KR20200033320A - 인간 모유 올리고당을 생산하기 위한 미생물 - Google Patents

Abstract

인간 모유 올리고당 (HMO)은 예를 들어 유아 영양, 임상 영양, 기능성 식품 및 동물 사료에 기능성 성분으로 사용될 수 있다. HMO를 생산하기 위한 개선된 수단이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 HMO 생산을 개선하기 위한 유전자 변형 미생물 및 이를 이용한 HMO 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 미생물은, 세포내 및 세포외 HMO의 용이한 추출을 가능하게 하는 유도성 세포용해 시스템, 세포내 락토스 수준을 높일 수 있는 락토스 퍼미아제 돌연변이, 또는 HMO 생산의 주 효소의 세포내 이용성을 높일 수 있는 샤페론을 비롯하여, 하나 이상의 수율-강화 변형을 포함할 수 있다.

Description

인간 모유 올리고당을 생산하기 위한 미생물

본 발명은 인간 모유 올리고당 (human milk oligosaccharide, HMO)을 생산하기 위한 유전자 변형 미생물 및 상기한 미생물을 이용한 HMO 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 미생물이 배양된 배지, 본 발명의 생산 방법에 의해 제조되는 정제된 HMO 및 상기한 배지 및 HMO의 용도에 관한 것이다.

인간 모유 올리고당 (HMO)은 인간 모유에서 발견되는 구조적으로 다양한 비-접합 글리칸이다. 지금까지 200종 이상의 HMO들이 동정되었으며, 이들 모두, 락토스 모이어티에 커플링된, 5종의 단당류 빌딩 블럭, 즉 D-갈락토스 (Gal), D-글루코스 (Glc), N-아세틸-D-글루코사민 (GlcNAc), L-푸코스 (Fuc) 및 시알산 유도체 N-아세틸-뉴라민산으로만 구성된다 (Petschacher and Nidetzky, J Biotechnol. 2016, 235:61-83). 환원성 말단은 락토스이거나, 또는 2가지 구조 타입, 즉, 락토-N-바이오스 (Gal-β1,3-GlcNAc, 타입 I) 또는 락토스아민 (Gal-β1,4-GlcNAc, 타입 II, LacNAc)의 이당류 유닛 수개에 의해 연장된 락토스일 수 있다. HNO의 구조 및 분류는 예를 들어 상기한 Petschacher and Nidetzky, 2016 문헌의 도 1 및 표 1에서 확인할 수 있다.

HMO 중에서도, 2'-푸코실락토스 (2-FL)가 가장 많이 존재하며, 전체 HMO의 약 30%를 차지한다. 다른 지배적인 HMO는 3'-푸코실락토스 (3-FL)이다. 또 다른 HMO는 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스 및 락토-N-푸코펜타오스 I이다. 이러한 중성 HMO 외에도, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스 및 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 다이시알릴-락토-N-테트라오스와 같은 산성 HMO도 인간 모유에서 발견할 수 있다. HMO는 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 장 병원성 E. coli 및 엔트아메바 히스톨리타 (Entamoeba histolytica)와 같은 병원체로부터 보호하는 것으로 알려져 있다 (Bode, Early Hum Dev. 2015; 91(11):619-22). 2-FL은 독소 및 병원체의 상피 수준에서 부착을 방지함으로써 감염성 질환으로부터 보호하는 능력을 가진 것으로 보인다. 이는, 유아에서 유병률이 가장 높은 독성 및 병원성 챌린지로부터 보호하는 특정 비피도박테리아 및 리셉터 유사체 (receptor analogon)의 증식을 자극한다. 이러한 사실을 기반으로, HMO, 특히 2-FL 및 3-FL은 임상 영양을 넘어선 소아 영양 (infant nutrition)에서 기능성 식품 및 동물 사료 범위에 이르는 제품에서 기능성 성분으로서의 사용에 특히 흥미롭다.

HMO는 인간 모유 또는 소 우유로부터 추출할 수 있다. 그러나, 이들 경우 모두, 대량 수득하거나 및/또는 만족할만한 순도를 확보하기 어렵다.

HMO는 또한 화학적으로 합성할 순 있지만, 기술이 탄탄하지 않으며, HMO 화학 합성 단가가 높다.

한편, 유전자 변형 미생물에서 HMO 생산은 적은 비용으로 안정적이고 안전한 생산하는 수단을 제공할 가능성을 보장한다. US 7,521,212에는, lacZ 유전자의 불활성화를 수반하는, 유전자 변형된 E. coli 세포에 의해 전구체 락토스로부터 올리고당을 생산하는 방법이 언급되어 있다. EP 2 675 899, EP 2 877 574, EP 2 440 661 및 EP 3 191 499에는, 또한 유전자 변형 미생물에서 2-FL 또는 3-FL을 생산하기 위한 여러가지 푸코실트랜스퍼라제들이 언급되어 있다. Huang et al., 2017에는 유전자 변형된 E. coli (Escherichia coli)에서 2-FL 또는 3-FL 생합성 및 이의 다중 모듈 최적화 전략이 언급되어 있다 (Huang et al., Metab Eng. 2017; (41):23-38). EP 2 440 661에는 2-FL의 배지내 분비를 높이기 위한 E. coli 발현성 당 엑스포터 (sugar exporter)들이 언급되어 있다.

2-FL은 락토스와 푸코스로 구성된다 (Pereira & McDonald, Sci Rep. 2012; 84(1):637-655). E. coli에서 2-(3-)-FL 생합성 경로는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. E. coli는 전구체 글루코스와 락토스를 특이적인 트랜스포터를 통해 세포 내로 도입할 수 있다. 글루코스는 포스포트랜스퍼라제 시스템을 통해 흡수되어, 글루코스-6-포스페이트로 변환된다. 글루코스-6-포스페이트는 증식하기 위한 탄소원 및 에너지로서, 그리고 콜라닌산 생합성의 중간물질인 GDP-L-푸코스의 전구체로서 사용된다. GDP-L-푸코스의 데 노보 생합성 경로는 당분해 중간산물 프럭토스 6-포스페이트로부터 파생되며, 이는 효소 ManA (만노스 6-포스페이트 이소머라제), ManB (포스포만노-뮤타제), GTP-의존적인 ManC (만노스 1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제), Gmd (GDP-D-만노스 4,6-데하이드라타제) 및 NADPH-의존적인 WcaG (GDP-L-푸코스 신타제)에 기반하며, 이들 모두 E. coli로부터 유래된 효소이다 (도 2). 제2 전구체 락토스는 락토스 퍼미아제 LacY, 락토스/H⁺-심포터 (symporter)를 통해 세포로 흡수된다. 2-FL 생산의 주요 효소는, 도너 GDP-L-푸코스의 푸코스 부분을 어셉터 락토스에 전달하여 2-FL을 만드는, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)로부터 유래되는, α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 (FutC)이다 (도 2). futC 유전자를 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 헬리코박터 필로리 유래 futA 유전자로 치환함으로써, 생합성 경로를 이용해 3'-푸코실락토스를 생산할 수 있다.

최근 진보에도 불구하고, 유전자 변형 미생물에서 HMO, 특히 2-FL 및/또는 3-FL의 개선된 생물공학적 생산 방법이 여전히 요구되고 있다. 본 발명에서는, E. coli에서 공지된 2-FL 생합성 경로를 통해, HMO 합성 및 이의 배지로의 분비를 현저하게 개선한다.

본 발명은 개선된 HMO 생산 미생물 및 이를 이용한 HMO 생산 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은, 세포내 및 세포외 HMO를 동시에 쉽게 추출할 수 있으며, 세포내 분획을 수득하기 위한 추가적인 처리 단계가 필요없는, 유도성 세포용해 시스템 (inducible lysis system)을 포함하는 미생물을 제공한다. 유도성 세포용해 시스템에 대한 바람직한 예는, 세포가 Mg^{2 +}-고갈 조건, 즉 세포외 Mg^{2 +} 농도가 특정 역치 값 미만일 때 세포용해되는, Mg^{2 +}-조절되는 자가-유발성 세포용해 시스템이다. 세포의 세포용해시, 세포내 HMO는 세포 배양하는 배지로 분비될 수 있으며, 이로써 배지내 HMO 농도는 증가한다. 이에 유익하게는 HMO 수율 증가뿐 아니라 시간 및 비용 절감을 달성할 수 있다.

또한, 본 발명은 락토스 퍼미아제를 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 미생물을 제공한다. 락토스 퍼미아제는, 바람직하게는, 야생형 LacY와 비교해 세포내 락토스에 의해 저해되는 경향이 거의 없는, LacY의 돌연변이이다. 이는 유익하게는 HMO의 수율 증가를 달성할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 미생물을 이용한 HMO 생산 방법을 제공한다.

HMO 생산 방법으로 본 발명의 미생물을 배양한 배지, 및 본 발명의 HMO 생산 방법에 의해 수득한 정제된 HMO를 또한 제공한다.

바람직한 구현예들 :

1. 인간 모유 올리고당을 생산하기 위한 유전자 변형 미생물.

2. 미생물이 박테리아인, 항목 1에 따른 유전자 변형 미생물.

3. 미생물이 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli, E. coli)인 항목 1 또는 2에 따른 유전자 변형 미생물.

4. 미생물이 유도성 세포용해 시스템 (inducible lysis system)을 포함하는, 항목 1-3 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

5. 유도성 세포용해 시스템이 자가-유도성 (auto-inducible)인, 항목 4에 따른 유전자 변형 미생물.

6. 유도성 세포용해 시스템이 Mg^{2 +}-조절되는, 항목 4 또는 5에 따른 유전자 변형 미생물.

7. 유도성 세포용해 시스템이 외인성 유리 Mg^{2 +} 농도에 의해 조절되는, 항목 4-6 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

8. 미생물이 Mg^{2 +}-조절성 프로모터를 포함하는, 항목 4-7 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

9. Mg^{2 +}-조절성 프로모터가 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)의 mgtB 유전자 유래 Pmgt 프로모터 또는 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli)의 PmgtA 프로모터인, 항목 8에 따른 유전자 변형 미생물.

10. 미생물이 부가적인 Mg^{2 +}-조절성 인자, 바람직하게는 에세리키아 콜라이의 mgtA 유전자의 5'UTR을 더 포함하는, 항목 8 또는 9에 따른 유전자 변형 미생물.

11. 미생물이 세포용해 유전자를 포함하는, 항목 4-10 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

12. 세포용해 유전자가 박테리오파지 유래 세포용해 유전자인, 항목 11에 따른 유전자 변형 미생물.

13. 박테리오파지가 λ 박테리오파지인, 항목 12에 따른 유전자 변형 미생물.

14. 세포용해 유전자가 λ 박테리오파지의 세포용해 유전자 SRRz 또는 λ 박테리오파지 돌연변이 Sam7 세포용해 유전자인, 항목 13에 따른 유전자 변형 미생물.

15. 세포용해 유전자가 유리 Mg^{2 +}-고갈 조건에서 유도가능하게 발현되는, 항목 11-14 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

16. 미생물이 Mg^{2 +}-조절성 프로모터 및 세포용해 유전자를 포함하고, 세포용해 유전자(들)의 발현이 Mg^{2 +}-조절성 프로모터에 의해, 선택적으로 부가적인 Mg^{2 +}-조절성 인자에 의해 제어되는, 항목 4-15 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

17. 미생물이 락토스를 글루코스 및 갈락토스로 절단할 수 없는, 항목 1-16 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

18. lac 오페론이 바람직하게는 결손에 의해 불활성화된, 항목 1-17 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

19. 미생물이 락토스 퍼미아제를 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는, 항목 1-18 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

20. 락토스 퍼미아제가 E. coli LacY 단백질인, 항목 19에 따른 유전자 변형 미생물.

21. 락토스 퍼미아제가 A198V 및/또는 S209I 돌연변이를 포함하는, 항목 19 또는 20에 따른 유전자 변형 미생물.

