KR20200029544A - 암 면역요법을 위해 면역 조절제와 조합된 면역조절 레티노이드 및 렉시노이드 화합물 - Google Patents

암 면역요법을 위해 면역 조절제와 조합된 면역조절 레티노이드 및 렉시노이드 화합물 Download PDF

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로샨타 에이 챤드라라트나
마틴 이 샌더스
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아이오 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본원은 CAR-변형된 면역 세포 및 적어도 하나의 레티노산 수용체 및/또는 레티노이드 X 수용체 활성 제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 개시한다.

Description

암 면역요법을 위해 면역 조절제와 조합된 면역조절 레티노이드 및 렉시노이드 화합물
관련 출원
본원은 2017년 7월 13일에 출원된 미국 가특허출원 제62/532,233호, 및 2017년 8월 31일에 출원된 미국 가특허출원 제62/552,814호의 이익을 주장한다. 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 각각 도입된다.
최근에, 암 치료의 초석은 수술, 화학요법 및 방사선요법이다. 지난 10년에 걸쳐, 표적화된 요법-주로 암 세포에서 확인된 특정 분자 변화로 곧장 향함으로써 암 세포를 표적화하는 약물-도 다수의 암들의 표준 치료로서 등장하였다. 면역요법에의 한 접근법은 종양을 인식하고 공격하도록 면역 세포를 조작하는 단계를 수반한다.
정상 조혈 줄기 세포(HSC)는 레티노이드(레티노산 수용체 또는 RAR에 특이적인 화합물)에 대한 높은 민감성을 갖도록 프라이밍되나, 이 세포를 생리학적 수준의 레티노이드로부터 단리함으로써 레티노이드 신호전달 미감작 상태로 유지된다. 골수 미세환경은 효소 CYP26을 발현함으로써 레티노산을 대사적으로 불활성화시키고 레티노이드에의 골수의 노출을 조절한다. 이 기작(CYP26 매개 레티노이드 대사)은 동력학적이고, HSC 거동을 생리학적 요구에 일치시키기 위해 골수 간질에 의해 사용된다. 예를 들면, 골수 적소 내의 레티노이드의 정상 상태 낮은 수준은 HSC를 휴면 상태로 유지하는 반면, 스트레스(즉, 방사선 또는 화학요법에의 노출)의 상황 동안 더 높은 레티노이드 수준은 HSC를 세포 분열에 동원하고 조혈작용을 레스큐하기 위해 유지된다.
혈액 악성종양을 가진 대상체에서, 암 HSC는 정상 상황과 유사한 방식으로 간질 CYP26에 의해 레티노이드로부터 보호된다. 그러나, 혈액 악성종양에서 골수 적소 내의 다른 변경, 예컨대, 알데하이드 데하이드로게나제(dehydrogenase)(ALDH) 활성의 차이 때문에, 혈액 악성종양의 치료에 유용하기 위해 레티노이드에 대한 치료 윈도우(window)가 존재한다. 골수 미세환경에 의한 CYP26의 발현은 올-트랜스 레티노산(ATRA)으로부터 미성숙 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 보호에 기여하고, ATRA가 AML의 치료에 효과적이지 않은 이유를 설명할 수 있다. 레티노산 수용체 감마(RARγ)를 통해 작용하는 약리학적 농도의 ATRA에의 노출은 골수 미세환경에서 CYP26 발현을 유도함으로써, 이 미세환경에서 암 줄기 세포를 레티노이드 활성으로부터 보호한다. 이 기작은 골수에서 비-조혈성 전이성 종양 세포도 차폐한다. 그러나, CYP26에 의해 불활성화되지 않는 레티노이드 유사체의 사용은 이러한 레티노이드가 보호 골수 적소로부터 암 HSC를 말기 분화시켜 제거할 수 있게 한다. 이러한 분화가 RARα에 의해 매개되기 때문에, CYP26에 대한 내성을 가진 RARα 특이적 유사체의 사용은 CYP26 효소에 의한 불활성화 없이 치료 분화 유도 활성을 가능하게 한다.
다른 레티노이드 및 렉시노이드(레티노이드 X 수용체 또는 RXR에 특이적인 화합물)는 표적화된 면역요법을 증가시키고 증강시키는 데 활용될 수 있는 면역조절 활성을 가진다.
따라서, 암 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한, 표적화된 면역요법의 RAR 작용제들의 조합, 및 표적화된 면역요법을 증강시키기 위한 RAR/RXR 활성 제제들의 조합은 암의 치료에 특히 유용할 수 있다.
본원은 표적화된 암 면역요법제를 증강시키는 화합물을 개시한다. 레티노산 수용체(RAR) 및 레티노이드 X 수용체(RXR)에 작용하는 화합물은 암 줄기 세포의 기존 존재량(burden)을 감소시키고 항암 활성을 증강시키기 위해 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 면역 세포(종종 CAR-MIC로서 약칭됨)와 조합되어 사용된다.
레티노이드 및 렉시노이드는 다양한 활성들을 가진다. 특정 레티노이드는 암 줄기 세포의 말기 분화에 기반을 둔 항암 효과를 가진다. 이 분화 레티노이드는, 본원이 우선권을 주장한 미국 가특허출원 제62/552,814호에 기재된 바와 같이, 면역요법의 전체 효과를 증가시키기 위해 CAR-MIC와 조합되어 사용될 수 있다. 다른 특정 레티노이드 및 렉시노이드는 예를 들면, Treg 세포를 하향조절하거나 Th17 세포를 상향조절하는 데 사용될 수 있는 면역조절 활성을 가진다. 이 면역조절 레티노이드 및 렉시노이드도, 본원이 우선권을 주장한 미국 가특허출원 제62/532,233호 및 전체로서 본원에 참고로 도입된, 본원과 동일한 날짜에 출원된 미국 특허출원 제__/___,___호(사건번호 1958481.00090)에 기재된 바와 같이, 면역요법의 전체 효과를 증가시키기 위해 CAR-MIC와 조합되어 사용될 수 있다. 분화 레티노이드와 CAR-MIC의 조합, 및 면역조절 레티노이드 및 렉시노이드와 CAR-MIC의 조합은 각각 별개로 유용하지만, 이 접근법들의 통합의 추가 장점이 있다. 따라서, 본원은 암 면역요법에 있어서 분화 레티노이드, 면역조절 레티노이드 및/또는 렉시노이드, 및 CAR-MIC의 사용과 관련된 통합된 방법 및 관련 조성물을 개시한다.
일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 CAR-변형된 T 세포이거나 CAR-변형된 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 CAR-변형된 NK 세포이거나 CAR-변형된 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 CAR-변형된 NKT 세포이거나 CAR-변형된 NKT 세포를 포함한다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 CAR-변형된 대식세포이거나 CAR-변형된 대식세포를 포함한다. 추가 실시양태는 이 세포 유형들의 혼합물을 포함할 수 있다. 대부분 전형적으로, 이러한 세포 제제는 주입, 예를 들면, 정맥내 주입에 의해 투여된다. 대조적으로, 레티노이드 및 렉시노이드는 경구, 예를 들면, 환제 또는 캡슐제 등으로서 투여될 수 있는 소분자이다. 따라서, 레티노이드 및 렉시노이드, 및 CAR-변형된 면역 세포는 독립적인 일정으로 투여될 수 있다.
CAR-MIC와 면역조절 레티노이드 및 렉시노이드의 조합
따라서, 한 양태에서, 본원은 암을 치료하는 방법으로서, CAR-변형된 면역 세포 및 적어도 하나의 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제(집합적으로 RAR/RXR 활성 제제)를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 레티노이드 활성 제제는 레티노산 수용체(RAR) 활성 제제이다. 일부 실시양태들에서, 렉시노이드 활성 제제는 레티노이드 X 수용체(RXR) 활성 제제이다. 일부 실시양태들에서, 2개의 RAR/RXR 활성 제제들이 사용되고; 이들은 2개의 RAR 활성 제제들, 2개의 RXR 활성 제제들, 또는 RAR 활성 제제 및 RXR 활성 제제일 수 있다. 일부 실시양태들에서 RAR/RXR 활성 제제는 그의 수용체의 작용제로서 작용하는 반면, 다른 실시양태에서 RAR/RXR 활성 제제는 그의 수용체의 길항제로서 작용한다. 다수의 RAR/RXR 활성 제제들을 사용하는 일부 실시양태들에서, 다수의 RAR/RXR 활성 제제들은 별도로 제제화되고 투여된다. 이 실시양태들의 일부 양태들에서, RAR/RXR 활성 제제들은 별도로 투여되되, 동일한 치료 기간 동안 투여된다. 이 실시양태들의 다른 양태에서, RAR/RXR 활성 제제들은 상이한 치료 기간에 투여된다. 다른 실시양태에서, 다수의 RAR/RXR 활성 제제들은 별도로 제제화되되, 공투여된다(즉, 동일한 치료 기간 동안 투여된다). 다른 실시양태에서, 다수의 RAR/RXR 활성 제제들은 단일 공통 약물로서 함께 제제화된다.
일부 실시양태들에서, 레티노이드 활성 제제는 RARα 길항제이다. 일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 하기 화학식 (I)의 화합물이다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 C(CH3)2, O, S 또는 NR7이고, 여기서 R7은 H 또는 C1-6 알킬이고; X1은 H 또는 할로겐, 예컨대, F, Cl 또는 Br이고; R8은 H 또는 OH이다.
일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 AGN194301, AGN193491, AGN193618, AGN194202 또는 AGN194574이다.
일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 하기 화학식 (II)의 화합물이다:
Figure pct00002
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 C1-6 알킬이고; X는 O, S 또는 CH2이고; Y는 O, S, CH2 또는 NR3이고, 여기서 R3은 C1-6 알킬이고; Z는 Cl 또는 Br이고; W는 H 또는 OH이고; U는 독립적으로 H 또는 F이다. 일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 하기 화합물이다:
Figure pct00003
일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 하기 화학식 (III)의 화합물이다:
Figure pct00004
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 O, S, N 또는 CH2이고; W는 H 또는 OH이고; Z는 Cl 또는 Br이다.
일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 하기 화합물이다:
Figure pct00005
일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 하기 화합물이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 실시양태들에서, 레티노이드 활성 제제는 RARγ 작용제이다. 일부 실시양태들에서, RARγ 작용제는 하기 화합물이다:
Figure pct00008
일부 실시양태들에서, RARγ 작용제는 하기 화학식 (IV)의 RARγ 선택적 작용제이다:
Figure pct00009
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; X는 O, S, CH2, C(R4)2 또는 NR5이고, 여기서 R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이다.
일부 실시양태들에서, RARγ 작용제는 하기 화합물들로부터 선택된 RARγ 선택적 작용제이다:
Figure pct00010
일부 실시양태들에서, 레티노이드 활성 제제는 RXR 길항제이다. 일부 실시양태들에서, RXR 길항제는 하기 화합물이다:
Figure pct00011
일부 실시양태들에서, RXR 길항제는 AGN195393 또는 LGN100849이다.
CAR-MIC와 분화 레티노이드의 조합
이 조합은 RARα 작용제를 사용한다. 일부 실시양태들에서, RARα 작용제는 하기 화학식 (III)의 화합물이다:
Figure pct00012
다른 실시양태에서, RARα 작용제는 타미바로텐(tamibarotene)(AM80), AM580 또는 Re 80이다:
Figure pct00013
다른 실시양태는 이 RARα 작용제들 중 하나 이상의 RARα 작용제를 구체적으로 배제한다.
일부 실시양태들에서, 암은 혈액 악성종양, 예컨대, 급성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종이다. 일부 실시양태들에서, 암은 고형 종양이다.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 추가적으로 적어도 하나의 암 화학요법제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 적어도 2개의 레티노이드 활성 제제들을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 2개의 레티노이드 활성 제제들은 RARα 길항제 및 RARγ 작용제이다.
일부 실시양태들에서, 상기 방법은 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태들에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG-3, PD-L1 리간드, B7-H3, B7-H4, BTLA 중 적어도 하나의 억제제이거나, ICOS 또는 OX40 작용제이다. 일부 실시양태들에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG-3, PD-L1 리간드, B7-H3, B7-H4, BTLA, ICOS 또는 OX40 중 적어도 하나에 특이적인 항체이다.
본원은 암 환자의 무질환 생존을 연장시키는 방법으로서, CAR-변형된 면역 세포 및 적어도 하나의 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법도 개시한다.
본원은 CAR-변형된 면역 세포의 독성을 감소시키는 방법으로서, 조합의 결과로서, CAR-변형된 면역 세포가 단독으로 투여된 경우보다 더 낮은 용량의 CAR-변형된 면역 세포가 더 안전하게 및 동등하게 효과적으로 투여되거나, 더 높은 용량의 CAR-MIC가 더 큰 효능 및 동등한 안전성으로 투여될 수 있도록, CAR-변형된 면역 세포와 조합된 적어도 하나의 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제를, 이러한 독성의 감소를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 개시한다.
본원은 CAR-변형된 면역 세포의 수를 증폭시키는 방법으로서, 적어도 하나의 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제를 포함하는 배양 배지에서 CAR-변형된 면역 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법도 개시한다. 일부 실시양태들에서, 이것은 RAR/RXR 활성 제제(들)을 환자에게 투여하는 단계 대신에 수행된다. 다른 실시양태에서, 이것은 RAR/RXR 활성 제제(들)을 환자에게 투여하는 단계와 더불어 수행된다. 다양한 실시양태에서, CAR-변형된 면역 세포 배양에 사용된 RAR/RXR 활성 제제(들)과 환자에게 투여된 RAR/RXR 활성 제제(들)은 상이하거나 동일하거나, 한 세트가 서로의 서브세트를 구성한다.
본원은 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 면역 세포, 적어도 하나의 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제, 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법도 개시한다.
명료성 및 수사학적 용이성을 위해, 본 개시의 대부분은 CAR-MIC와 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 조합 및 CAR-MIC와 분화 RAR 활성 제제의 조합의 양태를 별도로 다루지만, 이들은 통합된 요법의 두 부분들을 구성하는 하위조합이라는 것을 이해해야 한다. 이 두 부분들의 나머지 중 하나에 반드시 특이적일 필요가 없는 실시양태는 RAR/RXR 활성 제제와 같은 용어가 통합된 요법의 분화 양태에 적용될 때 RAR 활성 제제 및 특히 RARα 작용제를 지칭하고, 특히 통합된 요법의 면역조절 양태에 적용될 때 RARα 길항제, RARγ 작용제, RXR 길항제 및 이들의 조합을 지칭하는 것으로 이해되도록 상기 부분들 둘 다에 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 화합물 IRX5183이 RARα, RARβ 및 RARγ에 결합하여 이들로부터의 전사를 활성화시키는 정도를, 트랜스활성화 어세이를 이용하여 보여준다.
도 2a 내지 2c는 RAR 수용체 특이적 작용제가 FoxP3, α4β7 및 CCR9 발현을 조절한다는 것을 보여준다. 정제된 CD4+ CD25- FoxP3- 세포를, 특정된 농도의 각각의 RAR 작용제를 가진 배지에서 배양하였고 총 CD4 T 세포에서의 FoxP3(도 2a), α4β7(도 2b) 및 CCR9(도 2c) 발현에 대해 유세포분석으로 분석하였다. FoxP3 결과는 3회 독립적 실험들을 대표한다. CCR9 및 α4β7 결과는 다회 실험들을 대표한다.
도 3a 내지 3h는 AGN(RA 수용체 길항제 AGN194310, 1 μM)과 함께 또는 이것 없이 간질의 부재(액체) 하에서 5일 동안 항온처리되었거나, R115(CYP26 억제제 R115866, 1 μM) 또는 IRX(CYP26 내성 레티노이드 IRX5183, 1 μM)와 함께 또는 이들 없이 BM 중간엽 세포(간질)와 공배양된, 다발성 골수종(MM) 세포주 H929(도 3a 내지 3d) 또는 3개의 상이한 환자 샘플들로부터의 CD138+ MM 세포(도 3e 내지 3h)에서 혈장 마커 BCL6(도 3a 및 3e), BLIMP-1(도 3b 및 3f), XBPS-1(도 3c 및 3g) 및 CHOP(도 3d 및 3h)의 상대적 농도를 보여준다. 비처리된 액체 조건에서의 발현은 1로 설정되었다. 데이터는 유사한 결과를 가진 3회 독립적 실험들을 대표하고, 평균 ± SEM을 나타낸다. 군들 사이의 통계학적 유의성의 측정을 위한 반복된 측정 일원 ANOVA에 의해, *P ≤ 0.05 및 **P ≤ 0.01; 던넷(Dunnett) 검정을 이용하여 다중 비교를 위해 P 값을 보정하였다. Ctrl, 대조군; max, 최대치.
도 4a 및 4b는 H929 세포의 집락형성(clonogenic) 회복(CFU)(도 4a) 또는 3개의 상이한 환자 샘플들로부터의 일차 CD138+ MM 세포의 세포 회복(도 4b)를 보여준다. MM 세포를 범-RAR 억제제 AGN(1 μM)과 함께 또는 이것 없이 간질의 부재(액체) 하에서, 또는 CYP26 억제제 R115(1 μM) 또는 CYP26 내성 레티노이드 IRX(1 μM)와 함께 또는 이들 없이 BM 중간엽 세포(간질)의 존재 하에서 5일 동안 항온처리한 후, 48시간 동안 보르테조밉(bortezomib)(BTZ; 2.5 nM)으로 처리하였다. 집락형성 또는 세포 회복을 BTZ의 부재 하의 각각의 조건으로 표준화하였다.
도 5는 BTZ(2.5 nM)로 처리된 H929 세포의 집락형성 회복을 보여준다. MM 세포를 R115(1 μM)와 함께 또는 이것 없이 BM 중간엽 세포(간질)의 부재(액체) 또는 존재 하에서 5일 동안 항온처리하였다. 이 예비항온처리 후, H929 세포를 BM 간질로부터 분리하고 0시간 내지 48시간 동안 새로운 배지에서 배양한 후, 48시간 동안 BTZ(2.5 nM)로 처리하였다. 집락형성 회복을 BTZ의 부재 하의 각각의 조건으로 표준화하였다.
도 6은 전신 MM 이종이식편의 생체발광 영상을 보여준다. H929 Luc+ 세포의 생착 후, 마우스를 4주 동안 IRX(n = 4), BTZ(n = 5), 또는 이들의 조합으로 처리하였다. 데이터는 0일째 날부터 생체발광도(광자/초)의 배수 변화의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 7a 내지 7c는 BM 간질에서 CYP26A1의 발현에 대한 MM 세포의 효과를 보여준다. MM 세포(H929[도 7a], MM.1S[도 7b], U266[도 7c])의 부재(대조군) 또는 존재(공배양 또는 트랜스웰) 하에서 24시간 동안 항온처리된 인간 BM 중간엽 세포에서의 CYP26A1 mRNA의 상대적 정량. 비처리된 BM 간질(대조군)에서의 발현을 임의로 1로 설정하였다.
도 8a 내지 8c는 MM 세포(H292, MM.1S, U266)의 부재(대조군) 또는 존재(공배양 또는 트랜스웰) 하에서 24시간 동안 항온처리된 마우스 야생형(WT) 또는 Smo-KO BM 간질에서의 CYP26A1 mRNA의 상대적 정량을 보여준다. 비처리된 WT 또는 Smo-KO 간질에서의 발현을 각각의 처리 조건에 대해 임의로 1로 설정하였다. 데이터는 3회 독립적 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. 비대응 양측 스튜던트(Student) 검정에 의해, *P ≤ 0.05 및 **P ≤ 0.01.
도 9는 IRX(10 mg/kg), BTZ(0.5 mg/kg) 또는 조합을 사용한 4주의 치료 동안 종양 존재량을 보여주는 마우스의 생체발광 영상을 보여준다. 전방 종양은 MM.1S 루시퍼라제+ 세포와, 대조군 벡터로 형질도입된 SmoFl/Fl BM 간질 세포(WT BM 간질)의 조합으로 구성되었다. 후방 종양은 MM.1S 루시퍼라제+ 세포와, Cre-재조합효소(recombinase)로 형질도입된 SmoFl/Fl BM 간질 세포(Smo KO BM 간질)의 조합으로 구성되었다.
도 10은 4주의 치료 동안 종양의 생체발광도(광자/초)의 배수 변화를 보여준다. 1일째 날 각각의 종양에 대한 생체발광도의 변화를, 14일째 날 및 치료의 말기(28일째 날) 생체발광도의 변화로 표준화하였다.
도 11a 내지 11h는 간질의 부재(대조군) 하에서 5일 동안 항온처리되었거나 WT 또는 Smo-KO 간질 세포와 공배양된 H929 세포(도 11a) 및 3명의 환자 샘플로부터의 일차 CD138+ MM 세포(도 11b)에서의 BCL6(B 세포 마커), BLIMP, XBP1s 및 CHOP(PC 마커)의 상대적 정량을 보여준다. 비처리된 액체 조건에서의 발현을 1로 설정하였다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. 치료군들 사이의 통계학적 유의성을 측정하기 위한 반복된 측정 일원 ANOVA에 의해, *P ≤ 0.05 및 **P; 던넷 검정을 이용하여 다중 비교를 위해 P 값을 보정하였다.
도 12a 내지 12c는 ATRA에 의해 매개되되, AM80 또는 IRX5183에 의해 유도되지 않는, AML의 분화 및 제거의 간질 차단을 보여준다. (도 12a) 10-7 M ATRA, IRX5183 또는 10-8 M AM80으로 처리된 NB4 세포; 10-6 M ATRA, IRX5183 또는 10-7 M AM80으로 처리된 (도 12b) OCI-AML3 세포 및 (도 12c) Kasumi-1 세포를 사용한 CFU 실험은 간질 안팎에서 AM80 및 IRX5183을 사용한 대조군에 비해 집락형성 성장의 감소를 보였다. 3회 독립적 실험에 대한 데이터.
본원은 레티노이드 및/또는 렉시노이드 화합물을 포함하는 암 요법, 및 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역 세포(CAR-변형된 면역 세포 또는 CAR-MIC)의 입양 전달을 위한 조합을 개시한다. 레티노산 수용체(RAR) 및/또는 레티노이드 X 수용체(RXR)에 작용하는 화합물은 CAR-변형된 면역 세포의 활성을 증가시킨다. RAR에 작용하는 다른 화합물, 특히 RARα 선택적 작용제는 암 줄기 세포가 분화하게 하고 골수 또는 종양 부위를 떠나게 하고 CAR-변형된 면역 세포에 의해 공격받을 수 있게 함으로써 CAR-변형된 면역 세포의 활성을 증강시킬 수 있다.
증강(potentiation)은 RAR/RXR 활성 제제가 CAR-변형된 면역 세포와 함께 사용되지 않을 때보다 RAR/RXR 활성 제제가 CAR-변형된 면역 세포와 함께 사용될 때 CAR-변형된 면역 세포가 더 크고/크거나 더 빠른 효과를 가짐을 의미하거나, 유사하게 RAR/RXR 활성 제제도 사용될 때 RAR/RXR 활성 제제를 사용하지 않은 경우 요구될 CAR-변형된 면역 세포의 용량보다 더 작은 용량의 CAR-변형된 면역 세포를 사용하여 소정의 정도의 효과를 수득할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증강시킨다"는 RAR/RXR 활성 제제(들)의 부재 하에서의 CAR-변형된 면역 세포의 사용에 비해 RAR/RXR 활성 제제, 특히 RARα 작용제, 및 RARα 길항제, RARγ 작용제, RXR 길항제, 또는 이들의 조합과 조합되어 사용될 때, CAR-변형된 면역 세포의 개선된 효능 또는 환자에 의한 개선된 반응을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증가시킨다"도 RAR/RXR 활성 제제가 사용되지 않은 상황에 비해 RAR/RXR 활성 제제를 사용할 때 개선된 효과를 지칭한다. 본원에 기재된 증강은 RAR/RXR 활성 제제(들)의 면역조정/면역조절 활성으로부터 비롯된다.
