KR20200035104A - Braf 특이적 tcr 및 그의 용도 - Google Patents

Braf 특이적 tcr 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20200035104A
KR20200035104A KR1020207006074A KR20207006074A KR20200035104A KR 20200035104 A KR20200035104 A KR 20200035104A KR 1020207006074 A KR1020207006074 A KR 1020207006074A KR 20207006074 A KR20207006074 A KR 20207006074A KR 20200035104 A KR20200035104 A KR 20200035104A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
leu
ser
seq
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020207006074A
Other languages
English (en)
Inventor
조슈아 비취
스탠리 알. 리델
실비아 리
Original Assignee
프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
유니버시티 오브 워싱턴
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터, 유니버시티 오브 워싱턴 filed Critical 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
Publication of KR20200035104A publication Critical patent/KR20200035104A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/15—Natural-killer [NK] cells; Natural-killer T [NKT] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/19—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4244—Enzymes
    • A61K40/4251—Kinases, e.g. Raf or Src
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 개시는 다양한 종양 관련 항원 (인간 BRAFV600E 에피토프 포함)에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예컨대 TCR, 이러한 항원 특이적 결합 단백질을 발현하는 세포, 이를 암호화하는 핵산, 및 세포가 암에서와 같이 BRAFV600E를 발현하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

BRAF 특이적 TCR 및 그의 용도
정부 이익에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 CA015704 하에서 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 카피 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 360056_454WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 126KB이고 2018년 8월 9일에 작성되었으며 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
종양-특이적 T 세포의 입양 전달은 기존의 종양을 제거하기 위한 매력적인 전략이며, 존재하는 종양을 제거하고 재발을 방지하기 위해 생체 내에서 항원-특이적 T 세포의 강력한 집단의 확립을 필요로 한다 (Stromnes et al., Immunol. Rev. 257:145, 2014). 최근에, 암에서의 돌연변이에 의해 생성된 항원에 대한 면역 반응이 T 세포에 의해 인식될 수 있고, 이들 T 세포가 입양 세포 요법 및 면역 체크포인트 억제제에 의한 치료에 대한 임상 반응을 매개할 수 있다는 증거가 증가하고 있다. 이러한 돌연변이로부터 발생하는 항원은 정상 조직에 비해 암에 대해 완전히 특이적이고 또한 다른 항원 유형에 대해 T 세포 기능을 제한할 수 있는 중심 내성 메커니즘이 없기 때문에 면역요법에 대한 특히 매력적인 표적이다.
그러나, 자가 또는 조작된 동종이계 종양-특이적 CD8+ 세포 독성 T 림프구 (CTL)의 투여는 선택된 환자에서 직접적인 항종양 활성을 매개할 수 있지만 (Chapuis et al., Cancer Res. 72:LB-136, 2012; Chapuis et al., Sci. Transl. Med. 5:174ra127, 2013; Chapuis et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 109:4592, 2012)2-4, 원하는 특성을 갖는 종양 반응성 T 세포를 동정하고 분리하는 것은 힘들고 복잡한 노력이 든다 (Stone and Kranz, Frontiers Immunol. 4:244, 2013; Chapuis et al., 2013; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; Ho et al., J. Immunol. Methods 310:40, 2006 참조). 또한, 각 환자 또는 공여체로부터 단리된 CTL의 결합성 변동은 임상 시험에서 항종양 효능을 제한한다 (Chapuis et al., 2013). 또한, 면역 반응을 유발하는 대부분의 항원-특이적 돌연변이는 한 개인의 암에서만 발견되며 여러 환자에서 발견되지는 않는다.
모발 세포 백혈병, 악성 흑색종, 갑상선암, 폐암 및 결장암과 같은 다양한 암에 대한 대안적인 항원-특이적 TCR 면역요법이 명백히 필요하다. 특히, 암에 특이적이고 암에 널리 퍼져있는 항원을 표적으로 하는 TCR 면역요법이 필요하다.
이제 개시되는 구체예들은 이러한 요구를 해결하고 다른 관련 이점을 제공한다.
도 1A-1I는 BRAFV600E에 특이적인 환자-유래 CD4+ T 세포의 확인 및 특성을 보여준다. (1A) 왼쪽 장골 영역 (좌측)과 왼쪽 허벅지 (우측)에서 재발성 종양을 보여주는 양전자 방출 단층 촬영. (1B-1D) BRAFV600E-특이적 T 세포의 특이성 및 HLA 제한: (1B) 야생형 및 돌연변이 BRAF 펩티드로 펄싱된 자가 B 세포와 인큐베이션된 환자 유래 T 세포주에 의한 IFN-γ 생산; (1C) 돌연변이 BRAF 펩티드로 펄싱되거나 돌연변이 또는 야생형 BRAF 서열을 암호화하는 mRNA로 형질감염된 자가 B 세포의 인식; (1D) HLA 차단 항체의 존재 또는 부재에서 돌연변이 BRAF 펩티드로 펄싱된 자가 B 세포의 인식; (1E) HLA-DQB1*0302/DQA1*03 (DQ3) 및 HLA-DRB1*0404 (DR4)로 형질도입 전 및 후에 환자와 HLA-DQ에서 매칭된 B-LCL 라인 1331, 또는 HLA-미스매치된 B-LCL 라인 VAVY의 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포에 의한 인식; (1F) HLA DQB1*03 대립유전자를 발현하는 동종이계 B-LCL 세포주와 인큐베이션되고 지시된 양의 21-mer BRAFV600E 펩티드로 펄싱된 환자 유래 BRAFV600E-특이적 T 세포에 의한 IFN-β 방출. 삼중 기술 복제가 수행되었다; (1G) 3일 동안 인간 IFN-α 500 U/ml로 전처리 및 전처리하지 않고 BRAFV600E 펩티드로 펄싱된 자가 B 세포 또는 지시된 종양 세포주와 인큐베이션된 환자 유래 BRAFV600E-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ 방출; (1H, 1I) 이소형 대조군에 대한 유세포 분석에 의해 정량화된, IFN-γ로 전처리 및 전처리하지 않은 종양 세포주에서 HLA-DQ (1H) 및 HLA-DR (1I)의 발현 (평균 형광 강도). 실험은 지시된 바와 같이 기술적인 중복 또는 삼중으로 수행되었으며, 두 독립적인 실험을 나타낸다.
도 2A-2O는 입양 전달 후 혈액에서 TIL (종양 침윤 림프구)에서의 CD8+ T 세포의 특이성 및 T 세포 클론형의 TCR 서열분석을 보여준다. (2A) 엘리스팟 분석에 의해 환자의 흑색종에 존재하는 20개의 비유사 돌연변이를 함유하는 40개의 20-mer 펩티드를 포함하는 13개 풀의 펩티드로 펄싱된 자가 CD40L-활성화된 B 세포와 함께 인큐베이션된 TIL에 의한 IFN-γ 생산. 분석에서 각 펩티드의 최종 농도는 10 ㎍/ml이었다. 삼중 기술 복제가 수행되었다. (2B-2F) 브레펠딘 A의 존재하에 29개의 비유사 돌연변이 또는 자가-항원 티로시나제, Mage A3, Mart1, SSX2 및 GP100의 암호화 서열을 포함하는 탠덤 미니유전자로 형질도입된 B 세포와 인큐베이션되거나, (2B-2E) 종양 관련 자가 항원 (2F)으로 펄싱된 TIL에 의한 IFN-γ 생산. 분석에서 각 펩티드의 최종 농도는 10 ㎍/ml이었다. 삼중 기술 복제가 수행되었다. (2G) 모의 자극, BRAFV600E 펩티드 자극 후, 또는 BRAFV600E 펩티드 재자극 후 IFN-γ 분비 세포를 분류한 후 말초 혈액 단핵 세포에서 TCR Vβ 서열의 빈도. (2H) 전처리 혈액, 종양 단일 세포 현탁액, 및 환자에게 주입된 TIL 산물의 TCRβ 서열분석에 의해 정량화된 BRAF-특이적 T 세포의 TCR Vβ 클론형. (2I) 유병률 (그래프의 오른쪽 부분)에 의해 순위가 매겨진 TIL 산물의 TCRVβ 서열. (2J) 10 및 24개월에 수득된 전처리 혈액 및 처리 후 혈액에서 (2I)로부터의 상위 34 TIL TCR Vβ 클론형의 빈도. (2K) 전처리 및 처리 후 혈액에서 특정 항원에 특이적인 CD4+ BRAFV600E 및 CD8+ T 세포의 TCR Vβ 클론형의 빈도. (2L-2O) 자가 B 세포 및 타일형 펩티드와 인큐베이션된 TIL로부터의 TIL 및 T 세포상의 TCR β 서열분석. 타일형 펩티드는 (2L) 티로시나제, (2M) Mart1, (2N) Mage A3 및 (2O) TRP2에 걸치며 IFN-γ 포획에 의해 분류되었다. 분류된 세포가 풍부한 항원-특이적 TCR β 서열은 박스로 표시되어 있다.
도 3A-3C는 종양-침윤 림프구 (TIL)로 처리한 후 BRAF-특이적 T 세포에 대한 표현형 분석을 보여준다. (3A) TIL에서 단핵구 (CD14+), B 세포 (CD19+) 및 죽은 세포 (ViaProbe)를 제외하기 위한 덤프 채널 게이팅 스킴. 생존 CD4+ T 세포를 사량체 및 CD45RA에 대해 플롯팅하였다. (3B) 사량체 양성 및 음성인 CD45RA-기억 세포 (CD4+의 88.1%)를 지시된 세포 표면 마커에 대해 플롯팅하였다. 수치는 게이트된 영역의 세포 백분율 또는 각 마커에 대한 사량체 양성 세포의 백분율을 나타낸다. (3C) 활성화된 (CD154+) BRAF-특이적 T 세포의 세포 내 사이토카인 염색.
도 4A-4B는 흑색종-반응성 환자 TIL의 우세한 Vα 및 Vβ 서열로부터 유래된 합성 TCR이 BRAFV600E를 발현하는 세포를 인식한다는 것을 보여준다. (4A) 모의 자극, BRAFV600E 자극 후, 또는 BRAFV600E 펩티드 재자극 후 IFN-β 분비 세포를 분류한 후 말초 혈액 단핵 세포에서 TCRBVa 서열의 빈도. (4B) 합성 TCR 작제물로 형질도입되고 BRAFV600E 펩티드로 펄싱되거나 돌연변이 또는 야생형 BRAF 서열을 암호화하는 mRNA로 형질감염된 HLA-DQB1*0302 B 세포주 1331과 인큐베이션된 두 정상 공여체로부터의 CD4+ T 세포에 의한 IFN-β 생산. 지시된 바와 같이 N=2 또는 3의 기술 복제물.
도 5는 환자 TIL에서 확인된 TCRβ 및 TCRα 유전자를 사용하여 제조된 4개의 TCR (pJV88-pJV91) 중 하나로 형질도입된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산을 보여준다. 좌측, 항원 펩티드 없음. 우측, 항원 펩티드.
도 6A 및 6B는 일차 인간 CD4+ T 세포에서 이종 BRAF-특이적 TCR의 발현에 대한 내인성 TCR 서열의 CRISPR-매개 녹아웃의 효과를 보여준다. (6A) 자극된 T 세포를 TCRA 및 TCRB를 표적으로 하는 Cas9-RNP로 형질감염시키고 BRAFV600E-특이적 TCR을 암호화하는 DNA로 형질도입하였다. BRAF-특이적 TCR 발현을 Vbeta3.1에 의해 측정하고 TCR 발현을 항-CD3를 사용하여 측정하였다. 상단 패널: CRISPR 매개 TCR 녹아웃이 없는 (왼쪽) 또는 있는 (오른쪽) 비변형 세포. 하부 패널: CRISPR-매개 TCR 녹아웃이 없는 (왼쪽) 또는 있는 (오른쪽) 형질도입된 세포. (6B) 사량체 염색: 내인성 TCR의 결실이 있거나 없는 BRAFV600E-특이적 TCR로 변형된 T 세포를 형질도입되지 않은 세포 (가장 왼쪽 피크) 및 환자-유래 항원-특이적 T 세포 클론 (가장 오른쪽 피크)과 사량체에 결합에 대해 비교하였다.
상세한 설명
특정 측면에서, 본 개시는 BRAFV600E 펩티드 항원, 예컨대 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)와 관련된 BRAFV600E 펩티드 항원 (예를 들어, 인간 백혈구 항원, HLA)에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 단백질, 예컨대 T 세포 수용체 (TCR)를 제공한다. 본 개시의 결합 단백질은 예를 들어 BRAFV600E 발현을 특징으로 하는 과증식성 질환, 예컨대 암을 치료하기 위한 요법에 유용하다.
배경으로, 암 관련 돌연변이에 의해 생성된 항원은 치료적 개입을 위한 매력적인 표적이지만, 일반적으로 개별 환자마다 고유하다. 따라서, 암의 필수 "구동" 돌연변이에 의해 유발된 항원은 이들이 암 세포에 특이적이고 환자 집단에서 높은 빈도로 발생하기 때문에 관심 대상이다. BRAF 단백질은 세포 성장 신호 전달에 관여하는 반면, 돌연변이 BRAF는 다수의 암에 연루된다 (예를 들어, Frasca et al., Endocrine-Related Cancer 15:191(2008) 참조). 특히, BRAF 유전자의 엑손 15에서 발생하는 치환 돌연변이 V600E (BRAFV600E)는 발암에서 초기 사건인 성장 신호 전달 경로를 구동하기 위해 BRAF를 활성화시킨다. 이 돌연변이는 모발 세포 백혈병, 악성 흑색종 사례의 약 절반, 및 진행된 갑상선암, 폐암 및 결장암 환자의 상당수에서 발견된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 특정 구체예에서 BRAFV600E 발현과 관련된 질환 및 상태의 치료를 위한 치료적 유용성을 가질 것이다. 이러한 질환에는 다양한 형태의 과증식성 장애, 예컨대 모발 세포 백혈병, 흑색종, 잘 분화되지 않은 갑상선암과 같은 갑상선암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 유두암, 비호지킨 림프종, 교모세포종, 및 털모양별아교세포종, 유방암, 난소암, 랑게르한스 세포 조직구증 및 육종 (예를 들어, 섬유육종 (섬유모세포 육종), 융기성 피부섬유 육종 (DFSP), 골육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 위장관 기질 종양, 평활근육종; 맥관육종 (혈관육종), 카포시육종, 지방 육종, 다형세포 육종 및 윤활막 육종)이 포함된다. 이들 및 관련 용도의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있고, 예를 들어 BRAFV600E 펩티드에 특이적인 TCR을 발현하는 재조합 T 세포의 사용에 의한 것과 같이, BRAFV600E 항원-특이적 T 세포 반응의 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 자극을 포함한다.
본 개시 내용을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이의 이해에 도움이 될 수 있다. 추가적인 정의는 본 개시 전체에 설명되어 있다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값 및 적절한 경우 그의 분수 (예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 중합체 소단위, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 임의의 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "하나"는 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 그의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "포함하다"는 동의적으로 사용되고, 이의 용어 및 변형체는 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
또한, 본원에서 기술된 구조 및 치환기의 다양한 조합으로부터 유도된, 개별 화합물, 또는 화합물의 군은 본원에 의해 각각의 화합물 또는 화합물의 군이 개별적으로 열거된 것과 동일한 범위로 기술된 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 치환기의 선택은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하지 않고, 청구한의 명시된 물질 또는 단계, 또는 청구된 대상의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역 또는 모듈 (예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈) 또는 (하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있는) 단백질은 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질 길이의 최대 20% (예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 활성도 (예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화도)에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 50%를 초과하여 활성도를 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 이들의 조합 (예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다".
본원에서 사용되는 "면역계 세포"는 (단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵세포 및 과립구와 같은 골수 세포에서 발생하는) 골수 전구 세포 및 (T 세포, B 세포 및 자연 살해 T (NK-T) 세포를 포함한 자연 살해 (NK) 세포와 같은 림프계 세포에서 발생하는) 림프계 전구 세포의 두 가지 주요 계통에서 발생하는 골수 내 조혈 줄기세포로부터 기원한 면역계의 임의의 세포를 의미한다. 예시적인 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포는 펩티드와 복합체화된 APC 표면 상의 주요 조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex)(MHC) 수용체가 T 세포 표면 상의 TCR과 상호작용하는 경우 T 세포를 활성화시킬 수 있는 특수화 세포인 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로 지칭될 수 있다.
"주요 조직 적합성 복합체" (MHC)는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 막 스패닝 (spanning) α 쇄 (3개의 α 도메인을 가짐) 및 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는 이형이량체이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질, 즉, α와 β로 구성되는데, 이들 둘 다 막에 걸쳐있다. 각각의 쇄는 2개의 도메인을 가진다. MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 유래하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래된 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 인간 MHC는 인간 백혈구 항원 (HLA)으로 지칭된다. HLA-II 유형에는 DP, DM, DOA, DOB, DQ 및 DR이 포함된다. 예를 들어, HLA-DQA1*03, HLA-DQB1*0301, HLA-DQB1*0302, HLA-DQB1*0303을 포함하여 다양한 HLA 유형의 서브 유닛을 암호화하는 다수의 대립유전자가 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 본 개시에 따른 결합 단백질은 HLA-DQ와 복합체화된 BRAFV600E 펩티드를 인식할 수 있다. 특정 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQB1*0301, *0302 또는 *0303을 포함한다. 특정 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQB1*0302를 포함한다. 추가의 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQA1*03을 포함한다.
"T 세포" 또는 "T 림프구"는 흉선에서 성숙하고 T 세포 수용체 (TCR)를 생산하는 면역계 세포이다. T 세포는 나이브 (항원에 노출되지 않음; TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA의 증가된 발현, 및 CD45RO의 감소된 발현), 기억 T 세포 (TM) (항원-경험 및 장기간 생존), 및 이펙터 세포 (항원-경험, 세포독성)일 수 있다. TM은 중추 기억 T 세포 (TCM, 나이브 T 세포에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 증가된 발현, 및 CD54RA의 감소된 발현) 및 이펙터 기억 T 세포 (TEM, 나이브 T 세포 또는 TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD45RA의 감소된 발현, 및 CD127의 증가된 발현)의 서브세트로 추가로 분화될 수 있다.
이펙터 T 세포 (TE)는 TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28의 발현이 감소되고, 그랜자임 및 퍼포린에 대해 양성인 항원-경험 CD8+ 세포독성 T 림프구를 지칭한다. 헬퍼 T 세포 (TH)는 사이토카인을 방출함으로써 다른 면역 세포의 활성에 영향을 미치는 CD4+ 세포이다. CD4+ T 세포는 적응성 면역 반응을 활성화 및 억제할 수 있고, 이들 두 기능 중 어느 것이 유도되는지는 다른 세포 및 신호의 존재에 의존할 것이다. T 세포는 공지된 기술을 사용하여 수집될 수 있고, 다양한 하위 집단 또는 그의 조합은 공지된 기술, 예를 들어 항체에 대한 친화성 결합, 유세포 분석 또는 면역 자기 선택에 의해 풍부화되거나 고갈될 수 있다. 다른 예시적인 T 세포는 조절 T 세포, 예컨대 CD4+ CD25+ (Foxp3+) 조절 T 세포 및 Treg17 세포뿐만 아니라 Tr1, Th3, CD8+CD28-, 및 Qa-1 제한 T 세포를 포함한다.
"T 세포 수용체" (TCR)는 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 (가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막관통 영역, 및 짧은 세포질 꼬리를 가짐; 예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조)을 지칭한다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있고, 일반적으로 α 및 β쇄 (또한 각각 TCRα 및 TCRβ로서 알려짐), 또한 γ및 δ쇄 (또한 각각 TCRγ및 TCRδ로서 알려짐)를 갖는 이형이량체로 구성된다. 면역글로불린과 같이, TCR 쇄 (예를 들어, α-쇄, β-쇄)의 세포외 부분은 2개의 면역글로불린 도메인, 즉, N-말단에서의 가변 도메인 (예를 들어, α-쇄 가변 도메인 또는 Vα, β-쇄 가변 도메인 또는 Vβ; 전형적으로 카바트 넘버링 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.)에 기초한 아미노산 1 내지 116, 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예를 들어, α-쇄 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 카바트에 기초한 아미노산 117 내지 259, β-쇄 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 카바트에 기초한 아미노산 117 내지 295)을 함유한다. 또한 면역글로불린과 같이, 가변 도메인은 프레임워크 영역 (framework region: FR)에 의해 분리되는 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR)을 함유한다 (예를 들어, 문헌[Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988] 참조; 또한 문헌[Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). TCR 가변 도메인 서열은 넘버링 체계 (예를 들어, Kabat, EU, IMGT (International Immunogenetics Information System) 및 Aho)에 정렬될 수 있으며, 이는 동일한 잔기 위치에 주석을 달고 항원 수용체 넘버링 및 수용체 분류 (ANARCI) 소프트웨어 도구 (2016, Bioinformatics 15: 298-300)를 사용하여 다른 분자를 비교할 수 있다. 넘버링 체계는 TCR 가변 도메인에서 프레임워크 영역 및 CDR의 표준화된 묘사를 제공한다.
특정 구체예에서, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견되고 CD3 복합체와 회합된다. 본 개시에 사용된 TCR의 공급원은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 포유동물로부터 유래될 수 있다.
