을 가능하게 한다. 예를 들어, 한 방법은 제한 영양분 예컨대 탄소원 또는 질소 수준을 고정된 비율로 유지시키게 되고 모든 다른 매개변수는 가변적이게 할 수 있다. 다른 시스템에서 성장에 영향을 미치는 다수의 인자는 연속적으로 변경시킬 수 있는 한편 배지 혼탁도로 측정된 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하려고 노력하며, 그에 따라 배지 배출로 인한 세포 손실은 발효되는 세포 성장 속도에 대해 균형을 유지해야만 한다. 연속 발효 과정을 위해 영양분 및 성장 인자를 조절하는 방법을 비롯하여 생성물 형성 속도를 최대화하기 위한 기술은 산업 미생물 분야에서 충분히 공지되어 있다.
본 발명은 회분식, 유가식 또는 연속식 과정을 사용해 실시될 수 있고 임의의 공지된 발효 방식이 적합할 수 있다는 것을 고려한다. 추가적으로, 세포는 전체 세포 촉매로서 기질 상에 고정될 수 있고 생산을 위한 발효 조건이 가해질 수 있다는 것을 고려한다.
여전히 엑토인 생산을 개선시키기 위해서, 특정한 실시형태는 재조합 효모 세포를 상기 언급된 바와 같은 적절한 배양 배지에서 배양시키는 단계로 이루어지고, 여기서 상기 배양 배지는 최적량의 탄소원, 특히 글루코스를 포함한다.
바람직하게, 세포는 전체 배양 지속기간의 오직 일부분 동안만 이러한 최적 배양 배지에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 효모 세포는 배양 개시 후 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간 또는 16시간 또는 그 이상을 포괄하여, 배양의 개시 후에 10시간 또는 그 이상 상기 최적 배양 배지에서 인큐베이션된다.
바람직하게, 세포는 배양 개시 후 6시간 내지 10시간, 예를 들어 8시간을 포함하여, 5시간 내지 15시간 범위의 기간 동안 이러한 최적 배양 배지에서 배양된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 최적 배양 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스로 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 상기 최적 배양 배지는 15% w/w 이상의 글루코스를 포함하여, 12% w/w 이상의 글루코스를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 최적 배양 배지는 35% w/w 이하의 글루코스를 포함하여, 40% w/w 이하의 글루코스를 포함한다.
따라서, 상기 기술된 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 엑토인을 제조하기 위한 방법은 단계 (a) 및 (c)사이에, 효모 세포를 상기 최적 배양 배지에서 배양시키는 단계로 이루어진 중간 단계 (b)를 더 포함할 수 있다.
엑토인의 정제
본 발명의 특별한 양상에 따라서, 엑토인의 발효 생산은 배양 배지로부터 엑토인의 단리 단계를 포함한다. 배양 배지로부터 엑토인을 회수하는 단계는 당업자에게는 통상적인 작업이다. 이것은 제한없이 증류, 가스-스트리핑, 투과증발법, 선택 침전법 또는 액체 추출법을 포함하는 당분야에 충분히 공지된 많은 기술을 통해 달성될 수 있다. 당분야의 전문가는 분리시키려는 물질의 특징에 따라서 각 기술의 매개변수를 적합화시키는 방법을 알고 있다.
본 발명에서 미생물의 모델로서 효모는 합성된 엑토인이 전체적으로 세포 밖으로 이출되게 유지시켰고, 따라서 정제 과정을 단순화시켰다.
합성된 엑토인은 증류를 통해서 수집될 수 있다. 증류는 특히 물과 공비혼합물을 형성하여 엑토인의 단리를 촉진하기 위해서 배양 배지와 상이한 선택 성분을 포함할 수 있다. 이러한 선택 성분은 유기 용매 예컨대 시클로헥산, 펜탄, 부탄올, 벤젠, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 옥탄, 디에틸에테르 또는 이의 혼합물이다.
가스 스트립핑은 헬륨, 아르곤, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 이의 혼합물 중에서 선택된 스트립핑 가스를 사용해 달성된다.
액체 추출은 소수성층으로서 유기 용매 예컨대 펜탄, 헥산, 헵탄 또는 도데칸으로 달성된다.
용어 "... 내지 ..." 및 "... 내지 ... 범위"는 달리 명시하지 않으면, 한계치를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 암시적인 제한없이 예시로 제시된다.
실시예
실시예 1: 본 발명에 따른 재조합 사카로마이세스 세레비지아 균주의 제조를 위한 프로토콜
모든 하기에 제공되는 재조합 사카로마이세스 세레비지아 균주는 표준 효모 분자 유전학 절차 (Methods in Yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press)를 사용하여 표준 균주로부터 제작되었다.
하기 언급된 유전자의 클러스터는 서열 상동성을 갖는 자유 DNA 말단을 효율적으로 재조합시키는 효모의 능력을 사용하여 한번에 재조합 효모에 통합시켰다.
또한, 하기 유전자형의 보다 나은 이해를 위해서,
- ade2, his3, leu2, trp1 및 ura3은 영양요구성 마커 유전자이다.