다수의 증강 방식들이 가능하다. 일부 방식들에서, RAR/RXR 활성 제제(들)은 CAR-변형된 면역 세포에 직접적으로 작용한다. 이하에 설명된 바와 같이, 이것은 사용된 구체적인 RAR/RXR 활성 제제(들)에 따라 이펙터 세포의 수 또는 효능의 증가, 및/또는 Treg 세포의 억제를 수반할 수 있다. 이 효과들은 RAR/RXR 활성 제제(들)을 CAR-변형된 면역 세포의 제조 배양물에 포함시킴으로써 수득될 수 있거나, CAR-변형된 면역 세포의 투여와 함께 및/또는 이러한 면역 세포의 투여 후에 RAR/RXR 활성 제제(들)을 환자에게 투여함으로써 수득될 수 있다. 일부 방식들에서, RAR/RXR 활성 제제(들)은 1) 종양에서 Treg 세포의 존재 또는 활성을 감소시켜 종양 환경을 변형시킴으로써, 종양이 면역학적 공격에 더 민감하게 만들고/만들거나, 2) CAR-변형된 면역 세포에 작용하여 그의 효과를 촉진하는 전구염증성 반응을 생성함으로써 CAR-변형된 면역 세포와 함께 작용한다. 이 효과들은 일반적으로 환자에게 투여되는 RAR/RXR 활성 제제(들)에 의해 좌우된다. 추가로, RAR/RXR 활성 제제(들)에 의해 촉진된 환자의 일반적 항종양 면역 반응은 이 치료들의 전체 효과를 더 증가시킬 수 있다.
레티노산(RA)은 더 높은 약리학적 농도에서 억제 CD4+ 조절 T 세포(Treg 세포)의 수준을 증가시킴으로써 소염 효과를 야기한다. RA는 Treg 세포 분화의 마스터 조절제인 전사 인자 FoxP3의 발현을 향상시킴으로써 이 기능에 영향을 미친다. RA는 전구염증성 Th17 세포의 수준도 감소시킨다. RA는 레티노산 수용체의 RARα 서브타입을 활성화시킴으로써 이 효과들을 이끌어낸다. RA 또는 RARα 선택적 작용제의 상기 기능은 이 화합물들이 면역요법에 대한 종양의 내성에 기여하게 만든다. 증가된 수준의 억제 Treg 세포는 면역요법에 의해 생성된 T 세포의 항종양 활성을 방해한다. RARα 작용제가 Th17 세포의 수준을 감소시키기 때문에, 종양을 공격하는 T 세포의 보체도 RARα 작용제에 의해 감소된다. 대조적으로, RARα 길항제가 억제 Treg 세포의 수준을 감소시키고 이펙터 Th17 세포의 수준을 증가시키기 때문에, RARα의 길항제는 종양을 면역요법에 감작시킨다. 따라서, 본원에 개시된 한 실시양태에서, 표적 암은 RARα 길항제와 조합된 CAR-변형된 면역 세포의 조합으로 치료된다.
RA 기능의 또 다른 양태에서, RA의 생리학적 농도는 T 세포 매개 면역 반응의 발생에 매우 중요한 것으로 밝혀졌다. T 세포에게 신호를 전달하는 RA는 CD4+ T 세포 이펙터 기능의 결정적인 초기 매개자이다. 우성 음성 RARα(dnRARα), RAR 기능을 없애는 변형된 RARα, 또는 RAR 길항제를 발현하는 T 세포를 사용하여, RARα를 통한 RA 신호전달이 T 세포 매개 기능, 예컨대, 피부 이식편 거부를 위해 요구된다는 것을 확인하였다. 따라서, 암 면역요법과 관련하여, CAR-변형된 면역 세포와 조합된 RARα 길항제 또는 RARα 역 작용제의 사용은 중화 효과를 가진다: 이러한 사용은 억제 Treg 세포의 수준을 감소시킴으로써 항종양 효과를 촉진할 수 있으나, 이러한 길항제는 CD4+ T 세포 이펙터 기능을 차단함으로써 항종양 효과도 감소시킬 수도 있다. 이와 관련하여, 암 면역요법과 조합된 RARα 길항제의 사용은 제한된 가치를 가질 수 있고 심지어 해로울 수 있다.
본원에 개시된 또 다른 실시양태에서, 항암 면역 반응을 위해 매우 중요한 RA 신호전달은 RARγ에 의해 매개된다. 상기 시나리오에서, 암 면역요법과 함께 RARα 길항제의 단독 사용은 억제 Treg 세포의 감소 및 결과적으로 면역요법의 항종양 효과의 제한된 향상만을 야기할 것이다. 그러나, 그 접근법은 CD4+ T 세포 이펙터 기능의 촉진 및 공투여된 암 면역요법의 항종양 효과의 잠재적 실질적인 향상에 대한 RARγ를 통해 작용하는 RA 또는 다른 RAR 작용제의 초기 효과를 이용하지 않는다. 따라서, RARγ를 통해 특이적으로 작용하는 RAR 작용제는 Treg 세포를 증가시키지 않으면서 CD4+ T 세포 이펙터 기능을 촉진할 것이고, 이러한 RARγ 선택적 작용제는 암 면역요법의 항종양 효과를 실질적으로 향상시킬 것이다. 또 다른 실시양태에서, 암 면역요법은 RARα 길항제와 RARγ 작용제의 조합과 함께 종양을 치료하는 데 사용된다. 이 상황에서, 레티노이드 화합물은 하기 기작으로 면역요법의 항종양 활성을 향상시킬 것이다: RARγ 작용제는 강력한 CD4+ T 세포 매개 면역 반응의 발생을 용이하게 할 것이고; RARα 길항제는 억제 Treg 세포의 수준을 감소시킬 것이고 Th17 세포의 수준을 유지함으로써, 면역요법의 항종양 효과의 조절을 최소화할 것이다. RARα 길항제가 (비선택적) RAR 작용제의 RARα 작용제 활성을 차단할 것이기 때문에, RARα 길항제 및 (비선택적) RAR 작용제 사용의 효과는 RARα 길항제 및 RARγ 작용제 사용의 효과와 유사할 것이라는 것을 이해해야 한다.
RXR 작용제는 억제 Treg 세포의 형성을 촉진하고 이펙터 Th17 세포의 형성을 억제한다. 따라서, 다른 실시양태에서, CAR-변형된 면역 세포와 조합된 RXR 길항제(또는 역 작용제)의 사용은 억제 Treg 세포의 형성을 감소시키고 Th17 이펙터 세포의 수준을 증가시킴으로써 항종양 활성을 향상시킬 것이다.
요약하건대, 하기 부류의 화합물들은 암 면역요법의 항종양 활성을 증가시키기 위한 조합에 유용할 것이다: RARα 길항제, RARγ 작용제 및 RXR 길항제. 본원에 개시된 방법에서, CAR-변형된 면역 세포는 일부 암을 치료하기 위해 다른 물질과 함께 또는 다른 물질 없이 하나 이상의 RAR/RXR 활성 제제(예를 들면, RARα 길항제, RARγ 작용제, RXR 길항제)과 조합되어 투여된다. RARα 길항작용 및 RARγ 효현작용(agonism)의 성질은 동일한 분자에 함께 존재할 수 있다. 따라서, 길항제로서 RARα에 작용하는 동일한 분자는 Treg 세포 형성을 감소시킬 수 있고, 동시에 작용제로서 RARγ에 작용하여, Treg 세포 형성을 더 감소시킬 수 있고 CD4+ T 세포 이펙터 기능을 촉진할 수 있다. 동일한 방식으로, RXR 길항작용의 성질은 상이한 분자에서 RARα 길항작용 또는 RARγ 효현작용의 성질과 별도로 조합될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "레티노이드 활성 제제"는 RAR에 작용하는 임의의 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 레티노이드 활성 제제의 비-한정적 예는 RARα 길항제 및 RARγ 작용제이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렉시노이드 활성 제제"는 RXR에 작용하는 임의의 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 렉시노이드 활성 제제의 비-한정적 예는 RXR 길항제이다.
대부분은 아니지만 많은 악성종양들은 종양을 자가재생하고 지속시키는 능력만을 유지하는 세포의 희귀 집단으로부터 비롯된다. 이 암 줄기 세포는 질환을 특징짓는 분화된 암 세포들의 대부분과 종종 생물학적으로 상이하다. 예를 들면, 만성 골수성 백혈병(CML)은 조혈 줄기 세포의 수준에서 발생하고, CML 줄기 세포는 그의 정상 대응물처럼 질서정연한 분화를 겪는다. 따라서, CML에서 백혈병 덩어리의 대부분은 분화된 혈액 세포로 구성되는 반면, 질환 유지의 원인인 희귀 세포는 정상 조혈 줄기 세포와 유사하다. 유사하게, 신생물성 형질 세포를 특징으로 하는 다발성 골수종(MM)에서, 이 세포는 그의 정상 대응물처럼 말기 분화되는 것으로 보인다. 종양의 대부분을 형성하는 골수종 형질 세포는 배중심 후 B 세포와 유사한 덜 분화된 암 줄기 세포의 집단으로부터 비롯된다. 혈액 악성종양, 골수이형성 증후군, 유방암, 전립선암, 췌장암, 결장암, 난소암, 흑색종, 비-흑색종 피부암 및 뇌암을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 암들은 상응하는 암 줄기 세포로부터 비롯되는 것으로 입증되었다.
따라서, 본원은 CAR-변형된 면역 세포를 사용한 요법에 민감한 성숙 암 세포로의 암 줄기 세포의 분화를 유도함으로써, 보호된 골수 적소 또는 종양 내에서 암 줄기 세포를 표적화할 수 있는 물질로 암을 치료하는 방법을 개시한다. 종래 연구는 골수 간질 세포가 골수 내의 다발성 골수종 및 급성 골수성 백혈병 세포에서 미성숙 약물 내성 표현형을 유도한다는 것을 입증하였다. 골수 간질은 정상 세포 및 악성 세포의 분화를 방해하는 CYP26을 통해 레티노산-낮은(RA-낮은) 환경을 생성한다. 레티노이드 신호전달이 PC 분화 및 Ig 생성을 촉진하기 때문에, RA 신호전달의 조절은 골수 미세환경에서 약물 내성을 극복하기 위한 매력적인 치료 전략이다. (RARα 작용제가 CYP26에 의해 불활성화되지 않기 때문에) 골수 적소에서 암 줄기 세포에 작용할 수 있고 상기 세포의 분화를 야기할(야기함으로써, 상기 세포가 CAR-변형된 면역 세포에 의한 사멸에 민감성을 갖게 만들) 수 있는 RARα 작용제의 투여는 하나의 이러한 접근법이다. 일부 실시양태들에서, 본원에 개시된 RARα 작용제를 사용한 요법의 효능은 보호된 환경에서 암 줄기 세포의 수의 실질적인 감소를 유발한다.
일부 실시양태들에서, 본원은 하나 이상의 RARα 작용제와 CAR-변형된 면역 세포의 조합으로 암을 치료하는 방법을 개시한다. 본원은 하나 이상의 RARα 작용제와 하나 이상의 면역 체크포인트 표적화된 암 치료제의 조합으로 암을 치료하는 방법도 개시한다. 본원은 하나 이상의 RARα 작용제 및 하나 이상의 면역 체크포인트 표적화된 암 치료제 및 CAR-변형된 면역 세포를 포함하는, 암을 치료하는 방법도 개시한다. 이 실시양태들은 면역조절 RAR/RXR 활성 제제들 중 어느 하나, 또는 면역조절 RAR/RXR 활성 제제들의 조합을 투여하는 단계도 포함할 수 있다.
일 부류로서, 그리고 많은 경우들에서 개별적으로 RAR/RXR 활성 제제는 효과 면에서 다면발현성을 나타낸다. 개시된 실시양태에서, RAR/RXR 활성 제제(예를 들면, RARα 길항제, RARγ 작용제, RXR 길항제)는 면역요법제 또는 면역요법 증강제로서 사용된다. 이것은 결정적인 효과가 종양 세포에 대한 직접적 효과보다는 오히려 면역 시스템의 세포에 대한 효과라는 점에서 간접적 작용 기작이다. 이들 또는 다른 RAR/RXR 활성 제제는 RAR/RXR 매개 기작(예를 들면, RXR 길항제) 또는 비-RAR/RXR 매개 기작을 통해 암 세포에 직접 작용함으로써 일부 암들의 치료에 유용할 수 있는 다른 효과를 가질 수 있다.
암 요법은 많은 기작들을 통해 진행할 수 있다. 일부 항암제들은 항증식제로서 분류된다. 이들은 일반적으로 세포독성을 나타내는 장기간 확립된 화학요법제뿐만 아니라 보다 최근에 개발된 표적화된 요법, 예컨대, 암 세포에서 성장 조절 경로에 작용하는 키나제 억제제, 및 암 세포의 세포 표면 항원을 인식하는 항체 기반 치료제도 포함한다. 다른 치료 방식은 영양분을 종양에게 공급하기 위한 종양 내로의 혈관의 내성장(in-growth)이 파괴되는 항신생혈관구조, 및 호르몬 의존적 종양이 호르몬 공급 또는 신호전달을 파괴함으로써 치료되는 항호르몬을 포함한다.
면역요법의 다양한 방식들을 구별하는 것도 가능하다. 예를 들면, 항체 기반 요법과 세포 기반 요법을 구별할 수 있고, 수동 요법과 능동 요법을 구별할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수동 요법은 일차 면역요법제가 환자에게 투여되는 요법을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 능동 요법은 일차 면역요법제가 투여된 물질, 예를 들면, 백신에 의해 환자에서 유도된 면역 반응의 성분인 요법을 지칭한다. 다른 면역요법제들은 면역조절제로서 분류된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 일차 활성 면역조절제는 표적 질환에 대한 직접적 치료 효과가 아니라, 오히려 치료 효과를 매개하거나 촉진하는 면역 시스템 성분의 생성 또는 활성을 증가시키거나 감소시킨다. 면역 시스템의 이러한 성분(세포 또는 항체)은 항원성 표적에 직접 작용하거나 항원성 자극에 다른 방식으로 반응하여 이러한 반응을 촉진한다(즉, 본 개시된 실시양태에서, 종양 세포, 특히 암 세포에 직접 작용하거나 보조자 기능을 제공하는 면역 시스템 성분). 따라서, CAR-변형된 면역 세포를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 실시양태에서, CAR-변형된 면역 세포는 수동 세포 면역요법제로서 간주되어야 한다. 이 실시양태들의 추가 양태에서, CAR-변형된 면역 세포는 직접적 세포독성 효과를 가진다. CAR-변형된 면역 세포 배양에 사용되든, 아니면 암 환자에게 투여되든, RAR/RXR 활성 제제의 사용을 수반하는 실시양태에서, RAR/RXR 활성 제제는 면역조절제로서 간주되어야 한다. 유사하게, 면역 체크포인트 억제제의 투여를 수반하는 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제가 항체인 경우조차도, 면역 체크포인트 억제제는 면역조절제로서 간주되어야 한다.
개시된 실시양태의 다양한 양태들은 오로지 면역요법 기작에 관한 것이다. 즉, RAR/RXR 활성 제제는 종양에 대한 면역학적 공격을 촉진하기 위해 사용되고, RAR/RXR 활성 제제가 가질 수 있는 다른 활성은 존재한다 하더라도 효과에 결정적이지 않다. 개시된 실시양태의 다른 양태는 오로지 암 세포 분화 기작에 관한 것이다. 즉, RARα 작용제, 특히 CYP26에 의해 용이하게 대사되지 않는 RARα 작용제는 암 줄기 세포의 분화를 촉진하여 CAR-변형된 면역 세포에 의한 공격에 대한 그의 민감성을 증가시키는 데 사용되고, RARα 작용제가 가질 수 있는 다른 활성은 존재한다 하더라도 효과에 결정적이지 않다. 일부 실시양태들은 다른 항암 활성을 가진 물질을 배제할 수 있다. 다른 실시양태는 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)이든, 아니면 분화 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)이든, 아니면 이들 둘 다이든, RAR/RXR 활성 제제(들)의 추가 활성을 이용할 수 있다. 유사하게, 일부 실시양태들은 RAR/RXR 활성 제제(들) 및 CAR-변형된 면역 세포만의 투여를 수반한다. 다른 실시양태는 다른 요법 및 치료제와의 조합을 허용한다. 이 실시양태들 중 일부는 다른 요법들 및 치료제들 중 어느 하나를 구체적으로 포함한다. 다른 또는 이 실시양태들은 다른 요법들 및 치료제들 중 어느 하나를 구체적으로 배제한다. 다른 요법들 또는 치료제들은 다른 면역요법, 항증식 요법, 화학요법, 세포독성제, 세포증식억제제, 표적화된 요법, 방사선 요법, 항호르몬 요법, 항신생혈관구조 요법, 항종양 항원 항체, 항암 백신, 면역 체크포인트 억제제, 및 면역 체크포인트 억제제 항체를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 일부 실시양태들은 면역 체크포인트 억제제의 사용을 구체적으로 포함하거나 배제하거나, 면역 체크포인트 억제제와의 조합을 허용하나, 다른 면역요법제 또는 다른 암 요법을 배제한다.
본원에서 사용된 용어 "작용제"는 수용체에 결합하고 이를 활성화시켜, 유전자 전사 및 후속 약리학적 반응(예를 들면, 수축, 이완, 분비, 효소 활성화 등)을 생성하는 화합물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RARγ 작용제"는 또 다른 분자, 예컨대, 상이한 RAR와의 결합에 비해 더 높은 친화성으로 RARγ에 결합하는 화합물을 지칭한다. 예시적 실시양태에서, RARγ 작용제는 RARα 및/또는 RARβ에 비해 RARγ에 대해 선택적이다. 따라서, RAR 선택적 작용제는 높은 결합 친화성으로 특정 RAR 수용체 표적에 결합하는 경향을 가진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작용제"는 선택적 작용제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "길항제"는 수용체를 활성화시키지 않으면서 작용제와 동일한 부위에서 결합함으로써 작용제의 효과를 약화시키는 화합물을 지칭한다. 길항제 그 자체는 점유되지 않은 수용체의 유전자 전사 활성에 영향을 미치지 않을 것이다. 통상적으로, RARα 길항제는 RARα 작용제의 활성을 억제하는 화학 물질이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RXR 길항제"는 RXR에 결합하고 이를 활성화시키지 않는 대신에 RXR 작용제에 의해 생성된 전사를 길항하는 화합물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "길항제"는 선택적 길항제를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "역 작용제"는 작용제의 효과와 반대되는 효과를 생성하지만 동일한 수용체에 작용하는 화합물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 역 작용제 그 자체는 점유되지 않은 수용체의 기초 유전자 전사 활성을 감소시킬 것이다.
RARα 길항제
일부 실시양태들에서, RARα 선택적 길항제는 하기 화학식 (I)로 표시된 화합물이다:
Figure pct00014
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 C(CH3)2, O, S 또는 NR7이고, 여기서 R7은 H 또는 C1-6 알킬이고; X1은 H 또는 할로겐, 예컨대, F, Cl 또는 Br이고; R8은 H 또는 OH이다. R 기의 각각의 조합 및 이들의 독립적으로 선택된 치환기의 각각의 조합은 상이한 개별 실시양태를 정의한다.
화학식 (I)의 예시적 RARα 선택적 길항제는 화합물 AGN194301이다:
Figure pct00015
화학식 (I)의 일반적 부류의 다른 예시적 RARα 길항제는 AGN193491, AGN193618, AGN194202, AGN193625 및 AGN194574를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
Figure pct00016
다른 실시양태에서, RARα 선택적 길항제는 하기 화학식 (II)로 표시된 화합물의 부류의 구성원이다:
Figure pct00017
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 C1-6 알킬이고; X는 O, S 또는 CH2이고; Y는 O, S, CH2 또는 NR3이고, 여기서 R3은 C1-6 알킬이고; Z는 Cl 또는 Br이고; W는 H 또는 OH이고; U는 독립적으로 H 또는 F이다. R 기의 각각의 조합 및 이들의 독립적으로 선택된 치환기의 각각의 조합은 상이한 개별 실시양태를 정의한다.
본원에 개시된 방법에 사용할 화학식 (II)로 표시된 부류의 예시적 RARα 선택적 길항제는 하기 구조(VTP196696)로 표시된다:
Figure pct00018
다른 실시양태에서, RARα 선택적 길항제는 하기 화학식 (III)의 화합물이다:
Figure pct00019
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 O, S, N 또는 CH2이고; W는 H 또는 OH이고; Z는 Cl 또는 Br이다. R 기의 각각의 조합 및 이들의 독립적으로 선택된 치환기의 각각의 조합은 상이한 개별 실시양태를 정의한다.
화학식 (III)의 예시적 화합물은 AGN194777이다.
Figure pct00020
다른 예시적 RARα 길항제는 BMS185411, BMS614, Ro41-5253 및 Ro46-5471을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
추가 RAR 길항제 또는 역 작용제는 미국 특허 제6,037,488호, 제5,612,356호, 제5,776,699호, 제5,958,954호, 제5,877,207호, 제6,225,494호, 제6,455,701호, 제5,723,666호, 제5,739,338호 및 제5,919,970호, 및 미국 특허출원 제2009/0176862호에 기재되어 있고, 이들 모두는 이들이 개시하는 RAR 길항제의 모든 내용에 대해 본원에 참고로 도입된다.
RARγ 작용제
하기 화합물들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 예시적 RARγ 작용제는 미국 특허 제5,234,926호, 제4,326,055호, 제5,324,840호, 제5,824,685호 및 제6,452,032호에 개시되어 있다:
Figure pct00021
또 다른 예시적 RARγ 작용제는 AGN 190168이다.
Figure pct00022
화합물, 예컨대, AGN190183, AGN190205, AGN190168(타자로텐)이 RARγ 작용제일지라도, 이들은 RARα 및/또는 RARβ도 활성화시키기 때문에 RARγ 선택적이지 않다. RARα의 활성화가 Treg 세포의 생성을 증가시킴으로써 RARγ 활성화에 의해 생성된 T 이펙터 세포 활성화 효과를 무효화시킬 수 있기 때문에 RARγ 선택적 작용제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 한편, RARγ 선택적 작용제는 암 면역요법제의 항종양 효과를 증강시킬 것이다.
고도 선택적 RARγ 작용제의 일례는 화합물 AGN204647(IRX4647)이다:
Figure pct00023
다른 RARγ 선택적 작용제는 하기 화학식 (IV)의 화합물의 패밀리의 구성원이다:
Figure pct00024
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; X는 O, S, CH2, C(R4)2 또는 NR5이고, 여기서 R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이다. R 기의 각각의 조합 및 이들의 독립적으로 선택된 치환기의 각각의 조합은 상이한 개별 실시양태를 정의한다.
추가 RARγ 선택적 작용제는 CD437, CD2325, CD666 및 BMS961을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 RARγ 작용제는 RARγ 작용제에 대해 개시하는 모든 내용에 대해 본원에 참고로 도입된 국제 특허출원 공보 제WO 02/28810A2호에 기재되어 있다.
RXR 길항제
예시적 RXR 길항제는 AGN195393, LGN100849, HX531, LG100754, PA451, PA452 및 UVI 3003을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
Figure pct00025
Figure pct00026
RARα 작용제
레티노이드 활성을 가진 화합물(비타민 A 및 이의 유도체)은 세포 증식 및 분화 과정에서 활성을 가진다. 레티노이드의 많은 생물학적 효과들은 핵 레티노산 수용체(RAR)를 조절함으로써 매개된다. RAR은 (RXR로서 공지되어 있는) 레티노이드 X 수용체들 중 하나를 가진 이종이량체의 형태로, RAR 반응 요소(RARE)로서 공지되어 있는 DNA 서열 요소에 결합함으로써 전사를 활성화시킨다. 인간 RAR의 3가지 서브타입들이 확인되어 있고 기재되어 있다: RARα, RARβ 및 RARγ.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RARα 선택적 작용제"는 RARα에 선택적으로 결합하는 화합물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, RARα 선택적 작용제를 언급할 때 용어 "선택적으로 결합한다"는 RARα 선택적 작용제가 RARβ 또는 RARγ와 같은 비-표적 수용체에 실질적으로 결합하지 않도록 RARα 선택적 작용제가 표시된 표적 RARα와 차별적으로 결합하는 것을 의미한다. 바람직한 실시양태는 RARα 선택적 작용제를 사용하지만, 다른 실시양태는 반드시 RARα에만 선택적이지는 않은 RARα 작용제를 사용할 수 있다. 따라서, 많은 실시양태들이 RARα 선택적 작용제를 사용하는 것으로서 기재되어 있지만, 일반적 RARα 작용제를 사용하는, 다른 방식으로 유사한 실시양태도 개시된다는 것을 이해해야 한다.