"CD3"은 6개 쇄의 다중-단백질 복합체로 알려져 있다 (문헌[Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172 및 178, 1999] 참조). 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄 및 CD3ζ쇄의 동종이량체를 포함한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε쇄는 단일 세포외 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε쇄의 막관통 영역은 음으로 하전되는데, 이는 이들 쇄가 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 회합되도록 허용하는 특징이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리는 각각 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ쇄는 3개의 ITAM을 가진다. 이론에 구애없이, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 중요한 것으로 여겨진다. 본 개시에서 사용되는 바와 같은 CD3은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물를 포함하는 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 "TCR 복합체"는 TCR과 CD3의 회합에 의해 형성되는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, TCR 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄의 동종이량체, TCRα 쇄 및 TCRβ 쇄로 구성될 수 있다. 대안적으로, TCR 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄의 동종이량체, TCRγ 쇄, 및 TCRδ 쇄로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 "TCR 복합체의 성분"은 TCR 쇄 (즉, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 쇄 (즉, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ), 또는 2 이상의 TCR 쇄 또는 CD3 쇄에 의해 형성된 복합체 (예를 들어, TCRα와 TCRβ의 복합체, TCRγ와 TCRδ의 복합체, CD3ε과 CD3δ의 복합체, CD3γ과 CD3ε의 복합체, 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, 및 2개의 CD3ε 쇄의 서브-TCR 복합체)를 지칭한다.
"CD4"는 항원-제시 세포와 소통하는 데 있어서 TCR을 보조하는 면역글로불린 공동수용체 당단백질이다 (문헌[Campbell & Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings, Sixth Ed., 2002)); uniProtKB P01730] 참고). CD4는 면역 세포, 예컨대, T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 표면 상에서 발견되며, 세포 표면에서 발현되는 4개의 면역글로불린 도메인 (D1 내지 D4)을 포함한다. 항원 제시 동안, CD4는 TCR 복합체와 함께 모집되어 MHCII 분자의 상이한 영역에 결합한다 (CD4는 MHCII β2에 결합하는 반면, TCR 복합체는 MHCII α1/β1에 결합함). 이론에 구애없이, TCR 복합체에 대한 인접은 CD4-회합된 키나제 분자가 CD3의 세포질 도메인 상에 존재하는 면역수용체 티로신 모티프 (ITAM)를 포스포릴화시킬 수 있게 한다고 여겨진다. 이러한 활성도는 다양한 유형의 T 헬퍼 세포를 생산하기 위해서 활성화된 TCR에 의해서 생성된 신호를 증폭시킨다고 생각된다.
본원에서 사용되는 용어 "CD8 공동수용체" 또는 "CD8"은 알파-알파 동종이량체 또는 알파-베타 이종이량체로서의 세포 표면 당단백질 CD8을 의미한다. CD8 공동수용체는 세포독성 T 세포 (CD8+)의 기능을 보조하고, 이의 세포질 티로신 포스포릴화 경로를 통한 신호전달을 통해서 기능한다 (Gao and Jakobsen, Immunol. Today 21:630-636, 2000; Cole and Gao, Cell. Mol. Immunol. 1:81-88, 2004). 다섯 (5) 종의 상이한 CD8 베타 쇄 (UniProtKB 식별인자 P10966 참고) 및 단일 CD8 알파 쇄 (UniProtKB 식별인자 P01732 참고)가 존재한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 TCR의 결합에 관여하는 TCR α-쇄 또는 β-쇄 (또는 γδ TCR의 경우 γ-쇄 및 δ-쇄)의 도메인을 의미한다. 천연 TCR의 α-쇄 및 β-쇄의 가변 도메인 (각각 Vα 및 Vβ)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 일반적으로 보존된 골격 영역 (FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. Vα 도메인은 2개의 분리된 DNA 세그먼트, 가변 유전자 세그먼트 및 결합 유전자 세그먼트 (V-J)에 의해 암호화되고; Vβ 도메인은 3개의 분리된 DNA 세그먼트, 가변 유전자 세그먼트, 다양성 유전자 세그먼트 및 결합 유전자 세그먼트 (V-D-J)에 의해 암호화된다. 항원 결합 특이성을 부여하는데 단일 Vα 또는 Vβ 도메인이 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 TCR은 각각 상보적 Vα 또는 Vβ 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 TCR로부터 Vα 또는 Vβ 도메인을 사용하여 단리될 수 있다.
용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이고, 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는, TCR 가변 영역 내의 아미노산의 비-인접 서열을 지칭하는 것으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 α-쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (αCDRl, αCDR2, αCDR3)이 존재하고, 각각의 β-쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (βCDR1, βCDR2, βCDR3)이 존재한다. CDR3은 처리된 항원을 인식하는데 관여하는 주요 CDR인 것으로 생각된다. CDR1 및 CDR2는 주로 MHC와 상호작용한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 Vα 도메인의 αCDR1, αCDR2 및/또는 αCDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질은 서열 번호 5 내지 7 중 어느 하나에 기재된 Vβ 도메인의 βCDR1, βCDR2 및/또는 βCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 면역원성 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 특이적인 면역학적-수용성 세포 (예를 들어, T 세포), 또는 둘 모두의 활성화를 포함할 수 있다. 항원 (면역원성 분자)은 예를 들어, 펩티드, 글리코펩티드, 폴리펩티드, 글리코폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지질 등일 수 있다. 항원은 합성되거나, 재조합 방식으로 생산되거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다는 것이 상당히 자명하다. 1종 이상의 항원을 함유할 수 있는 예시적인 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포, 생물 유체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 항원은 항원을 발현하도록 변형되거나 유전자 조작된 세포에 의해 생성될 수 있다. 예시적인 항원은 BRAFV600E를 포함한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 에피토프"는 동족 결합 분자, 예컨대, 면역글로불린, T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체, 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질에 의해서 인식되거나 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면기, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄를 함유하고, 특정 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "결합 도메인" ("결합 영역" 또는 "결합 모이어티"로도 지칭 됨)은 표적 (예를 들어, BRAFV600E)과 특이적으로 그리고 비공유적으로 회합, 통합 또는 조합되는 능력을 보유하는 분자 또는 이의 부분 (예를 들어, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질)을 지칭한다. 결합 도메인은 생물학적 분자, 분자 복합체 (즉, 2종 이상의 생물학적 분자를 포함하는 복합체), 또는 다른 관심 표적에 대한 임의의 자연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합 방식으로 생산된 결합 파트너를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 단일쇄 면역글로불린 가변 영역 (예를 들어, scTCR, scFv), 수용체 엑토도메인, 리간드 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인), 또는 생물학적 분자, 분자 복합체 또는 다른 관심 표적에 결합하는 그의 특이적 능력을 위해 선택된 합성 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 "특이적으로 결합한다" 또는 "에 대해서 특이적"은 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 성분과 유의하게 회합 또는 통합되지 않고, 105M-1 (이것은 이러한 회합 반응에 대한 오프-레이트 [koff]에 대한 온-레이트 [kon]의 비와 동일함) 이상의 친화도 또는 Ka (즉, 1/M을 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 회합 상수)로 표적 분자에 결합 단백질 (예를 들어, TCR 수용체) 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)이 회합 또는 통합하는 것을 지칭한다. 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)은 "고 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질) 또는 "저 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)으로 분류될 수 있다. "고 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 1012M-1, 또는 적어도 1013M-1의 Ka를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. "저 친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 최대 107M-1, 최대 106M-1, 최대 105M-1의 Ka를 갖는 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화도는 M (예를 들어, 10-5M 내지 10-13M) 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수 (Kd)로서 정의될 수 있다.
특정 구체예에서, 수용체 또는 결합 도메인은 야생형 (또는 모) 결합 도메인보다 표적 항원에 대해서 더 강한 결합을 갖는 선택된 또는 조작된 수용체 또는 결합 도메인을 지칭하는 "향상된 친화도"를 가질 수 있다. 예를 들어, 향상된 친화도는 야생형 결합 도메인보다 더 높은 표적 항원에 대한 Ka (평행 회합 상수)로 인한 것이거나, 야생형 결합 도메인의 것보다 낮은 표적 항원에 대한 Kd (해리 상수)로 인한 것이거나, 야생형 결합 도메인의 것보다 낮은 표적 항원에 대한 오프-레이트 (koff)로 인한 것이거나 또는 이들의 조합으로 인한 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 향상된 친화도 TCR은 특정 숙주 세포, 예컨대, T 세포에서 발현을 향상시키도록 코돈 최적화될 수 있다 (Scholten et al., Clin. . Immunol. 119:135, 2006).
결합 도메인 또는 융합 단백질 친화도를 결정하는 것뿐만 아니라 특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시의 결합 도메인을 식별하기 위한 다양한 검정,예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA, 분석 초원심분리, 분광법 및 표면 플라즈몬 공명 (Biacore®) 분석이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993; 및 미국 특허 제5,283,173호, 5,468,614호, 또는 등가물 참조). 친화도 또는 겉보기 친화도 또는 상대 친화도를 평가하기 위한 분석도 알려져 있다. 특정 예에서, TCR에 대한 겉보기 친화도는 다양한 농도의 사량체에 대한 결합을 평가함으로써, 예를 들어 표지된 사량체를 사용한 유세포 분석에 의해 측정된다. 일부 예에서, TCR의 겉보기 KD는 다양한 농도에서 표지된 사량체의 2배 희석 다음에, 비선형 회귀에 의한 결합 곡선의 결정을 이용하여 측정되며, 겉보기 KD는 최대 절반의 결합을 수득한 리간드 농도로서 결정된다.
용어 "BRAFV600E-특이적 결합 단백질"은 BRAFV600E 펩티드 항원 또는 BRAFV600E 펩티드 항원:HLA 복합체에, 예를 들어 세포 표면에서 특이적으로 결합하고, BRAFV600E 돌연변이를 함유하지 않는 BRAF 펩티드를 포함하는 세포 표면에서 HLA 복합체에 결합하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
특정 구체예에서, BRAFV600E-특이적 결합 단백질은 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만, 약 10-10 M 미만, 약 10-11 M 미만, 약 10-12 M 미만, 또는 약 10-13 M 미만의 Kd, 또는 예를 들어 동일한 분석에 의해 측정되어 본원에 제공된 예시적인 BRAFV600E-특이적 결합 단백질, 예컨대 본원에 제공된 임의의 BRAFV600E-특이적 TCR에 의해 나타나는 친화력과 대략 동일하거나, 적어도 대략 동일하거나 또는 그의 값이나 대략적인 그의 값보다 큰 친화도로 BRAFV600E-함유 펩티드:HLA 복합체 (또는 BRAFV600E-함유 펩티드:MHC 복합체)에 결합한다. 특정 구체예에서, BRAFV600E-특이적 결합 단백질은 BRAFV600E-특이적 면역글로불린 슈퍼 패밀리 결합 단백질 또는 이의 결합 부분을 포함한다.
용어 "BRAFV600E 결합 도메인" 또는 "BRAFV600E 결합 단편"은 특정 BRAFV600E 결합을 담당하는 BRAFV600E-특이적 결합 단백질의 도메인 또는 부분을 지칭한다. BRAFV600E-특이적 결합 도메인 단독 (즉, BRAFV600E-특이적 결합 단백질의 임의의 다른 부분이 없는 것)은 가용성일 수 있고, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만, 약 10-10 M 미만, 약 10-11 M 미만, 약 10-12 M 미만, 또는 약 10-13 M 미만의 Kd로 BRAFV600E (예를 들어, MHC 수용체 분자 또는 이의 기능적 단편과의 복합체로)에 결합할 수 있다. 예시적인 BRAFV600E-특이적 결합 도메인은 항-BRAFV600E TCR 또는 항체로부터 유래될 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 BRAFV600E-특이적 scTCR (예를 들어, Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vα, 또는 Vα-L-Vβ-Cβ와 같은 단일쇄 αβTCR 단백질을 포함하며, 여기서 Vα 및 Vβ는 각각 TCRα 및 β 가변 도메인이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCRα 및 β 불변 도메인이고, L은 링커임) 및 scFv 단편을 포함한다.
항원 제시 세포 (APC) (예컨대, 수지상 세포, 대식세포, 림프구 또는 다른 세포 유형)에 의한 항원 처리의 원리, 및 면역상용성 (예를 들어, 항원 제시에 관련된 MHC 유전자의 적어도 하나의 대립유전자 형태를 공유함) APC와 T 세포 간의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)-제한 제시를 비롯한, APC에 의한 T 세포에 대한 항원 제시의 원리는 널리 확립되어 있다 (예를 들어, 문헌[Murphy, Janeway's Immunobiology (8th Ed.) 2011 Garland Science, NY; chapters 6, 9 and 16] 참고). 예를 들어, 사이토졸 (예를 들어, 종양 항원, 세포내 병원균)에서 기원한 처리된 항원 펩티드는 일반적으로 약 7개의 아미노산 내지 약 11개의 아미노산 길이이고, 부류 I MHC 분자와 회합할 것이지만, 혈관계에서 처리되는 펩티드 (예를 들어, 박테리아, 바이러스)는 일반적으로 약 10개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산의 길이에서 달라질 것이고, 부류 II MHC(HLA) 분자와 회합한다.
"BRAFV600E 항원" 또는 "BRAFV600E 펩티드 항원" 또는 "BRAFV600E-함유 펩티드 항원"은 약 7개 아미노산 내지 약 20개 아미노산의 길이 범위에 있고 V600E 치환 돌연변이를 포함하는 BRAF 단백질의 자연적으로 또는 합성적으로 생성된 부분 (예를 들어, 전장 야생형 BRAF의 600번 위치에 상응하는 잔기에서 발린으로 치환된 글루탐산을 포함하는 BRAF597-603 또는 BRAF590-610의 펩티드; 예를 들어, Uniprot 등록 번호 P15056 및 NCBI 참조 식별자 NP_004324.2 참조)을 지칭하는데, 이것은 MHC (예를 들어, HLA) 분자와 복합체를 형성할 수 있고, 이 복합체는 BRAFV600E 펩티드:MHC (예를 들어, HLA) 복합체에 대해서 특이적인 결합 단백질과 결합할 수 있다. 예시적인 BRAFV600E 펩티드 항원은 서열 번호 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함한다.
"링커"는 2개의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하는 아미노산 서열을 지칭하며, 얻어진 폴리펩티드가 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화도 (예를 들어, scTCR)를 보유하거나 또는 신호전달 활성 (예를 들어, TCR 복합체)을 보유하도록 2개의 하위-결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 링커는 약 2 내지 약 35개의 아미노산, 예를 들어, 또는 약 4개 내지 약 20개의 아미노산 또는 약 8 내지 약 15개의 아미노산 또는 약 15 내지 약 25개의 아미노산으로 이루어진다.
"접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 두 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이, 예컨대 결합 도메인과 인접한 불변 도메인 사이 또는 TCR 쇄와 인접한 자기 절단 펩티드 사이의 하나 이상의 (예를 들어, 약 2 내지 10개의) 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계 (예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용으로부터 초래된 아미노산 잔기)로부터 초래될 수 있다.
"변경된 도메인" 또는 "변경된 단백질"은 적어도 85% (예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%)의 야생형 모티프, 영역, 도메인, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 야생형 TCRα 쇄, TCRβ 쇄, TCRα 불변 도메인, TCRβ 불변 도메인)에 대해 비동일 서열 동일성을 갖는 모티프, 영역, 도메인, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는, "핵산" 또는 "핵산 분자"는, 예를 들어, 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)에 의해 또는 시험관내 번역에 의해 생성된 임의의 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 단편, 및 임의의 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 또는 엑소뉴클레아제 작용에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 핵산은 PCR에 의해 생산된다. 핵산은 천연 유래 뉴클레오티드 (예컨대 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드), 천연 유래 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 천연 유래 뉴클레오티드의 α-거울상체 형태), 또는 이들 둘의 조합물인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티, 또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에서의 변형 또는 대체를 가질 수 있다. 핵산 단량체는 이러한 결합의 포스포디에스테르 결합 또는 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 하나일 수 있다.
용어 "단리된"은 물질이 그의 본래의 환경 (예를 들어, 천연 유래라면 천연 환경)으로부터 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 천연 유래 핵산 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 천연 시스템에서 공동 존재하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드가 단리된다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물 (예를 들어, 세포 용해물)의 부분일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 천연 환경의 부분이 아니도록 여전히 단리된다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 생산하는 데 수반되는 DNA 세그먼트를 의미하며; 이는 암호화 영역 앞과 뒤의 영역 ("리더 및 트레일러 (trailer)")뿐만 아니라 개개 암호화 세그먼트 사이의 개재 서열 (엑손)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형되는, 인간 개입에 의해 유전자 조작된 세포, 미생물, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하거나, 또는 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어되거나, 하향조절되거나, 결실되거나, 축퇴되거나 또는 구성적이되도록 변경된 세포 또는 미생물을 지칭한다. 인간-발생 유전자 변경은, 예를 들어, (프로모터와 같은 발현 제어 요소를 포함할 수 있는) 하나 이상의 단백질 또는 효소를 암호화하는 핵산 분자를 도입하는 변형, 또는 세포의 유전자 물질에 대한 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환 또는 다른 기능성 파괴 또는 첨가를 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 참조 또는 모 분자로부터의 이종 또는 상동성 폴리펩티드의 암호 영역 또는 이의 기능성 단편에서의 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는, "돌연변이"는 참조 또는 야생형 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자에 비해 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자에서의 변화를 각각 지칭한다. 돌연변이는 뉴클레오티드(들) 또는 아미노산(들)의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열에서의 몇몇 상이한 유형의 변화를 초래할 수 있다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 1 또는 3개의 코돈 또는 아미노산의 치환, 1 내지 약 5개의 코돈 또는 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합이다.
"보존적 치환"은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환으로서 당업계에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당 업계에 이미 알려졌다 (예를 들어: WO 97/09433의 10 페이지; 문헌[Lehninger, Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990] 참조).
용어 "작제물"은 재조합 핵산 분자를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 작제물은 벡터 (예를 들어, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터)에 존재할 수 있거나 또는 게놈에 통합될 수 있다. "벡터"는 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비-염색체, 반-합성 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 예시적인 벡터는 그들이 연결된 핵산 분자(발현 벡터)의 자율적 복제 (에피솜 벡터) 또는 발현을 가능하게 하는 것이다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토-믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스 (예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (예를 들어, 홍역 및 센다이 (Sendai)), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중-가닥 DNA 바이러스 (아데노바이러스, 헤르페스 (예를 들어, 단순포진 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아, 계두 및 카나리아두창)를 포함)를 포함한다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D 형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다 (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
본원에서 사용되는 "렌티바이러스 벡터"는 통합 또는 비통합일 수 있고, 상대적으로 거대한 패키징 능력을 가지며, 다양한 상이한 세포 유형을 형질도입할 수 있는, 유전자 전달을 위한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 보통 셋 (패키징, 외피 및 전달) 이상의 플라스미드의 생산자 세포 내로의 일시적 형질감염 후에 생성된다. HIV와 같이, 렌티바이러스 벡터는 세포 표면 상에서 수용체와 바이러스 표면 당단백질의 상호작용을 통해 표적 세포에 유입된다. 유입 시, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사 산물은 감염 세포의 DNA 내로의 바이러스 통합을 위한 기질인, 이중 가닥 선형 바이러스 DNA이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서의 2 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 해당 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 암호화 서열과 작동 가능하게 연결된다 (즉, 암호화 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). "연결되지 않은"은 회합된 유전자 요소가 서로 가깝게 회합되지 않고 하나의 기능은 다른 것에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는, "발현 벡터"는 적합한 숙주에서 핵산 분자의 발현을 달성할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 지칭한다. 이러한 제어 서열은 전사를 달성하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 선택적 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제하고 작용할 수 있거나, 또는 일부 예에서, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 종종 상호 호환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 핵산 분자, 예컨대 유전자의 암호화 서열에 기반하여 폴리펩티드가 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 전사, 전사후 제어, 전사후 변형, 번역, 번역후 제어, 번역후 변형 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
세포내에 핵산 분자를 삽입하는 것과 관련하여 용어 "도입된"은 "형질감염", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하며, 진핵 또는 원핵 세포 내로 핵산 분자의 혼입에 대한 언급을 포함하되, 핵산 분자는 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 혼입되거나, 자율 복제로 전환되거나 또는 일시적으로 발현될 수 있다 (예를 들어, 형질감염된 mRNA).
본원에서 사용되는 "이종성" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 숙주 세포에 천연이 아니지만, 숙주 세포로부터의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부에 대해 상동성일 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부를 지칭한다. 이종 핵산 분자, 작제물 또는 서열의 공급원은 상이한 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예에서, 이종 핵산 분자는, 예를 들어, 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공법 등에 의해 숙주 세포 또는 숙주 게놈에 첨가되며 (즉, 내인성 또는 천연이 아님), 이때 첨가된 분자는 숙주 게놈에 통합될 수 있거나 또는 염색체외 유전자 물질로서 (예를 들어, 플라스미드 또는 자기-복제 벡터의 다른 형태로서) 존재할 수 있고, 다중 복제물에 존재할 수 있다. 추가로, "이종성"은, 숙주 세포가 상동성 단백질 또는 활성을 암호화한다고 해도, 숙주 세포 내로 도입되는 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 비천연 효소, 단백질 또는 다른 활성을 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같은, 복수의 이종 핵산 분자는 별개의 핵산 분자로서, 복수의 개별 제어된 유전자로서, 다시스트론성 (polycistronic) 핵산 분자로서, 융합 단백질을 암호화하는 단일 핵산 분자로서 또는 이들의 임의 조합으로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은, 숙주 세포는 BRAFV600E 항원 펩티드 (예를 들어, TCRα 및 TCRβ)에 특이적인 원하는 결합 단백질을 암호화하는 2 이상의 이종 핵산 분자를 발현하도록 변형될 수 있다. 2 이상의 이종 핵산 분자가 숙주 세포에 도입될 때, 2 이상의 이종 핵산 분자가 단일 핵산 분자로서 (예를 들어, 단일 벡터 상에서) 도입될 수 있거나, 별개의 벡터 상에서 단일 부위 또는 다중 부위에서 숙주 염색체에 통합될 수 있거나, 또는 이들의 임의 조합인 것이 이해된다. 언급된 이종 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성은 암호화 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성의 수 (숙주 세포에 도입된 별개의 핵산 분자의 수는 아님)를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "내인성" 또는 "천연"은 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질 또는 활성을 지칭한다. 게다가, 모 유전자, 단백질 또는 활성에 비해 돌연변이되거나, 과발현되거나, 셔플링되거나, 중복되거나 또는 달리 변경된 유전자, 단백질 또는 활성은 해당 특정 숙주 세포에 대해 내인성 또는 천연인 것으로 여전히 고려된다. 예를 들어, 제1 유전자로부터의 내인성 제어 서열 (예를 들어, 프로모터, 번역 감쇠 서열)은 제2 천연 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 변경시키거나 또는 조절하기 위해 사용될 수 있되, 제2 천연 유전자 또는 핵산 분자의 발현 또는 조절은 모 세포에서의 정상 발현 또는 조절과 상이하다.