22. 인간 모유 올리고당이 2'-푸코실락토스 및/또는 3'-푸코실락토스인, 항목 1-20 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

23. 미생물이 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는, 항목 1-22 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

24. 푸코실트랜스퍼라제가 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제인, 항목 23에 따른 유전자 변형 미생물.

25. 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 이종의 유전자이거나, 및/또는 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 이종의 프로모터에 의해 구동되는, 항목 23 또는 24에 따른 유전자 변형 미생물.

26. 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 미생물에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 항목 23-25 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

27. 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)의 futC 또는 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)의 futA인, 항목 23-26 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

28. 미생물이 샤페론을 코딩하는 이종의 유전자를 포함하는, 항목 1-27 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

29. 샤페론이 인간 Hsp70인, 항목 28에 따른 유전자 변형 미생물.

30. 미생물이, GDP-L-푸코스 데 노보 합성에 참여하는 유전자의 발현을 높이는, 전사 조절 단백질을 과다 발현하는, 항목 1-29 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

31. rcsA 유전자가 과다 발현되는, 항목 1-30 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

32. rcsA 유전자가 E. coli로부터 유래된, 항목 30 또는 31에 따른 유전자 변형 미생물.

33. Lon 프로테아제 패밀리 단백질을 코딩하는 유전자가 바람직하게는 결손에 의해 불활성화된, 항목 1-32 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

34. Lon 프로테아제 패밀리 단백질이 E. coli Lon 프로테아제인, 항목 33에 따른 유전자 변형 미생물.

35. wcaJ 유전자가 바람직하게는 결손에 의해 불활성화된, 항목 1-34 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

36. zwf 유전자 및 2종의 pntAB 유전자가 과다 발현되는, 항목 1-35 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

37. zwf 유전자 및 pntAB 유전자가 E. coli로부터 유래되는, 항목 36에 따른 유전자 변형 미생물.

38. gsk 유전자가 과다 발현되는, 항목 1-37 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

39. gsk 유전자가 E. coli로부터 유래되는, 항목 38에 따른 유전자 변형 미생물.

40. trxA 유전자가 과다 발현되는, 항목 1-39 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

41. trxA 유전자가 E. coli로부터 유래되는, 항목 39에 따른 유전자 변형 미생물.

42. trxB 유전자가 바람직하게는 결손에 의해 불활성화된, 항목 1-41 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물.

43. (a) 항목 1-42 중 어느 하나에 따른 유전자 변형 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

44. 배지가 락토스를 더 포함하는, 항목 43에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

45. 배지가 유리 Mg^{2 +}를 더 포함하는, 항목 43 또는 44에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

46. 배양 개시 전 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도가 5 mM 이상인, 항목 45에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

47. 배양 종료시 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도가 10 μM 이하인, 항목 45 또는 46에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

48. 배양이 배치 배양으로, 선택적으로 피드-배치 배양으로 수행되는, 항목 43-47 중 어느 하나에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

49. 배양 부피가 10L 이상, 바람직하게는 100L 이상인, 항목 43-48 중 어느 하나에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

50. 배양 종료시 배지내 인간 모유 올리고당의 농도가 적어도 15 g/L, 바람직하게는 적어도 20 g/L인, 항목 43-49 중 어느 하나에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

51. 인간 모유 올리고당이 2'-푸코실락토스 및/또는 3'-푸코실락토스인, 항목 43-50 중 어느 하나에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

52. (b) 배양 배지 및/또는 미생물 자체로부터 인간 모유 올리고당을 정제하는 단계를 더 포함하는, 항목 43-51 중 어느 하나에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

53. 세포용해가 유도성 세포용해 시스템을 통해 유도된 후 배양 배지로부터 인간 모유 올리고당을 정제하는, 항목 52에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

54. 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도가 10 μM 이하이거나 및/또는 세포용해를 직접 가시화할 수 있을 시점에 배양 배지로부터 인간 모유 올리고당을 정제하는, 항목 52 또는 53에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

55. 세포용해가 배양물의 OD₆₀₀ 값 하락시 직접 가시화될 수 있는, 항목 54에 따른 인간 모유 올리고당의 생산 방법.

56. 항목 43-51 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 배지.

57. 항목 52-55 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 모유 올리고당.

58. 동물 사료 제조를 위한, 항목 56에 따른 배지 또는 항목 57에 따른 인간 모유 올리고당의 용도.

도 1: 에세리키아 콜라이에서의 2'-(3')-푸코실락토스의 생합성. Glc-6-P: 글루코스 6-포스페이트; Fru-6-P: 프럭토스 6-포스페이트; Man-6-P: 만노스 6-포스페이트; 6-P-Gluc: 6-포스포-글루코네이트; Ribu-5-P: 리불로스-5-포스페이트; Ribo-5-P: 리보스-5-포스페이트; PPP: 포스포리보실-피로포스페이트; gal: 갈락토스; glc: 글루코스; XMP: 잔토신 5'-모노포스페이트; IMP: 이노신-5-모노포스페이트; Pgi: 포스포글루코스-이소머라제; ManA: 만노스 6-포스페이트 이소머라제; ManB: 포스포만노 뮤타제; ManC: α-D-만노스 1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제; Gmd: GDP-만노스 6-데하이드로게나제; WcaG: GDP-L-푸코스 신타제; WcaJ: UDP-글루코스 캐리어 트랜스퍼라제; Wca A-F, I-M: 콜라닌산 생합성 유전자; LacA: β-갈락토시드-트랜스아세틸라제; LacZ: β-갈락토시다제; LacY: 락토스 퍼미아제; Lon: 프로테아제; ClpYQ (HslUV): 프로테아제; RscA: 파지티브 전사 조절인자 (positive transcription regulator); guaA: GMP-신테타제; GuaB: IMP-데하이드로게나제; GuaC: GMP-리덕타제; DeoD: 퓨린 뉴클레오티드 포스포릴라제; Gpt: 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제; Gnd: 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제; Ndk: 뉴클레오티드 다이포스페이트-키나제.
도 2: pETDuet-1. 더블 T7-프로모터 (P_T7), T7-종결인자 (T_T7), ColE1 ori, 암피실린 내성 유전자 (ampR), lac 억제인자 (lacI)를 포함하는 E. coli 발현 벡터.
도 3: pET-manCB-gmd-wcaG. 더블 T7-프로모터 (P_T7), T7-종결인자 (T_T7), pBR322 ori, 암피실린 내성 유전자 (ampR) 및 lac 억제인자 (lacI), manB: 포스포만노-뮤타제, manC: α-D-만노스 1-포스페이트 구아닐릴 트랜스퍼라제, gmd: GDP-만노스 6-데하이드로게나제; wcaG: GDP-L-푸코스 신타제를 포함하는 E. coli pETDuet-1.
도 4: pCDFDuet-1. 더블 T7-프로모터 (P_T7), T7-종결인자 (T_T7), CloDF13 ori, 스트렙토마이신 내성 유전자 (SmR), lac 억제인자 (lacI)를 포함하는 E. coli 발현 벡터.
도 5: pUC19. 암피실린 내성 유전자 (AmpR), lacZ alpha 펩타이드 (lacZ '), ori를 포함하는 E. coli 클로닝 벡터.
도 6: pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz. E. coli pCDFDuet-1 더블 T7-프로모터 (P_T7), T7-종결인자 (T_T7), CloDF13 ori, 스트렙토마이신 내성 유전자 (SmR) 및 lac 억제인자 (lacI). futC: alpha-1,2-푸코실트랜스퍼라제, lacY*: S209I를 포함하는 락토스 퍼미아제, hHSP70: 인간 열 충격 단백질 70, trxA: 티오레독신, SRRz: mtgA-프로모터의 제어 하 λ 박테리오파지 유래 세포용해 유전자, + 5'-UTR 및 3'- LuxICDABEG 종결인자.
도 7: pCOLADuet-1. 더블 T7-프로모터 (P_T7), T7-종결인자 (T_T7), ColA ori, 카나마이신 내성 유전자 (KmR) 및 lac 억제인자 (lacI)를 포함하는 E. coli 발현 벡터.
도 8: pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsk. E. coli pCOLADuet-1 더블 T7-프로모터 (P_T7), T7-종결인자 (T_T7), ColA ori, 카나마이신 내성 유전자 (KmR) 및 lac 억제인자 (lacI). pntAB: 막-결합형 트랜스하이드로게나제, rcsA: 콜라닌산 생합성의 파지티브 전사 조절인자, zwf: 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제, gsk: 구아노신 이노신 키나제.

정의 및 일반 기술

달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.

"포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 용어는, 이들 용어가 선택적으로 각각 용어 "로 이루어진다" 및 "로 이루어진"으로 치환가능하게 사용된다.

"가진다" 또는 "비롯하여"와 같은 용어는, 이들 용어가 선택적으로 각각 용어 "로 이루어진다" 및 "로 이루어진"으로 치환가능하게 사용된다.

용어 "유전자 변형된"은 임의 변형이 세포의 유전 물질에 대해 세포로 도입된 것을 의미한다. 이는 새로운 유전 물질의 도입, 유전 물질의 결손, 유전 물질의 돌연변이 등을 포함할 수 있다.

용어 "유도성 세포용해 시스템"은 외부 자극에 의해 세포 용해가 유도될 수 있는 것을 의미한다. "자가 유도성"은 외부 자극이 본 발명을 수행하는 당업자에 의해 적극적으로 인가될 필요가 없다는 것을 의미한다.

용어 "외부 자극들" 또는 "외부 자극"은 외부로부터 세포에 부여되는 화학적 또는 물리적 자극을 의미한다.

용어 "Mg^{2 +}-조절성"은 어떤 것이 유리 마그네슘 (Mg^{2 +}) 이온의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 것을 의미한다. "외인성 유리 Mg^{2 +} 농도"는 외부로부터, 예를 들어 세포를 둘러싼 배지로부터 세포에 작용하는 유리 Mg^{2 +} 농도를 의미한다. "Mg^{2 +}-고갈 조건"은 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도가 낮거나 또는 배지내 유리 Mg^{2 +}이 완전히 없는 것을 의미한다.

"세포용해 유전자"는 세포에서 발현되었을 때 세포용해를 유발하는 인자, 예를 들어 단백질을 코딩하는 유전자이다.

용어 "유도가능하게 발현된다"는 것은 유전자가 구성적으로 발현되는 것이 아니라, 발현이 외부 자극에 의해 유도될 수 있음을 의미한다.

용어 "세포용해 유전자가 Mg^{2 +}-조절성 프로모터에 의해 제어된다"는 것은, 그 프로모터가 유리 Mg^{2 +} 이온의 존재 또는 부재로 인해 각각 활성 또는 불활성일 경우에 유전자가 발현되거나 또는 발현되지 않는 것을 의미한다.

"유리 Mg^{2 +} 이온"은 예를 들어 배양 배지에 용해된 것, 즉 예를 들어 EDTA와 같은 킬레이트제에 의해 착물을 형성하지 않은 것이다. 즉, 예를 들어 킬레이트제를 첨가하여, 배지내 유리 Mg^{2 +}의 농도를 낮출 수 있다. 달리 언급되지 않은 한, "Mg²⁺"는 본원에서 "유리 Mg²⁺ 이온"을 의미한다.

용어 "외인성 유전자"는 예를 들어 형질전환에 의해 외부로부터 세포내 도입된 유전자를 의미한다. 그러나, 용어 "외인성 유전자"가 유전자의 기원을 나타내는 것은 아니며, 예를 들어 E. coli에서 외인성 유전자는 E. coli 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 외인성 유전자는, 예를 들어 플라스미드와 같이 (발현) 벡터에 존재하는 에피좀일 수 있거나, 또는 이는 세포의 염색체에 삽입될 수 있다

용어 "이종의 유전자"는 외부로부터 세포내에 도입되고 도입된 세포와는 다른 유기체로부터 유래된 유전자를 의미하며, 예를 들어 E. coli에서 이종의 유전자는 E. coli로부터 유래되지 않는다. 이종의 유전자는 예를 들어 플라스미드와 같이 (발현) 벡터에 존재하는 에피좀일 수 있거나, 또는 이는 세포의 염색체에 삽입될 수 있다.

