KR20200029362A - 조직 유도 재생용 바이오물질 장치 및 국소 조성물 - Google Patents

조직 유도 재생용 바이오물질 장치 및 국소 조성물 Download PDF

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Abstract

유도된 조직 재생(GTR)을 위한 장치들은 키토산 및 가변성 콜라겐 조직(MCT)의 매트릭스를 포함하고, 여기서 상기 키토산은 MCT-키토산 복합 물질을 형성하기 위해 상기 MCT에 정전기적으로 결합되어 있다. 상기 MCT는 해면체들, 해파리, 연체동물들 및 극피동물들과 같은 무척추 해양 유기체들로부터 분리될 수 있다. 상기 MCT-키토산 복합 재료는 바이오 필름, 3D-해면체, 하이드로 겔, 또는 전기 방사 나노 섬유로 제형화 될 수 있거나, 또는 상기 MCT-키토산 복합 재료는 바이오 물질 표면을 코팅할 수 있다. 상기 장치들은 상처 드레싱 및 3D 해면체들을 포함하는 조직 해면체들을 포함할 수 있다. 적용 분야에는 조직 공학 및 상처 치유가 포함되고, 상기 상처 치유에는 화상 및 유도된 조직 재생 적용과 관련된 다른 것이 있다. 약제학적으로 허용되는 국소 담체에 함유된 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질은 흉터 치료뿐만 아니라 피부 변색 및 흑반/기미를 포함한 다양한 색소 침착 문제들을 치료하기 위한 화장품 용도들을 갖는다.

Description

조직 유도 재생용 바이오물질 장치 및 국소 조성물{BIOMATERIAL DEVICES AND TOPICAL COMPOSITIONS FOR GUIDED TISSUE REGENERATION}
본 발명은 조직 유도 재생(GTR; guided tissue regeneration)을 위한 바이오 물질 장치들(biomaterial devices)에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 조직 해면체들(tissue sponges), 상처 드레싱들, 화장품 조성물들 및 다른 장치들 및 GTR의 효과를 내기 위해 가변 콜라겐 조직(MCT)을 포함하는 국소부위용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 GTR의 효과를 내기 위해 MCT 및 키토산 바이오 폴리머(CHT; chitosan biopolymer)의 복합재들을 포함하는 장치들에 관한 것이다. 본 발명은 GTR을 촉진하기 위해 바이오 물질 장치들 내에서 MCT를 단독 또는 복합재로 적용하여 화상, 상처, 궤양, 및 기타 병변 및 관련된 피부 질환을 치료하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화장품 제제에 MCT 및/또는 MCT-키토산 복합재들을 적용함으로써, 흉터 및 피부 간반(chloasma)과 같은 피부 이상의 치료에 관한 것이며, 상기 변색은 갈변을 포함한다.
천연 중합체들은 많은 제약 용도들 및 의료 장치 기술들에 사용되어왔다. 하나의 천연 중합체인 키토산(여기서 때때로 CHT라고도 함)이 나노 입자들, 마이크로스피어들(microspheres), 하이드로 겔들, 필름들, 섬유들, 정제의 제조에 사용되었다. 키토산은 경구, 비강, 비 경구, 경피 및 안과용 제제와 같은 잠재적인 약물 전달 시스템들을 준비하는데 사용되어 왔다. 키토산은 상처 드레싱 및 조직 해면체를 제조하는데 사용되어 왔다(Kumar et al., Chem. Rev. 2004, 104, 6017-6084). 그러나, 키토산 제제들 및 물질들은 제한된 안정성, 생분해성 및 인장 강도를 포함한 수많은 단점들이 있다. 변형된 키토산 및 합성 복합 재료들과 같은 재료들은 키토산이 평가되도록 많은 동일한 용도에 대해 시험되었지만, 이러한 재료들 중 다수는 불충분한 바이오 적합성을 포함한 유사 단점들을 겪고 있다.
본 발명의 실시예들은 생분해성 및 생적합성 가변 콜라겐 조직(MCT) 및 MCT-키토산 복합 물질들을 제공한다. 이러한 복합재들은 하이드로 겔들, 바이오 필름들, 3차원 스폰지들 및 나노 섬유들과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 MCT-키토산 복합 물질들은 공지된 키토산 재료들보다 강하고 기계적 특성이 우수하다. 상기 복합재들의 상기 MCT 성분은 상기 키토산 성분의 상기 항균 및 지혈 특성에 바이오 안정성, 세포 부착, 물리적 및 화학적 안정성, 및 향상된 기계적 특성들을 추가하여, 치료적 적용들에서 상기 복합재의 상기 효과를 상당히 증가시킨다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 MCT 또는 MCT와 키토산(CHT)의 매트릭스를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 MCT는 해양 무척추동물들로부터 분리된다. 상기 매트릭스에서, 상기 CHT는 MCT-CHT복합 재료를 형성하기 위해 수소결합 및 쌍극자-쌍극자 상호작용과 같은 정전기적 상호작용들에 의해 상기 MCT와 연결될 수 있다. 일 측면에서, 상기 MCT-키토산 복합재는 MCT내에서 GAG(glycosaminoglycan)와 콜라겐 사이에서 고분자 전해질이 가교된 구조 및 키토산의 N-글루코사민 단위체들과의 상호작용을 포함한다. 상기 가변 콜라겐 조직은 콜라겐 및 글리코오스아미노글리칸(GAG)으로 구성될 수 있다.
일 측면에서, 상기 MCT는 콜라겐 및 황산 콘드로이틴을 포함할 수 있다. 상기 조성물들, 또는 상기 MCT는 상기 조성물을 형성하는데 사용되었고, 그것은 주로 제1 형 콜라겐으로 구성될 수 있다. 상기 키토산은 약 60% 내지 약 99%의 탈 아세틸화 정도(deacetylation degree)를 가질 수 있다. 상기 키토산의 평균분자량은 약 20kDa 내지 약 400kDa일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 복합 물질들에서 상기 MCT의 질량비는 상기 복합 물질에서 상기 키토산 질량비의 100:0 내지 10:90일 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 MCT의 상기 질량비는 상기 키토산 질량비의 약 100:0 내지 50:50이다.
적절한 해양 무척추 동물 공급원들(예를 들어, 해면체들, 해파리, 연체동물들 및 극피동물들)을 선택 및 분리하는 절차를 통해, 콜라겐 및 글리코오스아미노글리칸을 높은 수율로 얻은 MCT의 양과 비율이 제어될 수 있다. 예를 들어, 여러 결합 조직들의 주요 구조적 조성물인 원섬유형 콜라겐 함량이 더 높은, 제1 형 콜라겐의 함량을 갖는 MCT가 분리될 수 있으며 본 명세서에 기재된 조성물들에 사용할 수 있다. 추가적으로, 분리된 상기 MCT들은 구조적 이질성뿐만 아니라, 원섬유의 콜라겐(I, II, III, V, XI) 및 글리코오스아미노글리칸(황산 콘드로이틴(chondroitin sulfate), 히알루론산)의 유형의 본질적 측면에서, 편향되거나 제어될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 MCT는 해면체들, 해파리, 연체동물 및 극피동물과 같은 해양 무척추동물들로부터 분리될 수 있다. 더 상세한 일 실시예에 있어서, 상기 MCT는 성게들 및 해삼들과 같은 해양 무척추 극피동물들로부터 분리될 수 있다. 더욱 상세한 일 실시예에 있어서, 상기 MCT는 해삼들로부터 분리될 수 있다.
다른 일 실시예에서, MCT는 콜라겐으로 구성될 수 있다. 더욱 상세한 일 실시예에서 상기 콜라겐은 제1형, 2형, 3형, 5형 또는 11형 원섬유형 콜라겐일 수 있다. 더욱 상세한 일 실시예에서, 원섬유형 콜라겐은 제1 형이다. 본 명세서에 기재된 상기 분리 공정에 의해, 제1형 원섬유형 콜라겐은 선택적으로 분리될 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 MCT는 콜라겐 및 글리코오스아미노글리칸을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 글리코오스아미노글리칸은 황산 콘드로이틴, 히알루론산, 헤파린, 황산 케라탄, 황산 헤파란 및/또는 황산 더마탄(dermatan sulfate) 또는 두 성분들의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, MCT에 있는 글리코오스아미노글리칸은 황산 콘드로이틴 및/또는 히알루론산 또는 두 성분들의 혼합물을 포함할 것이다.
상기 MCT및 MCT-키토산 조성물은 하이드로 겔, 바이오 필름, 3D-해면체, 또는 나노 섬유일 수 있다. 나노 입자들은 경구 용액, 제4 용액, 또는 에어로졸과 같이 다양한 치료제 전달 시스템들로 제형화 될 수 있다. 바이오 필름은 상처 치유, 표면 코팅, 포장재로 형성될 수 있다. 3D-해면체들은 조직 공학 및 상처 드레싱 템플릿들과 같은 해면체로 사용될 수 있다. 나노 섬유들은 상처 드레싱 템플릿 또는 표면 코팅제들로서 제형화 될 수 있다.
몇몇 실시예들에서, 상기 MCT및 MCT-CHT 복합 재료는 물리적 및/또는 화학적 공정에 의해 가교될 수 있다. 물리적 가교는 방사선 처리(UV, 감마) 및/또는 열 처리에 의해 달성될 수 있다. 화학적 가교는 가교제를 MCT 또는 MCT-키토산 복합재에 첨가함으로써 달성될 수 있고, MCT의 상기 함량과 관련하여 가교된 바이오 물질들에 사용되는 가교제의 양은 약 0.1 내지 약 1.0%일 수 있다. 사용될 수 있는 가교제들은 글루타르알데하이드, 에틸-디메틸-카르보디미드(carbodiimide)(EDC)-M-하이드록시숙시니미드(hydroxysuccinimide)(NHS), 리보플라빈(riboflavin), 제니핀(genipin) 등을 포함한다. 상기 MCT 및 상기 MCT-키토산 복합 물질은 또한 향상된 수분 흡수, 열 안정성, 증기 투과 및 세포 부착을 갖는 3D 해면체의 바이오 필름을 만들어 낼 수 있다. 이러한 실시예들에서, 상기 바이오 필름들 및/또는 3D-해면체들은 조직 공학을 위한 해면체들, 및 수술 및 의료적 적용을 위한 상처 드레싱 템플릿으로서 적합할 수 있다.
본 명세서에서 또한 본 발명의 상기 방법은 포유류 MCT 또는 MCT-키토산 복합 물질을 투여하는 것을 포함하는, 생물활성제를 포유류에게 전달하는 방법을 제공한다. 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질들은 약물 또는 영양소와 같은 생물활성제를 캡슐화 하는 나노입자, 나노섬유, 하이드로 겔, 바이오 필름 또는 3D-해면체를 형성할 수 있다. 약물들, 비타민들, 및 영양소들은 지방을 포함한다. 예를 들어, 오메가-3 및 오메가-6 를 포함하는 지방산들, 지용성 비타민(예를 들어, 비타민 A, D, E 및/또는 E), 항생제들(예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 클린다마이신, 독시사이클린, 에리스로마이신, 메트로니다졸, 페니실린, 테트라사이클린, 반코마이신 등), 프로바이오틱스(예를 들어, 젖산 박테리아, 비피도 박테리아 등), 활성 피부 화합물들(예를 들어, 레티노 산, 트라넥사믹 산, 과산화수소, 하이드로 퀴논, 시스테아민, 아젤라익 산, 티로시나아제 억제제 등), β-카로틴 및/또는 아스코르빅 산과 같은 미량 원소들, 단백질들, 및 펩타이드를 포함한다. 일부 실시예들에서, MCT들 및 다른 영양 보충제들은 MCT-키토산 복합 매트릭스, 또는 MCT-키토산 복합 매트릭스를 포함하는 조성물에 포함될 수 있다.
상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질들은 상기 MCT 및 상기 복합 물질들을 제조하기 위한 성분들 및 방법들의 수를 변화시킴으로써, 다양한 조건 하에서 다양한 속도로 분해되도록 맞춤화 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 인간과 같은 포유류의 박테리아 감염 및/또는 진균 감염, 화상, 당뇨병 발 및 염증 상태와 같은 상태의 치료에 유용한 바이오 의학 장치 및 의약의 제조를 위한 조성물의 상기 용도를 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서, MCT 및 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 콜라겐화, 흉터 치유, 상처 치유, 기미(melasma) 및 간반(chloasma)의 감소, 및 기타 피부관련 이익들을 증진시키기 위해 치료용 화장품들, 또는 약용화장품으로 제공될 수 있고, MCT 또는 MCT-키토산 복합재들은 용액, 현탁액, 액체, 겔, 연고, 로션, 또는 크림을 포함하지만 이에 제한되지 않으며 약학적으로 허용되는 국소 담체와 함께 사용된다.
따라서, 바이오 적합성 및 생분해성이 있고, 인간 및 다른 포유류의 치료 및 요법에 사용하는데 적합한 안정성 및 기계적 특성들 및 성능을 갖는 새로운 물질들이 필요하다. 이러한 새로운 물질들 및 조성물들은 바람직하게는 키토산 단독에 대해, 예를 들어 추가적 및/또는 개선된 바이오 적합성, 높은 안정성 및 개선된 물리적, 생물학적 특성과 같은 장점을 가질 수 있다 치료제 전달을 위한 해면 조직들, 상처 드레싱들, 화장품들 및/또는 시스템들로써, 이들 물질의 사용가능성은 바이오 의학 공학, 바이오 물질 및 조직 공학 분야의 연구자들에게 추가로 도움이 될 것이다.
하기 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하고 특정 실시예들 또는 본 발명의 다양한 측면을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 어떤 경우에, 본 발명의 실시예들은 여기에 제시된 상기 상세한 설명과 함께 첨부된 도면을 참조함으로써 가장 잘 이해될 수 있다. 상기 설명 및 첨부된 도면들은 특정 예 또는 본 발명의 특정 측면을 강조할 수 있다. 그러나, 통상의 기술자들은 상기 예시 또는 관점의 일부분이 본 발명의 실시예에 따른 측면 또는 다른 예시와 조합하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
도면에서:
도 1A 및 1B는 일반적인 콜라겐 구조와 일반적인 MCT 구조 사이의 비교 구조를 도시한다.
도2는 글리코오스아미노글리칸들의 일반적인 구조들을 도시한다.
도 3A 및 3B는 소 콜라겐과 MCT사이의 원섬유 콜라겐 구조의 비교형태를 도시한다.
도 4는 키토산의 일반적인 구조를 도시한다.
도 5A 및 5B는 일 실시예에 따른 MCT-키토산 복합 물질들의 제조에 대한 개략도이다.
도 6은 일 실시예에 따른 MCT-키토산 복합 바이오 필름들의 제조에 대한 개략도이다.
도 7은 일 실시예에 따른 MCT-키토산 복합3D-해면체들의 제조에 대한 개략도이다.
도 8은 일 실시예에 따른 MCT-키토산 복합 하이드로 겔들의 제조에 대한 개략도이다.
도 9A는 MCT-키토산 전기방사 나노섬유들의 제조에 대한 개략도이고, 도 9B는 실시예에 따른 나노섬유들의 사진이다.
도 10A는 MCT-CHT 복합 바이오 필름들의 기계적 특성들에 대한 가교제(글루타르알데히드 0.1% v/v)의 효과를 도시하고, 도 10B는 일 실시예에 따른 MCT-CHT 복합 바이오 필름들의 팽창 거동을 도시한다.
도 11A 및 11B는 MCT-키토산 바이오 필름들 및 이들의 상처 드레싱 템플릿들로 적용이 가능한 대표적인 예시를 도시하고, 도 11C 및 11D는 주사 전자 현미경(SEM)에 의한 MCT-키토산 복합 전기방사 나노섬유의 형태적 특성을 도시한다.
도 12는 GTR 적용에 사용되는 다양한 MCT-키토산 복합 물질들의 개략도이다.
도 13A-13C는 실시예들에 따라 상이한 MCT/CHT 질량비로 제조된 MCT-키토산(MCT/CHT) 복합 3D-해면체들의 물리적 외관을 도시한다.
도 14는 상이한 MCT/CHT 질량비로 제형화 된 MCT-키토산 복합 3D-해면체들에 대한 TGA 온도 기록(thermogram)을 도시한다.
도 15는 상이한 MCT/CHT의 질량비로 제형화 된 상이한 MCT-키토산 복합 3D-해면체들에 대한 흡수 용량(absorption capacity)을 도시한다.
도 16A(세포 미첨가) 및 16B(세포 첨가)는 ADSC세포의 MCT-CHT-3D-해면체들로의 흡수를 나타내는 SEM 현미경을 도시한다.