용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 또는 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드는 천연 숙주 세포 유전자에 대해 상동성일 수 있고, 선택적으로 변경된 발현 수준, 상이한 서열, 변경된 활성 또는 이들의 임의 조합을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "서열 동일성"은, 필요하다면, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 다른 참조 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 하나의 서열 내 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 서열 동일성 값의 백분율은 문헌[Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에서 정의된 바와 같은 NCBI BLAST2.0 소프트웨어를 이용하여 생성될 수 있으며, 매개변수는 디폴트 값으로 설정한다.
본원에서 사용되는 "조혈 전구 세포"는 조혈 줄기 세포 또는 태아 조직으로부터 유래될 수 있고, 성숙 세포 유형 (예를 들어, 면역계 세포)으로 추가로 분화될 수 있는 세포이다. 예시적인 조혈 전구체 세포는 CD24Lo Lin- CD117+ 표현형 또는 흉선에서 발견되는 것을 갖는 것 (전구체 흉선세포로서 지칭됨)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주"는 관심 대상의 폴리펩티드 (예를 들어, 항-BRAFV600E TCR)를 생산하기 위해 이종 핵산 분자로 유전자 변형에 대해 표적화된 세포 (예를 들어, T 세포) 또는 미생물을 지칭한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 임의로 예를 들어 이종 단백질의 생합성과 관련되거나 관련없는 목적하는 특성을 부여하는 다른 유전자 변형 (예를 들어, 검출 가능한 마커; 결실, 변경 또는 절단된 내인성 TCR; 또는 증가된 공자극 인자 발현의 포함)을 이미 갖거나 또는 이들을 포함하도록 변형될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 BRAFV600E 항원 펩티드에 특이적인 TCRα 쇄를 암호화하는 이종 핵산 분자로 형질도입된 인간 조혈 전구체 세포이다.
본원에서 사용되는, "과증식성 장애"는 정상 또는 병에 걸지 않은 세포에 비해 과도한 성장 또는 증식을 지칭한다. 예시적인 과증식성 장애는 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전암성 세포뿐만 아니라 비-신생물 또는 비악성종양 과증식성 장애 (예를 들어, 선종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 혈관종, 섬유증, 재협착증뿐만 아니라 자가면역질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 염증성 장 질환 등)를 포함한다.
BRAF V600E 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 결합 단백질
BRAF (B-RAF1, BRAF1, NS7, RAFB1, B-Raf, B-Raf 원발암 유전자 및 세린/트레오닌 키나제로도 알려져 있음)는 BRAF 유전자에 의해 암호화된 766-아미노산 단백질을 지칭한다. 인간 야생형 BRAF에 대한 전사 서열은 NCBI 참조 식별자 NM_004333.4 (서열 번호 78)에서 제시되고, 단백질 서열은 NCBI 참조 식별자 NP_004324.2 (서열 번호 36)에서 제시된다. BRAF는 성장 신호 전달 단백질 키나제의 Raf 키나제 패밀리의 구성원이며, 세포 분열, 분화 및 분비에 영향을 미치는 MAP 키나제/ERK 신호 전달 경로를 조절하는 역할을 한다. 구조적 측면에서, BRAF는 Raf 키나제의 특징적인 3개의 보존된 도메인: Ras-GTP-결합 자기-조절 도메인; 세린이 풍부한 힌지 영역; 및 단백질 기질에서 공통 서열을 인산화하는 촉매 키나제 도메인 (각각 CR1, CR2 및 CR3)으로 구성된다. 활성 B-Raf는 이량체를 형성한다.
V600E 돌연변이 (BRAFV600E)를 포함하는 돌연변이 형태의 BRAF 키나제는 흑색종 사례의 40%, 결장직장암 사례의 10% 및 비소세포 폐암 사례의 1%를 포함하여 수많은 신생물 상태에 존재하는 발암성 유발자이고, 종양 세포 성장 및 생존을 촉진하는 구성적 신호 전달을 제공한다. 소분자 BRAF 억제제는 흑색종에서 약간의 효능을 갖지만, BRAFV600E 단백질의 발현 손실없이 대안적인 신호 전달 경로를 동원함으로써 내성이 진화한다. Shi et al., Cancer Disc. 4(1):80 (2014) 참조.
특정 측면에서, 본 개시는 (a) 서열 번호 29 내지 32 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 최대 5개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 서열 번호 29 내지 32 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) α 쇄 가변 (Vα) 도메인, 및 TCR β 쇄 가변 (Vβ) 도메인; (b) 서열 번호 33 내지 35 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 최대 5개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 서열 번호 33 내지 35 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 Vα 도메인 및 Vβ 도메인; 또는 (c) (a)의 Vα 도메인 및 (b)의 Vβ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 제공하고, 여기서, 결합 단백질은 BRAFV600E 돌연변이를 함유하는 BRAF 펩티드를 포함하는 세포 표면상의 HLA 복합체에 특이적으로 결합할 수 있고, BRAFV600E 돌연변이를 함유하지 않는 BRAF 펩티드를 포함하는 세포 표면상의 HLA 복합체에 결합하지 않는다. 특정 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQ를 포함한다.
특정 구체예에서, (a) Vα 도메인은 서열 번호 29의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (b) Vα 도메인은 서열 번호 30의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (c) Vα 도메인은 서열 번호 31의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (d) Vα 도메인은 서열 번호 32의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (e) Vα 도메인 서열 번호 29의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (f) Vα 도메인은 서열 번호 29의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (g) Vα 도메인은 서열 번호 30의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (h) Vα 도메인은 서열 번호 30의 CDR3 아미노산을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (i) Vα 도메인은 서열 번호 31의 CDR3 아미노산을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (j) Vα 도메인은 서열 번호 31의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, (k) Vα 도메인은 서열 번호 32의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (l) Vα 도메인은 서열 32의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
펩티드-MHC 복합체, 예컨대 BRAFV600E펩티드:HLA 복합체는 Vα 및 Vβ 도메인을 통해 TCR에 의해 인식되고 결합된다. 림프구 발생 동안, Vα 엑손은 상이한 가변 및 결합 유전자 세그먼트 (V-J)로부터 조립되고, Vβ 엑손은 상이한 가변, 다양성 및 결합 유전자 세그먼트 (V-D-J)로부터 조립된다. TCRα 염색체 좌는 70 내지 80개의 가변 유전자 세그먼트 및 61개의 결합 유전자 세그먼트를 가진다. TCRβ 염색체 좌는 52개의 가변 유전자 세그먼트, 및 6 또는 7개의 결합 유전자 세그먼트와 함께 단일 다양성 유전자 세그먼트를 각각 함유하는 2개의 별개의 클러스터를 가진다. 기능성 Vα 및 Vβ 유전자 엑손은 Vα에 대해 결합 유전자 세그먼트를 갖는 가변 유전자 세그먼트, 및 Vβ에 대해 다양성 유전자 세그먼트 및 결합 유전자 세그먼트를 갖는 가변 유전자 세그먼트의 재조합에 의해 생성된다.
Vα 및 Vβ 도메인은 각각 펩티드-MHC 복합체와 접촉되는 상보성 결정 영역 (CDR)으로서도 지칭되는 3개의 초가변 루프를 포함한다. CDR1 및 CDR2는 가변 유전자 세그먼트 내에서 암호화되는 반면, CDR3은 Vα에 대해 가변 및 결합 세그먼트에 걸쳐있는 영역, 또는 Vβ에 대해 가변, 다양성 및 결합 세그먼트에 걸쳐있는 영역에 의해 암호화된다. CDR1 및 CDR2와 비교하여, CDR3은 재조합 과정 동안 뉴클레오티드의 첨가 및 손실로 인해 훨씬 더 다양하다.
TCR 가변 도메인 서열은 넘버링 체계 (Kabat, Chothia, Enhanced Chothia 및 Aho)에 대해 정렬되어, ANARCI 소프트웨어 툴 (2016, Bioinformatics 15:298-300)을 사용하여 동등한 잔기 위치가 주석이 달리고 상이한 분자가 비교되도록 할 수 있다. 넘버링 체계는 TCR 가변 도메인에서 프레임워크 영역 및 CDR에서 표준화된 묘사를 제공한다.
따라서, CDR1 및 CDR2 서열은 상응하는 가변 유전자 세그먼트 (예를 들어, TCRBV28-01, TCRAV21-01, TCRAV26-01, TCRAV12-02 대립유전자)로부터 추론될 수 있다. 특정 구체예에서, (a) Vα CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, Vα 도메인은 서열 번호 11에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 CDR1 아미노산 서열 및 CDR2 아미노산 서열을 추가로 포함하거나, (b) Vα CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, Vα 도메인은 서열 번호 12에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 CDR1 아미노산 서열 및 CDR2 아미노산 서열을 추가로 포함하거나, (c) Vα CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, Vα 도메인은 서열 번호 13에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 CDR1 아미노산 서열 및 CDR2 아미노산 서열을 추가로 포함하거나, 또는 (d) Vα CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, Vα 도메인은 서열 번호 13에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 CDR1 아미노산 서열 및 CDR2 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, Vβ CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 33 내지 35 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 8에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 CDR1 아미노산 서열 및 CDR2 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
TCR Vα 및 Vβ 도메인의 결합 쌍을 확인하는 방법은 예를 들어 PCT 특허 공개 번호 WO 2016/161273; Redmond et al., 2016, Genome Med. 8: 80; Munson et al., 2016, Proc. Natl. Acad. Sci. 113:8272-7; Kim et al., 2012, PLoS ONE 7:e37338 (각각의 방법은 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 BRAFV600E-특이적 Vβ 도메인 (예를 들어, 서열 33 내지 35 중 어느 하나에 기재된 CDR3을 포함하는 Vβ 도메인)에 대한 Vα 도메인이 확인될 수 있고, 그 반대도 확인될 수 있다.
본원에 기재된 BRAFV600E-특이적 결합 단백질은 자연 발생 결합 단백질 (예를 들어, TCR)에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 보유할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 공지되어 있고, 자연적으로 발생하거나 결합 단백질 또는 TCR이 재조합적으로 생성될 때 도입될 수 있다. 아미노산 치환, 결실 및 삽입은 돌연변이 유발 방법을 사용하여 단백질에 도입될 수 있다 (예를 들어, Sambrook et　al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001 참조). 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적 (또는 세그먼트-특이적) 돌연변이 유발 절차는 원하는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변형된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발, 오류가 발생하기 쉬운 중합효소 연쇄 반응 돌연변이 유발, 및 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발과 같은 무작위 또는 포화 돌연변이 유발 기술을 사용하여 면역원 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 (Sambrook et al., 참조).
관련 기술 분야에 공지된 다양한 기준은 펩티드 또는 폴리펩티드의 특정 위치에서 치환된 아미노산이 보존적 (또는 유사한)인지를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 아미노산은 하기 카테고리에 포함될 수 있다: 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산); 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판). 분류하기가 다소 어려운 것으로 생각되는 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 류신, 발린, 이소류신 및 알라닌)과 특성을 공유한다. 특정 상황에서, 글루타민산의 글루타민 치환 또는 아스파르트산의 아스파라긴 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 간주될 수 있다. 당 업계에서 이해되는 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 보존된 아미노산 대체물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 (예를 들어, GENEWORKS, Align, BLAST 알고리즘 또는 본원에 기술되고 당 업계에서 실시되는 다른 알고리즘을 사용하여) 결정된다.
따라서, 특정 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 약 99.9% 동일한) Vα 도메인을 포함하고, 서열 번호 5 내지 7 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 약 99.9% 동일한) Vβ 도메인을 포함하되, (a) CDR 중 적어도 셋 또는 넷은 돌연변이가 없고, (b) 돌연변이가 있는 CDR은 최대 3개의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 이의 조합을 갖는다. 특정 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구체예에서, Vβ 도메인은 서열 5 내지 7 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인은 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인은 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 구체예에서, BRAFV600E-특이적 결합 단백질은 TCR, TCR의 항원-결합 단편 또는 키메라 항원 수용체이다. "키메라 항원 수용체" (CAR로도 불림)는 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인 (임의로 공동-자극 도메인(들)을 함유함)에 연결된 항원 결합 도메인 (예를 들어, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예컨대 암 항원에 특이적인 항체 또는 TCR에서 유래된 scFv로부터 수득 또는 유래되거나, 또는 NK 세포로부터의 살해 면역수용체로부터 수득 또는 유래된 항원-결합 도메인)을 포함하는 융합 단백질이다 (예를 들어, Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4): 388-398, 2013; see also Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3): 220-230, 2016; Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163-1176,2014 참조). 특정 구체예에서, 결합 단백질은 BRAFV600E-특이적 TCR 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다 (예를 들어, Walseng et al., Scientific Reports 7:10713, 2017 참조; 그의 TCR CAR 작제물 및 방법에 대한 전체가 본원에 참조로 포함됨). CAR의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,410,319호; 미국 특허 제7,446,191호; 미국 특허 공개 제2010/065818호; 미국 특허 제8,822,647호; PCT 공개 제WO 2014/031687호; 미국 특허 제7,514,537호; 및 Brentjens et al., Clin. Cancer Res. 13:5426, 2007 참조).
특정 구체예에서, TCR의 항원-결합 단편은 단일쇄 TCR (scTCR)을 포함하며, 이는 TCR Vα 및 Vβ 도메인 TCR 둘 다를 포함하지만 단일 TCR 불변 도메인 (Cα 또는 Cβ)만을 포함한다. 특정 구체예에서, TCR의 항원-결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체는 키메라 (예를 들어, 복수의 공여체 또는 종으로부터의 아미노산 잔기 또는 모티프를 포함)이며, 인간화 (예를 들어, 인간에서 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 변경되거나 치환된 비인간 유기체로부터의 잔기를 포함함)이거나, 인간이다. 본 개시에 따른 결합 단백질, 예를 들어, TCR은 TCR 불변 도메인, 예를 들어 Vα 도메인, Vβ 도메인 또는 둘 다의 C-말단에 연결된 TCR 불변 도메인을 추가로 포함할 수 있다. TCR β-쇄 불변 도메인은 TRBC1 유전자 또는 TRBC2 유전자에 의해 암호화될 수 있고, TCRα-쇄는 TRAC 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 특정 구체예에서, TCR은 서열 번호 25에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 약 99.9%) 서열 동일성을 가지는 α쇄 불변 (Cα) 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, Cα 도메인은 서열 번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, TCR은 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 약 99.9%) 서열 동일성을 가지는 β 쇄 (Cβ) 불변 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, Cβ 도메인은 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 결합 단백질은 서열 번호 55 내지 58 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 α-쇄 (Vα 도메인 및 Cα 도메인으로 구성됨)를 포함한다. 특정 구체예에서, 결합 단백질은 서열 번호 59 내지 61 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 β-쇄 (Vβ 도메인 및 Cβ 도메인으로 구성됨)를 포함한다.
예로서 재조합적으로 생산된 가용성 결합 단백질 (예를 들어, TCR)을 단리시키고 정제하는 데 유용한 방법은 재조합 가용성 TCR을 배양 배지에 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터로부터 상등액을 얻는 단계 및 이어서 상업적으로 입수 가능한 필터를 이용하여 배지를 농축시키는 단계를 포함할 수 있다. 농축 후에, 농축물은 단일의 적합한 정제 기질에 또는 일련의 적합한 기질, 예컨대 친화도 기질 또는 이온 교환 수지에 적용될 수 있다. 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해 사용될 수 있다. 이들 정제 방법은 또한 면역원을 그의 천연 환경으로부터 단리시킬 때 사용될 수 있다. 본원에 기재된 단리된/재조합 가용성 TCR 중 하나 이상의 대규모 생산 방법은 회분식 세포 배양 (batch cell culture)을 포함하는데, 이는 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링되고 수집된다. 가용성 TCR의 정제는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 국내 및 외국 규제기관의 법 및 가이드라인을 따른다.
특정 구체예에서, BRAFV600E 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 결합 단백질 (예를 들어, TCR)을 암호화하는 핵산 분자는 입양 전달 요법에서 사용하기 위해 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)를 형질감염/형질도입하기 위해 사용된다. TCR 서열분석의 진보가 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌[Robins et al., Blood 114:4099, 2009; Robins et al., Sci. Translat. Med. 2:47ra64, 2010; Robins et al., (Sept. 10) J. Imm. Meth. Epub ahead of print, 2011; Warren et al., Genome Res. 21:790, 2011]) 본 개시에 따른 구체예를 실행하는 과정에서 사용될 수 있다. 유사하게, T 세포에 목적하는 핵산을 형질감염/형질도입하기 위한 방법은, HLA 수용체와 복합체화된 BRAFV600E 펩티드 항원에 특이적인 TCR로 지향된 것을 비롯하여, 본원의 교시에 기반하여, 본 명세서에 개시된 구체예에 대한 이들 방법의 적용이 고려되도록, 목적하는 항원-특이성의 T 세포를 이용하는 입양 전달 절차를 갖는 것으로 (예를 들어, 문헌[Schmitt et al., Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 17:742, 2009; Till et al., Blood 112:2261, 2008; Wang et al., Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007; US　2011/0243972; US 2011/0189141; Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007]) 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0087025호).
본원에 기재된 바와 같은 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 또는 도메인은 T　세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하고 또한 항원-특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함하는, T 세포 활성을 검정하기 위한 임의의 다수의 당업계에 허용되는 방법에 따라 기능적으로 특성규명될 수 있다. 예는 T 세포 증식, T 세포 사이토카인 방출, 항원-특이적 T 세포 자극, MHC 제한된 T　세포 자극, CTL 활성 (예를 들어, 사전 부하된 표적 세포로부터 51Cr 방출을 검출함으로써), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 T-세포 기능의 다른 측정의 결정을 포함한다. 이들 및 유사한 검정을 수행하는 절차는, 예를 들어, 문헌[Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)]에서 찾을 수 있다. 또한 문헌[Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.
"MHC-펩티드 사량체 염색"은 적어도 하나의 항원 (예를 들어, BRAFV600E)에 동족인 (예를 들어, 이와 동일하거나 또는 관련된) 아미노산 서열을 갖는 동일한 펩티드를 각각 포함하는 MHC 분자의 사량체를 특징으로 하는 항원-특이적 T 세포를 검출하기 위해 사용되는 검정을 지칭하되, 복합체는 동족 항원에 특이적인 T 세포 수용체에 결합할 수 있다. 각각의 MHC 분자는 비오틴 분자로 태그될 수 있다. 비오티닐화된 MHC/펩티드는 형광적으로 표지될 수 있는 스트렙타비딘의 첨가에 의해 사량체화된다. 사량체는 형광 표지를 통해 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다. 특정 구체예에서, MHC-펩티드 사량체 검정은 본 개시의 향상된 친화도 TCR을 검출하거나 또는 선택하기 위해 사용된다.
사이토카인 수준은, 예를 들어, ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 및 유세포 분석 및 이들의 조합 (예를 들어, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 포함하여 본 명세서에 기재되고 당업계에서 실행되는 방법에 따라 결정될 수 있다. 면역 반응의 항원-특이적 유발 또는 자극으로부터 초래되는 면역 세포 증식 및 클론 확장은 림프구를 단리시키는 것, 예컨대 말초 혈액 세포 또는 림프절로부터의 세포의 샘플에서 림프구를 순환시키는 것, 항원으로 세포를 자극하는 것 및 사이토카인 생산, 세포 증식 및/또는 세포 생존도를, 예컨대 삼중수소 티미딘의 혼입 또는 비방사성 분석, 예컨대 MTT 분석 등에 의해 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다. Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 사이의 균형에 대한 본원에 기재된 면역원의 효과는, 예를 들어, Th1 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-12, IL-2 및 TNF-β 및 2형 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13 수준을 결정함으로써 조사할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 개시는 본 개시에 따른 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 인간 또는 다른 비인간 포유동물 대상에 투여하기에 적합한 생물학적으로 적합한 비히클, 예를 들어 생리 식염수이며 본원에 보다 상세히 설명된다.
면역 세포 (예를 들어, 수지상 세포, 식세포 및 B 세포)에 의한 항원 제시는 세포 상에 존재하는 HLA 복합체에 의해 부분적으로 결정된다. 이론에 구애없이, 상이한 HLA 대립유전자에 의해 암호화된 HLA 단백질은 특정 항원 펩티드를 제시하고 면역 세포 단백질 (예를 들어, TCR)과 상호작용하는 능력이 다양할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 주어진 항원 펩티드는 HLA-DR 복합체가 아닌 HLA-DQ 복합체에 의해 제시될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 특정 구체예에서, 본 개시에 따른 결합 단백질은 HLA-DQ와 복합체화된 BRAFV600E 펩티드를 인식할 수 있다. 특정 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQB1*0301, *0302, 또는 *0303을 포함한다. 특정 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQB1*0302를 포함한다. 추가의 구체예에서, HLA 복합체는 HLA-DQA1*03을 포함한다.
