KR20200034169A - 항균 활성, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 jdfm lp11 균주 및 이의 용도 - Google Patents

항균 활성, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 jdfm lp11 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균 활성, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11(KACC81076BP) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 LP11 균주는 장 유해 미생물의 생육을 억제하고, 내산성 및 내담즙성을 가질 뿐만 아니라, 장부착능 및 항노화 활성이 우수한 특징이 있다. 따라서, 상기 JDFM LP11 균주를 포함하는 항균용, 생균제, 동물 사료용 조성물 등의 제조에 다양하게 이용될 수 있으므로, 관련 산업 분야에 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

항균 활성, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주 및 이의 용도{Lactobacillus plantarum JDFM LP11 strain having antimicrobial activity, anti-aging activity and probiotics properties and uses thereof}
본 발명은 항균 활성, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
국내 양돈산업의 현대화와 규모화에 따라 과거에 비해 대규모로 밀집된 사육 환경으로 바뀌며 생산효율을 높이고 있다. 하지만, 이러한 대규모 군사사육 형태 및 생산성 위주의 사양관리로 인해 돼지는 점차 여러 질병에 노출될 위험성이 높아졌다. 실제로도 양돈 농가에서는 4P라 하여, PMWS(Postwearing Multisystemic Wasting Syndrome, 이유 후 전신소모성증후군), PRDC(Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지 호흡기 질병 복합 감염증), PED(Porcine Epidemic Diarrhea, 돼지유행성설사) 및 PRRS(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, 돼지 생식기 호흡기증후군)와 같은 각종 소모성 질병으로 인해 경제적인 측면에서 많은 어려움을 겪고 있다. 이를 보완하기 위해 양돈장은 환경적인 개선 및 돼지 개체들의 면역력 강화 등의 질병 관리가 필요하다.
특히, 신생자돈은 위장 및 장내에 균총이 형성되지 않은 상태로 태어나 생후 일주일 전후부터 균총을 형성시킨다. 균총이 형성되기 전까지는 면역적으로 불완전한 상태이기 때문에 장내에 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 병원성 미생물의 번식으로 발생하는 질병의 위험이 있다. 또한, 아직 위장이 미성숙한 상태로 모유에서 고형의 사료로 섭취물의 변화가 일어나는 이유 시기에는 섭취물의 변화뿐만 아니라 모돈과의 분리 및 사육환경의 변화와 같은 외부적인 요인으로 인한 스트레스로 소화 및 흡수 기능의 장애로 설사 또는 변비가 발생하게 된다. 위와 같은 문제로 자돈은 설사 등을 유발하는 소화 기능의 장애로 성장률 및 사료효율이 감소하게 되어 영양소 결핍이 일어나 심각할 경우 폐사로까지 이어지게 된다. 그러나 자돈의 사료에 생균제를 첨가함으로써 장내 유산균과 같은 유익균이 우점하게 되어 장내의 pH가 저하됨으로써 대장균과 같은 유해균의 성장 억제 및 감소로 위와 같은 소화기성 질병에 대한 문제들을 개선해 성장률과 사료 효율을 높여줄 수 있다는 연구결과가 보고되어 있다. 또한, 생균제의 첨가 급여는 성장률과 사료 효율의 증대뿐만 아니라 락타아제(lactase)의 활성을 높여준다는 연구결과도 보고되어있다. 면역력 강화 외에도 생균제를 돼지에게 급여하게 되면 생산성 향상 및 돼지고기의 품질 개선에 도움을 줄 수 있다.