도 17은 15일 배양 기간 동안 MCT-키토산 복합 3D-해면체들에서 배양된 ADSC 세포들의 증식 프로파일을 도시한다.
도 18은 상이한 질량비의 MCT-키토산 복합재들로 제조된 복합전기방사 나노섬유(ESNF)의 ATR-FTIR스펙트럼을 도시한다.
도 19는 키토산, MCT 및 MCT-키토산 복합재들에 대한 TGA의 열 분석을 도시한다.
도 20A-20C는 키토산의 SEM 현미경 사진이고, 도 20D-20F는 MCT-키토산 ESNFs의 SEM 현미경 사진이고, 눈금 막대는 10 mm (도 20A 및 20D), 눈금 막대는 2 mm (도 20B 및 20E), 및 눈금 막대는 200 mm (도 20C 및 20F), 여기서 원은 키토산 ESNF에서 잘못된 전기 방사 공정과 관련된 방울의 존재를 나타내며, 전기방사된 나노섬유들을 얻기 위한 MCT-키토산 복합재들의 개선 정도를 나타낸다.
도 21은 키토산, MCT 및 MCT-키토산 복합 ESNF들과 함께 배양된 L929 섬유아세포들의 증식을 도시한다.
도 22A-22C는 7일 배양 후, 키토산(도 22A), MCT- 키토산 복합재(도 22B) 및 MCT(도 22C) ESNF들에 대한 세포부착을 보여주는 SEM 현미경 사진이다.
도 23은 겔 전기영동 분석(SDS-PAGE)으로서, 송아지 및 닭으로부터 추출된 콜라겐 샘플들과 비교하여 MCT에 대한 주요 단백질 결합들을 도시한다.
도 24는 해삼으로부터 상기 MCT의 분리 공정의 상기 효과를 보여주는 겔 전기영동 분석(SDS-PAGE)을 도시하며, 배치(batch)로부터 배치까지의 MCT에 대한 단백질 결합들의 일관성이 도시되었다.
도 25A는 송아지 콜라겐과 비교하여 MCT 콜라겐에 대한 FTIR-적외선 스펙트럼에 관한 것으로, 두 샘플들 사이의 상기 화학적 구조 차이들을 보여주며, 도 25B는 해삼으로부터의 MCT 분리 공정의 효과를 보여주는 비교 FTIR 스펙트럼을 도시한 것으로, 배치로부터 배치까지의 MCT에 대한 상기 FTIR 화학적 프로파일의 일관성이 도시되었다.
도 26은 송아지 콜라겐 샘플들에 대한 열 거동의 차이를 나타내는 콜라겐 샘플들의 열 용량 분석(TGA)을 도시한다.
도 27은 해삼에서 추출되고, 송아지 피부로부터 분리된 소 콜라겐과 비교한 가변 콜라겐 조직에서 발견되는 콜라겐 구조 아미노산 조성물의 분포를 보여준다.
도 28A 및 28B는 용매 캐스팅 기법에 의해 제조된 MCT-키토산 드레싱 템플릿(3D-해면체)의 형태 및 다공성을 보여주는 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다.
도 29A 및 29B는 전기 방사 기술에 의해 제조된 MCT-키토산 나노섬유 드레싱 템플릿의 상기 표면 형태 및 구조를 보여주는 전기 주사 현미경(SEM) 이미지들이다.
도30A 및 30B는 일 실시예에 따른 흉터 크림의 투여 효과를 나타내는 사진의 전후를 나타낸다.
도 31A 및 도 31B는 일 실시예에 따른 흉터 크림의 투여 효과를 나타내는 사진의 전후를 추가적으로 나타낸다.
도 32A-32C는 일 실시예에 따른 흉터 크림의 투여 효과를 나타내는 사진의 전후를 추가로 더 나타낸다.
도 33A 및 33B는 일 실시예에 따른 흉터 크림의 투여 효과를 나타내는 사진의 전후를 추가로 더 나타낸다.
도 34A-34D는 일 실시예에 따른 흉터 크림의 투여 효과를 나타내는 사진의 전후를 나타낸다.
도 35A-35C는 MCT-DHT 복합 구조를 도시한다.
도 36은 일 실시예에 따른 상처 해면체 및 그 특성 및 특징을 도시한다.
도 37은 일 실시예에 따른 3D 해면체의 기능을 도시한다.
도 38은 일 실시예에 따른 장치의 기능을 도시한다.
본 출원은 2018년 9월 6일자로 출원된 미국 정규출원 제 16/123,942호의 이익을 주장하며, 본출원에서 그 전체를 참고문헌으로 포함한다.
본 발명의 관점들에 따르면, 본 출원은 가변 콜라겐 조직(MCT) 및 키토산의 조합을 포함하는 새로운 생분해성, 바이오 적합성 복합 물질들을 설명한다. 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합재들은 매우 다재다능하며, 예를 들어 피부 패치, 3차원 해면체들, 생분해성 봉합선들, 및 조직 공학에서 세포 증식을 위한 해면체들뿐만 아니라 조직 재생을 위한 하이드로 겔 및 바이오 필름들과 같은 다양한 종류의 바이오 물질로 구성될 수 있다.
추가적으로, 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질은 또한 개선된 수분흡수, 열 안정, 증기 투과 및 세포 부착을 갖는 3D-해면체의 바이오 필름과 같은 바이오 필름을 생성할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 상기 바이오 필름들 및/또는 3D-해면체들은 조직 공학에서 안내된 조직 재생을 위한 해면체, 및 수술 및 의료적 적용을 위한 상처 드레싱 템플릿으로서 적합할 것이다.
정의: 본 명세서의 특정 용어들은 다음과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 다른 모든 용어들 및 문구들은 통상의 기술자가 이해할 수 있는 평범하고 일반적인 의미를 갖는다. 이러한 명백하고 일반적인 의미는 Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14th Edition, by R.J. Lewis, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2001.의 기술사전들을 참조하여 얻을 수 있다.
본 명세서에서 "일 실시예", "실시예", "예시적인 실시예" 등은 상기 실시예가 특정 관점, 특징, 구조, 일부, 또는 특성을 포함할 수 있지만, 모든 실시예가 반드시 관점, 특징, 구조, 일부, 또는 특성을 포함하는 것은 아니라는 나타낸다. 게다가, 이러한 문구들은 본 명세서의 다른 부분들에서 언급된 동일한 실시예를 지칭할 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 또한, 특정 관점, 특징, 구조, 일부, 또는 특성이 실시예와 관련하여 설명될 때, 통상의 기술자에게 설명되기 위해 그러한 관점, 특징, 구조, 일부, 또는 다른 실시예들과 관련된 특성이 통상의 기술자의 지식 내에 있는 것인지가 명시적으로 기술되었는지 본다.
"및/또는"이라는 상기 용어는 항목 중 하나, 항목의 조합 또는 이 용어와 관련된 모든 항목을 의미한다.
"a", "an", 및 "the"의 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 다른 의미로 해석되지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 이에 더해, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 다수의 이러한 화합물들을 포함하므로, 화합물 X는 다수의 화합물들 X를 포함한다.
"약" 이라는 용어는 명시된 값의 ± 5%, ± 10%, ± 20%, 또는 ± 25%의 변화를 가리킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예들에서 "약 50" 퍼센트는 45 내지 55퍼센트의 변동을 가질 수 있다. 정수 범위의 경우, "약"이라는 상기 용어는 인용된 정수보다 크거나 및/또는 작은 정수를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한, "약"이라는 상기 용어는 예를 들어, 중량 백분율과 같은 상기 개별 성분, 상기 조성물, 또는 상기 실시예의 기능적 측면에서 동등한 가치인 언급된 범위에 근접한 가치를 포함하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 언급된 범위(예를 들어, 중량 백분율, 탄소 그룹들 등)는 특정 값, 정수, 십진법, 또는 동일성의 범위를 포함한다. 본 명세서에 나열된 특정 값들은 단지 예시를 위한 것이며 다른 정의 값 또는 정의된 범위 내의 다른 값들은 제외하지 않는다.
"하나 이상의"이라는 상기 어구는 특히 그 사용시의 문맥에서 읽을 때 통상의 기술자에게 쉽게 이해된다. 예를 들어, 페닐 고리가 2치환된 경우, 페닐 고리상의 하나 이상의 치환기는 예를 들어, 1 내지 5개, 또는 1내지 최대 4개를 지칭하기도 한다
"접촉"이라는 상기 용어는 예를 들어, 반응 혼합물 또는 용액 내 물리적 변화 또는 다른 반응 혼합물 내 물리적 변화처럼, 상기 분자 수준을 포함하여, 터치, 접촉, 또는 즉시 또는 가까이 가져오는 행위를 의미한다.
"유효량"은 일반적으로 원하는 효과를 제공하는 양을 의미한다. 그러므로 유효량은 치료되는 상태 또는 질병 상태에 대한 치료 효능을 향상시키는데 충분한 투여량을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 상기 환자, 상기 질병, 및 영향을 받는 상기 치료에 따라 달라질 수 있다.
"환자" 또는 "주체" 와 같은 상기 용어들은 들쥐들, 생쥐들, 다른 설치류들, 토끼들, 개들, 고양이들, 돼지들, 소들, 양들, 말들, 영장류들, 및 인간을 포함한 포유류와 같은 임의의 동물을 가리킨다.
MCT와 관련하여, "실질적으로 콜라겐을 포함"이라는 상기 문구는 적어도 원섬유형 콜라겐을 포함함을 의미한다. 예를 들어, MCT 원섬유형 콜라겐은 제 1, 2, 3, 5 및/또는 11형 콜라겐을 포함할 수 있다. 일 측면에서, MCT 원섬유형 콜라겐은 제1 형으로 특징화 될 것이다. 본 명세서에 기재된 복합재들로부터 명확히 제외되거나 포함될 수 있는 다른 화합물들은 제2, 3, 5 및/또는 11형 원섬유형 콜라겐 또는 이들의 조합을 포함한다. "글루코오스아미노글리칸"의 상기 용어는 예를 들어, 황산 콘드로이틴(chondroitin sulfate), 히알루론산, 헤파린, 황산 케라탄, 황산 헤파란 및/또는 황산 더마탄과 같은 반복 이당류 단위체를 포함하는 긴 비 분지 다당류들을 포함하는 분자를 의미한다.
가변 콜라겐 조직(MCT): 극피동물들은 모든 바다에 널리 퍼져있는 해양 무척추동물이며, 수십년 동안 먹이로 사용된다(예를 들어, 해삼 및 성게). 그들은 또한 신경계 조절 하에서 수동 기계적 성질(강성 및 점도)을 빠르게 변화시킬 수 있는 가변성 콜라겐 조직(MCT)으로 불리는 그들의 독특한 결합 조직으로 잘 알려져 있다. MCT는 극피동물들의 독특한 특징이며, 5개의 현존하는 모든 클래스에서 설명되었다( I.C.　Wilkie, "가변 콜라겐 조직: 개관 및 관점," V.　Matranga　(Ed.),　Echinodermata. Progress in Molecular and Subcellular Biology. Marine Molecular Biotechnology,　vol. 5,　Springer,　Berlin　(2005), pp.　221-250.). 가변 콜라겐 구조들은 피브릴린(fibrillin) 미세섬유들(microfibrils)의 탄성 중합체 네트워크에 의해 번들(bundles) (fibers)로 조직된 불연속적인 콜라겐 섬유들로 구성되며, 섬유에 결합하고 응집하는 글리코오스아미노글리칸으로 구성된 응력-전달 매트릭스에 의해 상호 연결된다. 이러한 유형의 조직은 최근에 조직 공학 및 재생 의학 적용을 위한 "스마트 다이나믹 바이오 재료들"에 대한 영감의 근원으로 제시되었습니다(A.　Barbaglio, S.　Tricarico,　C.　Di Benedetto, D.Fassini, A.P.　Lima, A.R.　Ribeiro, C.C.　Ribeiro, M. Sugni, F.　Bonasoro,　I.C.　Wilkie,　M.　Barbosa,　M.D.Candia Carnevali, "극피 동물들의 스마트 결합 조직: 생명 공학 적용 분야에 대한 실현 가능성," Cah. Biol. Mar.,　54　(2013), pp.　713-720; C.　Di Benedetto, A.　Barbaglio, T.　Martinello, V.Alongi, D.　Fassini, E. Cullora, M.　Patruno,　F.Bonasoro,　M.A.　Barbosa,　M.D.　Candia Carnevali,　M.Sugni, "대안적이고 지속 가능한 공급원으로부터 해양 콜라겐 매트릭스들의 생산 및 특성화 및 바이오 적합성: 성게 Paracentrotus lividus," Mar. Drugs,　12　(2014), pp.　4912-4933. ). 특히, 상기 해삼 막(잘 알려진 MCT)은 재생 의학 적용을 위한 얇은 막들을 생성하기 위해 지속 가능하고 바이오 적합성 있는 천연 원 섬유 콜라겐 공급원을 제공할 수 있다. 도 1은 일반적인 콜라겐 구조를 보여준다. 왼쪽이 소 콜라겐의 경우이고, 오른쪽이 MCT의 일반적 구조이다. MCT의 경우, 도 1의 오른쪽은 원섬유 사이의 매트릭스들과 콜라겐 섬유들 사이에 프로테오글리칸-CAG 가교 결합을 갖는 상기 구조 일부의 분해도를 보여준다.
상기 "청색 바이오 물질들"중에서 해양 무척추동물 콜라겐은 가장 일반적으로 사용되는 포유류 유래 콜라겐(예를 들어, 도1의 좌측에 도시된, 소 콜라겐)을 유효한 대체물로서 제시한다. 포유류 유래 콜라겐은 식품, 제약/기능 식품 산업 및 화장품과 같은 대규모 용도들로부터 세포 배양 및 생의학/ 임상적 용도들과 같이 보다 표적화 된 분야까지 인간 이용 분야에서 일상적으로 사용된다. 그러나 알레르기 문제, 종교문제 및 사회/생활 양식 제약, 질병 전파 관련 이유들(예: 소 해면상 뇌증), 및 재조합 기술의 높은 비용으로 인해 포유류에 대한 콜라겐 공급원이 지속적으로 연구되고 있다(T.H.　Silva,　J.　Moreira-Silva,　A.L.P.　Marques,　A. Domingues,　Y.　Bayon,　R.L.　Reis, "해양 기원 콜라겐 및 그 잠재적 적용", Mar. Drugs,　12　(2014), pp.　5881-5901.).
하단의 도 2에 상기 일반적인 구조를 나타내는 글리코오스아미노글리칸은 반복되는 이당류 단위체로 구성된 긴 비분지 다당류이다. 아미노 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)의 상기 반복되는 단위체는 우론산(글루쿠론산 또는 이두론산) 또는 갈락토오스와 함께 구성된다. 글리코오스아미노글리칸들은 극성이 높고 물을 끌어들인다. 그러므로, 그것들은 주로 세포 표면 또는 상기 세포외 매트릭스(ECM)에 위치하는 윤활제 또는 충격 흡수제로서 신체에 유용하다.
극피동물 MCT들의 또 다른 장점은 그들의 원래 구조(Di Benedetto et al., 2014, 에서 인용)를 유지하는 다량의 천연 콜라겐 원섬유들을 쉽게 얻을 수 있다는 것이다. 실제로, 대부분의 포유류 콜라겐은 일반적으로 가수분해된(가용화된 산) 형태로 사용되는데, 이는 상기 생성된 막/해면체의 상기 기계적 성능을 강하게 저해시키고, 섬유소 3차원적 구조가 요구됨(예를 들어, 힘줄/인대 재생 또는 진피 재생)과 함께 바이오의학 적용에서 제한될 수 있다. 극피동물의 MCT들은 결합 조직의 생리학적 상황에 대한 초구조적이고 기계적 특성 측면에서 높은 유사성을 갖는 원섬유형 콜라겐 막들을 빠르고 쉽게 생성하는데 유용할 수 있다. 도 3A 및 도 3B는 소 콜라겐 (도 3A) 및 MCT (도 3B)에 대한 콜라겐 섬유질 구조의 비교 형태를 보여준다. MCT 원섬유들은 글루코오스아미노글리칸(GAG)에 의해 내부적으로 가교되어, 콜라겐의 거대분자 구조에 더욱 안정성을 부여하고 생분해성, 상처 치유의 중요한 측면 및 소 콜라겐 결핍 특성을 감소시킨다. 도 35A-35C는 GAG를 사용하는 원섬유들의 가교를 도시한다. 도 35A는 상기 콜라겐 원섬유들의 거시적 배열을 보여주고, 정렬된 원섬유 구조들이 글리코오스아미노글리칸(GAG)과 콜라겐의 핵심 단백질 사이의 상호작용에 의해 구동되는 원섬유 사이의 가교 결합 네트워크에 의하여 함께 유지됨을 보여준다. 도 35B는 원섬유 사이의 가교 결합 네트워크를 보다 상세히 보여준다. 도 35C는 강하게 조직된 그물망의 다방향 안정성을 도시하여, 결과적으로 바이오내에서 기계적 성능 및 생분해특성을 개선시킨다.
