KR20200034748A - Sost 항체 약학적 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 용액 내에서 SOST 항체 또는 그의 항체 결합 절편을 포함한다. 아울러, 상기 약학적 조성물은 또한 당, 비이온성 계면활성제 또는 다른 부형제를 포함할 수 있다. 수 개월 동안 보관된 후, 상기 약학적 조성물은 양호한 항체 안정성을 보인다.

Description

SOST 항체 약학적 조성물 및 그의 용도
본 발명은 약학적 제조물의 분야, 특히 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편을 포함하는 약학적 조성물, 및 약제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
폐경후 골다공증(PMO) 및 노인성 골다공증을 포함하는 골다공증(OP)은 전신 뼈 대사 질병으로서, 낮은 뼈 질량 및 뼈 미세구조의 붕괴를 특징으로 하며, 감소된 뼈 강도, 증가된 뼈 취약성(fragility), 및 증가된 골절 위험을 야기한다. 통계에 따르면, 전세계적으로 약 2억 명의 사람들이 골다공증을 앓고 있으며, 그 발생률은 가장 흔한 질환 및 빈번하게 발생하는 질환 중 상위 7번째까지 올랐다. 60세 이상의 중국 여성에서 골다공증의 유병률은 60%만큼 높고, 남성에 대한 유병률은 40-50%이다.
운동을 하고, 칼슘 및 비타민 D를 섭취하고, 골절을 방지하기 위한 방법에 대한 지식을 전파하는 것과 같은 전통적인 조치에 더하여, 현재의 의약 치료는 주로 골절을 방지하기 위하여 뼈 흡수의 감소에 초점을 맞춘다. 상기 항-뼈 흡수 약물은 칼시토닌, 비스포스포네이트, 에스트로겐 대체제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제(SERM) 등을 포함한다. 비스포스포네이트로 나타내는 상기 뼈 흡수 억제제는 추가적인 뼈의 손실을 방지할 수 있지만, 손실된 뼈를 재건하지는 못한다. 아울러, 상기 뼈 흡수 억제제는 또한 뼈 흡수를 억제하면서 뼈형성도 억제한다. 호르몬 약물은 정맥 혈전증 및 심혈관 질환을 초래할 위험성이 더 높다. 보다 중요하게는, 뼈 동화작용 약물은, 그 진정한 의미에서, 뼈 질량을 개선할 뿐만 아니라 뼈 미세구조를 효과적으로 개선하고 뼈형성을 촉진해야 한다. 그러나, 이것은 정확하게는 현존하는 항-뼈 흡수 약물이 달성할 수 없는 것이다. 지난 15년 동안, 골절의 위험성을 감소시키기 위한 목적의 다양한 의학적 조치가 임상 시험에서 체계적으로 조사되어 왔지만, 효과적인 약물에 대한 필요성은 여전히 높다. 지금까지, 부갑상선 호르몬(PTH) 약물만이 뼈형성 자극용으로 승인되었다. 그러나, 많은 단점들이 명확하다. 예를 들면, 뼈 리모델링에 대한 그 효과는 지속적이지 않고, 골절의 회복에는 거의 영향이 없으며, 1년 이상까지 매일 피부 주사가 필요하고, 저-용량의 투여만이 요구되며, 비용이 높고 2년 이상 지속적으로 사용할 수 없다; 그 안전성 문제는 미국 FDA 등에 의해 경고된 블랙-박스이다.
스클레로스틴(sclerostin)은 약물 개발을 위한 새로운 생물학적 표적으로 기능한다; 그 메커니즘은 골다공증이 조골세포의 이화작용을 조절함으로써 치료될 수 있다는 점에 기초한다. 이러한 표적은 뼈 대사 조절에 의한 골다공증 치료 분야에서의 간격을 메운다.
스클레로스틴은 SOST 유전자의 발현에 의해 분비되는 당단백질이며, 그 아미노산 서열은 190개 잔기와 시스테인을 함유하는 루프 도메인에 의해 특정된다. 이것은 뼈 세포에서 주로 발현되고, 조골세포, 연골세포, 간, 신장, 골수, 심장, 췌장 및 다른 위치에서 매우 낮게 발현되는 것으로 입증되었다.
연구 결과 스클레로스틴은 저-밀도 지방단백질 수용체 LRP5/6에 결합하여 Wnt 신호전달 경로를 억제함으로써 뼈형성을 조절할 수 있는 것으로 나타났다. 현재, 여러 회사에 의해 개발된 상기 표적에 대한 단일클론 항체 약물이 임상 시험 Ⅲ 상 또는 Ⅱ 상에 진입해 있다. 3 곳의 회사에 의해 제공된 임상 데이터는 모두 골다공증의 치료의 근간이 되는 메커니즘은 상기 표적을 통한 뼈 대사의 조절에 의한 것임을 보여주었고, 또한 안전성 및 현저한 효능을 보여주었다. A㎎en 및 UCB에 의해 제공된 항-스클레로스틴 항체인 로모소주맙에 대한 임상 보고서는 그 안전성 및 내성이 모두 양호하고, 뼈 밀도는 대조군과 비교하여 치료된 뼈에서 현저하게 증가하였음을 나타내었다. 상기 약물은 임상 시험 Ⅲ 상으로 진행하였다. 다른 2가지 단일클론 항체 약물은 각각 Lilly 및 Novartis에 의해 임상 시험 Ⅱ 상으로 나아갔다. 상기 항체들의 적응증(indication)은 골다공증, 뼈 손상/연관 뼈병증 등의 치료를 위한 것이다. 일부 연구는 항-스클레로스틴 항체가 전통적인 비스포스포네이트를 이용한 치료와 충돌하지 않고, 이들 2가지 약물이 조합으로 사용될 수 있음을 보였음은 언급할 만하다.
그러나, 항체 약물은 큰 분자량 및 복잡한 구조를 가지며, 분해, 중합, 및 원하지 않게 화학적으로 변형되기 쉽다. 항체를 투여에 적합하고, 안정성을 유지하며, 보관 및 이후의 사용 동안에 더 나은 효과를 발휘하도록 하기 위해서는 항체 약물의 안정한 제형에 대한 연구가 특히 중요하다.
현재 많은 회사가 항-SOST 항체를 포함하는 약학적 제형을 개발하고 있으며, 예를 들면 WO2016145961, WO2012028683, WO2012135035 등이 있다. 그러나, 새로운 항-SOST 항체와 관련하여, 투여용으로 보다 적합한 항-SOST 항체를 함유하는 약학적 (제형) 조성물을 개발할 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편, 및 버퍼를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 버퍼는 아세테이트 버퍼, 히스티딘 버퍼, 포스페이트 버퍼 또는 숙시네이트 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세테이트 버퍼이며, 보다 바람직하게는 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편의 농도(즉, 상기 버퍼 내에 제조된 상기 SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편이 농도)는 약 1㎎/㎖ 내지 120㎎/㎖이고, 바람직하게는 약 60㎎/㎖ 내지 120㎎/㎖이며, 더욱 바람직하게는 약 80㎎/㎖ 내지 120㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 약 90㎎/㎖ 내지 110㎎/㎖이며, 더욱 바람직하게는 80㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖이다. 상기 농도의 비제한적 구현예는 90㎎/㎖, 91㎎/㎖, 92㎎/㎖, 93㎎/㎖, 94㎎/㎖, 95㎎/㎖, 96㎎/㎖, 97㎎/㎖, 98㎎/㎖, 99㎎/㎖, 100㎎/㎖, 101㎎/㎖, 102㎎/㎖, 103㎎/㎖, 104㎎/㎖, 105㎎/㎖, 106㎎/㎖, 107㎎/㎖, 108㎎/㎖, 109㎎/㎖, 110㎎/㎖를 포함하고, 가장 바람직하게는 약 100㎎/㎖이다.
대안적 구현예에서, 상기 버퍼의 농도는 약 5mM 내지 30mM이고, 바람직하게는 약 10mM 내지 20mM이며, 상기 버퍼의 농도의 비제한적 구현예는 10mM, 12mM, 14mM, 16mM, 18mM, 20mM을 포함하고, 가장 바람직하게는 10mM이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내의 상기 버퍼의 pH 값은 약 4.8 내지 5.5이고, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5이며, 상기 pH의 비제한적 구현예는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5일 수 있고, 가장 바람직하게는 약 5.0이다. 본 발명의 버퍼를 이용해 약학적 조성물을 제형화한 후, 상기 약학적 조성물의 최종 pH는 상기 버퍼의 pH보다 약 0.2-0.3 더 높다. 따라서, 대안적 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물의 pH는 약 4.8 내지 5.5이고, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5이다. 비제한적 구현예, 상기 약학적 조성물의 pH는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5일 수 있고, 가장 바람직하게는 약 5.2 또는 5.3이다.