한편, 생균제, 즉 프로바이오틱스(probiotics)란 섭취되어 숙주 동물에게 여러 이로운 효과를 내는 살아있는 미생물을 총칭하며 주로 유산균류가 이에 속한다. 유산균(lactic acid bacteria, LAB)으로는 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacilus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 등이 있다. 이들 유산균은 장내로 유입된 후 장내 상피세포에 착생하게 되어 유해 미생물의 장 정착을 방지하고 항균 물질을 분비함으로써 유해 미생물의 생육을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 면역활성 증진, 항암 작용 등의 효능을 가지고 있다. 유산균이 장내에 유입되어 자체적인 대사활동을 통해 분비하는 물질은 숙주에 많은 이로움을 주기 때문에 유산균을 이용한 많은 연구가 진행되고 있다. 유산균은 대부분 동물의 장내에 정상적으로 존재하며 장내 미생물의 균형을 유지하고 숙주의 건강에 유익한 영향을 끼친다. 유산균은 장내 미생물 균형에 도움을 주고 항균 활성, 면역 활성 및 항암 활성 등 많은 유용한 점이 있음에도 불구하고, 현재 생균제로서 사용되고 있는 유산균의 대부분은 정확한 생균제로서의 평가가 이루어지지 않은 경우가 다수이며, 타 유산균의 도용을 억제할 수 있는 시스템 개발도 전무한 것이 현실이다. 또한, 가축용 생균제는 가축의 장내에서 분리하여 개발하는 것이 가장 이상적이나, 많은 생균제로 사용되는 균주가 그러하지 못하고 있다.
한편, 한국등록특허 제1335454호에는 '신규한 락토바실러스 속 균주 및 이의 생균제 용도'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1634270호에는 '락토바실러스 플랜타룸 JSA22 균주 및 이를 포함하는 조성물'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 항균 활성, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 돼지 분변으로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주(KACC81076BP)가 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 생육을 억제하고, 내산성, 내담즙성 및 장 부착능을 가질 뿐만 아니라, 항노화 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물의 생육을 억제하고, 내산성, 내담즙성, 장 부착능 및 항노화 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주(기탁번호: KACC81076BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주는 장 유해 미생물의 생육을 억제하고, 내산성 및 내담즙성을 가질 뿐만 아니라, 장부착능 및 항노화 활성이 우수한 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 균주는 생균제(프로바이오틱스), 항균용 조성물 및 동물 사료용 조성물 등의 제조에 다양하게 이용될 수 있으므로, 관련 산업 분야에 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주(KACC81076BP)를 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에 노출시켰을 때, 상기 JDFM LP11 균주의 예쁜꼬마선충의 장 우점능(A) 및 수명 연장 효과(B)를 확인한 결과이다. LGG는 비교대조군으로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이며, OP50은 예쁜꼬마선충의 일반적인 먹이로서 대장균 OP 균주를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 내산성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 내담즙성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 돼지 장 부착능을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유해 미생물의 생육을 억제하고, 내산성, 내담즙성, 장 부착능 및 항노화 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주(기탁번호: KACC81076BP)를 제공한다.
본 발명에서는 돼지 분변으로부터 분리한 약 250개의 유산균 중에 예쁜꼬마선충의 장 우점능이 우수한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주를 선발하였다. 상기 JDFM LP11 균주는 예쁜꼬마선충의 수명을 연장시킬 뿐만 아니라, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 생육을 억제하고, 내산성, 내담즙성 및 돼지 장 부착능을 가지는 것을 확인하였다. 따라서 상기 균주를 농업생명공학연구원에 2018년 08월 13일로 기탁하였다(기탁번호: KACC81076BP).