MCT원섬유형 콜라겐을 상업적 용도로 쓰기에 적합한 특정 재생 의학 분야는 유도 조직 재생(GTR)이다. GTR의 상기 목표들 중 하나는 수술 후 조직 유착을 감소시키는 것인데, 일반적이고 부분적으로 해결된 문제로는, 적절한 조직 재생을 방해하는 것이다. 유착은 수술 후 또는 국소 염증으로 인해 조직들 또는 기관들 간에 형성되는 비 정상적인 부착 또는 세포의 혼합이다. 최근에 들어서야 연구자들은 그것들을 극복하기 위해 효과적이고 만족스러운 도구들을 생산하고자 노력했다. 실제로, 여러 가지 다른 바이오 물질들(예를 들어, 키토산 및 히알루론산)을 포함하는 장벽-막들은 GTR에 대해 시험되었지만, 상기 필요한 기능적 특성들을 모두 보여주지는 않았으며, 가장 중요한 것은 근본적인 해부학상의 구획으로의 세포 침투를 피하는 것이다(S.　Tang,　W.　Yang,　X.　Mao, "접착 방지 시트로서의 아가로스/콜라겐 복합 골격", Biomed. Mater.,　2　(2007), pp.　S129-S134). 극피동물의 MCT기반 막들은 원하는대로 수정될 수 있는 다공성 및 3차원 구조를 갖는다.
키토산: 키틴은 폴리 N-아세틸 글루코사민으로 구성된 바이오 폴리머이다. 키틴은 지구상에서 셀룰로오스 다음인, 두번째로 풍부한 바이오 폴리머이다. 그것은 일반적으로 해양 절지동물의 상기 껍질과 같은 다수의 무척추동물의 외골격 또는 상피들, 및 대부분의 곰팡이와 일부 조류의 상기 세포벽에서 발견된다. 키틴은 일반적으로 물에 녹지 않으나, 수용성 양이온 다당류를 형성하기 위해 수산화 나트륨과 같은 산화제로 처리함으로써 탈 아세틸화 될 수 있다. 키토산의 상기 화학명은 폴리(β-(1→4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루코피라노스(glucopyranose)). 도 4는 키토산의 일반적인 화학적 구조를 보여준다.
HemCon Medical Technologies에서 생산한 키토산 기반 붕대들 및 수술 드레싱들은 최근 미국의 승인을 받았다. 지혈 붕대로 사용하기 위한 FDA는 MRSA 및 acinetobacter baumannii를 포함한 광범위환 유해 유기체들에 대한 입증된 항균 특성을 갖는다. 상기 붕대들 및 드레싱들은 광범위한 동맥 출혈을 포함하여, 빠르게 지혈하는데 사용할 수 있다. 상기 물질들의 상기 혈액 응고 및 상기 항균 특성은 키토산에 기인할 수 있다(미국 특허 제 7,482,503(Gregory et al.)호는 본원 명세서에 참조로서 포함된다). 상기 MCT-키토산 복합 물질은 본 명세서에 기재된 상기 복합물들에서 키토산 대신 사용될 수 있으나, 점막 점착성, 바이오 적합성, 및 생분해성과 같은 키토산의 유용한 특징은 여전히 유지될 수 있다.
키토산은 Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO 와 같은 많은 화학 공급 업체들로부터 상업적으로 이용가능하다. 키토산은 다양한 등급들, 평균 분자량들, 및 탈 아세틸화 정도로 제공된다.
일부 실시예들에서, 상기 키토산은 "고 분자량"키토산 일 수 있다. 고 분자량 키토산은 수 평균 분자량이 적어도 약 100kDa, 일반적으로는 약 170kDa 내지 약 400kDa인 키토산을 지칭한다. 일부 실시예들에서, 고 분자량 키토산은 적어도 약 100kDa, 적어도 약 110kDa, 적어도 약 150kDa, 또는 적어도 약 200kDa의 분자량을 가질 수 있다. 다른 실시예들에서, 고 분자량 키토산의 분자량은 약 100kDa내지 약 400kDa, 약 120kDa 내지 약 400kDa, 약 150kDa 내지 약 400kDa, 약 170kDa 내지 약 400kDa, 약100kDa 내지 약 300kDa, 약 120kDa 내지 약 300kDa, 약 150kDa 내지 약 300kDa, 약 170kDa 내지 약 300kDa. 도 4에서 "DA"의 상기 값은 임의의 수 또는 범위일 수 있고, 그것은 대략적으로 본 명세서에 기재된 키토산의 상기 N-아세틸-D-글루코사민 함량의 값들일 수 있다. 통상의 기술자에게 빠르게 인식될 수 있는 바와 같이, 도 4에 도시된 키토산은 또한 부분적으로 아세틸화 될 수 있다.
다른 실시예들에서는 저 분자량 키토산을 포함할 수 있다. 저 분자량 키토산은 100 이하의 단량체 단위체들(약 18kDa 이하 또는 약 20kDa 이하)을 갖는 키토산 분자를 가리킨다. 키토산의 분자량은, 예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피 및 모세관 점도에 의해 결정될 수 있다.
상기 키토산은 일반적으로 적어도 약 60%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 탈 아세틸화도를 가질 수 있다. 그 대신에, 상기 키토산은 완전히 탈 아세틸화 될 수 있다.
MCT-키토산 복합 재료: 키토산은 양으로 하전된 아미노 그룹들에 의해 구동되는 정전기적 상호작용에 의해 MCT 구조적 성분들에 결합하여, 양 MCT 및 키토산 고분자량 및 충전 밀도에 의한, 강한 수소 결합 및 쌍극자-쌍극자 상호작용들을 형성할 수 있다. 이러한 상호작용들은 하이드로 겔들, 바이오 필름들, 3D-해면체들, 및 나노 섬유들과 같은 안정적인 바이오 물질들의 개발을 가능하게 한다. MCT-키토산 복합 물질들은 상처 치유 효과를 위한 피부 패치들, 화장품들, 및 드레싱들을 준비하기 위해 GTR에 사용될 수 있다. MCT-키토산 복합 물질들은 하이드로 겔들 또는 해면체 유사 물질들 또는 골격들처럼 피부 및 연골 조직 배양을 위해 조직 공학용 매트릭스들, 및 바이오의학 기기들용 바이오 적합성 코팅으로 사용될 수 있다.
MCT 및 MCT-키토산 복합 물질들은 알려진 합성 및 동물 콜라겐 기반 장치들에 비해 높은 바이오 적합성, 향상된 기계적 성능, 및 우수한 생분해성을 제공한다. 상기 MCT-키토산 복합재들(항균성, 항진균 및 상처 치유 특성)에서의 직접적인 생물학적 효과뿐만 아니라, 상기 바이오 물질은 경구, 피부, 또는 호흡 전달을 위한 치료제들을 캡슐화하기 위한 표적화 또는 제어된 출력 시스템에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 나노 입자들 및 바이오 필름들은 MCT 및 키토산으로부터 준비될 수 있다. 콜라겐을 포함하는 MCT는 특히 나노 입자들을 제조하는데 유용하다. MCT는 주로 원섬유형 콜라겐을 포함하기 때문에, MCT는 MCT-키토산 복합 하이드로 겔들, 바이오 필름들, 3D-해면체들 및 나노 섬유들을 제조하는데 적합하고, 알려진 동물 콜라겐 기반 바이오 물질들에 비해 우수한 기계적 성능을 갖는 복합 바이오 물질을 제공한다.
상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 생물학적 호환성 가교제들(글루타르알데하이드, ECC/NHS)과의 반응 또는 진공 하에서의 열 처리에 의해, 화학 처리에 의한 준비 동안 가교될 수 있다. 복합 중합체 매트릭스의 팽창은 기계적 특성의 빠른 분해 및 감소를 불러 일으킬 수 있다. 가교 결합은 복합 바이오 물질들의 자발적인 팽창을 방지하거나 감소시키고, 기계적 성능 및 취급성을 증가시킨다.
몇몇 실시예들에서, 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질은 키토산 또는 MCT 이외의 중합체들을 포함하거나 배제할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시예들은 덱스트란, 알긴산염, 및/또는 하이드록시에틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유래 물질들을 포함하고, 다른 실시예들은 이들 중 일부 또는 전부를 배제한다. 일부 실시예들은 폴리비닐알코올, 폴리카프로락톤 또는 폴리에틸렌 옥사이드, 합성 중합체들을 포함하는 반면, 다른 실시예들은 이들 중 일부 또는 전부를 배제한다.
MCT, 키토산 및 조합 제품들의 분석: 다양한 방법들이 MCT, 키토산 및 이들의 복합 제품을 평가하고 분석하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 질량 분석, 기계적 특성들(인장 강도) 및 팽창 특성, 주사 전자 현미경(SEM) 및 표면 형태를 특성을 나타내기 위한 원자력 현미경(AFM), 복합 바이오 재료의 열 특성 분석을 위한 시차주사 열량측정법(DSC)이 포함되어 있다. 상기 복합 바이오 물질들의 인장 강도 및 팽창 특성은 ASTM 측정에서 특성화됐다.
본 명세서에 기재된 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합재들의 분석은 키토산만을 포함하는 조성물들과 비교하였을 때, 상기 복합 재료들이 개선된 안정성, 더 높은 약물 로딩 용량, 개선된 약물 방출 특성, 개선된 세포 흡수, 더 큰 다공성, 개선된 인장 강도, 및 열 안정성을 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 물질들은 또한 시험관 내에서 비세포독성이다.
상처 치유: MCT 및 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 또한 순수한 키토산과 관련하여, 향상된 정균 활성, 개선된 바이오 적합성 및 향상된 기계적 특성들을 나타내기 때문에 상처 치유 효과의 유용한 특성들을 갖는다. 상기 MCT-키토산 복합재들은 키토산 항균 활성이 증가된 것으로 나타났다. 상기 복합재들은 상기 음으로 하전된 박테리아 표면에 결합하여 상기 세포막을 교란시킨다. 이러한 특성들은, 예를 들어, 궤양 및 화상 치유를 촉진하기 위해 사용되는 주사용 하이드로 겔들, 피부 패치들, 및 상처 드레싱 템플릿들의 제형화에 의해 GTR 사용에 적용될 수 있다. 상기 MCT-키토산 복합재들은 또한 상처 및 수술 드레싱들에서 지혈제들로서 사용될 수 있다.
상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 다양한 다른 바이오 의학 용도에 사용될 수 있다. 우수한 혈액 호환성, 강화된 기계적 성능, 및 세포 성장 효율과 같은 상기 바이오 적합 특징들의 결과로, MCT-키토산 복합재들은 외과용 및 재생 의학에 사용될 수 있다. MCT-키토산 복합 막들의 상기 투과성은 플라즈마 처리를 통해 제어될 수 있다. 결과적으로, 이러한 복합 막들은 투석에 사용될 수 있다.
상기 언급된 미국 특허 제 7,482,503호(Gregory et al.)는 상처 드레싱의 상기 제조 방법들을 설명한다. 상처 드레싱들은 Gregory et al.에서 설명된 키토산 바이오 물질을 대신하여, 본 명세서에서 설명된 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 물질들을 사용하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 게다가, 상기 MCT-키토산 복합재들은 유해한 바이오 필름 형성 또는 환자들의 균혈증을 방지하고, 및 바이오 모방 및 골격 합성을 촉진하기 위해 스텐트들, 카테터들, 및 인공 삽입물들과 같은 의료 장치용 코팅제로 사용될 수 있다. 키토산으로의 MCT 착화는 SEM 현미경들로 나타낸 것과 같이, 3D-해면체 골격들의 상기 다공성을 증가시키는 콜라겐 원섬유의 표면 변형을 촉진시킨다. MCT는 또한 기계적 분석 및 DSC열량 측정법에 의해 보여지는 것과 같이, 인장 강도, 팽창도, 및 열 안정성과 같은 키토산 골격들의 상기 물리적 특성들을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
조직 공학: 조직 공학(TE) 연구는 다공성 생분해 고분자 매트릭스들에 세포를 살포하는 것을 기반으로 한다. 성공적인 살포를 위한 주된 요소는 세포들이 증식하고 분화하기 위한 임시 매트릭스 또는 골격으로서 역할을 하는 우수한 바이오 물질들의 상기 유용성이다. 최근에, 키토산 및 그 유도체들은 상기 새로운 조직들이 형성되는 것처럼 그들이 분해되어, 결국에는 염증 반응 또는 독성 분해 없기 때문에, 해면체 유사 물질들의 매력적인 후보들로 보고되었다. TE 적용에서, 키토산의 상기 양이온 성질은 주로 음이온성 글리코오스아미노글리칸들, 프로테오글리칸들, 및 다른 음으로 하전된 분자들과의 정전기적 상호작용들을 담당한다.
키토산으로의 MCT 착화는 SEM 현미경들로 나타낸 바와 같이, 3D- 해면체들의 상기 다공성을 증가시키는 키토산 필름들의 표면 개질을 촉진한다. MCT는 또한 기계적 분석 및 DSC 열량 측정법에 의해 나타낸 바와 같이, 인장 강도, 팽창도, 및 열 안정성과 같은, 키토산 바이오 필름들의 상기 물리적 특성들을 개선시키는 것으로 확인됐다. 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 세포들의 기능 및 형태를 제어하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 GTR을 위한 상처 치유 과정에서 조직 공학 골격 또는 매트릭스로써 사용될 수 있다. 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 또한 TE 사용을 위해 화학적으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 상기 복합재들은 MCT 척추에 특정 당을 이식함으로써 변화될 수 있다. 특정 세포들은 상기 특정 당들을 특정하게 인식할 수 있으며, 따라서 B-세포들, 수지상 세포들, 대식세포들과 같은 항원 제시 세포들에 대한 특정한 인식을 제공할 수 있다.
화장품 제제들: 본 발명은 또한 치료용 화장품들(화장품들(cosmeceuticals))로서 사용하기 위해 본 명세서에 기술된 MCT 및 MCT-키토산 복합재들을 포함하는 제제들을 제공한다. 분말 또는 용액 형태의 MCT 및 MCT-키토산 복합재들은 기본 화장품 제제들에 첨가되어 제약, 및/또는 기능성 화장품 제품들을 형성할 수 있다. 이들 화장료 조성물들은 피부학적 및/또는 약제학적으로 허용되는 국소 담체로 제형화 될 수 있지만, 용액, 현탁액, 액체, 겔, 연고, 로션, 또는 크림에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물들은 조직 내로 MCT 및 CHT을 장기간에 걸쳐 방출하고, 콜라겐 합성, 흉터 치유, 상처 치유, 기미/간반의 감소 또는 다른 피부 변색, 및 피부에 대한 다른 이점을 촉진한다.
화장료 조성물들은 미국 특허 제 9,980,894호 및 미국 특허 제 9,962,464(Herrmann et al.)에 설명된 상기 기술과 같이, 통상의 기술자들에게 공지된 일반적 기술에 의해 제형화 될 수 있으며, 이 둘은 본 명세서에 참조로써 통합된다.
약물들, 비타민들 및 영양소들의 예시들은, 오메가-3 및 오메가-6지방산을 포함한 지방산들, 지용성 비타민들(예를 들어, 비타민 A, D, E 및/또는 K), 수용성 비타민들(예를 들어, 비타민 C, 티아민, 리보플라빈, 나이아신, 판토텐산, 비타민 B6, 엽산, 비타민 B12), 항생제(예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 클린다마이신, 독시사이클린, 에리스로마이신, 메트로니다졸, 페니실린, 테트라사이클린, 반코마이신 등), 프로바이오틱스(예를 들어, 젖산 박테리아, 비피도 박테리아 등), 활성 피부 화합물들(예를 들어, 레티노산, 트라넥사믹산, 과산화수소, 하이드로 퀴논, 시스테아민, 아젤라산, 티로시나아제 억제제 등)과 같은 액상을 포함한 제제로 통합될 수 있다. 상기 제제는 베타카로틴 및/또는 아스코르브 산, 단백질들, 및 펩타이드들과 같은 미량 영양소로 구성된다.
