KR20200027680A - 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법 및 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법 및 상기 분획물, 그리고 상기 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병, 기억력 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 손상 콜린성 체계, 미토콘드리아 손상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법 및 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 {A method for preparing ethyl acetate fraction from Aruncus dioicus var. kamtschaticus and the composition comprising the same as the effective ingredient}

본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법 및 상기 분획물, 그리고 상기 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지 섭취가 에너지 소비보다 많은 경우 남겨진 에너지가 지방으로 과잉 축적되면서 야기되는 질환으로 유전적 원인 또는 생활 습관상의 원인에 의해 발생된다. 한국인의 경우 고도비만(체질량지수 30-35 미만)과 초고도비만(체질량지수 35 이상) 인구가 급격하게 증가하고 있다. 국민건강보험공단에서 발표한 '2016 비만백서'에 따르면 2006년 우리나라의 초고도비만 인구는 1만 448명에서 2015년 3만 6343명으로 9년 새 3배가 증가되었다. 비만 인구는 233만 2146명에서 406만 6015명으로 1.7배 증가하였으며 이와 같은 추세라면 2025년 우리나라 성인 17명 중 1명이 고도비만이 될 것이라는 전망이다. 최근 비만은 대사증후군의 하나로써, 대사증후군이란 각종 심혈관질환과 제 2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것이다. 이에 비만은 제 2형 당뇨병, 이상지질혈증, 지방간, 심혈관계 질환 및 만성퇴행성질환 등의 질병을 유발하는 위험 인자로 작용한다. 또한, 비만은 '인슐린저항성'의 증상을 야기하며 이는 제 2형 당뇨병으로 이어진다. 인슐린저항성은 세포에서 발생된 인슐린 내성으로 인하여 인슐린의 신호전달 체계가 손상됨으로써 야기되며 이로 인해 혈당이 증가하게 되고 나아가 다양한 질환을 유발하게 되는 증상이다. 구체적으로, 내장지방의 축적은 심혈관 질환을 일으키는 중요한 요인으로, 내장지방 축적과 더불어 합성분비가 증가하여 혈중 농도가 증가되는 것으로 증명되었으며, 지방세포에서 분비되는 TNF-α는 인슐린 감수성을 저하시켜 당뇨병 발생기전의 하나로 보고되었다. 최근 일부 학자들은 말초 인슐린저항성이 나아가 중추 인슐린저항성을 야기시킴으로써 중추 신경을 손상시켜 알츠하이머병 형태의 인지손상을 초래한다고 보고하고 있으며 이에 알츠하이머병을 제 3형 당뇨병이라 칭하기도 한다.

이처럼 비만으로 야기된 인슐린 저항성에 의한 인지저하를 치료, 예방 혹은 개선하기 위한 천연물이나 식품 개발 및 연구의 필요성이 대두되었다.

눈개승마와 관련된 학술문헌으로는 눈개승마 용매 추출물의 항산화 및 항균활성 (김 등, 2011. 한국식품영양과학회지, 40: 47-55)에서 우수한 항산화 및 항균 활성이 보고된 바 있으며, 눈개승마의 성분에 관한 연구 (심창민, 대구카톨릭대학 약학과 석사논문, 2009)에서 항산화력을 가지는 cinnamic acid 유도체, quercetin 유도체, kaempferol 유도체 등이 보고된 바 있다. 한편, 눈개승마와 관련된 특허로는 대한민국 등록특허 제 10-1869353호가 있으나 이는 눈개승마 추출물에서 분리된 신규 화합물 및 항염증 조성물에 관한 것이 있고, 대한민국 등록특허 제 10-1243220은 삼나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것으로 상기 문헌 어디에도 dicaffeoyl glucose isomer Ⅰ, Ⅱ을 주요 페놀릭 화합물로 하는 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 당뇨, 기억력 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 콜린성 체계 이상, 미토콘드리아 손상, 중추인슐린 저항성에 기한 인지손상의 예방, 개선 혹은 치료용 조성물에 대하여 암시하거나 개시한 연구는 전무하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 비만 혹은 고지방식이로 야기된 중추인슐린저항성에 의한 인지저하를 포함하는 관련 질환을 예방, 개선 혹은 치료하는 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, dicaffeoyl glucose isomer Ⅰ, Ⅱ을 주요 페놀릭 화합물로 하는 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 상기 기능을 확인하고 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 목적은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 당뇨병, 기억력 및 인지기능 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 손상 콜린성 체계, 미토콘드리아 손상, 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 당뇨병, 기억력 및 인지기능 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 손상 콜린성 체계, 미토콘드리아 손상, 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 출원의 목적을 달성하기 위하여 본 출원은 눈개승마 추출물 및 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법을 제공한다. 상기 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법은,

냉동건조된 눈개승마를 에탄올에 혼합하고 추출하여 눈개승마 추출물을 수득하는 단계;

상기 추출물을 여과 및 농축하는 단계;

상기 농축된 추출물을 3차 증류수에 용해하고 동일 비율의 n-hexane, chloroform 및 ethyl acetate 용매를 사용하여 분획하여 각 분획물을 수득하는 단계;

상기 ethyl acetate 분획물을 농축 및 냉동건조하여 수득하는 단계로 이루어질 수 있다.