"이종의 프로모터"는 유전자에 작동가능하게 연결된 경우, 본래 그 유전자와 조합되어 있지 않은 프로모터를 지칭한다.

외인성 또는 이종의 유전 물질은 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 기법에 의해 미생물로 도입될 수 있다. 예를 들어, 유전 물질은 형질전환에 의해 박테리아에 도입될 수 있다. 형질전환은, 예를 들어, 화학적으로 적합한 (competent) 박테리아의 열-충격에 의해, 또는 전기적으로 적합한 (electrocompetent) 박테리아의 전기천공에 의해 수행될 수 있다 (예, Hanahan et al., Methods Enzymol. 1991; 204:63-113; Miller and Nickoloff, Methods Mol Biol. 1995; 47:105-13).

외인성 또는 이종의 유전 물질은 lambda Red 시스템-매개 삽입 또는 CRISPR/Cas9과 같은 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 기법에 의해 세포의 염색체에 삽입될 수 있다 (예, Juhas and Ajioka, Microb Cell Fact. 2016; 15(1):172; Reisch and Prather, Sci Rep. 2015; 5:15096).

E. coli와 같은 특정 유기체"로부터 유래된" 유전자는 그 유기체로부터 나온 (직접 수득되는) (즉, 돌연변이 및/또는 코돈-최적화에 의한 서열 변형 없이) 해당 유전자일 수 있다. 다른 예로, 이는 또한 유기체로부터 나온 오리지날 서열에 돌연변이 (예, 1-10개, 바람직하게는 1-5개, 더 바람직하게는 1-3개)를 도입함으로써 수득되는 돌연변이를 포함할 수 있으며, 및/또는 또한 코돈-최적화 변이체를 포함할 수 있다.

용어 "미생물 발현을 위해 코돈-최적화된다"는 것은, 유전자의 오픈 리딩 프래임 (ORF)의 핵산 서열이 유전자가 도입되는 유기체에서 단백질로의 번역을 위해 최적화되는 것을 의미한다.

본 발명의 미생물이 특정 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 그 미생물은 또한 코딩된 단백질을 생산하기 위해 유전자를 또한 발현할 수 있는 것으로 의도된다.

유전자 맥락에서 용어 "과다 발현된다" 또는 "과다 발현"은, 유전자가 과다 발현되는 미생물에서의 유전자의 발현 수준이 그 유전자를 과다 발현하지 않는 동일 미생물에서의 동일 미생물의 발현 수준 보다 높은 것을 의미한다. 유전자는 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 기법에 의해 과다 발현될 수 있으며, 예를 들어, 부가적인 외인성 유전자 카피가 세포에 도입될 수 있거나, 세포는 외인성 전사 활성인자로 처리될 수 있거나, 전사 활성인자를 코딩하는 외인성 유전자가 세포에 도입될 수 있다. 부가적인 유전자 카피의 도입이 본 발명에서 바람직하다.

유전자의 "불활성화"는, 유전자가 임의의 기능성 단백질을 더 이상 발현하지 않는 것을 의미한다. 이는 발현의 거의 완전한 또는 완전한 결핍 또는 비-기능성 (dysfunctional) 단백질의 발현을 포함한다. 발현의 거의 완전한 또는 완전한 결핍은, 예를 들어 프로모터와 같은 조절 서열의 결손, 유전자의 오픈 리딩 프래임 (ORF)의 (일부의) 결손, 또는 프로모터 및 ORF를 포함하여 전체 유전자의 결손을 통해, 달성될 수 있다. 유전자의 넉아웃 역시 이 용어에 포함된다. 비-기능성 단백질의 발현은, 예를 들어 절단된 (truncated) 및/또는 촉매적으로 비활성 단백질의 발현으로 이어지는, 예를 들어 ORF의 부분 결손, 점 돌연변이 및/또는 삽입에 의해 달성될 수 있다. 결손, 점 돌연변이 및/또는 삽입의 도입 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기 Reisch and Prather, 2015 문헌 또는 Zerbini et al. (Microb Cell Fact. 2017; 16(1):68), Jensen et al. (Sci Rep. 2015; 5:17874)를 참조한다.

특정 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 대상 특정 유전자의 기저 서열 또는 프로모터 서열 등은 유기체, 예를 들어 E. coli의 게놈 서열로부터 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭시킬 수 있거나, 또는 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다.

유전자은행 등재 번호 (GenBank 등재 번호)는 유전자은행에서 사용되는 고유한 식별자로서, 예를 들어 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/를 통해 접근가능하다. 유전자 식별자 (GI)는 특정 유전자를 식별하기 위해 사용되는 고유 번호로서, 이는 예를 들어 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/에서 검색할 수 있다.

구현예들

HMO를 생산하기 위한 유전자 변형 미생물

본 발명은 HMO를 생산하기 위한 유전자 변형 미생물을 제공한다.

본 발명에서 생산되는 HMO는 2당류 락토스 또는 N-아세틸락토스아민을 기본으로 한다. 락토스 기반의 HMO가 바람직하다.

본 발명의 맥락에서 바람직한 인간 모유 올리고당은, 2'-푸코실락토스 (2-FL), 3'-푸코실락토스 (3-FL), 3'-시알릴락토스 (3-SL), 6'-시알릴락토스 (6-SL), 락토-N-테트라오스 (LNT), 락토-N-네오테트라오스 (LNnT), 락토-N-헥사오스 (LNH), 이소-락토-N-옥타오스, 이소-락토-N-네오옥타오스, 파라-락토-N-옥타오스, 락토-N-푸코펜타오스 I (LNFP I), 락토-N-푸코펜타오스 II (LNFP II), 락토-N-푸코펜타오스 III (LNFP III), 락토-N-푸코펜타오스 V (LNFP V), LS-4당류 a (LST a), LS-4당류 b (LST b), LS-4당류 c (LST c) 및 다이시알릴락토-N-테트라오스 (DSLNT)를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는 본 발명에서는 3당류 2-FL 및/또는 3-FL을 생산하며, 2-FL이 특히 바람직하다. 2-FL 및 3-FL의 구조는 (Pereira & McDonald, Sci Rep. 2012; 84(1):637-655)에 도시되어 있다.

본 발명에서는 2-FL 및/또는 3-FL 생산과 관련하여 엔테로박테리움 에세리키아 콜라이 K-12 (E. coli)의 유전자 및 경로의 조작에 대해 보다 상세한 내용을 기술한다. 그러나, 본 발명은 E. coli 또는 E. coli 이외의 다른 미생물에서의 기타 HMO의 생산 방법에도 유사하게 적용가능하다. 2-FL 및/또는 3-FL 이외의 다른 HMO 미생물 생산은 기존에 기술된 바 있다. 예를 들어, Priem et al. 문헌에는, 락토스를 당화하여, 네이세리아 메닝기티데스 (Neisseria meningitides) 유래 β1,3-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 LgtA (예,GI: 904226)의 발현을 이용하여, 3당류 GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc에 도달할 수 있으며, 추가적으로, 네이세리아 메닝기티데스 (Neisseria meningitides) 유래 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 LgtB (예,GI: 904227)에 의해 락토-N-네오테트라오스 (LNnT)에까지 이어질 수 있다 (Priem et al., Glycobiology. 2002; 12(4):235-40). H. pylori β1,3-푸코실트랜스퍼라제 FutA 또는 FutB에 의해 촉매되는, LNnT의 후속적인 세포내 푸코실화는, 주 산물로서 락토-N-네오디푸코헥사오스 II (LNnDFHII)와의 HMO 혼합물을 제공할 수 있다 (Dumon et al., Biotechnol Prog. 2004; 20(2):412-9). 다른 생산 방법들 역시 Han et al. (Han et al., 2012, Biotechnol Adv. 2012; 30(6):1268-78)에 논의되어 있다.

본 발명에서 사용할 미생물은 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, HMO에 대한 천연 생산 능력을 가진 미생물, 또는 HMO를 세포내에서 생산하기 위한 전구체 분자를 생산할 수 있거나 또는 세포외 공간으로부터 이러한 전구체를 유입할 수 있는 미생물이다. 미생물의 예로는 박테리아 또는 효모를 포함한다. 박테리아의 예로는 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli), 에르위니아 헤르비콜라 (Erwinia herbicola) (판토에아 어글로메란스 (Pantoea agglomerans)), 시트로박터 프룬디이 (Citrobacter freundii), 판토에아 시트레아 (Pantoea citrea), 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum), 또는 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 등이 있다. 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실러스 서모필러스 (Bacillus thermophilus), 바실러스 라테로스포루스 (Bacillus laterosporus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 미코이데스 (Bacillus mycoides), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) 및 바실러스 시르쿨란스 (Bacillus circulans) 등의 바실러스 속 박테리아도 이용할 수 있다. 마찬가지로, 비-제한적인 예로, 락토바실러스 액시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 델브루이키이 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 크리스파?스 (Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 젠세니 (Lactobacillus jensenii) 및 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 등의 락토바실러스 및 락토코커스 속 박테리아 역시 본 발명의 방법으로 변형할 수 있다. 스트렙토코커스 서모필러스 (Streptococcus thermophiles) 및 프로프리오니박테리움 프로이덴라이히 (Proprionibacterium freudenreichii) 역시 본 발명에 적합한 박테리아 종이다. 또한, 본 발명의 일부로서, 엔테로코커스 속 (예, 엔테로코커스 패슘 (Enterococcus faecium) 및 엔테로코커스 서모필러스 (Enterococcus thermophiles)), 비피도박테리움 속 (예, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테러움 인판티스 (Bifidobacterium infantis) 및 비피도박테러움 피비둠 (Bifidobacterium bifidum)), 스포로락토바실러스 (Sporolactobacillus) spp., 마이크로모모스포라 (Micromomospora) spp., 마이크로코커스 (Micrococcus) spp., 로도코커스 (Rhodococcus) spp. 및 슈도모나스 (예, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa))로부터 본원에 기술된 바와 같이 변형된 것 역시 포함된다. 효모의 예로는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 포함한다. 미생물은 바람직하게는 박테리아이고, E. coli가 특히 바람직하다. 사용할 E. coli 균주는 특별히 제한되지 않는다.

박테리아 세포로부터 HMO 분비는 공업적인 생산을 위한 필수 공정이다. 2-FL 수율 약 50%가 세포내 잔류하고, 나머지는 배지로 분비된다 (Huang et al., 2017). 100℃ 열-유도성 세포용해는 2-FL 총량을 수득하기 위해 필요하다. 회수 공정을 개선하기 위해, 본 발명의 미생물에서는 자가세포용해 시스템을 확립한다. 본 발명의 미생물은 따라서 유도성 세포용해 시스템을 포함할 수 있다. 세포용해 시스템의 타입은 외부 자극에 의해 세포용해를 유도할 수 있는 한 특별히 제한되진 않는다. 예를 들어, 박테리오파지 λ의 세포용해 유전자 (S, R 및 Rz)는 Mg^{2 +}-조절성 P _mgtA -UTR 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다 (Tamekou Lacmata et al., Bioengineered. 2017; 26:1-6)). 유리 Mg^{2 +}가 소모되면 (예, 10 μM 이하에서), 세포용해 유전자의 합성이 유도되어, 세포벽 성분인 펩티도글리칸의 분해에 의해 배지로의 2-FL 분비가 촉진된다. MgSO₄가 시스템에 역작용하거나 (Li et al., Curr Microbiol. 2016; 72(4):390-6) 또는 용매 첨가에 의해 세포용해 유도되는 (Hajnal et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2016; 100(21):9103-9110), Zhang et al. (J Microbiol Methods. 2009; 79(2):199-204)에 기술된 Mg^{2 +}-조절성 프로모터, Liu and Curtiss, (Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106(51):21550-4)에 기술된 니켈-유도성 시스템, 자 (Juhas et al., PLoS One. 2016; 11(10):e0165778)에 기술된 열민감성 λ 억제인자, 니신-유도성 프로모터 (Visweswaran et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2017 Feb;101(3):1099-1110), 아라비노스-유도성 프로모터 (Masuda et al., FEMS Microbiol Lett. 2016; 363(6)), 아라비노스-유도성 프로모터를 기반으로 하는, 자가세포용해 시스템을 확립하기 위한 이용가능한 몇가지 대안책들이 있다. 이러한 시스템들 또한 표 1에 요약 개시한다.