이러한 조성물들 및 제제들은 일반적으로 0.1% 이상의 MCT 또는 MCT-키토산 복합 재료들을 함유한다. 상기 조성물들 및 제제들의 상기 백분율은 물론 다양할 수 있고, 편리하게는 주어진 단위 투여 형태 중량의 약 2% 내지 약 60% 사이일 수 있다. 치료적으로 유용한 조성물들에 있어서, MCT 및 MCT-키토산 복합 물질들의 상기 양은 효과적인 투여 수준을 얻을 수 있도록 하는 양이다.
화장료 조성물 등은 또한 다음을 함유할 수 있다: 잔탄검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 및/또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제; 일부 특정 화장료 조성물들은 상기 유형의 재료, 식물성 오일 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 상기 액체 담체 또는 운반기는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜, 등), 식물성 오일들, 무독성 글리세릴 에스테르들, 및 이들의 적절한 혼합물과 같은, 용액 또는 액체 분산액일 수 있다. 상기 적절한 유동성은 예를 들어, 분산액들의 경우 입자 크기의 유지 또는 계면활성제들의 사용에 의해 유지될 수 있다. 특정 미생물들의 작용의 예방은 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티오메르산 등과 같은 다양한 추가적인 항균 및 항진균제에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 그것은 예를 들어, 당들, 완충제들 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제의 상기 조성물 내의 사용에 의해, 주사제들의 흡수 지연을 불러일으킬 수 있다. 물론, 임의의 단위체 투여 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 상기 사용되는 양으로 약제학적 허용이 되고 실질적으로 무독성이어야 한다.
국소 투여를 위해, 상기 MCT 및 MCT-키토산 복합 재료들은 순수한 형태로 적용될 수 있다. 그러나, 그것은 일반적으로 그것들을 상기 피부에 조성물들 또는 제제들로써 투여하기 위해 고체 또는 액체인 것이 바람직할 것이다. 상기 조성물들 또는 제제들의 예로는 피부학적 및/또는 약제학적으로 허용되는 국소 담체와 결합한 것이다.
유용한 고체 담체는 활석, 점토, 미세 결정질 셀룰로오스, 실리카, 알루미나 등과 같은 작게 분할된 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체들은 물, 디메틸설폭사이드(DMSO), 알코올들 또는 글리콜들 또는 물-알코올/글리콜 혼합제들을 포함하며, 상기 MCT 또는 MCT-키토산 복합 물질들은 효과적인 수준으로 용해 또는 분산될 수 있고, 무독성 계면활성제들의 상기 도움으로 선택적으로 용해 또는 분산될 수 있다. 주어진 용도에 대한 특성을 최적화 하기 위해 향료들 및 추가적인 항균제들과 같은 보조제가 첨가될 수 있다. 상기 생성된 액체 조성물들은 흡수성 패드들로부터 도포될 수 있고, 붕대들 및 다른 드레싱들을 스며들게 하는데 사용되거나, 또는 펌프형 또는 에어로졸 분무기들을 사용하여 상기 영향을 받는 영역에 분무될 수 있다.
합성 중합체들, 지방산들, 지방산 염들 및 에스테르들, 지방 알코올들, 변성된 셀룰로오스들 또는 변성된 미네랄 물질들과 같은 증점제들을 액체 담체들과 함께 사용하여 상기 사용자의 상기 피부에 직접 작용하도록, 확산성 페이스트들, 겔들, 연고들, 비누들 등을 직접 사용할 수 있다.
MCT 또는 MCT-키토산 복합 물질들을 피부에 전달하는데 사용될 수 있는 유용한 피부학적 조성물들의 예시들은 당 업계에 공지되어 있으며; 예를 들어 Jacquet et al.(미국 특허 번호. 4,608,392), Geria(미국 특허 번호. 4,992,478), Smith et al.(미국 특허 번호. 4,559,157), 및 Wortzman(미국 특허 번호. 4,820,508)들은 모두 본 명세서에 참조로써 포함된다.
본 발명의 관점들은, 포유류의 GTR과 관련된 다양한 상태들을 치료하는 방법들을 제공하며, 본 발명의 하나 이상의 실시예들에 따른 MCT 또는 MCT-키토산 복합재의 유효량을 갖는 조건으로 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. 포유류는 영장류, 인간, 설치류, 개과, 고양이과, 소, 양, 말, 돼지, 염소 등을 포함한다.
하기의 실시예들은 본 발명의 관점들을 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 좁게 해석하여서는 안된다. 통상의 기술자는 상기 예시들이, 본 발명이 실시될 수 있는 다른 방식들을 제안한다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 발명의 상기 범위 내에서 수많은 변형들 및 수정들이 생길 수 있다는 것을 이해해야 한다.
[실험예]
실험예 1. MCT-키토산 복합재들 : 제조, 데이터 및 적용들
제약 등급 키토산(1H NMR에 의해 계산된 탈 아세틸화도 92%; 비점도계(specific viscosimetry)에 의해 계산된 평균 분자량 185kDa)은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 상기 탈 아세틸화 정도 및 평균 분자량 분포는 MCT-키토산 복합재들의 제조에서 키토산의 탈 아세틸화 정도가 더 높거나 낮은 및/또는 더 높거나 낮은 평균 분자량을 제공하도록 제어 될 수 있다.
가변 콜라겐 조직(MCT)은 해양 무척추 동물들로부터 분리하였다. 상기 성게, 불가사리 및 해삼의 성체 표본을 중국, 타히티, 및 일본의 스쿠버 다이버들이 서로 다른 장소들에서 수집하고, 즉시 해부했다. Ferrario C., Leggio L., Leone R., Di Benedetto C., Guidetti L., Cocce V., Ascagni M., Bonasoro F., La Porta CAM, Candia Carnevali MD, Sugni M의 "극피동물의 결합 조직으로부터의 해양 유래 콜라겐 바이오 물질들" Mar Environ Res. Volume 128, pp. 46-57에서 묘사된, 성게 이끼류의 막들, 불가사리의 입에서 먼 다리의 벽들(aboral arm walls) 및 해삼 전신 벽들(body walls)의 샘플들을 at -20 °C에서 콜라겐 추출 프로토콜에 대해 수집 및 저장하였다. 동물 수집 및 실험 조작은 각국의 법규들 및 규정들에 따라 수행되었다. 성게(이끼류의 막들) 및 불가사리(비경구 팔 벽들)는 작은 조각들로 해부하고, 인공 해수로 헹구고, 저농도의 완충액(10 mM Tris, 0.1% EDTA)에 상온에서 12시간 동안 방치하고, 이어서 탈-세포 용액(10 mM Tris, 0.1% 황산도데실나트륨)에 상온에서 12시간동안 방치하였다. 인산 완충 염수(PBS)에서 여러 차례 세척을 한 후, 샘플들을 분해 용액(0.5M NaCl, 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M 베타-머캅토에탄올, 0.05 M EDTA-Na)에 넣었다. 상기 수득된 MCT현탁액을 실온에서 3시간 동안 0.5M EDTA-나트륨 용액(pH 8.0)을 dH2O에 대해 여과하고 투석하였다. 불가사리 샘플들은 신선한 세포에 존재하는 상기 탄산 칼슘 소골들을 가능한 많이 제거하기 위해 탈 세포화 및 분해 용액 사이에서 1mM 시트르산(pH 3-4) 추가 단계를 거쳤다. 모든 단계들은 교반 조건들 하에서 수행되었다. 해삼 MCT는 다른 프로토콜에 따라 전신 벽으로부터 추출되었다. 간단하게, 상기 시작 조직을 작은 조각들로 절단하고, PBS 및 겐타마이신(40 μg/mL)에 넣고, 여과된 후에 MCT 현탁액을 수득하기 위해 실온에서 적어도 5일 이상 교반 조건에 두었다. 상기 3가지 실험 모델들로부터 수득된 현탁액들을 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하였다.
MCT-키토산 복합재들의 제조: 가변 콜라겐 조직들(MCT)을 실온에서 밤새 아세트산 (0.5% v/v)에서 용해시키고, 키토산을 사용한 바이오 재료들 및 복합재들을 제조하기 전에 탈기시켰다. 실온에서 키토산 분말을 아세트산 수용액(0.5% v/v)으로 용해시켜 키토산 용액을 제조하였다. 상기 키토산 분말이 완전히 용해된 후, 상기 용액을 진공 여과에 의해 여과하고 탈기시켰다. 도 5A는 일 실시예에 따른 상기 키토산 용액의 상기 용해 및 탈기를 개략적으로 도시한다. 상기 키토산 용액(0.1-0.5% w/v)은 상이한 MCT-CHT 몰비(100:0, 80:20, 60:40, 50:50, 40:60, 20:80 및 10:90)에서 극피동물에서 분리된 MCT들(2.0-10.0% v/v)과 혼합하였다. 상기 용액은 상온에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 도 5B는 일 실시예에 따른 상기 MCT-키토산 복합재들의 상기 제조를 추가로 도시한다. 키토산 및 MCT의 상기 농도는 상기 각 성분들의 상이한 비율을 첨가하여 원하는 조성을 제공함으로써 복합 물질들을 형성하는 상기 과정에서 제어되었다.
MCT-키토산 복합 바이오 필름들의 제조: 상기 MCT-키토산 복합 용액들은 유리 또는 실리콘 주형들에 주입되고 천천히 확산시켜 액체 필름들을 형성하였다. 복합 바이오 필름들의 2D 주물을 제공하기 위해 상기 액체 필름들을80ºC에서 24시간동안 증발시키거나 40ºC에서 밤새 증발시켰다. 도6은 일 실시예에 따른 상기 MCT-키토산 바이오 필름들의 주입과정을 도시한다.
MCT-키토산 복합 3D-해면체들의 제조: MCT-키토산3D-해면체들은 진공하에서 열처리에 의해 구동되는 가교방법에 의해 제조된다. 복합 해면체들(직경= 12mm, 두께= 6mm)은 주물/동결건조 기술들(단계 3c)에 의해 제조되었다. 그림 7에 도시된 바와 같이, 2% w/w키토산 수용액 또는 0.5%v/v 아세트산 1 그람은 MCT 수용액(0.5- 2.5% v/v)과 혼합된다. 상기 생성된 혼합물은 유리 또는 실리콘 주형에 붓고, -20 °C에서 동결시키고, 상기 용매를 제거하기 위해 동결 건조시키고, 상기 MCT-키토산 다공성 3D-해면체를 제공하였다. 상기 MCT-키토산 복합 3D-해면체들은 알려진 키토산 해면체들과 물리적으로 유사하다. 그러나, 상기 복합 3D-해면체들은 높은 수분 보유(팽창), 향상된 기계적 특성, 및 우수한 바이오 적합성과 같은 상당한 추가적인 특성들을 갖는다. 상기 MCT-키토산 복합 3D-해면체들은 예를 들어, 개선된 상처 및 지혈(혈액 응고) 드레싱을 제공하기 위해 사용될 수 있는데, 이는 키토산의 상기 지혈 효과가 상기 MCT 성분의 상기 면역 역학적 특성들에 의해 증가되기 때문이다. MCT를 추가하면 기계적 성능, 세포 부착 및 성장도 향상된다.
MCT-키토산 복합 하이드로 겔들의 제조: MCT(2% v/v), 키토산 (1% w/v)복합 용액을 -20 °C에서 동결시키고, 동결 건조하여 상기 용매를 제거하고, 분말 물질을 남겼다. 도 8에 도시된 바와 같이, 동결 건조된 MCT-키토산 복합재 2그람을 100mL탈 이온수에 용해시키고, 강하게 교반하면서 NaOH 6N의 농축 용액으로 적용하여 상기 pH를 증가시켰다. 상기 용액이 적절한 pH값(~7.2)에 도달하면, 복합 하이드로 겔이 자발적으로 형성되었고, 및 상기 분산의 상기 점도가 상당히 증가하였다. 다른 실시예에서, MCT-키토산 하이드로 겔들은 또한 2 내지 10% w/v 고 분자량(HMW) 키토산 상기 최종 농도를 조절하거나 상기 최종 MCT-키토산 복합재와 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose), 글리세롤, 또는 폴리에틸렌글리콜, 등과 같은 점도 향상제를 혼합함으로써 제조될 수 있다.
MCT-키토산 복합 전기 방사 나노 섬유들의 제조: 도 9A 및 9B에 도시된 바와 같이, 부직 형태의 MCT-키토산 나노 섬유 매트들은 전기 방사 기술에 의해 제조되었다. MCT-키토산 복합재는 0.5 내지 2.0(%w/v) 범위의 키토산 농도에서 탈 이온수에 용해시켰다. MCT-키토산 복합재의 상기 농도는 점도 및 전도성이 전기 방사에 적합하도록 조정되었다. 전기 방사 실험들 전에 완전한 수화를 위해 상기 분산액을 냉장고(4°C)에 넣고 밤새 방치하였다. 상기 최대 전단 속도는 멱승법 자료에 따라 관형의 부피 유량(Q)가 2.78 x10-10 m3/s 이고, 상기 튜브 내부의 반경이 1mm(R = 0.5 x 10-3 m)이다. 전기 방사를 위한 MCT-키토산 복합 특성들을 향상시키기 위해, 전기 방사 보조제로서, 샘플들을 폴리비닐알코올(PVA)와 혼합하였다. PVA (10% w/v)를 4시간 동안 80°C에서 강하게 교반하며 물에 용해시켰다. 상기 MCT-키토산 복합재 및 PVA 혼합 분산액들을100:00, 60:40, 50:50, 40:60 및 0:100 질량비로 혼합하였다. MCT-키토산/PVA 혼합 샘플들(5 mL)을 전기 방사 장치 및 30-kV 전원 공급 장치(Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL, USA)를 사용하여 방사시켰다. 상기 니들 끝과 상기 수집기 사이의 상기 거리를 20 cm로 설정하고, 상기 전압을 20kV로, 상기 용액을 1mL/h로 펌핑하였다. 도 9A에 도시된 바와 같이, 나노 섬유들을 알루미늄 호일에 모았고, 추가적인 특성화를 위해 건조기에 저장하였다.
MCT-키토산 바이오 필름들의 특성: 상기 MCT-키토산 복합 바이오 필름들의 상기 기계적 특성들은 인장 강도 및 팽창 거동을 비교하여 평가되었다. 팽창은 바이오 필름들의 상기 물리적 분해에서 상기 첫 번째 단계이다. 급속 팽창은 바이오 필름 매트릭스로부터의 활성 화합물들(예를 들어, 약물들 및/또는 살충제들)의 신속하고 제어되지 않은 방출을 촉진한다. 글루타르알데하이드는 일반적으로 팽창 속도를 늦추기 위해 키토산 바이오 필름들의 상기 생산에서 가교제로 첨가된다. 하이드로 겔 제제에서 글루타르알데하이드를 사용하는 단점은 상기 바이오 필름의 상기 인장 강도 감소이다. MCT-키토산 복합 바이오 필름들은 이전에 설명된 방법론들에 따라 주입하였다. 또한, 키토산 또는 MCT-키토산 복합 바이오 필름들의 주입 전 글루타르알데하이드 용액 (0.10% v/v)에서 30분 동안, 첫 번째 담금을 하였고, 이후 탈 이온수로 철저히 세척하고, 80°C에서 2 시간 동안 건조하여, 가교된 바이오 필름들을 제조했다.
기계적 특성들의 평가: 10 mm/min의 크로스 헤드 속도 및 2 kN고정 로드 셀을 사용하여 범용 기계적 시험 기계(TEST Winner 920 소프트웨어가 탑재된 프랑스 GT Test의 TEST 108모델)로 인장 강도 측정을 수행했다. 상기 바이오 필름들을 17 mm Х 4 mm Х 0.08 mm(길이 Х 폭 Х 두께)의 크기를 갖는 아령 모양 나이프(H3 타입)로부터 표준 인장 샘플들로 절단하였다. 각 유형의 5개 이상의 바이오 필름 샘플을 적절한 저장 기간(3 및 20주) 후에 습도 챔버(CIAT, 프랑스)에서50 ± 3% RH 및 23 ± 2 °C 시험하였다. 막을 파괴하기 위한 상기 최대 하중을 단면적으로 나누어 상기 최대 인장 응력(TS)를 계산하였다. MCT-키토산 복합 바이오 필름들은 키토산 바이오 필름 단독의 경우보다 높은 인장 강도를 나타냈다. 도 10A 및 10B는 단독의 키토산(0:100)과 비교하여 상이한 MCT-키토산 복합 바이오 필름들(각각 50:50 및 100:0 질량비)의 상기 기계적 거동을 도시한다. 데이터는 [평균 ± SD; n = 5]. 가교제(글루타르알데하이드)의 상기 첨가는 상기 비가교된 것들에 비해 모든 생물막의 인장 강도를 감소시켰다.