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
본 발명의 "프로바이오틱스"는 살아 있는 균 즉, 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 장내 세균 총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 사람 및 동물에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제에서, 상기 균주 배양액에는 균주가 생산해 낸 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균 물질들이 포함되어 있어 생균제 조성물의 유효성분으로 포함되었을 때 균주를 포함한 조성물과 동등한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 상기 락토바실러스 속 유산균과 함께 가축이 섭취하기에 적합하고, 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며, 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 장내 병원성 세균의 억제, 내산성 및 내담즙성 등이 우수한 균주 또는 그 배양액을 포함함으로써, 다양한 장내 병원성 세균들의 감염 억제 및 치료 효과가 우수하고, 숙주의 장내 균총을 정상화시킴으로써 세균성 질병을 예방할 수 있음은 물론, 장내 병원성 세균 억제제, 면역 증강제, 살균제, 소화제, 정장제 및 지사제 등의 생균제 조성물로서 사료, 식품 및 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 "항균용 조성물"은 세균과 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액 그 자체일 수 있고, 제형화에 필요한 부형제나 희석제 등의 통상적으로 사용되는 첨가제가 더 포함될 수 있으며, 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외의 다른 항균 물질을 더 포함할 수도 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 항균용 조성물에 포함되는 본 발명의 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 전체 조성물을 기준으로 1 ~ 100중량%, 바람직하게는 10 ~ 100중량%, 더욱 바람직하게는 50 ~ 100중량%일 수 있다.
본 발명의 "배양물"은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 동물 사료용 조성물에서, 상기 동물은 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 돼지인 것을 특징으로 한다.
상기 사료 조성물은 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하여 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 이에 한정되지는 않으나 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유산균과 여러 가지 미생물 또는 효소를 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유산균을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명의 유산균으로 발효시킴으로써 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 균주 분리
건강한 돼지 분변(전라북도 소양군 도지 농장)으로부터 유산균(lactic acid bacteria, LAB) 균주들을 분리하였다. 구체적으로, 10g의 돼지 분변을 45mL의 L-시스테인 수용액(8.5g NaCl, 0.5g L-시스테인 및 1L 증류수)에 희석한 후, 0.004% BCP(bromocresol purple)가 첨가된 MRS(DE MAN, ROGOSA 및 SHARPE) 아가 배지에 분주하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 콜로니 중에서 단일 콜로니를 형성하면서 노란색을 띄는 콜로니를 임의로 선별하여 MRS 액체 배지에 계대배양한 후, MRS 아가 배지에 재접종하여 순수분리하였다. 그람 염색 및 카탈라아제 시험과 같은 기본 분석은 버지의 방법(Bergey's method)에 따라 수행하였으며, 분리된 모든 유산균들은 하기 실시예에 사용하기 전에 글리세롤 수용액을 포함하는 MRS 액체 배지에 -80℃의 조건으로 보관하였다.
2. 예쁜꼬마선충을 이용한 분리 균주들의 장 부착능 및 수명 연장 확인
본 발명에 사용된 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 전북대학교에서 보관중인 돌연변이 균주 CF512 fer - 15(b26)II;fem -1( hc17 ) IV(Kim and Mylonakis, 2012, Infect Immun., 80(7), 2500-8)를 사용하였으며, 상기 선충 배양을 위해, 대장균(E. coli) OP50 배양액을 NGM(nematode growth medium) 플레이트에 균일하게 분주하고 건조시킨 후, 예쁜꼬마선충을 옮기고 25℃의 조건으로 배양하였다. 상기 분리한 유산균 균주들이 숙주(선충) 수명을 연장시키는지 확인하기 위해, 가리건 등의 방법(Garigan et al., 2002, Genetics, 161(3), 1101-1112)을 변형하여 NGM 배지 플레이트에서 20개의 선충 그룹을 각 유산균 균주에 노출시킨 후, 선충 생균수를 매일 측정함으로써, 선충 수명을 측정하였다.