- 소문자는 고려되는 유전자가 불활성임을 의미하고, 대문자는 활성 유전자를 의미한다.
- "::": 유전자 명칭에 뒤따르면 그 유전자는 그 후속된 것이 단절된 것을 의미한다 (하나 초과의 유전자가 삽입되면, 그들은 괄호 [] 표시됨). 유전자의 단절은 코딩 서열의 전체 결실을 수반하지만 프로모터는 보존된다. 결론적으로, "::"가 후속되는 유전자는 불활성이고 소문자로 표시된다. 명시되지 않으면 삽입된 유전자의 전사는 파괴된 유전자의 프로모터에 의해 제어된다.
- "유전자.Kl"은 유전자가 클루이베로마이세스 락티스로부터 기원된다는 것을 의미한다.
보다 특히, 클로닝되는 코딩 서열은 인공적으로 합성되었다. 이종성 서열 (비효모)의 경우, 핵산 서열은 효모 코돈 용법을 사용하여 동의 코딩 서열을 수득하기 위해 변형되었다. 제한 효소 및 고전적인 클로닝 기술을 사용하여, 각 합성 서열을 전사 프로모터와 전사 종결인자 사이에 클로닝하였다. 각각의 프로모터 서열은 상류 유전자의 종결인자 서열과 상동성인 50 내지 200개 뉴클레오티드 서열이 선행된다. 유사하게, 각 유전자 (프로모터-코딩 서열-종결인자를 포함하는 유전자)의 종결인자는 바로 뒤에 후속되는 유전자와 상동성인 서열이 후속된다. 그래서 통합되는 각각의 유닛은 상류 유닛 및 하류 유닛 둘 모두와 중복되는 50개 내지 200개 뉴클레오티드를 갖는다. 제1 유닛의 경우, 프로모터는 통합될 유전자좌에 대한 효모 염색체 뉴클레오티드와 상동성인 50개 내지 200개 뉴클레오티드가 선행된다. 유사하게, 마지막 유닛의 경우, 종결인자는 통합될 유전자좌에 대한 효모 염색체 뉴클레오티드와 상동성인 50개 내지 200개 뉴클레오티드가 후속된다.
그 다음으로 각 유닛은 플라스미드 구성체로부터 PCR 증폭되어 중복된 서열을 갖는 선형 DNA의 X 유닛을 산출한다. 이들 유전자 중 적어도 하나는 재조합 사건에 대한 선별을 위해, 영양요구성 마커이다. 모든 선형 단편은 한번에 효모를 형질전환시키고, 재조합 효모는 사용된 마커와 관련된 영양요구성에 대해 선별된다. 그 다음으로 서열의 무결성은 PCR 및 시퀀싱으로 검증된다.
실시예 2: 엑토인 생산의 비교예
A. 먼저, 2종의 재조합 균주: YA3370-20 및 YA3371-46을 수득한다. 이들 2종 균주는 오직 본 발명에 따른 변형의 일부를 포함하기 위해 재조합되었다.
따라서, 이들 2종의 균주는 다음과 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
PEPCK-1은 글리신으로 위치 2의 아르기닌 아미노산의 변형을 통해 안정화된 PEPCK의 형태이다.
PPC-5는 알라닌이 N+1로 첨가된 PPC의 보다 안정된 형태이다.
모든 이들 균주는 24시간 동안 YE (효모 추출물 (Yeast Extract)) 2% 및 글루코스 8%에서 성장시켰고, 500 μM의 CuSO4 는 8시간 후에 첨가되었다. 배지 중 엑토인의 함량은 24시간 후에 제조사의 조언에 따라서 Waters의 AccQ-Tag Ultra Derivatization 키트를 사용하여 아미노산 결정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법을 사용해 어세이하였다.
이들 상이한 균주로 수득된 엑토인의 양은 각각 다음과 같다:
- YA3370-20: 1 g/L-1.
- YA3371-46: 1.55 g/L-1.
비교하여, 천연 균주는 엑토인을 생산하지 않는다.
이러한 비교 실험의 결과로서, 본 발명에 따른 변형을 포함하는 재조합 균주는 본 발명에 따른 모든 유전자 변형을 포함하지 않는 다른 재조합 균주와 동일 조건에서 배양시 더 많은 양의 엑토인을 생산한다.
B. 5종의 다른 재조합 균주: YA3380-40B, YA3595-25 및 YA3595-34가 또한 수득되었다.
이들 3종의 균주는 다음과 같다:
Figure pct00003
Figure pct00004
균주 YA3380-40B 및 YA3595-25는 24시간 동안 YPA 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 0.01% 아데닌 헤미술페이트), 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50 mM, 및 메티오닌 0.5 mM 및 트레오닌 0.85 mM에서 성장시켰다. 배지 중 엑토인의 함량은 24시간 후에 제조사의 조언에 따라 Waters의 AccQ-Tag Ultra Derivatization 키트를 사용하여 아미노산 결정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법을 사용해 어세이하였다.