본 실험에 사용한 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus)는 강원도 태백시에 위치한 태백쌈채마을에서 구입할 수 있고, 눈개승마의 어느 부위도 사용될 수 있으나, 구체적으로 어린잎과 줄기를 사용하여 냉동건조시켜, 냉동건조된 눈개승마 20g을 50% 내지 80% 에탄올 0.5 내지 2 L, 구체적으로는 1L 에 혼합한 후, 30 내지 50℃, 구체적으로는 40℃에서 2시간 30분 동안 환류냉각장치를 포함하는 추출기를 이용하여 추출할 수 있다. 상기 추출된 추출물은 거름장치, 구체적으로는 No.2 거름종이(Whatman Inc, Kent, UK)로 여과하여 농축하여 눈개승마 추출물을 수득할 수 있다. 상기 농축된 눈개승마 추출물은 유기용매, 구체적으로는 3차 증류수에 용해하고, n-hexane, chloroform 및 ethyl acetate 용매를 다양한 비율로 혼합하거나 분리하여 순차적으로 혹은 동시에 사용하여 분획할 수 있다. 구체적으로는 상기 용매를 동일한 비율로 사용하여 분획할 수 있거 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물을 사용할 수 있다. 각 분획물은 농축하여 냉동건조하여 수득하였으며 -20℃에서 보관할 수 있다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 주요 화합물을 분리하고자, 크로마토그래피 분석에 근거하여 ultra-performance liquid-quadrupole-time-of flight mass spectrometry (UPLC-QTOF/MS²)를 사용할 수 있다. 즉, 메탄올에 용해된 샘플을 0.2㎛ 필터로 여과하고, 페놀릭 화합물의 UPLC 분리를 ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column (2.1 x 100 mm, 1.7㎛ particle size, Waters Corp, Milford, MA, USA)에서 수행하고, 40℃에서 0.4 mL/min 의 유속으로 흘릴 ㅅ수 있다. 분석에 사용된 이동상은 용매 A (distilled water with 0.1% formic acid) 및 용매 B (ACN with 0.1% formic acid)이고 적합한 용매 구배 조건을 사용하여 데이터를 얻을 수 있다. 본 출원에서는 다음의 조건이 사용되었다 : 0-0.5분, 0% B; 0.5-8분, 100% B; 8-8.5 분 100% B; 8.5-10분 0% B; 및 10-11분 0% B. MS² 데이터를 얻기 위해, 이온화는 음성 전자 스프레이 (ESI) 모드로 작동될 수 있고 실험에 적합한 이온화 조건을 사용하여 분석할 수 있다. 본 출원에서 사용된 조건은 다음과 같다 : 램프 충돌 에너지, 20-45 V; 모세관 전압, 3 kV; 탈 용매 온도, 350℃ ; 분무기의 압력, 40 psi; fragmentor, 175 V; cone 전압, 40V; 질량 범위, 50-1, 200 m/z; 오븐 온도, 40℃. 모든 MS 데이터는 MarkerLynx 소프트웨어(Waters MassLynx TM, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 대사성 질환은 당뇨병, 기억력 감퇴 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 콜린성 체계 손상, 미토콘드리아 손상, 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 당뇨병의 예방, 치료나 개선효과는 공복혈당과 IPGTT를 포함하나 이에 제한되지 않는 방법의 내당능 측정을 통하여 확인할 수 있다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 기억력 감퇴 및 인지능력 감퇴 예방 및 치료용 약학적 조성물, 또는 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에서, 용어 "기억력 감퇴의 예방, 치료 또는 개선"이란 치매의 증상 중의 하나인 기억력의 감퇴 증세가 본 발명에 따른 약학적 조성물이나 식품 조성물의 투여에 의해서 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 또한 본 발명에서, 용어 "인지능력 감퇴의 예방, 치료 또는 개선"이란 치매의 증상 중의 하나인 인지능력의 감퇴 증세가 본 발명에 따른 약학적 조성물이나 식품 조성물의 투여에 의해서 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

또한 본 발명에서, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물이나 식품 조성물의 투여에 의해 고지방식이로 야기된 당뇨, 기억력 및 인지능력 감퇴, 치매, 이상지지질혈증, 간손상, 손상된 콜린성 체계, 미토콘드리아 손상, 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 치매에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 치매는 뇌의 위축과 신경세포의 감소 및 노인 반(senile plaque)의 출현으로 인한 뇌신경의 비가역적인 파괴가 원인이 되어 기억력 저하와 언어장애, 행동장애 등의 다양한 후천적 인지기능 장애 증상을 수반하는 증후군을 일컫는다. 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease)은 치매의 가장 주요한 발병요인으로서 familial type과 sporadic type으로 분류되며, 전체 질환의 90% 이상이 주로 65세 이상의 노인에게 나타나는 sporadic type이다. Familial type은 amyloid precursor protein(APP), presenilin 1(PS1), presenilin 2(PS2) 유전자의 돌연변이가 병인으로 알려져 있으며. sporadic type의 경우는 그 원인이 노화 및 ApoE4 대립형질의 다양성이 병인으로 보고되었다. Aβ(β-amyloid)의 응집은 familial type과 sporadic type 모두에서 공통적으로 나타나는 병리현상으로 응집된 Aβ는 활성산소를 발생하고 염증반응을 일으켜 신경세포사를 유도한다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 이상지질혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 이상지질혈증(dyslipidemia)이란 고지혈증, 동맥경화증 등 혈장 내 총 콜레스테롤, 저밀도지단백-콜레스테롤(LDL-Cholesterol), 중성지방(triglyceride)이 증가되거나 고밀도지단백-콜레스테롤(HDL-Cholesterol)의 감소로 유발되는 혈관질환을 통칭하는 것으로, 동맥내벽에 콜레스테롤 등이 침착돼 동맥의 내면이 좁아짐에 따라 여러 장기와 사지말단에 혈액공급이 원활치 않은 혈액순환장애 등의 증상을 의미한다. 이상지질혈증은 혈중 내 지질 농도 변화에 따른 다양한 질환을 유발시키기도 하는데, 특히, 동맥경화, 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 간손상 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 간손상은 B형 간염, C 형 간염, 알코올성 간질환, 간경변증, 간암에 기인한 간의 조직이나 세포에 발생하는 각종 손상을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 이상지질혈증 및 간손상의 측정은 혈청의 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamine pyruvic transaminase (GPT), blood urea nitrogen (BUN), creatine (CRE), lactate dehydrogenase (LDH), total cholesterol (TCHO), triglyceride (TG) 및 high density lipoprotein cholesterol (HDLC) 농도를 통해 측정될 수 있다. 더불어 low density lipoprotein cholesterol (LDLC)는 Friedewald 등의 방법에 따라 계산식, LDLC (mg/dL) = TCHO-(HDLC + TG/5)로 산출할 수 있고, HDLC와 TCHO 비율인 HTR은 HTR(%) = (HDLC/TCHO) x 100로 산출할 수 있다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 손상된 콜린성 체계의 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 콜린성 체계는 아세틸콜린(ACh)을 신경전달물질로 사용하고, 아세틸콜린(Acetylcholine)은 신경근육연접(neuromuscular junction)에서 흔히 볼 수 있는 신경전달물질이다. 뇌에서는 2가지의 콜린성 확산조절시스템이 있는데 그 중 하나는 기저전뇌복합체(Basal Forebrain Complex)이다. 콜린성 뉴런의 세포체는 기저전뇌핵(Basal forebrain nucleus), 특히 마이너르트 기저핵(Basal nucleus of Meynert)에 위치하고, 해마(Hippocampus)로 투사되는 중격핵(Medial septal nuclei)에도 세포체가 분포한다. 마이너르트 기저핵에서 아세틸콜린은 피질영역의 거의 모든 영역으로 퍼져나가기 때문에 신경과 정신기능의 전반적인 면에 영향을 미칠 수 있다. 콜린성 체계의 분석을 위하여, 뇌조직의 MDA, SOD, GSH, ACh 수치 및 AChE 활성 실험을 진행할 수 있으나 분석 지표는 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 미토콘드리아 기능 이상으로 인한 질병은 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능이상, 유전적 요인으로 인한 기능이상, 그리고 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함으로 인한 질환 등이 포함될 수 있는데, 상기 원인으로 인한 질병은 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 프리드리히 보행실조, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육병증, 근육위축, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 간질, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등이 발생할 수 있다. 미토콘드리아의 기능을 확인하기 위하여, Mitochondrial membrane potential (MMP), Reactive oxygen species (ROS), Adenosin triphosphate(ATP)가 측정될 수 있으며, 미토콘드리아 매개 apoptosis 경로 관련 인자를 분석하기 위하여 p-JNK, BAX, Cytochrome C, p-Akt, p-tau, TNF-α, p-NK-κB가 웨스턴 블랏을 이용하여 측정될 수 있으나, 지표가 이에 한정되지는 않는다.