팽창 거동의 평가: 키토산의 및 MCT-키토산 복합 바이오 필름들의 팽창 정도는 중량 측정 방법들에 의해 평가되었다. 각 건조 바이오 필름은 먼저 분석 저울(Wd)로 측정하였다. 계량 후, 바이오 필름들은 실온에서 50분동안 증류수에 담궜다. 바이오 필름들을 상기 물에서 제거하고 5, 10, 20, 30, 40, 50, 및 60 분에 중량(Ws)을 측정하였다. 고 정밀 저울로 무게를 측정하기 전에, 각 바이오 필름 샘플은 수조에서 신속하게 꺼내고, 티슈 페이퍼로 닦아내어 과량의 물을 제거하였다. 무게 측정 후, 상기 바이오 필름들은 물로 되돌려 보냈다. 각 바이오 필름 샘플의 팽창도(%)는 다음 식에 따라 계산되었다:
팽창도(%) = [(Ws-Wd)/Ws] x 100
상기 결과들은 MCT-키토산 복합 바이오 필름들이 키토산 바이오 필름들에 비해 더 낮은 팽창도 및 더 낮은 총 팽창도를 나타냄을 보여준다. 도 10B는 시간의 함수로써, 상기 MCT-키토산 하이드로 겔들의 상기 팽창 정도를 도시한다.
이러한 결과들은 MCT-키토산 복합 물질들이 강한 가교제 또는 등가물로 작용하여, 상기 복합 물질들의상기 팽창을 감소시키고, 상기 바이오 필름의 상기 인장 강도를 높인다는 것을 나타낸다. MCT에 의해 제공되는 상기 특성들은 키토산 바이오 필름들에서 글루타르알데하이드 가교제의 특성보다 우수했다. 그러므로 MCT는 패키징, 패치, 및 외과용 바이오 물질들을 조제하기 위해 글루타르알데히드에 적합하고, 신뢰할 수 있으며, 바이오 적합한 '녹색 대안들'이다.
MCT-키토산 복합 상처 드레싱 템플릿들(바이오 필름들, 3D-해면체들, 및 전기 방사 나노 섬유들)의 특성: 상기 MCT-키토산 복합 상처 드레싱 템플릿들(바이오 필름들, 3D-해면체들 및 전기 방사 나노 섬유들)은 약화된 총 반사율 푸리에-변형 적외선 분광법(Nicolet 4700 ATR FT-IR, Thermo Scientific, Grand Island, NY, USA) 및 열 중량 분석(TGA, Q100, TA Instruments, Lindon, UT, USA)을 사용하여 화학적 프로파일에 따라 특성화 되었다. 질소 대기(20 mL/min)에서 20내지 400°C의 온도 스캔 범위에 걸쳐 5°C /min으로 열 분석(DSc 및 TGA)를 수행하였다. Eh 11A 및 11B는 MCT-키토산 바이오 필름들 및 상처 드레싱 템플릿들로서의 잠재적인 적용들을 도시한다. 나노 섬유들의 상기 형태는 SEM(Leo 1530-FE, Zeiss, Cambridge, UK)을 사용하여 검사하였다. 상기 평균 섬유 직경은 ImageJ 소프트웨어를 사용한 SEM이미지에서 적어도 20개의 섬유들을 분석함으로써 결정되었다. 도 11C 및 11D는 상기 표면의 형태를 도시한다.
키토산 바이오 물질들과 비교한 MCT-키토산 복합 바이오 물질들의 장점: 상기 MCT-키토산 복합 바이오 물질들(도 12)은 키토산 바이오 물질들과 비교하여 다양한 적용 분야에서 상당히 향상된 특징들을 제공한다. 상기 MCT-키토산 복합 바이오 물질들은 나노 입자들, 하이드로 겔들, 바이오 필름들, 3D-해면체들 또는 전기 방사된 나노 섬유들로 제조될 수 있다. 이러한 형태들의 바이오 물질들 각각은 다양한 표적 적용에 사용할 수 있고, 각각의 상기 복합 바이오 물질들은 하단의 표 1에 요약된 바와 같이 키토산 바이오 물질들에 비해 상당한 장점들을 갖는다.
표 1은 GTR 적용을 위한 키토산 및 콜라겐 바이오 물질들과 비교하여 MCT-키토산 복합물의 개선을 나타낸 표이다.
바이오 물질 적용 대상 MCT-키토산 복합재들을 이용한 개선
바이오 필름들 제어된 약물 방출
기계적 성질들



항균성

생분해성
상처 치유		 MCT 가교 효과는 제어 방출을 증가시키고; 이는 글루타르알데하이드 MCT-키토산 복합 바이오 필름들을 대체할 수 있으며, 키토산과 비교하여 인장 강도가 증가하는 것을 보여줌; 따라서 상기 복합재들은 드레싱, 패치, 및 적용 재료 포장 분야에 적합함
MCT는 지속적 전달을 촉진하는 중요한 특성인, 상기 바이오 필름들의 상기 생분해 속도를 감소시킴
MCT immunostatic 특성들은 상처 치유의 촉진제로서 바이오 필름의 성능을 향상시킬 수 있음
상처 드레싱 템플릿들(3D-해면체들 및 전기 방사 나노 섬유들) 항균성바이오 적합성
상처 치유 및 응고제


세포 성장 및 조직 공학
 MCT는 단독의 키토산과 비교할 때 MCT-키토산 복합재에서 기계적 특성을 증가시킴으로써, 피부 패치들 또는 붕대들처럼 더욱 활동적이고 적합하게 할 수 있음
MCT immunostatic 특성들은 상처 치유, 세포 증식 및 응고 촉진제들로서 상처 드레싱 템플릿의 성능을 증가시킬 수 있음
MCT-키토산 복합 상처 드레싱 템플릿의 바이오 적합성, 항균성 및 다공성들은 이러한 복합재들을 조직 공학 및 외과 드레싱 적용 분야에 유리한 해면체 재료로 만듬
하이드로 겔들
바이오 적합성
추가적인 바이오 물질

 MCT-키토산 하이드로 겔들은 개선된 점막 접착성 및 점도뿐만 아니라, 항 미생물 및 immunostatic 특성들로 인해 다양한 제제들(예를 들어, 식품, 접착제들, 제약들, 바이오 의학 용도)에서 추가적인 바이오 물질들로써 쉽게 사용될 수 있음
실험예 2. 상처 치유 및 조직 공학인 GTR에서의 적용을 위한 MCT-키토산 복합 3D-해면체.
키토산(CHT)는 바이오 적합성 및 생체 흡수성이 있는 것으로 보고되었다. 특히, CHT는 좋은 상처 치유 촉진제로 간주된다. 한편, 콜라겐(MCT)는 조직 공학에서 가장 널리 사용되는 매트릭스 바이오 물질들 중 하나이다. 다공질 MCT 단일 3D-해면체들은 많은 유형의 조직들의 시험관 내 성장을 지원하기 위해 사용되어 왔다. 하이브리드 3D-해면체 바이오 물질들은 해삼 표본들로부터 분리된 CHT 및 MCT를 용매 주물 및 동결 건조를 포함한, 이전에 개발된 방법론들을 적용하고, 상이한 질량비로 혼합하여 제조되었다. MCT/CHT 하이브리드 3D-해면체들은 그들의 수분 흡수 용량, 기계적 특성, 열 거동(TGA), 및 형태(SEM)에 따라 특성화되었다. 하이브리드 3D-해면체들은 단일 3D-해면체들과 비교하여 더 높은 생 분해성뿐만 아니라, 개선된 안정성, 큰 다공성, 증가된 열 안정성, 및 기계적 특성들을 나타냈다. 지방 세포 유래 줄기 세포(ADSC)의 세포 배양 및 SEM 이미지화의 MCT/CHT 하이브리드 3D-해면체들이 허용된 ADSC의 부착, 확산 및 시험관 내 성장을 보여준다.
MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들의 제조: 하이브리드 용액들을 제조하기 위해 각각 MCT-CHT를 100:0, 80:20, 60:40, 및 50:50의 몰 비로 키토산(CHT, 2.0% w/v)을 아세트산(0.1% v/v)에 용해시키고, 콜라겐 수용액(MCT, 5% w/v)과 천천히 혼합시켰다. MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들은 각 용액을 유리 몰드들에 붓고 용매를 붓고 동결 건조하여 제조되었다. 상기 해면체들은 추가적인 특성화 및 세포 증식 연구 및 제어된 상대 습도에서 데시케이터로의 저장을 위해 작은 조각들(직경 12mm, 두께 3mm )로 절단되었다.
MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들의 물리 화학적 특성: 상기 제조된 하이브리드 해면체들의 광학 현미경 이미지를 4배율로 반전 현미경(LIB-305, USA)에서 수집했다. MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들의 상기 형태를 20kx의 배율로 전자 현미경(SEM, JSM-5200, JEOL, USA)상에서 관찰하였다. 각 샘플의 상기 경사각은 30도였다. TGA-7 기기(Perkin Elmer, USA)에서 열 중량 분석(TGA)를 수행하였다. 해면체 샘플들(5-10mg)을 알루미늄 홀더에 붓고, 질소 대기(10mL/min)하에서 10 °C/min의 가열 속도로 50 내지 600°C로 설정된 온도 프로그램에 따라 분석하였다. 주위 조건(20°C 및 50% 상대 습도, RH)에서 최대 인장력이 250N인 범용 인장 시험 기계(Tensilon RTG, Japan)의 로드 셀을 사용하여 MCT/CHT 하이브리드 3D-해면체들(조건당n = 5)의 단축 기계적 압축 테스트를 수행했다. 상기 압축(mm) 및 하중(N)을 크로스헤드 속도 5mm/min으로 수집하였다. 상기 압축 탄성 계수는 상기 압축 곡선의 상기 초기 선형 영역 내의 상기 응력-변형률 곡선들의 상기 접선 경사로 계산되었다. 상기 압축 강도는 15% 변형률(상기 응력-변형률 곡선이 모든 샘플에서 선형인 상기 영역 내)에서 계산되었다. 상기 건조된 3D-해면체 샘플들은 전자 마이크로 미터(DMH 시리즈 293, Mitotoyo, Japan)에 의해 측정될 때, 지름이 12mm 및 두께가 3mm인 원통형 형태를 가졌다.
세포 부착 및 증식 연구: 지방 조직 유래 줄기 세포들(ADSC)를 살아있는 말들로부터 분리하였다. 상기 ADSC(~105 cells/cm2)를 각각의 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들 위에 놓았다. 조직 배양 플레이트(폴리스티렌) 웰을 대조군으로 사용하였다. 상기 배양물을 상기 인큐베이터에 1일 동안 두고, 제거시 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고 트립신으로 처리하였다. 생성된 해리 세포 현탁액의 일부 표본들을 쿨터 계수기 multisizer(모델 0646, Coulter Electronics, Hialeah, FL, USA)에서 계수하였다. 지름이 8 내지 32 μm인 것들만 사용되었다. 세포 증식은 또한 세포 카운트에 의해 1, 3, 7 및 10일 후에 상기 기재된 바와 같이 측정되었다. 이 실험에서, 6개의 복제 샘플들이 검사되었다. 부착 및/또는 ADSC 세포들을 0.1M PBS (pH7.4) 중 글루타르알데히드(2.5% v/v)로 30분 동안 고정한 후, 0.1M PBS로 헹구었다. 상기 고정된 세포 샘플들을 주사 전자 현미경(SEM, Hitachi Model S-2460N, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)에 의해 형태 분석을 위해 동결 건조시키고 금으로 스퍼터 코팅하였다.
데이터 및 통계 분석: 모든 데이터는 적어도 3회 이상의 반복의 평균 ± 표준 편차로 보고되었다. 통계 분석은 JMP Pro(버전 10.0.0; SAS Institute Inc., 미국, 노스캐롤라이나 주, 캐리)를 사용하여 수행되었으며, p = 0.05로 설정되었다. 유의미한 차이를 평가하기 위해 "샘플"과 "농도" 사이에서 독립 변수들이 서로 상호작용 하는 양방향 ANOVA 모델로 결과를 분석하였다.
MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들의 물리 화학적 특성: 키토산은 이용 가능한 아민 및 하이드록실 그룹들에 의해 구동되는 수소결합 상호작용들에 의해 콜라겐에 물리적으로 결합한다. 이러한 상호작용은 나노 입자들, 바이오 필름들, 바이오 폼들, 및 조직 해면체들과 같은 안정한 바이오 물질들을 개발할 수 있게 한다(Madrigal-Carballo et al.,콩 레시틴 리포좀들에 대한 천연 중합체들의 정전기적 생체 흡착에 의해 수득된 폴리머-리포좀 나노 입자, Intl. J. Nanoparticles 5 (3) (2012) 196-209; Madrigal-Carballo et al., 단백질이 로딩된 키토산 나노 입자들은 뮤린 복막 대식세포에 의한 달걀 난백 리소자임의 흡수 및 항원 제시, Intl. J. Nanoparticles 3 (2) (2010) 179-191; Ma et al., 인간의 신생아 피부 섬유아세포들의 해면체로써 새로운 키토산 이중층 재료의 상기 합성 및 조직 공학 적용에 대한 예비 시험관 내 연구, Biomaterials, 22(4) (2001), pp. 331-336). 도 13A는 제조된 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들을 도시한다. 도 13A에 도시된 바와 같이, 상기 도시된 하이브리드 3D-해면체들은 상이한 MCT/CHT 질량비들(50:50, 60:40, 80:20, 및 100:0)로 제조된다. 도 13B는 상기 해면체들의 광학 현미경 이미지들을 도시하고, 도 13C는 각각의 제조된 3D-해면체에 대한 SEM 현미경 사진이다. 도 13C에서, 상기 스케일 바들은 500mm이다.
도 13C의 상기 SEM 현미경은 MCT와 결합된 키토산 단일 해면체의 상기 표면 형태 변화를 보여준다. 이러한 변화는 상기 MCT/CHT 하이브리드 3D-해면체 매트릭스에서 MCT의 첨가에 따른 겉보기 기공 크기의 감소에 의해 나타난다. 따라서, 키토산과 MCT의 상호작용은 더 큰 가교 밀도를 제공하는 것으로 나타나고, 더 많은 수의 잠재적인 수소결합 상호작용들에 의하여 두 거대분자들 사이에서 이용 가능한, 증가된 분자 정렬 및 소형화 구동 가능하다.
도 14는 열량 측정(TG)에 의한 상기 MCT-키토산 하이브리드 3D 해면체들의 열 분석 그래프이며, MCT/CHT (50:50)하이브리드 3D-해면체의 상기 열 거동은 MCT/CHT (100:0) 및 MCT/CHT(0:100) 복합 해면체들 사이의 상호작용을 도시한다. MCT와 통합된 상기 하이브리드 3D-해면체는 상기 CHT 단일 해면체와 비교할 때, 열 안정성에 있어서 15배 증가에 상응하는 평균 분해 온도가 300 °C인 상기 키토산 단일 해면체에 비해 우수한 열 안정성을 보여준다.
생물학적 3D-해면체들은 이식 후 온전함을 유지하기에 충분한 기계적 특성이 필요하다. 따라서, MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체에 대해 압축 테스트를 수행하여, 상기 응력-변형 기계적 곡선들을 얻고 탄성 계수 및 압축 응력 (15% 변형률)을 각각 표 2에 나타낸 바와 같이 계산하였다. 상기 결과들은 상기 키토산 3D-해면체 매트릭스에 MCT를 추가함으로써 상기 기계적 특성들에 긍정적인 영향을 보여준다. 상기 하이브리드 MCT/CHT(50:50) 3D-해면체는 MCT/CHT(100:0) 해면체와 비교할 때, 압축 영률이 약 85배 증가한 것으로 나타났다. 또한, 상기 압축 강도(15% 변형률)는 MCT/CHT (60:40) 하이브리드 3D-해면체 시스템에 대해 약 78배 증가하는 것으로 확인되었다. 상기 관찰된 기계적 강도의 향상은 내부 구조, 수소 결합 구동, 콜라겐과 키토산 사이의 폴리머 네트워크들과 관련되어 매트릭스의 기계적 안정화를 촉진하고, 주입 목적에 적합한 3D-해면체를 형성할 수 있다.
표 2는 다른 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체에 대한 영의 기계적 계수를 나타내며, 결과들은 ± SD (n = 5)로 보고된다.