표 1 유도성 자가세포용해 시스템

화학적 또는 물리적 자극	종	참조문헌
Mg2 +-억제	E. coli	(Zhang et al., 2009; Tamekou Lacmata et al., 2017)
니켈-유도	E. coli	(Liu and Curtiss, 2009)
열-유도	E. coli	(Juhas et al., 2016)
니신-유도	락토코커스	(Visweswaran et al., 2017)
L-아라비노스-유도	E. coli	(Masuda et al., 2016) (Li et al., 2016)
유기 용매 (예,클로로포름, 이소프로판올)에 의한 유도	E. coli	(Hajnal et al., 2016)

Mg^{2 +}-조절성 시스템은, 세포용해를, 예를 들어 금속 이온 (예, Ca^{2 +} 또는 Mg²⁺)을 격리시키는 킬레이트제인 에틸렌 다이아민테트라아세트산 (EDTA)의 첨가에 의해 개선할 수 있는, 이점을 가진다. 또한, α-1,2- 및 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제 활성에 2가 금속 이온으로서 Mg^{2 +} 이온이 필요하다 (Zhang et al., Glycobiology. 2010; 20(9):1077-88; Zhao et al., Chem Commun (Camb). 2016; 52(20):3899-902). 따라서, Mg^{2 +} 존재시, 효소 활성 강화로 인해 2'-푸코실락토스 합성이 향상될 수 있으며, 이의 부재시 세포용해가 유도되어 세포벽 파괴를 통한 생산물 회수가 용이해진다. 이에, Mg^{2 +}-조절 시스템이 바람직하게는 본 발명에 사용되며, 바람직하게는, Mg²⁺-조절 시스템은 Mg^{2 +}-억제성이다.

유도성 세포용해 시스템의 경우, Mg^{2 +}-조절성 프로모터를 사용할 수 있다. Mg²⁺-조절성 프로모터는 바람직하게는 외인성 유리 Mg^{2 +} 농도에 의해 조절된다. 바람직하게는 Mg^{2 +}-고갈 조건에서 활성을 나타낸다. Mg^{2 +}-고갈 조건은, 배양 배지가 유리 Mg²⁺를 500 μM 이하, 100 μM 이하, 50 μM 이하, 10 μM 이하, 1 μM 이하 또는 0 μM로 포함하는, 조건이다. 바람직하게는, Mg^{2 +}-고갈 조건은 유리 Mg^{2 +} 10 μM 이하이다. Mg^{2 +}-조절성 프로모터는 바람직하게는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) mgtB 유전자 (예,GI: 1250998)의 PmgtB 프로모터, 살모넬라 티피무리움 pagC 유전자 (예, 1248241)의 PpagC 프로모터 또는 E. coli mgtA 유전자 (예, GI: 948778)의 PmgtA 프로모터이다.

살모넬라 티피무리움 mgtB 유전자의 PmgtB 프로모터는 예를 들어 상기한 Zhang et al., 2009 문헌에 기술되어 있으며, 예를 들어 주형으로서 살모넬라 티피무리움 게놈 및 프라이머 5'-GTATACTCCGGAGCAAACGCCTGAACTCCC-3' (서열번호 1) 및 5'-TCTAGAGGAAGAATAAGTACGTGCTATATTTAG-3' (서열번호 2)를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해, 수득가능하다. E. coli PmgtA 프로모터는 예를 들어 상기한 Tamekou Lacmata et al., 2017 문헌에 기술되어 있으며, 주형으로서 E. coli 게놈 및 프라이머 5'-CGAGCTCCTTTCGTTATTCAGCACCCG-3' (서열번호 3) 및 5'-CGAGCTCGCGATATAATACCTGCTGGC-3' (서열번호 4)를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 수득가능하다.

Mg^{2 +}-조절성 프로모터는 E. coli mgtA 유전자의 5'UTR과 같은 부가적인 Mg^{2 +}-조절성 인자와 조합될 수 있다. E. coli mgtA 유전자의 5'UTR은 예를 들어 상기한 Tamekou Lacmata et al., 2017 문헌에 기술되어 있으며, PmgtA 프로모터는 mgtA 5'UTR과 조합하여, 예를 들어 주형으로서 E. coli 게놈 및 프라이머 5'-CGAGCTCCTTTCGTTATTCAGCACCCG-3' (서열번호 3) 및 5'-CGAGCTCAAGGAGTCCCTCCGCACTGT-3' (서열번호 5)를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 수득가능하다.

유도성 세포용해 시스템을 포함하는 미생물은 하나 이상의 세포용해 유전자(들)를 더 포함할 수 있다. 세포용해 유전자는, 발현시 세포에 세포용해를 유발할 수 있는 한, 특별히 제한되진 않는다. 예를 들어, 세포용해 유전자는 λ 박테리오파지, MS2 박테리오파지, ΦX174 박테리오파지 또는 RLT 박테리오파지와 같은 박테리아파지로부터 유래될 수 있다. 세포용해 유전자의 예로는, 상기한 Masuda et al., 2016 문헌에 기술된 E. coli ydfD, 스트렙토코커스 디스갈락티아제 아종 에퀴시밀리스 (Streptococcus dysgalactiase subsp. equisimilis)의 sicG, 살모넬라 파지 P22의 SRRz, 살모넬라 엔테리카 혈청형 파라티피 A (S. enterica serovar Paratyphi A)의 yncE, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 파지 P68의 세포용해 유전자 등이 있다.

세포용해 유전자에 대한 바람직한 예는 λ 박테리오파지 유래의 SRRz 유전자 (예, 유전자은행 등재 번호: NC_001416의 서열에서 확인) 또는 S 유전자의 161번 위치에 G에서 A로의 돌연변이를 가진 이의 Sam7 돌연변이, E 단백질을 코딩하는 MS2 파지 세포용해 유전자 또는 L 단백질을 코딩하는 ΦX174 박테리오파지 세포용해 유전자이다. SRRz 유전자는 예를 들어 상기 Zhang et al., 2009 문헌에 기술되어 있으며, 예를 들어 주형으로서 λ 박테리오파지 게놈 및 프라이머 5'-CCGCATATGCCAGAAAAACATGACCTG-3' (서열번호 6) 및 5'-TTAGTCGACGCAACTCTATCTGCACTGCTC-3' (서열번호 7)를 이용한 PCR에 의해 수득가능하다. MS2 박테리오파지 또는 ΦX174 박테리오파지 세포용해 유전자는 예를 들어 상기 Juhas et al., 2016 문헌에 기술되어 있다.

또한, 미생물은 동일한 타입이거나 또는 상이한 타입인 2 이상의 세포용해 유전자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 서로 다른 작용 기전이 보다 효과적인 세포용해를 유도할 수 있으므로, 2 이상의 다른 세포용해 유전자의 조합을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미생물은 λ 및 MS2 박테리오파지 유래 세포용해 유전자, λ 및 ΦX174 박테리오파지 유래 세포용해 유전자, MS2 및 ΦX174 박테리오파지 유래 세포용해 유전자 또는 λ, MS2 및 ΦX174 박테리오파지 유래 세포용해 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이들 조합으로 한정되지 않으며, 본원에 기술된 다른 세포용해 유전자가 단독으로 또는 조합된 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 2 이상의 세포용해 유전자가 탠덤으로 위치하고, 동일한 프로모터 및 동일한 선택적인 부가적인 조절 인가에 의해 폴리시스트론 방식으로 제어된다.

하나 이상의 세포용해 유전자(들)는 Mg^{2 +}-고갈 조건에서 유도가능하게 발현될 수 있으며, 바람직하게는 부가적인 조절 인자를 이용해 또는 없이 Mg^{2 +}-조절성 프로모터에 의해 제어된다. mgtA 유전자의 5'UTR이 부가적인 조절 인자로서 사용되는 경우, 세포용해 유전자(들)의 발현 카세트는 바람직하게는 Mg^{2 +}-조절성 프로모터, mgtA 유전자의 5'UTR 및 세포용해 유전자(들)의 ORF (또는 ORF들)를 순차적으로 포함한다.

전술한 유도성 세포용해에 사용될 수 있는 발현 카세트는 발현 벡터와 같은 에피솜 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 미생물에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 염색체에 삽입될 수 있다.

아울러, HMO의 전구체가 락토스이므로, HMO의 세포내 생산은 락토스를 세포내 고 농도로 달성하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 미생물은 락토스를 글루코스 및 갈락토스로 절단하지 못할 수 있다. 이는 락토스 절단을 담당하는 β-갈락토시다제 LacZ를 코딩하는 lacZ 유전자 또는 LacZ뿐 아니라 락토스 억제인자 LacI, 트랜스아세틸라제 LacA 및 락토스 퍼미아제 LacY를 코딩하는 lac 오페론을 불활화함으로써, 달성할 수 있다. 불활성화는 발현 저해, 불활성화 돌연변이 유도 또는 결손에 의해 달성할 수 있다. 유전자 lacI, lacZ, lacY 및 lacA를 포함한 전체 lac 오페론의 불활성화는, i) 락토스의 글루코스 및 갈락토스로의 분해 방지, 및 ii) 알로- 또는 아세틸-락토스의 형성 방지에 의해 세포내 락토스 이용가능성을 높일 수 있다. 후자는 2종의 오염 (contaminating) 당 분자를 제거함으로써 정제 공정을 추가적으로 단순화한다.

락토스 퍼미아제는 락토스를 세포 흡수시키는 작용을 한다. 다수의 박테리아들은, E. coli 락토스 퍼미아제의 상동체 (예, 바실러스 리케니포미스에서 발견되는 것), 또는 PTS 당 트랜스포트 패밀리의 멤버 (예, 락토바실러스 카세이 및 락토바실러스 람노수스에서 발견되는 것)인 트랜스포터 단백질을 이용함으로써, 락토스를 배양 배지에서 세포로 전달하는 고유한 능력을 가지고 있다. 즉, E. coli LacY와 같은 외인성 락토스 퍼미아제 유전자의 도입이 세포내 락토스 농도를 높일 수 있다. 세포외 락토스를 세포로 수송하는 선천적인 능력이 없는 박테리아의 경우 (전체 lac 오페론이 불활성화된 것), 이러한 능력은 E. coli lacY와 같은 외인성 락토스 퍼미아제 유전자의 도입에 의해 부여 또는 복구할 수 있다. 본 발명의 미생물은 따라서 락토스 퍼미아제를 코딩하는 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 락토스 퍼미아제는 E. coli LacY (예,GI: 949083)이다. 특히 바람직하게는, E. coli LacY는 A198V 및/또는 S209I 돌연변이를 가진다 (Wilson et al., Biochim Biophys Acta. 1990; 1029(1):113-6). 이들 2가지 돌연변이는 LacY와 이의 저해제 단백질 효소-IIa^Glc 간의 상호작용을 방지할 것으로 예측된다 (Hogema et al., Mol Microbiol. 1999; 31(6):1825-33). 그 결과, 자가조절 기전이 세포내 락토스 고 농도에서 억제될 수 있다. 이에, HMO의 수율은 락토스 흡수를 높임으로써 증가될 수 있다. 또한, 락토스가 T7 프로모터 발현 시스템의 천연 유발제이므로 (하기 참조), 예를 들어 세포내 락토스 이용가능성 증가에 의해 2-FL 합성의 필수 효소의 발현이 추가적으로 향상될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 2-FL 및/또는 3-FL을 생산하기 위한 것이다.