본 출원의 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상 예방 및 치료용 약학적 조성물이나 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 중추신경에 인슐린 저항성이 야기되면, 인슐린과 인슐린 수용체가 결합하게 되었을 경우, 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrate, IRS)의 세린잔기가 인산화됨으로써 Akt의 활성을 감소시키게 되며 Akt의 감소로 인해 타우 단백질의 과인산화가 진행되어 신경섬유 엉킴으로 이어져 신경전달 방해 및 아폽토시스를 유발할 수 있으므로, IRS와 타우의 과인산화 억제, AMPK 인산화의 회복, IDE 발현량의 증가 및 베타아밀로이드 플라그 형성의 감소는 인슐린저항성으로 인한 인지손상 관련 메커니즘이 억제됨을 확인할 수 있는 지표가 된다. 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상은 각 인자 p-IRS, p-Akt, p-tau, p-AMPK, IDE, Amyloid β의 측정을 통해 확인할 수 있으나 지표는 이에 제한되지 않는다.

본 출원은 상기 제조방법으로 수득된 본 출원의 눈개승마 추출물 또는 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨, 기억력 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 콜린성 체계 이상, 미토콘드리아 손상, 중추인슐린 저항성에 기한 인지손상의 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물을 제공한다.

본 출원의 분획물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 출원에 따른 분획물을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 출원의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 출원의 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 출원의 분획물을 포함하는 조성물은 당뇨, 기억력 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 콜린성 체계 이상, 미토콘드리아 손상, 중추인슐린 저항성에 기한 인지손상의 예방 및 개선을 위한 건강기능 식품 조성물을 제공한다. 본 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 또한, 본 출원의 분획물은 당뇨, 기억력 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 콜린성 체계 이상, 미토콘드리아 손상, 중추인슐린 저항성에 기한 인지손상의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 출원의 건강기능식품으로는 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 출원의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 출원의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이다. 상기 외에 본 출원의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 출원의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 출원의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 출원의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물은 당뇨병, 기억력 및 인지능력 감퇴, 이상지질혈증, 간손상, 손상 콜린성 체계, 미토콘드리아 손상, 중추 인슐린 저항성으로 인한 인지손상의 예방, 치료 또는 개선에 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) 공복혈당, (B) 내당능(IPGTT), (C)AUC 를 대조군, 고지방식이군과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 2는 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) 공간 인지능(Y-maze), (B) 단기 기억능(Passive avoidance), (C) 장기 기억능 (Morris water maze)을 대조군, 고지방식이군과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 3은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) MDA, (B) SOD, (C) GSH 수치를 대조군, 고지방식이군과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 4는 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) 아세틸콜린(ACh), (B) 아세틸콜린에스테라제(AChE), (C) AChE의 웨스턴 블랏 측정을 대조군, 고지방식이군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) MMP, (B) ROS, (C) ATP 수치를 대조군, 고지방식이군과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 6은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) MMP, (B) ROS, (C) ATP 수치를 대조군, TMT군과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 7은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 p-JNK, BAX, Cytochrome C, p-Akt, p-tau, TNF-α, p-NK-κB 지표를 대조군, TMT군과 비교하여 측정한 결과의 웨스턴블랏 사진도 및 그래프이다.
도 8은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 투여한 쥐의 (A) p-IRS,p-Akt,p-tau, (B) p-AMPK, IDE, β-amyloid 수치를 대조군, 고지방식이군과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 9은 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 (A) UPLC 크로마토그래피와 dicaffeoylglucose 분자구조, (B) dicaffeoylglucose isomerⅠ의 UPLC-QTOF/MS² 결과, (C) dicaffeoylglucose isomerⅡ의 UPLC-QTOF/MS² 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1. 눈개승마 추출물 및 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 수득

본 실험에 사용한 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus)는 강원도 태백시에 위치한 태백쌈채마을에서 구입하였다. 눈개승마는 국립산림과학원으로부터 눈개승마임을 검증받았다. 눈개승마의 어린잎과 줄기를 사용하여 냉동건조시켰으며, 냉동건조된 눈개승마 20g을 80% 에탄올 1 L에 혼합한 후, 40℃에서 2시간 30분 동안 환류냉각장치를 이용하여 추출하였고, 추출된 추출물은 No.2 거름종이(Whatman Inc, Kent, UK)로 여과하여 농축하여 눈개승마 추출물을 수득하였다.