아울러, 대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 또한 당류(saccharide)를 포함한다. 본 발명의 상기 "당류"는 관습적인 조성의 (CH2O)n 및 그의 유도체를 포괄하며, 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당알코올, 환원당, 비-환원당 등을 포함하고, 글루코오스, 수크로오스, 트레할로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 덱스트란, 글리세롤, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리바이오스, 멜레지토오스, 멜리트리오스, 만노트리오스, 스타키요스, 락툴로오스, 말툴로오스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 이소말툴로오스 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 당류는 바람직하게는 비-환원 이당류이고, 보다 바람직하게는 트레할로오스 또는 수크로오스이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내의 상기 당류의 농도는 약 40㎎/㎖ 내지 95㎎/㎖이고, 바람직하게는 약 60㎎/㎖ 내지 90㎎/㎖이며, 상기 당류의 농도의 비제한적 구현예는 60㎎/㎖, 65㎎/㎖, 70㎎/㎖, 75㎎/㎖, 80㎎/㎖, 85㎎/㎖, 90㎎/㎖를 포함하고, 보다 바람직하게는 80㎎/㎖이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 또한 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머, 트리톤, 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우릴 설포네이트, 나트륨 옥틸 글리코시드, 라우릴-설포베타인, 미리스틸-설포베타인, 리놀레일-설포베타인, 스테아릴-설포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우릴 아미도프로필-베타인, 코카르아미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-베타인, 팔미토일아미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-디메틸아민, 팔미토일아미도프로필-디메틸아민, 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민, 나트륨 메틸 코카아실, 2나트륨 메틸 올레일-타우레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 코폴리머 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이고, 보다 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내의 상기 계면활성제의 농도는 약 0.02㎎/㎖ 내지 0.8㎎/㎖이고, 바람직하게는 약 0.3㎎/㎖ 내지 0.6㎎/㎖이며, 상기 계면활성제의 농도의 비제한적 구현예는 0.3㎎/㎖, 0.35㎎/㎖, 0.4㎎/㎖, 0.45㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 0.55㎎/㎖, 0.6㎎/㎖를 포함하고, 보다 바람직하게는 약 0.4㎎/㎖이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 점도 변형제를 추가로 포함한다. 상기 점도 변형제는 칼슘 염, 염화나트륨, 염화마그네슘 및 아르기닌 염산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 염화칼슘 또는 칼슘 아세테이트이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내의 상기 칼슘 염의 농도는 바람직하게는 약 4.5mM 내지 20mM이고, 바람직하게는 약 4.5mM 내지 10mM이며, 비제한적 예는 4.5mM, 5mM, 5.5mM, 6.0mM, 6.5mM, 7.0mM, 7.5mM, 8.0mM, 8.5mM, 9.0mM, 9.5mM, 10mM을 포함하고, 가장 바람직하게는 약 0.4㎎/㎖이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 1㎎/㎖ - 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편;
(b) 5mM - 30mM의 아세테이트 버퍼;
(c) 45㎎/㎖ - 95㎎/㎖의 트레할로오스;
(d) 0.02㎎/㎖ - 0.8㎎/㎖의 폴리소르베이트 80; 및
(e) 4.5mM - 20mM의 칼슘 염; 바람직하게는 상기 약학적 조성물의 pH는 약 4.8 내지 5.5이고, 보다 바람직하게는 약 5.0 내지 5.2이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 90㎎/㎖ - 110㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편;
(b) 10mM - 20mM의 아세테이트 버퍼;
(c) 60㎎/㎖ - 90㎎/㎖의 트레할로오스;
(d) 0.3㎎/㎖ - 0.6㎎/㎖의 폴리소르베이트 80; 및
(e) 4.5mM - 10mM의 칼슘 염; 바람직하게는 상기 약학적 조성물의 pH는 5.0 내지 5.2이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편;
(b) 10mM의 아세테이트 버퍼;
(c) 80㎎/㎖의 트레할로오스;
(d) 0.4㎎/㎖의 폴리소르베이트 80; 및
(e) 4.5mM의 칼슘 염; 바람직하게는 상기 약학적 조성물의 pH는 5.0이고, 여기서 상기 아세테이트 버퍼는 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 80㎎/㎖ - 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편; 및
(b) 10mM - 20mM의 아세테이트 버퍼; 상기 약학적 조성물의 pH는 5.0 내지 5.2이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편;
(b) 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼, pH 5.0;
(c) 80㎎/㎖의 트레할로오스;
(d) 0.4㎎/㎖의 폴리소르베이트 80; 및
(e) 4.5mM의 염화칼슘.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내에 존재하는 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 각각 서열번호 3, 서열번호 9 및 서열번호 5에 나타낸 것과 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및
각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 것과 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;을 포함한다.
대안적 구현예에서, 상기 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 서열번호 10의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내에 존재하는 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 뮤린(murine) 항체, 키메라 항체, 인간화 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인간화 항체이다.
대안적 구현예에서, 상기 약학적 조성물 내에 존재하는 항-SOST 항체의 경쇄 아미노산 서열은 Ab-5의 경쇄 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성(identity)을 갖고, 상기 항-SOST 항체의 중쇄 아미노산 서열은 Ab-5의 경쇄 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지며, Ab-5 항체의 경쇄 서열은 서열번호 25에 나타나 있고, Ab-5 항체의 중쇄 서열은 서열번호 22에 나타나 있다.
본 발명은 또한 전술한 것과 같은 약학적 조성물을 냉동-건조하는 단계를 포함하는, 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 약학적 조성물을 냉동-건조하는 단계를 포함하는, 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형의 제조 방법을 제공한다.
항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형을 제조하는 방법의 대안적 구현예에서, 상기 냉동-건조하는 단계는 사전-냉동, 1차 건조, 및 2차 건조 단계를 순차적으로 포함한다. 상기 사전-냉동 단계는 진공의 정도와 무관하게 5℃로부터 -40℃ 내지 -50℃, 가장 바람직하게는 -45℃에서 냉동하는 것이다. 상기 1차 냉동-건조를 위한 온도는 -30℃ 내지 0℃이고, 가장 바람직하게는 -27℃이다; 진공의 정도는 0.05mBar 내지 0.2mBar이고, 가장 바람직하게는 0.1mBar이다. 상기 2차 건조를 위한 온도는 20℃ 내지 30℃이고, 가장 바람직하게는 25℃이며, 진공의 정도는 0.05mBar - 0.2mBar, 가장 바람직하게는 0.1mBar로부터 0.005mBar - 0.02mBar, 가장 바람직하게는 0.01mBar로 감소된다.
본 발명은 전술한 것과 같은 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형의 제조 방법에 의해 제조된 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형을 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 동결건조된 제형은 2-8℃에서 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 상기 동결건조된 제형은 40℃에서 적어도 7일, 적어도 14일 또는 적어도 28일 동안 안정하다.
본 발명은 전술한 것과 같은 동결건조된 제형을 재구성하는 단계를 포함하는, 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 제조 방법을 추가로 제공하며, 여기서 재구성을 위한 용매는 주사용수, 생리식염수 및 글루코오스 용액으로 이루어진 군으로부터 비제한적으로 선택된다. 본 발명에 따른 재구성은 상기 단백질이 상기 재구성된 제조물 내에 분산되도록, 즉 대응하는 재구성된 용액이 수득될 수 있도록 상기 동결건조된 단백질 제형을 (주사용수, 생리식염수 및 글루코오스 용액으로 이루어진 군으로부터 비제한적으로 선택되는) 희석액 내에 용해시키는 것을 의미한다.
본 발명은 전술한 것과 같은 항-SOST 항체를 포함하는 재구성된 용액의 제조 방법에 의해 제조된 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액을 추가로 제공한다.
항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 대안적 구현예에서, 상기 항-SOST 항체 및 그의 항원 결합 절편의 농도는 80㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖이다; 가장 바람직하게는 100㎎/㎖이다.
항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 대안적 구현예에서, 상기 재구성된 용액의 pH는 4.8 내지 5.5이고, 바람직하게는 5.3이다.
대안적 구현예에서, 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액은 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼를 추가로 포함하며, 여기서 상기 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼의 농도는 10mM 내지 30mM이고, 바람직하게는 10mM이다.
대안적 구현예에서, 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액은 이당류를 추가로 포함하며, 여기서 상기 이당류는 트레할로오스 또는 수크로오스이다.
항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 대안적 구현예에서, 상기 이당류의 농도는 45㎎/㎖ 내지 90㎎/㎖이고, 바람직하게는 75㎎/㎖ 내지 80㎎/㎖이며, 가장 바람직하게는 80㎎/㎖이다.
대안적 구현예에서, 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액은 계면활성제를 추가로 포함한다; 여기서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트이고, 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.
항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 대안적 구현예에서, 상기 계면활성제의 농도는 0.3㎎/㎖ 내지 0.6㎎/㎖이고, 바람직하게는 0.4㎎/㎖이다.
대안적 구현예에서, 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액은 점도 변형제를 추가로 포함하며, 여기서 상기 점도 변형제는 칼슘 염, 염화나트륨, 염화마그네슘 및 아르기닌 히드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 칼슘 염은 염화칼슘 또는 칼슘 아세테이트로부터 선택된다.
항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 대안적 구현예에서, 상기 칼슘 염의 농도는 4.5mM 내지 20mM이고, 바람직하게는 4.5mM 내지 10mM이며, 가장 바람직하게는 4.5mM이다.
본 발명은 추가로 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형에 관한 것이며, 상기 동결건조된 제형은 전술한 것과 같은 약학적 조성물을 형성하기 위해 재구성된다.
본 발명은 추가로 본 명세서에서 개시된 임의의 안정한 약학적 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 물품 또는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 바이알은 중성 보로실리케이트 유리로 만들어진 주사용 바이알이다.
본 발명은 추가로 SOST-연관 질환 또는 증상의 치료용 약제의 제조에 있어서의 전술한 것과 같은 약학적 조성물, 동결건조된 제형, 또는 재구성된 용액의 용도를 제공하며, 여기서 상기 SOST-연관 질환 또는 증상은 골다공증, 골감소증 또는 골관절염, 류마티스성 관절염, 치주 질환 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 골다공증이다.
본 발명은 추가로 치료적 유효량의 전술한 것과 같은 약학적 조성물, 또는 동결건조된 제형, 또는 재구성된 용액을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, SOST-연관 질환 또는 증상의 치료 및 예방 방법을 제공하며, 여기서 상기 SOST-연관 질환 또는 증상은 골다공증, 골감소증 또는 골관절염, 류마티스성 관절염, 치주 질환 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 골다공증이다.
본 발명은 추가로 전술한 것과 같은 약학적 조성물, 또는 동결건조된 제형, 또는 재구성된 용액을 함유하는 용기를 포함하는 물품을 제공한다.
본 명세서에 개시된 다양한 구현예의 하나, 일부, 또는 모든 특성들은 본 발명의 다른 구현예를 수득하기 위해 추가로 조합될 수 있음이 인식된다. 본 발명의 상기 및 다른 측면들은 본 기술분야의 기술자에게 자명하다. 본 발명의 상기 및 다른 구현예는 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 개시된다.
용어
본 발명을 보다 잘 이해하도록 하기 위하여, 일부 기술적 및 과학적 용어가 아래에 구체적으로 정의된다. 본 문서에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주될 것이다.
"버퍼"는 그 짝 산-염기 성분으로 인해 pH에서의 변화에 저항성인 버퍼를 나타낸다. 이러한 범위에서 pH를 조절하는 버퍼의 예는 아세테이트 버퍼, 숙시네이트 버퍼, 글루코네이트 버퍼, 히스티딘 버퍼, 옥살레이트 버퍼, 락테이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 시트레이트 버퍼, 타르트레이트 버퍼, 푸마레이트 버퍼, 글리실글리신 및 다른 유기산 버퍼를 포함한다.
"히스티딘 버퍼"는 히스티딘 이온을 포함하는 버퍼를 나타낸다. 상기 히스티딘 버퍼의 예는 히스티딘-히드로클로라이드 버퍼, 히스티딘-아세테이트 버퍼, 히스티딘-포스페이트 버퍼, 히스티딘-설페이트 버퍼 등을 포함하고, 바람직하게는 히스티딘-히드로클로라이드 버퍼이다. 상기 히스티딘-히드로클로라이드 버퍼는 히스티딘 및 염산 또는 히스티딘 및 히스티딘 히드로클로라이드에 의해 제조된다.