RARα 작용제와 RARα의 선택적 결합은 결합 성질, 예를 들면, 결합 친화성 및 결합 특이성을 포함한다. 결합 친화성은 RARα 작용제가 그의 RARα 결합 부위에 체류하는 시간의 길이를 지칭하고, RARα 작용제가 RARα에 결합하는 강도로서 간주될 수 있다. 결합 특이성은 RARα 작용제가 RARα와, 그의 결합 부위를 함유하지 않는 수용체, 예를 들면, RARβ 또는 RARγ를 구별하는 능력이다. 결합 특이성을 측정하는 한 방법은 그의 결합 부위를 함유하지 않는 수용체에 대한 RARα 작용제의 결합 속도에 비해 그의 RARα에 대한 RARα 작용제의 결합 속도를 비교하는 것, 예를 들면, RARβ 및/또는 RARγ에 비해 그의 RARα에 대한 RARα 작용제의 결합 속도 상수를 비교하는 것이다.
일부 실시양태들에서, RARα 작용제는 RARβ 및/또는 RARγ에 비해 RARα에 대한, 예를 들면, 적어도 5배 더 큰, 적어도 10배 더 큰, 적어도 15배 더 큰, 적어도 20배 더 큰 또는 적어도 100배 더 큰 활성의 비를 가질 것이다. RAR 범-작용제는 RARα, RARβ 및 RARγ에 대한 활성, 즉 RARα, RARβ 및 RARγ에 대한 유사한 친화성을 가질 것이다.
RARα에 선택적으로 결합하는 RARα 작용제의 결합 특이성은 이러한 RARα 작용제가 그의 결합 부위를 포함하지 않는 수용체, 예를 들면, RARβ 또는 RARγ에 배해 그의 RARα에의 결합을 통해 발휘할 수 있는 활성 비로서 특징규명될 수도 있다. 일부 실시양태들에서, RARα에 선택적으로 결합하는 RARα 작용제는 그의 결합 부위를 포함하지 않는 수용체에 비해 그의 RARα를 통해, 예를 들면, 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 64:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1 또는 적어도 40:1의 활성 비를 가진다. 일부 실시양태들에서, RARα에 선택적으로 결합하는 RARα 작용제는 RARβ 및/또는 RARγ에 비해 그의 RARα를 통해, 예를 들면, 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 64:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1 또는 적어도 40:1의 활성 비를 가진다.
일부 실시양태들에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 RARα 작용제는 CYP26에 의해 대사되지 않는 RARα 작용제이다. CYP26은 레티노산을, 세포로부터 용이하게 제거될 수도 있고 레티노산의 세포 수준을 조절할 수도 있는 불활성 또는 더 낮은 활성 제제로 대사하는 사이토크롬 P450 모노옥시게나제(monooxygenase)이다. CYP26에 의해 용이하게 대사되는 RARα 선택적 작용제는 본 방법의 범위 내에 있지 않다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CYP26 내성"은 CYP26 효소에 의해 대사되지 않거나, 분해되지 않거나 다른 방식으로 불활성화되지 않고 골수 내에서 활성을 가진 RARα 작용제를 지칭한다.
이 실시양태의 한 양태에서, RARα 작용제는 하기 화학식 (V)의 구조를 가진 화합물이다:
Figure pct00027
상기 식에서, R1은 H 또는 C1-6 알킬이고; R2 및 R3은 독립적으로 H 또는 F이고; R4는 할로겐이다.
화학식 I의 일부 실시양태들에서, 할로겐은 F, Cl, Br 또는 I이다. 화학식 I의 일부 실시양태들에서, 할로겐은 F이다. 화학식 I의 일부 실시양태들에서, 할로겐은 Cl이다. 화학식 I의 일부 실시양태들에서, 할로겐은 Br이다. 화학식 I의 일부 실시양태들에서, 할로겐은 I이다.
이 실시양태의 한 양태에서, RARα 작용제는 하기 화학식 (VI)의 구조를 가진 화합물이다:
Figure pct00028
상기 식에서, R1은 H 또는 C1-6 알킬이다.
이 실시양태의 또 다른 양태에서, RARα 작용제는 하기 화학식 (VII)의 구조를 가진 화합물이다:
Figure pct00029
또 다른 실시양태에서, RARα 작용제는 타미바로텐(AM80; 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카바모일]벤조산)이다. 또 다른 실시양태에서, RARα 작용제는 AM580(4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카복스아미도]벤조산)이다. 또 다른 실시양태에서, RARα 작용제는 Re 80(4-[1-하이드록시-3-옥소-3-(5,6,7,8-테트라하이드로-3-하이드록시-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산)이다.
본원에 개시된 화합물로서 유용한 다른 RARα 작용제는 전체로서 각각 참고로 도입된 미국 특허 제5,856,490호, 제5,965,606호 및 제6,387,950호에 기재되어 있다. 이 참고문헌들은 상기 화합물이 실제로 RARα 작용제임을 보여주기 위해 데이터도 제시한다. 화합물을 시험할 수 있고 RARα 작용제로서 확립할 수 있는 어세이는 당분야에서 공지되어 있고 다수의 종래기술 공개문헌들 및 특허들에 기재되어 있다. 예를 들면, RARα, RARβ, RARγ 및 RXRα 수용체 서브타입들에서 작용제 유사 활성에 대해 시험하는 키메라 수용체 트랜스활성화 어세이는 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,455,265호에 상세히 기재되어 있다.
본 명세서의 양태는 부분적으로 RARα 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다. RARα 작용제는 본원에 개시된 화합물들을 포함한다.
CAR-변형된 면역 세포
종양 세포는 주조직적합성 복합체(MHC) 발현을 종종 하향조절하고, 나아가 이들이 MHC 대립유전자를 발현할 때, 면역우성 에피토프는 종종 공지되어 있지 않다. 따라서, MHC 의존적 암 면역요법은 종종 효과적이지 않다. 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 면역 세포는 MHC 독립적 방식으로 암 세포의 표적 항원과 반응한다. CAR은 항원 결합 도메인을 통해 표적 세포에 결합할 수 있게 하고, 여기서 CAR-변형된 세포는 표적 세포에 결합하여 종양 표적에 대한 변형된 세포의 활성화, 증식 및 세포독성을 유도함으로써 MHC 비-제한된 방식으로 표적 세포를 사멸시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 세포"는 CAR에 의해 결합될 수 있는 표면 항원을 발현하는 세포를 지칭한다. 항원은 "표적 항원"으로서도 지칭될 수 있다. 표적 항원은 CAR이 비-암 세포에 비해 암 세포를 우선적으로 표적화하도록 암 세포에서 구별가능하게 발현되는 항원이다.
일단 변형된 면역 세포가 표적 항원에 결합하면, 내부 자극 도메인은 면역 세포가 전체적으로 활성을 갖게 되는 데 필요한 신호를 제공한다. 이 전체적 활성 상태에서, 면역 세포는 더 효과적으로 증식할 수 있고 암 세포를 공격할 수 있다.
CAR-변형된 세포는 다양한 유형의 항원, 즉 종양 세포 표면에서 전형적으로 발현되는 단백질뿐만 아니라 탄수화물 및 당지질 구조물도 인식할 수 있다. T 세포 수용체(TCR) 인식과 달리, 항원은 MHC에 의해 프로세싱되고 제시될 필요가 없으므로, 동일한 CAR 분자는 HLA 유형과 관계없이 동일한 종양 항원을 발현하는 모든 환자들에 사용될 수 있다.
CAR은 적어도 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 세포내 자극 도메인(세포질 신호전달 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인으로서도 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드 구축물을 포함한다. 항원 결합 도메인은 변형된 면역 세포가 표적 조직에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 막횡단 도메인은 CAR을 면역 세포에 고착시키고, 세포내 자극 도메인은 형질도입된 세포에서 지속, 수송 및 이펙터 기능을 유도한다.
CAR의 항원 결합 도메인은 종종 단일클론 항체로부터 유래하나, 다른 리간드(예를 들면, 히레굴린(heregulin), 사이토카인) 및 수용체(예를 들면, NKp30)도 사용될 수 있다. 항원 결합 도메인은 항원 결합 기능을 보유하는 항체의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들면, CAR 항원 결합 도메인은 종종 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들로부터 형성된 단일 쇄 가변 단편(scFv)에 의해 제공된다.
한 양태에서, 막횡단 도메인은 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타(ζ) 쇄, 예컨대, 인간 CD3 ζ 쇄의 세포내 도메인의 서열을 포함한다.
세포내 자극 도메인은 CD28, 4-1BB(CD137), CD134(OX-40), ICOS 및 CD40L 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 자극 도메인(들)은 직접적으로 또는 스페이서 서열을 통해 연결된다.
CAR 서열은 발현 벡터 내로 도입된다. 다양한 발현 벡터들이 당분야에서 공지되어 있고, 임의의 이러한 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터일 것이다. 다른 실시양태에서, 벡터는 아데노 관련 바이러스로부터 유래할 것이다.
면역 세포는 CAR로 형질전환되고, 그 후 CAR은 세포 표면에서 발현된다. 일부 실시양태들에서, 면역 세포가 CAR을 일시적으로 발현할 수 있을지라도, 전형적으로, 면역 세포는 CAR을 안정하게 발현한다. 따라서, 면역 세포는 CAR을 코딩하는 핵산, 예를 들면, mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 본 개시의 면역 세포는 포유동물 세포(예를 들면, 인간 세포)를 포함하고, 자가 세포, 동계 세포, 동종이계 세포, 및 심지어 일부 경우 이종 세포일 수 있다. 세포는 CAR을 발현하도록 조작되므로, 자연에서 발견되지 않는다. 예시적 면역 세포는 T 림프구(T 세포), 천연 킬러(NK) 세포, NKT 세포 및 대식세포(단핵구 및 수지상 세포를 포함함)를 포함한다.
그 다음, 단회 용량 또는 다회 용량을 위한 적합한 수의 세포를 수득하기 위해 CAR-변형된 면역 세포를 배양하여 집단을 증폭시킨다.
일부 실시양태들에서, 하나 이상의 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 배양 기간 동안 증폭 배양물에 첨가되고 CAR-변형된 세포에 직접적으로 영향을 미친다. 예를 들면, CAR-MIC를 배양하는 데 있어서, 증폭 배양물에 첨가된 하나 이상의 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 예를 들면, Treg 세포의 발생을 억제하는 그들의 능력 및/또는 Th17 세포의 발생을 촉진하는 그들의 능력으로 인해 선택될 것이다. 일부 실시양태들에서, 하나 이상의 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 CAR-변형된 면역 세포의 증폭 배양물에 포함되고 대상체에게 직접 투여된다.
면역 체크포인트 표적화된 암 치료제
면역 체크포인트 요법은 항종양(또는 다른 치료) 활성이 실현될 수 있도록 이 체크포인트를 통해 T 세포 발생 프로그램의 통과를 촉진하기 위해 T 세포의 분화 및 활성화에 있어서 조절 경로를 표적화한다. 면역 체크포인트 요법을 야기하는 물질은 통상적으로 면역 체크포인트 억제제로서 지칭되고, 억제되고 있는 T 세포 발생에 대한 점검인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 많은 면역 체크포인트 억제제들이 수용체-리간드 쌍(예를 들면, 항-PD-1, 항-PD-L1 및 CTLA-4)의 상호작용도 억제하지만, 다른 것들(예컨대, 항-OX40 및 항-ICOS)은 T 세포 발생에 대한 점검을 방출하거나 다른 방식으로 억제하여, 궁극적으로 이펙터 기능을 촉진하고/하거나 조절 기능을 억제하는 표적의 작용제로서 작용한다.
본원은 CAR-변형된 면역 세포와 조합된, 면역 체크포인트 억제제 분자의 항종양 효과의 증강제로서 레티노이드 및 렉시노이드 수용체 활성 분자(RAR/RXR 활성 제제)의 용도를 개시한다. 면역 체크포인트 단백질을 억제하는 분자는 PD-1, PD-1 리간드, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, B7-H3 및 B7-H4 중 하나 이상에 특이적인 항체를 포함한다.
프로그래밍된 사멸-1(PD-1)은 T 세포에 대한 체크포인트 단백질이고 정상적으로 T 세포가 신체 내의 다른 세포를 공격하지 못하도록 돕는 일종의 "오프 스위치(off switch)"로서 작용한다. 이 단백질은 일부 정상 세포들 및 암 세포들에 존재하는 단백질인 프로그래밍된 사멸 리간드-1(PD-L1)에 결합함으로써 이것을 수행한다. PD-1이 PD-L1에 결합할 때, T 세포는 표적 세포를 공격하지 않을 것이다. 일부 암 세포들은 이들이 면역 공격을 피하도록 돕는 다량의 PD-L1을 가진다. PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 단일클론 항체는 암 세포에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있고, 일부 암들을 치료하는 데 있어서 큰 가능성을 보여주었다. PD-1/PL-L1을 표적화하는 단일클론 항체의 예로는 항-PD-1 mAb 니볼루맙(nivolumab)(OPDIVO®, Bristol-Myers Squibb) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(KEYTRUDA®, Merck & Co.), BMS-936559(Bristol-Myers Squibb), 피딜리주맙(pidilizumab)(Medivation); 및 항-PD-L1 mAb 두르발루맙(durvalumab)(MEDI4736, IMFINZI™, Medimmune), 아테졸리주맙(atezolizumab)(MPDL3280A; TECENTRIQ®, Hoffman-La Roche), 아베루맙(avelumab)(BAVENCIO®, EMD Serono)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 다양하게는, 이 항체들은 악성 흑색종(MM), 신장 세포 암종(RCC), 메르켈 세포 암종, 요로상피 암종 및 비-소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 다양한 암들을 치료하는 데 있어서 유용성을 입증하였다. PD-1/PD-l1 상호작용의 비-항체 억제제, 예를 들면, 스테핀(stefin) A 기반의 작은 조작된 단백질(AFFIMER® 분자로서 지칭됨)도 개발되고 있다. PD-L1 이외에, PD-1은 PD-L2에도 결합할 수 있다. PD-1 이외에, PD-L1은 B7-1(CD80)에도 결합할 수 있다.
CTLA-4는 CD4 및 CD8 T 세포, 및 CD25+, FOXP3+ T 조절(Treg) 세포의 표면에서 발현된 면역 체크포인트 분자이다. CTLA-4는 T 세포 반응을 차단하고 종양 성장을 가능하게 하는 억제 신호를 생성한다. 항-CTLA-4 mAb, 예컨대, 이필리무맙(ipilimumab)(YERVOY®; Bristol-Myers Squibb)은 동물 모델에서 종양의 수축을 야기한다. 이필리무맙은 MM 환자에서 전체 생존을 개선하고 MM의 치료용으로 승인되어 있다. 반응은 RCC 및 NSCLC에서도 관찰되었다. 다른 예시적 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(tremelimumab)(Medimmune)을 포함한다.
CTLA-4 차단 항체 이필리무맙은 흑색종 환자의 서브세트에서만 지속가능한 반응을 제공하고, 전체 생존에 대한 그의 효과는 제한된다. 이것은 CTLA-4 차단에 대한 내성 기작의 검색, 및 흑색종 내성의 강력한 매개자로서 세포질 효소 인돌레아민 2,3-디옥시게나제(IDO)의 확인으로 이어졌다. IDO는 이펙터 T 세포를 직접 억제하고 억제 Treg 세포를 활성화시킴으로써, CTLA-4 차단의 항종양 효과를 조절한다. IDO의 억제제, 예컨대, 1-메틸-트립토판은 T 세포 의존적 항종양 효과를 갖고 CTLA-4 차단 항체와 상승작용하여 종양 성장을 제어하고 생존을 향상시킨다.
TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3)은 IFN-γ 생성 CD4+ T 헬퍼 1(Th1) 및 CD8+ T 세포독성 1(Tc1) T 세포에서 선택적으로 발현되는 분자이다. TIM-3은 Th1 및 Tc1 T 세포 반응의 지속시간 및 크기를 한정하도록 특이적으로 작용하는 면역 체크포인트 수용체이다. TIM-3에 대한 예시적 항체는 항-TIM-3 항체에 관해 함유하는 모든 내용에 대해 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제20160075783호에 개시되어 있다.
LAG-3(림프구 활성화 유전자 3; CD223)은 CTLA-4 및 PD-1과 유사한 방식으로 T 세포의 세포 증식, 활성화 및 항상성을 음성적으로 조절하고, Treg 억제 기능에 있어서 역할을 수행한다. LAG-3에 대한 예시적 항체는 GSK2831781(GlaxoSmithKline), BMS-986016(Bristol-Myers Squibb), 및 항-LAG-3 항체에 관해 함유하는 모든 내용에 대해 본원에 참고로 도입된 미국 특허출원 공보 제2011/0150892호에 개시된 항체를 포함한다.
B7 패밀리는 항원 제시 세포의 표면에서 발현되고 T 세포의 리간드와 상호작용하는 보조자극 단백질의 패밀리이다. B7-H3(CD276)은 이 패밀리 내의 분자들 중 하나이다. B7-H3에 대한 항체인 에노블리투주맙(enoblituzumab)(EMPLICITI™, Bristol-Myers Squibb)은 다발성 골수종의 치료용으로 승인되어 있다. 상기 패밀리 내의 또 다른 분자는 B7-H4(V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1)이고, 이에 대한 항체는 개발되고 있다.
다른 면역 체크포인트 억제제 표적, B 세포 및 T 세포 감쇠제(attenuator)(BTLA), 유도성 T 세포 보조자극제(ICOS), OX40(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 4) 등은 개시된 방법에서 잠재적으로 유용하다. 항-ICOS 작용제 항체인 JTX-2011(Jounce Therapeutics)처럼, MEDI0562 및 MEDI6469(Medimmune), MOXR0916(Genetech), 및 PF-04518600(Pfizer)을 포함하는 여러 항-OX40 작용제 단일클론 항체들이 초기 상 암 임상 시험중이다.
본원은 CTLA-4 억제제, PD-1 억제제, TIM-3 억제제, LAG-3 억제제, PD-1 리간드(예컨대, PDL-1), PD-1 리간드의 억제제, OX40 작용제, ICOS 작용제, B7-H3 단백질, B7-H3 단백질의 억제제, B7-H4 단백질, 및 B7-H4 단백질의 억제제를 포함하는 면역 체크포인트 표적화 면역요법제의 항암 활성을 증강시키는 방법을 개시한다. 일부 실시양태들에서, 억제제는 항체이다.
면역 체크포인트 표적화 면역요법 항체는 전체 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 용어 "항체의 단편", "항체 단편" 및 "항체의 기능성 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진, 항체의 하나 이상의 단편을 의미하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 항체 단편은 바람직하게는, 예를 들면, 하나 이상의 상보적 결정 영역(CDR), 가변 영역(또는 이의 부분), 불변 영역(또는 이의 부분) 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 단편의 예로는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VL 및 VH 도메인이 펩타이드 링커 서열에 의해 연결된 단일 쇄 Fv; 약한 환원 조건을 이용하여 F(ab')2 단편의 디설파이드 가교를 절단함으로써 생성된 Fab' 단편; 디설파이드-안정화된 Fv 단편(dsFv); 및 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 영역 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩타이드인 도메인 항체(dAb)가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이들 형태들 중 임의의 형태의 항원 결합 항체 단편이 CAR의 항원 결합 도메인을 제공할 수 있다는 것도 인식해야 한다.
대안적 실시양태에서, 항체는 면역 체크포인트 표적 분자에 유사하게 결합하는 또 다른 단백질로 대체된다. 일부 경우, 이 비-항체 분자는 면역 체크포인트 표적 분자의 리간드 또는 결합 파트너의 세포외 부분, 즉 적어도 면역 체크포인트 표적 분자에의 결합을 매개하는 데 필요한 세포외 부분을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 리간드의 이 세포외 결합 부분은 융합 단백질에서 추가 폴리펩타이드에 연결된다. 일부 실시양태들에서, 추가 폴리펩타이드는 항체의 Fc 또는 불변 영역을 포함한다.
치료 방법
본원은 CAR-변형된 면역 세포 및 하나 이상의 RAR/RXR 활성 제제를 투여함으로써 포유동물에서 암을 치료하는 방법들을 제공한다. 보다 구체적으로, 이들은 암 면역요법의 방법 및 CAR-변형된 면역 세포 면역요법을 증강시키는 방법이다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포 및 하나 이상의 RAR/RXR 활성 제제 이외에 면역 체크포인트 억제제가 투여된다. 암을 가진 대상체에서 종양 존재량을 감소시켜 무질환 생존을 증가시키는 방법도 제공된다. 다른 실시양태는 암의 치료, 암 면역요법, 및 CAR-변형된 면역 세포 매개 면역요법의 증강에 사용하기 위한, 이러한 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다른 실시양태는 암의 치료, 암 면역요법, 및 CAR-변형된 면역 세포 매개 면역요법의 증강을 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 사용된 다수의 물질들은 별도의 투여 경로에 의해, 및/또는 별도의 시간에 투여될 수 있는 별도의 조성물 또는 약물로 제공될 수 있음에도 불구하고; 이러한 다수의 조성물들 또는 약물들의 사용은 이들을 투여 받은 환자가 다수의 물질들의 조합된 상호작용 활성이라는 이익을 제공받도록 조화된다는 것을 이해해야 한다. 본원에 개시된 암 치료의 각각의 방법에 대해, 암 면역요법의 상응하는 방법이 있다. 암 치료 또는 암 면역요법의 각각의 방법에 대해, 암 치료/면역요법을 증강시키는 상응하는 방법이 있다.
다양한 실시양태들에서, 하나 이상의 RARα 작용제는 CAR-변형된 면역 세포 또는 면역 체크포인트 억제제를 제공받고 있거나 제공받도록 예정된 대상체에게 투여된다. 이 실시양태들에서, 이 분화 RARα 작용제는 CAR-변형된 면역 세포 또는 면역 체크포인트 억제제가 대상체에 존재하는 기간 전 및/또는 동안 투여된다. RARα 작용제는 CYP26 내성을 갖는 것이 바람직하다. 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 투여는 RARα 작용제의 투여와 조화되되, 일반적으로 동시에 일어나지 않는다. 분화 RAR 활성 제제(예를 들면, RARα 작용제)는 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 투여 전에 시간 간격을 두고 투여되는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 실시양태들에서, 일정 기간 동안 분화 RAR 활성 제제를 투여함으로써 환자를 RAR/RXR 활성 제제(들)로 전치료한 후, 일정 기간 동안 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 투여한 다음, CAR-MIC를 투여한다. 대안적 실시양태에서, 분화 RAR 활성 제제만을 CAR-MIC의 투여 전에 투여하고, CAR-MIC 투여 시 초기에 또는 일정 시간 후에 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 투여한다. 상기 택일적 방식들 중 어느 한 방식에 따른 실시양태에서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)은 CAR-MIC가 환자에 존재하는 동안, 즉 CAR-MIC 투여 시 또는 투여 후에 투여된다. 상기 택일적 방식들 중 어느 한 방식에 따른 실시양태에서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)은 투여 전에 CAR-MIC를 위한 배양 배지에 포함된다. 추가 실시양태에서, 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제 둘 다는 CAR-MIC가 환자에 존재하는 동안 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 분화 및 면역조절 활성 제제는 특히 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 RARα 길항제를 포함할 때 별도의 시간 간격을 두고 제공된다.
일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포 및 RAR 활성 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포 및 RARα 길항제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포 및 RARγ 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포 및 2개의 RAR 활성 제제들을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포, RARα 길항제 및 RAR 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포, RARα 길항제 및 RARγ 선택적 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, RARα 길항제는 AGN194301, AGN193491, AGN193618, AGN194202, AGN194574, VTP196696, AGN19477, BMS185411, BMS614, Ro41-5253 또는 Ro46-5471이다. 일부 실시양태들에서, RAR 작용제는 AGN190183, AGN190205, AFN204647 또는 타자로텐이다. 일부 실시양태들에서, RARγ 선택적 작용제는 CD437, CD2325, CD666 또는 BMS961이다.
일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포 및 RXR 활성 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 CAR-변형된 면역 세포 및 RXR 길항제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, RXR 길항제는 AGN195393 또는 LGN100849이다. 본원에 기재된 치료 실시양태의 다양한 용도 또는 방법에 있어서 다수의 RAR/RXR 활성 제제들의 용도와 관련하여, 임의의 개시된 화학식 속, 이의 아속 및 개별 종은 임의의 다른 화학식 속, 이의 아속 및 개별 종과 조합될 수 있고, 각각의 이러한 조합은 개별 실시양태를 정의한다.
일부 실시양태들에서, 방법은 하나 이상의 RARα 작용제 및 CAR-변형된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 방법은 하나 이상의 RARα 작용제 및 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 RARα 작용제, CAR-변형된 면역 세포, 하나 이상의 RARα 작용제 및 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, RARα 작용제는 IRX5183(AGN195183)이다. 본원에 기재된 치료 실시양태의 다양한 용도 또는 방법에 있어서 다수의 RARα 작용제들의 용도와 관련하여, 임의의 개시된 화학식 속, 이의 아속 및 개별 종은 임의의 다른 화학식 속, 이의 아속 및 개별 종과 조합될 수 있고, 각각의 이러한 조합은 개별 실시양태를 정의한다.