상기 농축된 눈개승마 추출물을 3차 증류수에 용해하고 동일 비율의 n-hexane, chloroform 및 ethyl acetate 용매를 사용하여 분획하였다. 각 분획물은 농축하여 냉동건조하여 수득하였으며 -20℃에서 보관되었다. 상기 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 사용되었다.

실험예 1. 공복혈당 및 내당능 측정

실험동물들 및 실험의 통계처리는 하기의 방법으로 준비되고 수행되었다.

4주령 C57BL/6 수컷쥐를 실험 동물 공급업체(Samtako Bio Korea, Korea)로부터 구입하였다. 실험동물은 온도(22±2℃)와 습도(55%)를 일정하게 유지하고, 12시간의 채광, 차광 조건에서 충분한 양의 식수와 사료가 공급되었다. 각 group 당 8마리씩 4 group으로 나누어 일주일간 일반 식이(protein (20 kcal%/g), carbohydrate (70 kcal%/g), fat(10 kcal%/g) 포함, 3.85 kcal/g)로 적응시킨 후 정상식이군(normal diet)을 제외한 모든 실험군은 고지방식이(high fat diet, including protein (20 kcal%/g), carbohydrate (20 kcal%/g) and fat (60 kcal%/g) 포함, 5.24 kcal/g) 으로 15주간 비만을 유도한 후 16주에서 19주까지 고지방식이와 함께 샘플 (20, 40 mg/kg of body weight (EFAD20 and EFAD40 group))을 경구투여하면서 사육되었다. 실험기간 동안 실험동물의 상태는 일주일에 일회씩 체중 및 식이섭취량 관찰을 통해 확인되었다.

모든 실험은 반복실험을 통해 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 통계적 유의성 검증은 SAS^® version 9.1(SAS institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 실시하고, Duncan's multiple range test로 각 시료간의 유의차를 5% 수준에서 검증하였다.

상기 실험동물들의 공복혈당 및 내당능을 측정하기 위하여 하기의 방법이 사용되었다. 비만 유도 기간까지의 15주부터 샘플식이 후 3주 동안의 공복혈당은 쥐꼬리 정맥혈관에서 혈액을 채취하여 Accu-Chek 포도당 측정기 (Roche DiagnosticsAustralia Pty. Ltd., Castle Hill, Australia)를 사용하여 측정하였다. Intraperitoneal gluose tolerance test (IPGTT)는 19주차에 시행되었으며, 실험동물을 12시간 공복 후 포도당(2 g/kg of body weight)을 복강 내 주사하였다. 쥐꼬리 정맥혈관으로부터 얻은 혈액을 통해 0, 15, 30, 60, 90 및 120분 간 Accu-Chek 포도당 측정기를 사용하여 혈당측정이 이루어졌다.

실험결과, 15주차에 측정된 공복혈당을 통해 일반식이를 한 쥐들에 비해 고지방식이를 한 쥐들의 공복혈당이 매우 높다는 것을 확인하였으며, 이에 샘플을 식이한 후 샘플식이군들에 있어 공복혈당이 효과적으로 감소함을 확인하였다(도 1(A)). 더불어, 내당능을 보기위한 IPGTT결과를 통해, 고지방식이군에서는 포도당주사 후 혈당이 급격하게 치솟고 그 후로 회복하는데까지 걸리는 시간이 오래 걸림을 확인하였으며, 샘플군에 고농도의 그룹에서 혈당의 증가가 급격하지 않으며 혈당이 차츰 회복해나가는 경향을 확인할 수 있었다(도 1(B),(C)). 이에 샘플이 고지방으로 야기된 혈당증가와 손상된 내당능장애를 억제하는 능력이 우수하여 당뇨병의 예방, 치료와 개선에 효과적임을 확인하였다.

실험예 2. 행동학적 분석 실험

실험동물들 및 실험의 통계처리는 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 준비되고 수행되었다. 행동학적 분석 실험은 Y-maze, Passive Avoidance, Morris water maze test를 하기의 방법으로 수행하였다.

Y-maze test

학습 없이 단기간의 공간 기억력 및 생쥐의 타고난 경향을 시험하기 위해 IPGTT측정 후, Y-maze 실험이 수행되었다. 미로는 흰색 플라스틱으로 구성되며, 각 팔은 길이 33 cm, 높이 15 cm, 너비 10 cm로 120℃의 각도로 구성되었다. 본 실험은 8분 동안 SMART 비디오 추적 시스템 (SMART v3.0, Panalb SL, Energia, Barcelona, Spain)에 의해 즉각적인 공간 선호도가 기록되었고, 또한 자발적 공간 선호 행동이 백분율로 계산되었다.

Passive Avoidance test

Y-maze 실험 후, 이틀 동안 순간적인 전기 자극에 의해 형성되는 쥐의 단기 기억능을 평가하기 위하여 passive avoidance 실험이 이루어졌다. 실험 장비는 두 공간이 하나의 문으로 구분되어 있으며 한 공간은 매우 밝은 등이 존재하며 다른 공간은 금속격자 바닥에 전기가 흐르도록 구성되어 있다. 첫째 날, 쥐를 1분 동안 밝은 공간에 1분 동안 두고서, 두 공간 사이의 문을 열어 쥐가 어두운 공간으로 이동하게 되면 문을 닫는다. 그 후, 전기 충격(0.5 mA, 3 s)을 발에 가했다. 둘째 날, 쥐를 밝은 공간에 두고 어두운 곳으로 이동하는 데까지 걸리는 step-through latency time을 측정했다 (step through latency maximum testing time : 300 s).