PEPCK-1은 글리신으로 위치 2의 아르기닌 아미노산의 변형을 통해 안정화된 PEPCK의 형태이다.
이들 2종 균주로 수득된 엑토인의 양은 각각 다음과 같다:
- YA3380-40B: 211 mg/L-1.
- YA3595-25: 1.29 g/L-1.
비교하여, 천연 균주는 엑토인을 생산하지 않는다.
균주 YA3595-34를 비롯하여 균주 YA3595-25는 24시간 동안 YPA 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 0.01% 아데닌 헤미술페이트), 사카로스 8%, (NH4)2SO4 50 mM, 및 메티오닌 0.5 mM 및 트레오닌 0.85 mM에서 성장시켰다. 배지 중 엑토인의 함량은 24시간 후에 제조사의 조언에 따라 AccQ-Tag Ultra Derivatization 키트를 사용하여 아미노산 결정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법을 사용해 어세이하였다.
이들 2종 균주로부터 수득된 엑토인의 양은 각각 다음과 같다:
- YA3595-25: 2.63 g/L-1.
- YA3595-34: 2.58 g/L-1.
비교시에, 천연 균주는 엑토인을 생산하지 않는다.
이러한 비교 실험으로부터, 본 발명에 따른 변형을 포함하는 재조합 균주는 본 발명에 따른 모든 유전자 변형을 포함하지 않는 다른 재조합 균주와 동일 조건 하에서 배양했을 때 더 많은 양의 엑토인을 생산하는 결과를 얻었다.
C. 3종의 다른 재조합 균주: YA4440, YA4442 및 YA4444가 또한 수득되었다.
이들 3종 균주는 다음과 같다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
GDH1 및 GDH2는 내생성 사카로마이세스 세레비지아 효소인 반면, GDH2.Eca는 엔토디미움 카우다텀 유래 GDH 효소이다.
이들 균주는 엘렌메이어 플라스크에서 28℃로 16시간 동안 효모 추출물 2%, 수크로스 8%, 메티오닌 0.5 mM, 트레오닌 4.2 mM, 우레아 50 mM, 비타민 B5 4 μM, 비타민 B1 6 μM, 비타민 B6 10 μM, 비타민 B10 1.5 μM, 비타민 B3 2.9 μM, 비타민 B2 0.5μM, 비타민 B8 0.08 μM, 비타민 B9 4.5 nM, CuSO4 500 μM 중에서 성장시켰다. 16시간 후에, 500 μM의 CuSO4 및 우레아 100 mM을 첨가하였고 배양물을 추가 8시간 동안 성장시켰다.
이어서, 엑토인 생산은 엑토인을 HPLC-UV로 검출한 것을 제외하고 [Ono H, et al. (1999) Journal of Bacteriology, p, 91-99]에 기술된 대로 본질적으로 평가하였다.
이러한 조건 하에서, YA4440는 6.4 g/L의 엑토인을 생산하였고, YA4442는 4.7 g/L의 엑토인을 생산하였으며, YA4444는 6.1 g/L의 엑토인을 생산하였다. 이들 동일 조건 하에서, 야생형 균주 (예를 들어, 비재조합체)는 검출가능한 양의 엑토인을 생산하지 않는다는 것을 상기한다.
이들 3종 균주는 동일하지만 GDH 효소를 과발현한다. 상기 결과는 NADH 의존적 GDH (YA4440의 경우 GDH2 및 YA4444의 경우 GDH2.Eca)의 과발현이 NADPH 의존적 GDH (YA4442의 경우 GDH1)의 과발현에 비해 더 많은 엑토인의 생산을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
따라서, NADH 의존적 글루타메이트 디히드로게나제의 과발현은 NADPH 의존적 글루타메이트 디히드로게나제 (GDH1)의 과발현에 비해 더 많은 엑토인의 생산을 가능하게 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ALDERYS <120> Ectoine-producing yeast <130> PR75767 <150> EP17305910 <151> 2017-07-11 <160> 121 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 1583 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTOKINASE (HOM3) <220> <223> ASPARTOKINASE (HOM3) <400> 1 atgccaatgg atttccaacc tacatcaagt cattcgaact gggtcgtgca aaagttcggt 60 ggtacatctg tcggtaaatt tcccgtccaa atagtggatg acattgtgaa gcactattct 120 aaacctgacg gcccaaacaa taatgtcgct gtcgtttgtt ccgcccgttc ttcatacacc 180 aaggctgaag gtaccacttc tcgtcttttg aaatgttgtg atttggcttc gcaagaatct 240 gaatttcaag acattatcga agttatcaga caagaccata tcgataatgc cgaccgcttc 300 attctcaatc ctgccttgca agccaagtta gtggatgata ccaataaaga acttgaactg 360 gtcaagaaat atttaaatgc ttcaaaagtt ttgggtgaag tgagttcacg tacagtagat 420 ctggtgatgt catgtggtga gaagttgagt tgtttgttca tgactgcttt atgtaatgac 480 cgtggctgta aggccaaata tgtggatttg agccacattg ttccctctga tttcagtgcc 540 agcgctttgg ataacagttt ctacactttc ctggttcaag cattgaaaga aaaattggcc 600 ccctttgtaa gtgctaaaga gcgtatcgtt ccagtcttta cagggttttt tggtttagtt 660 ccaactggtc ttctgaatgg tgttggtcgt ggctataccg atttatgtgc cgctttgata 720 gcagttgctg taaatgctga tgaactacaa gtttggaagg aagttgatgg tatatttact 780 gctgatcctc gtaaggttcc tgaagcacgt ttgctagaca gtgttactcc agaagaagct 840 tctgaattaa catattatgg ttccgaagtt atacatcctt ttacgatgga acaagttatt 900 agggctaaga ttcctattag aatcaagaat gttcaaaatc cattaggtaa cggtaccatt 960 atctacccag ataatgtagc aaagaagggt gaatctactc caccacatcc tcctgagaac 1020 ttatcctcat ctttctatga aaagagaaag agaggtgcca ctgctatcac caccaaaaat 1080 gacattttcg tcatcaacat tcattccaat aagaaaaccc tatcccatgg tttcctagct 1140 caaatattta ccatcctgga taagtacaag ttagtcgtag atttaatatc tacttctgaa 1200 gttcatgttt cgatggcttt gcccattcca gatgcagact cattaaaatc tctgagacaa 1260 gctgaggaaa aattgagaat tttaggttct gttgatatca caaagaagtt gtctattgtt 1320 tcattagttg gtaaacatat gaaacaatac atcggcattg ctggtaccat gtttactact 1380 cttgctgaag aaggcatcaa cattgaaatg atttctcaag gggcaaatga aataaacata 1440 tcctgcgtta tcaatgaatc tgactccata aaagcgctac aatgtattca tgccaagtta 1500 ctaagtgagc ggacaaatac ttcaaaccaa tttgaacatg ccattgatga acgtttagaa 1560 caattgaaaa gacttggaat taa 1583 <210> 2 <211> 526 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTOKINASE (HOM3) <220> <223> ASPARTOKINASE (HOM3) <400> 2 Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val Gln 1 5 10 15 Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val Asp 20 25 30 Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn Val 35 40 45 Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly Thr 50 55 60 Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser Glu 65 70 75 80 Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn Ala 85 90 95 Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp Asp 100 105 110 Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser Lys 115 120 125 Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser Cys 130 135 140 Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp Arg 145 150 155 160 Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser Asp 165 170 175 Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val Gln 180 185 190 Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg Ile 195 200 205 Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu Leu 210 215 220 Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile Ala 225 230 235 240 Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp Gly 245 250 255 Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp 260 265 270 Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu 275 280 285 Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile Pro 290 