본 개시에 따른 결합 단백질에 의해 표적화된 펩티드 항원은 또한 예를 들어 항원을 제시하는 HLA 분자의 유형에 따라 크기가 변할 수 있다. 일반적으로, HLA 클래스 I 복합체는 약 8 내지 10개 아미노산 길이의 펩티드를 제공하는 반면, HLA 클래스 II 복합체는 약 15 내지 24개 아미노산 길이의 펩티드를 제시하지만, 펩티드는 이들 일반적인 길이보다 짧거나 길 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질에 특이적으로 결합된 BRAFV600E 펩티드는 약 7 내지 약 27개 아미노산, 약 10 내지 약 25개 아미노산, 또는 약 12 내지 약 20개 아미노산, 또는 약 15 내지 약 19개 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, BRAFV600E 펩티드는 서열 번호 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
BRAF V600E 특이적 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 관련 벡터
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 결합 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터가 제공된다. 관심있는 BRAFV600E 펩티드에 특이적인 결합 단백질 또는 TCR을 유전자 조작하고 생성하는데 사용되는 발현 벡터의 작제는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 분자 생물학 공학 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다. 효율적인 전사 및 번역을 위해, 각각의 재조합 발현 작제물에서의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 적절한 발현 제어 서열 (또한 조절 서열로 불림), 예컨대 리더 서열 및 특히 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 (즉, 작동적으로) 연결된 프로모터를 포함한다.
특정 구체예는 본원에 제공된 결합 단백질, 예컨대 BRAFV600E 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 결합 단백질 (예를 들어, TCR 또는 CAR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 핵산은 임의 형태의 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, cDNA 또는 RNA일 수 있으며, 안티센스 DNA, cDNA 및 RNA를 포함하여 서로 상보적인 핵산의 양성 및 음성 가닥을 포함할 수 있다. 또한 siRNA, 마이크로 RNA, RNA-DNA 하이브리드, 리보자임 및 기타 다양한 천연 또는 합성 형태의 DNA 또는 RNA가 포함된다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 변할 수 있고 (즉, 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함함), 예를 들어 유전자 코드의 변성으로 인해 동일한 아미노산 또는 폴리펩티드를 여전히 코딩한다는 것이 이해될 것이다. 특정 구체예에서, 예를 들어 결합 단백질 또는 이의 일부, 자기 절단 펩티드, 링커 펩티드를 인코딩하는 폴리 뉴클레오티드; 또는 결합 단백질-암호화 작제물은 서열 번호 8 내지 24; 27; 28; 44 내지 48; 62 내지 68; 및 73 내지 77 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% (예를 들어, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 약 99.9%) 동일성을 가질 수 있다.
임의의 상기 언급된 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 표적 숙주 세포에서 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화된다.
특정 구체예는 벡터에 함유된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 벡터는 그것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있거나 숙주 유기체에서 복제가 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 벡터의 일부 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 등을 포함한다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있는 반면 (예를 들어 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터), 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 숙주 세포 내로 도입 시 폴리뉴클레오티드 삽입체의 통합을 촉진함으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터). 또한, 일부 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다 (이 벡터는 "발현 벡터"로 지칭될 수 있다). 관련 구체예에 따르면, 하나 이상의 작용제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 BRAFV600E에 특이적인 결합 단백질 또는 재조합 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변이체)가 대상에게 공동 투여되는 경우, 각각의 작용제가 별개 또는 동일한 벡터에 존재할 수 있고, 다수의 벡터 (각각 상이한 작용제 또는 동일한 작용제를 함유함)가 세포 또는 세포 집단에 도입될 수 있거나 대상에게 투여될 수 있음이 추가로 이해된다.
특정 구체예에서, BRAFV600E 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 벡터의 특정 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열이 결찰된 암호화 서열의 발현 및 처리를 달성하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열은 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역을 효율적으로 향상시키는 서열 (즉, 코작 (Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 가능하게는 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은, 관심 유전자 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스에서 또는 일정 거리에서 작용하는 발현 제어 서열과 인접한 경우 작동 가능하게 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터인 발현 벡터에 함유된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 전달할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 추가의 구체예에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의 조합이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포이다. 특정 구체예에서, T 세포는 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합이다.
본원의 임의의 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터이다.
숙주 세포
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 결합 단백질을 그의 세포 표면에서 발현한다 (즉, 본 개시에 따른 결합 단백질을 발현한다). 특정 구체예에서, 발현 벡터는 적절한 세포, 예를 들어 T 세포 또는 항원-제시 세포, 즉 그의 세포 표면 상에 펩티드/MHC 복합체를 나타내는 세포 (예를 들어, 수지상 세포)로 전달된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포)는 CD8 공동 수용체 또는 CD4 공동 수용체가 없고 암호화된 결합 단백질은 CD4 또는 CD8 공동 수용체 부재에서 BRAFV600E 항원:HLA 복합체에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 예를 들어, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의 조합이다. 일부 구체예에서, 암호화된 결합 단백질은 MHCII-제한 TCR 결합 도메인을 포함하고 숙주 세포 (예를 들어, CD8+ T 세포)는 이종 CD4+ 공동 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 구체예에서, T 세포가 숙주인 경우, T 세포는 나이브, 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 특정 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 둘 다이다. 숙주 세포 내로 도입된 발현 벡터는 또한 예를 들어 림프 조직 특이적 전사 조절 요소 (TRE), 예컨대 B 림프구, T 림프구 또는 수지상 세포 특이적 TRE를 포함할 수 있다. 림프 조직 특이적 TRE는 당 업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12:1043, 1992); Todd et al., J. Exp. Med. 177:1663, 1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483, 1993 참조).
숙주 세포는 벡터를 수용할 수 있거나 핵산이 도입되었거나 단백질을 발현할 수 있는 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 유 전적으로 또는 표현형으로 동일하거나 다른 숙주 세포의 자손을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 의존할 수 있고 포유동물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 원숭이 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 이들 세포는 바이러스 벡터, 인산칼슘 침전을 통한 형질전환, DEAE-덱스트란, 전기 천공법, 미세주입법 또는 다른 방법을 사용하여 벡터 또는 다른 물질을 포함하도록 유도될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 참조.
따라서, 일 측면에서, 본 개시에 따른 이종 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 숙주 세포는 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 결합 단백질을 그의 세포 표면에서 발현시킨다. 특정 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 18 내지 21 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일하다. 특정 구체예에서, Vβ 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드의 일부는 서열 번호 22 내지 24 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일하다.
특정 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 18 내지 21 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구체예에서, Vβ 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 일부는 서열 번호 22 내지 24 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 18 내지 21 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, Vβ 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 일부는 서열 번호 22 내지 24 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분은 TCR α 쇄 불변 도메인을 암호화하는 부분에 연결되며, 여기서 α 쇄 불변 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 27에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vβ 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분은 TCR β 쇄 불변 도메인을 암호화하는 부분에 연결되며, 여기서 β 쇄 불변 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 28에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 18을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 22를 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 19를 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 23을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 20을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 23을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, Vα 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 21을 포함하거나 이로 이루어지고 Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 24를 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)는 BRAFV600E-함유 항원을 제시하거나 발현하는 항원-제시 세포와 공동 배양되는 경우 인터페론을 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 생성된 인터페론은 인터페론-감마 (IFN-γ)를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 BRAFV600E-함유 항원을 포함하거나 이로 이루어진, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄싱되었다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 BRAFV600E-함유 항원을 포함하거나 이로 이루어진, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA, cDNA 또는 mRNA)로 형질감염되었다. 특정 구체예에서, 본 개시의 숙주 세포는 약 0.005 μg/mL 내지 약 10 μg/mL 항원의 농도로 BRAFV600E-함유 항원으로 펄싱된 항원-제시 세포와 함께 배양되는 경우 IFN-γ를 생성한다. 추가의 구체예에서, 숙주 세포는 적어도 약 0.1 μg/mL 항원의 농도에서 BRAFV600E-함유 항원으로 펄싱된 항원-제시 세포와 함께 배양되는 경우 적어도 약 1,000 pg/mL의 IFN-γ를 생성한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 μg/mL 항원의 농도로 BRAFV600E-함유 항원으로 펄싱된 항원-제시 세포와 함께 배양되는 경우 적어도 약 1,000 pg/mL의 IFN-γ를 생성한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 약 0.5 μg/mL 항원 내지 약 10 μg/mL 항원의 농도로 BRAFV600E-함유 항원으로 펄싱된 항원 제시 세포와 함께 배양되는 경우 약 1,000 pg/mL 내지 약 10,000 pg/mL의 IFN-γ를 생성한다. 일부 구체예에서, 표적 세포는 B 세포를 포함한다. 추가의 구체예에서, B 세포는 HLA-DQ 대립유전자를 발현한다. 또 다른 구체예에서, B 세포는 B-LCL 라인 1331이다.
특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 일부는 자기 절단 펩티드를 암호화하고 TCR α 쇄-암호화 부분과 TCR β 쇄-암호화 부분 사이에 배치된다. 단일 벡터에 의한 분리 가능한 폴리펩티드의 발현에 유용한 자기 절단 펩티드는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 돼지 테스코바이러스-1 2A (P2A) 펩티드, 토세아아시그나 바이러스 2A (T2A) 펩티드, 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 2A (E2A) 펩티드, 및 구제역 바이러스 2A (F2A) 펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예에서, 자기 절단 펩티드를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 일부는 서열 번호 44 내지 48 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 구체예에서, 암호화된 자기 절단 펩티드는 서열 번호 49 내지 52 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4 -CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 또는 이들의 임의 조합이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 T 세포이다. 특정 구체예에서, T 세포는 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합이다. 추가의 구체예에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다.
특정 구체예에서, T 세포에 의해 발현된 결합 단백질 또는 TCR은 내인성 TCR과 비교하여 CD3 단백질, CD4 단백질 또는 둘 모두와 보다 효율적으로 회합할 수 있다. 특정 구체예에서, 결합 단백질 또는 TCR은 내인성 TCR과 비교하여 T 세포에서 더 높은 표면 발현을 가진다.
임의의 상기 구체예에서, BRAFV600E-특이적 결합 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, TIGIT, HLA 분자, TCR 분자 또는 이들의 임의의 성분 또는 조합으로부터 선택된 폴리펩티드 산물을 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 면역 세포이다. 이론에 구애없이, 특정 내인성 발현된 면역 세포 단백질은 변형된 면역 숙주 세포 (예를 들어, PD-1, LAG-3, CTLA4, TIGIT)의 면역 활성을 하향 조절할 수 있거나 또는 숙주 세포에 의한 발현, TCR 복합체 성분 (예를 들어, CD3 단백질)과의 회합에 대해 본 개시의 이종 결합 단백질과 경쟁할 수 있거나, 또는 본 개시의 이종적으로 발현된 결합 단백질 (예를 들어, 비-BRAFV600E 항원 또는 비-BRAFV600E 항원:HLA 복합체에 결합하고, BRAFV600E 항원에 대한 본 개시의 결합 단백질의 결합을 방해하는 내인성 TCR)의 결합 활성을 방해할 수 있거나, BRAFV600E 항원을 발현하는 표적 세포에 결합하는 면역 숙주 세포를 방해할 수 있거나, 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 또한, 세포 전달 요법에 사용되는 공여체 면역 세포 상에서 발현된 내인성 단백질 (예를 들어, HLA와 같은 면역 숙주 세포 단백질)은 동종이계 수용자에 의해 외래로 인식될 수 있으며, 이는 동종이계 수용자에 의한 공여체 면역 세포의 제거 또는 억제를 야기할 수 있다.
따라서, 이러한 내인성 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 감소 또는 제거는 자가 또는 동종이계 숙주 환경에서 숙주 세포의 활성, 내성 및 지속성을 개선시킬 수 있고, 세포의 보편적 투여 (예를 들어, HLA 유형에 무관하게 임의의 수용자에게)를 가능하게 한다. 특정 구체예에서, 변형된 숙주 면역 세포는 공여체 세포 (예를 들어, 동종이계) 또는 자가 세포이다. 특정 구체예에서, 본 개시의 변형된 면역 숙주 세포는 PD-1, LAG-3, CTLA4, TIM3, HLA 성분 (예를 들어, α1 마크로글로불린, α2 마크로글로불린, α3 마크로글로불린, β1 마이크로글로불린 또는 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 유전자), 또는 TCR 성분 (예를 들어, TCR 가변 영역 또는 TCR 불변 영역을 암호화하는 유전자)을 암호화하는 유전자 중 하나 이상의 염색체 유전자 녹아웃을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Torikai et al., Nature Sci. Rep. 6:21757 (2016); Torikai et al., Blood 119(24):5697 (2012); 및 Torikai et al., Blood 122(8):1341 (2013) 참조], 이의 유전자 편집 기법, 조성물 및 입양 세포 요법은 본원에 그 전체가 참조로 포함됨; 예를 들어 서열 번호 142-149). 본원에서 사용되는 용어 "염색체 유전자 녹아웃 (knockout)"은 기능적으로 활성인 내인성 폴리펩티드 산물의 숙주 세포에 의해 생산을 방지하는 숙주 세포의 유전자 변경을 지칭한다. 염색체 유전자 녹아웃을 초래하는 변경은, 예를 들어, 도입된 넌센스 돌연변이 (조숙 정지 코돈의 형성을 포함), 미스센스 돌연변이, 유전자 결실 및 가닥 파손뿐만 아니라 숙주 세포에서 내인성 유전자 발현을 억제하는 억제 핵산 분자의 이종 발현을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃 또는 유전자 녹인은 숙주 세포의 염색체 편집에 의해 생성된다. 염색체 편집은, 예를 들어, 엔도뉴클레아제를 이용하여 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 "엔도뉴클레아제"는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 표적화된 유전자를 절단할 수 있고, 이에 의해 표적화된 유전자를 비활성화 또는 "녹아웃"할 수 있다. 엔도뉴클레아제는 천연 유래, 재조합, 유전자 변형 또는 융합 엔도뉴클레아제일 수 있다. 엔도뉴클레아제에 의해 야기되는 핵산 가닥 파손은 상동성 재조합 또는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)의 별개의 메커니즘을 통해 통상적으로 수선된다. 상동성 재조합 동안, 공여체 핵산 분자는 표적 유전 "녹아웃"에 대한 공여체 유전자 "녹인 (knock-in)"을 위해, 임의로는 공여체 유전자 녹인 또는 표적 유전자 녹아웃 사건을 통해 표적 유전자를 비활성화하기 위해 사용될 수 있다. NHEJ는 절단 부위에서 DNA 서열에 대한 변화, 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가를 종종 초래하는 오류 유발 수선 과정이다. NHEJ는 표적 유전자를 "녹아웃"하기 위해 사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제의 예는 아연 핑거 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, CRISPR-Cas 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 메가TAL을 포함한다.
본원에서 사용되는 "아연 핑거 뉴클레아제" (zinc finger nuclease: ZFN)는 비-특이적 DNA 절단 도메인, 예컨대 Fokl 엔도뉴클레아제에 융합된 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 약 30개 아미노산의 각각의 아연 핑거 모티프는 DNA의 약 3개의 염기쌍에 결합하고, 특정 잔기에서 아미노산은 삼중 서열 특이성을 변경시키도록 변화될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260, 1993; Wolfe et al., J. Mol. Biol. 285:1917-1934, 1999] 참조). 다중 아연 핑거 모티프는 목적하는 DNA 서열, 예컨대 약 9개 내지 약 18개의 염기쌍 범위의 길이를 갖는 영역에 대한 결합 특이성을 생성하기 위해 템덤으로 연결될 수 있다. 배경기술의 방법에 의해, ZFN은 게놈에서 부위-특이적 DNA 이중 가닥 파손 (DSB)의 형성을 촉매함으로써 게놈 편집을 촉매화하고, DSB 부위에서 게놈에 상동성인 측접 서열을 포함하는 이식유전자의 표적화된 통합은 상동 직접 수선 (homology directed repair)에 의해 용이하게 된다. 대안적으로, ZFN에 의해 생성되는 DSB는 절단 부위에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 초래하는 오류 유발 세포 수선 경로인 비-상동성 말단 결합 (NHEJ)에 의한 수선을 통해 표적 유전자의 녹아웃을 초래할 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자 녹아웃은 ZFN 분자를 이용하여 만들어진 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 "전사 활성체-유사 이펙터 뉴클레아제" (TALEN)는 TALE DNA-결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질, 예컨대 FokI 엔도뉴클레아제를 지칭한다. "TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 각각 분기하는 12번째 및 13번째 아미노산을 갖는 고도로 보존된 33 내지 35개의 아미노산 서열을 일반적으로 갖는, 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위로 구성된다. TALE 반복 도메인은 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 연루된다. 반복 가변 2잔기 (Repeat Variable Diresidue: RVD)로서 지칭되는 분기 아미노산 잔기는 특정 뉴클레오티드 인식과 상관 관계가 있다. TALE의 12 및 13번 위치에서 HD (히스틴-아스파르트산) 서열이 사이토카인 (C)에 대한 TALE 결합을 야기하고, NG (아스파라긴-글리신)가 T 뉴클레오티드에 결합하고, NI (아스파라긴-이소류신)가 A에 결합하고, NN (아스파라긴-아스파라긴)이 G 또는 A 뉴클레오티드에 결합하며, NG (아스파라긴-글리신)가 T 뉴클레오티드에 결합하도록 결정되었다. 비정규 (비전형적) RVD가 또한 공지되었다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2011/0301073호를 참조하며, 이 비전형적 RVD는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). TALEN은 T 세포의 게놈에서 부위-특이적 이중-가닥 파손 (DSB)을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 비상동성 말단 결합 (NHEJ)은 어닐링에 대한 서열 중복이 거의 없거나 또는 전혀 없는 이중 가닥 파손의 양측으로부터 DNA를 결찰함으로써, 유전자 발현을 녹아웃하는 오류를 도입한다. 대안적으로, 상동성 관련 수선은 DSB 부위에서 이식유전자를 도입할 수 있으되, 단, 상동성 측접 서열이 이식유전자에 존재한다. 특정 구체예에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하며, TALEN 분자를 이용하여 만들어진다.
본원에서 사용되는, "주기적인 간격으로 분포하는 짧은 회문구조 반복부 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas" (CRISPR/Cas) 뉴클레아제 시스템은 염기쌍 상보성을 통해 게놈 내의 표적 부위 (프로토스페이서로서 알려짐)를 인식하기 위해, 이어서, 짧은 보존된 프로토스페이서 결합 모티프 (PAM)가 상보성 표적 부위의 3' 바로 다음이라면 DNA를 절단하기 위해 CRISPR RNA (crRNA)-가이드된 Cas 뉴클레아제를 사용하는 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 뉴클레아제의 서열 및 구조에 기반하여 3가지 유형 (즉, I형, II형 및 III형)으로 분류된다. I형 및 III형에서 crRNA-가이드된 감시 복합체는 다중 Cas 서브유닛이 필요하다. 가장 잘 연구된 II형 시스템은 적어도 3가지 성분을 포함한다: RNA-가이드 Cas9 뉴클레아제, crRNA, 및 트랜스-작용성 crRNA (tracrRNA). tracrRNA는 이중가닥 형성 영역을 포함한다. crRNA 및 tracrRNA는 Cas9 뉴클레아제와 상호작용하고 crRNA 상의 스페이서와 PAM으로부터 상류의 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 표적 DNA 상의 특정 부위로 Cas9/crRNA:tracrRNA 복합체를 가이드할 수 있는 이중가닥을 형성한다. Cas9 뉴클레아제는 crRNA 스페이서에 의해 정해진 영역 내에서 이중-가닥 파손을 절단한다. NHEJ에 의한 수선은 표적화된 좌위의 발현을 붕괴시키는 삽입 및/또는 결실을 초래한다. 대안적으로, 상동성 측접 서열을 갖는 이식유전자는 상동 직접 수선을 통해 DSB의 부위에 도입될 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (sgRNA 또는 gRNA)로 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 337:816-21, 2012] 참조). 추가로, 표적 부위에 상보성인 가이드 RNA의 영역은 목적하는 서열을 표적화하도록 변경되거나 또는 프로그래밍될 수 있다 (문헌[Xie et al., PLOS One 9:e100448, 2014]; 미국 특허 출원 공개 제2014/0068797호, 미국 특허 출원 공개 제2014/0186843호; 미국 특허 제8,697,359호 및 국제 특허 출원 WO　2015/071474호; 이들은 각각 참고로 포함된다). 특정 구체예에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하며, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 이용하여 만들어진다.
예시적인 gRNA 서열 및 면역 세포 단백질을 암호화하는 내인성 유전자를 녹아웃시키기 위해 이를 사용하는 방법은 Ren et al., Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017)에 기재된 것을 포함하며, 이의 gRNA, CAS9 DNA, 벡터 및 유전자 녹아웃 기술은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 구체예에서, 유전자 녹아웃은 TCR α-쇄 불변 영역 좌 (Cα), TCR β-쇄 불변 영역 좌 (Cβ) 또는 둘 다의 CRISPR-매개 유전자 녹아웃을 포함한다. 특정 구체예에서, TCR Cα 좌를 표적화하는 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열 AGAGTCTCTCAGCTGGTACA (서열 번호 136)를 포함한다. 특정 구체예에서, TCR Cα 좌를 표적화하는 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열 TGTGCTAGACATGAGGTCTA (서열 번호 137)를 포함한다. 특정 구체예에서, TCR Cβ 좌를 표적화하는 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열 GCAGTATCTGGAGTCATTGA (서열 번호 138)를 포함한다. 특정 구체예에서, TCR Cβ 좌를 표적화하는 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열 GGAGAATGACGAGTGGACCC (서열 번호 139)를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전자 녹아웃은 인간 β2M 좌의 CRISPR-매개 유전자 녹아웃을 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 β2M을 표적으로 하는 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열 CGCGAGCACAGCTAAGGCCA (서열 번호 140)를 포함한다. 일부 구체예에서, 유전자 녹아웃은 PD-1 좌의 CRISPR-매개 유전자 녹아웃을 포함한다. 특정 구체예에서, PD-1을 표적으로 하는 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열 GGCCAGGATGGTTCTTAGGT (서열 번호 141)를 포함한다.