Morris water maze test

Passive avoidance 실험 후, 쥐의 반복적인 학습을 통한 장기간의 공간 기억능을 평가하기 위하여 Morris water maze 실험이 수행되었다. 실험 장비는 측면에 시각적 기호가 있는 임의로 나뉜 사분면 (E, N, S 및 W)로 구성된 원형의 스테인리스강 pool (직경 90 cm)이다. Pool은 흰색 분유를 용해시킨 물(22?2?C)이 30 cm 높이까지 채워졌다. 플랫폼 (직경 6 cm)은 훈련 중 위치가 변경되지 않았으며 N 구역의 중간에 놓여졌다. 각 사분면에 놓여져서 플랫폼까지 도달하는 4가지의 훈련 (E, N, S 및 W)이 4일 동안 실시했다. SMART 비디오 추적 시스템은 4일 동안 최대 60초 동안 숨겨진 플랫폼에 도달 할 때까지의 대기시간을 측정하였다. 4일간의 훈련 후, 플랫폼을 제거하고 플랫폼이 위치했던 N 구역에 얼마동안 머무르는지 60초 동안 측정하였으며, 실험결과는 다음과 같다.

도 2의 (A),(B),(C)는 선천적인 쥐의 탐험능력을 보고자 한 Y-maze 실험 결과로, 각 그룹의 쥐들간의 운동능력에는 차이가 없음을 확인하였으며, 교대행동이 고지방식이군에서 매우 낮은 결과값을 보인 바, 쥐의 공간인지능이 감소됨을 확인하였다. 이에 샘플군에서 공간 인지능이 개선됨을 확인하였다.

도 2의 (D)는 전기충격을 통한 단기 기억능을 보고자 한 passive avoidance 실험 결과로, 고지방식이군에서 단기기억능이 감소됨을 확인하였고, 이에 샘플군에서는 우수하게 개선됨을 보였다.

도 2의 (E),(F),(G)는 4일간의 반복적인 학습을 통해 쥐들의 장기 기억능을 보고자 한 Morris water maze 실험 결과로, 4일동안 각 그룹들의 쥐들이 플랫폼을 인지하고 도달하기까지 학습이 이루어짐을 알 수 있었고, 플랫폼을 제거하고 나서 플랫폼이 존재하던 N 구역에 머무는 정도를 확인한 결과, 고지방식이군에 있어서 플랫폼을 인지하고 있는 능력이 부족함을 알 수 있었으며, 샘플군에서는 이러한 손상된 장기기억능이 개선됨을 확인하였다. 각각의 실험들을 통해, 고지방식이로 야기되어진 손상된 인지능력 및 기억력이 샘플식이를 통해 효과적으로 개선된다는 것을 확인하였다.

실험예 3. 혈청의 생화학적 분석

실험동물들 및 실험의 통계처리는 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 준비되고 수행되었다. 혈청의 생화학적 분석을 위하여 하기의 방법이 수행되었다.

실험동물은 에틸에테르(ethyl ether)로 마취하여 심장에서 채혈하고, 채혈된 혈액은 15,000 rpm에서 15분간 4℃에서 원심분리한 혈청이 분석 시료로 사용되었다. 혈청의 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamine pyruvic transaminase (GPT), blood urea nitrogen (BUN), creatine (CRE), lactate dehydrogenase (LDH), total cholesterol (TCHO), triglyceride (TG) 및 high density lipoprotein cholesterol (HDLC) 농도는 혈액분석기(Fuji dri-chem 4000i; Fuji film Co., Tokyo, Japan)를 통해 측정되었다. 더불어 low density lipoprotein cholesterol (LDLC)는 Friedewald 등의 방법에 따라 계산식, LDLC (mg/dL) = TCHO-(HDLC + TG/5)로 산출하였고, HDLC와 TCHO 비율인 HTR은 HTR(%) = (HDLC/TCHO) x 100로 산출하였다.

실험결과, 간 손상 인자인 GOT, GPT 수치가 고지방식이군에서 매우 높음을 확인하였으며 더불어 TCHO 및 TG 함량이 높음을 확인하였다. 이에 고지방식이로 인해 간손상과 이상 지질혈증이 야기됨을 확인하였으며, 이에 샘플군에서 GOT, GPT, TCHO 및 TG를 감소되었으며 이를 통해 샘플이 고지방식이로 야기된 간손상 및 이상지질혈증을 효과적으로 개선함을 확인하였다(표 1).

실험예 4. 생화학지표 실험 (ex vivo tests)

실험동물들 및 실험의 통계처리는 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 수행되었으며, 생화학지표 실험을 위해 희생된 쥐의 뇌조직을 얼음 위에 두고 차가운 인산 완충 생리 식염수 (PBS)를 10배 첨가하여 잘게 잘랐다. 균질화 후 뇌조직을 MDA, SOD, GSH, ACh 수치 및 AChE 활성 실험에 측정 될 때까지 -80℃에서 유지했다.

지질과산화물의 생화학적 지표인 MDA(Malondialdehyde)를 측정하기 위하여, 미리 전처리된 뇌조직을 2,500x g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액을 1 % 인산과 0.67 % TBA 용액과 혼합한 후 water bath (95℃)에서 1시간 동안 두었다. 그 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

SOD(Superoxide dismutase) 수준을 측정하기 위해 이전에 전처리된 뇌조직을 400 x g에서 10분간 4℃에서 원심분리했다. 상등액을 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt) (WST-1) working 용액 및 효소 용액에 혼합하여 37℃에서 20분간 두었다. 그 후 1분 간격으로 450 nm에서 10분간 흡광도를 측정하였다.