"시트레이트 버퍼"는 시트레이트 이온을 포함하는 버퍼를 나타낸다. 상기 시트레이트 버퍼의 예는 시트르산-나트륨 시트레이트 버퍼, 시트르산-칼륨 시트레이트 버퍼, 시트르산-칼슘 시트레이트 버퍼, 시트르산-마그네슘 시트레이트 버퍼 등을 포함한다. 바람직한 시트레이트 버퍼는 시트르산-나트륨 시트레이트이다.
"숙시네이트 버퍼"는 숙시네이트 이온을 포함하는 버퍼를 나타낸다. 상기 숙시네이트 버퍼의 예는 숙신산-나트륨 숙시네이트 버퍼, 숙신산-칼륨 숙시네이트 버퍼, 숙신산-칼슘 숙시네이트 버퍼 등을 포함한다. 바람직한 숙시네이트 버퍼는 숙신산-나트륨 숙시네이트 버퍼이다.
"포스페이트 버퍼"는 포스페이트 이온을 포함하는 버퍼를 나타낸다. 상기 포스페이트 버퍼의 예는 2나트륨 수소 포스페이트-나트륨 2수소 포스페이트 버퍼, 및 2나트륨 수소 포스페이트-칼륨 2수소 포스페이트 버퍼 등을 포함한다. 바람직한 포스페이트 버퍼는 2나트륨 수소 포스페이트-나트륨 2수소 포스페이트 버퍼이다.
"아세테이트 버퍼"는 아세테이트 이온을 포함하는 버퍼를 나타낸다. 상기 아세테이트 버퍼의 예는 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼, 아세트산-히스티딘 버퍼, 아세트산-칼륨 아세테이트 버퍼, 아세트산-칼슘 아세테이트 버퍼, 아세트산-마그네슘 아세테이트 버퍼 등을 포함한다. 바람직한 아세테이트 버퍼는 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼이다.
"점도 변형제"는 제형의 점도를 조정하기 위해 첨가되는 관습적인 약학적 물질이다. 본 명세서에 나타낸 점도 변형제는 주로 무기 염 및 아미노산 염을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 무기 염은 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 칼슘 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 아미노산 염은 아르기닌 히드로클로라이드, 히스티딘 히드로클로라이드, 글리신 히드로클로라이드, 및 히스티딘 아세테이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"약학적 조성물"은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 화합물 또는 그의 생리학적/약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 전구약물과 다른 화학적 성분을 포함하는 혼합물을 나타낸다. 상기 다른 화학적 성분은, 예를 들면, 생리학적/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제이다. 상기 약학적 조성물의 목적은 활성 성분의 흡수를 촉진하여 생물학적 활성을 나타내도록 유기체 내로의 투여를 촉진하기 위한 것이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "약학적 조성물" 및 "제형"은 상호 배타적인 것이 아니다.
본 발명에 있어서 상기 약학적 조성물의 용액 형태와 관련하여, 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 포함되는 용매는 물이다.
"동결건조된 제형"은 약학적 조성물 또는 제형의 액체 또는 용액 형태를 진공 냉동-건조함으로써 수득되는 제형 또는 약학적 조성물을 나타낸다.
본 발명의 냉동-건조는 사전-냉동, 제1 건조, 및 제2 건조를 포함한다. 사전-냉동의 목적은 생성물을 냉동하여 결정질 고체를 수득하는 것이다. 상기 사전-냉동을 위한 2가지 중요한 공정 파라미터는 온도 및 속도이다. 본 발명에 있어서, 사전-냉동을 위한 온도는 -45℃로 세팅되고, 사전-냉동을 위한 속도는 1℃/분으로 세팅된다. 상기 제1 건조는 또한 1차 건조로도 알려져 있으며, 냉동-건조의 주된 단계이다. 그 목적은 생성물의 형태를 유지하면서 생성물로부터 얼음을 제거하여 상기 생성물의 손상을 최소화하는 것이다. 상기 1차 냉동을 위한 온도 및 진공 정도가 적절하지 않다면, 생성물의 붕괴를 초래할 것이다. 높은 온도 및 진공 정도는 동결건조의 효율을 가속화할 것이지만, 동시에 생성물 붕괴의 위험성을 증가시킨다. 본 발명의 제1 건조를 위한 온도는 본 기술분야의 관습적인 온도, 예를 들면, -30℃ 내지 0℃일 수 있다. 2차 건조는 또한 분석적 건조로 알려져 있으며, 궁극적인 진공(0.01mbar) 및 증가된 온도(20-40℃)에 의해 생성물로부터 결합된 물을 제거하기 위한 주된 단계이다. 대부분의 생물학적 생성물은 온도에 민감하기 때문에, 상기 2차 건조를 위한 온도는 상기 온도 범위의 낮은 온도, 즉 25℃가 되도록 선택된다. 냉동-건조의 기간은 냉동기, 동결건조된 제형의 용량, 동결건조된 제제를 포함하는 용기와 연관된다. 본 기술분야의 기술자는 상기 냉동-건조를 위한 기간을 조정하는 방법을 잘 알고 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같이, 용어 "약"은 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 정의된 것과 같이 특정한 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내인 값을 나타내며, 부분적으로는 상기 값이 어떻게 측정 또는 결정되었는지, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 본 기술분야에서 실행 당 1 또는 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 20%까지의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 크기의 제곱수까지 또는 값의 5배까지를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구항에서 특정한 값이 언급될 때, 달리 나타내지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 상기 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 이내인 것으로 추정되어야 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 안정한 효과를 달성할 수 있다: 상기 항체는 보관 후에 그 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 유지할 수 있다; 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 보관 후에 그 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 실질적으로 유지한다. 그 반감기는 일반적으로 상기 약학적 조성물의 소정의 반감기에 기초하여 선택된다. 현재 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 보관 후의 안정성을 측정하는 단백질 안정성을 측정하기 위한 다수의 분석 기술이 있다.
안정한 항체 약학적 제조물은 다음의 조건에서 현저한 변화가 관찰되지 않은 것이다: 냉장 온도(2-8℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 더 바람직하게는 2년까지 보관. 또한, 상기 안정한 액체 제조물은, 예를 들면, 25℃의 온도에서 예를 들면 1개월, 3개월, 및 6개월의 기간 동안, 또는 40℃에서 1개월 동안 보관시에 원하는 특징을 나타내는 액체 제조물을 포함한다. 안정성에 대한 전형적인 허용가능한 기준은 다음과 같다: SEC-HPLC에 의해 평가될 때, 전형적으로 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 항체 모노머가 분해된다. 상기 약학적 항체 제조물은 시각 분석에서는 무색이거나 약간 유백색으로 맑다. 상기 제조물의 농도, pH 및 삼투질농도(osmolality)는 ±10% 변화 이하이다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 절단물(truncate)이 관찰된다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 응집물(aggregation)이 형성된다.
항체는 색상 및/또는 투명도의 시각 검사에서, 또는 UV 광 산란법, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 동적 광 산란법(DLS)에 의해 측정될 때 현저한 응집, 침전 및/또는 변성의 증가를 보이지 않는다면, 약학적 제조물에서 "그 물리적 안정성을 유지한다". 단백질 입체형태(conformation)의 변화는 (단백질 3차 구조를 결정하는) 형광 분광법 및 (단백질 2차 구조를 결정하는) FTIR 분광법에 의해 평가될 수 있다.
항체는 현저한 화학적 변경을 보이지 않는다면, 약학적 제조물에서 "그 화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은 화학적으로 변경된 형태의 단백질을 검출 및 정량함으로써 평가될 수 있다. 종종 단백질의 화학적 구조를 변경하는 분해 공정은 (크기 배제 크로마토그래피 또는 SDS-PAGE와 같은 방법에 의해 평가되는) 가수분해 또는 절단화, (질량 분광법 또는 MALDI/TOF/MS와 조합하여 펩티드 맵핑과 같은 방법에 의해 평가되는) 산화, (이온-교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 전기영동(isoelectric focusing), 펩티드 맵핑, 이소아스파르트산 측정과 같은 방법에 의해 평가되는) 디아민화, 및 (이소아스파르트산 함량의 측정, 펩티드 맵핑 등에 의해 평가되는) 이성질체화를 포함한다.
항체는 해당 시간에서의 항체의 생물학적 활성이 상기 약학적 제조물이 제조된 시점에서 나타내는 생물학적 활성의 소정의 범위 이내라면, 약학적 제조물에서 "그 생물학적 활성을 유지한다". 항체의 생물학적 활성은, 예를 들면, 항체 결합 분석법에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같이, 용어 "스클레로스틴" 또는 "SOST" 또는 "SOST 단백질"은 스클레로스틴(SOST) 유전자 발현 생성물(단백질)을 나타낸다. 뮤린 SOST(m-SOST) 또는 시노몰구스 원숭이 SOST(cyno-SOST)와 같이 달리 특정하지 않는 한, 상기 용어는 본 발명에 있어서 인간 SOST(h-SOST)를 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 인간, 뮤린 및 시노몰구스 원숭이 SOST의 뉴클레오티드 서열은 GenBank로부터 수득되며, 예를 들면, NP_079513.1은 인간 SOST 단백질 서열을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 아미노산 잔기에 대한 3 문자 코드 및 1-문자 코드는 [J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968)]에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용된 것과 같은 "항체"는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄 사이가 사슬간 이황화 결합에 의해 서로 연결된 테트라-펩티드 사슬 구조인 면역글로불린을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ, λ 사슬 또는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
상기 항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 인접하는 약 110개 아미노산 서열은 매우 가변적이며, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있다; C-말단에 가까운 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하며, 불변 영역으로 알려져 있다. 상기 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 상대적으로 보존된 뼈대 영역(FR)을 포함한다. 상기 항체의 특이성을 결정하는 3개의 초가변 영역은 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 이루어지며, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 다음의 순으로 연속된 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 상기 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3으로 나타내고, 상기 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3으로 나타낸다. 본 명세서에서 상기 항체 또는 항원 결합 절편의 LCVR 및 HCVR 영역 내의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카밧(Kabat) 번호지정 기준과 부합하거나(LCDR1-3, HCDR2-3), 카밧 및 초티아(Chothia) 번호지정 기준과 부합한다(HCDR1).
본 발명의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체를 포함하고, 바람직하게는 인간화 항체이다.
본 발명에 있어서, 용어 "뮤린 항체"는 본 기술분야의 지식 및 기술에 따라 제조된 인간 SOST에 대한 단일클론 항체를 나타낸다. 제조하는 동안, 테스트 대상체에 SOST 항원을 주사한 후, 원하는 서열 또는 기능 특성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마(hybridoma)를 분리한다.