"호밍 엔도뉴클레아제"로도 지칭되는 본원에서 사용되는 "메가뉴클레아제"는 거대 인식 부위 (약 12 내지 약 40개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제를 지칭한다. 메가뉴클레아제는 서열 및 구조 모티프에 기반하여 5가지 패밀리로 나눌 수 있다: LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, His-Cys 박스 및 PD-(D/E)XK. 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함하며, 이의 인식 서열은 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,420,032호 및 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al., Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon et al., Gene 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol. Biol. 263:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998] 참조).
특정 구체예에서, 천연 유래 메가뉴클레아제는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA4, HLA-암호화 유전자, 또는 TCR 성분-암호화 유전자로부터 선택된 표적의 부위-특이적 게놈 변형을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 유전자에 대해 신규한 결합 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제는 부위-특이적 게놈 변형을 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌[Porteus et al., Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005; Sussman et al., J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003; Chevalier et al., Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al., Nature 441:656-659, 2006; Paques et al., Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007]; 미국 특허 공개 제2007/0117128호; 미국 특허 공개 제2006/0206949호; 미국 특허 공개 제2006/0153826호; 미국 특허 공개 제2006/0078552호; 및 미국 특허 공개 제2004/0002092호 참조). 추가의 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃은 메가TAL로 알려진 융합 단백질을 만들기 위해 TALEN의 모듈식 DNA 결합 도메인으로 변형된 홈밍 엔도 뉴클레아제를 사용하여 생성된다. 메가TAL은 하나 이상의 표적 유전자를 녹아웃할 뿐만 아니라, TCRα 쇄, TCRβ 쇄 또는 둘 다와 같은 관심 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 공여체 주형과 함께 사용될 때 이종 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입 (녹인)하는데 이용될 수 있으며, 여기서 세포에 의해 생성된 녹인된 TCR은 BRAFV600E 항원 또는 펩티드에 특이적이다.
특정 구체예에서, 염색체 유전자 녹아웃은 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포)에 도입되는 억제 핵산 분자를 포함하며, 여기서 억제 핵산 분자는 표적-특이적 억제제를 암호화하고 암호화된 표적-특이적 억제제는 숙주 세포에서 (즉, PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, HLA 성분, TCR 성분 또는 이들의 임의 조합의) 내인성 유전자 발현을 억제한다.
염색체 유전자 녹아웃은 녹아웃 절차 또는 제제의 사용 후에 숙주 세포의 DNA 서열분석에 의해 직접적으로 확인될 수 있다. 염색체 유전자 녹아웃은 녹아웃 후에 유전자 발현의 부재 (예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 폴리펩티드 산물의 부재)로부터 추론될 수 있다.
치료 방법
일부 측면에서, 본 개시의 방법은 과증식성 장애를 치료하기 위한 것이며, 여기서 방법은 이를 필요로 하는 인간 대상에게 인간 BRAFV600E에 특이적인 결합 단백질 또는 본 개시에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
특정 측면에서, 본 개시는 상기 언급된 임의 결합 단백질에 따른 BRAFV600E 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 결합 단백질을 발현하는 결합 단백질 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여함으로써 BRAFV600E 발현을 특징으로 하는 과증식성 장애 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
대상에서 과증식성 장애 또는 악성 상태의 존재는 예를 들어 신생물, 종양, 비접촉 억제되거나 또는 종양발생적으로 형질전환된 세포 등 (예를 들어, 고형암, 림프종 및 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 등을 포함하는 혈액 암, 예컨대 신장, 위, 난소 및 결장직장 암)을 포함하는, 대상에서 이형성, 암성 및/또는 형질전환된 세포의 존재를 지칭하며, 이들은 당업계에 공지되어 있고, 이의 진단 및 분류를 위한 기준은 확립되어 있다 (예를 들어, 문헌[Hanahan and Weinberg, Cell 144:646, 2011; Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, 2000; Cavallo et al., Canc. Immunol. Immunother. 60:319, 2011; Kyrigideis et al., J. Carcinog. 9:3, 2010] 참조). 특히, 예를 들어, 모발 세포 백혈병, 흑색종, 비소세포 폐암, 결장직장암, 유두암 및 갑상선암, 예컨대 잘 분화되지 않은 갑상선 암. 따라서, 추가의 구체예에서, 모발성 세포 백혈병, 흑색종, 예를 들어 잘 분화되지 않은 갑상선암과 같은 갑상선암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 유두암, 비호지킨 림프종, 폐의 선암종 및 교모세포종 및 털모양별아교세포종을 포함하는 뇌종양을 포함하는 BRAFV600E 발현과 관련된 과증식성 장애 또는 다른 상태를 치료하는 방법이 제공된다.
본원에 사용된 용어 "치료한다" 및 "치료"는 대상 (즉, 인간 또는 인간이 아닌 동물일 수 있는 환자, 숙주)의 질환, 장애 또는 상태의 의학적 관리를 지칭한다 (예를 들어 Stedman 's Medical Dictionary 참조). 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 하나 이상의 결합 단백질 또는 BRAFV600E 펩티드:HLA 복합체 또는 이를 발현하는 숙주 세포, 및 임의로 보조 요법 (예를 들어, IL-2, IL-15, IL-21과 같은 사이토카인 또는 이들의 임의 조합)을 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 제공한다. 치료적 치료 또는 예방적 또는 방지적 방법으로부터 초래되는 치료적 또는 예방적 이점은, 예를 들어 개선된 임상 결과를 포함하되, 목적은 목적하는 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 또는 지연시키거나 또는 달리 감소시키거나 (예를 들어, 비처리 대조군에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 감소), 또는 이러한 질환 또는 장애의 확장 또는 중증도를 지연시키거나 또는 달리 감소시키는 것이다. 대상을 치료하는 것으로부터의 유리한 또는 목적하는 임상적 결과는 치료될 질환 또는 장애로부터 초래되거나 또는 이와 관련된 증상의 경감, 감소 또는 완화; 증상의 감소된 발생; 개선된 삶의 질; 더 긴 무 질환 상태 (즉, 대상이 질환의 진단이 만들어진 것에 기반하여 증상을 제공하는 가능성 또는 경향의 감소); 질환 정도의 감소; 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 질환 상태; 질환 진행의 지연 또는 늦춤; 질환 상태의 개선 또는 완화; 및 검출 가능하든 또는 검출 가능하지 않든 관해 (부분적이든 또는 전체적이든); 또는 전반적 생존을 포함한다.
"치료"는 또한 대상이 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비교할 때 연장된 생존을 의미할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물이 필요한 대상은 이미 질환 또는 장애를 갖는 대상체뿐만 아니라 질환 또는 장애를 갖거나 또는 발생할 위험의 경향이 있는 대상을 포함한다. 예방적 치료가 필요한 대상은 질환, 상태 또는 장애가 예방될 (즉, 질환 또는 장애의 발생 또는 재발 가능성이 감소되는) 대상을 포함한다. 본원에 기재된 조성물 (및 조성물을 포함하는 제제) 및 방법에 의해 제공되는 임상적 이점은 실시예에 기재된 바와 같이 조성물의 투여가 유리하게 의도되는 시험관 내 분석, 전임상 연구 및 임상 연구의 설계 및 실행에 의해 평가될 수 있다.
본원에 기재된 결합 단백질을 발현하는 세포는 약학적 또는 생리학적으로 허용되거나 적합한 부형제 또는 담체 중에 대상에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 인간 또는 다른 비인간 포유동물 대상에 투여하기에 적합한 생물학적으로 적합한 비히클, 예를 들어 생리 식염수이고 본원에 보다 상세히 설명된다.
입양 세포 요법과 관련하여 치료적 유효량은 치료된 인간 또는 비인간 포유동물에서 임상적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 입양 전달에 사용되는 (본 개시에 따른 결합 단백질을 발현하는) 숙주 세포의 양 (즉, BRAFV600E를 발현하는 세포에 대해 통계적으로 유의한 방식으로 특이적인 T 세포 면역 반응 (예를 들어, 세포 독성 T 세포 반응)을 유도하거나 향상시키기에 충분항 양)이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체중, 체 표면적, 연령, 투여될 특정 요법, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 상태 및 기타 동시에 투여되는 약물을 비롯한 많은 요인에 의존한다. 투여량은 다양하지만, 본원에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 투여를 위한 바람직한 용량은 약 107 세포/m2, 약 5 x 107 세포/m2, 약 108 세포/m2, 약 5 x 108 세포/m2, 약 109 세포/m2, 약 5 x 109 세포/m2, 약 1010 세포/m2, 약 5 x 1010 세포/m2, 또는 약 1011 세포/m2이다.
본 개시된 구체예 중 임의의 것에서, 단위 용량은 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 둘 다를 포함할 수 있으며, 여기서 T 세포는 벌크 T 세포, 나이브 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포, 또는 이펙터 기억 T 세포를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 단위 용량은 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포를 포함하고 CD8+ T 세포를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 단위 용량은 BRAFV600E-특이적 CD8+ T 세포를 포함하고, 이는 이종 CD4+ 공동 수용체를 발현하도록 조작될 수 있고, 임의로 CD4+ T 세포를 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, 단위 용량은 본 개시의 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 숙주 세포를 포함하고, 하나 이상의 다른 항원 또는 항원-HLA 복합체, 예를 들어 BRAFV600E 항원, V600E 돌연변이를 포함하지 않는 BRAF 항원; 단위 용량에서 본 개시된 숙주 세포의 결합 단백질과 상이한 HLA와 회합하는 BRAFV600E-함유 항원; 또는 과증식성 질환 또는 장애와 관련된 다른 항원; 예를 들어 NY-ESO-1, SSX-2, 티로시나제, TMG1-4, GP100, MAGE-A3, MART1, ROR1, EGFR, EGFRvIII, EGP-2, EGP-40, GD2, GD3, HPV E6, HPV E7, Her2, L1-CAM, Lewis A, Lewis Y, MUC1, MUC16, PSCA, PSMA, CD19, CD20, CD22, CD56, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD44v7/8, CD38, CD56, CD123, CA125, c-MET, FcRH5, WT-1, 엽산 수용체 α, VEGF-α, VEGFR1, VEGFR2, IL-13Rα2, IL-11Rα, MAGE-A1, PSA, 에프린 A2, 에프린 B2, NKG2D, NY-ESO-1 , TAG-72, 메소텔린, NY-ESO, 5T4, BCMA, FAP, 탄산 탈수효소 9, ERBB2, 또는 CEA, 또는 이들의 임의 조합)에 대한 결합 특이성을 갖는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 (예를 들어, 동종 또는 자가, 변형 (예를 들어, TCR, CAR, CD4 공동 수용체, CD8 공동 수용체, 또는 이들의 임의 조합과 같은 이종 단백질을 발현하기 위해) 또는 비변형된 것)를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다 (즉, 유사한 수의 PBMC를 갖는 환자 샘플과 비교하여 단위 용량에 존재하는 나이브 T 세포 집단의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만을 가짐).
일부 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 50%의 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 50%의 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다. 추가의 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 60%의 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 60%의 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 70%의 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 70%의 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 80%의 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 80%의 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 85%의 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 85%의 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 90%의 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 90%의 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 단위 용량은 동일하거나 거의 동일한 수의 조작된 CD45RA- CD3+ CD8+ 및 조작된 CD45RA- CD3+ CD4+ TM 세포를 포함한다.
약학적 조성물은 의학 분야 업자에 의해 결정되는 바와 같이 치료 (또는 예방)될 질환 또는 상태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적합한 지속 기간 및 투여 빈도는 환자의 건강 상태, 환자의 크기 (즉, 체중, 질량 또는 체표면적), 환자 상태의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점 (예컨대 개선된 임상 결과, 이를테면 더 빈번한 완전 또는 부분적 관해, 또는 더 긴 무 질환 및/또는 전반적 생존, 또는 증상 중증도의 감소를 포함하여, 본원에 기재된 바와 같이)을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(들)을 제공한다. 예방적 사용을 위해, 용량은 질환 또는 장애와 관련된 질환을 예방하거나, 질환의 개시를 지연시키거나 또는 질환의 중증도를 감소시키는데 충분하여야 한다. 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 조성물의 예방적 이점은 전임상 (시험관 내 및 생체 내 동물 연구를 포함) 및 임상 연구를 수행함으로써 그리고 적절한 통계적, 생물학적 및 임상적 방법 및 기법으로부터 얻은 데이터를 분석함으로써 결정될 수 있으며, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
BRAFV600E 발현과 관련된 상태는 BRAFV600E-구동 세포 또는 분자 사건이 존재하는 임의의 장애 또는 상태를 포함하고, 전형적으로 정상 세포에 비해 병든 세포의과성장에서 나타난다. BRAFV600E 발현과 관련된 일부 상태는 급성뿐 아니라 만성 장애 및 질환, 예컨대 대상을 특정 장애에 취약하게 하는 병리학적 상태를 포함할 수 있다.
BRAFV600E 발현과 관련된 상태의 일부 예는 과증식성 장애를 포함하며, 이는 종양, 신생물, 암, 악성 종양 등을 포함해 대상에서 활성화 및/또는 증식성 세포의 상태 (전사적으로 과활성일 수 있음)를 지칭한다. 활성화 또는 증식성 세포 외에, 과증식성 장애는 또한 괴사 또는 아폽토시스에 의한 세포 사멸 과정의 변조 또는 조절 이상을 포함할 수 있다. 이러한 세포 사멸 과정의 변조는 암 (일차, 이차 악성 종양 및 전이 포함) 또는 다른 상태를 포함하는 다양한 상태와 관련될 수 있다.
특정 구체예에 따르면, BRAFV600E 발현을 특징으로 하는 암은 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용함으로써 치료될 수 있다. 또한, "암"은 고형 종양, 복수 종양, 혈액 또는 림프 또는 다른 악성 종양을 비롯한 세포의 임의의 가속화된 증식; 결합 조직 악성 종양; 전이성 질환; 장기 또는 줄기 세포의 이식 후 최소 잔류 질환; 다제 내성 암, 원발성 또는 이차성 악성 종양, 악성 종양과 관련된 혈관신생 또는 다른 형태의 암을 지칭할 수 있다. 또한, 상기 개시된 유형의 질환 중 하나만이 포함되거나, 또는 이들이 BRAFV600E 발현에 의해 특징화되는지 여부에 관계없이 특정 상태가 배제될 수 있는 특정 구체예가 본 개시된 구체예 내에서 고려된다.
본원에서 고려되는 특정 치료 또는 예방 방법은 세포의 염색체에 안정적으로 통합된 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 (자가, 동종 또는 동계일 수 있음)를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 세포 조성물은 원하는 BRAFV600E-표적화된 T-세포 조성물을 입양 면역요법으로 대상에게 투여하기 위해 자가, 동종 또는 동계 면역계 세포 (예를 들어, T 세포, 항원-제시 세포, 자연 살해 세포)를 사용하여 생체 외에서 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역 세포이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의 조합이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합이다. 특정 구체예에서, 세포는 CD4+ T 세포이다.
본원에서 사용되는 조성물의 투여는 전달 경로 또는 전달 모드에 관계없이, 대상에게 이를 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 연속적으로 또는 간헐적으로 그리고 비경구로 실시될 수 있다. 투여는 인식된 상태, 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 확인된 대상의 치료 또는 이러한 상태, 질환 또는 질환 상태의 발생에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상의 치료를 위한 것일 수 있다. 보조 요법과의 공동 투여는 임의의 순서 및 임의의 투여 계획으로 다수의 작용제의 동시 및/또는 순차적 전달을 포함할 수 있다 (예를 들어, BRAFV600E-특이적 재조합 (즉, 조작된) 숙주 세포와 1종 이상의 사이토카인; 면역억제 요법, 예컨대 칼시뉴린 억제제, 코티코스테로이드, 미소관 억제제, 저용량 마이코페놀산 전구약물 또는 이들의 임의 조합물).
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 복수의 용량의 재조합 숙주 세포가 대상에게 투여되며, 이는 약 2주 내지 약 4주의 투여 간격으로 투여될 수 있다. 추가의 구체예에서, 사이토카인 (예를 들어, IL-2, IL-15, IL-21)이 순차적으로 투여되되, 단 대상은 사이토카인 투여 전에 적어도 3회 또는 4회 재조합 숙주 세포가 투여되어야 한다. 특정 구체예에서, 사이토카인은 숙주 세포와 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 사이토카인은 피하 투여된다.
또 다른 구체예에서, 치료되는 대상은 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 프로드럭, 또는 이들의 임의 조합과 같은 면역 억제 요법을 추가로 받고 있다. 또 다른 구체예에서, 치료되는 대상은 비골수증식성 또는 골수증식성 조혈 세포 이식을 받았으며, 여기서 치료는 비골수증식성 조혈 세포 이식 후 적어도 2개월에서 적어도 3개월에 투여될 수 있다.
유효량의 치료 또는 약학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, 목적하는 임상 결과 또는 이로운 치료를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안에서의 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 투여가 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 알려졌거나 확인된 대상에 대한 것인 경우, 용어 "치료량"은 치료와 관련하여 사용될 수 있고, 반면에 "예방적 유효량"은 예방적 과정으로서 질환 또는 질환 상태의 발생 (예를 들어, 재발)에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상에 대한 유효량의 투여를 기술하기 위해 사용될 수 있다.
CTL 면역 반응의 수준은 본원에 기재되고 당업계에서 일상적으로 실행되는 많은 면역학적 방법 중 어느 하나에 의해 결정될 수 있다. CTL 면역 반응의 수준은, 예를 들어, T 세포에 의해 발현된 본원에 기재된 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 중 어느 하나의 투여 전, 후에 결정될 수 있다. CTL 활성을 결정하기 위한 세포독성 분석은 당업계에서 일상적으로 실행되는 몇몇 기법 및 방법 중 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), 페이지 1127-50, 및 이에 인용된 참고문헌 참조).
항원-특이적 T 세포 반응은 적절한 상황에서 동족 항원 (예를 들어, 면역적합성 항원-제시 세포에 의해 제시될 때 T 세포를 프라이밍하거나 또는 활성화하기 위해 사용되는 항원)에 노출되는 T 세포와 구조적으로 상이하거나 비관련 대조군 항원 대신에 노출되는 동일한 공급원 집단으로부터의 T 세포 사이에 만들어질 수 있는 본원에 기재된 임의의 T 세포 기능성 매개변수 (예를 들어, 증식, 사이토카인 방출, CTL 활성, 변경된 세포 표면 마커 표현형 등)에 따라 관찰된 T 세포 반응의 비교에 의해 전형적으로 결정된다. 대조군 항원에 대한 반응보다 통계학적 유의도가 더 큰 동족 항원에 대한 반응은 항원-특이성을 의미한다.
본원에 기재된 BRAFV600E-함유 항원 펩티드에 대한 면역 반응의 존재 및 수준을 결정하기 위해 생물학적 샘플을 대상으로부터 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 혈액 샘플(이로부터 혈청 또는 혈장이 준비될 수 있음), 생검 표본, 체액 (예를 들어, 폐 세척액, 복수, 점막 세척액, 활액), 골수, 림프절, 조직 외식편, 기관 배양물 또는 대상 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제제일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 면역원성 조성물을 받기 전에 대상으로부터 얻을 수 있는데, 이의 생물학적 샘플은 기준선 (즉, 사전 면역화) 데이터를 확립하기 위한 대조군으로서 유용하다.
본원에 기술된 약학적 조성물은 단위 용량 또는 다회-용량 용기, 예컨대, 밀봉 앰플 또는 바이알에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 제형의 안정성을 유지하기 위해 환자에게 주입될 때까지 냉동될 수 있다. 특정 구체예에서, 단위 용량은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포를 약 107개 세포/㎡ 내지 약 1011개 세포/㎡의 용량으로 포함한다. 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기에 적합한 투여 및 치료 요법의 개발은 예를 들어, 비경구 또는 정맥내 투여 또는 제형을 포함한다.
대상 조성물이 비경구로 투여되는 경우, 조성물은 또한 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 비경구적으로 허용 가능한 비독성 희석제 또는 용매는 물, 링거액, 등장성 염 용액, 1,3-부탄디올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 물과의 혼합물로의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 용액 또는 현탁액은 또한 1종 이상의 완충제, 예컨대, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 또는 타르트산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 제형을 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약학적으로 순수하고, 사용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상에 대해서 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 적절한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 제조합 세포 또는 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다.
일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 요법은 치료 또는 예방적 이익을 제공하기에 충분한 양의 활성 분자 또는 세포를 제공한다. 이러한 반응은 비치료 대상과 비교할 때 치료 대상에서 개선된 임상적 결과 (예를 들어, 더 빈번한 완전 또는 부분적인 차도, 또는 장기간 무질환 생존)를 확립함으로써 모니터링될 수 있다. 종양 단백질에 대한 기존 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상 결과와 상관 관계가 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 일상적이며 처리 전 후 대상으로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시에 따른 숙주 세포를 포함하는 단위 용량 형태가 제공된다.
본 개시에 따른 방법은 1종 이상의 추가적인 작용제를 투여하여 병용 요법으로 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 병용 요법은 면역 체크포인트 억제제와 함께 (동시에, 함께, 또는 순차적으로) BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 요법은 자극성 면역 체크포인트제의 작용제와 함께 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 투여하는 단계를 포함한다. 추가 구체예에서, 병용 요법은 2차 요법, 예컨대, 화학요법제, 방사선 요법, 수술, 항체 또는 이들의 임의 조합물과 함께 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 억제 약제" 또는 "면역억제제"는 면역 반응을 제어하거나 억제하는 데 도움을 주기 위한 억제성 신호를 제공하는 하나 이상의 세포, 단백질, 분자, 화합물 또는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, 면역 억제제는 면역 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나; 면역 활성화를 감소, 예방 또는 지연시키거나; 면역 억제를 증가, 활성화 또는 상향조절하는 분자를 포함한다. (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제와 함께) 표적에 대한 예시적인 면역 억제 약제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G(CD112R), PVRL2, 아데노신, A2aR, 면역억제성 사이토카인 (예를 들어, IL-10, IL-4, IL-1RA, IL-35), IDO, 아르기나제, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, Treg 세포 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다.