뇌조직에서의 환원형 글루타치온(Reduced glutathione (GSH))을 측정하기 위하여 뇌조직에 10 배 용량의 인산완충액을 취하여 혼합하여 균질화했다. 그 후 균질액을 10,000 x g에서 15분간 원심분리 하였다. 상층액의 단백질 정량을 통해 각 샘플을 상대 정량화하였다. 상등액을 5% metaphosphoric acid와 혼합하고 2,000 x g에서 2 분간 원심분리하였다. 상등액에 Tris-HCl 완충액 (0.26M, pH 7.8), 0.65N NaOH 및 OPT (1mg / mL)를 첨가하고 어두운 곳에서 15분간 방치하였다. 그 후, 형광 마이크로 플레이트 리더 (Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)로 측정 하였다 (여기 필터 320 nm, 방출 필터, 420 nm). 측정된 GSH 수준은 감소 된 글루타티온 표준 곡선에 대한 값으로 표현되었다.

콜린성 체계를 측정하기 위해 아세틸콜린(ACh) 수치와 아세틸콜린에스테라제(AChE) 활성을 생화학 지표로 측정하였다. 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)은 시냅스말단에 분비되는 신경전달물질이며, 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE)는 ACh을 분해시키는 효소이다. 각 지표의 측정을 위하여 전처리 된 뇌조직을 12,000 x g에서 30분간 4℃에서 원심분리했다. ACh 수치를 측정하기 위해, 상등액을 alkaline hydroxylamine reagent (2M hydroxylamine in HCl and 3.5N sodium hydroxide)에 혼합하였다. 1분 후 (0.5 N HCl and 0.37 M FeCl₃ in 0.1 N HCl)용액을 혼합물에 첨가한 후 540nm에서 흡광도를 확인하였다. AChE 활성을 측정하기 위해, 50mM sodium phosphate buffer (pH 8.0)을 이전 상등액에 첨가하고 혼합물을 37℃에서 5분간 두었다. 그 후 Ellman 반응 혼합물 (1mM DTNB and 0.5mM acetylthiocholine in 50mM sodium phosphate buffer)을 첨가하였다. 흡광도는 37℃에서 20 분간 배양 한 후 10분 동안 1분 간격으로 405nm에서 측정하였다.

실험 결과는 하기 기재와 같았다.

뇌조직에서 과산화지질물인 MDA 수치를 확인한 결과, 고지방식이군에서 높은 MDA 함량을 나타냈으며 샘플군에서는 MDA 함량이 일반식이군에 상응함을 보아 샘플이 효과적으로 MDA의 생성을 억제함을 알 수 있었다(도 3(A)). 체내 항산화체계에서 주요한 역할을 하는 SOD 및 환원형태의 GSH수치를 뇌조직에서 확인한 결과, 고지방식이군에서 SOD 및 환원형태의 GSH수치가 급격히 감소됨을 확인하여 항산화체계가 손상됨을 보았다(도 3 (B),(C)). 이에 샘플군에서 SOD 및 환원형태의 GSH수치가 증가됨을 보아 샘플식이가 고지방식이로 인해 손상되어진 항산화체계를 효과적으로 회복시켜주는데 우수함을 확인하였다.

콜린성 체계 실험 결과, 고지방식이군에서 ACh함량이 감소되고 AChE활성이 증가됨을 보임에 따라 콜린성체계가 손상됨을 확인하였고, 이에 샘플군에서 ACh함량이 증가되고(도 4 (A)) AChE활성이 감소됨(도 4 (B),(C))을 확임함에 따라 고지방식이로 인해 야기된 손상된 콜린성 체계가 샘플식이를 통해 효과적으로 회복됨을 확인하였다.

실험예 5. 미토콘드리아 손상 실험 (Ex vivo tests)

실험동물들 및 실험의 통계처리는 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 수행되었다.

우선, 고지방식이로 인한 미토콘드리아 손상 및 개선을 알아보기 위한 방법은 하기의 기재와 같다. 미토콘드리아를 뇌조직으로부터 분리하기 위해 다음 절차가 수행되었다. 쥐 전체 뇌 조직을 isolation buffer (215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1 % bovine serum albumin (BSA) (Bioworld, Dublin, OH, USA), 1 mM EGTA, 20 mM HEPES sodium, and pH 7.2)에 혼합하여 13,000 x g에서 5분간 원심분리 하였다. 그 후, 상등액을 13,000 x g에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 0.1 % digonin을 함유하는 isolation buffer를 pellet에 첨가하고 5분간 방치하였다. 5분 후, 13,000 x g에서 15분 동안 원심분리를 수행하고, 상등액을 제거하였다. 그 후, EGTA가없는 isolation buffer를 pellet에 첨가하고 10,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 마지막으로, EGTA가 없는 isolation buffer를 남은 pellet에 첨가하고 추후 실험에 사용했다.

또한, TMT는 뇌에서의 해마 특정부위에 있어서의 미토콘드리아 손상을 시킨다고 알려져 있다. 따라서, TMT(trimethyltin)가 복강주사된 쥐로부터 얻은 뇌의 미토콘드리아가 막전위 (MMP) 손상 및 활성산소종(ROS)의 증가가 확인되고, ATP 생성이 감소된 점을 이용하여, 눈개승마 에틸아세테이트 분획물이 손상된 미토콘드리아를 개선시키는 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험방법이 사용되었다. ICR 마우스(Samtoko, Osan Korea)에 습도, 온도와 광량을 각 55%, 22±2℃, 12h light -dark cycle을 사용하고, 샘플 (20, 40 mg/kg of body weight (EFAD20 and EFAD40 group))을 경구투여하면서 삼주간 사육되었다. TMT는 상기 두 샘플식이를 섭취한 두 그룹의 쥐들에게 삼주간 7.1㎍/kg의 농도로, 0.85% sodium chloride 용액을 이용하여 100㎕가 복강으로 주사되었다. 대조군의 쥐들은 오로지 sodium chloride 용액만이 주사되었고, 상기 기재된 방법으로 미토콘드리아가 분리되었다.

또한, TMT 가 복강주사된 쥐의 미토콘드리아 매개 apoptosis 경로 관련 인자를 분석하기 위하여 p-JNK, BAX, Cytochrome C, p-Akt, p-tau, TNF-α, p-NK-κB가 웨스턴 블랏을 이용하여 각 측정되었다.