295 300 Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile Ile 305 310 315 320 Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His Pro 325 330 335 Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly Ala 340 345 350 Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His Ser 355 360 365 Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr Ile 370 375 380 Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu Val 385 390 395 400 His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys Ser 405 410 415 Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp Ile 420 425 430 Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys Gln 435 440 445 Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu Gly 450 455 460 Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile Ser 465 470 475 480 Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile His 485 490 495 Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu His 500 505 510 Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile 515 520 525 <210> 3 <211> 1215 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <223> ASPARTATE KINASE (AK) <220> <223> ASPARTATE KINASE (AK) <400> 3 atggctatta tcgtccaaaa attcggagga actagcgtta aggatgacaa agggagaaag 60 ttggccttag ggcacattaa ggaggcaatt tcagagggtt ataaggtggt tgtagttgta 120 tcggctatgg gtagaaaagg ggacccctac gcgacggact cactattggg tttactttac 180 ggggatcaat cagcaatcag cccaagagag caggatctgc tgctatcatg tggagaaacc 240 atatcctcgg ttgtgttcac cagcatgtta ttagataatg gagtaaaagc agcagccctg 300 acgggagccc aggctggttt tttaaccaac gatcagcata ctaatgcaaa aattatagag 360 atgaagcctg aacgtctttt cagtgttctt gcaaaccacg acgcagttgt cgtcgctgga 420 tttcagggcg ctaccgagaa aggagatact accacaatcg gtagaggtgg ctcggacacg 480 tcagctgcag ccctaggtgc tgctgttgat gcagagtaca tagatatctt tactgacgta 540 gaaggggtga tgaccgcaga tccaagagta gtagaaaatg caaagccact accagtggta 600 acttataccg aaatctgcaa cttggcttac caaggtgcta aggtaatatc tccaagagct 660 gtggaaattg ctatgcaagc aaaggttcct atccgtgtta ggagtactta ttcaaacgat 720 aaaggtacgt tagtaactag tcatcatagt tccaaagttg gctctgacgt ctttgaaagg 780 ttaatcactg gtatcgcaca tgttaaagac gtcactcaat tcaaggtccc ggcgaaaata 840 ggtcaatata acgttcaaac agaagtgttt aaagcgatgg cgaatgccgg tatatctgtc 900 gatttcttta atattacacc ctctgaaata gtatatacag tcgcgggtaa taagactgaa 960 acagctcaaa ggattttgat ggatatgggc tatgatccta tggtcacaag aaattgtgcc 1020 aaggtgtctg ccgtgggtgc tggcattatg ggtgtcccag gtgtgacatc gaaaattgtt 1080 tctgccttat ctgaaaaaga aattccgatt ttgcaatctg ctgattccca tacaacaatt 1140 tgggttttgg ttcatgaagc cgatatggtt cctgctgtta atgccttgca cgaagttttt 1200 gaattgtcca aataa 1215 <210> 4 <211> 404 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <220> <223> ASPARTATE KINASE (AK) <220> <223> ASPARTATE KINASE (AK) <400> 4 Met Ala Ile Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Lys Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Arg Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Lys Glu Ala Ile Ser Glu 20 25 30 Gly Tyr Lys Val Val Val Val Val Ser Ala Met Gly Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Leu Leu Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Gln Ser 50 55 60 Ala Ile Ser Pro Arg Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ser Cys Gly Glu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Val Phe Thr Ser Met Leu Leu Asp Asn Gly Val Lys 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Leu Thr Asn Asp Gln 100 105 110 His Thr Asn Ala Lys Ile Ile Glu Met Lys Pro Glu Arg Leu Phe Ser 115 120 125 Val Leu Ala Asn His Asp Ala Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Ala 130 135 140 Thr Glu Lys Gly Asp Thr Thr Thr Ile Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr 145 150 155 160 Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Asp Ala Glu Tyr Ile Asp Ile 165 170 175 Phe Thr Asp Val Glu Gly Val Met Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Glu 180 185 190 Asn Ala Lys Pro Leu Pro Val Val Thr Tyr Thr Glu Ile Cys Asn Leu 195 200 205 Ala Tyr Gln Gly Ala Lys Val Ile Ser Pro Arg Ala Val Glu Ile Ala 210 215 220 Met Gln Ala Lys Val Pro Ile Arg Val Arg Ser Thr Tyr Ser Asn Asp 225 230 235 240 Lys Gly Thr Leu Val Thr Ser His His Ser Ser Lys Val Gly Ser Asp 245 250 255 Val Phe Glu Arg Leu Ile Thr Gly Ile Ala His Val Lys Asp Val Thr 260 265 270 Gln Phe Lys Val Pro Ala Lys Ile Gly Gln Tyr Asn Val Gln Thr Glu 275 280 285 Val Phe Lys Ala Met Ala Asn Ala Gly Ile Ser Val Asp Phe Phe Asn 290 295 300 Ile Thr Pro Ser Glu Ile Val Tyr Thr Val Ala Gly Asn Lys Thr Glu 305 310 315 320 Thr Ala Gln Arg Ile Leu Met Asp Met Gly Tyr Asp Pro Met Val Thr 325 330 335 Arg Asn Cys Ala Lys Val Ser Ala Val Gly Ala Gly Ile Met Gly Val 340 345 350 Pro Gly Val Thr Ser Lys Ile Val Ser Ala Leu Ser Glu Lys Glu Ile 355 360 365 Pro Ile Leu Gln Ser Ala Asp Ser His Thr Thr Ile Trp Val Leu Val 370 375 380 His Glu Ala Asp Met Val Pro Ala Val Asn Ala Leu His Glu Val Phe 385 390 395 400 Glu Leu Ser Lys <210> 5 <211> 1098 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <400> 5 atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60 attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctcttctaga 120 tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180 tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240 gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300 ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360 gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420 gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480 ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540 actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatt 600 ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660 aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720 atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780 tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840 gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900 gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960 ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020 tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080 gcaagaaact tgatttaa 1098 <210> 6 <211> 1098 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <400> 6 atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60 attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctctgagaga 120 tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180 tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240 gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300 ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360 gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420 gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480 ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540 actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatc 600 ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660 aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720 atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780 tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840 gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900 gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960 ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020 tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080 gcaagaaact tgatttaa 1098 <210> 7 <211> 365 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <400> 7 Met Ala Gly Lys Lys Ile Ala Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Ser Val 1 5 10 15 Gly Gln Arg Phe Ile Leu Leu Leu Ala Asn His Pro His Phe Glu Leu 20 25 30 Lys Val Leu Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ala Gly Lys Lys Tyr Val Asp 35 40 45 Ala Val Asn Trp Lys Gln Thr Asp Leu Leu Pro Glu Ser Ala Thr Asp 50 55 60 Ile Ile Val Ser Glu Cys Lys Ser Glu Phe Phe Lys Glu Cys Asp Ile 65 70 75 80 Val Phe Ser Gly Leu Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Ala Ile Glu Lys Glu 85 90 95 Phe Met Glu Ala Gly Ile Ala Ile Val Ser Asn Ala Lys Asn Tyr Arg 100 105 110 Arg Glu Gln Asp Val Pro Leu Ile Val Pro Val Val Asn Pro Glu His 115 120 125 Leu Asp Ile Val Ala Gln Lys Leu Asp Thr Ala Lys Ala Gln Gly Lys 130 135 140 Pro Arg Pro Gly Phe Ile Ile Cys Ile Ser Asn Cys Ser Thr Ala Gly 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Leu Lys Pro Leu Ile Glu Lys Phe Gly Pro Ile Asp 165 170 175 Ala Leu Thr Thr Thr Thr Leu Gln Ala Ile Ser Gly Ala Gly Phe Ser 180 185 190 Pro Gly Val Pro Gly Ile Asp Ile Leu Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ile 195 200 205 Gly Gly Glu Glu Asp Lys Met Glu Trp Glu Thr Lys Lys Ile Leu Ala 210 215 220 Pro Leu Ala Glu Asp Lys Thr His Val Lys Leu Leu Thr Pro Glu Glu 225 230 235 240 Ile Lys Val Ser Ala Gln Cys Asn Arg Val Ala Val Ser Asp Gly His 245 250 255 Thr Glu Cys Ile Ser Leu Arg Phe Lys Asn Arg Pro Ala Pro Ser Val 260 265 270 Glu Gln Val Lys Thr Cys Leu Lys Glu Tyr Val Cys Asp Ala Tyr Lys 275 280 285 Leu Gly Cys His Ser Ala Pro Lys Gln Thr Ile His Val Leu Glu Gln 290 295 300 Pro Asp Arg Pro Gln Pro Arg Leu Asp Arg Asn Arg Asp Ser Gly Tyr 305 310 315 320 Gly Val Ser Val Gly Arg Ile Arg Glu Asp Pro Leu Leu Asp Phe Lys 325 330 335 Met Val Val Leu Ser His Asn Thr Ile Ile Gly Ala Ala Gly Ser Gly 340 345 350 Val Leu Ile Ala Glu Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ile 355 360 365 <210> 8 <211> 1413 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <220> <223> DIAMINOBUTYRATE AMINOTRANSFERASE (EctB) <220> <223> DIAMINOBUTYRATE AMINOTRANSFERASE (EctB) <400> 8 atggctcacg ttgctacatc agttatcgag gaccaaccct tacgcgccac tcccgcagaa 60 ggcgagactc tgtacgagtt ctcccaatct cctctcttag aacgtcagtc tcgccaagag 120 agcaatgctc gaagctatcc acgtagaata ccacttgcat taaagaaggc ccgaggtctg 180 ctagtggaag acgtcgaagg gaggactttc attgactgtc tcgccggtgc aggaacccta 240 gcattgggac ataatcaccc ggtagttata gaagccatta gacaggttct tgctgatgaa 300 ttgcccttgc acaccttaga tttgacgacc cctgtgaagg accaattcgt ccaggattta 360 tttgggttgc tcccacctgc tttggcagcg gaagccaaga tccaattctg tgggccaaca 420 ggaacagacg cagttgaggc cgctcttaag cttgtgcgga cggcgactgg ccgttctaca 480 atactaagtt ttcaaggagg atatcacgga atgtcccaag gtgcactggg cttgatgggc 540 aacctcggtc caaagaagcc attgggcgca gtactctcaa ccggcgtcca attcctccca 600 tacccgtacg attacagatg tccattcggt ctgggtggcg aagctggagt caaggcgaat 660 ctacattact tagaaaattt gctcaatgat cctgaaggag gtgtacaatt gccggccgct 720 gtcattgttg aagttgtaca aggcgaaggt ggggtcgtgc cagcagattt ggactggtta 780 cgaggattac gtaggattac tgagcaggcc ggtgtagccc ttattgtgga tgaaattcaa 840 tccggctttg cgcgtactgg tcggatgttc gcctttgagc atgccggcat cgtgcctgat 900 gtggtagtgc tttccaaagc tatcggtggc tccctccctt tagctgtggt cgtatatcgg 960 gaatggctag acaagtggca acctggggca catgctggaa ccttcagagg caatcagatg 1020 gcgatggcag ctggcagtgc agtcatgaga tacctaaaag agcatgatct ggcagcccat 1080 gcagccgcca tgggcgaacg actagctgag catctcagga tcttgcagag agactatccg 1140 cagttaggtg atatacgagg ccgcggctta atgttaggtg tcgagatagt agatccgcag 1200 ggcgaagctg acgctctagg tcatccaccc actgacggag ccctggcctc gcgggtacaa 1260 cgggaatgtt tgagaagagg tctcatattg gaattaggcg ggcgacacgg atctgttgta 1320 agattcttgc cacctttgat