면역 억제 약제 (면역 체크포인트 억제제라고도 지칭됨)는 화합물, 항체, 항체 단편 또는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 융합체, 예컨대, CTLA4-Fc 또는 LAG3-Fc), 안티센스분자, 리보자임 또는 RNAi 분자 또는 저분자량 유기 분자일 수 있다. 본원에 개시된 구체예 중 임의의 것에서, 방법은 단독으로 또는 임의의 조합으로 하기 면역 억제 성분 중 어느 하나의 1종 이상의 억제제와 함께 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, BRAFV600E-특이적 결합 단백질은 PD-1 억제제, 예를 들어, PD-1-특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, 피딜리주맙, 니볼루맙 (케이트루다, 이전 MDX-1106), 펨브롤리주맙 (옵디보, 이전 MK-3475), MEDI0680 (이전 AMP-514), AMP-224, BMS-936558 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다. 추가 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)는 PD-L1 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, BMS-936559, 두르발루맙 (MEDI4736), 아테졸리주맙 (RG7446), 아벨루맙 (MSB0010718C), MPDL3280A 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 LAG525 억제제, 예컨대 LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, BRAFV600E-특이적 결합 단백질은 CTLA4의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 CTLA4 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, 이필리무맙, 트레멜리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질 (예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트) 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 B7-H3 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, 에노블리투주맙 (MGA271), 376.96, 또는 이들 둘 모두와 조합하여 사용된다, B7-H4 항체 결합 단편은 예를 들어, 문헌[Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013]에 기술된 바와 같은 scFv 또는 이의 융합 단백질뿐만 아니라 미국 특허 제9,574,000호 및 PCT 특허 공개 제WO /201640724A1호 및 제WO 2013/025779A1호에 기술된 것일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 CD244의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 BLTA, HVEM, CD160의 억제제 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다. 항 CD-160 항체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2010/084158호에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 TIM3의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 Gal9의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 아데노신 신호전달의 억제제, 예컨대, 디코이 (decoy) 아데노신 수용체와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 A2aR의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 KIR의 억제제, 예컨대 리릴루맙 (BMS-986015)과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 억제성 사이토카인 (전형적으로, TGFβ가 아닌 사이토카인) 또는 Treg 발달 또는 활성의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 IDO 억제제, 예컨대, 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트 (INCB024360; Liu el al., Blood 115:3520-30, 2010), 엡셀렌 (Terentis et al. , Biochem. 49:591-600, 2010), 인독시모드, NLG919 (Mautino el al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013), 1-메틸-트립토판(1-MT)-티라-파자민 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 아르기나제 억제제, 예컨대, N(오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-1-아르기닌 (노르-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥산산 (ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인 (BEC) 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 VISTA의 억제제, 예컨대, CA-170 (큐리스 (Curis), 미국 매사추세츠주 렉싱톤 소재)과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 TIGIT의 억제제, 예를 들어, COM902 (콤푸젠(Compugen), 캐나다 온타리오주 토론토 소재) 등, CD155의 억제제, 예를 들어, COM701 (콤푸젠) 등, 또는 둘 모두와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 PVRIG의 억제제, PVRL2의 억제제 또는 이들 둘 모두와 조합하여 사용된다. 항-PVRIG 항체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2016/134333호에 기술되어 있다. 항-PVRL2 항체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2017/021526호에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 LAIR1 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 CEACAM-1의 억제제, CEACAM-3의 억제제, CEACAM-5의 억제제 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 자극성 면역 체크포인트 분자의 활성을 증가시키는 제제 (즉, 작용제)와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)은 CD137(4-1BB) 작용제 (예를 들어, 우렐루맙 등), CD134 (OX-40) 작용제 (예를 들어, MEDI6469, MEDI6383, 또는 MEDI0562 등), 레날리도미드, 포말리도미드, CD27 작용제 (예를 들어, CDX-1127 등), CD28 작용제 (예를 들어, TGN1412, CD80, 또는 CD86 등), CD40 작용제 (예를 들어, CP-870,893, rhuCD40L, 또는 SGN-40 등), CD122 작용제 (예를 들어, IL-2 등), GITR의 작용제 (예를 들어, PCT 특허 공개 제WO 2016/054638호에 기술된 인간화된 모노클로날 항체), ICOS의 작용제 (CD278) (예를 들어, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 또는 이들의 임의 조합물 등)와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 개시된 구체예 중 임의의 것에서, 방법은 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 단독으로 또는 상기 중 임의의 것을 비롯한, 하나 이상의 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제와 함께 임의의 조합물로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 병용 요법은 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포), 및 비-염증성 고형 종양에 의해서 발현된 암 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합-단편, 방사선요법, 수술, 화학요법제, 사이토카인, RNAi 또는 이들의 임의 조합물 중 하나 이상을 포함하는 제2 요법을 포함한다.
특정 구체예에서, 병용 요법 방법은 BRAFV600E-특이적 결합 단백질을 투여하고, 방사선요법 또는 수술을 추가로 수행하는 것을 포함한다. 방사선 요법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, X-선 요법, 예컨대, 감마-방사선 및 방사성약학적 요법을 포함한다. 대상에서 주어진 암을 치료하기에 적절한 수술 및 수술 기법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 병용 요법은 본 개시의 BRAFV600E-특이적 결합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 투여하는 것을 포함하고, 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 화학요법제는 크로마틴 기능의 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사물질 (예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제 (예컨대, 인터칼레이팅제), 및 DNA 수선 억제제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 화학요법제는 하기 군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 항대사물질/항암제, 예컨대, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식성/세포분열 방지제, 예컨대, 자연 산물, 이를테면, 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloid) (빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미소관 파괴제, 예컨대, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포사이드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로로에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테르, 테모졸아미드, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 에토포시드 (VP 16); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신에서 대사시키고 그 자체의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드 (메클로에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬설포네이트-부설판, 니트로소우레아 (카르무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-데카바지닌 (DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예컨대, 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 복합체 (시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 (aromatase) 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소 용해제 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tissue plasminogen activator), 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 분비억제제 (브레벨딘); 면역억제제 (사이클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시롤리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제제 (혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 억제제, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙, 리툭시맙); 키메라 항원 수용체; 세포 주기 억제제 및 분화 유도인자 (트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신 및 이리노테칸 (CPT-11) 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코티코스테로이드 (코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도인자 및 독소, 예컨대, 콜레라 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신, 보데텔라 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 또는 디프테리아 독소 및 카스파제 활성인자; 및 염색질 파괴인자.
사이토카인은 숙주 면역 반응을 항암 활성 쪽으로 조작하기 위해서 점점 더 사용이 증가하고 있다 (예를 들어, 문헌[Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015]). 단독으로 또는 본 개시의 결합 단백질 또는 이의 발현 세포와 조합하여, 면역 항암 또는 항종양 반응을 촉진시키기에 유용한 사이토카인은 예를 들어, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 21, IL-24, 및 GM-CSF를 포함한다.
다른 암 치료 접근법은 암 세포에 의한 성장, 유지, 증식 및 면역 회피에 필요한 종양 유전자 및 다른 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함한다. RNA 간섭, 특히 마이크로RNA (miRNA) 및 소 억제성 RNA (siRNA)의 사용은 암 유전자의 발현을 녹다운시키기 위한 접근법을 제공하며 (예를 들어, Larsson et al., Cancer Treat. Rev. 16 (55):128-135, 2017 참조), 본 개시의 동일 발현 결합 단백질 또는 세포와 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 구체예에서, 임의의 치료제 (예를 들어, BRAFV600E-특이적 결합 단백질 또는 조작된 숙주 세포, 면역 억제 성분의 억제제, 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제, 항종양 림프구, 화학요법제, 방사선 요법, 수술, 사이토카인 또는 억제성 RNA)는 치료 과정 동안 대상에게 1회 이상 투여될 수 있고, 조합시 임의의 순서 또는 조합으로 대상에게 투여될 수 있다. 치료제의 적절한 용량, 적합한 지속 기간 및 투여 빈도는 환자의 상태; 종양 또는 암의 크기, 유형, 확산, 성장 및 중증도; 특정 형태의 활성 성분; 및 투여 방식과 같은 요인에 의해 결정될 것이다.
실시예
실시예 1
흑색종 환자에서 CD4 + BRAF V600E 특이적 T 세포의 확인
왼발에서 시작된 IIIC 기의 BRAFV600E-돌연변이화 흑색종을 나타낸 52세 남성에게 광범위 절개, 림프절 절제술과 보조 이필리무맙으로 치료를 하였다. 1년의 이필리무맙을 마치기 직전 왼쪽 다리에 3개의 통과 전이의 절제와, 3개월 후 추가적인 통과 전이의 절제가 필요했다. 그 뒤에 3 cm 왼쪽 장골절 전이와 왼쪽 허벅지에 연조직 결절 FDG 광적 병변으로 진행했다 (도 1A). 전체 엑솜 서열분석 및 TIL의 확장에 대한 장골절 절개 후, 환자에 림프구 제거 화학요법제 후 TIL 주입을 하였다. 왼쪽 허벅지 병변이 해결되었고 환자는 치료 27개월 후 질병이 없는 상태로 있었다.
정제된 종양 세포 및 정상 조직의 전체 엑솜 및 RNA 서열분석에 의해 표 1에 나타낸 단 20개의 비유사 미스센스 돌연변이만이 동정되었다 (왼쪽으로부터 2 및 3 컬럼; 왼쪽으로부터 4-6 컬럼: 암호화된 비유사 돌연변이 및 DNA 또는 RNA-Seq에서의 돌연변이의 존재를 포함하는 27-mer 펩티드 (왼쪽으로부터 4-6 컬럼); 돌연변이를 포함하는 조작된 20-mer 펩티드 (왼쪽으로부터 7 및 8 컬럼); 및 백만당 전사체 (TPM) 단위의 RNA-seq 발현.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
또한 표 1에는 나타내지 않았지만, 각 돌연변이에 대한 염색체 위치 (GRCh37/hg19 참조 어셈블리 사용) 및 변이체 대립유전자 빈도 (VAF)도 결정되었다. BRAFV600E 돌연변이에 대한 VAF는 35.4%였다.
TIL 요법 후 환자로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 20개 각 돌연변의 측접 펩티드 풀로 자극하여 상기 잠재적인 신항원에 대한 T 세포 반응을 평가하였다. 후보 신항원에 대한 CD8+ T 세포 반응은 검출되지 않았다; 그러나, BRAFV600E를 포함하는 20-mer 펩티드에 특이적인 CD4+ T 세포 반응이 확인되었다. BRAFV600E-반응성 T 세포를 IFN-γ 포획에 의해 정제하고, 돌연변이 BRAF 펩티드로 펄싱된 자가 B 세포를 인식하지만 야생형 BRAF 펩티드로 펄싱된 자가 B 세포는 인식하지 않는 것으로 나타난 바, 이는 돌연변이 펩티드에 대한 특이성을 입증한다 (도 1B). BRAFV600E가 클래스 II MHC+ APC에 의해 처리되고 제시되는지를 결정하기 위해, 자가 B 세포를 엔도솜을 표적으로 하는 야생형 또는 돌연변이 BRAF 서열을 암호화하는 mRNA로 형질감염시켰다. T 세포는 돌연변이 BRAF를 발현하는 세포를 인식하지만 야생형 BRAF에 대해서는 인식하지 않았다 (도 1C).
항-클래스 I 또는 항 HLA-DR 항체가 아닌 항-HLA-DQ에 의해 인식이 차단되어, HLA-DQ는 제한 대립유전자일 것임을 확인했다 (도 1D). 공지된 유전자형의 다수의 B 세포주 분석은 약한 DQB1*0301의 인식과 보다 강한 DQB1*0302 및 DQB1*0303의 인식과 함께, HLA-DQB1*03과 쌍을 이룬 HLA-DQA1*03에 의한 제한을 제시하였다 (도 1F 및 표 2).
항원의 존재 또는 부재하에 상이한 클래스 II 대립유전자를 발현하는 동종이계 B-LCL 세포주와 인큐베이션한 후 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산.
세포주 BRAF V600E 펩티드 평균 IFN-G pg/ml HLA DRB1 HLA DQB1
1331 - 10 404 302
+ 41791
CFS - 10 0401, 0101 0301, 0501
+ 1547
DEM - 23 　0401,　1602 0302, 0502
+ 29873
DEU - 6 401 301
+ 10359
FAL - 9 0403, 0801 03BG, 0402
+ 31620
BM14 - 536 401 302
+ 42832
DMB - 38 0101, 1501 0501, 0602
+ 7
DLM - 26 0403, 0801 03BG, 0402
+ 39388
AMM - 6 0802, 1501 0402, 06WG
+ 9
CLC - 9 0301, 1104 02AB, 0301
+ 6
BP - 35 1601, 1101 0502, 0301
+ 36
JWP - 12 0701, 0701 02AB, 0303
+ 359
DAH2 - 17 09, 1501 0303, 06W6
+ 49784
VRM - 6 0701, 10 0303, 0501
+ 188
완전한 환자 HLA 형은 다음과 같다:
A*11:01:01/A*24:02:01; B*15:01:01/B*40:01:02; C*03:03:01/C*03:04:01;
DPA1*01:03:01/DPA1*01:03:01; DPB1*04:01:01/DPB1*04:01:01;
DQA1*03:01:01/DQA1*03:02; DQB1*03:02:01/DQB1*03:03:02;
DRB1*04:03:01/DRB1*09:01:02; DRB4*01:03:01/DRB4*01:03:02.
밀접하게 연관된 HLA-DRB1*04가 아닌 HLA-DQA1*03 또는 DQB1*0302로 형질감염된 B-LCL이 돌연변이 펩티드로 펄스된 경우 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포에 의해 인식되었고 이로 HLA 제한이 입증되었다 (도 1E).
HLA-DQB1*0302 및 BRAFV600E 유전자형을 갖는 세 흑색종 세포주의 인식에 대해 시험하였다. 가장 많은 양의 HLA-DQ를 발현하는 하나의 종양 세포주가 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포에 의해 인식되어 에피토프가 종양 세포에 의해 직접 제시될 수 있음을 입증하였다 (도 1G-1I). 종양-특이적 CD4+ T 세포는 직접적인 세포 사멸 및 사이토카인 방출을 통해 항종양 활성을 가질 수 있으나 (예를 들어, Quezada et al., J. Exp. Med. 207(3):637-650 (2010); Manici et al., J. Exp. Med. 189(5):871-876 (1999) 참조), 주된 역할은 APC를 라이센싱하고 사이토카인을 생산함으로써 CD8+ T 세포의 발생과 기능을 지원하는 것이다 (예를 들어, Sun and Bevan, Science 300(5617):339-342 (2003); Williams et al., Nature 441(7095):890-893 (2006) 참조). 입양적으로 전달된 TIL이 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포를 함유하였지만, CD8+ T 세포가 TIL에서 우세한 집단이었다 (표 3). 간략하게, 환자에게 주입된 최종 TIL 산물을 유세포 분석법으로 표현형에 대해 분석하고, PMA/이오노마이신으로 자극한 후, 사이토카인에 대해 세포 내로 염색하였다. 표 3에 나타낸 백분율은 CD45+ 세포 (위) 또는 CD4 또는 CD8 세포 (아래)의 백분율이다.
Figure pct00004
또한, 자가 종양에 의한 다수의 독립적인 TIL 배양물의 자극으로 생성된 IFN-γ의 대부분은 HLA 클래스 I 차단 항체에 의해 차단되었다 (표 4).
초기 TIL 배양물의 종양 특이성 및 클래스 I 차단
풀 T 풀 R 풀 B 풀 A 풀 S 풀 1 풀 2 풀 3 풀 4 풀 5 풀 6 Frag. 12
종양 2179.50 752.12 2993.64 4427.63 2313.73 3409.99 7213.00 3722.50 3866.23 2914.58 3916.23 2.44
종양 + 클래스 I 차단 94.32 11.95 67.49 38.78 67.88 75.74 394.68 258.88 86.28 369.32 513.78 2.44
배지
단독		 2.44 52.71 67.56 2.44 2.44 40.87 16.52 131.40 2.44 2.44 21.22 2.44
PMA/Iono 2010.14 360.33 2563.22 2929.14 1203.62 2038.37 1565.83 1454.78 2757.56 2012.09 2155.09 2.44
차단 % 96% 98% 98% 99% 97% 98% 95% 93% 98% 87% 87% 0%
TIL이 종양 엑솜 서열분석에 의해 확인된 20개의 비유사 돌연변이를 모두 포함하는 펩티드 풀로 펄싱된 자가 B 세포와 함께 배양된 경우에는 IFN-γ 생산이 관찰되지 않았지만 (도 2A), 계통 제한 자가 항원 (티로시나제, Mart-1, TRP2) 및 흑색종에서 T 세포의 표적으로 알려진 암 시험 항원 (Mage A3)으로부터의 펩티드로 펄스되었거나 (예를 들어, Gros et al. Nat. Med. 2016 참조) (도 2F), 또는 29개의 비유사 돌연변이 또는 티로시나제, Mage-A3, Mart1, SSX2 및 GP100의 암호화 서열을 포함하는 텐덤 미니 유전자로 형질감염된 (도 2B-2E) B 세포와 공동 배양 후에 IFN-γ가 생산되었다. 따라서, 환자 TIL은 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포 및 자가-항원에 대한 다양한 CD8+ T 세포 반응을 함유하고 있다.
임상 프로토콜
환자는 FDA 승인 IND 하에 Fred Hutchinson Cancer Research Center의 기관 검토위원회 (FHCRC 2643; NCT01807182)에 의해 승인된 임상 프로토콜에 따라 TIL 생성에 대한 등록을 마쳤다. 수술로 치유될 것 같지 않고 ECOG </=1이며 안전하게 절제하거나 생검이 가능한 전이성 질환 부위를 갖고 있는 18세 이상의 IV기 흑색종 또는 III기 환자가 자격이 있다. 국립암연구소 수술 부서 (Surgery Branch of the National Cancer Institute)에서 개발한 방법론 (예를 들어, Dudley et al., J. Immunother. 24(4):363-373 (2002))을 이용하여 TIL을 6,000 IU/ml 재조합 IL-2 (Proleukin; Novartis)로 종양 단편으로부터 확장시켰다. TIL 배양물은 자가 종양 세포와의 공동 배양 후 IFN-γ 분비에 의해 결정된 바와 같이 세포 성장 및 자가 종양 반응성에 기초하여 선택되었다. TIL을 사용이 필요할 때까지 동결 보존하고, 해동한 뒤, 전술한 바와 같이 고속 확장 프로토콜을 사용하여 추가로 확장시켰다 (Riddell and Greenberg, J. Immunological Methods 128(2):189-201 (1990)). 사이클로포스파미드 60 mg/kg/일 × 2일, 이어 플루다라빈 25 mg/m2/일 × 5일의 림프절 제거 화학치료 요법 후, 확장된 TIL을 환자에게 투여하였다. TIL 주입 후 24시간 이내에, 환자에게 총 9회 용량으로 8시간마다 600,000 IU/kg IV로 고용량 IL-2를 투여하였다. 6, 12 및 24주에 그 후로 3-6 개월마다 CT 및 MRI와 함께 RECIST 버전 1.1을 사용하여 주요 담당자의 재량으로 종양 반응을 평가하였다.
엑솜 포획 및 RNA 서열분석을 위한 핵산 제조
치료 후 혈액을 사용하여 비-종양 DNA를 단리하였다. 장골 절 종양 재발로부터 얻은 단일 세포 현탁액에서 다량의 침윤 림프구를 제거하고 신생물 세포를 풍부하게 하기 위해 유동 선별 (요오드화 프로피듐 음성 및 CD45 음성)하였다. 정상 조직 및 선별된 종양 세포를 Qiagen DNA/RNA AllPrep Micro 키트로 처리하여 엑솜 포획을 위한 DNA를 단리하고 후속 RNA-seq 프로파일링을 위해 RNA를 보존하였다. 게놈 DNA 농도를 Invitrogen Qubit® 2.0 형광계 (미국 캘리포니아 칼스배드에 소재한 Life Technologies-Invitrogen) 및 Trinean DropSense96 분광광도계 (매사추세츠 홉킨턴에 소재한 Caliper Life Sciences)로 정량하였다.
전체 엑솜 서열분석
Agilent SureSelectXT 시약 키트 및 Agilent All Human Exon v6 (미국 산타클라라에 소재한 Agilent Technologies)를 사용하여 단리한 엑손 표적을 사용하여엑솜 서열분석 라이브러리를 제작하였다. 200 ng의 게놈 DNA를 Covaris LE220 집속 초음파장치 (미국 매사추세츠 워번에 소재한 Covaris, Inc.) 및 제작한 라이브러리를 사용하여 단편화하고, Sciclone NGSx Workstation (미국 매사추세츠 월탐에 소재한 PerkinElmer)에서 수집하였다. 라이브러리 크기 분포를 Agilent 2200 TapeStation을 사용하여 검증하였다. Life Technologies의 Invitrogen Qubit® 2.0 형광계를 사용하여 추가 라이브러리 QC, 풀링된 인덱스 라이브러리 블렌딩 및 클러스터 최적화를 수행하였다.