용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 융합함으로써 형성되는 항체이며, 상기 키메라 항체는 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 경감할 수 있다. 키메라 항체를 구축하기 위하여, 특이적인 뮤린 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 구축하고, 이후 상기 마우스 하이브리도마 세포로부터 가변 영역 유전자를 클로닝한다. 이어서, 원하는 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝한다. 상기 뮤린 가변 영역 유전자는 상기 인간 불변 영역 유전자와 접합(ligation)되어 인간 벡터 내로 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성하고, 마지막으로 키메라 항체 분자가 진핵생물 또는 원핵생물 산업 시스템에서 발현된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 SOST 키메라 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 사슬, 또는 그의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 상기 SOST 키메라 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 또는 그의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다.
용어 "인간화 항체"는 CDR-이식 항체로도 알려져 있으며, 뮤린 CDR 서열을 인간 항체의 가변 영역 뼈대 내로 이식함으로써 생성되는 항체, 즉 상이한 타입의 인간 생식선(germline) 항체 뼈대 서열로부터 생산된 항체를 나타낸다. 인간화 항체는 많은 양의 뮤린 단백질 성분을 운반하는 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 항체 반응의 단점을 극복한다. 이러한 뼈대 서열은 생식선 항체 유전자 서열을 아우르는 공공의 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식선 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식선 서열 데이터베이스(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase 웹 상에서 이용가능함)에서 발견될 수 있고, 또한 카밧 등의 문헌[Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed]에서 발견될 수 있다. 면역원성의 감소와 함께 활성이 감소되는 것을 피하기 위하여, 인간 항체의 가변 영역 내의 뼈대 서열은 최소로 역 돌연변이 되거나 복귀 돌연변이되어 그 활성을 유지한다. 본 발명의 인간화 항체는 또한 CDR 친화도 성숙이 파지 디스플레이에 의해 수행된 인간화 항체를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "항-스클레로스틴 항체", "인간 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체", "항-SOST 항체", "항-SOST", "SOST 항체" 및 "SOST에 결합하는 항체"는 충분한 친화도로 SOST에 결합할 수 있는 항체를 나타내며, 따라서 상기 항체는 SOST를 표적화하기 위한 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "SOST에 대한 결합"은 인간 SOST와 상호작용할 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 것과 같이, 용어 "∼에 특이적으로 결합하는"은 경쟁적 ELISA, BIACORE® 분석법, 또는 KINEXA® 분석법과 같은 본 기술분야에서 이용가능한 기술에 의해 결정된다. 예를 들면, 상기 용어는 또한 본 발명의 항체의 항원 결합 도메인이 많은 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프(epitope)에 대해 특이적인 경우에도 적용가능하다. 이러한 경우, 상기 항원 결합 도메인을 운반하는 항체는 이러한 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 명세세에서 언급된 "항원-결합 절편"은 항원-결합 활성을 갖는 Fab 절편, Fab' 절편, 또는 F(ab')2 절편뿐만 아니라 인간 SOST에 결합하는 scFv 절편, 및 상기 항-SOST 항체의 VH 및 VL을 이용하는 인간 SOST에 결합할 수 있는 다른 절편을 나타낸다; 이것은 서열번호 3 내지 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 개시된 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 포함한다. Fv 절편은 불변 영역 없이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이것은 모든 항원-결합 부위를 갖고 있는 최소 항체 절편이다. 일반적으로, Fv 항체는 상기 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다. 또한, 상이한 링커를 사용해 2개의 항체의 가변 영역을 연결하여 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv)로 나타내는 폴리펩티드 사슬을 형성할 수 있다.
용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체에 의해 인식 및 결합될 수 있는 항원에 위치하는 부위를 나타낸다.
"보존적 변형" 또는 "보존적 교체 또는 치환"은 단백질 내의 아미노산을 유사한 특징(예컨대, 전하, 측쇄의 크기, 소수성도/친수성도, 백본의 입체형태 및 강성도 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하여, 상기 변화가 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않으면서 빈번하게 일어날 수 있는 것을 나타낸다. 본 기술분야의 기술자는 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수 영역 내의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 인식한다(예컨대, [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조적 및 기능적으로 유사한 아미노산에 대한 치환은 생물학적 활성을 손상시킬 가능성이 낮다.
"아미노산 동일성"은 2개의 단백질 사이 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 비교되는 2개 서열 모두에서의 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 예컨대 2개의 폴리펩티드 각각에서의 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유된다면, 상기 분자는 해당 위치에서 동일하다. 서열 동일성 백분율 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 각각 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 개시되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공공이 이용가능하다.
항체 및 항원-결합 절편의 제조 및 정제 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, [Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15]에서 확인될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 절편은 하나 이상의 인간 뼈대 영역(FR)을 비-인간 유래의 CDR 영역으로 도입하기 위해 유전적으로 조작된다. 인간 FR 생식선 서열은 그 웹사이트(http://imgt.cines.fr)를 통해 ImMunoGeneTics(IMGT)로부터, 또는 [The 면역글로불린 FactsBook , 2001ISBN012441351]로부터, IMGT 인간 항체 가변 영역 생식선 유전자 데이터베이스 및 MOE 소프트웨어를 비교함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 조작된 항체 또는 항원-결합 절편은 관습적인 방법에 의해 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열은 GS 발현 벡터 내로 클로닝 및 재조합될 수 있다. 이후, 상기 재조합된 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포 내로 안정하게 전달감염될 수 있다. 본 기술분야에 잘 공지된 보다 권고되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역 내의 매우 보존된 N-말단에서 항체를 글리코실화시킬 것이다. 안정한 클론은 인간 SOST에 특이적으로 결합하는 항체의 발현을 통해 수득될 수 있다. 양성 클론은 생물반응기(bioreactor)에서 항체 생산을 위한 혈청-부재 배양 배지에서 확장될 수 있다. 그 내부로 항체가 분비되는 배양 배지는 관습적인 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 상기 배지는 조정된 버퍼로 평형화된 단백질 A 또는 G 세파로오스 FF 컬럼에 의해 편리하게 정제될 수 있다. 상기 컬럼은 비특이적 결합 성분을 제거하기 위해 세척된다. 결합된 항체는 pH 구배(gradient)에 의해 용출되고, 항체 절편은 SDS-PAGE에 의해 검출되며, 이후 모아진다. 상기 항체는 보통의 기술을 이용하여 여과 및 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 멀티머(multimer)는 또한 분자 체 또는 이온 교환을 포함하는 보통의 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 수득된 생성물은, 예를 들면 -70℃에서 즉시 냉동될 수 있거나, 동결건조될 수 있다.
동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, "투여" 및 "처치"는 외인성 약학적, 치료적, 진단적 제제, 또는 조성물을 상기 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 나타낸다. "투여" 및 "처치"는, 예컨대 치료, 약동학, 진단, 연구, 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. 세포의 처치는 시약을 상기 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포괄하며, 이때 상기 유체가 상기 세포와 접촉한다. 또한, "투여" 및 "처치"는, 예컨대 시약, 진단, 결합 화합물에 의한, 또는 다른 세포에 의한 세포의 시험관내(in vitro) 및 생체외(ex vivo) 처치를 의미한다. 인간, 가축, 또는 연구 대상체에 적용될 때, "처치"는 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치, 연구적 및 진단적 적용을 나타낸다.
"치료하는"은 제제가 치료적 활성을 갖는 것으로 알려진 하나 이상의 질환 징후를 갖는 환자에게 본 발명의 임의의 결합 화합물을 포함하는 조성물과 같은 치료제를 내적으로 또는 외적으로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 상기 제제는 치료되는 환자 또는 개체군(population)에서 하나 이상의 질환 징후를 경감하기 위한 효과량으로 투여되어, 이러한 징후(들)를 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 축소를 유도하거나 진행을 억제한다. 임의의 특정 질환 징후를 경감하기에 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"으로도 나타냄)은 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 및 상기 환자에서 원하는 반응을 일으키는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 질환 징후가 경감되었는지 여부는 상기 징후의 증세 또는 진행 상태를 평가하는 내과의사 또는 다른 숙련된 건강돌봄 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상적 측정법에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 구현예(예컨대, 치료 방법 또는 제조 물품)는 모든 환자에서 관심있는 질환 징후(들)를 경감하는데 효과적이지 않을 수는 있지만, 스튜던트 t-테스트, 카이-스퀘어 테스트, 만(Mann) 및 휘트니(Whitney)에 따른 U-테스트, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 테스트(H-테스트), 존키어-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra)-테스트 및 윌콕슨(Wilcoxon)-테스트와 같은 본 기술분야에 공지된 임의의 통계적 테스트에 의해 결정될 때 통계적으로 유효한 수의 환자에서 관심있는 표적 질환 징후(들)를 경감해야 한다.
"유효량"은 의학적 증상의 징후 또는 기색을 개선 또는 방지하기에 충분한 양을 포괄한다. 유효량은 또한 진단을 허용 또는 촉진하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 가축 대상체에 대한 유효량은 환자의 치료되는 증상, 일반적인 건강, 투여 경로 및 용량, 및 부작용의 증세와 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 유효량은 현저한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 복용 프로토콜일 수 있다.
"Tm 값"은 단백질의 열적 변성 중간점, 다시 말해 단백질의 절반이 접히지 않고 단백질의 공간 구조가 파괴되는 온도를 나타낸다. 따라서, Tm 값이 더 높을수록 단백질의 열적 안정성이 더 높을 것이다.
구현예 및 테스트 실시예
이하, 본 발명은 실시예를 참조하여 추가로 개시된다. 그러나, 본 발명의 범위는 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예 또는 테스트 실시예에서, 구체적인 조건이 개시되어 있지 않다면, 실험은 일반적으로 관습적인 조건 또는 원료 물질 또는 생성물의 제조사에 의해 제시되는 조건에 따라 수행된다. 시약의 공급처가 구체적으로 기재되어 있지 않다면, 상기 시약은 상업적으로 시판되는 관습적인 시약이다.
구현예
본 발명의 SOST 항원 및 항체의 제조 및 정제 방법은 그 출원일이 2016년 2월 16일이고, 그 출원 번호가 PCT/CN2016/073857이며, 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 WO2016145961에 개시되어 있다.
구현예 1. 단일클론 항-인간 SOST 항체의 생산
마우스를 면역시킴으로써 항-인간 SOST 단일클론 항체를 생산하였다. 6주령의 암컷 실험용 SJL 백색 마우스(Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., 동물 생산 허가 번호: SCXK (Beijing) 2012-0001)를 사용하였다. 사육 환경: SPF 레벨. 마우스를 구입한 후, 상기 동물을 12/12시간 명/암 사이클, 20-25℃의 온도, 및 40-60% 습도의 실험실 환경에서 1주일 동안 유지하였다. 상기 환경에 순응된 마우스를 각 군당 10마리씩 2개의 군(A/B)으로 나누었다.