본원에 개시된 화합물, 약학 조성물 및 방법은 암의 치료에 특히 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 제어되지 않거나 이상조절된 세포 증식, 감소된 세포 분화, 주변 조직을 침습하는 부적절한 능력, 및/또는 이소성 부위에서 새로운 성장을 확립하는 능력을 특징으로 하는 세포 장애를 지칭한다. 용어 "암"은 고형 종양 및 혈액 종양을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 용어 "암"은 피부, 조직, 장기, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 질환을 포괄한다. 용어 "암"은 원발성 암 및 전이성 암도 포괄한다. 암 줄기 세포는 용어 "암 세포" 내에 포함된다.
개시된 방법은 당분야에서 공지되어 있는 임의의 유형의 암, 예컨대, 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 타액선암, 전립선암, 췌장암, 혈액암 또는 메르켈 세포 암종을 치료하는 데 이용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 혈액암은 백혈병, 림프종, 골수이형성 증후군 또는 골수종이다. 선택된 실시양태에서, 특정 유형의 암이 치료된다. 다른 선택된 실시양태에서, 특정 유형의 암이 치료로부터 배제된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 효과는 치료 효과이다. 즉, 상기 효과는 질환, 및/또는 질환에 기인할 수 있는 불리한 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 용량에서 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 CAR-변형된 면역 세포 및 하나 이상의 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 레티노이드 활성 제제의 치료적 유효량은 CAR-변형된 면역 세포의 항암 활성을 증강시키거나 대상체에서 무질환 생존의 발생 또는 지속을 증가시키는 양이다.
추가로, 하나 이상의 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 더 낮은 용량의 CAR-변형된 면역 세포가 동일한 효능으로 투여될 수 있게 하거나 더 높은 용량의 CAR-변형된 면역 세포가 동일한 안전성 정도로 투여될 수 있게 함으로써 CAR-변형된 면역 세포와 관련된 독성을 감소시킬 수 있다.
다양한 기작들로 암 줄기 세포의 수를 셈으로써, CYP26 내성 RARα 작용제 투여의 결과로서 이 세포의 수의 감소를 측정할 수 있다. 본원에 개시된 실시양태에서, RARα 작용제의 투여의 결과로서, 골수 내의 암 줄기 세포는 약 0.5 로그 초과, 약 1 로그 초과, 약 1.5 로그 초과, 약 2.0 로그 초과, 약 2.5 로그 초과, 약 3.0 로그 초과, 약 3.5 로그 초과, 약 4.0 로그 초과, 약 4.5 로그 초과 또는 약 5.0 로그 초과의 수준으로 감소된다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 넓게는 인간 또는 다른 동물에서의 질환의 진단, 경감 또는 예방을 비롯한 임의의 종류의 치료 활동, 또는 인간 또는 다른 동물의 신체의 구조 또는 임의의 기능에 다른 방식으로 영향을 미치는 임의의 활동을 포함한다. 치료 활동은 건강관리 전문가, 환자 그 자신 또는 임의의 다른 인간이 특히 본원에 개시된 다양한 치료 방법들에 따라 본원에 기재된 약물, 제형 및 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 치료 활동은 다른 건강관리 전문가 또는 환자 그 자신을 포함하는 임의의 다른 인간에 의해 실천되는, 건강관리 전문가, 예컨대, 의사, 의사 보조자, 간호사 등의 명령, 지시 및 권고를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 치료 활동은, 보험 회사 또는 약국 이익 관리 회사 등에 의해 수행될 바와 같이, 약물에 대한 보험 적용범위를 승인하거나, 대안적 약물에 대한 적용범위를 부정하거나, 약물을 약물 처방전에 포함시키거나, 대안적 약물을 약물 처방전으로부터 배제하거나, 약물 사용에 대한 재정적 혜택을 제공함으로써, 상태의 치료를 위해 특정 약물 또는 이의 조합을 선택할 것을 권장하거나, 유도하거나 명령하는 것(그리고, 실제로 상기 약물을 사용하는 것)도 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 치료 활동은 병원, 진료실, 건강 유지 조직, 의학적 관행 또는 의사 집단 등에 의해 확립될 정책 또는 관행 표준에 따라 상태의 치료를 위해 특정 약물을 선택할 것을 권장하거나, 유도하거나 명령하는 것(그리고, 실제로 상기 약물을 사용하는 것)도 포함할 수 있다.
CAR-변형된 면역 세포의 전형적인 용량은 예를 들면, 용량당 1x106개 내지 3x1010개 세포의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 적어도 1x106개 세포/용량, 적어도 3x106개 세포/용량, 적어도 1x107개 세포/용량, 적어도 3x107개 세포/용량, 적어도 1x108개 세포/용량, 적어도 3x108개 세포/용량, 적어도 1x109개 세포/용량, 적어도 3x109개 세포/용량, 적어도 1x1010개 세포/용량, 적어도 3x1010개 세포/용량, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포의 전형적인 용량은 예를 들면, 환자 체중 킬로그램당 1x105개 내지 1x108개 세포의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 적어도 1x105개 세포/kg, 적어도 3x105개 세포/kg, 적어도 6x105개 세포/kg, 적어도 1x106개 세포/kg, 적어도 3x106개 세포/kg, 적어도 6x106개 세포/kg, 적어도 1x107개 세포/kg, 적어도 3x107개 세포/kg, 또는 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내의 용량으로 투여된다.
치료 또는 예방 효능은 치료된 환자의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 수일 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해, 상태에 따라, 치료는 질환 또는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 반복될 수 있다. 그러나, 다른 용법이 유용할 수 있고 본 개시의 범위 내에 있다. 원하는 용량은 CAR-변형된 면역 세포의 단회 볼루스 투여, 다회 볼루스 투여 또는 연속적 주입 투여에 의해 전달될 수 있다. 다양한 실시양태들에서, 연속적 주입은 반시간, 한 시간, 수시간, 하루 또는 수일 동안 연장될 수 있다. 치료는 단회 또는 다회 주입을 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 추가 물질의 다른 전치료 또는 동시적 투여와 함께 투여된다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포를 제공받을 대상체는 사이클로포스프아미드 및/또는 플루다라빈을 사용한 치료와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 비-골수제거성 림프구 고갈법으로 전치료된다. 일부 실시양태들에서, CAR-변형된 면역 세포는 인터류킨-2와 함께 투여된다.
CAR-변형된 면역 세포는 대상체에게 단회 또는 다회 투여될 수 있다. 세포는 매주, 격주, 매월 또는 격월로 투여될 수 있거나, 암 진행의 입증 시 투여될 수 있다.
암의 유형, 치료되는 환자 및 투여 경로에 따라, 개시된 RARα 선택적 작용제, RARα 길항제, RARγ 작용제 및 RXR 길항제는 이를 필요로 하는 환자에게 다양한 치료 유효 용량으로 투여될 수 있다.
그러나, 본 방법과 관련하여, 포유동물, 특히 인간에게 투여되는 용량은 적당한 기간에 걸쳐 포유동물에서 치료 반응을 달성하기에 충분해야 한다. 당분야에서 숙련된 자는 정확한 용량 및 조성, 및 가장 적절한 전달법의 선택도 특히 제제의 약리학적 성질, 치료되는 상태의 성질 및 중증도, 및 수용자의 신체적 상태 및 정신적 예민함뿐만 아니라, 구체적인 화합물의 효능, 치료되는 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 반응, 및 질환의 단계/중증도에 의해 영향을 받을 것임을 인식할 것이다.
RARα 길항제의 전형적인 용량은 0.01 내지 300 mg/m2/일이나; 이 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량은 본 개시의 범위 내에 있다. 매일 용량은 약 0.5 내지 100 mg/m2/일, 1 내지 90 mg/m2/일, 또는 5 내지 80 mg/m2/일일 수 있거나; 적어도 0.02, 0.03, 0.05, 0.07, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 또는 100 mg/m2/일일 수 있거나; 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 mg/m2/일 이하일 수 있거나; 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내에 있을 수 있다.
RARγ 작용제의 전형적인 용량은 0.01 내지 300 mg/m2/일이나; 이 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량은 본 개시의 범위 내에 있다. 매일 용량은 약 0.5 내지 100 mg/m2/일, 1 내지 90 mg/m2/일, 또는 5 내지 80 mg/m2/일일 수 있거나; 적어도 0.02, 0.03, 0.05, 0.07, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 또는 100 mg/m2/일일 수 있거나; 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 mg/m2/일 이하일 수 있거나; 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내에 있을 수 있다.
RXR 길항제의 전형적인 용량은 0.01 내지 300 mg/m2/일이나; 이 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량은 본 개시의 범위 내에 있다. 매일 용량은 약 0.5 내지 100 mg/m2/일, 1 내지 90 mg/m2/일, 또는 5 내지 80 mg/m2/일일 수 있거나; 적어도 0.02, 0.03, 0.05, 0.07, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 또는 100 mg/m2/일일 수 있거나; 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 mg/m2/일 이하일 수 있거나; 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내에 있을 수 있다.
비-한정적 예로서, 본원에 개시된 RARα 작용제를 포유동물에게 투여할 때, 치료적 유효량은 일반적으로 약 1 mg/m2/일 내지 약 100 mg/m2/일의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에 개시된 RARα 작용제의 유효량은 약 5 mg/m2/일 내지 약 90 mg/m2/일, 약 10 mg/m2/일 내지 약 80 mg/m2/일, 약 15 mg/m2/일 내지 약 70 mg/m2/일, 약 20 mg/m2/일 내지 약 65 mg/m2/일, 약 25 mg/m2/일 내지 약 60 mg/m2/일, 또는 약 30 mg/m2/일 내지 약 55 mg/m2/일일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에 개시된 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량은 적어도 10 mg/m2/일, 적어도 15 mg/m2/일, 적어도 20 mg/m2/일, 적어도 25 mg/m2/일, 적어도 30 mg/m2/일, 적어도 35 mg/m2/일, 적어도 40 mg/m2/일, 적어도 45 mg/m2/일, 적어도 50 mg/m2/일, 적어도 55 mg/m2/일, 적어도 60 mg/m2/일, 적어도 65 mg/m2/일 또는 적어도 75 mg/m2/일일 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에 개시된 RARα 작용제의 치료적 유효량은 최대 15 mg/m2/일, 최대 20 mg/m2/일, 최대 25 mg/m2/일, 최대 30 mg/m2/일, 최대 35 mg/m2/일, 최대 40 mg/m2/일, 최대 45 mg/m2/일, 최대 50 mg/m2/일, 최대 55 mg/m2/일, 최대 60 mg/m2/일, 최대 65 mg/m2/일, 최대 70 mg/m2/일, 최대 80 mg/m2/일, 최대 90 mg/m2/일 또는 최대 100 mg/m2/일일 수 있다.
인체의 평균 표면적은 일반적으로 성인 남성의 경우 1.9 m2, 성인 여성의 경우 1.6 m2, 그리고 12세 또는 13세 소아의 경우 1.33 m2인 것으로 받아들여진다. 이 값들은 앞 단락들에서 값들에 대한 매일 용량을 위한 용량 범위를 계산하는 데 사용될 수 있다. RAR/RXR 활성 제제의 총 매일 용량은 단회 용량으로서, 또는 8시간 내지 16시간, 또는 10시간 내지 14시간 간격을 두고 24시간 이내에 투여되는 2회 용량으로서 투여될 수 있다. RAR/RXR 활성 제제는 CAR-변형된 면역 세포와 함께 투여되고, 전술된 바와 같이 치료 또는 예방 효능은 치료된 환자의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 수일 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해, 상태에 따라, 치료는 질환 또는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 반복될 수 있다. 그러나, 다른 용법이 유용할 수 있고 본 개시의 범위 내에 있다. 원하는 용량은 조성물의 단회 볼루스 투여, 조성물의 다회 볼루스 투여, 또는 조성물의 연속적 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 비경구, 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 포함하는 표준 투여 기법을 이용함으로써 포유동물에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. CAR-변형된 면역 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용함으로써 포유동물에게 투여된다. 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 바람직하게는 예를 들면, 환제, 정제 또는 캡슐로서 경구 투여에 적합하다.
투여는 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 용량은 투여의 시기 및 빈도에 의해서도 결정될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 RARα 작용제는 일정 기간 동안 매일, 매주, 격주 또는 매월 제공될 수 있고, 임의적 휴약기(약물 부재 기간)가 뒤따를 수 있고, 이 약물 투여/휴약 주기는 필요에 따라 반복될 수 있다. 일부 실시양태들에서, RARα 작용제의 총 매일 용량은 단회 용량으로서, 또는 8시간 내지 16시간, 또는 10시간 내지 14시간 간격을 두고 24시간 이내에 투여되는 2회 용량으로서 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, RARα 작용제는 CAR-변형된 면역 세포의 투여 전 일정 기간, 즉 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 매일 투여된다. 일부 실시양태들에서, RARα 작용제는 자가 CAR-변형된 면역 세포의 생성을 위해 환자의 말초 혈액 림프구를 수득한 지 1일 내지 7일 이내부터 투여된다. CAR-변형된 면역 세포는 일반적으로 RARα 작용제보다 훨씬 더 긴 연장된 기간 동안 체내에 지속될 것이다. RARα 작용제 요법은 일정 기간 동안 매일 투여될 것이고 CAR-변형된 면역 세포보다 더 오래 제공될 수 있다는 것이 예상된다. 일부 실시양태들에서, RARα는 CAR-변형된 면역 세포보다 더 긴 기간, 예컨대, 총 30일, 90일, 1년, 2년 또는 5년 이상 동안 투여된다.
나아가, CAR-변형된 면역 세포는 단회 볼루스 투여로서 투여되거나, 투여당 0.5x106개 내지 20x106개 세포의 매일, 매주 또는 매월 투여에 의해 투여된다.
본원에 개시된 CAR-변형된 면역 세포 및 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 실질적으로 동일한 시간(서로 1시간 이내) 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 대상체는 CAR-변형된 면역 세포의 투여 전 적어도 30분, 적어도 1시간 또는 적어도 2시간 동안 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제로 전치료된다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 CAR-변형된 면역 세포의 투여 전 적어도 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 동안 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제로 전치료된다. 일부 실시양태들에서, 대상체는 CAR-변형된 면역 세포의 투여 전 5일 내지 10일, 예를 들면, 6일, 7일 또는 8일 동안; 또는 상기 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 임의의 범위 내의 기간 동안 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제로 전치료된다. 일부 실시양태들에서, 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 CAR-변형된 면역 세포 투여의 시작 후, 예를 들면, 동일한 날, 다음 날, 2일 후, 3일 후, 1주 후 등에 투여된다. RAR/RXR 요법은 일정 기간 동안 매일 투여될 것이고 CAR-변형된 면역 세포보다 더 오래 제공될 수 있다는 것이 예상된다. 일부 실시양태들에서, RAR 및/또는 RXR 활성 제제(들)의 투여는 환자가 지속가능한 완전한 반응(즉, CAR-변형된 면역 세포의 투여 후 적어도 6개월 동안 완전한 반응)을 나타낼 정도의 시간까지 계속된다. 다른 실시양태에서, 종양 퇴행이 진행되거나 안정한 질환이 존재하는 한, RAR 및/또는 RXR 활성 제제(들)의 투여는 계속된다.
예시적 통합된 실시양태에서, CAR-MIC의 예정된 투여 전 4주 내지 8일의 시간 간격 동안 환자를 먼저 CYP26 내성 RARα 작용제로 치료하여 면역요법의 시작 전에 종양 존재량을 감소시킨다. 그 다음, CAR-MIC의 예정된 투여 1주 전부터 환자를 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들), 예를 들면, RARα 길항제 및 RARγ 작용제로 치료한다. 그 다음, 치료는 본원에 기재된 바와 같이 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)의 계속된 투여, 또는 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)의 주기 및 가능하게는 CAR-MIC의 추가 투여로 시작된다.
본원에 개시된 CAR-변형된 면역 세포 및 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 예를 들면, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 화학요법제, 이온화 방사선, 소분자 항암제, 암 백신, 생물학적 요법(예를 들면, 다른 단일클론 항체, 암 사멸 바이러스, 유전자 요법 및 적응 T 세포 전달) 및/또는 수술을 포함하는 적어도 하나의 다른 항암제와 같은 다른 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, CAR-변형된 면역 세포 및 레티노이드 및/또는 렉시노이드 활성 제제는 투여된 유일한 치료제 또는 제공된 유일한 치료이거나; 항암 면역 반응을 촉진하는 것이 주요 유용성인 제공된 유일한 치료 또는 치료제이거나; 항암 면역 반응을 촉진하는 것이 주요 유용성인 제공된 유일한 치료 또는 치료제이다.
암 요법의 효과는 전형적으로 "반응" 면에서 측정된다. 반응을 모니터링하는 기법은 하기 시험들과 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는, 암을 진단하는 데 이용된 시험과 유사할 수 있다:
Figure pct00030
일부 림프절을 수반하는 혹 또는 종양은 촉진될 수 있고 신체검사에 의해 외부적으로 측정될 수 있다.
Figure pct00031
일부 내부 암 종양들은 x-선 또는 CT 스캔에서 보일 것이고 롤러(ruler)에 의해 측정될 수 있다.
Figure pct00032
장기 기능을 측정하는 혈액 시험을 포함하는 혈액 시험을 수행할 수 있다.
Figure pct00033
일부 암들에 대한 종양 마커 시험을 수행할 수 있다.
혈액 시험이든, 아니면 세포 카운트이든, 아니면 종양 마커 시험이든, 이용된 시험과 관계없이, 결과가 동일한 유형의 초기 시험과 비교될 수 있도록 시험을 특정 간격으로 반복한다.
암 치료에 대한 반응은 여러 방식으로 정의된다:
Figure pct00034
완전한 반응 - 모든 암 또는 종양이 사라지고; 질환의 증거가 없다. (적용가능한 경우) 종양 마커의 발현 수준이 정상 범위 내에 속할 수 있다.
Figure pct00035
부분적 반응 - 암은 일정 퍼센트까지 수축되나, 질환은 남아있다. (적용가능한 경우) 종양 마커의 수준은 떨어졌을 수 있으나(또는 종양 마커를 기준으로, 감소된 종양 존재량의 표시로서 증가되었을 수 있으나), 질환의 증거는 남아있다.
Figure pct00036
안정한 질환 - 암은 성장하지 않았고 수축하지도 않았고; 질환의 양은 변화지 않았다. (적용가능한 경우) 종양 마커는 유의미하게 변화지 않았다.
Figure pct00037
질환 진행 - 암은 성장하였고; 치료 전보다 현재 더 많은 질환이 있다. (적용가능한 경우) 종양 마커 시험은 종양 마커가 상승하였다는 것을 보여준다.
암 치료의 효능의 다른 척도는 전체 생존의 기간(즉, 진단부터 측정되거나 치료의 시작부터 평가되는, 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간), 암 부재 생존(즉, 완전한 반응 후 암이 검출될 수 없는 상태로 유지되는 시간의 길이), 및 진행 부재 생존(즉, 질환 안정화 또는 부분적 반응 후 재개된 종양 성장이 검출될 수 없는 시간의 길이)을 포함한다.
종양 크기(종양 존재량)와 관련하여 고형 암 치료 반응을 평가하는 2종의 표준 방법들인 WHO 표준 및 RECIST 표준이 있다. 이 방법들은 고형 종양을 측정하여, 현재의 종양을 과거 측정치와 비교하거나 변화를 향후 측정치와 비교하고 치료법을 바꾼다. WHO 방법에서, 고형 종양의 장축 및 단축을 측정한 후, 이 두 측정치들의 곱을 계산하고; 다수의 고형 종양들이 있는 경우, 모든 곱들의 합계를 계산한다. RECIST 방법에서, 장축만을 측정한다. 다수의 고형 종양들이 존재하는 경우, 모든 장축 측정치들의 합계를 계산한다. 그러나, 림프절의 경우, 장축 대신에 단축을 측정한다.
본 방법의 일부 실시양태들에서, 치료된 환자의 종양 존재량은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 이 값들에 의해 한정된 임의의 범위 내의 값까지 감소된다.
다른 실시양태에서, 치료된 대상체의 1년 생존율은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 이 값들에 의해 한정된 임의의 범위 내의 값까지 증가된다.
다른 실시양태에서, 치료된 대상체의 5년 생존율은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 이 값들에 의해 한정된 임의의 범위 내의 값까지 증가된다.
다른 실시양태에서, 치료된 대상체의 10년 생존율은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 또는 이 값들에 의해 한정된 임의의 범위 내의 값까지 증가된다.
다른 실시양태에서, 대상체는 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 14개월, 적어도 16개월, 적어도 18개월, 적어도 20개월, 적어도 22개월, 적어도 24개월, 적어도 27개월, 적어도 30개월, 적어도 33개월, 적어도 36개월, 적어도 42개월, 적어도 48개월, 적어도 54개월 또는 적어도 60개월 이상의 지속된 관해를 가진다.
다른 실시양태에서, 방법은 암과 관련된 상태, 증상 또는 장애를 치료하거나 완화시키는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태들에서, 이 상태 또는 증상은 빈혈, 무기력, 악액질, 쿠싱 증후군, 피로, 통풍, 잇몸병, 혈뇨, 고칼슘혈증, 갑상선기능저하증, 내부 출혈, 탈모, 중피종, 구역, 식은땀, 호중구감소증, 방종양성 증후군, 능막염, 류마티스성 다발근육통, 횡문근용해증, 스트레스, 팽윤된 림프절, 혈소판감소증, 비타민 D 결핍 또는 체중 손실을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 다른 실시양태에서, RARα 작용제 및 CAR-변형된 면역 세포 둘 다의 투여는 CAR-변형된 면역 세포 단독을 사용한 치료에 비해 치료되는 개체의 생존을 연장시킨다.
특정 실시양태의 목록
실시양태의 하기 목록은 본원에서 설명된 본 발명의 범위, 조합 및 하위조합, 부류 등에 대한 다양한 실시양태들을 예시하나, 본원을 뒷받침하는 모든 실시양태들을 배타적으로 열거하기 위한 것이 아니다.
실시양태 1. 키메라 항원 수용체-변형된 면역 세포(CAR-MIC), 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 적어도 2개의 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제(RAR/RXR 활성 제제들)을, 암 면역요법을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 면역요법의 방법.
실시양태 2. CAR-MIC, 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 적어도 2개의 RAR/RXR 활성 제제들을, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
실시양태 3. 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 적어도 2개의 RAR/RXR 활성 제제들을, CAR-MIC를 제공받고 있거나, 제공받았거나 제공받도록 예정된 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CAR-MIC 암 면역요법을 증강시키는 방법.
실시양태 4. 분화 RAR 활성 제제 및 CAR-MIC를, 암 면역요법을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 면역요법의 방법으로서, CAR-MIC를 대상체에게 투여하기 전에 적어도 하나의 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것인 방법.
실시양태 5. CAR-MIC, 및 분화 RAR 활성 제제 및 RAR/RXR 면역조절 활성 제제를 포함하는 적어도 2개의 RAR/RXR 활성 제제들을 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자의 무질환 생존을 연장시키는 방법.
실시양태 6. 조합의 결과로서, CAR-MIC가 단독으로 투여된 경우보다 더 낮은 용량의 CAR-MIC가 투여되도록 CAR-MIC와 조합된 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 적어도 2개의 RAR/RXR 활성 제제들을, CAR-MIC의 독성의 감소를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CAR-MIC의 독성을 감소시키는 방법.
실시양태 7. 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 배양 배지에서 CAR-MIC를 배양하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 CAR-MIC의 수를 증폭시키는 방법.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, CAR-MIC를 대상체에게 투여하기 전에 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 RARα 길항제, RARγ 작용제, RXR 길항제, 또는 이들의 조합인 방법.
실시양태 10. 실시양태 1 내지 6, 8 및 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 분화 RAR 활성 제제가 RARα 작용제인 방법.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, RARα 작용제가 CYP26 내성을 가진 것인 방법.
실시양태 12. 실시양태 10 또는 11에 있어서, RARα 작용제가 RARα 선택적 작용제인 방법.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 6 및 8 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역 체크포인트 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG-3, PD-L1 리간드, B7-H3, B7-H4, BTLA 중 적어도 하나의 억제제이거나, ICOS 또는 OX40 작용제인 방법.