샘플 압축 계수
(MPA) 		압축 강도
(Mpa, 15% 변형률)
MCT/CHT (100:0) 0.18 ± 0.07 0.12 ± 0.01
MCT/CHT (80-20) 0.34 ± 0.10 0.44 ± 0.02
MCT/CHT (60-40) 0.78 ± 0.55 0.51 ± 0.02
MCT/CHT (50-50) 1.22 ± 0.61 0.55 ± 0.03
해면체의 수화 및 세포 성장을 촉진시키기 위해 팽윤 특성이 중요하다. 상기 MCT-키토산 3D 해면체들은 MCT와 키토산의 상기 간단한 두 해면체들 사이의 중간 거동을 보였고, 키토산의 비율이 가장 높은 해면체가 가장 높은 수분 흡수 성능을 나타냈다. 이러한 결과들은 콜라겐의 상기 4차 구조에 의해 상기 기능적 그룹의 회전 및 이동성의 상기 감소 때문에, 현재 추가로 이용 가능한 수소 결합 점이 상기 콜라겐 보다 상기 키토산 바이오 분자에 존재하는 것으로 설명될 수 있다.
도 15는 상이한 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들에 대해 수득된 상기 수분 흡수 거동을 도시한다. 도 15에서, 데이터는 동일한 시점의 MCT/CHT(100:0)단일 3D-해면체와 비교하여 평균 ± SD, n = 3, 및 (*) = p < 0.05로 제시된다. 도 15는 또한 예시적인 목적으로, MCT/CHT(50:50) 하이브리드 3D-해면체의 상기 팽창 거동을 보여주기 위해 삽입된 그림을 포함한다. 상기 도 15 그래프는 모든 다른 하이브리드 3D-해면체들에 대한 70% 이하 상대 습도의 유사성을 보여준다. 한편, 상대 습도 85%에 도달한 후, 상기 하이브리드 3D-해면체 매트릭스에서 상기 MCT의 비율이 증가함에 따라 중요한 차이들이 상기 시스템들간에서 발견되었다. 상기 MCT/CHT (50:50) 하이브리드 3D-해면체에서 수분 흡수가 250배 범위의 차이를 보여줌으로써, 거의 300%로 가장 높은 수분 흡수 용량을 나타내고, 상기 MCT/CHT (100:0) 단일 3D-해면체는 50%에 가까운 값인 가장 낮은 수분 흡수 용량을 나타낸다. MCT/CHT(80:20) 및 MCT/CHT(60:40)는 MCT/CHT (100:0) 및 MCT/CHT (50:50) 사이의 물 흡수 능력을 보여준다.
물을 보존하기 위한 복합 해면체의 상기 능력은 피부 조직 공학에 대한 그 특성 및 적합성을 평가하는 중요한 측면이다. 상기 MCT-키토산 해면체의 상기 수분 결합 능력은 친수성 및 3차원 구조의 유지에 기인할 수 있다. 키토신 및 MCT는 히드록시기, 아미노, 및 카복실기들과 같이 풍부한 친수성기들을 가지며, 이들은 미세구조 내에서 수분을 보유할 수 있다. MCT는 더 높은 상대 습도에서 친수성의 증가를 촉진하는 것처럼 보이고, 더 높은 수분 흡수 용량으로 이어진다. 상기 MCT-키토산 해면체에 대해 얻은 상기 수분 흡수 값들은 이전에 보고된 유사 실험에 동의했다(Ma 등, '피부 조직 공학을 위한 바이오 안정성이 개선된 키토산 다공성 해면체들', Biomaterials. Elsevier, 24(26) (2003), pp. 4833-4841; Chhabra 등, '최적화, 특성화 및 조직 공학 및 상처 치유를 위한 2% 키토산 해면체들의 효능 평가', 약학 및 생물 동종학 저널, Medknow Publications, 8(4) (2016) , p. 300).
MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들의 지방 조직 유래 세포들(ADSC)의 성장: ADSC 및 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체 사이의 상호작용을 연구하기 위해, 직경이 약 12mm 및 두께가 약 3mm인 다공성 구조들이 사용되었다. 72시간 배양 후, 상기 ADSC는 상기 해면체들에서 90%이상 일치에 도달하였다. 상기 MCT/CHT(100:0) 3D-해면체(도 16A 및 16B) 단면의 SEM 이미지들은 72시간의 세포 이식 후, ADSC가 상기 다공성 MCT-키토산(100:0) 3D-해면체 표면에 부착되고 퍼짐을 보여주었고, 세포가 부착되지 않은(도 16A) 상기 해면체 시스템과 비교할 때, 세포간 연결이 보이지 않도록(도 16B), 서로 완전히 합쳐졌다. 도 16A 및 16B에서, 상기 스케일 바는 10 mm를 나타낸다. 다공성 해면체들의 상기 표면은 상기 세포들로부터 ECM 침전이 분비될 수 있는 세포들 및 필름으로 채워져 있다(Lin, Li and Su, '3차원 키토산 해면체들은 Schwann 세포들의 세포 외 기질 발현에 영향을 미침', Materials Science and Engineering C, 42 (2014), pp. 474-478; Ji 등, '지방 조직 유래 줄기 세포들을 이용한 실크 피브로인-키토산 해면체의 바이오 적합성 연구', Experimental and Therapeutic Medicine, 6(2) (2013), pp. 513-518).
도 17은 15일의 배양기간 후, MCT-키토산(50:50) 복합 3D-해면체의 상기 증식 수준을 보여주고, the legend (□)는 MCT/CHT(100:0) 3D-해면체를 나타내고, the legend (o)는 MCT/CHT(0:100) 단일 3D-해면체를 나타내고, the legend (Δ)는 MCT/CHT(50:50) 복합 3D-해면체를 나타내고, 동일 시점에서의 MCT/CHT(0:100) 단일 3D-해면체와 비교하여 데이터가 평균 ±　SD, n = 5. (*) = p < 0.05로 표시된다. 상기 3개의 그래프들은 3D-해면체 MCT/CHT(0:100), MCT/CHT(100:0), 및 MCT/CHT(50:50) 복합 3D-해면체를 도시한다. MCT/CHT(0:100) 및 MCT/CHT(100:0) 3D-해면체들을 비교할 때, ADSC와 3일간 배양하면서, 상기 MCT/CHT(50:50)복합 3D-해면체는 세포 부착 및 증식의 상당한 증가를 보여준다.
폴리스티렌 접시들의 상기 표면은 세포 부착이 용이하고, 빠른 세포 합류를 나타내는 것으로 알려져 있다(Jeong Park 등, '치주골의 재생을 위한 키토산 해면체를 방출하는 혈소판 유래 성장 인자', Biomaterials, 21(2) (2000), pp.153-159). 세포 부착 및 증식의 상기 정도는 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들이 우수한 세포 적응성을 갖는다는 것을 의미한다. 상기 해면체에서 세포 증식을 조사한 결과 ADSC와 3일 동안 배양한 후 상기 실험군과 대조군 사이에 통계적으로 상당한 차이가 있는 것으로 드러났다. 이것은 ADSC를 상기 해면체에 결합시킨 적응 과정에 기인한 결과일 수 있다. 3일간 배양 후에 상기 샘플들 사이의 상기 차이가 현저하게 시작되었다는 사실은 상기 ADSC가 상기 해면체에서 느린 초기 증식 속도를 나타내는데, 이는 3일 후에 보다 정상적인 증식 속도로 복귀했기 때문일 수 있다. 또한, 상기 MCT/CHT(50:50) 복합 3D-해면체는 현저하게 증가된 세포 부착 및 증식을 보여준다. 15일의 배양 기간 동안 MCT/CHT(0:100) 및 MCT/CHT(100:0) 3D-해면체들에 반해, 50배 정도로 높은 수준의 세포 부착 및 증식이 상기 MCT/CHT(50:50)으로부터 관찰되었다. MCT는 골모세포들 및 인대 섬유아세포들의 증식, 주화성 및 콜라겐 단백질 합성을 자극하는 것으로 알려져있다(Zhang 등, '치주 조직 공학을 위한 변형 성장 인자-β1 DNA를 포함하는 새로운 키토산/콜라겐 해면체', Biochemical and Biophysical Research Communications, 344(1) (2006), pp. 362-369). 또한, MCT는 전구세포의 상기 증식을 향상시키는 것으로 보고되었다(Costa-Pinto 등, '새로운 용융-기반 키토산/폴리에스터 3D 다공성 해면체들에 뿌려진 쥐 간엽 줄기 세포 선(BMC9)의 접착, 증식, 및 골 형성 분화' 조직 공학. Part A, 14(6) (2008), pp. 1049-1057 ). MCT와 키토산의 상기 조합은 상기 세포 증식 반응을 증가시키기 위해 매우 유리할 수 있다.
결론: 콜라겐의 상기 빠른 분해와 달리, 키토산은 시험관에서 서서히 생분해된다. 키토산으로 콜라겐 3D-해면체들을 변형시키면 기계적 강도, 열 안정성, 바이오 적합성, 및 생 분해성이 개선된다. 상기 MCT-키토산 하이브리드 3D 해면체들은 상기 표면 및 상기 내부 모두에서 ADSC를 위한 다차원 구조를 제공하며, 세포 부착, 이동 및 증식을 위한 공간적 특징들과 상기 세포 성장을 촉진한다. 72시간의 배양 후 ADSC가 합쳐져 상기 해면체의 상기 표면상에 완전한 세포층이 형성되어, 상기 표면이 거의 덮히고 오직 몇 개의 구멍만이 보이고, 몇몇 세포들은 상기 구멍들 안으로 이동함을 발견했다. 상기 MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들은 ADSC부착, 증식 및 분화를 지원하였다. SEM 이미지들은 상기 다공성 해면체들의 상기 큰 표면적이 ADSC를 부착, 펴짐 및 상기 해면체들을 성장시킬 수 있음을 보여주었다. 상기 평평한 형태, 및 상호 연결된 다공성 구조 주변으로의 우수한 확산은 세포들의 강한 세포 부착 및 성장을 나타냈다. 결과적으로, MCT-키토산 하이브리드 3D-해면체들은 ADSC부착에 대한 바이오 적합성을 나타내며, 조직 공학에서 잠재적인 적용들을 위한 좋은 후보이다.
실험예 3. 상처 치유 및 조직 공학 적용에서 세포 증식을 위한 바이오 적합성 해면체들로써 전기 방사 MCT-키토산 복합 나노 섬유들
전기 방사 나노 섬유들(ESNFs)는 MCT-키토산 복합 물질들로부터 제조되었다. 폴리비닐알코올(PVA)를 보조제로 사용하였다. 상이한 부피비(100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 및 0:100)의 MCT-키토산/PVA 혼합 용액을 제조하고 전기 방사에 적절한 점도 및 전기 전도성과 유사하도록 조정하였다. 주사 전자 현미경(SEM), 푸리에 변환 적외선 분광계(FTIR), 및 시차 주사 열량 측정(DSC)을 사용하여 상기 ESNF의 형태를 조사하였다. 나노 섬유들(NFs)의 화학적 조성물 및 열 특성들을 특성화하기 위해 연구가 이용되었다. 섬유아세포의 증식을 지원하는 상기 NF의 상기 능력은 상기 최적화된 MCT-키토산/PVA 용액을 사용하여 시험관 내에서 조사되었다. 상기 결과는 MCT-키토산 기반 ESNF가 섬유아세포 성장에 적절하고, PVA의 ESMF보다 현저히 우수함을 보여준다. 상기 결과들은 MCT-키토산이 키토산 단독으로 세포 증식을 지원하는 것보다 낫다는 것을 보여준다.
전기 방사를 위한 MCT-키토산 복합재들의 제조: MCT-키토산 분말을 균일한 분산액(1% v/v)이 얻어질 때까지 격렬히 교반하면서 탈 이온수에서 팽창시켰다. 특성화 실험들 전에 완전한 수화를 위해 상기 분산액을 냉장고(4ºC)에 밤새 방치하였다. MCT-키토산 복합 분산액은 0.7265 cm-1의 전기 전도 상수를 갖는, 전도도 측정기(Orion Star A215, ThermoFisher, Waltham MA, 미국)를 사용하여 25 ºC에서 콘-플레이트 구조 및 전기 전도도 레오미터(C-VOR, Bohlin Instruments, Malvern, 영국)를 통한 stress-sweep 테스트에 의해 점도를 측정함으로써 특징화된다.
MCT-키토산 복합재들의 전기 방사: MCT-키토산 복합재들을 균질한 분산액을 얻을 때까지 격렬히 교반하면서 수성 아세톤(30% v/v)과 혼합하였다. 복합 용액의 농도는 점도들 및 전도도들이 유사하고, 전기 방사에 적합하도록 조정되었다. 전기 방사 실험들 전에 완전한 수화를 위해 상기 분산액을 냉장고(4°C)에 밤새 방치하였다. 부피 유량(Q)이 2.78 x10-10 m3/s 및 상기 튜브의 내부 반경이 1mm(R = 0.5 x 10-3 m)로, 관형 형상의 전력 법칙 재료들에 따라, 최대 전단 속도는 각 MCT-CHT 복합 샘플에 대해 계산되었다.
전기 방사를 위한 복합 특성들을 개선하기 위해, 샘플들을 전기 방사 보조제로서 PVA와 혼합하였다. PVA(10% w/v)를 4시간 동안 격렬히 교반하면서 80 °C에서 물에 용해시켰다. 상기 MCT-키토산 복합재 및 PVA 혼합 분산액들을 100:00, 60:40, 50:50, 40:60 및 0:100 부피비로 혼합하였다. MCT-키토산/PVA 혼합 샘플들(5mL)을 전기 방사 장치 및 30-kV 전원 공급 장치(Gamma High Voltage Research, Ormond Beach, FL, 미국)를 사용하여 전기 방사시켰다(도 9A 및 9B 참조). 상기 니들 팁 및 상기 수집기 사이의 상기 거리를 20cm로 설정하고 상기 용액을 1mL/h로 펌핑하였다. 나노 섬유들을 알루미늄 호일상에 수집하고, 추가적인 특성화를 위해 데시케이터에 저장하였다.
MCT-키토산 ESNF의 특성 분석: 상기 ESNF는 약화된 총 반사율 푸리에-변형 적외선 분광법(Nicolet 4700 ATR FT-IR, Thermo Scientific, Grand Island, 뉴욕, 미국)을 사용하여 화학적 프로파일 및 열 중량 분석(TGA, Q100, TA Instruments, Lindon, 유타 주, 미국)에 의한 열적 특성에 따라 특징화되었다. 질소 대기(20mL/min)에서 100 내지 400°C의 온도 스캔 범위에 걸쳐 5°C/min로 TGA 분석들을 수행하였다. 나노 섬유들의 상기 형태는 SEM(Leo 1530-FE, Zeiss, Cambridge, UK)을 이용하여 검사되었다. 상기 평균 섬유 직경은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 SEM 이미지들에서 적어도 20개의 섬유들을 분석함으로써 결정되었다.
세포 증식 분석: 생존 세포 수에 대한 MTT 세포 증식 분석에 의해 세포 증식을 측정하였다. 간략하게, 멸균 조건 하에서 미리 수집된 ESNF를 배지가 있는 멸균된 세포 배양 플레이트에서 다른 웰들에 넣고 3mL의 섬유아세포 현탁액(L929, 1.5 x 105)을 각 처리 웰에 넣었다. 상기 세포 배양 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 각각 3, 7 및 14일 동안 방치하였다. 배양 후, 상기 배지를 제거하고 MTT 용액을 새로운 배지로 하여 1:10 희석하여 각 처리 웰에 넣었다. 플레이트들을 37°C에서 4시간 동안 배양하고 마이크로 플레이트 리더(SpectraMax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 미국)를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 성장 실험(7일) 후, ESNF를 수집하고 배지로 세척하고, 4°C에서 2시간 동안 글루타르알데하이드(2.5% v/v)로 고정하고 SEM에 의한 이미지화 전에 금으로 코팅하였다.
통계적 분석: 통계적 분석은 AssistatVR 소프트웨어(Statistics, Arlington, TX)를 사용하여 수행되었다. 실험 데이터는 평균 ± SD값으로 제시되었다. 상기 대조군 및 실험군들을 비교하기 위해, 상기 데이터를 일반화된 선형 모델에 의한 최소 평균 제곱(SAS; Cary, NC)으로 분석하였다. 상기 차이들은 P <0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다.