E. coli에서 2-FL을 다량 생산하기 위한 예시적인 유전자 변형을 표 2에 나타낸다.

표 2 E. coli 에서 2'- 푸코실락토스를 다량 생산하기 위한 유전자 변형

Nr.	유전자	효소	기능
과다 발현
1	manB	포스포만노 뮤타제	GDP-L-푸코스 생합성
2	manC	만노스 1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제
3	gmd	GDP-D-만노스 4,6-데하이드라타제
4	wcaG	NADPH-의존적인 GDP-L-푸코스 신타제
5	rcsA	파지티브 전사 조절인자	콜라닌산 생합성 유전자의 파지티브 활성인자
6	gsk	구아노신-이노신 키나제	ManC에 필요한 GTP-합성
7	lacY	락토스 퍼미아제	LacY-S209I 또는 A198V, 락토스 흡수 증가
8	futC	α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 (E. coli 코돈 최적화)	GDP-L-푸코스에서 락토스로의 전달
9	zwf	G6PDH, 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제	WcaG에 필요한 NADPH-조절
10	pntAB	막 결합된 트랜스하이드로게나제
11	trxA	티오레독신	재조합 단백질의 발현 및 용해성 증가 (레독스 활성은 이황화 결합 형성, 추정의 샤페론 기능, T7 DNA 중합효소의 진행성 (processivity) 인자를 촉진함)
12	hHsp70	인간 열 충격 단백질 70 (E. coli 코돈 최적화)	유도를 위한 IPTG 첨가에 앞서 자기-유도성 발현 시스템의 확립 및 샤페론 기능
13	SRR z	비브리오 피셔리 (Vibrio fischeri) 유래 2 방향성 LuxICDABEG 종결인자 및 PmgtA-UTR의 제어하 λ 박테리오파지 세포용해 유전자	E. coli 유래 Mg2 +-억제성 프로모터 PmgtA-UTR 제어하 세포용해 유전자, 생산물 분비를 개선하기 위한 자동용해 시스템
결손
1	ΔlacIZYA	LacI 억제인자, LacZ β-갈락토시다제, LacY 퍼미아제 및 LacA 트랜스아세틸라제	넉아웃은 락토스의 가수분해 및 이의 알로- 또는 아세틸락토스로의 변형을 차단한다.
2	Δlon	Lon-프로테아제	넉아웃은 RcsA 분해를 방지한다
3	ΔclpYQ	ClpYQ 프로테아제 (동의어 HslUV)
5	ΔwcaJ	UDP-글루코스 지질 캐리어 트랜스퍼라제	넉아웃은 2-푸코실락토스 대신 GDP-L-푸코스에서 콜라닌산으로의 변환을 방지한다
5	ΔtrxB	NADPH-의존적인 티오레독신 리덕타제	넉아웃은 WcaG에 필요한 NADPH의 소모를 차단하고, 이황화 결합 형성을 촉진함으로써 단백질 용해성을 증가시킨다

2-FL 또는 3-FL은 활성화된 당 GDP-L-푸코스의 락토스에의 커플링에 의해 합성할 수 있다. 전술한 바와 같이, E. coli는 락토스 퍼미아제 LacY (락토스/H⁺ 심포터)를 통해 전구체 분자 락토스를 세포로 유입시킬 수 있다. 또한, E. coli는 포스포트랜스퍼라제 시스템을 통해 글루코스를 세포로 유입시킬 수 있다. 글루코스는 증식을 촉진하기 위한 에너지원으로서 사용될 수 있으며, 데 노보 경로를 통해, 콜라닌 생합성의 천연 중간산물인 GDP-L-푸코스를 생산하기 위한 전구체로서 이용할 수 있다 (도 1 참조). 활성화된 당 GDP-L-푸코스를 생합성하기 위한 데 노보 경로는 당분해 중간산물 프럭토스-6-포스페이트로부터 갈라지며, E. coli 유래 효소 ManA 및 ManB, GTP-의존적인 ManC, NADPH-의존적인 Gmd 및 WcaG를 기반으로 한다. 다른 예로, GDP-L-푸코스는 또한 세포로 유입되는 푸코스로부터 구조 경로 (salvage pathway)에 의해 합성할 수 있다.

GDP-L-푸코스의 푸코스 모이어티는 푸코실트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.x)를 통해 세포내 어셉터 락토스에 전달하여, 2-FL 또는 3-FL을 제조할 수 있다 (도 1 참조). 2-FL 생산의 주 효소는 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) FutC와 같은 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제이다. 3-FL을 생산하는 경우, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) FutA와 같은 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제를 이용할 수 있다. 이에, 본 발명의 미생물은 외인성 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자, 바람직하게는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제를 포함한다. 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 이종의 유전자이거나, 및/또는 이종의 프로모터에 의해 구동된다.

박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis), 박테로이데스 불가투스 (B. vulgatus), 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), E. coli, 헬리코박터 빌리스 (Helicobacter bilis), 헬리코박터 헤파티쿠스 (H. hepaticus), 헬리코박터 무스텔라 (H. mustelae), 헬리코박터 필로리 (H. pylori) 및 서모시네코코커스 일롱가투스(Thermosynechococcus elongatus)와 같은 박테리아에서, 몇가지 푸코실트랜스퍼라제가 동정되어 있다. 다수의 유기체들이 다양한 코돈 용법을 사용하므로, 동족 tRNA 안티코돈의 이용성이 제한적인 코돈의 존재는 리포좀 스톨링 (ribosome stalling)으로 인해 이종의 유전자 발현을 낮출 수 있다. 본 발명의 미생물에서 단백질의 높은 발현을 보장하기 위해, α-1,2- 및 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제 코딩 유전자 (예, futC 및 futA)의 코돈 용법을 본 발명의 미생물에 대해 최적화할 수 있다. 이에, 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 미생물에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 코돈-최적화는 2-FL 및/또는 3-FL의 수율을 개선할 수 있는 세포내 푸코실트랜스퍼라제 단백질 수준 증가를 유도할 수 있다.

본 발명에서 사용하기 바람직한 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 예는 헬리코박터 필로리의 FutC (예, NCBI 등재 번호 KY499613), 헬리코박터 무스텔라의 FutL (예, NCBI 등재 번호 WP_013023529.1), 헬리코박터 빌리스의 FutF (예, NCBI 등재 번호 WP_020995676.1), 바실러스 프라길리스 NCTC 9343의 WcfB (예, NCBI 등재 번호 WP_005817145.1), E. coli O128의 WbsJ (예, NCBI 등재 번호 AAO37698.1), E. coli O86의 WbwK (예, NCBI 등재 번호 AAO37719.1), E. coli O126의 WbgL (예, NCBI 등재 번호 ADN43847.1), E. coli O127의 WbiQ (예, NCBI 등재 번호 CAS09719.1), 캄필로박터 제주니의 FutG (예, NCBI 등재 번호 WP_002861859.1), 박테로이데스 불가투스 ATCC 8482의 FutN (예, NCBI 등재 번호 ALK85429.1), 박테로이데스 프라길리스 NCTC9343의 WcfB 및 WcfW (예, NCBI 등재 번호 WP_005817145.1 및 WP_005813010.1)이다.

본 발명에서 사용하기 바람직한 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제의 예는 헬리코박터 필로리의 FutA (예, NCBI 등재 번호 AAD07447.1), 헬리코박터 필로리 26695의 FutB (예, NCBI 등재 번호 AAD07710.1), 헬리코박터 트로곤툼 (H. trogontum)의 FutD (예, NCBI 등재 번호 WP_052089242.1), 헬리코박터 빌리스의 FutE (예, NCBI 등재 번호 WP_034580283.1), 헬리코박터 티필로니우스 (H. typhlonius)의 FutH (예, NCBI 등재 번호 WP_052082154.1), 헬리코박터 헤파티쿠스의 FutJ (Hh0072) 및 FutK (Hh1776) (예, NCBI 등재 번호 WP_011114915.1 및 AAP78373.1), 박테로이데스 프라길리스의 FutM (예, NCBI 등재 번호 CAH09151.1.1)이다.

바람직한 구현예에서, 푸코실트랜스퍼라제의 활성은 Mg^{2 +} 존재에 의해 증가된다.

푸코실트랜스퍼라제는 세포내 불용성 봉입체 (inclusion body)를 형성할 수 있으며, 이는 세포내 활성 푸코실트랜스퍼라제의 이용가능성을 감소시킬 수 있다. 외인성으로 도입된 샤페론의 존재는 유익하게는 푸코실트랜스퍼라제의 용해성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 2-FL 및/또는 3-FL의 생산을 개선할 수 있다. 본 발명의 미생물은 따라서 샤페론을 코딩하는 외인성 유전자를 더 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 샤페론은 인간 Hsp70 (예, GenBank 등재 번호: BC112963)이다. 샤페론 기능과 별개로, 배양 배지에서 발현 유도제 IPTG의 첨가를 회피하기 위해 이용가능한 자기-유도성 발현을 확립하기 위해, 인간 Hsp70을 추가적으로 이용할 수 있다 (Briand et al., Sci Rep. 2016; 6:33037). IPTG는 락토스 퍼미아제의 기질이므로, IPTG 생략은 락토스 흡수를 높일 수 있으며, 따라서 HMO, 특히 2-FL 및/또는 3-FL의 생산을 더욱 개선할 수 있다.

상기한 변형과는 별도로, HMO, 특히 2-FL 및/또는 3-FL의 생산을 추가적으로 최적화하기 위해, 여러가지 다른 유전자를 도입하거나 또는 세포에서 불활성화할 수 있다. RcsA는 중간산물로서 GDP-L-푸코스를 이용하는 E. coli의 콜라닌산 생합성의 파지티브 전사 조절인자이다. rcsA (예, GenBank 등재 번호 M58003)의 과다 발현은 GDP-L-푸코스 중간산물의 생합성에 관여하는 유전자들의 전사를 증가시켜, GDP-L-푸코스 경로 강화에 의해 2-FL 및/또는 3-FL 합성을 개선할 수 있다 (도 1 참조) (상기 Huang et al., 2017 문헌). 따라서, 본 발명의 미생물은 또한 바람직하게는 E. coli로부터 유래되는 rcsA 유전자를 과다 발현할 수 있다.

그러나, RcsA는 Lon- 및 ClpYQ 프로테아제의 제어 하에 배치된다. 따라서, 각각의 lon 및 clpYQ-유전자는, 필수적인 GDP-L-푸코스 생합성 유전자의 하향 조절을 방지하기 위해, 불활성화될 수 있다. rcsA의 과다 발현은, lon/clpYQ 불활성화와 조합하여, GDP-L-푸코스를, 따라서 2-FL 생산을 상당히 개선할 수 있다. 이에, 본 발명의 미생물에서, Lon 프로테아제 패밀리 유전자, 바람직하게는 E. coli Lon 프로테아제 (예, GenBank 등재 번호 L20572), 및/또는 clpYQ 유전자 (NC_000913.3)가 불활성화될 수 있다.

아울러, wcaJ 유전자 (예, GenBank 등재 번호 (아미노산) BAA15900)는 콜라닌산 생합성을 개시하는 것으로 예상되는 UDP-글루코스 지질 캐리어 트랜스퍼라제를 코딩한다. wcaJ 유전자의 불활성화는, i) 경쟁적인 콜라닌산 경로에 의한 GDP-L-푸코스 소비 방지, ii) 엑소다당류 콜라닌산 유출로 인한 배양 배지의 고 점성 방지, 및 iii) 다른 오염성 당 분자 (콜라닌산) 제거에 의한 2-FL 정제 공정의 단순화를 위해, 수행할 수 있다. 이에, 본 발명의 미생물에서, wcaJ 유전자, 바람직하게는 E. coli wcaJ 유전자는 불활성화될 수 있다.