실시양태 15. 실시양태 13 또는 14에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 항체인 방법.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 레티노산 수용체(RAR) 활성 제제를 포함하는 것인 방법.
실시양태 17. 실시양태 16에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 RAR 활성 제제인 방법.
실시양태 18. 실시양태 16 또는 17에 있어서, RAR 활성 제제가 RARα 길항제인 방법.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, RAR 활성 제제가 선택적 RARα 길항제인 방법.
실시양태 20. 실시양태 16 또는 17에 있어서, RAR 활성 제제가 RARγ 작용제인 방법.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, RAR 활성 제제가 선택적 RARγ 작용제인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 레티노이드 X 수용체(RXR) 활성 제제를 포함하는 것인 방법.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 제제가 레티노이드 X 수용체(RXR) 활성 제제인 방법.
실시양태 24. 실시양태 23에 있어서, RXR 활성 제제가 RXR 길항제인 방법.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 적어도 2개의 RAR 활성 제제들을 포함하는 것인 방법.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 제1 RAR 활성 제제가 RARα 길항제이고, 제2 RAR 활성 제제가 RARγ 선택적 작용제인 방법.
실시양태 27. 실시양태 25에 있어서, 제1 RAR 활성 제제가 RARα 선택적 길항제이고, 제2 RAR 활성 제제가 RARγ 작용제인 방법.
실시양태 28. 실시양태 25에 있어서, 제1 RAR 활성 제제가 RARα 선택적 길항제이고, 제2 RAR 활성 제제가 RARγ 선택적 작용제인 방법.
실시양태 29. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 길항제가 하기 화학식 (V)의 화합물인 방법:
Figure pct00038
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 C(CH3)2, O, S 또는 NR7이고, 여기서 R7은 H 또는 C1-6 알킬이고; X1은 H 또는 할로겐, 예컨대, F, Cl 또는 Br이고; R8은 H 또는 OH이다.
실시양태 30. 실시양태 29에 있어서, RARα 길항제가 하기 화합물인 방법:
Figure pct00039
Figure pct00040
실시양태 31. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 길항제가 하기 화학식 (II)의 화합물인 방법:
Figure pct00041
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 C1-6 알킬이고; X는 O, S 또는 CH2이고; Y는 O, S, CH2 또는 NR3이고, 여기서 R3은 C1-6 알킬이고; Z는 Cl 또는 Br이고; W는 H 또는 OH이고; U는 독립적으로 H 또는 F이다.
실시양태 32. 실시양태 31에 있어서, RARα 길항제가 하기 화합물인 방법:
Figure pct00042
실시양태 33. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 길항제가 하기 화학식 (III)의 화합물인 방법:
Figure pct00043
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 O, S, N 또는 CH2이고; W는 H 또는 OH이고; Z는 Cl 또는 Br이다.
실시양태 34. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 길항제가 BMS185411, BMS614, Ro41-5253, Ro46-5471 또는 하기 화합물인 방법:
Figure pct00044
실시양태 35. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARγ 작용제가 하기 화학식 (IV)의 RARγ 작용제인 방법:
Figure pct00045
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; X는 O, S, CH2, C(R4)2 또는 NR5이고, 여기서 R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이다.
실시양태 36. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARγ 작용제가 하기 화합물인 방법:
Figure pct00046
실시양태 37. 실시양태 9, 18, 19, 및 26 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARγ 작용제가 CD437, CD2325, CD666 및 BMS961로부터 선택된 선택적 RARγ 작용제인 방법.
실시양태 38. 실시양태 9, 22 및 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, RXR 길항제가 하기 화합물들로부터 선택된 것인 방법:
Figure pct00047
Figure pct00048
실시양태 39. 실시양태 9, 22 및 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, RXR 길항제가 AGN195393 또는 LGN100849인 방법.
실시양태 40. 실시양태 10 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 작용제가 하기 화학식 (V)의 화합물인 방법:
Figure pct00049
상기 식에서, R1은 H 또는 C1-6 알킬이고; R2 및 R3은 독립적으로 H 또는 F이고; R4는 할로겐이다.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, R4가 F, CL, BR 또는 I인 방법.
실시양태 42. 실시양태 10 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 작용제가 하기 화학식 (VI)의 화합물인 방법:
Figure pct00050
상기 식에서, R1은 H 또는 C1-6 알킬이다.
실시양태 43. 실시양태 10 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, RARα 작용제가 하기 화학식 (VII)의 화합물인 방법:
Figure pct00051
실시양태 44. 실시양태 10 또는 11에 있어서, RARα 작용제가 타미바로텐(AM80; 4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카바모일]벤조산)인 방법.
실시양태 45. 실시양태 10 또는 11에 있어서, RARα 작용제가 AM580(4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카복스아미도]벤조산)인 방법.
실시양태 46. 실시양태 10 또는 11에 있어서, RARα 작용제가 Re 80(4-[1-하이드록시-3-옥소-3-(5,6,7,8-테트라하이드로-3-하이드록시-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산)인 방법.
실시양태 47. 실시양태 1 내지 6 및 8 내지 46 중 어느 한 실시양태에 있어서, 적어도 하나의 암 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 48. 실시양태 1 내지 6 및 8 내지 47 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체 또는 환자를 CAR-MIC의 투여 전 적어도 하나의 RAR/RXR 활성 제제로 전치료하는 것인 방법.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 적어도 하나의 RAR/RXR 활성 제제가 면역조절 RAR/RXR 활성 제제인 방법.
실시양태 50. 실시양태 48에 있어서, 적어도 하나의 RAR/RXR 활성 제제가 분화 RAR 활성 제제인 방법.
실시양태 51. 실시양태 48 또는 49에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 CAR-MIC의 투여 전 적어도 12시간 동안 투여하는 것인 방법.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제를 CAR-MIC의 투여 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 동안 투여하는 것인 방법.
실시양태 53. 실시양태 50에 있어서, 분화 RAR 활성 제제를 CAR-MIC의 투여 전 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 1개월 동안 투여하는 것인 방법.
실시양태 54. 실시양태 50 또는 53에 있어서, 분화 RAR 활성 제제의 투여를 CAR-MIC의 투여 전 2일 내지 10일 동안 중단하는 것인 방법.
실시양태 55. 실시양태 54에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)의 투여를 분화 RAR 활성 제제의 투여의 중단 후 및 CAR-MIC의 투여 전에 시작하는 것인 방법.
실시양태 56. 실시양태 55에 있어서, 예정된 CAR-MIC의 투여가 시작되기 4주 전에 시작되어 8일 전에 종결하는 기간 동안 분화 RAR 활성 제제를 투여하고, 예정된 CAR-MIC의 투여가 시작되기 1주 전에 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)의 투여를 시작하는 것인 방법.
실시양태 57. 실시양태 1 내지 6 및 8 내지 56 중 어느 한 실시양태에 있어서, 대상체 또는 환자를 CAR-MIC의 투여와 동시 또는 투여 후에 면역조절 RAR/RXR 활성 제제로 치료하는 것인 방법.
실시양태 58. 실시양태 57에 있어서, (있다하더라도, 전치료와 상이한) 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 치료를 CAR-MIC의 투여 또는 제1 투여와 동일한 날에 시작하는 것인 방법.
실시양태 59. 실시양태 57에 있어서, (있다하더라도, 전치료와 상이한) 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 치료를 CAR-MIC의 투여 또는 제1 투여 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일째 날에 시작하는 것인 방법.
실시양태 60. 실시양태 57 내지 60 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 치료를 CAR-MIC의 투여 또는 제1 투여 후 적어도 6개월 동안 계속하는 것인 방법.
실시양태 61. 실시양태 57 내지 60 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 치료를 지속가능한 완전한 반응이 수득될 때까지 계속하는 것인 방법.
실시양태 62. 실시양태 57 내지 60 중 어느 한 실시양태에 있어서, 계속된 종양 퇴행이 있는 한, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 치료를 계속하는 것인 방법.
실시양태 63. 실시양태 57 내지 60 중 어느 한 실시양태에 있어서, 안정한 질환이 있거나 암이 진행하지 않는 한, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 치료를 계속하는 것인 방법.
실시양태 64. 실시양태 57 내지 63 중 어느 한 실시양태에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)의 투여를 분화 RAR 활성 제제가 투여되는 시간인 1 내지 3주 동안 중단하는 것인 방법.
실시양태 65. 실시양태 64에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)의 투여를 1회 초과의 빈도로 중단하고, 중단이 면역조절 RAR/RXR 활성 제제(들)을 사용한 연속 10일 치료 직후에 일어나지 않는 것인 방법.
실시양태 66. 실시양태 1 내지 6 및 8 내지 65 중 어느 한 실시양태에 있어서, RAR/RXR 활성 제제를 매일 투여하는 것인 방법.
실시양태 67. 실시양태 1 내지 66 중 어느 한 실시양태에 있어서, CAR-MIC가 CAR-T 세포인 방법.
실시양태 68. 실시양태 1 내지 66 중 어느 한 실시양태에 있어서, CAR-MIC가 CAR-NKT 세포인 방법.
실시양태 69. 실시양태 1 내지 66 중 어느 한 실시양태에 있어서, CAR-MIC가 CAR-NK 세포인 방법.
실시양태 70. 실시양태 1 내지 66 중 어느 한 실시양태에 있어서, CAR-MIC가 CAR-대식세포인 방법.
실시양태 71. CAR-MIC를 제공받고 있거나, 제공받았거나 제공받도록 예정된 환자에서 암 면역요법에 사용하기 위한 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제로서, CAR-MIC의 면역요법 효과가 증강되는 것인 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제.
실시양태 72. 암 면역요법에 사용하기 위한 CAR-MIC 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제.
실시양태 73. 암 환자의 무질환 생존을 연장시키는 데 사용하기 위한 CAR-MIC 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제.
실시양태 74. CAR-MIC 요법의 독성을 감소시키는 데 사용하기 위한 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제.
실시양태 75. 암의 치료에 사용하기 위한 CAR-MIC 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제.
실시양태 76. 암의 치료에 있어서 CAR-MIC의 면역요법 효과를 증강시키기 위한 약물의 제조에 있어서 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 용도.
실시양태 77. 암 면역요법을 위한 약물의 제조에 있어서 CAR-MIC 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 용도.
실시양태 78. 암 환자의 무질환 생존을 연장시키기 위한 약물의 제조에 있어서 CAR-MIC 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 용도.
실시양태 79. CAR-MIC 요법의 독성을 감소시키기 위한 약물의 제조에 있어서 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 용도.
실시양태 80. 암의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 CAR-MIC 및 분화 RAR 활성 제제 및 면역조절 RAR/RXR 활성 제제의 용도.
실시양태 8 내지 70에 의한 실시양태 1 내지 6의 변형과 유사한 방식으로 실시양태 71 내지 80을 각각 변형시킬 수 있다는 것이 자명할 것이다.
실시양태 8 내지 49에 의한 실시양태 1 내지 6의 변형과 유사한 방식으로 실시양태 50 내지 59를 각각 변형시킬 수 있다는 것이 자명할 것이다.
실시예
하기 비-한정적 실시예는 현재 고려된 대표적인 실시양태들을 더 완전히 이해할 수 있도록 예시적 목적으로만 제공된다. 이 실시예는 본 명세서에 기재된 실시양태들 중 임의의 실시양태를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
시험 화합물과 RAR 수용체의 결합 및 레포터 유전자의 활성화
레티노산 수용체 트랜스활성화 활성 및 결합 효율을 본질적으로 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,298,429호 및 제5,071,773호에 기재된 바와 같이 측정한다. 트랜스활성화 어세이는 전체 길이 수용체 RARα, RARβ 및 RARγ를 코딩하는 발현 플라스미드를 사용한다. 헤르페스 바이러스 타이미딘 키나제 프로모터 및 적절한 레티노산 수용체 반응 요소(RARE)를 함유하는 레포터 플라스미드는 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 오픈 코딩 영역의 업스트림에 위치된다.
방사성 표지가 부착된 올-트랜스-레티노산(RAR)을 클로닝된 수용체 RAR 분자에 먼저 적재한 후, 시험 화합물의 농도가 증가함에 따라 유리된 방사성의 양을 측정하는 고전적 경쟁 어세이 포맷을 이용하여 결합 어세이를 수행한다.
상기 어세이를 이용하여 상기 본원에 개시된 RARα 작용제를 확인한다.
실시예 2
화합물 IRX5183은 RARα 특이적이다.
화학식 I의 구조를 가진 화합물이 RARα 선택적 작용제인지를 확인하기 위해, 작용제 결합 친화성을 측정하기 위한 이탈 어세이 및 작용제 활성을 측정하기 위한 트랜스활성화 어세이(본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,455,265호에 기재됨)를 이용하여 RARα, RARβ 및 RARγ에 결합하는 화합물 IRX5183의 능력을 조사하였다. 이 결과는 화합물 IRX5183이 높은 친화성으로 RARα에 선택적으로 결합하고(표 1) RARα를 특이적으로 활성화시킨다는(도 1) 것을 시사한다. 이러한 RARα 선택적 작용제는 임상 연구에서 점막피부 독성, 두통 및 전구염증성 사건을 포함하는, 범-활성화와 관련된 부작용을 최소화할 수 있었다.
Figure pct00052
실시예 3
RARα 신호전달은 Foxp3 발현을 유도한다.
RAR(RARα, RARβ, RARγ) 신호전달 경로들 중 어느 경로가 Foxp3 발현의 유도에 중요한지를 확인하는 것은 중요하다. 이를 확인하기 위해, GFP- 표현형에 기반을 둔 분류 및 단리로 유세포분석을 이용하여 Foxp3-GFP 마우스로부터 미감작 CD4+ CD25- FoxP3- 세포를 정제하였다. 이 세포를 IL-2 및 TGF-β의 존재 하에서 시험관내에서 αCD3으로 다중클론적으로 활성화시켰다. RA에 의해 유도된 Foxp3 발현에 관여하는 RAR을 확인하기 위해, 배양된 세포를 RAR 선택적 작용제와 함께 항온처리하였다. 그 다음, GFP+(Foxp3+)의 빈도에 대해 점수를 배양된 세포에게 부여하였다. 선택적 작용제의 사용과 관련하여, RARα 작용제만이 α4β7 및 CCR9(장 귀소 수용체)의 발현을 향상시키면서, Foxp3의 발현에 유의미한 영향을 발휘하여 거의 100%의 Foxp3+ T 세포를 유도하였다(도 1). RARγ 작용제 및 RARβ 작용제는 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 RARα 선택적 작용제가 염증 또는 자가면역 장애의 증상을 감소시키는 데 유용할 수 있다는 것을 시사한다. 대조적으로, RARα 선택적 길항제 또는 역 작용제는 면역억제 Treg 세포의 생성을 하향조절함으로써, 면역 반응, 예컨대, 항암 면역 반응을 촉진하는 데 유용할 수 있다.
실시예 4
시험 화합물과 RAR 및 RXR 수용체의 결합 및 레포터 유전자의 활성화
레티노산 수용체 트랜스활성화 활성 및 결합 효율을 본질적으로 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,298,429호 및 제5,071,773호에 기재된 바와 같이 측정한다. 트랜스활성화 어세이는 전체 길이 수용체 RARα, RARβ, RARγ, RXRα, RXRβ 및 RARγ를 코딩하는 발현 플라스미드를 사용한다. 헤르페스 바이러스 타이미딘 키나제 프로모터 및 적절한 레티노산 수용체 반응 요소(RARE) 또는 레티노이드 X 수용체 반응 요소(RXRE)를 함유하는 레포터 플라스미드는 반딧불이 루시퍼라제를 코딩하는 오픈 코딩 영역의 업스트림에 위치된다.
방사성 표지가 부착된 올-트랜스-레티노산(RAR) 또는 방사성 표지가 부착된 9-시스 레티노산(RXR)을 클로닝된 수용체 RAR 및 RXR 분자에 먼저 적재한 후, 시험 화합물의 농도가 증가함에 따라 유리된 방사성의 양을 측정하는 고전적 경쟁 어세이 포맷을 이용하여 결합 어세이를 수행한다.
상기 어세이를 이용하여 상기 본원에 개시된 RARα 선택적 길항제, RARγ 선택적 작용제 및 RXR 선택적 길항제를 확인한다.
실시예 5
RARγ 작용제를 사용한 RARγ 신호전달의 약리학적 활성화는 B16 흑색종 세포의 거부에 있어서 항-CTLA-4 항체와 협력적 효과를 가진다.
10 nM RARγ 작용제(AGN204647(IRX4647))와 조합된 항-CTLA-4 항체 치료의 항종양 효과를, B16F10 종양 세포가 생착된 C57BL/6 마우스에서 조사하였다. 비히클로 치료된 마우스만이 비치료된 대조군 마우스에 비해 생존 이익(0%)을 보이지 않는다. 항-CTLA-4 항체만으로 치료된 마우스의 생존율은 50일째 날에 40%인 반면, RARγ 작용제만으로 치료된 마우스는 동일한 시간에 30% 생존을 가진다. 놀랍게도, 항-CTLA-4 항체 및 RARγ 작용제 둘 다로 치료된 마우스는 50일째 날에 100% 생존을 가짐으로써, 이들 두 물질들이 협력하여 B16 흑색종 세포를 제거한다는 것을 시사한다. 조합 치료를 받은 생존 마우스는 2배 용량의 생존 종양 세포를 사용한 재챌린지에 대한 내성을 나타냄으로써, B16 특이적 기억 세포의 효과적 형성을 시사한다. 중요한 것은 급성 또는 지연된 독성의 징후 없이 약물들의 이 조합에 의해 항-흑색종 효과가 수득된다는 것이다.
실시예 6
RARα 선택적 작용제는 T 세포 분화를 조절한다.
RARα 작용제가 T 세포 분화에 영향을 미칠 수 있는지를 확인하기 위해, T 세포를 RARα 작용제와 함께 항온처리하여 Foxp3 발현에 대한 그의 효과를 확인하였다. GFP- 표현형에 기반을 둔 분류 및 단리로 유세포분석을 이용하여 Foxp3-GFP 마우스로부터 미감작 CD4+ CD25- FoxP3- 세포를 정제하였다. 이 세포를 IL-2 및 TGF-β의 존재 하에서 시험관내에서 αCD3으로 다중클론적으로 활성화시켰다. 그 다음, 이 세포를 다양한 농도의 화합물 IRX5183(RARα 작용제)을 가진 배지에서 배양하였고 FoxP3-GFP의 발현을 유세포분석으로 분석하였다. RARα 작용제 화합물 IRX5183은 면역억제 Treg 세포의 분화를 향상시켰고 시험관내에서 미감작 T 세포로부터 염증성 TH17 세포의 분화를 억제하였다(표 2).
Figure pct00053
상기 발견을 확장하기 위해, T 세포 분화에 대한 RARα 작용제의 생체내 효과를 마우스 모델에서 평가하였다. 마우스를 10일 동안 이틀마다 100 ㎍의 화합물 IRX5183 또는 동등한 부피의 DMSO(비히클 대조군)로 치료하였다. 그 다음, 혈액 및 비장으로부터 림프구를 단리하였고, CD4+ T 세포에서의 FoxP3 발현을 평가하였다. 데이터는 화합물 IRX5183의 투여 후 치료된 마우스의 비장 및 혈액에서 Foxp3+ T 세포의 퍼센트의 유의미한 증가가 있었다는 것을 보여준다(표 3).
Figure pct00054
대조적으로, RARα 선택적 길항제인 AGN196996은 상기 시험관내 및 생체내 어세이에서 Th17 세포 수를 증가시키고 Treg 세포 수를 감소시킨다(데이터는 제시되어 있지 않음).
실시예 7
골수 적소는 다발성 골수종에서 보르테조밉 내성을 유도한다.
다발성 골수종(MM)은 BM 내에서의 악성 형질 세포(PC)의 증식 및 이 세포들의 단일클론 면역글로불린(Ig) 생성을 특징으로 한다. 프로테오좀 억제제를 포함하는 신규 요법은 MM을 가진 환자의 생존을 유의미하게 연장시켰으나, 치유를 달성하지 못하였다. 증가하는 증거는 BM 미세환경과의 상호작용이 화학요법 동안 MM 세포의 생존에 결정적인 역할을 한다는 것을 입증한다. 그러나, 이 BM 적소 의존적 화학보호를 매개하는 기작은 불완전하게 이해되어 있고 중요한 연구 분야로 남아있다.
일부 MM 세포들은 성숙 B 세포와 유사하고 보르테조밉(BTZ)에 대한 내성을 나타낸다. 이 CD138- MM 세포들은 그들의 정상 B 세포 대응물처럼 집락형성 성장을 할 수 있고 CD138+ PC로 분화할 수 있다. 더욱이, 이 세포들은 최소 잔류 질환(MRD) 동안 풍부해지는데, 이것은 질환 재발에 있어서 결정적인 역할을 암시한다. CD138+ MM 세포와 CD138- MM 세포의 상이한 BTZ 민감성은 이들의 분비 활성에 의해 설명될 수 있다. CD138+ PC는 그의 풍부한 Ig 생성의 결과로서, 부적절하게 폴딩된 단백질을 분해하기 위해 온전한 프로테아좀 경로에 크게 의존한다. 프로테아좀에 의한 단백질 분해를 파괴하는 조건은 단백질 합성을 감소시키고 단백질 분해를 촉진함으로써 ER 스트레스를 상쇄시키는 언폴딩된 단백질 반응(UPR)으로서 공지된 세포 스트레스 경로를 활성화시킨다. 항상성이 재확립될 수 없다면, UPR 활성화는 궁극적으로 아폽토시스로 이어진다. 다른 한편, CD138- MM 세포는 제한된 Ig 생성 및 낮은 ER 스트레스를 나타내고 잘못 폴딩된 단백질의 프로테아좀 매개 분해에 덜 의존한다.
종래 연구는 BM 간질 세포가 MM에서 미성숙 약물 내성 표현형을 유도한다는 것을 입증하였다. BM 간질은 정상 세포 및 악성 세포의 분화를 방해하는 CYP26을 통해 레티노산-낮은(RA-낮은) 환경을 생성한다. 레티노이드 신호전달이 PC 분화 및 Ig 생성을 촉진하기 때문에, 이 연구는 BM 적소가 간질 CYP26 활성을 통해 PC 분화를 방해함으로써 BTZ 내성을 유도하는지를 확인하였다(Alonso S. et al., J. Clin. Invest. 126:4460-4468, 2016). 간질 CYP26에 의해 유도된 RA-낮은 환경은 MM 세포에서 B 세포와 유사한 BTZ 내성 표현형을 유지하는 원인이다. CYP26을 직접 억제하거나 CYP26 내성 레티노이드를 통해 간질 보호를 우회하는 것은 PC 분화 및 BTZ 민감성을 레스큐한다. 나아가, 본 발명자들은 MM 세포에 의해 분비된 측분비 헤지호그(Hedgehog)가 RA를 불활성화시키는 BM 간질의 능력을 증가시킴으로써 보호 적소를 강화하는 양방향 소통(crosstalk)를 기술한다. 이 데이터는 RA 신호전달의 조절이 MM BM 미세환경에서 BTZ 내성을 극복하기 위한 매력적인 치료 전략이라는 것을 시사한다.
방법
세포 배양. 모든 세포주들을 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구입하였다. 10% FCS(태아 소 혈청), 2 mM L-글루타민 및 100 ㎍/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 가진 RPMI 1640에서 H929, MM.1S 및 U266 세포를 배양하였다. α-MEM, 20% FCS, L-글루타민 및 P/S에서 OP-9 세포를 배양하였다. 세포주는 짧은 탠덤 반복부 프로파일링에 의해 인증되었다.
IRB에 의해 승인된 프로토콜 하에서, 새로 진단되었거나 재발된 MM을 가진 환자로부터 일차 MM 세포를 수득하였다. 요약하건대, 밀도 구배 원심분리(Ficoll-Paque)로 새로운 BM 흡입물로부터 단핵 세포를 단리한 후; 자성 비드 및 컬럼을 통해 CD138+ 세포를 선택하였고 37℃에서 RPMI 1640, 10% FCS, L-글루타민 및 P/S에서 항온처리하였다.
IRB에 의해 승인된 프로토콜 하에서, 건강한 기증자로부터 채취된 흡입물로부터 일차 인간 BM 간질 세포를 유도하였다. 요약하건대, BM 흡입물로부터 단리된 총 단핵 세포를, 10% 말 혈청, 10% FCS, 10-5 M 하이드로코르티손 21-헤미석시네이트, P/S 및 0.1 mM β-머캡토에탄올(β-ME)로 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)(FBMD1 배지)에서 배양하였다. 다음날, 현탁액 중의 세포를 PBS로 2회 세척함으로써 제거하였고, 배지를 교체하였다. 전면생장 단일층이 수득될 때까지, 부착된 간질 세포를 33℃에서 항온처리하였다. 마우스 대퇴골로부터 총 BM 단핵 세포를 단리한 후, 마우스 일차 BM 간질 세포를 동일한 프로토콜에 따라 단리하였다.