Mitochondrial membrane potential (MMP) 측정

미토콘드리아 생존 능력의 원동력인 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 확인하기 위해 JC-1을 이용한 실험을 수행하였다. 먼저, 분리된 미토콘드리아 (최종 농도 : 0.8 mg/mL)에 assay buffer (EGTA-free buffer with 5 mM pyruvate and 5 mM malate)와 1 ㎛ JC-1을 가하고 부드럽게 흔들었다. 이를 어두운 곳에서 20 분간 방치 한 후 형광 마이크로 플레이트 리더 (excitation filter 530/25 nm, emission filter; 590/30 nm)로 측정하였다.

Reactive oxygen species (ROS) 측정

미토콘드리아에서 존재하는 ROS를 측정하기 위해 DCF-DA를 이용한 방법이 수행되었다. 먼저 분리된 미토콘드리아 (최종 농도 : 0.8 mg/mL)에 25 ㎛ DCF-DA를 첨가하고 20분간 방치하였다. 이어서, 미토콘드리아의 ROS 수준을 형광 마이크로 플레이트 판독기 (Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)로 정량화하였다 (excitation filter, 485/20 nm, emission filter, 528/20 nm).

Adenosin triphosphate (ATP) 측정

미토콘드리아의 주요 기능인 ATP 수준은 Promega Corporation (Madison, WI, USA)에서 구입 한 ATP 분석 키트로 측정하였다. 이전에 분리된 미토콘드리아 샘플에 ATP 분석 혼합물 용액을 첨가하였다. ATP 표준 정량 곡선으로 정량화하였다.

실험 결과는 다음의 기재와 같다.

우선, 고지방식이로부터 야기된 미토콘드리아의 기능개선 효과를 확인하기 위하여 뇌조직으로부터 분리한 미토콘드리아에 있어 미토콘드리아의 활성에 주요한 역할을 하는 막전위차인 MMP를 측정한 결과, 고지방식이군에서 MMP가 감소되었고 이에 샘플 그룹에서는 MMP가 증가함을 확인하였다(도 5(A)). 더불어 미토콘드리아 내부의 ROS수치를 확인한 결과, 고지방식이군에서 높은 ROS수치를 보였으며 샘플 군에서는 ROS수치가 감소함이 확인되었다(도 5(B)). 마지막으로, 미토콘드리아에서 생합성되는 ATP수치를 확인한 결과, 고지방식이군에서는 낮은 ATP수치를 통해 미토콘드리아의 에너지 생합성능에 손상이 일어났음을 확인하였으며 샘플군에서 미토콘드리아의 생합성능이 개선됨을 확인하였다(도 5 (C)). 이에 고지방식이로 야기되어진 미토콘드리아 활성의 손상이 샘플을 식이함으로써 효과적으로 억제됨을 확인한 바, 샘플이 고지방식이로 야기된 미토콘드리아 손상을 개선시키는데 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 트리메틸틴(TMT)으로 야기된 미토콘드리아가 손상된 쥐들이 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 섭취하였을 경우 그 개선 효과를 확인한 결과, 눈개승마 에틸아세테트 분획물을 섭취한 그룹은 이러한 미토콘드리아의 기능손상이 개선됨을, 즉, 눈개승마 에틸아세테이트 분획물을 섭취한 쥐의 MMP는 증가하고, ROS는 감소, ATP는 증가함을 확인하였다(도 6 A,B,C). 즉, 눈개승마 에틸아세테이트 분획물은 고지방식이로 야기되거나 TMT로 야기된 미토콘드리아의 손상에 모두 개선 효과를 보임을 확인하였다.

나아가, TMT 가 복강주사된 쥐의 미토콘드리아 매개 apoptosis 경로 관련 인자를 분석하기 위하여 p-JNK, BAX, Cytochrome C, p-Akt, p-tau, TNF-α, p-NK-κB가 웨스턴 블랏을 이용하여 각 측정하였다. c-Jun N terminal kinase (JNK)는 세포사멸에 직접적으로 관련되는 인자이며 ser-63 과 ser-73잔기가 인산화되면 활성을 띈다. JNK는 Bcl-2-associated X protein (BAX)의 발현을 증가시키며, BAX는 미토콘드리아 막의 붕괴를 야기하여 결국 미토콘드리아 내에 존재하는 cytochrome C의 세포질로의 방출을 유도한다. 이에 미토콘드리아 매개 apoptosis가 유발되게 된다. Protein kinase B (Akt)는 세포생존과 관련된 인자로써 Akt 또한 인산화 될 경우 활성화된다. Akt는 활성이 감소되면 세포사멸이 급진적으로 진행된다. Akt의 불활성화는 tau를 인산화시키는 GSK3β의 활성화를 유도하게 되어 결국 tau의 과인산화가 진행되고 그로인해 신경독성 물질이 형성된다. 이에 미토콘드리아 매개 apoptosis가 급진적으로 발생하게 되며 나아가 미토콘드리아손상으로 과도하게 분비되는 과산화수소(H₂O₂)는 핵에서의 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) 전사를 활성화시키게 되어 tumor necrosis factor alpha (TNF-α)분비를 유도함으로써 결국 신경염증으로 이어진다. 실험 결과, 눈개승마 에틸아세테이트 분획물이 미토콘드리아 매개 apoptosis 경로를 억제하여 결국 신경세포 사멸을 개선시켜 주어 나아가 인지개선에 효과가 있음을 확인하였다(도 7 A,B,C).

실험예 6. 중추 인슐린 저항성 관련 인자 실험

실험동물들 및 실험의 통계처리는 상기 실험예 1에 기재된 방법으로 수행되었다. 중추 인슐린 저항성 관련 인자의 변화를 알아보기 위한 실험은 하기 방법으로 수행되었다.