조인자 NADPH 및 GTP 역시 GDP-L-푸코스 생합성에 중요한 역할을 수행하며, 이의 이용가능성은 활성화된 당 (GDP-L-푸코스)의 합성을 제한함으로써 또한 2-FL 및/또는 3-FL과 같은 HMO의 전체 수율을 제한할 수 있다. GDP-L-푸코스 합성시 조인자의 이용가능성을 높이기 위해, 4종의 유전자를 본 발명의 미생물에서 과다 발현시킬 수 있다. Zwf는 펜토스 포스페이트 경로의 일부이고, PntA 및 PntB는 트랜스하이드로게나제 시스템에 속한다. zwf 및 pntAB의 과다 발현은 NADPH-재생 (regeneration)에 유의하게 기여함으로써, GDP-L-푸코스 합성에 참여하는 NADPH-의존적인 WcaG 효소에 필수적인 조인자를 제공할 수 있다 (도 1). 따라서, 본 발명의 미생물은, 바람직하게는 E. coli로부터 유래되는, zwf 유전자 및 2종의 pntAB 유전자 (KEGG Entry, E. coli K-12 MG1655: b1852, b1603 및 b1602)를 공동-과다 발현할 수 있다.

2번째 조인자 GTP는 2가지 대안적인 경로를 통해, 포스포리보실 피로포스페이트 형성을 통한 데 노보 GTP 생합성 경로 또는 외인성으로 전달된 구아노신으로부터의 구조 경로를 통해 합성된다. 이들 2가지 경로 모두에서, GMP의 적절한 공급이 GTP 수준을 증가시킬 수 있으며, 따라서 GDP-L-푸코스 생산 효율을 개선할 수 있다. 본 발명의 미생물에서, 양쪽 대사 경로에 참여하는, gsk 유전자 (구아노신 이노신 키나제, 예컨대 GI: 946584)의 과다 발현이 ManC에 필요한 GTP-이용성을 높일 수 있다 (도 1). 그 결과, GDP-L-푸코스 합성, 따라서 HMO 생산이 현저하게 개선될 수 있다 (Lee et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2012; 93(6):2327-34). 이에, 본 발명의 미생물은, 바람직하게는 E. coli로부터 유래되는, gsk 유전자를 과다 발현할 수 있다.

전술한 예시적인 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머는 예를 들어 상기 Huang et al., 2017 문헌의 표 S2에서 확인할 수 있다.

부가적인 최적화는 티오레독신 활성의 조작을 수반할 수 있다. trxA 유전자 (KEGG Entry, E. coli K-12 MG1655: b3781)는 E. coli에서 주 생리학적 전자 도너를 코딩한다. 티오레독신 (TrxA)의 과다 발현은 난용성 단백질에서 이황화 결합 형성을 촉진함으로써 이종의 단백질 발현을 개선하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 다른 2가지 기능, 잠재적인 샤페론 기능 및 T7-DNA 중합효소의 진행성 인자로서 기능은 TrxA와 연관되어 있다 (Weickert et al., Curr Opin Biotechnol. 1996; 7(5):494-9). 따라서, trxA의 과다 발현은, i) HMO 합성에 필요한 효소의 용해성 증가, 및 ii) 해당 유전자의 발현에 긍정적으로 작용하기 위해 수행할 수 있다. 즉, 본 발명의 미생물은, 바람직하게는 E. coli로부터 유래되는, 티오레독신 trxA 유전자를 과다 발현할 수 있다.

아울러, trxB 유전자 (KEGG Entry, E. coli BL21 (DE3): ECD_00892)는 TrxA를 산화된 형태로부터 재생하는 NADPH-의존적인 티오레독신 리덕타제 (TrxB)를 코딩한다. trxB의 불활성화는 사이토플라즘에서 환원 가능성을 제한하고, 이황화 결합 형성을 허용한다 (Weickert et al., 1996, supra). trxB의 불활성화는, i) 단백질 용해성과 효소 활성의 개선, 및 ii) WcaG에 필요한 조인자 NADPH의 소모 방지를 위해 수행할 수 있다 (도 1). 따라서, 본 발명의 미생물에서, trxB 유전자는 불활성화될 수 있다.

HMO 생산 방법

또한, 본 발명은 본 발명의 유전자 변형 미생물을 이용한 HMO 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 미생물을 배양함으로써, HMO를 생산할 수 있다.

배양 배지는, 미생물의 증식을 유지시키는 한 특별히 제한되진 않는다. 본 발명의 미생물을 배양하지 위한 배지의 예는 LB 배지 (10 g/L 트립톤; 5 g/L 효모 추출물; 10 g/L NaCl, pH 7.5), 탄소원으로서 글루코스 (또는 글리세롤)를 함유한 변형된 M9 최소 배지 (36 g/L 글루코스; 12.8 g/L Na₂HPO₄·7H₂O, 3 g/L KH₂PO₄, 2 g/L NH₄Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.25 g/L MgSO₄·7H₂O, 14.7 mg/L CaCl₂·2H₂O, 10 mg/L 티아민, 2 g/L 효모 추출물, 0.1%(v/v) Triton-X 100, 및 1 mL/L 미량 금속 스톡 용액; 미량 금속 스톡 용액: 25 g/L FeCl₃·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 2 g/L ZnCl₂, 2 g/L Na₂MoO₄·2H₂O, 1.9 g/L CuSO₄·5H₂O 및 0.5 g/L H₃BO₃, pH 7.2) (상기 Huang et al., 2017 문헌 참조), 2.68 g/L (NH₄)₂SO₄, 1g/L (NH₄)₂-H-사이트레이트, 26.42 g/L 글리세롤, 14.6 g/L K₂HPO₄, 0.241 g/L MgSO₄, 2g/L Na₂SO₄, 4 g/L NaH₂PO₄ㆍH2O, 0.5 g/L NH₄Cl, 10 mg/L 티아민 및 3 ml/L 미량 원소 용액 (0.5 g/L CaCl₂ 2 H₂O, 16,7 g/L FeCl₃ 6 H₂O, 20.1 g/L Na₂-EDTA, 0.18 g/L ZnSO₄ㆍ7 H₂O,0.1 g/L MnSO₄ㆍH₂O, 0.16 g/L CuSO₄ㆍ5 H₂O 및 0.18 g/L CoCl₂ㆍ6 H₂O)을 함유한 최소 배지 (Baumgartner et al., Microb Cell Fact. 2013; 12:40), 또는 20 g/L 글리세롤, 13.5 g/L KH₂PO₄, 4.0 g/L (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/L 구연산, 1.4 g/L MgSO₄·7H₂O, 10 ml/L 미량 원소 용액 (10 g/L Fe(III) 사이트레이트, 2.25 g/L ZnSO₄·7H₂O,1.0 g/L CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.35 g/L MnSO₄ㆍH₂O, 0.23 g/L Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 0.11 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄, 2.0 g/L CaCl₂·2H₂O)을 함유한 최소 배지 (Chin et al., J Biotechnol. 2016. pii: S0168-1656(16)31632-7)이다.

본 발명의 미생물은 배양에 적합한 임의 온도, 예를 들어 16-37℃, 예를 들어 16-30℃, 바람직하게는 16-25℃에서 배양할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 배지는 락토스를 포함한다. 배양 개시전, 배지내 락토스 농도는 20 g/L 이상, 12 g/L 이상, 10 g/L 이상, 8 g/L 이상, 8 내지 20 g/L, 10 내지 20 g/L, 또는 12 내지 20 g/L일 수 있다. 바람직하게는, 배양 개시 전, 배지내 락토스 농도는 10 내지 20 g/L이다.

다른 바람직한 구현예에서, 배지는 유리 Mg^{2 +}를 포함한다.

배양 개시전, 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도 (즉, 유리 Mg^{2 +} 농도)는 80 mM 이상, 70 mM 이상, 60 mM 이상, 50 mM 이상, 40 mM 이상, 30 mM 이상, 20 mM 이상, 10 mM 이상, 5 mM 이상, 1 mM 이상, 1 내지 50 mM, 5 내지 50 mM, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 1 내지 10 mM, 5 내지 10 mM, 1 내지 5 mM, 또는 약 50 및 60 μM일 수 있다. 바람직하게는, 배양 개시전, 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도는 5 내지 20 mM이다.

배양 종료시 유리 Mg^{2 +} 농도는 500 μM 이하, 100 μM 이하, 50 μM 이하, 10 μM 이하, 1 μM 이하 또는 0 μM일 수 있다. 바람직하게는, 배양 종료 후 유리 Mg²⁺ 농도는 10 μM 이하이다.

바람직하게는, Mg^{2 +}는 MgSO₄ 형태로 배지에 첨가된다.

배양 종료시, EDTA 또는 EGTA 같은 킬레이트제가, 선택적으로, 남아있는 유리 Mg^{2 +} 이온을 고립시키고 세포용해를 촉발하기 위해, 충분량으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 HMO 생산 방법은, 바람직하게는, 배치 배양 또는 피드-배치 배양으로 수행된다. 배치 배양은 추가적인 영양분의 첨가없이 특수 환경 조건 하에 고정된 부피의 영양 배지에서 세포를 배양하는 폐쇄 시스템이다. 피드-배치 배양의 경우, 배양 중에 영양분이 생물반응조에 공급된다. 이들 양자의 경우에, 세포 및 생산물은 배양 종료시까지 생물반응조내에 유지된다.

본 발명의 HMO 생산 방법에서 배양 부피는 바람직하게는 10L 이상, 100L 이상, 1000L 이상, 10000L 이상, 50000L 이상, 10L - 100L, 100L - 1000L, 1000L - 10000L 또는 10000L 이상 50000L 미만이다. 바람직하게는, 배양 부피는 100L - 1000L이다.

배양 종료시 배지내 HMO 농도는 바람직하게는 적어도 15 g/L, 더 바람직하게 적어도 20 g/L, 더 더 바람직하게 적어도 30 g/L, 가장 바람직하게는 적어도 50 g/L이다.

본 발명에서, 1종의 HMO를 생산하거나, 또는 2종 이상의 HMO를 동시에, 바람직하게는 한종의 유전자 변형 미생물에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 및 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제의 동일 세포에서의 발현으로, 락토다이푸코테트라오스 또는 락토-N-다이푸코헥사오스와 같은 다이푸코시화 구조 (difucosylated structure), 2-FL 및/또는 3-FL을 생산할 수 있다.

본 발명에서 생산되는 HMO는 바람직하게는 2-FL 및/또는 3-FL이고, 특히 바람직하게는 2-FL이다.

HMO는 배지로부터 및/또는 미생물 자체로부터 회수할 수 있다. 미생물로부터 HMO를 회수하기 위해서는, 미생물을 파괴하여야 한다. 세포용해에 의한 세포 파괴는 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 화학적 또는 물리적 수단에 의해 수행될 수 있거나, 또는 세포용해는 본원에 기술된 유도성 세포용해 시스템에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 HMO 생산 방법은 배양 배지로부터 HMO를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서 정제는 HMO가 정제 후 순수한 형태로 존재하거나 또는 본질적으로 순수한 형태로 존재하는 것을 의미한다. 정제 후, HMO, 예컨대, 2-FL 및/또는 3FL은, 바람직하게는 건조 중량으로, 정제된 산물의 적어도 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% (w/w)를 구성한다.

정제는 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 기법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, HMO는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 공지된 방법에 의해, 예를 들어 차콜 단계 (charcoal step) 및 35-50% 에탄올 용출을 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해, 에탄올 농도 구배에 의해 또는 크기 배제에 의해 배지로부터 정제할 수 있다.

순도는 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 박막 크로마토그래피 또는 전기천공 기법 (electrophoretic technique)또는 크로마토그래피 기법과 같이 임의의 공지된 방법에 의해 분석할 수 있다.