tattggggca gaacagatag acgaagtggc gcgtagattt 1380 gccagggcat taggagctgc ccttgctggg taa 1413 <210> 9 <211> 1266 <212> DNA <213> Halomonas elongata <220> <223> DIAMINOBUTYRATE AMINOTRANSFERASE (EctB) <220> <223> DIAMINOBUTYRATE AMINOTRANSFERASE (EctB) <400> 9 atgcagacac aaatcttgga acgtatggaa tccgacgtca gaacgtactc aagatctttc 60 cctgtagtct ttaccaaggc gcgaaatgct cgacttaccg acgaagaagg gcgagagtac 120 atagacttcc tagcaggcgc tggtacgcta aattatgggc ataacaatcc acacctgaag 180 caagcattac tcgactacat tgattcagac ggcattgtcc atggtctgga tttctggacc 240 gcggcaaagc gcgattacct tgagacactc gaagaggtca ttttgaaacc gcgtggtttg 300 gactataagg ttcacttacc gggcccaacg ggcaccaatg cagttgaagc cgccattcgt 360 ttggccaggg tcgccaaagg tcgtcataat attgtctctt ttacaaatgg ctttcacggt 420 gttactatgg gcgctctggc gacgaccggt aacagaaagt ttcgggaagc gacaggtggc 480 gtccctactc aggcagcgag cttcatgcca tttgacgggt atcttggctc ttccactgat 540 acacttgatt acttcgaaaa gttattgggt gataagtcag gtgggcttga tgtgccagcc 600 gcggtaatag ttgaaacagt ccaaggagaa ggcggaataa 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tgcgtctagg tgtggagaag 720 ctttcaacgg tctctcccgt ctttgtctgt cagtcctttg ccaagaacgc cggtatgtac 780 ggtgagcgtg taggttgttt ccatctagca cttacaaaac aagctcaaaa caaaactata 840 aagcctgctg ttacatctca attggccaaa atcattcgta gtgaagtgtc caacccaccc 900 gcctacggcg ctaagattgt cgctaaactg ttggaaacgc cagaattaac ggaacagtgg 960 cacaaggata tggttaccat gtcctccaga attacgaaaa tgaggcacgc attaagagac 1020 catttagtca agttgggcac tcctggcaac tgggatcata tagtaaatca atgcgggatg 1080 ttctccttta cagggttgac tcctcaaatg gttaaacgac ttgaagaaac ccacgcagtt 1140 tacttggttg cctcaggtag agcttctatt gctggattga atcaaggaaa cgtggaatac 1200 gtggctaaag ccattgatga agtggtgcgc ttctatacta ttgaagctaa attgtaa 1257 <210> 21 <211> 418 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTATE TRANSAMINASE (AAT2) <220> <223> ASPARTATE TRANSAMINASE (AAT2) <400> 21 Met Ser Ala Thr Leu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Pro Pro Asp Ala 1 5 10 15 Leu Phe Gly Ile Lys Gln Arg Tyr Gly Gln Asp Gln Arg Ala Thr Lys 20 25 30 Val Asp Leu Gly Ile Gly Ala Tyr Arg Asp 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pTEF3" <223> "pTEF3 <220> <223> pTEF3 <220> <223> pTEF3 <400> 27 ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat 60 atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt 120 ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca 180 cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc 240 cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc 300 ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc 360 ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt 420 gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa 480 taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt 540 ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaa 598 <210> 28 <211> 383 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pTEF1" <223> "pTEF1 <220> <223> pTEF1 <220> <223> pTEF1 <400> 28 gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 60 ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca 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pCUP1.Sba <220> <223> pCUP1.Sba <400> 41 agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta 60 tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg 120 acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat 180 tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga 240 tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc 300 aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc 360 tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc 420 ataaa 425 <210> 42 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pACU1" <223> "pACU1 <220> <223> pACU1 <220> <223> pACU1 <400> 42 ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt 60 tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag 120 atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt 180 aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt 240 ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta 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caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca 300 cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct 360 cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt 420 aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt 480 gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa 540 agtataatta ac 552 <210> 97 <211> 363 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pSAM1" <223> "pSAM1 <220> <223> pSAM1 <220> <223> pSAM1 <400> 97 gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa 60 tactttcttt tttttttttc acaggaaaac tgtggtggcg cccttgccta ctagtgcatt 120 tcttttttcg ggttcttgtc tcgacgaaat tttagcctca tcgtagtttt tcactctggt 180 atcgatgaaa aagggaagag taaaaagttt tccgtttagt acttaatggg attggtttgg 240 gacgtatata tcgactggtg ttgtctgtta ttcatcgttg tttttcggtt agcttcgaaa 300 aaaaaataga gtaaaaacca ggaatttacc ctaaaaacaa gaaaaaataa gataaacgaa 360 aat 363 <210> 98 <211> 500 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pSAM2" 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caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat 240 cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga 300 <210> 100 <211> 300 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> tCYC1" <223> "tCYC1 <220> <223> tCYC1 <220> <223> tCYC1 <400> 100 acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc 60 cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc 120 cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt 180 ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg 240 agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct tcgcagttta cactctcatc 300 <210> 101 <211> 300 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> tTDH3" <223> "tTDH3 <220> <223> tTDH3 <220> <223> tTDH3 <400> 101 gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60 tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120 tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180 atacctgata cattgtggat gctgagtgaa 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75 80 Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys 85 90 95 Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp 100 105 110 Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr 115 120 125 Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu 130 135 140 Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr 145 150 155 160 Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala 165 170 175 Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn 180 185 190 Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile 195 200 205 Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser 210 215 220 Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val 225 230 235 240 Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val 245 250 255 Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu 260 265 270 Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser 275 280 285 Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu 290 295 300 Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly 305 310 315 320 Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg 325 330 335 Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala 340 345 350 Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala 355 360 <210> 116 <211> 499 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pNUP57 <220> <223> pNUP57 <400> 116 tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60 gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120 cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180 agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240 atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300 tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360 aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420 atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480 ttgttgacca attgatcac 499 <210> 117 <211> 451 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pGAP1 <220> <223> pGAP1 <400> 117 cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60 ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120 ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180 ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga 240 tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg 300 tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca 360 aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac 420 agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a 451 <210> 118 <211> 998 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pJEN1 <220> <223> pJEN1 <400> 118 aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca 60 gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa 120 gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac 180 tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta 240 aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct 300 tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta 360 gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac 420 aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc 480 tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg 540 ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600 atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660 agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720 tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780 ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840 caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900 tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960 gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998 <210> 119 <211> 450 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pICL1 <220> <223> pICL1 <400> 119 ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60 ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120 aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180 atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240 gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300 ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360 tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420 tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450 <210> 120 <211> 598 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pADH2 <220> <223> pADH2 <400> 120 tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60 gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120 atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180 taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240 acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300 accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420 atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480 ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540 atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598 <210> 121 <211> 793 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pMLS1 <220> <223> pMLS1 <400> 121 tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60 gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120 tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180 agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240 cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300 gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360 gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420 ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480 atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540 tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600 tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660 aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720 tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780 aagaattaag aaa 793