도 18은 MCT/CHT(0:100)(연속된 선으로 표시) 및 MCT/CHT(100:0)("---" 점선으로 표시)의ESNF의 ATR-FTIR 스펙트럼에 관한 그래프들을 개별적으로, 및 또한 두 가지 다른 MCT/CHT 복합재들(60:40,"…"으로 표시 및 40:60,"_._._."일점쇄선으로 표시)을 보여준다. 상기 도면에서 상기 화살표들은 키토산에 MCT의 첨가와 관련된 나노 섬유 FTIR 스펙트럼의 변화를 도시한다. 특히, 1650 cm-1 및 1000 cm-1모두에서 증가된 흡수 경향을 볼 수 있다. 이들은 각각 키토산의 다당류 성질과 관련된 카보닐(실선 화살표) 및 탄소-산소(점선 화살표) 스트레칭 주파수(stretching frequencies)에 해당한다. 일반적으로 CHT와 MCT의 차이는 상기 도면에 제시된다. 상기 두 복합재들의 경우, 그래프의 특정 위치들에서 전환이 발생하나, 많은 위치들에서 상당한 중복이 발생하고, 이는 CHT 및 MCT의 상기 비교적 유사한 비율의 관점에서 놀라운 것은 아니다.
도 19는 MCT/CHT 복합재들(100:0, 60:40, 40:60 및 0:100)에 대한 TGA 열 분석을 도시하고, MCT 첨가로 인한 키토산 열 안정성에 긍정적인 영향을 나타낸다. MCT-키토산(60:40) 복합재는 키토산 단독에 비해 열 안정성을 나타낸다. 상기 MCT-키토산(60:40) 복합재는 약 320°C의 평균 분해 온도를 나타내고, 단독의 키토산은 280°C의 평균 분해 온도를 나타낸다.
도 20A-20F는 키토산 전기 방사 나노 섬유들 및 MCT-키토산 전기 방사 나노 섬유들의 SEM 현미경 사진을 보여준다. 도 20A 및 20D에서, 상기 스케일 바는 10 mm이고; 도 21B 및 20E에서 상기 스케일 바는 2 mm이고, 도 20C 및 20F에서 상기 스케일 바는 200nm이다. 상기 점선 원들은 키토산 ESNF에서 부적절한 전기 방사 공정과 관련된 방울들의 존재를 나타내고, MCT-키토산 복합재들의 상기 개선된 ESNF를 나타낸다.
도 21은 키토산, MCT, MCT-CHT 복합(50:50) ESNF와 함께 배양된 L929 섬유아세포들의 증식을 도시한다. 상기 도면은 대조군으로서 PVA ESNF를 사용하여 MTT 세포 증식 분석으로부터 데이터를 보여준다. 생존 세포들의 상기 평균 퍼센트 표준 편차는 세 가지 다른 시간에 수행된 실험들로부터 도출된다. 도 22A-22C는 키토산, MCT-키토산 복합재, 및 MCT에 세포 부착을 각각 나타내는 SEM 현미경 사진이다.
결론: MCT-키토산 복합 나노 섬유들은 보조제로서 PVS(10% w/v)를 사용한 전기 방사를 통해 성공적으로 제조되었다. MCT-키토산 복합 나노 섬유 합성을 위한 전기 방사 파라미터들을 설정하고 MCT 대 키토산의 질량비를 50:50으로 최적화했다. ATR-FTIR 분석은 상기 ESNF에서 MCT-키토산 성분들의 상기 존재를 보여준다. MCT-키토산 복합 ESNF의 열 안정성을 키토산 단독의 열 안정성과 비교했고, 키토산에 MCT 추가가 열적 안정성을 향상시킨다는 것을 암시했다. 섬유아세포의 증식 결과는 MCT-키토산 ESNF가 세포 성장에 적절하고 7일 배양 후 키토산 또는 MCT ESNF 단독에 비해 현저히 우수함을 나타낸다. SEM 이미지들은 상기 MCT-키토산 ESNF의 상기 넓은 표면적이 L929 섬유아세포의 우수한 부착, 확산 및 성장을 허용함을 보여준다. 상기 결과들은 MCT-키토산 ESNF가 섬유아세포의 세포 부착을 위한 바이오 적합성 및 활성화를 증진시키고, 조직 공학, 재생 의학에서의 적용을 위한 상처 드레싱 템플릿들을 개발하고 조직 화상의 치료를 위한 상처 치유 드레싱으로서 유용하다는 것을 나타낸다.
도 36 내지 38에 대한 상기 추가적인 논의는 실시예들에 따른 GTR 장치들의 구조 및 적용뿐만 아니라 이러한 장치들의 장점의 요약을 제공하는 것이다.
도 36은 일 실시예에 따른 3D-해면체를 도시한다. 상기 도면에서, 상기 해면체는 콜라겐 및 글리코오스아미노글리칸으로 구성된 MCT를 포함하고, 이는 네오더미스(Neodermis)의 주된 성분들이다. 네오더미스(Neodermis)는 상처 치유 동안 형성되는 새로운 조직이다. 상기 MCT의 상기 콜라겐-GAG의 구조는 상기 치유 과정 동안 인테그린 결합을 촉진한다. 앞에서 언급한 바와 같이, 상기 MCT는 하나의 관점에서의 해양 무척추동물들, 더욱 특정한 관점에서의 극피 동물들, 및 더더욱 특정한 관점에서의 성게 및/또는 해삼을 포함하는 해양 공급원으로부터 온다. 이러한 MCT의 상기 초미세구조는 인간의 결합 조직과 일부 유사하며, 네오더미스(neodermis) 형성과 같은 유익한 GTR 효과들을 가리킵니다.
도 36의 상기 해면체는 또한 수분 관리를 제공하고 상처 봉합 및 치유를 촉진한다. 일 측면에서, 상기 해면체는 겔화 효과를 가지며, 이는 치료되는 동안 냉각, 보습효과를 통해 환자의 편안함을 증진시킨다. 상기 결과적인 구조는 낮은 물리적 분해 및 단백질 분해 효소들에 대한 저항성을 나타내므로, 상기 MCT의 상기 가교 처리는 상기 해면체가 최대 30일 동안 효과를 갖도록 할 수 있다. 특히, 상기 생성된 구조는 단백질들을 분해할 수 있는 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMPs)와 같은 과잉 효소들을 표적으로 하고 비활성화시킨다. 이러한 표적화 및 비활성화는 상처 봉합 및 치유를 촉진 및 개선한다.
도 37은 일부 실시예들에 따른 3D-해면체를 도시한다. 상기 해면체는 실시예에 따라 MCT 또는 MCT-CHT의 매트릭스로 구성될 수 있다. 상기 해면체 내의 이러한 물질은 조직 및 혈관의 성장을 보조한다. 상기 해면체 구조의 다른 관점들은 습한 환경을 유지하고, 삼출물을 제어하여 치유 및 조직 재생을 촉진하는, 흡습제 및 겔-형성 조성물을 포함한다.
도 38은 치료의 일부로서 피부의 열린 부분에 봉합된 MCT 또는 MCT-CHT의 매트릭스로 구성될 수 있는 GTR 장치를 도시한다. 상기 도면은 상기 치료 과정의 일부로, 상기 장치 주변의 봉합선 뿐만 아니라 상기 장치 아래에 형성되는 네오더미스(neodermis)를 보여준다. 도 38의 일부는 상기 네오더미스, 상기 MCT 표시, 인테그린 결합 위치들을 갖는 CHT의 단독 또는 복합 매트릭스를 도시한다.
실험예 4. 화장품 투여 형태들
하기 제제들은 대표적인 약제학적 제제들을 예시한다. 상기 제제들은 본 명세서에 설명된 MCT 및 MCT-키토산 (MCT-CHT) 조성물의 치료 또는 예방적 투여에 사용될 수 있으며, 용액, 현탁액, 겔, 연고, 로션, 또는 크림을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 피부학적 및/또는 제약상 허용되는 국소 담체가 사용될 수 있다. 다음의 예시들에서, 젤 또는 크림이 제공된다.
(i) GTR 젤 중량%
파트 A
MCT or MCT-CHT 복합재 2.0
폴리에틸렌 옥사이드 0.4
카보폴 0.4
물 90.9
파트 B
에톡실레이트 글리세린 0.5
폴리에틸렌글리콜 올레일 에스테르 1.0
디에탄올아민 올레스-3 포스페이트 0.8
크로다몰 PMP 0.5
에톡시화 글루코오스 메틸 에스테르 0.7
파트 C
트리에탄올아민 0.4
향료 0.1
이 제제는 다음과 같이 별도의 단계로 제조된다: 상기 혼합물의 파트 A는 상기 카보폴을 물에 분산시킨 후 다른 성분들에서 교반함으로써 제조되었다. 모든 파트 B 성분들은 함께 혼합되고 70°C까지 가열되었다. 파트 A 및 B를 결합하고, 트리에탄올아민 및 향료를 첨가하였다(파트 C). 상기 생성된 크림은 안정적이고 매끄럽고 보습 특성이 우수하고 피부에서 느낌이 우수하다.
(ii) GTR 크림 1 중량%
MCT or MCT-CHT 복합재 2.5
폴리에틸렌 옥사이드 0.3
글리세린 5.0
에탄올 15.0
올레스-5 2.0
에톡시화 글루코오스 메틸 에스테르 0.7
보존제 0.3
향료 0.15
물 최대량(Water up to) 100.0
모든 상기 성분들을 함께 혼합하여 상기 제제를 제조하였다.
(iii) GTR 크림 2 중량%
파트 A
MCT or MCT-CHT 복합재 2.5
폴리에틸렌 옥사이드 1.5
카보폴 0.5
물 83.5
파트 B
바셀린 5.0
폴리에틸렌글리콜 스테아르산 2.5
디에탄올아민 올레스-3 인산 2.0
실리콘 공중합체 1.5
보존제 0.3
파트 C
트리에탄올아민 0.5
향료 0.1
상기 제제는 다음과 같이 별도의 단계들로 제조된다: 상기 혼합물의 부분 A는 상기 카보풀을 물에 분산시킨 후 다른 성분들에서 교반함으로써 제조하였다. 모든 상기 파트 B 성분들을 함께 혼합하고 70°C로 가열하였다. 파트 A 및 B를 결합하고 상기 트리에탄올아민 및 향료를 첨가하였다(부분 C). 상기 생성된 크림은 보습성이 뛰어나고 피부에 기름기가 덜 생긴다.
(iv) 흉터 크림 조성물
Figure pat00001
준비 절차:
1. 비타민 E 150mg를 부드럽게 섞어주면 크림 베이스 분산액과 섞인다.
2. MCT-CHT 동결 건조된 분말(MCT:CHT 질량비 100:0 내지 70:30으로 제형화 됨.) 1000mg 및 (pH3.2)에서 제조된 5.00mL의 아세트산(0.5M)에 용해시킨다.
3. 모링가(Moringa)/비타민 C 추출물 200mg을 MCT-CHT의 상기 수용액에 녹인다.
4. 아스타잔틴(Astaxanthin) 50mg의 무게를 측정하고 MCT-CHT 및 모링가/비타민 C 추출물을 함유한 상기 수용액에 용해시킨다.
5. 로얄 젤리 100mg을 MCT-CHT, 모링가/비타민 C 추출물 및 아스타잔틴을 함유한 상기 수용액과 혼합한다.
6. MCT-CHT, 모링가/ 비타민 C 추출물 및 아스타잔틴을 균질한 분산액에 도달할 때까지 연속적이고 부드럽게 혼합한다. 상기 아스타잔틴은 비타민 E를 함유한 상기 크림베이스를 가진다.
7. 균질화된 흉터 크림 제제를 적절한 유리 용기에 붓고 실온에서 저장한다.
상기 설명된 제제들은 제약 분야에 널리 공지된 통상적인 절차에 의해 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물들은 활성 성분으로서, 상기 MCT-CHT 복합재의 상이한 양 및 유형들을 수용하기 위해 잘 알려진 제약 기술에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다.
상기 설명된 흉터 크림 조성물은 몇몇 환자들에게 적용되었다. 도 30A 및 30B는 한 환자에 대한 전후 결과들을 보여준다. 도 30A는 5년된 제왕 절개 부위의 흉터 크림을 바르기 전 사진이다. 도 30B는 2주 동안 상기 흉터 크림을 매일 적용한 후 동일한 흉터의 사진이다. 도 30B에서 명백한 것처럼, 치료 후 상기 흉터는 더 짧고, 주위 피부색에 더 가까운 다른 색을 갖는다.
도 31A 및 31B는 다른 환자에 대한 전후 결과를 보여준다. 도 31A는 상기 나열된 흉터 크림을 적용하기 전, 왼쪽 무릎 관절 아래의 15년 된 흉터 사진이다. 도 31B는 상기 흉터 크림의 적용 후 동일한 흉터의 사진이다. 도 31B로부터 명백한 것처럼, 상기 흉터는 주위 피부의 색에 더 가까운 다른 색을 갖는다.
도 32A 내지 32C는 또 다른 환자에 대한 결과 전후를 도시한다. 도 32A는 상기 나열된 흉터 크림을 적용하기 전, 25년 된 맹장 수술 흉터의 사진이다. 도 32B는 매일 적용한 후의 동일한 흉터 사진이고, 도 32C는 실시예에 따른 흉터 크림을 8일간 매일 적용 후의 동일한 흉터의 사진이다. 도 32B 및 32C에서 명백한 것처럼, 치료 후의 상기 흉터는 더 짧고, 주위 피부색에 더 가까운 다른 색을 갖는다.
도 33A 및 33B는 또 다른 환자에 대한 결과 전후를 보여준다. 도 33A는 무릎 수술로부터 6개월 된 흉터의 사진이고, 도 33B는 상기 나열된 흉터 크림을 7일간 매일 적용한 후의 동일 흉터 사진이다. 도 33A 및 도 33B로부터 명백한 것처럼, 치료후의 상기 흉터는 훨씬 덜 눈에 띠고, 주위 피부의 색에 더 가까운 다른 색을 갖는다. 상기 환자는 부작용이나 과형성을 겪지 않았다.
도 34A 내지 D는 상기 흉터 치료에 있어서 또 다른 환자에 대한 더 나은 결과를 보여준다. 도 34A는 화상 흉터 사진을 나타내고, 도 34B 및 34C는 상기 나열된 흉터 크림을 매일 적용하는 동안의 상기 흉터 사진을 나타내고, 도 34D는 7일간의 치료 후 상기 흉터 사진을 나타낸다. 이러한 도면들로부터 명백한 것처럼, 치료 후 상기 흉터의 외관과 비교 시, 치료 후의 흉터가 상기 주변 피부의 색에 더 가까운 색으로 상당히 치유되었다.
상기 전술한 치료 예시들에 더하여, 흉터 형성은 예를 들어, 부상, 수술, 성형 수술, 또는 다른 회복 및/또는 치료 절차의 결과로서 눈꺼풀 주위를 포함하여 신체의 다양한 영역에서 발생할 수 있다. 상기 설명된 흉터 크림은 이러한 종류의 치료에도 사용되고, 효과가 있다.
전술한 작업 및 생산된 실시예들의 일부로서, 해삼에서 추출된 MCT와 송아지 피부 조직으로부터 분리된 소 콜라겐 사이의 구조적인 차이를 결정하고 보여주는 작업이 수행되었다. 콜라겐 샘플들의 아미노산 조성물 분석은 하기 자료에서 설명된다. (Cui F., Li Z., Zhang Y., Dong P., Fu X., Gao X., "해삼의 체벽으로부터 유래된 콜라겐의 특성 및 보조 유닛 조성물," Stichopus Japonicus, Food Chem. 100(3) (2007): 1120-5). 간단히, 콜라겐 샘플들을 6M의 HCl로 110 ºC에서 24시간 동안 가수분해 하고, 상기 가수분해물의 주요 아미노산 조성물을 SYKAM 아미노산 분석기 S433D(SYKAM, Munich, Germany)를 사용하여 분석하였다.
하기 표 3은 해삼으로부터 분리된 상이한 MCT 샘플들 및 송아지 가죽으로부터 분리된 소 (송아지 피부) 콜라겐에 대한 아미노산 조성물을 나타낸다. 하기 표의 송아지 피부 콜라겐 샘플 1 내지 4에 대한 분석은 다음의 문헌들에 나와있는 연구에서 수행되었다: X. Cheng, Z. Shao, C. Li, L. Yu, M.A. Raja, C. Liu, "지혈에 사용하기 위한 해파리 Rhopilema esculentum Kishinouye에서 콜라겐의 분리, 특성화 및 평가," PLOS One, 2017, 0169731; Y. Han, J-R. Ahn, J-W. Woo, C-K. Jung, S-M. Cho, Y-B. Lee, S-B. Kim, "황다랑어(Thunnus albacares)의 비늘에서 얻은 콜라겐의 가공 최적화 및 물리화학적 특성," Fisheries and Aquatic Sciences, Volume 13, Issue 2, 2010, pp.102-111; H. Li, B.L. Liu, L.Z. Gao, H.L.Chen, "황소개구리 피부 콜라겐 연구," Food Chemistry, Volume 84, Issue 1, January 2004, pp. 65-69; P. Kittiphattanabawon, S. Nalinanon, S. Benjakul, and H. Kishimura. "화려한 오징어(Loligo formosana)의 상기 피부에서 펩신이 가용화 된 콜라겐의 특성," Journal of Chemistry, Volume 2015, Article ID 482354, 8 pages.