벡터 및 바이러스 상청액. Smo-KO 및 WT 간질을 생성하기 위해, BM 간질 세포를 Smofl/fl 마우스로부터 유도하였고, 각각 Cre-재조합효소를 코딩하는 레트로바이러스 벡터 PIG-Cre(Addgene; 카탈로그 50935) 또는 대조군 백터(Addgene; 카탈로그 18751)로 형질도입하였다. 5일 동안 4 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 사용하여 성공적으로 감염된 세포를 선택하였고 유세포분석을 통해 GFP의 발현으로 확인하였다. pLenti-CMV-LUC-Puro 렌티바이러스 벡터(플라스미드 17477)를 사용하여 H929 Luc+ 세포를 생성하였다.
CYP26A1 과다발현 간질 세포를 생성하기 위해, CYP26A1을 코딩하도록 조작된 렌티바이러스 벡터 pBABE-neo(Addgene; 카탈로그 1767)로 WT 및 Smo-KO 간질 세포를 형질도입하였다. 요약하건대, 제한 부위 BamHI 및 EcoRI을 도입하는 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 Cyp26a1 cDNA(Origene)를 증폭하고 pCR2.1 벡터 내로 클로닝하였다. 생거 시퀀싱을 통해 Cyp26a1 cDNA를 확인하였고, 제한 효소 BamHI 및 EcoRI으로 분해한 후 단편을 단리하였고 pBABE 벡터의 상응하는 부위 내로 서브클로닝하였다. 렌티바이러스 입자를 앞서 기재된 바와 같이 생성하였다. 10일 동안 3 ㎍/㎖ G-418을 사용하여 성공적으로 감염된 간질 세포를 선택하였고, Cyp26a1의 발현을 qRT-PCR로 확인하였다.
공배양 실험. 24웰 플레이트를 37℃에서 30분 동안 PBS 중의 0.1% 젤라틴으로 코팅하였다. 젤라틴 용액을 제거하였고, 간질 세포를 5x104개 세포/웰의 밀도로 하룻밤 동안 배양하여 전면생장 단일층을 수득하였다. 그 때, MM 세포주 또는 일차 MM 세포(2 ㎖ 중의 1x105개)를 간질 배양물에 첨가하였다. AGN194310(5일 동안 1 μM), R115866(5일 동안 1 μM), IRX5183(5일 동안 1 μM) 또는 BTZ(48시간 동안 2.5 nM)의 존재 또는 부재 하에서 10% FCS, L-글루타민 및 P/S를 함유하는 37℃의 RPMI에서 간질 공배양물을 항온처리하였다.
트랜스웰 실험. 트랜스웰 실험을 위해, 6웰 플레이트를 37℃에서 30분 동안 PBS 중의 0.1% 젤라틴으로 코팅하였다. 젤라틴 용액을 제거하였고, 간질 세포를 배지 2 ㎖ 중의 10x104개 세포/웰의 밀도로 FBMD1 배지에서 하룻밤 동안 배양하여 전면생장 단일층을 수득하였다. 그 때, 트랜스웰 삽입체(Corning)를 간질 배양물 위에 배치하였고, MM 세포주(1 ㎖ 중의 1x106개)를 37℃에서 24시간 동안 트랜스웰에 시딩하였다. 이 항온처리 후, 트랜스웰 및 MM 세포를 제거하였고, 간질 세포를 웰로부터 탈착시켰고 CYP26 발현에 대해 qRT-PCR로 분석하였다.
이동 실험. 웰 주위에서 수회 약한 피펫팅으로 MM 세포를 BM 간질 세포로부터 분리하였다. 탈착된 세포를 원심분리하고 새로운 배지에 재현탁하고 37℃에서 1시간 동안 24웰 플레이트에서 항온처리하였다. 이 짧은 항온처리 시간 동안, 오염 간질 세포는 웰에 부착된 반면, MM 세포는 현탁액에 남아있었다. 그 다음, MM 세포를 약한 피펫팅으로 회수하였다. qRT-PCR 및 CFU 공배양 실험을 위해 이 프로토콜을 이용하였다. 이 프로토콜을 이용함으로써 달성된 순도는 98% 내지 99% MM 세포 및 2% 미만의 오염 간질인 것으로 유세포분석에 의해 확인되었다.
집락형성 어세이. 처리 후, MM 세포를 모아 PBS로 세척하였고, 30% FBS, 10% BSA, L-글루타민, P/S 및 0.1 mM β-ME로 보충된 1.32% 메틸셀룰로스 1 ㎖ 중의 5,000개 세포/㎖의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 35 mm 배양 접시에 삼중으로 플레이팅하고 37℃에서 항온처리하고, 14일 후 콜로니의 존재에 대해 점수를 부여하였다.
qRT-PCR. RNeasy 미니 키트(QIAGEN)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 총 RNA를 추출하였다. iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하여 역전사로 cDNA를 합성하였다. 서열 특이적 프라이머를 사용하여 iTaq SYBR 그린 수퍼믹스(Green Supermix)(Bio-Rad)로 qRT-PCR을 수행하였다. 유전자 발현을 GAPDH로 표준화하였고, ΔΔCt를 사용하여 상대적 정량을 계산하였다. 모든 실험들을 이중으로 수행하였고 바이오-라드 CFX96 기계에서 실시하였다.
유세포분석. 처리 후, MM 세포를 모아 PBS로 세척하였고, 파이코에리쓰린-접합된(PE-접합된) 항-CD138로 실온에서 15분 동안 염색하였다. 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 FACSCalibur 시스템(BD Biosciences)에서 평가하였다. 간질 세포를 GFP 발현으로 확인하였고, 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 사용하여 생존 세포를 확인하였다. 세포 수를 계산하기 위해, 생존 GFP- 세포를 보정 비드로 표준화하였다.
마우스 이종이식. 1x106개의 H929 Luc+ 세포 및 1x106개의 마우스 BM 간질 세포를 100 ㎕ MATRIGEL®에 재현탁하고 RPMI(1:1)로 희석하고 16주령 수컷 NSG 마우스 내로 피하 주사하였다. 4일 후, BTZ(0.5 mg/kg 복강내 매주 2회) 및 IRX(10 mg/kg 복강내 매일)을 사용한 치료를 시작하였다. 생체내 영상화 시스템(PerkinElmer)을 이용하여 생체발광도로 종양 존재량을 평가하였다. 영상화를 위해, 영상화하기 10분 내지 5분 전에 복강내 주사를 통해 마우스를 120 mg/kg D-루시페린에 노출시키고, 이소플루란을 사용하여 마취시켰다. 영상을 리빙 이미지 소프트웨어(Living Image Software) 버전 2.5(PerkinElmer)로 분석하였고, 데이터를 광자/초로서 정량하였다.
전신 MM 모델을 위해, 꼬리 정맥을 통해 2x106개의 Luc+/GFP+ H929 세포를 16주령 수컷 NSG 마우스 내로 주사하였다. 생체발광도의 기하급수적 증가에 의해 확인된 생착 후, 마우스를 BTZ(0.5 mg/kg 복강내)로 매주 2회 치료하였고 IRX(10 mg/kg)로 매일 1회 치료하였다. 전술된 바와 같이, 종양 존재량을 생체발광도로 평가하였다.
통계학. 일원 ANOVA를 이용하여, 치료군이 대조군과 상이한 지를 먼저 평가하였다. ANOVA 검정이 통계학적으로 유의미한 결과를 제공하는 경우, 던넷 검정을 이용함으로써 다중 비교를 위해 조정된 P 값으로 대조군과 각각의 치료군 사이의 차이를 평가하였다. 2개 세트의 데이터만이 분석된 실험의 경우, 비대응 양측 스튜던트 t 검정을 이용하여 통계학적 유의성을 평가하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7(GraphPad Software)을 이용하여 상관관계에 대한 피어슨(Pearson)의 R 값 및 P 값을 계산하였다.
결과
BM 미세환경("적소(niche)"로서도 지칭됨)은 레티노이드 신호전달을 조절함으로써 PC 분화를 제한한다. B 세포와 표현형적으로 유사한 MM 전구세포의 집단은 본질적으로 BTZ에 대한 내성을 나타내고 MRD 및 재발에 기여한다. BM 적소가 MM 세포의 표현형을 결정하는 데 있어서 역할을 하는 지를 조사하기 위해, 마우스 BM 간질과의 공배양 후 인간 특이적 프라이머를 사용하여 MM H929 세포주(도 3a 내지 3d) 및 MM CD138+ 일차 세포(도 3e 내지 3h)에서의 B 세포 및 PC 마커의 mRNA 발현을 분석하였다. 배중심 B 세포의 자가재생을 촉진하고 PC 분화를 방해하는 전사 리프레서인 B 세포 림프종 6(BCL6)은 BM 간질 세포의 존재 하에서 상향조절되었다(도 3a 및 3e). 대조적으로, MM 세포와 BM 간질의 공배양은 PC 분화의 결정적인 매개자들인 B 림프구-유도된 성숙 단백질 1(BLIMP1) 및 스플라이싱된 X 박스 결합 단백질 1(XBP1)의 mRNA 발현을 감소시켰다(도 3b, 3c, 3f 및 3g). 유사하게, UPR 경로의 핵심 성분인 C/EBP 상동성 단백질(CHOP)은 BM 간질 세포의 존재 하에서 하향조절되었다(도 3d 및 3h).
BM 적소는 레티노이드 불활성 효소 CYP26을 발현시킴으로써 조혈 줄기 세포(HSC) 분화를 조절한다. CYP26 효소는 BM 중간엽 세포에서 높게 발현된 반면, 그의 발현은 MM 세포에서 거의 검출될 수 없었다. 레티노이드 신호전달은 PC 분화를 촉진하고 Ig 분비를 증강시키기 때문에, 간질 CYP26이 MM 세포에서 B 세포 표현형을 유도하는 원인인 지를 확인하였다. 이를 위해, 공배양 조건을 CYP26 억제제 R115866(R115) 또는 CYP26 내성 RA 수용체 α 선택적(RARα 선택적) 레티노이드 IRX5183(IRX)으로 처리하였다. 간질 공배양물과 R115 또는 IRX의 항온처리는 액체 대조군 조건의 수준에 필적할만한 수준까지 모든 마커들을 회복시켰다(도 3a 내지 3h). 더욱이, 범-RAR 길항제 AGN194310(AGN)을 사용한 MM 세포의 처리는 BM 간질 세포에 의해 유도된 변화를 모방함으로써(도 3a 내지 3h), PC 분화를 제한하였다.
CD138의 발현은 MM PC뿐만 아니라 정상 PC 분화의 특징이기도 하다. PC 마커의 mRNA 수준과 일치하여, 표면 CD138 발현은 BM 간질 세포와의 공배양 또는 AGN과의 항온처리에 의해 현저히 감소되었다. BM 간질 세포 공배양물과 R115 또는 IRX의 항온처리는 MM 세포에서 CD138 발현을 회복시켰다. R115는 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR) 또는 유세포분석에 의한 확인 시 액체 조건에서 분화 마커의 발현에 유의미하게 영향을 미치지 않은 반면, IRX는 BM 간질의 존재 또는 부재와 관계없이 필적할만한 변화를 유도하였다. 종합하건대, 이 데이터들은 레티노이드 신호전달이 MM 세포의 PC 분화를 촉진하고 이 과정이 RA의 간질 CYP26 매개 대사에 의해 차단된다는 것을 암시한다.
RA-낮은 미세환경은 BTZ 내성을 유도한다. 감소된 레티노이드 신호전달이 BM 적소 내에서 BTZ 내성에 기여하는 지를 확인하기 위해, MM 세포주 및 MM CD138+ 일차 세포를 5일 동안 BM 간질과 함께 항온처리한 후, BTZ로 처리하였다. BM 간질의 부재 하에서(액체), MM 세포는 BTZ에 매우 민감하였다(도 4a 및 4b). 그러나, BM 간질과의 항온처리는 BTZ 내성을 유도하였고, 이 내성은 R115를 통한 CYP26 억제 또는 CYP26 내성 레티노이드 IRX에 의해 극복되었다. 더욱이, 범-RAR 길항제 AGN을 사용한 MM 세포의 처리는 BM 간질 세포에 의해 유도된 변화를 모방함으로써(도 5), BTZ 민감성을 감소시켰다.
미세환경 의존적 화학보호를 극복하기 위한 전략은 암 세포를 BM 적소로부터 말초 순환계 내로 이동시키는 것에 초점을 맞추었다. MM 세포의 표현형의 변화 및 후속 BTZ 내성이 이동을 모방하는 과정인 BM 간질로부터의 분리 시 상실되었는 지를 분석하였다. 이를 위해, 5일 간질 공배양 후 BM 중간엽 세포로부터 H929 세포를 분리하고 새로운 배지(10% FBS를 가진 RPMI)에서 0시간 내지 48시간 동안 항온처리한 후, BTZ로 처리하였다. 흥미롭게도, MM 세포는 간질로부터의 탈착 후 최대 48시간 동안 BTZ에 대한 부분적 내성을 유지하였다(도 5). 나아가, R115를 사용한 공배양 조건의 처리는 BTZ 내성 표현형의 발생을 방해하였다(도 5). 따라서, MM 세포 표현형의 변화에 의해 유도된 미세환경 의존적 BTZ 내성은 종양 이동에 의해 즉시 역전되지 않을 수 있다.
레티노이드가 MM에서 BTZ 활성을 향상시킬 수 있는 지를 시험하기 위해, 비-비만 당뇨병성 중증 복합 면역결핍 IL-2 수용체 γ-KO(NSG) 마우스의 꼬리 정맥을 통해 2x106개의 H929 루시퍼라제+(Luc+) 세포를 주사함으로써 전신 MM 이종이식편을 발생시켰다. IRX, BTZ 또는 이들의 조합을 동물들에게 무작위로 제공하였고, 생체발광도 영상화로 질환 존재량을 매주 추적조사하였다(도 6). BTZ로 치료된 마우스는 비치료된 대조군에 비해 감소된 종양 성장을 보였으나; 일부 MM 세포들은 생체발광도의 계속된 증가에 의해 입증된 바와 같이 BTZ에 대한 내성을 유지하였다. 유사하게, IRX 단일요법으로 치료된 마우스는 비치료된 마우스에 비해 종양 존재량의 감소를 보였다. 가장 중요하게는, IRX는 MM 세포를 BTZ에 감작시켜, 질환 존재량의 유의미한(P < 0.01) 감소를 이끌어내었다. 종합하건대, 이 데이터들은 간질 CYP26에 의해 생성된 RA-낮은 미세환경이 BM 적소로부터의 이탈 후조차도 유지되는 BTZ 내성 표현형을 유도한다는 것을 암시한다.
MM 세포는 간질 CYP26을 유도한다. 최근 연구는 간질 세포가 보호 미세환경을 제공할뿐만 아니라 암 세포도 능동적으로 적응하고 강화된 적소를 구축하는 양방향 소통의 존재를 입증하였다. 따라서, MM 세포가 레티노이드를 불활성화시키는 BM 간질의 능력을 강화함으로써 보호 미세환경을 강화하는 지를 확인하였다. 간질 CYP26 발현을 MM 세포와의 24시간 공배양 후 BM 중간엽 세포에서 qRT-PCR로 분석하였다. 이소효소 CYP26A1은 시험된 모든 3종의 MM 세포주들에 의해 높게 상향조절되었다(도 7a 내지 7c). 대조적으로, 이소효소 CYP26B1은 mRNA 수준의 변화를 거의 내지 전혀 보이지 않았다. MM 세포로부터 유래한 컨디셔닝된 배지도 더 적은 정도이기는 하지만 BM 간질 세포에서 CYP26A1을 상향조절하였다. 이것은 공배양 실험에서 물리적 상호작용의 존재에 의해, 또는 컨디셔닝된 배지 실험에서 MM 세포에 의한 가용성 리간드의 연속적 생성의 결여에 의해 설명될 수 있었다. 후자와 일치하여, 간질 CYP26A1은 MM 세포와 BM 간질 세포가 물리적 접촉을 방해하되 가용성 인자의 확산을 허용하는 트랜스웰에 의해 분리되었을 때 높게 상향조절되었다(도 7a 내지 7c).
MM 세포는 BM 간질 구획에 영향을 줄 수 있는, 사이토카인(IL-1, IL-3, IL-6, TNF-α)뿐만 아니라 헤지호그 리간드, 예컨대, 소닉 헤지호그(SHH)도 포함하는 다양한 가용성 인자들을 생성한다. 따라서, 이 인자들 중 어느 인자가 BM 간질 세포에서의 CYP26A1의 관찰된 상향조절의 원인인 지를 확인하였다. 시험된 가용성 인자들 중 SHH만이 CYP26A1의 지속된 과다발현을 생성한 반면, IL-1, IL-3, IL-6 및 TNF-α는 유의미한 효과를 갖지 않았다. SHH가 BM 간질 세포에 의해 발현되므로, 자가분비 방식으로 헤지호그 경로를 활성화시킬 수 있는 반면, 그의 발현은 BM 간질에서 검출된 발현에 비해 MM 세포에서 상당히 더 높았는데, 이 결과는 측분비 활성화가 주된 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다. 이것과 일치하여, 단백질 패치 상동체 1(PTCH1) 발현에 의해 확인되었을 때, MM 세포에서의 SHH의 mRNA 수준과 간질 헤지호그 신호전달의 활성화 사이에 통계학적으로 유의미한 상관관계가 있었다. 더욱이, 간질 헤지호그의 활성화는 CYP26A1 상향조절과 유의미한 상관관계를 가졌다. 구체적으로, 가장 높은 SHH 발현을 가진 MM.1S 세포는 간질 세포에서 PTCH1 및 CY26A1 둘 다의 가장 높은 발현도 유도하였다. SHH는 1시간 미만의 반감기를 갖는데, 이것은 공배양 및 트랜스웰 실험에서 관찰된 효과에 비해 간질 CYP26A1 발현에 대한 MM-컨디셔닝된 배지의 감소된 효과를 설명할 수 있다.
이 상호작용에 대한 측분비 헤지호그의 역할을 확인하기 위해, SHH 신호전달을 형질도입하는 막 수용체인 스무쓴드(smoothened)(Smo)를 중간엽 구획에서 게놈 수준에서 넉아웃시켰다. 이를 위해, Smofl/fl 마우스로부터 유래한 BM 중간엽 세포를, Cre 재조합효소를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입하였다(Smo-KO 간질). 빈 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 마우스 Smofl/fl 간질 세포를 대조군(WT 간질)으로서 사용하였다. 형질도입된 BM 간질 세포를 24시간 동안 MM 세포와 공배양하였다. 예상된 바와 같이, Smo-KO 간질은 WT 간질에 비해 MM 세포에 반응하여 Cyp26a1을 상향조절하는 감소된 능력을 가졌다(도 8a 내지 8c). 유사하게, SMO 억제제 사이클로파민은 MM 세포에 의한 간질 Cyp26a1 상향조절을 부분적으로 극복하였다. 이 데이터들은 MM 세포가 적어도 부분적으로 측분비 SHH를 통해 간질 CYP26 발현을 조절한다는 것을 암시한다.
MM 세포에 의해 생성된 측분비 헤지호그는 보호 미세환경을 강화한다. 간질 CYP26 활성이 MM 세포에서 BTZ 내성의 원인일 수 있다는 관찰결과를 고려하여, MM 세포에 의해 분비된 측분비 헤지호그가 레티노이드 대사를 조절함으로써 화학보호 적소를 강화하는 지를 평가하였다. 헤지호그 신호전달의 조절이 앞서 관찰된 레티노이드 의존적 표현형과 유사한 지를 먼저 조사하였다. Smo-KO 간질 공배양에서의 측분비 헤지호그 신호전달의 파괴는 H929(도 11a 내지 11d) 및 일차 CD138+ MM 세포(도 11e 내지 11h)에서 PC 분화(BCL6의 하향조절, 및 BLIMP1, XBP1 및 CHOP의 상향조절)를 부분적으로 회복시켰다. CD138의 표면 발현도 Smo-KO 간질의 존재 하에서 회복되었다. 예상된 바와 같이, 이 발견은 WT 간질에 비해 Smo-KO 간질의 존재 하에서 처리된 MM 세포의 BTZ에 대한 증가된 민감성과 관련되어 있었다.
측분비 헤지호그가 실제로 레티노이드를 불활성화시키는 BM 간질의 능력을 증가시킴으로써 BTZ 내성 표현형을 유도한다는 것을 입증하기 위해, WT(WT-Cyp26a1) 및 Smo-KO(Smo-KO-Cyp26a1) 간질 세포에서 필적할만한 CYP26A1 수준을 달성하도록 렌티바이러스 매개 유전자 전달(pBABE-Cyp26a1)을 통해 Smo-KO 간질에서의 Cyp26a1 발현을 레스큐하였다. 측분비 헤지호그의 역할이 레티노이드 신호전달과 관련 없는 경우, B 세포 표현형 및 BTZ 내성을 유도하는 Smo-KO 간질의 상대적 무능력은 Cyp26a1 상향조절 후조차도 지속되어야 한다. 그러나, Cyp26a1 과다발현은 B 세포 표현형을 유도하는 Smo-KO 간질의 능력을 레스큐하였고 분화 마커의 발현 및 BTZ 내성을 WT 및 WT-Cyp26a1 간질 공배양 조건에서 검출된 수준에 필적할만한 수준까지 회복시켰다. 이 발견은 측분비 헤지호그가 Cyp26a1 상향조절을 통해 보호 적소를 강화한다는 가설과 일치한다.
BM 간질에 의해 생성되고 측분비 헤지호그 신호전달을 통해 MM 세포에 의해 향상된 RA-낮은 환경이 BTZ 내성에 어느 정도 기여하는 지를 연구하기 위해, MM-적소 상호작용의 이종이식편 모델을 개발하였다. 각각의 마우스는 H929 Luc+ 세포 및 WT(전방 종양) 또는 Smo-KO 간질(후방 종양)로 구성된 2개의 피하 종양을 보유하였다. 마우스를 IRX(10 mg/kg 복강내 매일), BTZ(0.5 mg/kg 복강내 매주 2회) 또는 이들의 조합으로 치료하였다. WT 또는 Smo-KO 간질을 가진 종양의 성장은 비치료군 또는 IRX 치료군에서 상이하지 않았다(도 9 및 10). 시험관내 데이터와 일치하여, 생체발광도의 기하급수적 증가에 의해 확인되었을 때, WT 간질을 가진 종양은 BTZ 치료에 불응하는 반면, Smo-KO 간질을 보유한 종양은 유의미한 반응을 보였다(도 8). 더욱이, IRX와 BTZ의 조합은 간질 구획의 표현형과 관계없이 유의미한 동등한 반응을 야기하였다(도 10). 조합된 IRX와 BTZ를 제공받은 치료군에서 일부 종양들은 해부학적 연구 후조차도 완전히 퇴행된 것으로 보였지만, 이것은 이 군 내의 모든 마우스들에게 해당하지는 않았다. 치료 후 종양의 유세포분석은 WT 또는 Smo-KO 간질의 생체내 성장의 차이를 보여주지 않았다. 종합하건대, 이 데이터들은 MM 세포에 의해 분비된 측분비 헤지호그가 CYP26A1 상향조절을 통해 BM 적소에서 레티노이드 신호전달 및 BTZ 민감성을 조절한다는 것을 암시한다.
PC는 그의 높은 Ig 분비를 고려할 때 프로테아좀 억제에 특히 민감하고, 이것은 이 패밀리의 약물로 치료된 MM 환자에서 달성된 높은 관해율을 설명한다. 그럼에도 불구하고, BTZ는 치유를 달성하지 못하였다. B 세포와 표현형적으로 유사한 MM 세포의 집단은 BTZ 치료에서 생존하고 PC로 분화할 수 있고 원래의 질환을 재현할 수 있다. MM PC의 효율적인 제거에도 불구하고, 이 MM B 세포는 BTZ 치료에서 생존하고 MRD 동안 우세한 세포 집단이 된다. 결과적으로, MM B 세포를 표적화하는 신규 치료 전략이 요구된다. 간질 CYP26에 의해 생성된 레티노이드-낮은 미세환경은 MM에서 미성숙 BTZ 내성 표현형을 유지하였다. 따라서, 이 데이터들은 CYP26 내성 레티노이드를 사용하여 MM 미세환경에서 BTZ 내성을 극복할 치료 기회를 보여준다.