생성된 라이브러리를 paired-end 100bp (PE100) 전략을 사용하여 Illumina HiSeq 2500에서 서열분석하였다. Illumina의 실시간 분석 v1.18 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석 및 염기 결정 (base calling)을 수행한 후, Illumina의 bcl2fastq Conversion Software v1.8.4 ((http://support.illumina.com/downloads/bcl2fastq_conversion_software_184.html)를 사용하여 인덱스된 호출에 대한 "역다중화" 및 FASTQ 파일을 생성하였다. 표준 Illumina 품질 필터를 통과한 판독 쌍을 추가 분석을 위해 유지하였다 (종양에 대해 77M 판독 쌍 및 정상에 대해 89M 판독 쌍 산출). 쌍을 이룬 판독값을 BWA-MEM 짧은 판독 정렬기로 인간 게놈 참조 (GRCh37/hg19)에 대해 정렬시켰다 (예를 들어,Li, H., arXiv preprint arXiv:1303.3997 (2013); Li and Rudbin, Bioinfomatics 25(14):1754-1760 참조). 표준 BAM 형식의 생성된 정렬 파일을 권장되는 최적의 방법에 따라 품질 점수 재교정, 삽입-결실 재배치 및 중복 제거를 위해 Picard 2.0.1 및 GATK 3.5[37]에 의해 처리하였다 (Auwera et al., Current Protocols in Bioinformatics pp. 11.10.1-11.10.33 (2013) 참조).
분석 준비가된 종양 및 정상 BAM 파일: MuTect 1.1.7[39], Strelka 1.0.14[40], 및 VarScan.v2.4.1로부터 체세포 돌연변이들을 판독하기 위해 3개의 독립적인 소프트웨어 패키지를 사용하였다 (Koboldt et al., Genome Res. 22(3):568-576 (2012)). VCF 형식의 모든 도구로부터의 변이체 호출에 Oncotator로 주석을 달았다 (Ramos et al., Human Mutation 36(4):E2423-E2429 (2015)). 추가로 야생형 및 변이체 펩티드 서열을 포함해 미스센스 체세포 변이체를 조합하고 주석을 달아서, 합성을 위한 후보 펩티드가 선택되는 통합 요약을 형성하였다.
RNA-Seq 데이터 처리
관찰된 발현 수준에 의해 후보 펩티드의 순위를 정하기 위해, 동일한 단일 세포 현탁액으로부터 유동 선별된 종양 세포에 대해 RNA-seq를 수행하였다. TruSeq RNA Sample Prep v2 Kit (미국 캘리포니아 샌디에고에 소재한 Illumina, Inc.) 및 Sciclone NGSx Workstation (미국 매세추세츠 월탐에 소재한 PerkinElmer)을 사용하여 전체 RNA로부터 RNA-seq 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리 크기 분포를 Agilent 2200 TapeStation (미국 캘리포니아 산타클라라에 소재한 Agilent Technologies)을 사용하여 검증하였다. Life Technologies의 Invitrogen Qubit® 2.0 형광계 (미국 캘리포니아 칼즈배드에 소재한 Life Technologies-Invitrogen)를 사용하여 추가 라이브러리 QC, 풀링된 인덱스 라이브러리 블렌딩 및 클러스터 최적화를 수행하였다. 라이브러리를 Illumina HiSeq 2500에서 서열분석하여 133M 50nt 쌍 판독값 (PE50)을 생성하였다. 판독값을 RSEM 1.2.19를 이용하여 RefSeq 유래 참조 전사체에 대해 정렬시켰다 (Li and Dewer, BMC Bioinformatics 12(1):323 (2011) 참조). TPM 단위의 RSEM으로부터의 유전자 수준 발현값을 미스센스 체세포 변이체의 요약에 추가하였다.
T 세포 배양
Elim Biopharma에서 입수한 중첩된 20-mer 미정제 펩티드로 초기 자극을 수행하였다 (20 아미노산 서열의 +7 또는 +13번 위치에서 돌연변이된 잔기를 갖는 각 돌연변이에 걸쳐있는 2개의 펩티드 사용). +11번 위치에 V600 (야생형) 또는 E600 (돌연변이)을 갖는 >80% 순도의 21 mer 펩티드로 후속 실험을 수행하였다. 동결 보존된 PBMC를 해동시키고, CTL (10% 인간 혈청 (내부에서 생산), 50 μM 베타-머캅토에탄올, 페니실린 및 스트렙토마이신, 4 mM L-글루타민 및 2 ng/ml 재조합 인간 IL-7 (Peprotech)이 보충된 HEPES (Gibco) 및 L-글루타민이 포함된 RPMMI 배지)에 밤새 그대로 두었다. 다음날 아침, PBMC를 세척하고 사이토카인 없이 각 펩티드 1 ㎍/ml의 풀로 6 웰 플레이트의 웰당 5 ml CTL에 10e6 세포로 자극시켰다. +3일에 재조합 IL-2 (Peprotech)를 10 U/ml의 최종 농도로 첨가하고, 보충 IL-2에 의한 반 매질 변화를 +3, +6 및 +9일에 수행하였다. +13일에 세포를 ELISA 및 사이토카인 염색 분석에 사용하였다.
제조업자의 지시에 따라 IFN-γ 분비 분석 APC (Milltenyi)를 사용하여 분비된 IFN-γ에 대해 생세포를 염색하고, 10 ㎍/㎖ 21-mer BRAF 돌연변이 펩티드로 펄싱된 항원 제시 세포로서 자가 B 세포를 사용하여 항원 특이적 T 세포 농축을 수행하였다. CD4+ IFN-γ 분비 세포를 FACS Aria2에서 분류하였다. 분류된 세포를 10 ng/ml 인간 IL-15가 보충된 CTL에 5일 동안 그대로 둔 후, 전술한 고속 확장 프로토콜을 사용하여 확장시켰다 (Riddell and Greenberg, 상동). 항원-특이적 T 세포를 항-Vβ 3.1 (Thermo Scientific, cat. no. TCR2740)로 염색하여 Vβ3.1 양성, CD4+ 세포를 분류시킴으로서 추가로 농축하고, 확장시킨 후, 확장 후 13일 또는 14일에 동결 보존하였다. 동결 보존된 세포를 해동하고 분석 전에 10 U/ml IL-2가 보충된 CTL에서 밤새 그대로 두었다.
항원-제시 세포
제조업자의 지시에 따라 자기 양성 선택 (Miltenyi, cat. no. 130-042-401) 및 CD19 (Miltenyi, cat. no. 130-050-301)를 인식하는 항체로 코팅된 자기 비드를 사용하여 신선 또는 해동된 PBMC로부터 자가 B 세포를 단리하였다. 일차 B 세포를 기재된 바와 같이 (Tran et al., Science 344(3184):641-645 (2014) 참조), 200 U/ml 인간 IL-4 (Peprotech)가 보충된 B 세포 배지에서 7일 동안 인간 CD40L을 발현하는 NIH 3T3 세포와 1:1 비로 인큐베이션하였다. 이어서, B 세포를 수확하고 3일마다 3T3 CD40L 및 신선한 배지로 재자극시켰다. B 세포를 자극 2 또는 3의 +3일에 분석에 사용하였다.
사이토카인 방출 분석
ELISA 분석을 위해, 550,000개의 이펙터 T 세포를 96 둥근 바닥 플레이트에서 % 열 불 활성화된 소 태아 혈청이 보충된 RPMI (Gibco) 중에서 100,000개의 B 세포 또는 B-LCL 라인 및 10 ㎍/ml 또는 특정 농도의 펩티드와 배양하였다. 상등액 중의 IFN-γ를 기술적인 삼중으로 준비 완료된 인간 IFN-γ ELISA 키트 (ebiosciences)를 사용하여 정량하였다. 펩티드 첨가 1 시간 전에 첨가된 20 ㎍/ml 항체 항 클래스 I (Biolegend, cat. no. 311411) 항-HLA DR (clone L243, cat. no. 307611) 및 HLA-DQ (Abcam, clone spv-1, cat. no. ab23632)를 사용하여 HLA 차단 실험을 수행하였다. elispot 분석을 위해, 50,000개의 종양 침윤 림프세포를 인간 IFN-γ ELISpot-Pro 키트 (Mabtech)를 사용하여 CTL 배지에서 10 μg/ml의 각 펩티드의 최종 농도에서 펩티드 풀로 펄스된 200,000개의 자가 B 세포와 함께 인큐베이션하고 제조업자의 지침을 사용하여 전개시켰다.
HLA 식별
LCL 세포주 1331, DUCAF, VAVY, BM14, DEM 및 DEU가 이용되었다. 공동 배양 분석을 위해, LCL 세포주에 10 ㎍/ml의 BRAF 돌연변이 펩티드 또는 DMSO 대조군을 4시간 동안 펄싱한 다음, ELISA 분석 전에 PBS로 3회 세척하였다. 특정 클래스 II 대립유전자의 동정을 위해, T2A 스킵 서열에 의해 HLA-DQA1 0301 단백질에 연결된 HLA-DRB1 0404 단백질 또는 HLA-DQB1 0302 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 선형 DNA 단편을 Genestrings™ (Life Sciences)를 사용하여 합성하고, NEBuilder 클로닝 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 NotI 및 EcoRI (Thermo Fisher)로 선형화된 벡터 MP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14(12):1155-1168 (2003))에 클로닝한 뒤, 서열을 확인하였다. 레트로바이러스를 Sommermeyer 등 (Leukemia, 2015))에 의해 기술된 바와 같이 HLA DRB10301, DQA1 0501 및 DQB1 0201 (Research cell bank)에 대해 동형 접합성인 VAVY 세포주에 형질도입하였다. DRB1404에 대해 양성인 세포를 항체 DRB1-PE (Biolegend, cat. no. 362303)를 사용하여 FACSAria2 분류기에서 분류하고, DQB1에 대해 DQA1 03에 양성인 세포를 항 DQ 항체 클론 HLADQ1-FITC (Biolegend, cat. 318104)를 사용하여 분류하였다. BRAFV600E 펩티드로의 펄싱 및 펄싱 없이 분석을 수행하였다. ELISA 실험은 지시된 바와 같이 기술적인 중복 또는 삼중으로 수행되었으며 두 독립적인 실험을 나타낸다.
실시예 2
TIL에 의한 TCR 유전자 사용 확인
BRAFV600E-특이적 T 세포 및 TIL의 다른 T 세포에서 TCR 유전자 사용을 확인하기 위해 딥 서열분석을 수행하였다. 3개의 TCR Vβ 클로노형이 BRAFV600E 펩티드로 후처리 후 PBMC의 자극 후 현저한 확장을 나타내었고, 이들 서열은 IFN-γ 포획 후에 추가로 풍부해졌으며, 이는 돌연변이 펩티드에 대한 특이성을 가리킨다 (도 2G). TIL 주입 전에 수득된 종양, TIL 및 PBMC의 TCR Vβ 서열분석으로 종양에서 3개의 TCR Vβ 클론 모두와 TIL에서 3개 중 2개를 확인하였다. 모든 3개의 TCR Vb 서열은 전처리 PBMC에서 검출 수준 미만이었으며, 이는 종양 부위에서 풍부함을 가리킨다 (도 2H). 총 34개의 공통 Vβ 서열이 전체로 TIL 산물의 50%를 초과하여 구성되었다 (도 2I). 전처리 혈액에서는 이들 34개 클론 중 5개만이 검출되었는 데, 그 중 4개는 매우 낮은 빈도로 검출되었다 (도 2J). 4 계통-특이적 또는 C/T 항원 각각을 인식하는 CD8+ T 세포의 TCR 유전자 사용을 평가하기 위해, IFN-γ 포획을 사용하여 TIL로부터 이들 세포를 분류하고 TCR Vβ 사용에 대해 평가하였다. 분류된 세포에서 7개의 상이한 Vβ 서열이 확인되었고 TIL 산물에서 4.7% T 세포를 나타내었다 (도 2L-2O). 이들 7개의 클로노형 및 BRAF-특이적 클론 중 하나가 후처리 10 및 24개월에 얻은 혈액에서 검출되었다 (도 2J 및 2K). 클래스 I MHC 분류 신호에 대한 항원의 융합에 의해 항원이 엔도솜에 표적화되는 문헌 [Kreiter et al. (J. Immunol. 180(1):309-318 (2008))]에 기술된 방법을 이용해 엔도좀을 표적으로 하는 RNA 발현을 수행하였다. 유전자 합성 (Geneart, Life Sciences)에 의해 인간 HLA-B 유전자의 N 말단 25개 아미노산에 융합된 T7 프로모터, 이어 BamHI 제한 부위, 강화된 GFP의 암호화 서열, AgeI 제한 부위, 인간 HLA-B 유전자의 C 말단 55개 아미노산, 이어 인간 베타 글로빈 비번역 영역, 이어 30 뉴클레오티드 폴리 A 후부, 이어 폴리 A 후부에서 절단을 지시하는 SapI 제한 부위를 포함하는 mRNA 발현 작제물 pJV57을 작제하였다. E600 치환을 함유하는 5' AgeI 및 3' BamHI 측접 BRAF 아미노산을 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (Ultramers, Integrated DNA Technologies)를 AgeI/BamHI 소화된 pJV57에 결찰시킴으로써 작제물 pJV84를 클로닝하였다. 야생형 V600 아미노산을 함유하는 5' AgeI 및 3' BamHI 부위가 측접해 있는 BRAF 아미노산 575-624를 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (Ultramers, Integrated DNA Technologies)를 결찰시킴으로써 작제물 pJV85를 작제하였다. 이어서, pJV84 및 pJV85를 SapI (Thermo Fisher)로 선형화하고, Highscribe T7 ARCA mRNA 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 mRNA를 시험관 내에서 전사시킨 후, 제조업자의 지침에 따라 리튬 침전에 의해 정제하였다. Tran 등 (상동)에 의해 기재된 바와 같이 공동 배양 실험 16시간 전에 mRNA를 CD40L 자극된 B 세포에 전기천공시켰다.
실시예 3
TIL 산물의 표현형 특성
TIL 처리 후 BRAF-특이적 클론의 표현형 분석을 수행하였다 (도 3A-3C). BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포는 이펙터 기억 표현형 (CD45RA-CCR7-CD27-KLRG1+)을 나타내었고 낮은 수준의 PD-1을 발현하였다 (도 3A, 3B). BRAFV600E-특이적 세포의 대부분이 CXCR3 및 CCR4를 발현하였다. 세포의 일부는 또한 피부 호밍 마커 피부 림프구 관련 항원 (CLA)을 발현하였다. BRAFV600E 펩티드-활성화 세포는 때때로 조합하여 IFN-γ, TNF-α, IL-4 및 IL-21 (도 3C)을 생성하였다 (데이터는 나타내지 않음). 종합하면, 이들 데이터는 TIL 주입 후 순환 BRAF-특이적 CD4+ T 세포가 흑색종에서 돌연변이된 BRAF에 대한 수립된 기억 세포 면역 반응과 일치하는 혼합된 Th1/Th2 표현형을 가지고 있음을 제시한다.
실시예 4
BRAF V600E TCR의 작제 및 시험
자가-항원 반응성 CD8+ T 세포 단독의 입양 전달 후 흑색종의 지속적인 차도는 매우 드물다 (예를 들어, JJohnson et al., Blood 114(3):535-546 (2009); Yee et al., PNAS 99(25):16168-16173 (2002); Dudley et al., J. Immunother. 24(4):363-373 (2001) 참조). 이론에 구애없이, BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포는 직접적인 항종양 효과를 제공하고, 소수의 신항원을 함유한 종양에 대한 자기-항원 반응성 CD8+ T 세포의 지속성 및 기능을 돕는 것으로 여겨진다. International Histocompatibility Workgroup 데이터베이스 (Petersdorf, E., personal communication, International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation. 2017)에는 개인 29%에 BRAFV600E-특이적 CD4+ T 세포에 대한 대립유전자를 제한하는 HLA-DQA1*03/DQB1*03이 존재하고, 이 환자로부터 BRAFV600E-특이적 TCR 유전자의 단리는 TCR 조작된 T 세포로의 BRAF 돌연변이 종양을 갖는 환자에 대한 입양 요법을 가능하게 할 수 있다. 다양한 수준의 BRAF-반응성 클론을 갖는 샘플에서의 TCR Vα 서열분석으로 빈도가 3개의 TCR Vβ 서열과 상관된 4개의 TCR Vα 서열을 확인하였다 (도 2G).
확인된 3개의 TCRB 대립유전자 및 4개의 TRCA 대립유전자로부터의 4개의 TCR을 작제하고 항원-특이적 반응에 대해 시험하였다 (도 4A, 4B 및 5). 환자로부터의 우세성 TCR (pJV88)이 두 건강한 공여체로부터의 CD4+ T 세포에서 발현되었고 야생형 BRAF 서열이 아닌 BRAFV600E를 발현하는 세포에 특이성을 부여하였다 (도 2H). 환자로부터 두 번째로 우세한 Vβ 클론 및 가능한 알파 쇄 중 하나로부터 제조된 TCR pJV90은 약간의 활성을 나타내었고, 비특이적 기준선 활성화도 또한 나타내었다.
TCR Vb 및 Va 서열분석
임상 샘플로부터의 DNA를 제조업자의 지시에 따라 Qiagen DNeasy 또는 Qiamp 마이크로 DNA 키트를 사용하여 단리하였다. 인간 TCRB 서열분석 키트 (Adaptive Biotechnology)를 제조업자의 지시에 따라 사용하고, MiSeq (Fred Hutchinson Cancer Research Center Genomics core)를 사용하여 서열분석하고 Adaptive biotechnology 소프트웨어에 의해 데이터 분석를 수행하여 TCRB 서열분석을 수행하였다. 인간 TCRA 서열분석 서비스 (Adaptive Biotechnology)를 사용하여 TCRA 서열분석을 수행하였다.
T 세포 수용체 작제
베타 쇄에 이어 P2A 번역 스킵 서열, 이어서 쌍이룸을 용이하게 하기 위해 도입된 시스테인이 포함된 알파 쇄와 함께 Lim and Brown, RNA Biology 13(9):743-747 (2016))에서와 같은 우드척 간염 바이러스 X 단백질의 시작 코돈 및 추정 프로모터 영역에 6개의 점 돌연변이를 도입함으로써 추가로 변형된 벡터 PRRL (Jones et al., Hum. Gene Ther. 20(6):630-640 (2009))에서 TCR을 작제하였다 (Kuball et al., Blood 109(6):2331-2338 (2007) 참조). TRBV28 및 CDR3 및 TRBJ1-3 서열에 이어 잔기 57에서 시스테인 치환된 TCRB1 서열, 이어 P2A 스킵 서열, 및 TRAV21 및 CDR3 서열, 이어서 TRAJ43 및 TRAC 서열을 함유하는 코돈 최적화된 DNA 단편을 유전자 스트링 (Life Sciences)으로 합성하고, NEBuilder 클로닝 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 PstI 및 AscI (Thermo Fisher)로 선형화된 벡터 PRRL-SIN에 클로닝하고 서열을 검증하였다. 형질도입 1주 후, 항체 클론 8F10 (Thermo Scientific, cat. no. TCR2740)을 사용하여 Vbeta3.1 발현에 기초하여 세포를 분류하고 상기한 바와 같이 고속 확장을 통해 확장시켰다. T 세포를 고속 확장 14일째에 분석에 사용하거나 동결 보존하였다.
실시예 5
내인성 TCR의 CRISPR-매개 결실은 일시적인 BRAF-특이적 TCR의 발현 증가로 이어진다
합성 T 세포 수용체 서열의 T 세포로의 유전자 전달 후, 전달된 TCR 알파 및 베타 쇄는 발현 및 신호전달 절차에 대해 내인성 TCR 서브 유닛과 경쟁할 수 있다. 내인성 TCR의 결실이 전달된 TCR의 발현을 증가시켰는지의 여부를 조사하기 위해, 자극된 T 세포를 먼저 내인성 TCR 알파 (가이드 rna AGAGTCTCTCAGCTGGTACA; 서열 번호 136) 및 TCR 베타 (가이드 rna: GGAGAATGACGAGTGGACCC; 서열 번호 139) 불변 영역 유전자 (Ren et al., Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017)로부터의 것)의 절단을 지시하는 가이드 RNA 서열로 CRISPR-Cas9 리보핵단백질로 형질감염시켰다. 전기천공 증강제 (IDT)와 12 uM Cas9 단백질 (IDT) 20 uM 가이드 RNA (IDT)를 조립하고, 뉴클레오펙션 완충제 P3 (Lonza)에서 항CD3/항CD28 Dynabeads (Thermo-Fisher)로 자극하고 2일 후에 3 ul을 2e6 일차 인간 T 세포에 첨가한 다음, 프로그램 EH-115를 사용하여 AMAXA 4D 뉴클레오펙션 전기 천공기 (Lonza)로 뉴클레오펙션시켰다. 이 조합은 TCR 수용체 복합체의 CD3 성분의 염색에 의해 측정된 바와 같이, TCR 발현을 갖는 세포를 >99% 감소시켰다 (도 6A). 내인성 TCR의 유전자 결실이 BRAFV600E-특이적 TCR의 유전자 전달과 조합된 경우, 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같이, 세포 표면에서 전달된 T 세포 수용체의 발현이 증가된 것으로 관찰되었다 (도 6B).
상기 기재한 다양한 구체예는 추가 구체예를 제공하도록 조합될 수 있다. 2017년 8월 11일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/544,695호를 포함해 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물 모두는 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 구체예의 측면은 필요한 경우 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하여 변형되어 추가의 구체예를 제공할 수 있다.