His 태그(His-h-태그)를 갖는 SOST 재조합 단백질을 면역원으로 사용하였다. A 군에서, 유화를 위해 프로인드 어주번트(adjuvant)(Sigma Lot Num: F5881/F5506)를 사용하였다. 프로인드 완전 어주번트(CFA)를 이용해 첫 번째 면역화를 수행하였고, 프로인드 불완전 어주번트(IFA)를 이용해 나머지 부스터(booster) 면역화를 수행하였다. 항원 대 어주번트의 비는 1:1이었으며, 200㎕/200㎍/마우스(첫 번째 면역화), 및 200㎕/100㎍/마우스(부스터)였다. B 군에서, 타이터맥스(Sigma Lot Num: T2684) 및 알룸(Thermo Lot Num: 77161)을 이용해 교차-면역화를 수행하였다. 항원 대 어주번트(Titermax)의 비는 1:1이었고, 항원 대 어주번트(Alum)의 비는 3:1이었으며, 200㎕/200㎍/마우스(첫 번째 면역화), 및 200㎕/100㎍/마우스(부스터)였다. 상기 항원을 유화하였고, 0, 14, 28, 42 및 56일에 접종하였다.
0일에, A/B 군의 마우스를 상기 유화된 항원을 이용해 50㎍/마우스로 복강내(IP) 주사하였다. 14일에, 상기 마우스를 복수의 부위(대개 등의 6-8 부위)에 25㎍/마우스로 피하(s.c.) 주사하였다. 28 및 42일에, 상기 항원의 등 또는 복강내 주사를 등의 덩어리 및 복부의 붓는 증상에 따라 선택하였다. 식염수를 이용해 제형화된 항원 용액을 비장세포 융합 3일 전에 200㎍/마우스로 복강내(IP) 주사함으로써 부스터 면역화를 수행하였다.
22, 36, 50, 및 64일에 혈액 테스트를 수행하였고, 인간 스클레로스틴에 대한 마우스 혈청의 결합 활성을 테스트 실시예 1에 개시된 것과 같은 ELISA 방법에 의해 측정하였으며, 그 결과는 표 1에 나타나 있다. 4차 면역화 후, 플랫폼의 경향이 있는 높은 혈액 역가를 갖는 마우스를 비장세포 융합을 위해 선택하였다. 최적화 PEG-매개성 융합 절차를 이용하여 비장세포를 골수종 Sp2/0 세포(ATCC® CRL-8287TM)와 융합함으로써 하이브리도마 세포를 수득하였다. 마우스 혈청에서 인간 SOST와 인간 LRP-6의 결합을 차단하기 위한 항-인간 SOST 항체의 활성은 테스트 실시예 2에 따라 검출하였고, 양호한 시험관내 활성을 갖는 단일클론 하이브리도마 세포 균주인 Ab-1을 선택하였다. 그 결과는 표 1에 나타나 있다.
뮤린 항체의 시험관내 활성
후보 항체 테스트 실시예 1-
EC50 (nM)		 테스트 실시예 2-
IC50 (nM)
Ab-1 0.701 9.91
구현예 2. 뮤린 항-인간 스클레로스틴 항체의 인간화
양호한 시험관내 활성을 갖는 단일클론 하이브리도마 세포 균주인 Ab-1을 선택하였다. 상기 단일클론 항체의 서열을 클로닝한 후, 인간화, 재조합 발현 및 활성 평가를 추가로 수행하였다.
하이브리도마 서열분석 공정은 다음과 같이 수행하였다. 상기 하이브리도마 세포를 대수성장기에 수집하였고, 트리졸(Invitrogen 15596-018, 키트의 설명서에 따름)을 이용해 RNA를 추출하였으며, 이후 RNA의 역전사(PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A)를 설명서와 같이 수행하였다. 역전사에 의해 수득된 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev.B 0503)를 이용한 PCR에 의해 증폭하였고, 서열분석 회사에 의해 서열분석하였다. 수득된 DNA 서열에 해당하는 아미노산 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타나 있다:
하이브리도마 세포로부터 수득된 중쇄 가변 영역:
EVQLQQSGPELVKPGTSVKIPCQTSGYTFTDYNLDWLKQRPGESLEWIGDIDPNNGDILYNQKFRDKATLTVDTSSNTAYLELRSLTSEDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTLTISS (서열번호 1)
하이브리도마 세포로부터 수득된 경쇄 가변 영역:
NIVMTQTPKLLFVSAGDRITITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYTSNRFTGVPDRFTGSGYGTDFTLTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPVTFGAGTKLELK (서열번호 2)
뮤린 항-인간 SOST 단일클론 항체의 인간화는 본 기술분야의 많은 문헌에 개시된 것과 같이 수행하였다. 간략하게, 모체 항체(뮤린 항체)의 불변 영역 도메인을 인간 불변 영역 도메인으로 교체하였고, 뮤린 및 인간 항체 사이의 상동성에 따라 인간 항체 생식선을 선택하였다. 본 발명에서 양호한 활성을 보이는 후보 분자를 인간화하였으며, 그 결과는 다음과 같다.
1. 뮤린 항-스클레로스틴 항체의 CDR 영역
VH/VL CDR의 아미노산 잔기를 확인하였고, 카밧 번호지정 시스템에 의해 할당하였다.
본 발명의 뮤린 Ab-1의 CDR 서열은 표 2에 개시되어 있다:
뮤린 항-SOST 항체의 CDR 영역 서열
항체 Ab -1
중쇄 CDR1 DYNLD (서열번호 3)
중쇄 CDR2 DIDPNNGDILYNQKFRD (서열번호 4)
중쇄 CDR3 RWAYYFDY (서열번호 5)
경쇄 CDR1 KASQSVSNDVA (서열번호 6)
경쇄 CDR2 YTSNRFT (서열번호 7)
경쇄 CDR3 QQDYSSPVT (서열번호 8)
2. 인간 생식선 FR 영역 서열의 선택
수득된 뮤린 항체의 전형적인 VH/VL CDR 구조에 기초하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 생식선 항체 데이터베이스와 비교하였고, 높은 상동성을 갖는 인간 생식선 주형을 선택하였으며, 여기서 인간 생식선 경쇄의 뼈대 영역은 인간 카파 경쇄 유전자 유래이고, 바람직하게는 인간 생식선 경쇄 주형의 IGKV1-39*01 또는 IGKV4-1*01을 본 발명에서 선택하였다. 인간 생식선 중쇄의 뼈대 영역은 인간 중쇄 유래이고, 바람직하게는 인간 생식선 중쇄 주형의 IGHV1-18*01이 본 발명에서 선택된다. 상기 뮤린 항체 Ab-1의 CDR 영역을 선택된 인간화 주형 상에 이식하여 상기 인간화 가변 영역을 교체하였고, 이후 IgG 불변 영역과 재조합하였다. 상기 뮤린 항체의 3차원 구조에 기초하여, 포획된 잔기, CDR 영역과 직접 상호작용하는 잔기, 및 VL 및 VH의 입체형태에 중요한 영향을 미치는 잔기에 대해 복귀-돌연변이를 수행하였고, 화학적 불안정성을 나타내는 CDR 영역 내의 잔기를 최적화하였으며(중쇄 CDR2를 최적화하여 새로운 중쇄 CDR2 서열 DIDPNDGDILYNQKFRD(서열번호 9)를 수득하였음), 마지막으로 인간화 분자를 수득하였다. 상기 인간화 분자의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 10-12에 나타나 있으며, 선택적으로 상기 서열들은 서열번호 16-18에 나타낸 중쇄 불변 영역 중 임의의 하나와 조합될 수 있다. 상기 인간화 분자의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 13-15에 나타나 있고, 상기 서열들은 각각 서열번호 19에 나타낸 경쇄 불변 영역 서열과 조합될 수 있다.
1) 중쇄 가변 영역:
Ab-5의 중쇄 가변 영역:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWLRQAPGEGLEWIGDIDPNDGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSS (서열번호 10)
Ab-9의 중쇄 가변 영역:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWLRQAPGEGLEWIGDIDPNNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSS (서열번호 11)
Ab-10의 중쇄 가변 영역:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWVRQAPGQGLEWMGDIDPNNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSS (서열번호 12)
2) 각각의 항체의 중쇄 불변 영역은 선택적으로 다음의 서열로부터 선택된다:
인간 IgG4의 중쇄 불변 영역(K는 부재임):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (서열번호 16)
인간 IgG4의 중쇄 불변 영역:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 17)
인간 IgG2의 중쇄 불변 영역:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 18)
3) 경쇄 가변 영역:
Ab-5의 경쇄 가변 영역:
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKSPKLLIYYTSNRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPVTFGGGTKVEIK (서열번호 13)
Ab-9의 경쇄 가변 영역:
NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKSPKLLIYYTSNRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPVTFGGGTKVEIK (서열번호 14)
Ab-10의 경쇄 가변 영역:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSNRFTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPVTFGGGTKVEIK (서열번호 15)
4) 인간 κ 사슬 유래의 경쇄 불변 영역:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 19)
유전자 클로닝 및 재조합 발현에 의해 상기 항체를 클로닝, 발현 및 정제한 후, 결합 ELISA 분석법, 항원-수용체 결합의 차단 분석법, 비아코어(Biacore), 세포 활성 검출 등에 의해 검출하였다. 마지막으로, 가장 좋은 활성을 갖는 인간화 항체인 Ab-5, Ab-9, 및 Ab-10을 선택하였으며, 그 서열은 다음과 같다:
인간화 항체 Ab-10:
중쇄:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWVRQAPGQGLEWMGDIDPNNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 20)
경쇄:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSNRFTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPVTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 23)
인간화 항체 Ab-9:
중쇄:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWLRQAPGEGLEWIGDIDPNNGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 21)
경쇄:
NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKSPKLLIYYTSNRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPVTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 24)
인간화 항체 Ab-5:
중쇄:
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNLDWLRQAPGEGLEWIGDIDPNDGDILYNQKFRDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRWAYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(K) (서열번호 22)
주: 상기 인간화 항체 Ab-5의 중쇄 서열 말단의 K는 항체 발현 과정에서 절단될 수 있고, 따라서 K는 최종 생성물의 중쇄 말단에 존재 또는 부재할 수 있지만, 이것이 생성물 자체의 성능에 영향을 미치지는 않을 것이다.