또한, 장 우점능(colonization)이 우수한 유산균 균주를 스크리닝하기 위해, 가르시아 등의 방법을 약간 변형하여 선충 장관 내의 유산균 균주들의 수를 측정하였다. 구체적으로, 니스타틴(nystatin, 5㎍/mL)이 첨가된 NGM 배지 플레이트에서 선충을 각 프로바이오틱스 후보 균주에 5일 동안 노출시킨 후, 10개의 선충을 무작위로 선택하여 M9 버퍼(3.0 g KH2PO4, 6.0 g Na2HPO4, 5.0 g NaCl, 1M MgSO4 1m 및 1L 증류수)에 2번 세척하고, 카나마이신(Kanamycin, 100㎍/mL) 및 스트렙토마이신(Streptomycin, 100㎍/mL)이 첨가된 BHI(brain heart infusion) 아가 플레이트에 옮겼다. 이후에, 5㎕의 겐타마이신 수용액(Gentamycin, 25㎍/ml)에 5분 동안 노출시킨 후, 선충을 M9 버퍼로 5번 세척하여 1% Triton X-100이 첨가된 M9 버퍼에 옮긴 후, 막자를 이용하여 기계적으로 파쇄하였다. 생성된 선충 용해물을 MRS(pH 5.0) 아가 배지에 분주하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였으며, 비교대조군으로 락토바실러스 람노서스 GG 균주를 사용하였다.
3. pH 및 담즙 내성
낮은 pH 조건에서의 유산균 균주들의 생육 활성은 1,000　unit/mL의 펩신(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 포함하는 산성화된 MRS 액체 배지(pH 2.5)에서 확인하였으며, 내담즙성은 0.5% 옥스갈(oxgall, Sigma, USA)이 첨가된 MRS 배지에서 분리 균주들의 생육 활성을 통해 확인하였다. 균주는 약 1.0×107　CFU/mL의 농도로 접종하였으며, 내산성은 37℃에서 3시간 배양한 후 생균수를 측정하였고, 내담즙성은 37℃에서 24시간 배양한 후 생균수를 측정하여 확인하였다.
4. 장 상피 세포를 이용한 장 부착능 분석
상기 분리한 유산균 균주들의 돼지 장 상피세포 부착능을 분석하였다. 돼지 장관 상피세포주인 IPEC-J2(intestinal porcine epithelial cell from jejunum)를 10% FBS(fetal bovine serum, Sigma, USA)를 함유하는 RPMI-1640 배지(Sigma, USA)가 담긴 24-웰 조직배양 플레이트에 웰 당 4　×　104　세포의 농도로 준비하였다. 상기 IPEC-J2 세포에 유산균 균주 1　×　107　CFU/mL를 처리하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, IPEC-J2 세포를 PBS로 6번 세척하였다. 장 상피세포에 부착된 유산균 균주는 냉각된 멸균수로 반복적으로 피펫팅하여 분리하고, PBS 수용액으로 희석한 후 MRS 아가 플레이트에서 계수하였다.
5. 항균 활성
장 유해 미생물에 대한 락토바실러스의 억제 효과는 오버레이(overlay) 방법을 이용하여 확인하였다. 돼지 장의 병원균으로 대표적인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 대상으로 분리 균주들의 항균 활성을 확인하였다. 분리 균주를 LB(Luria-Bertani, Difco, USA) 액체 배지에 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 10㎕의 분리 균주 배양액을 MRS 아가 배지에 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음, 반고체 아가 배지로 중첩시키고, 37℃에서 18~24시간 배양한 병원균인 살모넬라 티피뮤리움 및 에스케리키아 콜라이 배양액을 각각 접종하였다. 억제 활성은 분리 균주의 콜로니 주변에 저해환(clear zone) 형성 유무를 통해 확인하였다.
6. 16S rRNA 시퀀싱을 이용한 분리 균주의 동정
각 분리 균주로부터 염색체 DNA를 추출하였으며, 일반적인 프라이머를 이용하여 16S rRNA 염기서열을 증폭시켰다. 증폭된 산물은 겔 추출 키트(Intron, Korea)를 이용하여 시퀀싱 분석을 위해 정제하였다. 최종 산물의 염기서열은 ABI 377 automated DNA sequencer(Perkin Elmer, USA)를 이용하여 분석되었으며, 염기서열 상동성은 DNA 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 통해 확보된 염기서열들과 비교함으로써 확인하였다. 최종 선발된 유산균은 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통해 동정하였으며, 본 발명자들은 본 발명에서 분리하고 최종 선발한 균주를 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11이라 명명하였다.