뇌조직을 1%의 protease inhibitor cocktails (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) 가 포함된 protinE^TM Animal cell/tissue (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)와 혼합하여 bullet blender로 균질화하였다. 샘플에서 단백질 함량은 Bradford 단백질 분석법을 사용하여 상대적으로 정량화되었다. 시료 중의 단백질은 dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고 polyvinylidene difluoride 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 막은 5% 탈지유로 1시간 동안 blocking 과정을 거치고 세척되었다. 그 후 막은 1차 항체 용액에 넣어 12시간 동안 교반했다. 그 후 막은 세척되고 2차 항체 용액에 1시간 동안 둔 다음 세척하였다. 마지막으로 ECL 시약(Bionote, Hwaseong, Korea)에 담근 후 ChemiDoc (iBrightTM CL1000 장비, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 발광을 검출 하였다. 막에 나타난 밴드의 밀도는 Image-J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA)로 측정했다. 각 인자 p-IRS, p-Akt, p-tau, p-AMPK, IDE, Amyloid β의 밀도는 β-actin의 밀도로 나눈 값을 결과값으로 나타냈다.

중추신경에 인슐린 저항성이 야기되면, 인슐린과 인슐린 수용체가 결합하게 되었을 경우, 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrate, IRS)의 세린잔기가 인산화됨으로써 Akt의 활성을 감소시키게 되며 Akt의 감소로 인해 타우 단백질의 과인산화가 진행되어 신경섬유 엉킴으로 이어져 신경전달 방해 및 아폽토시스를 유발하게 된다. 실험 결과, 도 8(A)의 결과를 통해 고지방식이군에서 중추 인슐린 저항성이 야기되었으며 더불어 p-tau가 증가함을 확인하였다. 반면, 샘플군이 효과적으로 중추인슐린저항성을 개선시켰으며 나아가 타우의 과인산화를 억제시켜줌을 확인하였다. 또한, 인슐린저항성으로 인해 야기된 에너지 항상성의 불균형은 AMPK의 활성을 감소시키는데, AMPK는 자가소화를 담당함으로써 인슐린 분해효소(insulin degradation enzyme, IDE)를 분비함으로써 인슐린 뿐만 아니라 베타아밀로이드플라그를 분해시키게 된다. 도 8(B)의 결과를 통해 고지방식이군에서 AMPK의 인산화가 감소됨으로써 IDE 발현량이 감소함을 확인하였고 나아가 베타아밀로이드 플라그 형성이 촉진됨이 확인되었다. 반면, 샘플군에서는 AMPK 인산화의 회복에 따른 IDE 발현량의 증가 및 베타아밀로이드 플라그 형성의 감소가 확인되었다. 이에, 샘플 식이를 통해 고지방식이로 야기되는 중추 인슐린저항성으로 인한 인지손상 관련 메커니즘이 억제됨을 확인함으로써, 샘플이 고지방식이로 야기된 인지손상 개선에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 7. UPLC-QTOF/MS ² 분석

눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 주요 화합물을 분리하기 위해 크로마토그래피 분석에 근거한 ultra-performance liquid-quadrupole-time-of flight mass spectrometry (UPLC-QTOF/MS²) (Waters, Milford, MA, USA)을 수행하였다. 메탄올에 용해된 샘플을 0.2㎛ 필터로 여과하고, 페놀릭 화합물의 UPLC 분리를 ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column (2.1 x 100 mm, 1.7㎛ particle size, Waters Corp, Milford, MA, USA)에서 수행하고, 40℃에서 0.4 mL/min 의 유속으로 흘렸다. 분석에 사용된 이동상은 용매 A (distilled water with 0.1% formic acid) 및 용매 B (ACN with 0.1% formic acid)이고 용매 구배 조건은 다음과 같다 : 0-0.5분, 0% B; 0.5-8분, 100% B; 8-8.5 분 100% B; 8.5-10분 0% B; 및 10-11분 0% B. MS² 데이터를 얻기 위해, 이온화는 음성 전자 스프레이 (ESI) 모드로 작동되었다. 이온화 조건은 다음과 같다 : 램프 충돌 에너지, 20-45 V; 모세관 전압, 3 kV; 탈 용매 온도, 350℃ ; 분무기의 압력, 40 psi; fragmentor, 175 V; cone 전압, 40V; 질량 범위, 50-1,200 m/z; 오븐 온도, 40℃. 모든 MS 데이터는 MarkerLynx 소프트웨어(Waters MassLynx TM, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석했다.

실험결과, 크로마토그램을 통해 2개의 주요 peak를 확인하였으며(도 9(A)) 주요 peak에 대한 조각이온 경향 패턴을 참고문헌을 통해 각각 dicaffeoyl glucose isomer Ⅰ, Ⅱ로 명명된 것을 확인하고, 이에 따라 눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 주요 페놀릭 화합물은 dicaffeoyl glucose isomer Ⅰ, Ⅱ인 것을 확인할 수 있었다(각 도 9(B),(C)).

본 출원의 눈개승마 추출물의 분획물을 함유하는 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 출원은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제 를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전 하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조 한다.

제제예 5. 액제의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액 제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품 조성물의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강 식품에 적합한 성 분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시 하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

상기 실시예 1의 눈개승마 에틸아세테이트 분획물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖ 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을

여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 출원의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조 성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 냉동건조된 눈개승마를 에탄올에 혼합하고 추출하여 눈개승마 추출물을 수득하는 단계;
   상기 추출물을 여과 및 농축하는 단계;
   상기 농축된 추출물을 3차 증류수에 용해하고 동일 비율의 n-hexane, chloroform 및 ethyl acetate 용매를 사용하여 분획하여 각 분획물을 수득하는 단계;
   상기 ethyl acetate 분획물을 농축 및 냉동건조하여 수득하는 단계로 이루어진
   눈개승마 에틸아세테이트 분획물의 제조방법.
2. 제1항의 방법으로 제조된 눈개승마 에틸아세테이트 분획물.
3. 제2항에 있어서, 상기 분획물의 주요 페놀릭 화합물은 dicaffeoyl glucose isomer Ⅰ, Ⅱ인 것이 특징인 분획물.
4. 제3항의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물
5. 제3항의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미토콘드리아 손상 예방 및 개선용 식품 조성물
6. 제3항의 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지방식이로 야기된 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물
7. 제3항의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미고지방식이로 야기된 대사성 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물
   
   
   
   
   
   
   

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