많은 혈액 악성종양들에서 광범위하게 연구되었음에도 불구하고, 분화 요법으로서의 레티노이드의 사용은 급성 전구골수세포성 백혈병(APL)을 가진 환자에서만 유리한 것으로 입증되었다. BM 간질 세포에 의한 CYP26 발현은 그의 시험관내 활성에도 불구하고 천연 레티노이드의 임상적 이익의 결여를 설명할 수 있다. 최근 연구는 암 세포를 분화시키고 표적화된 요법에 감작시키는 데 있어서 CYP 내성 합성 레티노이드의 효능을 강조하였다. 예를 들면, AM80은 FMS 유사 티로신 키나제 3/내부 탠덤 중복(FLT3/ITD) 급성 골수성 백혈병(AML) 세포를 분화시키고 FLT3 억제제에 대한 그의 민감성을 증가시킨다. 유사하게, 합성 레티노이드는 BCR-ABL1+ 백혈병 림프모세포에서 줄기 세포 표현형을 역전시키고 생체내에서 티로신 키나제 억제제(TKI) 요법에 대한 그의 반응성을 실질적으로 증가시킨다. 간질 CYP26을 우회하기 위한 이러한 전략은 레티노이드 요법의 임상적 효능을 확장시킬 수 있다.
MM 세포는 BM 적소 내에서 약물 내성을 유지하고 생존하기 위해 물리적 접촉을 이용한다. 따라서, 간질 화학보호를 극복하기 위한 치료 전략은 부착 분자 또는 케모카인, 예컨대, CXCR4를 표적화함으로써 BM 적소로부터의 악성 세포의 이동에 초점을 맞추었다. 레티노이드-낮은 미세환경에 노출된 MM 세포는 이 세포가 그의 적소로부터 이탈된 후조차도 유지되는 BTZ 내성 표현형을 획득한다. 초기 임상 연구는 BTZ와 조합된 CXCR4 억제제 플레릭사포르(plerixafor)를 제공받은 재발/불응성 환자에서 개선된 반응률을 보여주었으나; 이 데이터는 이러한 이동 접근법이 MM B 세포를 제거하기에 불충분할 수 있다는 것을 암시한다.
최근 연구는 간질 세포가 화학보호 적소를 제공할 뿐만 아니라, 암 세포도 능동적으로 형태를 갖추고 그의 미세환경을 강화하는 양방향 소통의 존재를 입증하였다. 측분비 헤지호그의 역할은 고형 악성종양에서 광범위하게 연구되었다. 이 시스템에서, 암 세포에 의해 분비된 리간드는 이웃 간질 세포에서 헤지호그 경로를 활성화시켜, 불완전하게 이해된 기작을 통해 그의 화학보호 성질을 향상시킨다. 이 데이터는 측분비 헤지호그가 적어도 부분적으로 CYP26의 상향조절을 통해 레티노이드를 불활성화시킴으로써 MM에서 BTZ 내성 표현형을 유지하는 간질의 능력을 증가시킴으로써 작용할 수 있다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, CYP26 상향조절은 측분비 헤지호그 신호전달이 잘 확립된 질환인 췌장암을 가진 환자에서 "활성화된 간질 서브타입" 및 유의미하게 더 나쁜 예후와 관련되어 있다. 암 세포에 의해 생성된 헤지호그 리간드가 이 "활성화된" 간질 표현형 및 높은 CYP26 수준에 기여하는 정도는 공지되어 있지 않다. 더욱이, BM 중간엽 세포는 이동하고 이 종양의 간질 구획에서 관련 세포 집단이 된다.
골내막 영역은 고형 종양으로부터의 MM, AML 및 미세전이성 질환의 일차 적소이다. 골모세포 영역 내에서, 이 암 세포들은 휴면 줄기 세포 표현형을 유지하고 화학요법에 의해 유도된 아폽토시스로부터 보호된다. 이 암 세포들이 화학요법에서 생존하고 질환을 영속시키기 위해 정상 조혈 줄기 세포가 의존하는 신호와 동일한 BM 미세환경으로부터의 신호에 의존할 가능성이 높다. BM 미세환경은 CYP3A4 및 다른 해독 효소의 발현을 통해 다양한 화학요법제들을 직접 불활성화시킴으로써 MM 및 AML 세포를 보호하였다. 미세환경 매개 약물 내성의 또 다른 잠재적 기작이 지금 입증된다: 약물 내성 B 세포 표현형을 유지하는 레티노이드-낮은 적소의 생성. CYP26 내성 레티노이드(IRX5183)는 BM 적소에서 MM에 대한 BTZ의 활성을 증강시켰고 이 내성 기작을 우회할 치료 기회를 제공한다.
실시예 8
급성 골수성 백혈병에서 IRX5183의 I/II 상 임상 연구
급성 골수성 백혈병(AML)은 표준 화학요법에 의해 젊은 환자들 중 단지 30% 내지 40% 및 극소수의 노인 환자에서 성공적으로 치료된다. 급성 전구골수세포성 백혈병(APL)에서 올-트랜스 레티노산(ATRA; 레티노산, RA)의 임상 활성을 고려할 때, ATRA는 다른 AML 서브타입에 대한 매력적인 치료 전략으로서 간주되었다. APL 및 대다수의 비-APL AML은 말기 분화를 겪으므로, 시험관내에서 ATRA에 의해 성공적으로 치료된다. 그러나, ATRA는 임상 시험에서 비-APL AML에 효과적인 것으로 입증되지 않았다.
레티노산(RA)은 조혈 줄기 세포(HSC)의 분화에 있어서 유의미한 역할을 한다. 골수(BM) 간질 세포에서 발현된 사이토크롬 P450 효소 CYP26은 RA를 불활성화시킴으로써, HSC의 분화를 제한한다. APL 및 비-APL 둘 다의 여러 AML 세포주들은 RA에 의해 유도된 분화에 민감하나, 이 효과는 BM 간질의 존재 하에서 없어졌다. 따라서, CYP26 경로에 의한 대사에 대한 내성을 가진 레티노이드로 AML을 치료하는 것이 유용할 수 있다. IRX5183은 CYP26 대사에 대한 내성을 가진 RARα 선택적 작용제이다. AML에서의 IRX5183의 사용은 이 혈액 악성종양 및 다른 혈액 악성종양의 예후를 변화시킬 잠재력을 가진, 이 질환에 대한 신규 표적화된 접근법을 제공한다. 따라서, 재발/불응 AML에서 IRX5183으로 I/II 상 임상 시험을 수행할 것이다.
연구 목적
용량 상승 상 일차 목적:
Figure pct00055
용량 제한 독성(DLT) 및 최대 내약 용량(MTD)을 결정함으로써 재발 및 불응성 AML을 가진 환자에서 IRX5183의 투여와 관련된 안전성 및 독성을 평가한다.
Figure pct00056
말초 혈액에서 IRX5183의 약동학(PK) 파라미터를 결정한다.
용량 상승 상 이차 목적:
Figure pct00057
골수에서 IRX5183의 PK 파라미터를 결정한다.
Figure pct00058
상이한 용량 수준에서 IRX5183, BM 세포 레티노이드 농도, 모세포 카운트 및 세포유전학과 관련된 분화 프로파일을 정의한다.
용량 확장 상 일차 목적:
Figure pct00059
최적 용량 수준에서 AML 환자에서 분화 마커, BM 레티노이드 농도, 모세포 카운트 및 세포유전학을 정의한다.
Figure pct00060
두 환자 코호트들에서 완전한 반응(CR), 부분적 반응(PR) 및 혈액학적 개선(HI)의 관점에서 IRX5183의 예비 효능 데이터를 수득한다.
용량 확장 상 이차 목적:
Figure pct00061
두 환자 코호트들에서 최적 용량에서 IRX5183의 독성 프로파일을 정의한다.
Figure pct00062
IRX5183에 의해 유도된 분화와 독성 및 임상 반응 사이의 상관관계에 대한 데이터를 수득한다.
적격 기준 - 용량 상승/결정
Figure pct00063
환자들은 사전동의서를 이해하고 자발적으로 서명할 수 있어야 한다.
Figure pct00064
사전동의서에 서명할 당시 18세 내지 70세의 연령.
Figure pct00065
연구 방문 일정 및 다른 프로토콜 요건을 준수할 수 있어야 한다.
Figure pct00066
6개월 초과의 기간의 기대 수명.
Figure pct00067
유도 화학요법 또는 과소메틸화제 요법의 1개 또는 2개의 사전 과정으로 AML을 병리학적으로 확인해야 하거나, 완전한 관해 후, 동종이계 골수 이식 전 또는 후 재발되어야 하고, 추가 집중적 화학요법에 대한 계획이 없어야 한다.
Figure pct00068
환자는 시험을 시작하기 3주 이내에 조혈 성장 인자를 포함하는, 그의 질환을 위한 임의의 다른 치료((AML 환자에서 모세포 카운트의 제어를 위한 하이드록시우레아 제외)를 제공받지 않아야 하고, (등급 0 또는 1까지) 사전 요법의 모든 독성으로부터 회복되어야 한다.
Figure pct00069
연구 참여 시 ≤2의 ECOG 수행 상태, 또는 카르노프스키(Karnofsky) ≥60%
Figure pct00070
이 범위들 내의 실험실 시험 결과:
o MDRD에 의한 계산된 크레아티닌 제거(CrCL) >50 ㎖/분/1.73 평방 미터
o 길버트 증후군, 용혈, 또는 비효과적 조혈 AST(SGOT) 및 ALT(SGPT) ≤3x ULN으로 인한 것이 아닌 한, 총 빌리루빈 ≤2.0 mg/dL
Figure pct00071
가임 여성은 음성 임신 시험을 받아야 한다.
Figure pct00072
환자는 CNS 또는 폐 백혈구울혈, 파종성 혈관내 응고, 또는 CNS 백혈병의 임상 증거를 갖지 않아야 한다.
Figure pct00073
환자는 심각한 또는 제어되지 않는 의학적 상태를 갖지 않아야 한다.
적격 기준 - 용량 확장. 이 상은 소개 시 다음과 같이 정의된 고위험 특징을 가진 병리학적으로 확인된 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)을 포함하는, 상기 인지된 적격 기준을 따를 것이다:
Figure pct00074
INT-2 또는 높은 IPSS 점수
Figure pct00075
≥5% 골수 모세포, 또는 RBC 또는 혈소판 수혈 의존성, 비정상적 핵형, 또는 증식 특징을 가진 CMML
치료 계획
용량 상승 상의 경우, IRX5183을 독성 또는 질환 진행까지 28일 주기로 연속적으로 매일 용량으로 경구 투여한다. 처음 4개 주기들 각각 동안 골수 시험은 골수 상태 및 반응을 확인한다. 단일 물질 IRX5183의 출발 용량(DL1)은 30 mg/m2/일이고, 개별 투약 수준은 다음과 같이 인식된다:
Figure pct00076
연구의 상-확장 부분은 연구의 상-상승 부분에서 확인된 최적 용량을 사용하고 26명의 환자들을 동원할 것이다.
AML 환자에서 IRX5183의 독성 프로파일을 확인하기 위해 한 번에 3명의 피험자들을 등록하는 것을 목적으로, 용량 수준을 전통적인 3+3 디자인에 따라 조사한다. DL1을 제공받은 3명의 환자들 중 어느 누구도 DLT를 경험하지 않는 경우, 또 다른 3명의 환자들을 다음 더 높은 용량 수준으로 치료할 것이다. 그러나, 처음 3명의 환자들 중 한 명의 환자가 DLT를 경험한 경우, 3명 더 많은 환자들을 동일한 용량 수준으로 치료할 것이다. 3명 내지 6명의 환자들의 코호트 중에서 적어도 2명의 환자들이 DLT를 경험할 때까지 용량 상승은 계속될 것이다. 2명 이상의 환자들이 DL1에서 DLT를 경험한 경우, 다음 환자는 DL(-1)로 동원될 것이다. 단일 물질 IRX5183의 MTD는 0 또는 1 DLT가 6명의 피험자들의 코호트에서 확인되는 가장 높은 용량일 것이다.
상 2 용량 확장 코호트를 위해, (시험의 제1상에서 MTD로 치료받은 환자들을 포함하는) 26명의 환자들을 등록하는 것을 목적으로, AML을 가진 환자를 MTD에서 계속 등록할 것이다. 환자들은 독성 또는 질환 진행을 경험할 때까지 단일 물질 IRX5183을 계속 제공받을 것이다. 환자가 완전한 관해를 달성하는 경우, 이 환자는 이식, 화학요법 및/또는 유지 IRX5183의 계속을 통합할 선택권을 가진다. 환자가 부분적 반응 또는 혈액학적 개선을 달성하는 경우, 이 환자는 IRX5183과 조합된 살비지(salvage) 요법을 수득할 선택권을 가진다.
약동학 분석. LCM-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학 탠덤)을 이용하여 상승 및 확장 상에 대해 IRX5183의 혈장 농도를 평가하여, 약동학으로 안전하고 효과적인 레티노이드 수준을 표적화한다. 1 pM의 표적화 피크 수준은 추정컨대 국소 BM 적소 레티노이드 수준을 보존하면서 전신 독성을 피해야 한다. 14일째 날 투약 전에 단일 2 ㎖ 혈액 샘플을 사용하여 IRX5183의 혈장 농도를 수득한다. 샘플은 지정된 분석 실험실로 운반되고 이 실험실에 의해 분석된다.
약력학 분석. 표준 임상 반응 기준의 평가 이외에, BM 세포(정상 HSC 및 LSC) 농도, 말초 혈액 및 골수 모세포 카운트, 분화의 마커, 아폽토시스 및 집락형성 성장을 확인한다. 골수 흡입물 및 생검을 기준시점, 14일째 날, 및 요법의 처음 4개 주기들 각각의 말기에 수득한다. 유세포분석을 이용하여, 14일째 날 골수 대 기준시점에서 CD45 양성 세포 및 ALDHint LSC의 분화 마커의 발현을 비교함으로써 분화를 평가한다. 백혈병 클론이 14일째 날에 여전히 존재하는 경우 기준시점 비정상을 가진 환자에 대해 각각의 주기 후 FISH 분석도 수행한다.
예상된 결과
말초 혈액 및 골수에서의 완전한 혈액 카운트 및 백혈병 모세포의 퍼센트를 비롯한 혈액학적 파라미터에 기반을 둔 반응 기준에 대해, RARα 선택적 작용제를 제공받는 환자를 모니터링한다. 골수에서의 모세포의 감소된 퍼센트, 및 이 악성 모세포의 분화 및 아폽토시스의 유도와 함께 개선된 호중구 카운트, 적혈구 세포 및 혈소판의 감소된 수혈 요구를 가진 환자는 요법에 반응하는 것으로 간주된다. 삶의 질 파라미터, 예컨대, 통증, 일상생활의 활동에서의 수행 상태 및 참여, 및 일상생활의 도구적 활동을 평가하여, 연구 환자에 대한 이 요법의 영향을 평가한다. 이 RARα 선택적 작용제의 사용은 AML 및 고형 악성종양을 가진 환자에서 혈액학적 파라미터 및 삶의 질 파라미터를 개선할 것으로 예상된다. 추가로, CYP26 내성을 나타내는 RARα 작용제의 사용은 분화를 야기함으로써, 이 환자의 골수에서 최소 잔류 질환의 제거를 야기할 수 있다.
실시예 9
급성 골수성 백혈병에서 IRX5183 + CAR-변형된 면역 세포의 임상 연구
적격 기준은 실시예 6에 기재된 기준과 동일하다.
치료 계획
본 연구는 상-상승 연구(실시예 6)에서 확인된 최적 용량의 IRX5183을 사용하고 2개의 별도의 아암들, 즉 CAR-변형된 면역 세포만을 제공받는 환자에 대한 한 아암(군 1), 및 IRX5183 및 CAR-변형된 면역 세포 둘 다를 제공받는 환자에 대한 또 다른 아암(군 2)을 포함하고, 이 2개의 아암들 각각은 26명의 환자들을 동원할 것이다.
모든 환자들은 D-5일째 날부터 D-3일째 날까지 25 mg/m2의 플루다라빈을 정맥내로 투여받고 D-3일째 날에 900 mg/m2의 사이클로포스프아미드를 정맥내로 투여받는다.
군 1은 문헌(Minagawa et al. (PLoS One 12:e0172640, 2017))에 개시되고 제조된 자가 CD33-CAR-T 세포를 제공받고 단회 볼루스 용량으로 환자 체중 kg당 5x106개 세포의 용량으로 정맥내로 투여받는다.
군 2 환자들은 자가 CD33-CAR-T 세포 요법을 시작하기 전(D-30) 30일 동안 매일 IRX5183으로 치료받고 6개월 동안, 또는 독성 또는 진행이 일어날 때까지 계속 치료받는다. CD33-CAR-T 세포를 IRX5183 투약의 시작 후 30일 동안 단회 볼루스 용량으로 환자 체중 kg당 5x106개 세포의 용량으로 정맥내로 투여한다.
약동학 분석. LCM-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학 탠덤)을 이용하여 상승 및 확장 상에 대해 IRX5183의 혈장 농도를 평가하여, 약동학으로 안전하고 효과적인 레티노이드 수준을 표적화한다. 1 pM의 표적화 피크 수준은 추정컨대 국소 BM 적소 레티노이드 수준을 보존하면서 전신 독성을 피해야 한다. 14일째 날 투약 전에 단일 2 ㎖ 혈액 샘플을 사용하여 IRX5183의 혈장 농도를 수득한다. 샘플은 지정된 분석 실험실로 운반되고 이 실험실에 의해 분석된다.
약력학 분석. 표준 임상 반응 기준의 평가 이외에, BM 세포(정상 HSC 및 LSC) 농도, 말초 혈액 및 골수 모세포 카운트, 분화의 마커, 아폽토시스 및 집락형성 성장을 확인한다. 골수 흡입물 및 생검을 기준시점, 14일째 날, 및 요법의 처음 4개 주기들 각각의 말기에 수득한다. 유세포분석을 이용하여, 14일째 날 골수 대 기준시점에서 CD45 양성 세포 및 ALDHint LSC의 분화 마커의 발현을 비교함으로써 분화를 평가한다. 백혈병 클론이 14일째 날에 여전히 존재하는 경우 기준시점 비정상을 가진 환자에 대해 각각의 주기 후 FISH 분석도 수행한다.
예상된 결과
말초 혈액 및 골수에서의 완전한 혈액 카운트 및 백혈병 모세포의 퍼센트를 비롯한 혈액학적 파라미터에 기반을 둔 반응 기준에 대해, RARα 작용제 + CD33-CAR-T 요법을 제공받는 환자를 모니터링한다. 골수에서의 모세포의 감소된 퍼센트, 및 이 악성 모세포의 분화 및 아폽토시스의 유도와 함께 개선된 호중구 카운트, 적혈구 세포 및 혈소판의 감소된 수혈 요구를 가진 환자는 요법에 반응하는 것으로 간주된다. 삶의 질 파라미터, 예컨대, 통증, 일상생활의 활동에서의 수행 상태 및 참여, 및 일상생활의 도구적 활동을 평가하여, 연구 환자에 대한 이 요법의 영향을 평가한다. 이 RARα 작용제 + CD33-CAR-T 요법의 사용은 AML을 가진 환자에서 혈액학적 파라미터 및 삶의 질 파라미터를 개선할 것으로 예상된다. 추가로, CAR-T 요법과 조합된, CYP26 내성을 나타내는 RARα 작용제의 사용은 분화를 야기함으로써, 이 환자의 골수에서 최소 잔류 질환의 제거를 야기할 수 있다.
실시예 10
다발성 골수종에서 IRX5183 + CAR-변형된 면역 세포의 임상 연구
다발성 골수종(MM)은 전형적으로 골수에서 발견되는, 형질 세포로서 공지된 백혈구 세포가 제어되지 않으면서 성장하고 종양으로 발전할 때 일어나는 혈액암의 한 형태이다. 대략 30,000건의 신규 다발성 골수종 사례가 미국에서 올해 진단될 것이다. 이 질환을 발생시키는 것으로 공지되어 있는 위험 인자는 거의 없고, 이 질환은 신장 및 다른 장기로 진행될 때까지 진단으로 이어질 징후 또는 증상을 야기하지 않을 수 있다.
B 세포 성숙 항원(BCMA)은 MM 내의 암성 형질 세포를 포함하는 모든 형질 세포들에서 발현된다. 자가 BCMA-CAR-T 세포 및 MM에서의 이의 사용은 문헌(Ali SA et al. Blood 128:1688-1700, 2016)에 개시되어 있다.
포함 기준:
Figure pct00077
환자는 불응성, 지속성 또는 진행성 질환과 함께, IMiD 및 PI를 포함하는 2차 이상의 선행 요법으로 이미 치료받은, BCMA를 발현하는 MM 세포를 가진, 병리학자에 의해 조직학적으로 확인된 MM을 가져야 한다.
Figure pct00078
연령 ≥18세
Figure pct00079
크레아티닌 ≤2.0 mg/dL, 직접적인 빌리루빈 ≤2.0 mg/dL, AST 및 ALT ≤3.0x 정상의 상한(ULN)
Figure pct00080
펄스 산소측정법에 의해 실내 공기에 대한 ≥92% 산소 포화도에 의해 평가될 때 적절한 폐 기능
배제 기준:
Figure pct00081
카르노프스키 수행 상태 <70
Figure pct00082
임신 또는 수유 여성. 가임 연령의 여성 및 남성은 이 연구 동안 효과적인 피임을 이용해야 하고 모든 치료가 종료된 후 1년 동안 피임을 계속해야 한다.
Figure pct00083
ECHO 또는 MUGA 스캔에 의해 평가될 때 손상된 심장 기능(LVEF <40%)
Figure pct00084
하기 심장 상태를 가진 환자는 배제될 것이다:
o 뉴욕 심장 협회(NYHA) III 또는 IV 기 울혈성 심부전
o 등록 전 심근경색 ≤6개월
o 미주신경성이거나 탈수에 기인하는 것으로 생각되지 않는, 임상적으로 유의미한 심실 부정맥 또는 설명되지 않는 실신의 이력
o 중증 비-허혈성 심근병증의 이력
Figure pct00085
HIV 또는 활성 B형 간염 또는 C형 간염 감염을 가진 환자는 부적격하다.
Figure pct00086
피부의 편평 및 기저 세포 암종을 제외하고, 기대 관찰 또는 호르몬 요법 이외의 임의의 요법을 요구하는 악성종양으로 정의된 임의의 공존 활성 악성종양을 가진 환자
Figure pct00087
선행 동종이계 이식을 받은 환자는 전신 스테로이드 또는 다른 전신 림프독성 요법을 요구하는 GvHD를 이전에 또는 현재 경험하지 않은 한 적격하다.
Figure pct00088
모집 2주 이내에 전신 스테로이드를 복용한 환자(부신 대체를 위한 경우만을 제외함)
Figure pct00089
결합 조직 질환, 포도막염, 사르코이드증, 염증성 장 질환 또는 다발성 경화증을 포함하는 활성 자가면역 질환, 또는 연장된 면역억제 요법을 요구하는 중증(주요 임상시험자에 의해 판단됨) 자가면역 질환의 이력을 가짐
Figure pct00090
유전자 변형된 T 세포를 사용한 선행 치료
Figure pct00091
골수종에 의한 선행 또는 활성 CNS 침범(예를 들면, 연수막 질환). 예를 들면, 요추 천자에 의한 이에 대한 스크리닝은 의심스러운 증상 또는 방사선촬영 소견이 존재하는 경우에만 요구된다.
Figure pct00092
형질 세포 백혈병
Figure pct00093
기존(활성 또는 중증) 신경학적 장애(예를 들면, 기존 발작 장애)
Figure pct00094
활성 비제어된 급성 감염
Figure pct00095
치료 의사의 견해에 따라 환자를 연구에 부적격하게 만들 임의의 다른 문제.
컨디셔닝 화학요법(사이클로포스프아미드 및 임의적으로 플루다라빈)을 완료한 지 2일 내지 7일 후 변형된 T 세포 주입을 투여한다. BCMA-CAR-T 세포를 1x106개 내지 10x106개 CAR-T 세포/kg의 용량으로 투여한다.