본 발명에 사용한 프라이머
프라이머 서열번호 염기서열(5'-3') 반응조건
정방향 2 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 94℃ 5 min →(94℃ 1 min
→50-55℃ 60 sec
→72℃ 40 sec →72℃ 5 min) 30 cycle
역방향 3 GGTTACCTTTGTTACGACTT
7. 통계처리
예쁜꼬마선충의 생존 유무는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 이용하여 분석하였고, 로그-랭크 검증(STATA6; STATA, College Station, TX, USA)을 통해 편차를 분석하였다. Student's t-test은 분리 균주의 CFU 계수 측정값의 통계적 편차를 확인하기 위해 수행하였다. 결과는 p < 0.05의 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. 예쁜꼬마선충을 이용한 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 장 부착능 및 숙주의 수명 연장 효과 확인
돼지 분변으로부터 분리한 약 250개의 유산균들을 대상으로 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 이용하여 인비보(in vivo)에서 분리한 유산균들의 장 우점능(colonization) 및 숙주의 수명 연장 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 1A에 개시한 바와 같이 분리한 유산균들 중에 숙주에 높은 장 우점능을 나타내는 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주를 최종적으로 선발하였다. 상기 JDFM LP11 균주는 숙주의 장벽에 4.3 CFU/mL/worm 이상으로 존재하였으며, 이를 통해, 비교대조군인 장 부착능을 가지는 락토바실러스 플란타룸 GG 균주(3.2 CFU/mL/worm)보다 장 우점능이 우수한 것을 확인하였다. 마찬가지로, JDFM LP11 균주에 노출된 예쁜꼬마선충들은 수명이 상당히 연장되었다(도 1B). 특히, JDFM LP11 균주는 JDFM LP11 균주에 노출되지 않고 대장균 OP50(선충의 일반적인 먹이)을 식이한 선충들과 비교하여 평균 수명을 현저하게 연장시키는 것을 보였다. 이러한 결과를 통해, JDFM LP11 균주는 항노화 활성을 보여줌으로써 숙주의 건강 증진 효과를 입증하였을 뿐만 아니라, 숙주의 장 우점능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 내산성 , 내담즙성 , 장 우점능 및 항균 활성 확인
소화관 환경 조건을 반영하는 낮은 pH와 담즙염에 대한 내성은 프로바이오틱스의 기본적인 특징이다. 따라서 본 실시예 2에서는 종래의 인비트로(in vitro) 방법을 이용하여 최종 선발된 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주의 프로바이오틱스 특징들을 확인하였다. 내산성 시험은 사람의 대장 환경과 유사한 산성 조건(pH 2.5)인 1,000 unit/mL의 펩신이 첨가된 배지에서 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 생균수를 측정하였다. 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 산성 조건에서 JDFM LP11 균주는 100% 이상의 높은 생존율을 나타내었다. 또한, JDFM LP11 균주를 0.5% 담즙염이 첨가된 배지에서 24시간 동안 배양하여 생존율을 확인한 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 높은 생존율을 보였으며, 비교대조군과 유사한 결과를 나타내었다.
또한, 돼지 장 상피세포주인 IPEC-J2를 이용하여 JDFM LP11 균주가 소화관 환경에서 지속적으로 생존하는지와 장 우점능을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 JDFM LP11 균주가 IPEC-J2 세포에 강하게 부착한 것을 확인하였다.
또한, 도 5에 개시한 바와 같이 JDFM LP11 균주가 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 생육을 억제하는 효과가 우수한 것을 확인하였다.
농업생명공학연구원 KACC81076BP 20180813
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Claims (6)

  1. 유해 미생물의 생육을 억제하고, 내산성, 내담즙성, 장 부착능 및 항노화 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) JDFM LP11 균주(기탁번호: KACC81076BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 유해미생물은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 항균용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 동물 사료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동물은 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동물 사료용 조성물.
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