표 3은 아미노산 조성을 나타낸 표이다.
조성 (%w/w)
아미노산 Code MCT 1 MCT 2 송아지 피부 콜라겐1 송아지 피부 콜라겐 2 송아지 피부 콜라겐 3 송아지 피부 콜라겐 4
CYS C 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
HYP Z 7.33 7.46 NR 9.06 8.60 9.40
ASP D 9.23 8.42 4.93 5.11 4.50 4.50
THR T 4.37 3.38 2.35 1.85 1.80 1.80
SER S 3.47 4.10 4.09 2.85 3.70 3.90
GLU E 13.46 14.01 7.84 10.69 7.10 7.50
PRO P 12.21 11.99 11.69 10.88 13.50 12.10
GLY G 19.13 19.64 32.56 16.28 32.50 33.00
ALA A 9.22 9.99 12.91 8.12 11.20 11.90
VAL V 2.53 2.60 3.97 2.27 2.20 2.10
MET M 0.65 0.61 0.86 NR 0.60 0.60
ILE I 1.72 1.64 2.35 1.37 1.10 1.10
LEU L 2.73 2.83 3.82 2.86 2.50 2.30
TYR Y 1.46 1.24 0.91 0.48 0.30 0.30
PHE F 1.42 1.19 1.94 1.84 1.30 0.30
HIS H 0.33 0.24 0.06 1.96 0.50 0.50
LYS K 0.65 0.50 4.27 0.27 2.70 2.60
ARG R 8.54 8.65 5.36 4.19 5.10 5.10
표 3은 가변 콜라겐 조직(MCT) 및 소 콜라겐(BC)의 상기 아미노산 조성을 나타낸다. MCT의 주요 아미노산은 글리신(19.0%), 글루탐산(14.0%), 프롤린(12.0%), 알라닌 (9.0%), 아스파르트 산(9.0%), 아르기닌(8.0%) 및 하이드록시프롤린(6.7%) 이고, 이 아미노산들은 표 4에서 나타낸 소 콜라겐에서 발견된 것과 유사하다(참고 문헌 참조).
1형 콜라겐의 1차 구조는 Gly-X-Y 서열(X는 대부분 프롤린이고 Y는 대부분 하이드록시프롤린임)이 연속적으로 반복되는 도메인을 포함하는 특징을 갖고, 텔로펩티드(telopeptides)(15 내지 26개 아미노산 잔기)라고 부르는 매우 짧은 N- 및 C- 말단 영역을 포함하는 특징을 갖는다. α1 사슬에서 상기 Gly-X-Y 반복 서열은 2차 구조의 3중 나선 형성에 중요한 역할을 한다. Gelse K, Poschl E, Aigner T. 2003 참조. 콜라겐-구조, 기능, 및 생합성. Adv Drug Deliver Rev 55(12):1531-46; Gomez-Guillen M, Gimenez B, Lopez-Caballero M, Montero M. 2011. 대체 공급원들로부터의 콜라겐 및 젤라틴의 기능적 및 생물 활성 특성들: 검토. 음식 하이드로 콜로이드 (Food Hydrocolloid) 25(8):1813-27. 분자량이 가장 작은 아미노산으로서, 삼중 나선의 상기 중심에 배열된 글리신 잔기들은 나선 구조가 쉽게 접히도록 도울 수 있다. See Fraser R, MacRae T, Suzuki E. 1979. 콜라겐 분자의 사슬 구조. J Mol Biol 129(3):463-81. 따라서, 글리신은 소 콜라겐의 주요 아미노산이다. 이전의 문헌들에 따르면, 소 콜라겐의 상기 글리신 함량은 총 아미노산의 약 1/4인 14 내지 33%의 범위이며, 이러한 수치는 MCT 글리신 함량(19%)과 일치하였다.
도 23 및 24는 송아지 및 닭 콜라겐과 비교하여 해양 콜라겐에 대한 콜라겐 매트릭스의 순도 분석 결과들을 보여주고, 해양 콜라겐은 송아지 및 닭 콜라겐만큼 안전하므로, 이전에 기술한대로 적용하기에 충분히 안전하다는 것을 보여준다. 이 도면들은 3중 나선 구조를 보여주는데, 하단의 넓은 파란색 결합은 알파 나선이며, 베타 또는 감마 나선 위에 있다. 이러한 도면들에서 MCT 1 및 MCT 2는 상이한 MCT 배치들을 나타내며, 결과의 재현성을 나타낸다.
도 25A는 연속 선으로 표시된 바와 같은 소 콜라겐의 스펙트럼을 도시한다. 상기 도면에서 "+"로 표시된 피크들(peaks)은 송아지 콜라겐이 가수분해되어 용해됨을 보여준다. 상기 비교 그래프는 MCT를 가수분해 피크"o"의 흔적이 없는 점선으로 나타낸다. 도 25B는 해삼에 대한 상기 MCT 분리 공정의 효율에 관한 결과의 재현성을 나타내는, 비교 가능한 FTIR 스펙트럼을 도시하며, MCT1은 실선으로 표시되며, MCT2는 점선으로 표시된다. 도 25B는 배치(batch)에서 배치에 이르기까지 MCT 화학적 프로파일의 높은 일관성을 도시한다.
도 26은 콜라겐 샘플들의 열용량 분석(TGA)의 결과를 나타내고 MCT 샘플들에 대한 열 거동의 차이들을 나타낸다. 도 26에서, 상기 그래프의 아래를 향함에 따라 줄어든 안정성이 표시된다. 소 콜라겐의 선은 280C에서 불안정성이 증가하는 반면, MCT1 및 MCT2 선들은 400C에서도 안정성을 보여준다. 상기 그래프는 소 콜라겐보다 MCT의 열 안정성이 더 우수하고, MCT-기반 제품들을 저장하는 능력이 향상되었음을 보여준다.
이미노산들(Imino acids) (프롤린 및 하이드록시프롤린)은 피롤리딘 고리들(pyrrolidine rings)과 콜라겐 삼중 나선의 안정성을 유지하는 능력 때문에 α 사슬에서 Gly-X-Y반복 서열을 구성하는 중요한 아미노산들이다. Wong, DW. 1989 참조. 식품 화학의 메커니즘 및 이론. New York: Van Nostrand Reinhold. MCT에서 프롤린과 하이드록시프롤린의 상기 함량들은, 도 27에서 보여지는 것과 같이, 소 콜라겐에서 발견된 값보다 약간 낮은 20.0%의 총 이미노산(imino acid) 함량에 대해 각각 12.0 및 7.0%이다.
프롤린 및 하이드록시프롤린의 상기 함량은 환경적 온도와 관련이 있는 것으로 나타났다. Zhong M, Chen T, Hu C, Ren C. 2015참조. 해삼 Stichopus monotuberculatus의 체벽으로부터 콜라겐의 분리 및 특성. Food Chem 80(4):C671-C679. 그러나, 소 콜라겐과 비교할 때, Gly 대비 이미노산(Hyp/Pro) 함량의 비는 낮으므로, MCT에서 이미노산에 의한 Gly-기반 삼중 나선의 보다 효율적인 안정성을 시사한다.
콜라겐의 안정성은 아미노산 조성, 특히 이미노산들에 의해 영향을 받을 수 있다. 프롤린(PRO) 및 하이드록시프롤린(HYP)은 피롤리딘 고리들로 콜라겐 공간 구조를 유지할 수 있는 반면, 하이드록시프롤린의 하이드록시기들은 인접한 사슬과 수소 결합들을 형성하여 삼중 나선의 안정성을 향상시킨다. MCT의 아미노산 조성물 분석은 소 콜라겐보다 낮은 분해 속도를 나타내는 안정한 콜라겐 삼중-나선의 형성에 적합한 글리신 및 이미노산의 높은 존재를 나타낸다.
도 27은 송아지 콜라겐의 몇몇 샘플들과 비교하여, MCT1 및 MCT2 샘플들에 대한 이미노산(HYP 및 PRO의 합)의 막대 그래프이다. MCT의 매우 유리한 측면들 중 하나는 GLY대비 이미노산들의 거의 1:1 비율이며, 일관성있게 재현 가능하다. 이와 비교하여, 상기 도면 중간에 가장 양호한 콜라겐 샘플조차도 MCT1 및 MCT2 샘플들과 마찬가지로 1:1 비율에 가깝지 않다. 이미노산들에 비해 높은 함량의 GLY는 낮은 안정성을 나타낸다. 높은 GLY 함량이 유리하지만, GLY 대비 이미노산들의 1:1 비율은 더 큰 안정성을 나타낸다.
도 28A 및 28B 및 도29A 및 29B는 두가지 상이한 방식들로 형성된 MCT의 주사 전자 현미경(SEM) 사진이다. 도 28A 및 28B는 용매 캐스팅 기술을 사용하여 MCT-키토산 복합재를 형성한 상기 결과를 보여준다. 도 28A는 MCT-키토산 드레싱 템플릿(예를 들어, 3D 해면체)의 상기 구조의 상기 형태를 보여준다. 도 28B는 상기 구조에 대한 높은 정도의 다공성을 나타낸다. 도 29A 및 29B는 전기 방사 기술을 사용하여 상기 MCT-키토산 드레싱 템플릿을 형성한 상기 결과들을 보여준다. 도 28A 및 28B와 같이, 각각 도 29A는 상기 구조의 상기 형태를 나타내고, 도 29B는 상기 구조에 대한 높은 정도의 다공성을 나타낸다. 다공성은 세포 부착 및 성장을 촉진하기 위해 유도된 조직 재생에서 중요한 속성이다.
모든 참고 문헌들, 특허들, 및 특허 문헌들은 개별적으로 참조로 통합되는 것과 같이, 본 명세서에 참조로서 포함된다. 또한, 본 발명의 다양한 관점들은 다양하고 구체적이며, 바람직한 실시예들 및 기술들을 참조하여 설명되었다. 그러나, 본 발명의 진의 및 범위 내에서 수 많은 변형들과 수정들이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (27)

  1. 유도된 조직 재생(GTR) 장치는:
    가변성 콜라겐 조직(MCT) 및 키토산; 및
    치료될 영역으로 상기 MCT 또는 상기 매트릭스를 전달하기 위한 적용기(applicator)를 포함하며,
    상기 키토산은 0이상 90이하의 질량 백분율로 존재하고, 상기 키토산이 존재할 때, 상기 MCT에 정전기적으로 결합되어 매트릭스를 형성하며, 키토산 및 MCT의 상기 매트릭스는 MCT-키토산 복합 물질의 형태인 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 MCT는 무척추 동물 해양 유기체들로부터 분리된 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  3. 제2 항에 있어서, 상기 무척추 동물 해양 유기체들은 해면체들, 해파리, 연체동물, 및 극피동물로 구성된 그룹으로부터 선택된 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  4. 제3 항에 있어서, 상기 MCT는 성게들 및 해삼들로 구성된 그룹으로부터 선택된 극피동물로부터 분리되는 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  5. 제4 항에 있어서, 상기 MCT는 해삼들로부터 분리된 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  6. 제1 항에 있어서, 상기 MCT는 콜라겐 및 글리코오스아미노글리칸(GAG)을 포함하는 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  7. 제1 항에 있어서, 상기 MCT는, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 V 나 유형 XI, 또는 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 V 나 유형 XI 중 둘 이상의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 원 섬유형 콜라겐으로 구성된 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  8. 제7 항에 있어서, 상기 MCT는 원 섬유형 콜라겐 I형으로 구성되는 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  9. 제6 항에 있어서, 상기 글리코오스아미노글리칸은 황산 콘드로이틴(chondroitin sulfate), 히알루론산, 헤파린, 황산 케라탄, 황산 헤파란이나 황산 더마탄, 또는 2종 이상의 황산 콘드로이틴, 히알루론산, 헤파린, 황산 케라탄, 황산 헤파란 및 황산 더마탄의 혼합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  10. 제9 항에 있어서, 상기 글리코오스아미노글리칸은 황산 콘드로이틴및 히알루론산, 또는 황산 콘드로이틴 및 히알루론산의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  11. 제1 항에 있어서, MCT 대 키토산의 질량비는 10:90, 20:80, 40:60, 50:50, 60:40, 80:20, 90:10 또는 100:0으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  12. 제1 항에 있어서, 상기 MCT 또는 MCT-키토산 복합재는 하이드로 겔, 바이오 필름, 3D-해면체, 전기 방사 나노 섬유, 나노 입자 또는 상처 드레싱 템플릿의 표면 코팅으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형태를 포함하는 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  13. 제1 항에 있어서, 상기 MCT-키토산 복합재는 키토산 상의 N-글루코사민 단위체를 갖는 MCT에서 GAG 및 콜라겐 사이의 고분자 전해질 가교 구조를 포함하는 유도된 조직 재생(GTR) 장치.
  14. 가변 콜라겐 조직(MCT) 및 키토산을 치료 부위에 적용하는 단계를 포함하며,
    상기 키토산은 0 이상 90 이하의 질량 백분율로 존재하고, 상기 키토산이 존재할 때, 상기 MCT에 정전기적으로 결합되어 매트릭스를 형성하며, 키토산 및 MCT의 상기 매트릭스는 MCT-키토산 복합 물질의 형태인 유도된 조직 재생 수행 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 하이드로 겔, 바이오 필름, 3D-해면체, 전기 방사 나노 섬유, 나노 입자 또는 상처 드레싱 템플릿의 표면 코팅으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장치에 상기 매트릭스를 제공하는 단계와, 치료 영역에 상기 장치를 적용하는 단계를 더 포함하는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  16. 제14 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 상기 적용 단계는 MCT를 포함하는 상기 매트릭스를 포함하며, 상기 MCT는 무척추 동물 해양 유기체들로부터 분리되는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 MCT가 포함된 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며, 상기 MCT는해면체들, 해파리, 연체동물 및 극피동물로 구성된 그룹으로부터 선택된 해양 무척추 동물 유기체들로부터 분리되는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 MCT가 포함된 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며, 상기 MCT는 상기 적용하는 단계는 성게들 및 해삼들로 구성된 그룹으로부터 선택된 극피동물들로부터 분리되는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 MCT를 포함하는 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며, 상기 MCT는 해삼들로부터 분리된 유도된 조직 재생 수행 방법.
  20. 제14 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 MCT의 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며, 상기 MCT는 콜라겐 및 글리코오스아미노글리칸(GAG)을 포함하는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  21. 제14 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 MCT를 포함하는 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하고, 상기 MCT는, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 V 나 유형 XI, 또는 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 V 나 유형 XI 중 둘 이상의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 원 섬유형 콜라겐으로 구성되는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  22. 제20 항에 있어서, 상기 MCT는, 원 섬유 콜라겐 유형 I로 구성되는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  23. 제20 항에 있어서, 상기 글리코오스아미노글리칸은 황산 콘드로이틴, 히알루론산, 헤파린, 황산 케라탄, 황산 헤파란 또는 황산 더마탄, 또는 2종 이상의 황산 콘드로이틴, 히알루론산, 헤파린, 황산 케라탄, 황산 헤파란 및 황산 더마탄의 혼합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  24. 제22 항에 있어서, 상기 글리코오스아미노글리칸은 황산 콘드로이틴, 및 히알루론산, 또는 황산 콘드로이틴 및 히알루론산의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단계인 유도된 조직 재생 수행 방법.
  25. 제14 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 키토산 및 MCT의 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며, MCT 대 키토산의 질량비가 10:90, 20:80, 40:60, 50:50, 60:40, 80:20, 90:10, 또는 100:0으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유도된 조직 재생 수행 방법.
  26. 제14 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 키토산 및 MCT의 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며, 상기 MCT-키토산 복합재는 하이드로 겔, 바이오 필름, 3D-해면체, 전기 방사 나노 섬유, 나노 입자 또는 상처 드레싱 템플릿의 표면 코팅으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형태를 포함하는 유도된 조직 재생 수행 방법.
  27. 제14 항에 있어서, 상기 적용하는 단계는 키토산 및 MCT의 상기 매트릭스를 적용하는 단계를 더 포함하며,
    상기 MCT-키토산 복합재는 상기 MCT의 GAG와 콜라겐 사이의 고분자 전해질 가교 구조를 포함하며, 상기 키토산의 N-글루코사민 단위체들과의 상호작용을 포함하는 유도된 조직 재생 수행 방법.


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