컨디셔닝 화학요법은 D-7일째 날 내지 D-2일째 날 1회 3000 mg/m2 IV의 사이클로포스프아미드, 또는 마지막 날이 D-7일째 날 내지 D-2일째 날에 존재하는 저강도 cy/flu(사이클로포스프아미드 300 mg/m2/일 x 3 + 플루다라빈 30 mg/m2/일 x 3)을 포함한다.
본 연구는 15 내지 75 mg/m2/일의 범위 내에서 2회 용량의 IRX5183을 사용하고(실시예 6에서의 임상 시험의 결과를 기반으로 이 범위를 좁힐 수 있음) 3개의 별개의 아암들, 즉 BCMA-CAR-T 세포만을 제공받는 환자에 대한 아암(군 1), 및 IRX5183 용량 1(군 2) 및 IRX5183 용량 2(군 3)로 IRX5183 및 BCMA-CAR-T 세포 둘 다를 제공받는 환자에 대한 아암을 포함하고, 이 2개의 아암들 각각은 26명의 환자들을 동원할 것이다.
군 1 환자는 컨디셔닝 화학요법 후 DO일째 날부터 시작하는 단회 볼루스 용량으로 환자 체중 kg당 1x106개 내지 10x106개 세포의 용량으로 정맥내로 BCMA-CAR-T로 치료받는다.
군 2 및 3 환자는 BCMA-CAR-T 세포를 시작하기 전 30일 동안 매일 IRX5183으로 치료받고, 6개월 동안, 또는 독성 또는 진행이 일어날 때까지 계속 치료받는다. BCMA-CAR-T 세포는 환자 체중 kg당 1x106개 내지 10x106개 세포의 단회 볼루스 용량으로 정맥내로 투여된다.
예상된 결과
피험자에서의 BCMA-CAR-T 세포의 지속 존재, 종양 성장, 전이 등에 기반을 둔 반응 기준에 대해, RARα 작용제 + BCMA-CAR-T 요법을 제공받는 환자를 모니터링한다. 삶의 질 파라미터, 예컨대, 통증, 일상생활의 활동에서의 수행 상태 및 참여, 및 일상생활의 도구적 활동을 평가하여, 연구 환자에 대한 이 요법의 영향을 평가한다. 이 RARα 작용제 + BCMA-CAR-T 요법의 사용은 BCMA 발현 종양을 가진 환자에서 삶의 질 파라미터를 개선하고 질환 진행을 예방할 것으로 예상된다. 추가로, BCMA-CAR-T 요법과 조합된, CYP26 내성을 나타내는 RARα 작용제의 사용은 분화를 야기함으로써, 이 환자의 골수에서 최소 잔류 질환의 제거를 야기할 수 있다.
실시예 11
메소텔린 발현 고형 종양에서 IRX5183 + CAR-변형된 면역 세포의 임상 연구
메소텔린은 메소텔린 유전자에 의해 코딩된 69 KDa 전구체 단백질로부터 유래한 40 KDa 세포 표면 종양 분화 항원이다. 메소텔린의 정상 생물학적 기능은 거의 알려져 있지 않은 상태로 남아있다. 일부 연구는 메소텔린이 CA125/MUC16의 수용체이고 메소텔린-CA125 사이의 상호작용이 세포 부착을 매개하고 난소암의 전이성에서 임계점일 수 있다는 것을 암시한다. 메소텔린 과다발현은 종양 세포 증식 및 국소적 침습을 촉진하고 좋지 않은 예후, 예컨대, 악화된 재발 부재 생존 및 전체 생존과 관련되어 있다. 종양 마커로서, 혈청에서 가용성 메소텔린은 악성 늑막 중피종(MPM) 및 난소암을 가진 환자에 대한 치료 효과를 진단하고 모니터링하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 메소텔린은 늑막, 심막, 복막, 초막을 포함하는 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현되나, MPM, 난소암, 췌장암 및 비-소세포 폐암을 포함하는 다양한 악성종양들에서 과다발현된다. 정상 조직에서의 약한 발현 및 여러 암들에서의 강한 발현으로 인해, 메소텔린은 면역 기반 요법을 위한 매력적인 표적이다.
환자는 비골수제거적 림프구 고갈 전처치를 제공받은 후, 자가 항-메소텔린 CAR 조작된 세포(메소-CAR-T 세포; 문헌(Adusumilli et al., Sci Transl. Med. 6(261):26ra151, 2014)에 개시됨)와 저용량 IV 알데스류킨의 IV 주입을 제공받을 것이다.
T 세포 성장을 자극하기 위해, 백혈구성분채집술에 의해 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양할 것이다. 대략 1x108개 내지 5x108개의 세포들을, 항-메소텔린 CAR을 함유하는 레트로바이러스 상청액에 노출시킴으로써 형질도입을 시작한다. 환자는 사이클로포스프아미드 및 플루다라빈을 포함하는 비골수제거적 림프구 고갈법(5일 동안 30분에 걸쳐 매일 25 mg/m2/일 IVPB 및 1시간에 걸쳐 250 ㎖ D5W 중의 사이클로포스프아미드 60 mg/kg/일 x 2일 IV)을 제공받은 후, 생체외 CAR 유전자-형질도입된 PBMC와 저용량 알데스류킨의 IV 주입(세포를 주입한 지 24시간 이내에 시작하고 최대 15회 용량을 위해 최대 5일 동안 계속되는, 대략 8시간마다(+/- 1시간) 15분에 걸쳐 72,000 IU/kg IV)을 제공받을 것이다.
적격
18세 이상의 환자는 메소텔린을 발현하는 전이성 또는 절제불가능한 암을 가져야 하고, 상기 환자는 이전에 표준 관리를 제공받았고 표준 관리에 대한 비-반응자이었거나 표준 관리 후 재발되었다. 환자는 저용량 알데스류킨 투여에 대한 사용금지사유를 갖지 않을 수 있다.
포함 기준:
Figure pct00096
메소텔린을 발현하는 전이성 또는 절제불가능한 측정가능한 암. 상피 중피종 및 췌장암은 이 종양들 모두가 메소텔린을 발현하는 것으로 밝혀져 있기 때문에 메소텔린 발현에 대해 평가될 필요가 없다. 다른 전이성 또는 절제불가능한 암은 종양 조직에 대한 RT-PCR 또는 면역화학에 의해 평가될 때 메소텔린을 발현하는 것으로 확인되어야 한다. 2상 중피종은 상피 성분 내의 50% 초과의 세포들에서 메소텔린을 발현해야 한다.
Figure pct00097
환자는 해당 질환에 효과적인 것으로 공지되어 있는 경우 전이성 또는 절제불가능한 질환을 위한 적어도 하나의 전신 표준 관리(또는 효과적인 살비지 화학요법)를 이전에 제공받았어야 하고, 비-반응자(진행성 질환)이었거나 재발하였다.
Figure pct00098
18세 이상, 그리고 70세 이하.
Figure pct00099
지속성 위임장에 서명할 의향이 있음.
Figure pct00100
사전동의서를 이해하고 서명할 수 있음.
Figure pct00101
ECOG 0 또는 1의 임상 수행 상태.
Figure pct00102
여성 환자 및 남성 환자 둘 다가 이 연구에 등록할 때부터 치료 후 최대 4개월 동안 피임을 실시할 의향이 있어야 한다.
Figure pct00103
혈청학:
o HIV 항체에 대한 혈청음성.
o B형 간염 항원에 대한 혈청음성 및 C형 간염 항체에 대한 혈청음성. C형 간염 항체 시험이 양성인 경우, 환자는 RT-PCR에 의해 항원의 존재에 대해 시험받아야 하고 HCV RNA 음성이어야 한다.
Figure pct00104
가임 여성은 태아에 대한 치료의 잠재적 위험 효과 때문에 음성 임신 시험을 받아야 한다.
Figure pct00105
혈액학:
o 필그라스팀의 뒷받침 없이 1000/mm3 초과의 절대 호중구 카운트.
o WBC(>3000/mm3).
o 100,000/mm3 초과의 혈소판 카운트.
o 8.0 g/dl 초과의 헤모글로빈.
Figure pct00106
화학:
o 정상의 상한의 2.5배 이하의 혈청 ALT/AST.
o 1.6 mg/dl 이하의 혈청 크레아티닌.
o 3.0 mg/dl 미만의 총 빌리루빈을 가져야 하는, 길버트 증후군을 가진 환자를 제외하고, 1.5 mg/dl 이하의 총 빌리루빈.
Figure pct00107
환자가 전처치를 제공받을 때 임의의 선행 전신 요법 이후 4주 초과의 시간이 경과되었어야 하고, (탈모 또는 백반증과 같은 독성을 제외한) 환자의 독성이 1 이하의 등급까지 회복되었어야 한다.
배제 기준:
Figure pct00108
육종성 중피종을 가진 환자.
Figure pct00109
임신중이거나 수유중인 가임 여성.
Figure pct00110
공지된 뇌 전이를 가진 환자.
Figure pct00111
전체 용량 항응고 요법을 제공받는 환자.
Figure pct00112
활성 전신 감염(예를 들면, 항감염 치료를 요구함), 응고 장애 또는 임의의 다른 주요 의학적 질병.
Figure pct00113
임의의 형태의 일차 면역결핍.
Figure pct00114
동시 기회 감염.
Figure pct00115
당뇨병성 망막병증을 가진 환자.
Figure pct00116
동시 전신 스테로이드 요법.
Figure pct00117
이 연구에 사용된 물질들 중 임의의 물질에 대한 중증 즉시 과다민감성 반응의 이력.
Figure pct00118
관상 재혈관형성 또는 허혈성 상태의 이력.
Figure pct00119
하기 심방 및/또는 심실 부정맥, 또는 연령을 가진 환자에서 시험된 45% 이하의 기록된 LVEF:
o 심방 세동, 심실 빈맥, 제2도 또는 제3도 심차단, 흉부 통증 또는 허혈성 심장 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임상적으로 유의미한 심방 및/또는 심실 부정맥.
o 60세 이상의 연령.
Figure pct00120
하기 이력 또는 증상을 가진 환자에서 시험된 예측된 50% 이하의 기록된 FEV1:
o 연장된 담배 흡연 이력(과거 2년 이내에 20 pk/년의 흡연).
o 호흡 기능장애의 증상.
Figure pct00121
임의의 다른 임상시험 물질을 제공받는 환자.
컨디셔닝 화학요법은 D-7일째 날 내지 D-2일째 날 1회 3000 mg/m2 IV의 사이클로포스프아미드, 또는 마지막 날이 D-7일째 날 내지 D-2일째 날에 존재하는 저강도 cy/flu(사이클로포스프아미드 300 mg/m2/일 x 3 + 플루다라빈 30 mg/m2/일 x 3)을 포함한다.
본 연구는 15 내지 75 mg/m2/일의 범위 내에서 2회 용량의 IRX5183을 사용하고(실시예 6에서의 임상 시험의 결과를 기반으로 이 범위를 좁힐 수 있음) 3개의 별개의 아암들, 즉 메소-CAR-T 세포만을 제공받는 환자에 대한 아암(군 1), 및 IRX5183 용량 1(군 2) 및 IRX5183 용량 2(군 3)로 IRX5183 및 메소-CAR-T 세포 둘 다를 제공받는 환자에 대한 아암을 포함하고, 이 2개의 아암들 각각은 26명의 환자들을 동원할 것이다.
군 1 환자는 컨디셔닝 화학요법 후 DO일째 날부터 시작하는 단회 볼루스 용량으로 환자 체중 kg당 1x106개 내지 10x106개 세포의 용량으로 정맥내로 메소-CAR-T로 치료받는다.
군 2 및 3 환자는 메소-CAR-T 세포를 시작하기 전 30일 동안 매일 IRX5183으로 치료받고, 6개월 동안, 또는 독성 또는 진행이 일어날 때까지 계속 치료받는다. 메소-CAR-T 세포는 환자 체중 kg당 1x106개 내지 10x106개 세포의 단회 볼루스 용량으로 정맥내로 투여된다.
예상된 결과
피험자에서의 메소-CAR-T 세포의 지속 존재, 종양 성장, 전이 등에 기반을 둔 반응 기준에 대해, RARα 작용제 + 메소-CAR-T 요법을 제공받는 환자를 모니터링한다. 삶의 질 파라미터, 예컨대, 통증, 일상생활의 활동에서의 수행 상태 및 참여, 및 일상생활의 도구적 활동을 평가하여, 연구 환자에 대한 이 요법의 영향을 평가한다. 이 RARα 작용제 + 메소-CAR-T 요법의 사용은 메소 발현 종양을 가진 환자에서 삶의 질 파라미터를 개선하고 질환 진행을 예방할 것으로 예상된다. 추가로, 메소-CAR-T 요법과 조합된, CYP26 내성을 나타내는 RARα 작용제의 사용은 분화를 야기함으로써, 이 환자의 골수에서 최소 잔류 질환의 제거를 야기할 수 있다.
실시예 12
폐암에서 IRX5183 + CAR-변형된 면역 세포 + 표적화된 면역요법의 임상 연구
포함 기준 및 실험 디자인은 다음과 같이 실질적으로 실시예 9에 기재된 바와 같을 것이다:
Figure pct00122
군 1 메소-CAR-T
Figure pct00123
군 2 IRX5183(실시예 9에서 확립된 최적 용량) + 메소-CAR-T
Figure pct00124
군 3 메소-CAR-T + PD-1 억제
Figure pct00125
군 4 IRX5193 + 메소-CAR-T + PD-1 억제
투약, 병용 약물, 및 결과의 평가는 실시예 9에 기재된 바와 같을 것이다.
실시예 13
CAR-변형된 T 세포의 제조에 있어서 IRX5183의 용도
환자의 말초 혈액으로부터 자가 T 림프구를 정제하고 피더(feeder) 세포(예컨대, 자가 항원 제시 세포) 및 성장 인자, 예컨대, IL-2와 함께 배양한다.
활성화 과정 동안, T 세포를 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터와 함께 배양하고, 수일 후, 상기 벡터를 희석 및/또는 배지 교체로 배양물로부터 세척하여 제거한다. 바이러스 벡터는 바이러스 기구를 이용하여 환자 세포에 부착하고, 세포 내로의 도입 시, 상기 벡터는 RNA의 형태로 유전 물질을 도입한다. CAR T 세포 요법의 경우, 이 유전 물질은 CAR을 코딩한다. RNA는 DNA로 역전사되고 환자 세포의 게놈 내로 영구적으로 삽입되므로; 세포가 생물반응기에서 분열하고 큰 수까지 생장할 때 CAR 발현은 유지된다. 그 후, CAR은 환자 세포에 의해 전사되고 번역되고, CAR은 세포 표면에서 발현된다. 감마레트로바이러스 벡터보다 더 안전한 삽입 부위 프로파일을 가진 렌티바이러스 벡터는 CAR T 세포 요법의 임상 시험에서 통상적으로 사용된다.
그 후, 형질도입된 세포를, 다회 라운드의 CAR-T 요법을 위해 요구된 수까지 배양한다. 향후 사용을 위해 배양 세포를 냉동보존할 수 있다.
RARα 작용제는 CAR 표현형의 성장 및 유지를 용이하게 하기 위해 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 전 및/또는 후에 배양물에 포함된다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 성분, 성질, 예컨대, 분자량, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 10% 내지 15% 이내, 바람직하게는 5% 내지 10% 이내를 의미한다. 따라서, 반대로 표시되어 있지 않은 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터들은 본 발명에 의해 수득되고자 하는 원하는 성질에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구범위에의 균등론의 적용을 한정하기 위한 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 고려하여 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 범위를 기재하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 정확히 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 반드시 그들 각각의 시험 측정치에서 발견된 표준 편차로부터 비롯된 일부 오차를 본질적으로 함유한다.
본원에서 달리 표시되어 있지 않거나 문맥에 의해 명확히 부인되지 않은 한, 본 발명을 기술하는 상황(특히 하기 청구범위를 기술하는 상황에서) 사용된 단수형 용어 및 유사한 지시대상은 단수 및 복수 둘 다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약칭 방법으로서 기여하기 위한 것이다. 본원에서 달리 표시되어 있지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급되어 있는 것처럼 본 명세서 내로 도입된다. 본원에서 달리 표시되어 있지 않거나 문맥에 의해 달리 명확히 부인되지 않은 한, 본원에 기재된 모든 방법들은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 실시예들 또는 예시적 용어(예를 들면, "예컨대")의 사용은 오로지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이고 다른 방식으로 청구된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 용어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 표시하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 실시양태의 군은 한정으로서 간주되어서는 안 된다. 각각의 군 구성원은 개별적으로, 또는 본원에서 발견된 군의 다른 구성원 또는 다른 요소와 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 군에 포함될 수 있거나 군으로부터 결실될 수 있을 것으로 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 일어날 때, 본 명세서는 변형된 군을 함유함으로써, 첨부된 청구범위에서 사용된 모든 마쿠쉬 군의 작성된 설명을 충족시키는 것으로 간주된다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 공지되어 있는 가장 우수한 방식을 포함하는 본 발명의 일부 실시양태들이 본원에 기재되어 있다. 당연히, 이 기재된 실시양태들의 변경은 상기 설명을 읽을 때 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명해질 것이다. 본 발명자들은 숙련된 당업자가 적절한 경우 이러한 변경을 이용할 것이라고 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 방식과 다른 방식으로 실시될 것이라고 생각한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용될 때 본 명세서에 첨부된 청구범위에서 언급된 보호대상의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 나아가, 본원에서 달리 표시되어 있지 않거나 문맥에 의해 달리 명확히 부인되지 않은 한, 전술된 요소들의 임의의 조합은 이들의 모든 가능한 변경으로 본 발명에 의해 포괄된다.
본원에 개시된 특정 실시양태들은 "로 구성된" 또는 "로 본질적으로 구성된"이라는 용어를 사용함으로써 청구범위에서 더 한정될 수 있다. 청구범위에서 사용될 때, 출원될 때 존재하였든 아니면 보정에 의해 추가되었든, 전이 용어 "로 구성된"은 청구범위에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전이 용어 "로 본질적으로 구성된"은 청구범위를 특정된 물질 또는 단계, 및 기본 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계로 한정한다. 청구된 본 발명의 실시양태는 본원에 본질적으로 또는 명시적으로 기재되어 있고 실시될 수 있다.
나아가, 본 명세서 전체에 걸쳐 특허 및 인쇄된 공개문헌이 다수 인용되어 있다. 상기 인용된 참고문헌 및 인쇄된 공개문헌 각각은 전체로서 본원에 개별적으로 참고로 도입된다.
마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 실시양태들은 본 발명의 원리를 예시한다는 것을 이해해야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 한정이 아닌 예로써, 본 발명의 대안적 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 정확히 제시되고 기재된 발명으로 한정되지 않는다.

Claims (32)

  1. 키메라 항원 수용체-변형된 면역 세포(CAR-MIC) 및 면역조절 레티노이드 활성 제제 및/또는 렉시노이드 활성 제제(RAR/RXR 활성 제제), 및 분화 RAR 활성 제제를, 암 면역요법을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 면역요법의 방법.
  2. 제1항에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 레티노산 수용체(RAR) 활성 제제를 포함하는 암 면역요법의 방법.
  3. 제1항에 있어서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제가 레티노이드 X 수용체(RXR) 활성 제제를 포함하는 암 면역요법의 방법.
  4. 제2항에 있어서, 면역조절 RAR 활성 제제가 RARα 길항제인 암 면역요법의 방법.
  5. 제1항에 있어서, 2개의 면역조절 RAR 활성 제제들을 투여하는 단계를 포함하는 암 면역요법의 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제1 면역조절 RAR 활성 제제가 RARα 선택적 길항제이고, 제2 면역조절 RAR 활성 제제가 RARγ 작용제이거나, 또는 제1 면역조절 RAR 활성 제제가 RARα 길항제이고, 제2 면역조절 RAR 활성 제제가 RARγ 선택적 작용제인 암 면역요법의 방법.
  7. 제4항에 있어서, RARα 길항제가 하기 화학식 (I)의 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00126

    상기 식에서, R1, R2, R3 및 R6은 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 C(CH3)2, O, S 또는 NR7이고, 여기서 R7은 H 또는 C1-6 알킬이고; X1은 H 또는 할로겐, 예컨대, F, Cl 또는 Br이고; R8은 H 또는 OH이다.
  8. 제7항에 있어서, RARα 길항제가 하기 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00127
  9. 제4항에 있어서, RARα 길항제가 하기 화학식 (II)의 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00128

    상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 C1-6 알킬이고; X는 O, S 또는 CH2이고; Y는 O, S, CH2 또는 NR3이고, 여기서 R3은 C1-6 알킬이고; Z는 Cl 또는 Br이고; W는 H 또는 OH이고; U는 독립적으로 H 또는 F이다.
  10. 제9항에 있어서, RARα 길항제가 하기 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00129
  11. 제4항에 있어서, RARα 길항제가 하기 화학식 (III)의 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00130

    상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; Ar은 페닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴 또는 나프틸이고; X는 O, S, N 또는 CH2이고; W는 H 또는 OH이고; Z는 Cl 또는 Br이다.
  12. 제4항에 있어서, RARα 길항제가 하기 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00131
  13. 제4항에 있어서, RARα 길항제가 BMS185411, BMS614, Ro41-5253 또는 Ro46-5471인 암 면역요법의 방법.
  14. 제2항에 있어서, 면역조절 RAR 활성 제제가 RARγ 작용제인 암 면역요법의 방법.
  15. 제14항에 있어서, RARγ 작용제가 하기 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00132
  16. 제14항에 있어서, 면역조절 RAR 작용제가 하기 화학식 (IV)의 RARγ 작용제인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00133

    상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고; R3은 H 또는 F이고; X는 O, S, CH2, C(R4)2 또는 NR5이고, 여기서 R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이다.
  17. 제14항에 있어서, RAR 작용제가 CD437, CD2325, CD666 및 BMS961로부터 선택된 RARγ 선택적 작용제인 암 면역요법의 방법.
  18. 제3항에 있어서, 면역조절 RXR 활성 제제가 RXR 길항제인 암 면역요법의 방법.
  19. 제18항에 있어서, RXR 길항제가 하기 화합물들로부터 선택된 것인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00134
  20. 제18항에 있어서, RXR 길항제가 AGN195393, 또는 LGN100849인 암 면역요법의 방법.
  21. 제1항에 있어서, 분화 RAR 활성 제제가 RARα 작용제인 암 면역요법의 방법.
  22. 제21항에 있어서, RARα 작용제가 하기 화학식 (V)의 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00135

    상기 식에서, R1은 H 또는 C1-6 알킬이고; R2 및 R3은 독립적으로 H 또는 F이고; R4는 할로겐이다.
  23. 제22항에 있어서, RARα 작용제가 하기 화학식 (VI)의 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00136

    상기 식에서, R1은 H 또는 C1-6 알킬이다.
  24. 제23항에 있어서, RARα 작용제가 하기 화학식 (VII)의 화합물인 암 면역요법의 방법:
    Figure pct00137
  25. 제1항에 있어서, 추가적으로 적어도 하나의 암 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는 암 면역요법의 방법.
  26. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 암 면역요법의 방법.
  27. 제26항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG-3, PD-L1 리간드, B7-H3, B7-H4, BTLA 중 적어도 하나의 억제제이거나, 또는 ICOS 또는 OX40 작용제인 암 면역요법의 방법.
  28. 제26항에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG-3, PD-L1 리간드, B7-H3, B7-H4, BTLA, ICOS 또는 OX40 중 적어도 하나에 특이적인 항체인 암 면역요법의 방법.
  29. 암 환자의 무질환 생존을 연장시키는 방법으로서, CAR-변형된 면역 세포, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제, 및 분화 RAR 활성 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  30. CAR-변형된 면역 세포의 독성을 감소시키는 방법으로서, 조합의 결과로서, CAR-변형된 면역 세포가 단독으로 투여된 경우보다 더 낮은 용량의 CAR-변형된 면역 세포가 더 안전하게 및 동등하게 효과적으로 투여되거나; 또는 더 높은 용량의 CAR-MIC가 더 큰 효능 및 동등한 안전성으로 투여될 수 있도록, CAR-변형된 면역 세포와 조합된 면역조절 RAR/RXR 활성 제제 및 분화 RAR 활성 제제를, 이러한 독성의 감소를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  31. CAR-MIC 암 면역요법을 증강시키는 방법으로서, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제, 및 분화 RAR 활성 제제를, CAR-MIC를 제공받고 있거나, 제공받았거나 또는 제공받도록 예정된 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 키메라 항원 수용체(CAR)-변형된 면역 세포, 면역조절 RAR/RXR 활성 제제, 분화 RAR 활성 제제 및 적어도 하나의 면역 체크포인트 억제제를, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
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