경쇄:
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKSPKLLIYYTSNRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPVTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 25)
항체 약학적 조성물(제형)을 제조하기 위한 예시적인 공정
단계 1: 항-SOST 항체(예컨대, Ab-5) 및 안정제(들)를 갖는 항-SOST 항체를 포함하는 약물 물질 용액을 제조 및 여과하고, 살균 테스트를 위해 상기 용액을 샘플링하였다. 상기 약물 물질 용액을 0.22㎛ PVDF 필터를 통해 통과시켰고, 여과물을 수집하였다.
단계 2: 여과물을 1.1㎖의 로딩 부피로 조정하고, 스토퍼(stopper)를 이용해 상기 여과물을 2㎖ 바이알에 로딩하였다; 그리고 각각 상기 로딩 절차의 시작, 중간 및 끝에 샘플링함으로써 부피 차이를 검출하였다.
단계 3: 캡핑 장치를 이용하여 알루미늄 캡을 캡핑하였다.
단계 4: 시각적 검사를 수행하여 부정확한 로딩과 같은 임의의 결함 유무를 확인하였다. 바이알에 라벨을 인쇄 및 부착하였다. 상기 바이알을 종이 트레이 내에 두고, 상기 종이 트레이에 라벨을 인쇄 및 부착하였다.
구현예 3. 버퍼 시스템의 스크리닝
80㎎/㎖의 단백질 농도를 갖는 항-SOST 항체 Ab-5 제형 샘플을 다음의 버퍼를 이용해 제조하였다:
1) 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트, pH 5.0
2) 10mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.0
3) 10mM의 히스티딘-아세트산, pH 5.5
4) 10mM의 2나트륨 수소 포스페이트-시트르산, pH 5.5
5) 10mM의 2나트륨 수소 포스페이트-시트르산, pH 7.0
6) 10mM의 2나트륨 수소 포스페이트-시트르산, pH 7.5
상기 항-SOST 항체 Ab-5가 pH 7.0 및 7.5 버퍼에서 교체되었을 때, 상기 단백질은 완전히 침전하였다. 그 등전점 범위와 조합하여, 상기 버퍼의 pH는 5.5 이하여야 함을 나타낸다.
성공적으로 교체된 제형 샘플을 2㎖ 바이알 내에 1.5㎖/바이알의 부피로 채웠고, 염소화 부틸 고무 스토퍼로 밀봉하였으며, 교반하여(25℃, 300 rpm) 안정성을 모니터링하였다. 3일 동안 교반한 후, 상기 2나트륨 수소 포스페이트-시트르산(pH 5.5) 시스템은 또한 완전히 탁해졌다. 상기 히스티딘-아세트산 시스템은 교반 후에 유백색 외관을 보였고, 상기 아세트산 시스템은 소량의 침전을 보였다. SEC 순도는 양쪽 시스템에서 현저하게 변화되지는 않았다. 따라서, 상기 항-SOST 항체 제형용 버퍼 시스템은 히스티딘-아세트산 시스템 또는 아세트산-나트륨 아세테이트 시스템일 수 있고, 상기 pH 범위는 5.0-5.5여야 한다. 이들 중, 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 5.0)가 상대적으로 더 나은 버퍼 시스템이다. 표 3 참조:
3일 동안 교반한 후 상이한 pH 및 버퍼 시스템 내에서 Ab-5의 안정성
버퍼
시스템		 시간 SEC(%) DLS 외관
모노머 폴리머 Z-Ave Mean(d.nm) PdI
10mM 아세트산-나트륨
아세테이트 pH5.0		 0 96.9 1.6 17.07 0.135 맑고 투명
3일 97.5 1.6 27.55 0.317 투명하고, 소량의 침전
10mM 히스티딘-아세트산
pH5.0		 0 96.9 1.6 20.06 0.147 맑고 투명
3일 97.2 1.9 358.2 0.807 흰 유백색
10mM 히스티딘-아세트산
pH5.5		 0 97.0 1.6 37.09 0.124 담청 유백색
3일 97.5 1.6 556.3 1.000 흰 유백색, 소량의 침전
10mM 2나트륨 수소
포스페이트-시트르산 pH5.5		 0 96.9 1.6 33.98 0.096 담청 유백색
3일 93.6 6.2 36.51 0.211 탁함
85㎎/㎖의 단백질 농도를 갖는 항-SOST 항체 제형 샘플을 다음의 버퍼를 이용해 제조하였다:
1) 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트, pH 4.8
2) 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트, pH 5.0
3) 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트, pH 5.2
4) 30mM의 아세트산-나트륨 아세테이트, pH 5.0
5) 10mM의 숙신산-나트륨 숙시네이트, pH 5.0
상기 제형 샘플을 2㎖ 바이알 내에 1.5㎖/바이알의 부피로 채웠고, 염소화 부틸 고무 스토퍼로 밀봉하였으며, 교반하였고(25℃, 300 rpm), 빛을 비추어(4500 Lx) 안정성을 모니터링하였다. 3일 동안 교반한 후, 상기 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 4.8) 시스템 및 10mM의 숙신산-나트륨 숙시네이트(pH 5.0) 시스템은 완전히 탁해졌다. 상기 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 5.0) 및 30mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 5.0) 시스템의 안정성은 상대적으로 양호하였고, 상기 2가지 시스템 사이에 현저한 차이는 없었다. 광 노출 10일 후, 상기 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 5.0) 및 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 5.2) 시스템 내에 포함되는 항-SOST 항체의 IEC 주된 피크 순도는 다른 3가지 군의 경우보다 덜 감소하였다. 따라서, 상기 항-SOST 항체 제형에 대한 최적의 버퍼 시스템은 아세트산-나트륨 아세테이트 시스템이며, 그 농도는 10-30mM, 바람직하게는 10mM일 수 있고, 그 pH는 4.8 이상이어야 한다.
3일 동안 교반한 후 상이한 pH, 이온 강도 및 버퍼 시스템에서 Ab-5의 안정성
버퍼
시스템		 시간 SEC(%) DLS 외관
모노머 폴리머 Z-Ave Mean(d.nm) PdI
10mM 아세트산-나트륨
아세테이트 pH4.8		 0 97.2 1.5 20.31 0.517 담청 유백색
3일 95.5 3.7 266.4 0.445 탁함
10mM 아세트산-나트륨
아세테이트 pH5.0		 0 97.3 1.5 18.65 0.153 맑고 투명
3일 97.5 1.6 249.4 0.421 유백색
10mM 아세트산-나트륨
아세테이트 pH5.2		 0 97.3 1.5 28.63 0.130 담청 유백색
3일 97.5 1.6 928.3 1.000 유백색
30mM 아세트산-나트륨
아세테이트 pH5.0		 0 97.0 1.5 23.05 0.119 맑고 투명
3일 97.5 1.6 454.6 0.667 유백색
10mM 숙신산-나트륨 숙시네이트
pH5.0		 0 97.2 1.5 30.41 0.090 담청 유백색
3일 N/A N/A 2022 0.496 탁함
10일 동안 광에 노출한 후 상이한 pH, 이온 강도 및 버퍼 시스템에서 Ab-5의 안정성
버퍼 시스템 시간 SEC(%) IEC(%) 외관
모노머 폴리머 주된 피크 산 피크 알칼리 피크
10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 pH4.8 0 97.2 1.5 70.9 20.0 9.1 담청 유백색
3일 96.5 2.5 38.3 16.1 45.6 투명, 소량의 침전
10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 pH5.0 0 97.3 1.5 71.1 20.0 8.9 맑고 투명
3일 96.5 2.6 40.4 17.4 42.3 투명, 소량의 침전
10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트
pH5.2		 0 97.3 1.5 70.7 20.2 9.1 담청 유백색
3일 96.1 2.7 42.5 17.1 40.4 담청 유백색, 소량의 침전
30mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 pH5.0 0 97.0 1.5 70.9 20.2 8.9 맑고 투명
3일 96.6 2.3 38.5 15.6 45.9 투명, 소량의 침전
10mM 숙신산-나트륨 숙시네이트
pH5.0		 0 97.2 1.5 71.1 20.2 8.7 담청 유백색
3일 96.5 2.6 37.1 15.9 47.0 담청 유백색, 소량의 침전
구현예 4. 제형 내에서 당류의 스크리닝
항-SOST 항체 용액을 10mM의 숙신산-나트륨 숙시네이트 버퍼, pH5.5에서 제조하였으며, 여기서 Ab-5 단백질의 농도는 1㎎/㎖이고, 상기 용액은 각각 4.5%, 6%, 7.5% 및 9%의 α,α-2수화물 트레할로오스 또는 6% 수크로오스를 포함한다. 상이한 제형 내에 포함되는 항-SOST 항체의 열적 안정성을 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 측정하였다. 그 결과는 항-SOST 항체 Ab-5의 초기 변성 온도(Tmonset)가 당류의 농도 증가와 함께 점진적으로 증가하였음을 보여주었다: 트레할로오스에서의 Tmonset은 수크로오스의 경우보다 현저하게 더 높았다. 상기 항-SOST 항체는 상대적으로 더 높은 트레할로오스의 농도를 가짐으로써 제형 내에서 열적 안정성이 더 양호했음이 제시된다.
주사 용액용으로 요구되는 삼투압으로 인해, 8% α,α-2수화물 트레할로오스가 가장 바람직한 조건으로 고려된다.
상이한 타입 및 농도의 당류에서 Ab-5의 열적 안정성
당류 타입 당류의 농도
(㎎/㎖)		 Tmonset
(℃)		 Tm1
(℃)		 Tm2
(℃)
α,α-2수화물 트레할로오스 45 58.19 67.00 81.15
60 58.71 67.25 81.14
75 57.72 67.61 81.49
90 60.37 67.58 81.48
수크로오스 60 56.92 67.08 81.24
주: 본 발명에 있어서, 6%의 당 농도는 60㎎/㎖와 등가이다; 9%의 농도는 90㎎/㎖와 등가이며, 다른 단위 전환은 이 규칙을 따른다.
구현예 5. 제형 내에서 점도 변형제의 스크리닝
상기 제형의 점도를 감소시키기 위하여, 다음의 점도 변형제를 각각 30㎎/㎖의 항-SOST 항체, 및 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH5.0)를 함유하는 용액에 첨가하여, 상기 점도가 낮아질 수 있는지 및 한외여과 효율이 개선되는지 여부를 결정하였다.