Claims (15)

  1. 엑토인-생산 재조합 효모로서, 이의 게놈에서,
    (A) (i) 아스파토키나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
    (ii) 아스파테이트 키나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
    (B) 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 및/또는 조효소로서 NAD 및 NADP 둘 모두를 사용할 수 있는 아스파테이트 세미-알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
    (C) 디아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
    (D) (i) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
    (ii) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (iii) 디아미노부티르산 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
    (E) 엑토인 신타제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고;
    (F) (i) 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 결실 및/또는 단절되었고/되었거나,
    (ii) 호모세린 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 핵산은 독립적으로
    - 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
    - 약 프로모터의 제어 하에 있고/있거나;
    - 탈안정화된 형태인, 엑토인-생산 재조합 효모.
  2. 제1항에 있어서, 게놈에서 아스파테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 게놈에서 옥소-글루타레이트를 글루타메이트로 전환시키는 글루타메이트 디히드로게나제, 특히 NADH를 사용하는 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하고, 보다 특히 엔토디니움 카우다텀 (Entodinium caudatum) 또는 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces Cerevisiae) 유래, 보다 더 특히 엔토디니움 카우다텀 유래 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나, 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈에서 적어도 하나의 하기 변형이 수행된 것인 엑토인-생산 재조합 효모:
    (A) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP3을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나
    (ii) 탈안정화된 일반 아미노산 퍼미아제 AGP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (B) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (C) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2를 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2를 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (D) 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (E) 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산이 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (F) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (G) 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (H) 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나, 바람직하게 모든 내생성 핵산은 효모의 게놈으로부터 결실되었고, 임의로
    (i) 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고 유도성 또는 억제성 프로모터의 제어 하에 있고/있거나,
    (ii) 탈안정화된 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이 삽입되었고;
    (I) 가능한 수송체 AQR1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현되고/되거나,
    (J) 폴리아민 수송체 1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 과발현된다.
  5. 제4항에 있어서, 게놈에서 제4항에 표시된 변형 중 적어도 2개, 특히 적어도 3개가 수행된 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파토키나제를 코딩하는 핵산은 효모, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지아 유래의 핵산인 엑토인-생산 재조합 효모.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 핵산은 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 해모필리우스 인플루엔자 (Haemophilius influenza), 스트렙토마이세스 라벤둘라에 (Streptomyces lavendulae), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia) 및 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 박테리아 유래 핵산인 엑토인-생산 재조합 효모.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 일반 아미노산 퍼미아제, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2, 일반 아미노산 퍼미아제 GAP1, 고친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1, 일반 아미노산 퍼미아제 AGP1, 저친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3 및 고친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 적어도 하나의 핵산은 독립적으로, 효모, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지아 유래 핵산인 엑토인-생산 재조합 효모.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 과발현되는 핵산은 특히 독립적으로 pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 및 pGK1로 이루어진 군으로부터 선택되는 강력 프로모터의 제어 하에 있는 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 또는 억제성 프로모터는 독립적으로, 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터 및 트레오틴 유도성 또는 억제성 프로모터로부터 선택되고, 특히 pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, 및 pCHA1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 프로모터는 독립적으로 pURA3, pRPLA1, pNUP57 및 pGAP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 또는 억제성 프로모터는 독립적으로, 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 리신 유도성 또는 억제성 프로모터 및 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 및 pMLS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 엑토인-생산 재조합 효모.
  13. 엑토인을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 효모를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양 배지로부터 엑토인을 회수하는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 배양 배지는 적어도 탄소원, 바람직하게 글루코스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원을 포함하는 것인 제조 방법.
  15. 엑토인의 제조를 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 효모의 용도.
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