바람직하게는, HMO는 유도성 세포용해 시스템을 통해 세포용해를 유도한 후 배양 배지로부터 정제한다. 세포용해시, 세포내 HMO는 배지로 방출되어, 배지내 HMO 농도가 증가한다. 이로써 HMO의 수율 증가뿐 아니라 수율 증가 및 적은 가공 단계로 인한 시간 및 비용 절감을 달성할 수 있다. 이에, HMO는 바람직하게는 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도가 10 μM 이하이거나 및/또는 세포용해를 직접 가시화할 수 있는 시점에, 배양 배지로부터 정제한다. 세포용해는, 예를 들어, 배양물의 가시적인 청징 (clearing)에 의해 및/또는 배양물의 600nm에서의 흡광도 (광학 밀도) 측정에 의해 직접 가시화할 수 있다. 배양물의 OD₆₀₀ 값은 당해 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어 분광광도계를 사용해 측정할 수 있다. OD₆₀₀ 값 감소는 세포용해가 발생되었음을 의미한다. 이에, 본 발명에서, 세포용해는 배양물의 OD₆₀₀ 값 감소에 의해 직접 가시화할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 HMO 생산 방법에 의해 수득가능한 배지를 제공한다. 본 발명의 미생물 배양에 의한 HMO 생산으로 인해, 배지는 HMO를 함유한다. 배양 종료시 배지내 HMO 농도는 바람직하게는 적어도 15 g/L, 더 바람직하게 적어도 20 g/L, 보다 더 바람직하게 적어도 30 g/L, 가장 바람직하게는 적어도 50 g/L이다. 본 발명의 배지는 추가적으로 예를 들어 동결건조에 의해 건조될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 HMO 생산 방법에 의해 수득가능한 정제된 HMO를 제공한다.

본 발명의 배지 및 정제된 HMO는 유아 영양과 같은 인간 및/또는 동물 소비용 제품 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 배지 및 정제된 HMO는 동물 사료 제조에 사용될 수 있다. 동물 사료는 반려 동물 (개, 고양이), 가축 (소, 말, 양, 염소 또는 돼지, 및 가금류) 및/또는 어류용일 수 있다. 동물 사료는 소 사료가 바람직하다. 바람직하게는 동물 사료는 송아지용 우유 대체품 (milk replacement product)이다.

본 발명은 아래 비-제한적인 실시예를 들어 예시될 것이다.

실시예

재료 및 방법

사용 균주, 플라스미드 및 프라이머를 표 3 및 4에 열거한다. E. coli BL21 (DE3)을 HMO 생산을 위한 숙주 균주로 사용하고, 플라스미드 구축 및 유지에는 E. coli TOP10을 사용하였다. E. coli는 필요에 따라 암피실린 (100 ㎍ ml^-1), 스트렙토마이신 (50 ㎍ ml^-1) 또는 카나마이신 (50 ㎍ ml^{- 1})이 첨가된 LB 배지 (10 gL^-1 트립톤, 5 gL^-1 효모 추출물, 10 gL^-1 NaCl)에서 배양하였다. 유전자 결손의 경우, Jensen et al. 2015 (Sci Rep 2015; 5:17874)의 lambda Red 재조합효소/플리파제 (flippase) 시스템을 사용할 수 있다. 벡터 pSIJ8을 E. coli BL21 (DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. lambda Red 유전자를 15 mM L-아라비노스 존재하에 유도하였다. 카나마이신-내성 카세트 (kanR)를 50 bp 길이의 상동적인 타겟 서열 및 FRT 부위가 측면에 위치한 벡터 pKD13 (Datsenko and Wanner, 2000)에서 증폭시킨 다음 L-아라비노스 유도된 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 결손 후, 50 mM L-람노스 존재하에 플리파제 재조합효소의 유도에 의해 항생제 카세트를 제거하였다. 온도-민감성 헬퍼 플라스미드 (pSIJ8)를 배양하기 위해, 세포를 42℃에서 배양하였다. 유전자를 발현하기 위해, 벡터 pETDuet-1, pCDFDuet-1 및 pCOLADuet-1을 사용할 수 있다 (표 3, 도 2, 4 및 7). 플라스미드를 E. coli BL21 (DE3) 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 배치 발효를 위해, E. coli를 36 g/L 글루코스 첨가된 100 ml LB에서 배양하였다. OD₆₀₀ 0,6-0,8에 도달하면, 0.1 mM IPTG 또는 0.2% 락토스를 유도를 위해 첨가하였다. 16-25℃에서 2 및 10시간 배양한 후, HMO 생산을 위해 5 g/L 락토스를 첨가하였다.

표 3 균주 및 플라스미드.

균주 또는 플라스미드	유전자형	오리진
균주
E. coli K-12 MG1655	F- λ- ilvG- frb - 50rph-1	CGSC
E. coli BL21 (DE3)	F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm rne131 λ(DE3)	Merckmillipore
E. coli TOP10	F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG	Thermofisher
플라스미드
pETDuet-1	Double T7 프로모터; ColE1 ori AmpR	Novagen
pCDFDuet-1	Double T7 프로모터; CloDF13 ori StrR	Novagen
pCOLADuet-1	Double T7 프로모터; ColA ori KanR	Novagen
pET-manCB-gmd-wcaG	E. coli K-12 MG1655 유래 manC - manB (NcoI, HindIII) 및 gmd-wcaG (NdeI, KpnI)를 수송하는 pETDuet-1
pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz	인간 코돈 최적화된 hHSP70 (NdeI, BglII), E. coli K12-MG1655 유래 lacY*(S209I; BamHI, HindIII), N-말단 3x Asp-tag(NcoI, BamHI)를 가진 헬리코박터 필로리 유래 코돈 최적화된 futC, E. coli K12-MG1655 유래 trxA (BglII, KpnI), E. coli BL21 (DE3) 유래 PmgtA-UTR 제어 하 SRRz 및 비브리오 피셔리 유래 LuxICDABEG-종결인자를 탑재한, pCDFDuet-1
pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsK	E. coli K12-MG1655 유래 rcsA (NdeI, BglII) 및 zwf (BglII, Kpn), E. coli K12-ATCC10798 유래 gsk (KpnI, XhoI), E. coli K12-MG1655 유래 pntAB (NcoI, BamHI)를 탐재한 pCOLADuet-1
pKD13	AmpR, FRT-KmR-FRT, oriR6K (ts)	addgene
pSIJ8	AmpR, araC-ParaB::gam-bet-exo-tL3, rhaR-rhaS, prhaB::flp-tL3, Rep ori1, repA101 (ts)	addgene

표 4. 유전자 과다 발현 또는 결손에 사용된 프라이머

프라이머	서열
과다 발현
PmgtA-UTR_ SRRz -luxTerm
SRRz-SacI-fw	CGAGCTCAAGGAGATATAATGCCAGAAAAACATGACCT
SRRz-luxTerm-PstI	CGGCTGCAGAATCTGGCTTTTTATATTCTCTAAGCGCGTGTGTATTGCTC
SacI-PmgtA-UTR-fw	CTCGAGCTCCTTTCGTTATTCAGCACCCG
SacI-PmgtA-UTR-rv	CGAGCTCAAGGAGTCCCTCCGCACTGT
Bsu36i-PmgtA-UTR-fw	CGCCTCAGGCTTTCGTTATTCAGCACCCG
SRRz-luxTerm-Bsu36i	CAGCCTGAGGAAATAATAAAAAAGCCGGATTAATAATCTGGCTTTTTATATTC
zwf
zwf-BglII-fw	GAGAGATCTATGGCGGTAACGCAAACAGC
zwf-KpnI-rv	GCGGGTACCTTACTCAAACTCATTCCAGGAAC
gsk
gsk-KpnI-fw	GTAAAAGGTACCATGAAATTTCCCGGTAAACGT
gsk_XhoI-rv	CGACCTCGAGTTAACGATCCCAGTAAGACTC
rcsA
rcsA-NdeI-fw	GTATCATATGTCAACGATTATTATGG
rcsA-BglII-rv	CCAAGATCTATGTGTTAGCGCATGTTGAC
lacY
lacY-BamHI-fw	GAAAGGATCCATGTACTATTTAAAAAACACAAAC
lacY-HindIII-rv	CATTAAGCTTTTAAGCGACTTCATTCAC
lacY-S209I-fw	ATTCGGCATTTATTCTTAAGCTGGCACTGGAACTG
lacY-S209I-rv	CTTAAGAATAAATGCCGAATGGTTGGCACC
trxA
trxA-BglII-fw	GAGAGATCTATGAGCGATAAAATTATTCACCTGAC
trxA-KpnI-rv	CGAAGGTACCATTCCCTTACGCCAGGTTAG
manC-manB
manCB-NcoI-fw	CATACCATGGCGCAGTCGAAACTCTATCCAG
manCB-HindIII-rv	CCCAAGCTTTGGGGTAAGGGAAGATCCGAC
gmd-wcaG
gmd-NdeI-fw	CGCCATATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACC
gmd-KpnI-rv	GGCGGTACCTTCCTGACGTAAAAACATCATT
pntA-pntB
pntAB-NcoI-fw	GGGCCATGGATGCGAATTGGCATACCAAG
pntAB-BamHI-rv	CCGGGATCCTTACAGAGCTTTCAGGATTG
넉아웃
lacIZYA-koF13	GTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTA GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
lacIZYA-koR13	TTAAACTGACGATTCAACTTTATAATCTTTGAAATAATAGTGCTTATCCC GATCCGTCGACCTGCAGTTC
wcaJ-koF13	ATGACAAATCTAAAAAAGCGCGAGCGAGCGAAAACCAATGCATCGTTAATC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
wcaJ-koR13	TCAATATGCCGCTTTGTTAACGAAGCCCTTGAATACCGTCAGGAAAACGA GATCCGTCGACCTGCAGTTC
lon-koF13	CAGTCGTGTCATCTGATTACCTGGCGGAAATTAAACTAAGAGAGAGCTCT GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
lon-koR13	CGAATTAGCCTGCCAGCCCTGTTTTTATTAGTGCATTTTGCGCGAGGTCA GATCCGTCGACCTGCAGTTC
clpYQ-koF13	TACTTTTGTACGGGGTTTGTACTCTGTATTCGTAACCAAGGGGTCAGCTC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
clpYQ-koR13	GCCTTTCAGCCCCATCAAACAATGATGAAAATGATTGAACGCGATTATAG GATCCGTCGACCTGCAGTTC
trxB-koF13	ATCTCATGGGCACGACCAAACACAGTAAACTGCTTATCCTGGGTTCAGGC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
trxB-koR13	GCATGGTGTCGCCTTCTTTACTTTTGTTACTGATTTGTAAAATTATTTTG GATCCGTCGACCTGCAGTTC

밑줄: 제한효소 부위 (과다 발현), 벡터 결합부 (넉아웃)

발현 벡터 구축:

pET - manCB - gmd - wcaG

유전자 manC - manB 및 gmd - wcaG를 E. coli K-12 MG1655의 게놈 DNA로부터 표 4에 열거된 프라이머를 사용해 증폭시켰다. 먼저, gmd-wcaG PCR 산물을 NdeI/KpnI로 절단하고, 동일하게 절단된 벡터 pETDuet-1 (도 2)에 삽입하여, pET-gmd-wcaG를 제조하였다. 그런 후, manC - manB PCR 단편을 NcoI/HindII로 절단하고, 동일하게 절단된 벡터 pET-gmd-wcaG에 삽입하여 벡터 pET-manCB-gmd-wcaG (도 3)를 제조하였다. 선택한 클론을 암피실린 (100 ㎍ ml^{- 1})이 첨가된 LB 배지에서 배양하고, 제한효소 맵핑 및 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.

pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz

E. coli 코돈 최적화된 인간 HSP70 유전자를 합성하였으며, pUC57 벡터 (GeneScript)에서 수득하였다. hHSP70 유전자를 NdeI/BglII 절단을 통해 벡터로부터 단리한 다음 동일하게 절단된 벡터 pCDFDuet-1 (도 4)에 삽입하여, pCDF-hHSP70을 제조하였다. lacY-유전자를 E. coli K12-MG1655의 게놈 DNA로부터 표 4에 열거된 프라이머를 사용해 증폭시켰다. 서브클로닝을 위해, PCR 산물을 벡터 pUC19 (도 5)에 BamHI/HindIII 제한효소 부위를 통해 삽입하였다. 부위 특이적인 돌연변이 유발을 수행하여, 아미노산 치환 S209I (lacY*)을 유도하는 돌연변이를 도입하였다. 그런 후, lacY* 유전자를 벡터 pUC19-lacY*에서 BamHI/HindIII를 이용해 절단하고, 동일하게 절단된 벡터 pCDF-hHSP70에 삽입하여, pCDF-lacY*-hHSP70을 제조하였다. N-말단 트리플 Asp-tag가 첨가 또는 비첨가되고 E. coli 코돈 최적화된, 헬리코박터 필로리 유래 futC 유전자를 pUC57 벡터 (GeneScript)에서 제공받았다. futC 단편을 pUC57로부터 NcoI/BamHI 제한효소를 통해 단리하고, pCDF-lacY*-hHSP70/NcoI/BamHI에 삽입하여, pCDF-futC-lacY*-hHSP70을 제조하였다. trxA 유전자를 E. coli K12-MG1655로부터 증폭시켜, pCDF-futC-lacY*-hHSP70에 BglII/KpnI 절단에 의해 삽입하여 플라스미드 pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA를 제조하였다. 마지막으로, 박테리오파지 lambda 유래의 SRRz 유전자를 E. coli BL21 (DE3)로부터 증폭시키고, 비브리오 피셔리 유래 2 방향성 LuxICDABEG-종결인자를 3' 말단에 도입하고, SacI/PstI로 절단한 다음 동일하게 절단된 벡터 pUC19에 삽입하였다. mgtA의 프로모터를 E. coli BL21 (DE3)로부터 5'-UTR 영역과 함께 증폭시키고, SacI로 절단한 다음 pUC19-SRRz-luxTerm/SacI에 삽입하여 pUC-PmgtA-UTR-SRRz-luxTerm을 제조하였다. 유전자 카세트 PmgtA-UTR-SRRz-luxTerm을 마지막으로 증폭시키고, 이를 Bsu36i로 절단한 다음 pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA/Bsu36i에 삽입하여 pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz (도 6)를 제조하였다. 선택한 클론을 스트렙토마이신 (50 ㎍ ml^{- 1})이 첨가된 LB 배지에서 배양하고, 제한효소 맵핑 및 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.

pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsk

rcsA 유전자를 E. coli K12-MG1655에서 증폭시키고, 이를 NdeI/BglII로 절단한 다음 동일하게 절단된 벡터 pCOLADuet-1 (도 7)에 삽입하여 pCOL-rcsA를 제조하였다. 다음으로, zwf 유전자를 E. coli K12-MG1655로부터 증폭시키고, 이를 pCOLA-rcsA/BglII/KpnI에 삽입하여 pCOLA-rcsA-zwf를 제조하였다. 그런 후, gsk 유전자를E. coli K12-ATCC10798로부터 증폭시키고, 이를 KpnI/XhoI로 절단한 다음 pCOLA-rcsA-zwf/KpnI/XhoI에 삽입하여 pCOLA-rcsA-zwf-gsk를 제조하였다. 마지막으로, pntAB 유전자를 E. coli K12-MG1655로부터 증폭시키고, 이를 NcoI/BamHI로 절단한 다음 pCOLA-rcsA-zwf-gsk/NcoI/BamHI에 삽입하여 벡터 pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsk (도 8)를 제조하였다. 선택한 클론을 카나마이신 (50 ㎍ ml^{- 1})이 첨가된 LB 배지에서 배양하고, 제한효소 맵핑 및 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.

산업적인 이용가능성

본 발명은 개선된 인간 모유 올리고당 (HMO) 생산 수단을 제공한다. 본 발명의 미생물 및 생산 방법에 의해 생산된 HMO는 예를 들어 유아 영양, 임상 영양, 기능 식품 및 동물 사료에 기능성 성분으로서 산업적으로 광범위하게 활용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> OligoScience Biotechnology GmbH <120> Microorganism for producing human milk oligosaccharide <130> 198 377 <160> 42 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FWD primer Pmgt <400> 1 gtatactccg gagcaaacgc ctgaactccc 30 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REV primer Pmgt <400> 2 tctagaggaa gaataagtac gtgctatatt tag 33 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FWD primer PmgtA <400> 3 cgagctcctt tcgttattca gcacccg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REV primer PmgtA <400> 4 cgagctcgcg atataatacc tgctggc 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FWD primer mgtA 5'UTR <400> 5 cgagctcctt tcgttattca gcacccg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REV primer mgtA 5'UTR <400> 6 cgagctcaag gagtccctcc gcactgt 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FWD primer SRRZ gene <400> 7 ccgcatatgc cagaaaaaca tgacctg 27 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REV primer SRRZ gene <400> 8 ttagtcgacg caactctatc tgcactgctc 30 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRRz-SacI-fw <400> 9 cgagctcaag gagatataat gccagaaaaa catgacct 38 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRRz-luxTerm-PstI <400> 10 cggctgcaga atctggcttt ttatattctc taagcgcgtg tgtattgctc 50 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-PmgtA-UTR-fw <400> 11 ctcgagctcc tttcgttatt cagcacccg 29 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacI-PmgtA-UTR-rv <400> 12 cgagctcaag gagtccctcc gcactgt 27 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bsu36i-PmgtA-UTR-fw <400> 13 cgcctcaggc tttcgttatt cagcacccg 29 <210> 14 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRRz-luxTerm-Bsu36i <400> 14 cagcctgagg aaataataaa aaagccggat taataatctg gctttttata ttc 53 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf-BglII-fw <400> 15 gagagatcta tggcggtaac gcaaacagc 29 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> zwf-KpnI-rv <400> 16 gcgggtacct tactcaaact cattccagga ac 32 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gsk-KpnI-fw <400> 17 gtaaaaggta ccatgaaatt tcccggtaaa cgt 33 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gsk_XhoI-rv <400> 18 cgacctcgag ttaacgatcc cagtaagact c 31 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rcsA-NdeI-fw <400> 19 gtatcatatg tcaacgatta ttatgg 26 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rcsA-BglII-rv <400> 20 ccaagatcta tgtgttagcg catgttgac 29 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacY-BamHI-fw <400> 21 gaaaggatcc atgtactatt taaaaaacac aaac 34 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacY-HindIII-rv <400> 22 cattaagctt ttaagcgact tcattcac 28 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacY-S209I-fw <400> 23 attcggcatt tattcttaag ctggcactgg aactg 35 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacY-S209I-rv <400> 24 cttaagaata aatgccgaat ggttggcacc 30 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trxA-BglII-fw <400> 25 gagagatcta tgagcgataa aattattcac ctgac 35 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trxA-KpnI-rv <400> 26 cgaaggtacc attcccttac gccaggttag 30 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> manCB-NcoI-fw <400> 27 cataccatgg cgcagtcgaa actctatcca g 31 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> manCB-HindIII-rv <400> 28 cccaagcttt ggggtaaggg aagatccgac 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gmd-NdeI-fw <400> 29 cgccatatgt caaaagtcgc tctcatcacc 30 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gmd-KpnI-rv <400> 30 ggcggtacct tcctgacgta 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Claims (15)

1. 인간 모유 올리고당 (human milk oligosaccharide)을 생산하기 위한 유전자 변형 미생물로서,
   상기 미생물이 선택적으로 박테리아이고, 바람직하게는 에세리키아 콜라이 (E. coli)인, 유전자 변형 미생물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 미생물이 유도성 세포용해 시스템 (inducible lysis system)을 포함하고,
   상기 유도성 세포용해 시스템이 선택적으로 자가-유도성 (auto-inducible)인, 유전자 변형 미생물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 유도성 세포용해 시스템이 Mg^{2 +}-조절성이거나, 및/또는
   상기 유도성 세포용해 시스템이 선택적으로 외인성 유리 Mg^{2 +} 농도에 의해 조절되거나, 및/또는
   상기 미생물이 선택적으로 Mg^{2 +}-조절성 프로모터를 포함하거나, 및/또는
   상기 미생물이 선택적으로 부가적인 Mg^{2 +}-조절성 인자, 바람직하게는 에세리키아 콜라이의 mgtA 유전자의 5'UTR을 더 포함하는, 유전자 변형 미생물.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
   상기 미생물이 세포용해 유전자를 포함하고,
   상기 세포용해 유전자가 선택적으로 박테리오파지 유래 세포용해 유전자인, 유전자 변형 미생물.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미생물이 Mg^{2 +}-조절성 프로모터 및 세포용해 유전자를 포함하고,
   상기 세포용해 유전자(들)의 발현이, Mg^{2 +}-조절성 프로모터에 의해, 선택적으로 부가적인 Mg^{2 +}-조절성 인자에 의해 제어되는, 유전자 변형 미생물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미생물이 락토스를 글루코스 및 갈락토스로 절단할 수 없거나, 및/또는
   선택적으로 lac 오페론이 바람직하게는 결손에 의해 불활성화된, 유전자 변형 미생물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미생물이 락토스 퍼미아제 (lactose permease)를 코딩하는 외인성 유전자를 포함하고,
   상기 락토스 퍼미아제가 바람직하게는 E. coli LacY 단백질이고,
   상기 락토스 퍼미아제가 선택적으로 A198V 및/또는 S209I 돌연변이를 포함하는, 유전자 변형 미생물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 인간 모유 올리고당이 2'-푸코실락토스 및/또는 3'-푸코실락토스인, 유전자 변형 미생물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미생물이 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 외인성 유전자를 포함하고,
   상기 푸코실트랜스퍼라제가 바람직하게는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 및/또는 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제이고,
   상기 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 선택적으로 이종의 유전자이거나, 및/또는 상기 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 선택적으로 이종의 프로모터에 의해 구동되고, 선택적으로 상기 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 상기 미생물에서 발현을 위해 코돈-최적화된, 유전자 변형 미생물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물이 샤페론 (chaperone)을 코딩하는 이종의 유전자를 포함하고,
    상기 샤페론이 바람직하게는 인간 Hsp70인, 유전자 변형 미생물.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로, 바람직하게는 E. coli로부터 유래된, rcsA 유전자가 과다 발현되거나; 및/또는
    선택적으로, Lon 프로테아제 패밀리 단백질, 바람직하게는 E. coli Lon 프로테아제를 코딩하는 유전자가, 바람직하게는 결손에 의해 불활성화되거나; 및/또는
    선택적으로, wcaJ 유전자가 바람직하게는 결손에 의해 불활성화되거나; 및/또는
    선택적으로, 바람직하게는 E. coli로부터 유래된, zwf 유전자와 2종의 pntAB 유전자가 과다 발현되거나; 및/또는
    선택적으로, 바람직하게는 E. coli로부터 유래된, gsk 유전자가 과다 발현되거나; 및/또는
    선택적으로, 바람직하게는 E. coli로부터 유래된, trxA 유전자가 과다 발현되거나; 및/또는
    선택적으로, trxB 유전자가, 바람직하게는 결손에 의해, 불활성화된, 유전자 변형 미생물.
12. 인간 모유 올리고당의 제조 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 배지가 선택적으로 락토스 및/또는 유리 Mg^{2 +} (free Mg^{2 +})를 더 포함하며,
    선택적으로, 배양 종료시 상기 배지내 인간 모유 올리고당의 농도가 적어도 30 g/L, 바람직하게는 적어도 50 g/L이고,
    바람직하게는, 상기 인간 모유 올리고당이 2'-푸코실락토스 및/또는 3'-푸코실락토스인, 방법.
13. 제12항에 있어서,
    (b) 배양 배지 및/또는 미생물 자체로부터 인간 모유 올리고당을 정제하는 단계를 포함하며,
    선택적으로, 유도성 세포용해 시스템을 통해 세포용해가 유도된 후 배양 배지로부터 인간 모유 올리고당을 정제하거나, 및/또는 선택적으로 배지내 유리 Mg^{2 +} 농도가 10 μM 이하이거나 및/또는 세포용해를 직접 가시화할 수 있는 시점에 배양 배지로부터 인간 모유 올리고당을 정제하는, 방법.
14. 제12항에 따른 방법에 의해 수득가능한 배지 또는 제13항에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 모유 올리고당
15. 동물 사료의 제조에 있어 제14항에 따른 배지 또는 인간 모유 올리고당의 용도.

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