1) 90㎎/㎖의 α,α-2수화물 트레할로오스
2) 70㎎/㎖의 α,α-2수화물 트레할로오스 + 40mM 염화나트륨
3) 90㎎/㎖의 α,α-2수화물 트레할로오스 + 10mM의 염화칼슘
4) 90㎎/㎖의 α,α-2수화물 트레할로오스 + 10mM의 염화마그네슘
5) 150mM의 염화나트륨
6) 140mM의 아르기닌 히드로클로라이드
7) 10mM의 칼슘 아세테이트
8) 20mM의 염화칼슘
9) 4.5mM의 염화칼슘
실험 결과는 당류가 한외여과 효율의 개선에 도움이 되지 못했음을 보여주었다. 염화나트륨 및 아르기닌 히드로클로라이드는 상기 한외여과 효율을 적당히 증가시킬 수 있지만, 칼슘 및 마그네슘 염은 한외여과 효율을 크게 개선하였다. 이들 중, 상기 칼슘 염의 농도는 4.5 내지 20mM의 범위일 수 있고, 상기 범위에서 한외여과 효율에서의 현저한 차이는 없었다.
구현예 6. 제형 내에서 계면활성제의 스크리닝
상이한 농도 및 타입의 계면활성제를 갖는 버퍼 내에서 상이한 농도의 단백질을 함유하는 항-SOST 항체 제형 샘플을 제조하였으며, 여기서 상기 버퍼는 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트(pH 5.0), 4.5mM의 염화칼슘, 80㎎/㎖의 α,α-2수화물 트레할로오스를 포함한다. 실험 디자인 및 분석은 DoE에 의해 수행되었고, 그 범위는 다음과 같다:
1) 단백질 농도: 80∼100㎎/㎖
2) 계면활성제의 타입: 폴리소르베이트 20(PS20), 폴리소르베이트 80(PS80)
3) 폴리소르베이트 농도: 0.02∼0.8㎎/㎖
상기 제형을 1.2㎖/브랜치로 1㎖ BD 투여 주사기 내에 넣었고, 25℃/300rpm/12일로 교반하였다. 그 결과, 12일의 교반 후에 SEC를 통한 순도, 비-환원 CE-SES 및 IEC 분석법에서 현저한 변화는 없음을 보여주었다. 상기 결과는 상기 SOST 항체 제형이 약물 운반 장치와 양호하게 호환됨을 보여준다. 동시에, MFI를 사용하여 2㎛보다 큰 현미경-수준(sub-visible) 입자의 수를 검출하였으며, 다양한 제형들 사이에 현저한 차이가 있음을 보여주었다. DoE 피팅 결과(효과적인 피팅 모델)에 따르면, 입자 수에서의 증가는 폴리소르베이트 80 및 96㎎/㎖ 이상의 단백질 농도를 이용함으로써 500 이내로 조절될 수 있다. 또한, 폴리소르베이트 80의 농도가 약 0.3-0.6㎎/㎖으로 세팅될 때, 상기 제형 내의 입자의 수는 0 포인트에서 최저였다.
상이한 타입 및 농도의 Tween에서 상이한 농도의 Ab-5의 교반 안정성(순도)
단백질의 농도
(㎎/㎖)		 Tween의 농도
(㎎/㎖)		 Tween의 타입 시간 % SEC % 비-환원
CE-SDS		 % IEC
폴리머 모노머 절편화 산 피크 주된 피크 알칼리 피크
80 0.02 PS20 0 0.6 99.0 0.4 96.8 11.9 76.6 11.5
12일 0.8 98.5 0.7 96.5 12.3 76.6 11.1
100 0.80 PS20 0 0.6 98.7 0.7 96.9 11.9 76.7 11.3
12일 0.8 98.2 1.0 96.1 12.3 76.6 11.1
80 0.80 PS20 0 0.6 98.8 0.6 96.5 11.9 76.7 11.4
12일 0.8 98.3 1.0 96.4 12.1 77.0 10.8
100 0.02 PS20 0 0.6 98.9 0.5 97.0 12.0 76.7 11.3
12일 0.8 98.4 0.8 96.0 12.3 76.9 10.8
80 0.41 PS80 0 0.6 98.8 0.6 96.8 11.9 76.8 11.3
12일 0.8 98.5 0.8 95.9 12.6 76.1 11.4
90 0.41 PS20 0 0.6 98.5 0.8 96.9 12.0 76.7 11.4
12일 0.8 98.5 0.7 96.3 12.3 77.1 10.6
100 0.41 PS80 0 0.7 98.6 0.8 97.0 12.0 76.8 11.2
12일 0.8 98.2 1.0 96.3 12.7 76.4 10.9
90 0.41 PS20 0 0.6 98.9 0.5 96.6 12.0 76.8 11.2
12일 0.8 98.2 1.0 95.9 12.2 77.2 10.6
90 0.02 PS80 0 0.6 98.7 0.7 96.7 12.0 76.9 11.2
12일 0.8 98.2 1.0 96.4 12.3 76.5 11.2
90 0.80 PS80 0 0.6 98.6 0.8 96.8 11.9 76.7 11.4
12일 0.8 98.5 0.8 96.5 12.2 77.0 10.7
상이한 타입 및 농도의 Tween에서 상이한 농도의 Ab-5의 교반 안정성(SVP)
단백질의 농도
(㎎/㎖)		 Tween의 농도
(㎎/㎖)		 Tween의 타입 시간 2㎛ 이상인 입자의 수 입자 수에서의 증가
80 0.02 PS20 0 224 675
12일 899
100 0.80 PS20 0 1124 553
12일 1677
80 0.80 PS20 0 325 1120
12일 1445
100 0.02 PS20 0 461 1077
12일 1538
80 0.41 PS80 0 1663 2105
12일 3768
90 0.41 PS20 0 100 3514
12일 3614
100 0.41 PS80 0 1224 -95
12일 1129
90 0.41 PS20 0 362 2072
12일 2434
90 0.02 PS80 0 2037 1066
12일 3103
90 0.80 PS80 0 1927 1816
12일 3743
구현예 7. 제형의 성분들의 안정성에 대한 연구
4.5mM의 염화칼슘, 80㎎/㎖의 α,α-2수화물 트레할로오스 또는 수크로오스, 0.4㎎/㎖의 폴리소르베이트 20 또는 80을 함유하는 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에서 Ab-5를 100㎎/㎖로 제조하였다. 상기 제형을 2㎖ 바이알 내에 1.5㎖/병으로 채웠고, 염소화 부틸 고무 스토퍼로 밀봉하였으며, 각각 25℃ 및 2 내지 8℃에 두어 안정성을 모니터링하였다. 그 결과, 2-8℃에서 6개월 동안 둔 후에 폴리소르베이트 20을 함유하는 제형 내에 다량의 작은 입자가 나타났음을 보여주었는데, 이는 항-SOST 항체 Ab-5 제형용으로는 적합하지 않은 것이었다. 폴리소르베이트 80을 함유하는 제형과 관련하여, 트레할로오스 및 수크로오스 사이에 현저한 차이는 없었으며, 상기 제형은 25℃에서 3개월 또는 2 내지 8℃에서 6개월 동안 양호한 안정성을 보여주었다.
25℃에서 상이한 유형의 당류 및 Tween을 함유하는 제형의 안정성
당류의 타입 Tween의 타입 시간
(월)		 % SEC % 비-환원
CE-SDS		 % IEC 외관
폴리머 모노머 절편화 산 피크 주된 피크 알칼리 피크
수크로오스 PS20 0 0.8 98.0 1.2 93.3 19.7 72.3 8.1 맑음
1 1.4 98.2 0.5 96.5 20.2 70.4 9.4 맑음
2 1.6 97.5 0.9 96.4 22.3 71.9 5.8 맑음, 소량의 입자
3 1.8 97.1 1.1 95.6 22.6 65.5 11.9 맑음, 소량의 입자
수크로오스 PS80 0 0.8 98.3 0.9 93.5 19.9 72.4 7.7 맑음
1 1.4 98.2 0.4 96.2 20.2 70.5 9.4 맑음
2 1.6 97.4 1.0 96.3 22.2 72.0 5.9 맑음, 소량의 입자
3 1.8 97.2 1.1 95.4 22.6 65.3 12.1 맑음, 소량의 입자
트레할로오스 PS20 0 0.8 98.3 0.9 93.4 19.8 72.1 8.1 맑음
1 1.4 98.1 0.5 96.1 20.2 70.8 9.0 맑음
2 1.7 97.3 1.1 96.1 22.2 72.0 5.8 맑음, 소량의 입자
3 1.8 97.0 1.2 95.8 22.7 65.5 11.9 맑음, 소량의 입자
트레할로오스 PS80 0 0.8 98.3 0.9 93.5 19.9 72.4 7.7 맑음
1 1.4 98.2 0.4 96.3 20.2 70.6 9.2 맑음
2 1.7 97.4 0.9 96.3 22.3 72.0 5.7 맑음, 소량의 입자
3 1.8 97.1 1.1 95.8 22.7 65.3 12.0 맑음, 소량의 입자
2-8℃에서 상이한 타입의 당류 및 Tween을 함유하는 제형의 안정성
당류의 타입 Tween의 타입 시간
(월)		 % SEC % 비-환원
CE-SDS		 % IEC 외관
폴리머 모노머 절편화 산 피크 주된 피크 알칼리 피크
수크로오스 PS20 0 0.8 98.0 1.2 93.3 19.7 72.3 8.1 맑음
1 0.9 98.7 0.4 96.4 19.2 72.4 8.4 맑음
3 1.0 98.1 0.9 96.5 18.8 71.3 9.8 맑음
6 1.2 98.2 0.7 97.5 19.5 70.8 9.7 다량의 작은 입자
수크로오스 PS80 0 0.8 98.3 0.9 93.5 19.9 72.4 7.7 맑음
1 0.9 98.7 0.4 96.8 19.4 72.7 7.9 맑음
3 1.0 98.0 1.0 96.4 18.8 71.7 9.5 맑음
6 1.2 98.3 0.5 97.4 19.4 71.1 9.5 맑음
트레할로오스 PS20 0 0.8 98.3 0.9 93.4 19.8 72.1 8.1 맑음
1 0.9 98.7 0.4 96.4 19.3 72.7 8.0 맑음
3 1.0 98.0 1.0 96.4 18.8 71.2 10.0 맑음
6 1.3 98.2 0.6 97.5 19.2 71.2 9.6 다량의 작은 입자
트레할로오스 PS80 0 0.8 98.3 0.9 93.5 19.9 72.4 7.7 맑음
1 0.9 98.6 0.4 96.2 19.3 72.8 7.9 맑음
3 1.0 98.1 0.9 96.3 18.9 71.5 9.6 맑음
6 1.2 98.2 0.6 97.4 19.4 70.9 9.7 맑음
구현예 8. 제형의 동결건조
10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 pH 5.0, 80㎎/㎖의 트레할로오스, 0.4㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 및 4.5mM의 염화칼슘을 함유하는 버퍼 내에서 항-SOST 항체 제형 샘플을 제조하였으며, 상기 항-SOST 항체 단백질의 농도는 100㎎/㎖였다. 상기 제형을 2㎖ 바이알 내에 1.1㎖/바이알로 채웠고, 동결건조 박스 내에 두었으며, 동결건조하였다. 상기 동결건조 절차는 사전-냉동, 1차 건조 및 2차 건조를 포함한다. 상기 동결건조 절차가 완료된 후, 진공 하에 플러그를 삽입하였다. 재구성된 샘플을 동결건조 절차 전후의 경우와 비교하였다. 상기 결과는 상기 재구성된 용액이 상기 액체 제형의 양호한 성능을 유지하였음을 보여주었다.
동결건조 절차
냉동-건조 공정
파라미터		 온도
(℃)		 진공 정도
(mBar)
사전-냉동 5 N/A
-45 N/A
1차 건조 -27 0.1
2차 건조 25 0.01
구현예 9. 대안적 제형
본 발명에 의해 제공되는 안정한 약학적 제형은 또한 다음으로부터 선택되는 안정한 조합일 수 있다:
(1) 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 15mM의 염화칼슘, 5.5의 최종 pH;
(2) 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 15mM의 염화칼슘, 5.4의 최종 pH;
(3) 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 15mM의 염화칼슘, 5.3의 최종 pH;
(4) 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 15mM의 염화칼슘, 5.1의 최종 pH;
(5) 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 15mM의 염화칼슘, 4.9의 최종 pH;
(6) 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 15mM의 염화칼슘, 4.8의 최종 pH;
(7) 110㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 40㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 7.5mM의 염화칼슘, 5.4의 최종 pH;
(8) 110㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 40㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 7.5mM의 염화칼슘, 5.3의 최종 pH;
(9) 110㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 40㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 7.5mM의 염화칼슘, 5.1의 최종 pH;
(10) 110㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 40㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 7.5mM의 염화칼슘, 4.9의 최종 pH;
(11) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 50㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 6.0mM의 염화칼슘, 4.9의 최종 pH;
(12) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 50㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 6.0mM의 염화칼슘, 5.1의 최종 pH;
(13) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 50㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 6.0mM의 염화칼슘, 5.3의 최종 pH;
(14) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 50㎎/㎖의 트레할로오스, 0.5㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼 및 6.0mM의 염화칼슘, 5.4의 최종 pH.
(15) 90㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 40㎎/㎖의 트레할로오스, 0.3㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 5mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼(pH 4.8) 및 15mM의 염화칼슘;
(16) 110㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 95㎎/㎖의 트레할로오스, 0.6㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 20mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼(pH 5.5) 및 20mM의 염화칼슘;
(17) 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 Ab-5, 80㎎/㎖의 트레할로오스, 0.4㎎/㎖의 폴리소르베이트 80, 10mM의 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼(pH 5.0) 및 4.5mM의 염화칼슘.
<110> Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. <120> SOST Antibody Pharmaceutical Composition and Uses Thereof <130> 2019-FPA-9794 <150> CN201710621754.2 <151> 2017-07-27 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> murine <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Pro Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Leu Asp Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> murine <400> 2 Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Leu Leu Phe Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 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Claims (34)

  1. 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 및 버퍼를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 버퍼는 아세테이트 버퍼, 히스티딘 버퍼, 포스페이트 버퍼 및 숙시네이트 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세테이트 버퍼이며, 보다 바람직하게는 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼이고; 상기 약학적 조성물 내에 포함되는 상기 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편의 농도는 1㎎/㎖ 내지 120㎎/㎖인 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 약학적 조성물 내에 포함되는 상기 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편의 농도는 60㎎/㎖ 내지 120㎎/㎖이고, 바람직하게는 90㎎/㎖ 내지 120㎎/㎖이며, 보다 바람직하게는 80㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 100㎎/㎖인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 약학적 조성물의 pH는 4.8 내지 5.5이고, 바람직하게는 5.0 내지 5.2인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 버퍼의 농도는 5mM 내지 30mM이고, 바람직하게는 10mM 내지 20mM이며, 가장 바람직하게는 10mM인 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 버퍼의 pH는 4.8 내지 5.5이고, 바람직하게는 5.0 내지 5.5이며, 보다 바람직하게는 5.0 내지 5.2이고, 가장 바람직하게는 5.0인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    이당류를 추가로 포함하며, 상기 이당류는 트레할로오스 및 수크로오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 이당류의 농도는 40㎎/㎖ 내지 95㎎/㎖이고, 바람직하게는 45㎎/㎖ 내지 90㎎/㎖이며, 보다 바람직하게는 60㎎/㎖ 내지 90㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 80㎎/㎖인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    계면활성제를 추가로 포함하며, 상기 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트이고, 보다 바람직하게는 폴리소르베이트 80인 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 계면활성제의 농도는 0.02㎎/㎖ 내지 0.8㎎/㎖이고, 바람직하게는 0.3㎎/㎖ 내지 0.6㎎/㎖이며, 가장 바람직하게는 0.4㎎/㎖인 약학적 조성물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    점도 변형제를 추가로 포함하며, 상기 점도 변형제는 칼슘 염, 염화나트륨, 염화마그네슘 및 아르기닌 히드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 칼슘 염은 염화칼슘 및 칼슘 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 칼슘 염의 농도는 4.5mM 내지 20mM이고, 바람직하게는 4.5mM 내지 10mM이며, 가장 바람직하게는 4.5mM인 약학적 조성물.
  12. (a) 1㎎/㎖ - 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편; (b) 5mM - 30mM의 아세테이트 버퍼; (c) 45㎎/㎖ - 90㎎/㎖의 트레할로오스; (d) 0.02㎎/㎖ - 0.8㎎/㎖의 폴리소르베이트 80; 및 (e) 4.5mM - 20mM의 칼슘 염;을 포함하는 약학적 조성물로서,
    바람직하게는 상기 약학적 조성물의 pH는 4.8 내지 5.5이고, 보다 바람직하게는 5.0 내지 5.2이며; 또는
    상기 약학적 조성물은 다음을 포함하는 약학적 조성물:
    (a) 80㎎/㎖ - 100㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편; (b) 10mM - 20mM의 아세테이트 버퍼, pH 4.8 내지 5.5; (c) 60㎎/㎖ - 90㎎/㎖의 트레할로오스; (d) 0.3㎎/㎖ - 0.6㎎/㎖의 폴리소르베이트 80; 및 (e) 4.5mM - 20mM의 칼슘 염.
  13. (a) 1㎎/㎖ - 120㎎/㎖의 항-SOST 항체 또는 그의 항원-결합 절편, 및
    (b) 10mM - 20mM의 아세테이트 버퍼를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물의 pH는 5.0 내지 5.2인 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 각각 서열번호 3, 서열번호 9 및 서열번호 5에 나타낸 것과 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및
    각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 것과 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3;을 포함하는 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 항-SOST 항체 또는 그의 항원 결합 절편은 서열번호 10의 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 13의 경쇄 가변 영역을 포함하는 약학적 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-SOST 항체의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 25에 나타낸 것과 같은 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖고, 상기 항-SOST 항체의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 22에 나타낸 것과 같은 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 약학적 조성물.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 냉동-건조하는 단계를 포함하는 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형의 제조 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 냉동-건조하는 단계는 사전-냉동, 1차 건조 및 2차 건조하는 단계를 순차적으로 포함하는 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형의 제조 방법.
  19. 청구항 17 또는 청구항 18에 따른 방법에 의해 제조되는 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형.
  20. 청구항 19의 동결건조된 제형을 재구성하는 단계를 포함하는 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액의 제조 방법으로서,
    상기 재구성을 위한 용매는 바람직하게는 주사용수인 방법.
  21. 청구항 20에 따른 방법에 의해 제조되는 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 항-SOST 항체 및 또는 그의 항원 결합 절편의 농도는 80㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖이고, 가장 바람직하게는 100㎎/㎖인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 재구성된 용액의 pH는 4.8 내지 5.5이고, 바람직하게는 5.3인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  24. 청구항 21에 있어서,
    아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼를 추가로 포함하며, 상기 아세트산-나트륨 아세테이트 버퍼의 농도는 10mM 내지 30mM이고, 바람직하게는 10mM인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  25. 청구항 21에 있어서,
    이당류를 추가로 포함하며, 상기 이당류는 트레할로오스 및 수크로오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 이당류의 농도는 45㎎/㎖ 내지 90㎎/㎖이고, 바람직하게는 75㎎/㎖ 내지 80㎎/㎖이며, 가장 바람직하게는 80㎎/㎖인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  27. 청구항 21에 있어서,
    계면활성제를 추가로 포함하며, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트이고, 바람직하게는 폴리소르베이트 80인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 계면활성제의 농도는 0.3㎎/㎖ 내지 0.6㎎/㎖이고, 바람직하게는 0.4㎎/㎖인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  29. 청구항 21에 있어서,
    점도 변형제를 추가로 포함하며, 상기 점도 변형제는 칼슘 염, 염화나트륨, 염화마그네슘 및 아르기닌 히드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 칼슘 염은 염화칼슘 및 칼슘 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 칼슘 염의 농도는 4.5mM 내지 20mM이고, 바람직하게는 4.5mM 내지 10mM이며, 가장 바람직하게는 4.5mM인 항-SOST 항체를 함유하는 재구성된 용액.
  31. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 형성하기 위해 재구성되는 것을 특징으로 하는 항-SOST 항체를 함유하는 동결건조된 제형.
  32. SOST-연관 질환 또는 증상의 치료용 약제의 제조에 있어서의 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 청구항 19 또는 청구항 31에 따른 동결건조된 제형, 또는 청구항 21 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 따른 재구성된 용액의 용도로서,
    상기 SOST-연관 질환 또는 증상은 골다공증, 골감소증 또는 골관절염, 류마티스성 관절염, 치주 질환 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 골다공증인 용도.
  33. 치료적 유효량의 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 청구항 19 또는 청구항 31에 따른 동결건조된 제형, 또는 청구항 21 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 따른 재구성된 용액을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 SOST-연관 질환 또는 증상의 치료 및 예방 방법으로서,
    상기 SOST-연관 질환 또는 증상은 골다공증, 골감소증 또는 골관절염, 류마티스성 관절염, 치주 질환 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 골다공증인 방법.
  34. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 또는 청구항 19 또는 청구항 31에 따른 동결건조된 제형, 또는 청구항 21 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 따른 재구성된 용액을 함유하는 용기를 포함하는 물품.
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