상기 상세한 설명에 비추어 이들 및 다른 변화가 구체예에 대해 행해질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위가 본 명세서에 개시된 특정 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 이러한 청구범위로 주어지는 등가의 전 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해서 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center University of Washington Veatch, Joshua Riddell, Stanley R. Lee, Sylvia <120> BRAF SPECIFIC TCRS AND USES THEREOF <130> 360056.454WO <140> PCT/US2018/046350 <141> 2018-08-10 <150> US 62/544,695 <151> 2017-08-11 <160> 149 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 alpha chain variable domain <400> 1 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 100 105 110 Arg Gly Asn Asn Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val 115 120 125 Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro 130 135 <210> 2 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 alpha chain variable domain <400> 2 Met Arg Leu Val Ala Arg Val Thr Val Phe Leu Thr Phe Gly Thr Ile 1 5 10 15 Ile Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Thr Ser Met Asp Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Arg Ala Ala Asn Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Asn Glu 35 40 45 Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile His Ser Gln Gly Pro Gln Tyr Ile 50 55 60 Ile His Gly Leu Lys Asn Asn Glu Thr Asn Glu Met Ala Ser Leu Ile 65 70 75 80 Ile Thr Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Arg Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Ala Tyr Ser Gly 100 105 110 Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met Leu Leu Val Ser Pro 115 120 125 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro 130 135 <210> 3 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 alpha chain variable domain <400> 3 Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser 1 5 10 15 Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu 20 25 30 Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu 85 90 95 Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 100 105 110 Ile Thr Leu Asn Asn Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro 130 135 140 <210> 4 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 alpha chain variable domain <400> 4 Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser 1 5 10 15 Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu 20 25 30 Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu 85 90 95 Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 100 105 110 Thr Ser Asn Ala Gly Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr 115 120 125 Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro 130 135 <210> 5 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 beta chain variable domain <400> 5 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Asn Glu Gly Asn Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp 115 120 125 Leu Thr Val Val 130 <210> 6 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2 beta chain variable domain <400> 6 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Gly Ala Arg Gln Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr 115 120 125 Val Val 130 <210> 7 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 beta chain variable domain <400> 7 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Asn Tyr Gly 115 120 125 Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val 130 135 140 <210> 8 <211> 287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRBV28-01 <400> 8 gatgtgaaag taacccagag ctcgagatat ctagtcaaaa ggacgggaga gaaagttttt 60 ctggaatgtg tccaggatat ggaccatgaa aatatgttct ggtatcgaca agacccaggt 120 ctggggctac ggctgatcta tttctcatat gatgttaaaa tgaaagaaaa aggagatatt 180 cctgaggggt acagtgtctc tagagagaag aaggagcgct tctccctgat tctggagtcc 240 gccagcacca accagacatc tatgtacctc tgtgccagca gtttatg 287 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRBJ01-03 <400> 9 ctctggaaac accatatatt ttggagaggg aagttggctc actgttgtag 50 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRBJ01-02 <400> 10 ctaactatgg ctacaccttc ggttcgggga ccaggttaac cgttgtag 48 <210> 11 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAV21-01 <400> 11 aaacaggagg tgacgcagat tcctgcagct ctgagtgtcc cagaaggaga aaacttggtt 60 ctcaactgca gtttcactga tagcgctatt tacaacctcc agtggtttag gcaggaccct 120 gggaaaggtc tcacatctct gttgcttatt cagtcaagtc agagagagca aacaagtgga 180 agacttaatg cctcgctgga taaatcatca ggacgtagta ctttatacat tgcagcttct 240 cagcctggtg actcagccac ctacctctgt gctgtgagg 279 <210> 12 <211> 277 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAV26-01 <400> 12 gatgctaaga ccacccagcc cccctccatg gattgcgctg aaggaagagc tgcaaacctg 60 ccttgtaatc actctaccat cagtggaaat gagtatgtgt attggtatcg acagattcac 120 tcccaggggc cacagtatat cattcatggt ctaaaaaaca atgaaaccaa tgaaatggcc 180 tctctgatca tcacagaaga cagaaagtcc agcaccttga tcctgcccca cgctacgctg 240 agagacactg ctgtgtacta ttgcatcgtc agagtcg 277 <210> 13 <211> 277 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAV12-02 <400> 13 cagaaggagg tggagcagaa ttctggaccc ctcagtgttc cagagggagc cattgcctct 60 ctcaactgca cttacagtga ccgaggttcc cagtccttct tctggtacag acaatattct 120 gggaaaagcc ctgagttgat aatgttcata tactccaatg gtgacaaaga agatggaagg 180 tttacagcac agctcaataa agccagccag tatgtttctc tgctcatcag agactcccag 240 cccagtgatt cagccaccta cctctgtgcc gtgaaca 277 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAJ43-01 <400> 14 acaataacaa tgacatgcgc tttggagcag ggaccagact gacagtaaaa ccaa 54 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAJ11-01 <400> 15 tgaattcagg atacagcacc ctcacctttg ggaaggggac tatgcttcta gtctctccag 60 <210> 16 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAJ39-01 <400> 16 tgaataataa tgcaggcaac atgctcacct ttggaggggg aacaaggtta atggtcaaac 60 ccc 63 <210> 17 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCRAJ27-01 <400> 17 taacaccaat gcaggcaaat caacctttgg ggatgggact acgctcactg tgaagccaa 59 <210> 18 <211> 409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 alpha chain variable domain <400> 18 atggaaacac tgctgggcct gctgatcctg tggctgcaac tgcaatgggt gtccagcaag 60 caagaagtga ctcagatccc tgccgctctg tctgtgcctg agggcgaaaa cctggtcctg 120 aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttcaggca ggatccaggc 180 aagggcctga catccctgct gctgattcag agcagccaga gagagcagac cagcggcaga 240 ctgaatgcca gcctggataa gtcctccggc agaagcaccc tgtatatcgc cgcttctcag 300 ccaggcgata gcgccacata tctgtgtgcc gttcggagag gcaacaacga catgagattc 360 ggagccggca ccagactgac cgtgaagccc aacattcaga accccgatc 409 <210> 19 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 alpha chain variable domain <400> 19 atgagactgg tggccagagt gacagtgttc ctgaccttcg gcaccatcat cgacgccaag 60 accacacagc ccaccagcat ggattgtgcc gagggcagag ctgccaacct gccttgtaat 120 cacagcacca tcagcggcaa cgagtacgtg tactggtaca ggcagatcca ctctcagggc 180 cctcagtaca tcatccacgg cctgaagaac aacgagacaa acgagatggc ctctctgatc 240 atcaccgagg accgcaagag cagcaccctg attctgcctc acgccacact gagagacacc 300 gccgtgtact actgtatcgt gcgggcctac agcggctaca gcacactgac atttggcaag 360 ggcaccatgc tgctcgtgtc cccagacatt cagaaccccg atc 403 <210> 20 <211> 424 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 alpha chain variable domain <400> 20 atgaagtccc tgagagtgct gctggtcatc ctgtggctgc agctgtcttg ggtctggtcc 60 cagcagaaag aggtggaaca gaacagcggc cctctgtctg ttcctgaagg cgctatcgcc 120 tctctgaatt gcacctacag cgacagaggc agccagagct tcttctggta tcggcagtac 180 agcggcaaga gccccgagct gatcatgttc atctacagca acggcgacaa agaggacggc 240 cggtttacag cccagctgaa caaggccagc cagtacgtgt cactgctgat cagagacagc 300 cagcctagcg acagcgccac ctatctgtgt gccgtgatca ccctgaacaa caacgccggc 360 aacatgctga cctttggcgg cggaacacgg ctgatggtta agccccacat tcagaacccc 420 gatc 424 <210> 21 <211> 412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 alpha chain variable domain <400> 21 atgaagtccc tgagagtgct gctggtcatc ctgtggctgc agctgtcttg ggtctggtcc 60 cagcagaaag aggtggaaca gaacagcggc cctctgtccg ttcctgaagg cgccattgct 120 agcctgaatt gcacctacag cgaccggggc agccagagct tcttctggta taggcagtac 180 agcggcaaga gccccgagct gatcatgttc atctacagca acggcgacaa agaggacggc 240 cggtttacag cccagctgaa caaggccagc cagtacgtgt cactgctgat cagagacagc 300 cagcctagcg acagcgccac ctatctgtgt gccgtgacaa gcaatgccgg caagtccaca 360 tttggcgacg gcacaaccct gaccgtgaag cccaacattc agaaccccga tc 412 <210> 22 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 beta chain variable domain <400> 22 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgc gccagcaacg agggcaatag cggcaacacc 360 atctacttcg gcgaaggcag ctggctgacc gtggtg 396 <210> 23 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2 beta chain variable domain <400> 23 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagcggcg ccagacagat cccttacaca 360 tttggctccg gcaccagact gaccgtggtg 390 <210> 24 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 beta chain variable domain <400> 24 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagctctc tgtctgctgc cggcggaggc 360 tatggctaca ccttcaatta cggctacaca ttcggcagcg gcaccagact gaccgtggtg 420 <210> 25 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR alpha chain constant domain <400> 25 Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys 1 5 10 15 Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp 20 25 30 Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met 35 40 45 Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe 50 55 60 Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe 65 70 75 80 Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser 85 90 95 Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly 100 105 110 Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr 115 120 125 Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 <210> 26 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR beta chain constant domain <400> 26 Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 130 135 140 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 145 150 155 160 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 165 170 175 Phe <210> 27 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR alpha chain constant domain <400> 27 ctgcagtgta ccagctgcgg gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgc ctgttcaccg 60 acttcgacag ccagaccaac gtgtcccaga gcaaggacag cgacgtgtac atcaccgata 120 agtgcgtgct ggacatgcgg agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg gcctggtcca 180 acaagagcga cttcgcctgc gccaacgcct tcaacaacag cattatcccc gaggacacat 240 tcttcccaag ccccgagagc agctgcgacg tgaagctggt ggaaaagagc ttcgagacag 300 acaccaacct gaacttccag aacctcagcg tgatcggctt ccggatcctg ctgctgaagg 360 tggccggctt caacctgctg atgaccctgc ggctgtggtc cagctga 407 <210> 28 <211> 454 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR beta chain constant domain <400> 28 gaagatctga acaaagtgtt ccctccagag gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag 60 atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg tgcctggcca ccggcttttt tcccgatcac 120 gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct 180 cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac gactccagat actgcctgag cagcaggctg 240 agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc 300 tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc caggatagag ccaagcctgt gacacagatc 360 gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat tgtggcttta cctccgtgtc ctatcagcag 420 ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtatgag atcc 454 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 alpha chain CDR3 <400> 29 Cys Ala Val Arg Arg Gly Asn Asn Asp Met Arg Phe 1 5 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 alpha chain CDR3 <400> 30 Cys Ile Val Arg Ala Tyr Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 alpha chain CDR3 <400> 31 Cys Ala Val Ile Thr Leu Asn Asn Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe 1 5 10 15 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 alpha chain CDR3 <400> 32 Cys Ala Val Thr Ser Asn Ala Gly Lys Ser Thr Phe 1 5 10 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 beta chain CDR3 <400> 33 Cys Ala Ser Asn Glu Gly Asn Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 beta chain CDR3 <400> 34 Cys Ala Ser Gly Ala Arg Gln Ile Pro Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 beta chain CDR3 <400> 35 Cys Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15 <210> 36 <211> 766 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Human BRAF <400> 36 Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45 Asn Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu 85 90 95 Gln Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140 Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe 145 150 155 160 Leu Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile 195 200 205 Gly Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 210 215 220 Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys 225 230 235 240 Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Gln Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Pro Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro 325 330 335 Ser Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350 His Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn 355 360 365 Val His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg 370 375 380 Asp Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala 385 390 395 400 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu 405 410 415 Gln Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp 435 440 445 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly 450 455 460 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val 465 470 475 480 Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gln Gln Leu Gln 485 490 495 Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ala Ile Val 515 520 525 Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile 530 535 540 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr 545 550 555 560 Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp 565 570 575 Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile 580 585 590 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His 595 600 605 Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val 610 615 620 Ile Arg Met Gln Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr 625 630 635 640 Ala Phe Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gln Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys Ile His Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly Phe Gln Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His 755 760 765 <210> 37 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 27-mer BRAFV600E peptide <400> 37 Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Trp Ser Gly Ser His Gln Phe Glu Gln Leu 20 25 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 20-mer BRAFV600E peptide <400> 38 Asp Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser 1 5 10 15 Arg Trp Ser Gly 20 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 20-mer BRAFV600E peptide <400> 39 Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His Gln 1 5 10 15 Phe Glu Gln Leu 20 <210> 40 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HLADRB1 <400> 40 Met Val Cys Leu Lys Leu Pro Gly Gly Ser Cys Met Thr Ala Leu Thr 1 5 10 15 Val Thr Leu Met Val Leu Ser Ser Pro Leu Ala Leu Ala Gly Asp Thr 20 25 30 Arg Pro Arg Phe Leu Trp Gln Leu Lys Phe Glu Cys His Phe Phe Asn 35 40 45 Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Leu Glu Arg Cys Ile Tyr Asn Gln Glu 50 55 60 Glu Ser Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr 65 70 75 80 Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu 85 90 95 Leu Glu Gln Arg Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr 100 105 110 Gly Val Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val Glu Pro Lys Val 115 120 125 Thr Val Tyr Pro Ser Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu 130 135 140 Val Cys Ser Val Ser Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Arg Trp 145 150 155 160 Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Lys Ala Gly Val Val Ser Thr Gly Leu 165 170 175 Ile Gln Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met Leu Glu Thr 180 185 190 Val Pro Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Pro Ser 195 200 205 Val Thr Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser Glu Ser Ala 210 215 220 Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Val Gly Gly Phe Val Leu Gly Leu Leu 225 230 235 240 Phe Leu Gly Ala Gly Leu Phe Ile Tyr Phe Arg Asn Gln Lys Gly His 245 250 255 Ser Gly Leu Gln Pro Thr Gly Phe Leu Ser 260 265 <210> 41 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HLADQB10302 <400> 41 Met Ser Trp Lys Lys Ala Leu Arg Ile Pro Gly Gly Leu Arg Val Ala 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Met Leu Ala Met Leu Ser Thr Pro Val Ala Glu Gly 20 25 30 Arg Asp Ser Pro Glu Asp Phe Val Tyr Gln Phe Lys Gly Met Cys Tyr 35 40 45 Phe Thr Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Val Thr Arg Tyr Ile Tyr 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Val Tyr Arg 65 70 75 80 Ala Val Thr Pro Leu Gly Pro Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln 85 90 95 Lys Glu Val Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp Thr Val Cys Arg 100 105 110 His Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Arg Thr Thr Leu Gln Arg Arg Val Glu 115 120 125 Pro Thr Val Thr Ile Ser Pro Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His 130 135 140 Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Gln Ile Lys 145 150 155 160 Val Arg Trp Phe Arg Asn Asp Gln Glu Glu Thr Thr Gly Val Val Ser 165 170 175 Thr Pro Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met 180 185 190 Leu Glu Met Thr Pro Gln Arg Gly Asp Val Tyr Thr Cys His Val Glu 195 200 205 His Pro Ser Leu Gln Asn Pro Ile Ile Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Ser Ala Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Ile Gly Gly Phe Val Leu 225 230 235 240 Gly Leu Ile Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ile Ile His His Arg Ser Gln 245 250 255 Lys Gly Leu Leu His 260 <210> 42 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HLADQA103 <400> 42 Met Ile Leu Asn Lys Ala Leu Met Leu Gly Ala Leu Ala Leu Thr Thr 1 5 10 15 Val Met Ser Pro Cys Gly Gly Glu Asp Ile Val Ala Asp His Val Ala 20 25 30 Ser Tyr Gly Val Asn Leu Tyr Gln Ser Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Tyr 35 40 45 Ser His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Glu Phe Tyr Val Asp Leu Glu Arg 50 55 60 Lys Glu Thr Val Trp Gln Leu Pro Leu Phe Arg Arg Phe Arg Arg Phe 65 70 75 80 Asp Pro Gln Phe Ala Leu Thr Asn Ile Ala Val Leu Lys His Asn Leu 85 90 95 Asn Ile Val Ile Lys Arg Ser Asn Ser Thr Ala Ala Thr Asn Glu Val 100 105 110 Pro Glu Val Thr Val Phe Ser Lys Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro 115 120 125 Asn Thr Leu Ile Cys Leu Val Asp Asn Ile Phe Pro Pro Val Val Asn 130 135 140 Ile Thr Trp Leu Ser Asn Gly His Ser Val Thr Glu Gly Val Ser Glu 145 150 155 160 Thr Ser Phe Leu Ser Lys Ser Asp His Ser Phe Phe Lys Ile Ser Tyr 165 170 175 Leu Thr Phe Leu Pro Ser Ala Asp Glu Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu 180 185 190 His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile 195 200 205 Pro Thr Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr Val Val Cys Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Ser Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val Gly Thr Val Leu Ile Ile 225 230 235 240 Arg Gly Leu Arg Ser Val Gly Ala Ser Arg His Gln Gly Pro Leu 245 250 255 <210> 43 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HLADQB10302-P2A-HLADQBA103 <400> 43 Met Ser Trp Lys Lys Ala Leu Arg Ile Pro Gly Gly Leu Arg Val Ala 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Met Leu Ala Met Leu Ser Thr Pro Val Ala Glu Gly 20 25 30 Arg Asp Ser Pro Glu Asp Phe Val Tyr Gln Phe Lys Gly Met Cys Tyr 35 40 45 Phe Thr Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Val Thr Arg Tyr Ile Tyr 50 55 60 Asn Arg Glu Glu Tyr Ala Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Val Tyr Arg 65 70 75 80 Ala Val Thr Pro Leu Gly Pro Pro Ala Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln 85 90 95 Lys Glu Val Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp Thr Val Cys Arg 100 105 110 His Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Arg Thr Thr Leu Gln Arg Arg Val Glu 115 120 125 Pro Thr Val Thr Ile Ser Pro Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His 130 135 140 Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Gln Ile Lys 145 150 155 160 Val Arg Trp Phe Arg Asn Asp Gln Glu Glu Thr Thr Gly Val Val Ser 165 170 175 Thr Pro Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Ile Leu Val Met 180 185 190 Leu Glu Met Thr Pro Gln Arg Gly Asp Val Tyr Thr Cys His Val Glu 195 200 205 His Pro Ser Leu Gln Asn Pro Ile Ile Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser 210 215 220 Glu Ser Ala Gln Ser Lys Met Leu Ser Gly Ile Gly Gly Phe Val Leu 225 230 235 240 Gly Leu Ile Phe Leu Gly Leu Gly Leu Ile Ile His His Arg Ser Gln 245 250 255 Lys Gly Leu Leu His Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 260 265 270 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ile Leu Asn Lys 275 280 285 Ala Leu Met Leu Gly Ala Leu Ala Leu Thr Thr Val Met Ser Pro Cys 290 295 300 Gly Gly Glu Asp Ile Val Ala Asp His Val Ala Ser Tyr Gly Val Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gln Ser Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Tyr Ser His Glu Phe Asp 325 330 335 Gly Asp Glu Glu Phe Tyr Val Asp Leu Glu Arg Lys Glu Thr Val Trp 340 345 350 Gln Leu Pro Leu Phe Arg Arg Phe Arg Arg Phe Asp Pro Gln Phe Ala 355 360 365 Leu Thr Asn Ile Ala Val Leu Lys His Asn Leu Asn Ile Val Ile Lys 370 375 380 Arg Ser Asn Ser Thr Ala Ala Thr Asn Glu Val Pro Glu Val Thr Val 385 390 395 400 Phe Ser Lys Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys 405 410 415 Leu Val Asp Asn Ile Phe Pro Pro Val Val Asn Ile Thr Trp Leu Ser 420 425 430 Asn Gly His Ser Val Thr Glu Gly Val Ser Glu Thr Ser Phe Leu Ser 435 440 445 Lys Ser Asp His Ser Phe Phe Lys Ile Ser Tyr Leu Thr Phe Leu Pro 450 455 460 Ser Ala Asp Glu Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Asp 465 470 475 480 Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile Pro Thr Pro Met Ser 485 490 495 Glu Leu Thr Glu Thr Val Val Cys Ala Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu 500 505 510 Val Gly Ile Val Val Gly Thr Val Leu Ile Ile Arg Gly Leu Arg Ser 515 520 525 Val Gly Ala Ser Arg His Gln Gly Pro Leu 530 535 <210> 44 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Porcine teschovirus-1 2A (P2A) peptide <400> 44 ggcagcggcg ccaccaactt tagcctgctg aaacaggctg gcgacgtgga agagaacccc 60 ggacct 66 <210> 45 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Porcine teschovirus-1 2A (P2A) peptide <400> 45 ggctctggcg ccaccaactt tagcctgctg aaacaggctg gcgacgtgga agagaacccc 60 ggacct 66 <210> 46 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Thoseaasigna virus 2A (T2A) peptide <400> 46 ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60 cct 63 <210> 47 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Equine rhinitis A virus (ERAV) 2A (E2A) peptide <400> 47 ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60 cctggacct 69 <210> 48 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Foot-and-Mouth disease virus 2A (F2A) peptide <400> 48 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gacct 75 <210> 49 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Porcine teschovirus-1 2A (P2A) <400> 49 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 50 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Thoseaasigna virus 2A (T2A) peptide <400> 50 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Equine rhinitis A virus (ERAV) 2A (E2A) peptide <400> 51 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 52 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Foot-and-Mouth disease virus 2A (F2A) peptide <400> 52 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Glycine-Serine linker <400> 53 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Glycine-Serine linker <400> 54 Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ser <210> 55 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 alpha chain (full-length) <400> 55 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 100 105 110 Arg Gly Asn Asn Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val 115 120 125 Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp 130 135 140 Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 145 150 155 160 Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 165 170 175 Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 180 185 190 Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn 195 200 205 Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 210 215 220 Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu 225 230 235 240 Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys 245 250 255 Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 56 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 alpha chain (full-length) <400> 56 Met Arg Leu Val Ala Arg Val Thr Val Phe Leu Thr Phe Gly Thr Ile 1 5 10 15 Ile Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Thr Ser Met Asp Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Arg Ala Ala Asn Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Asn Glu 35 40 45 Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile His Ser Gln Gly Pro Gln Tyr Ile 50 55 60 Ile His Gly Leu Lys Asn Asn Glu Thr Asn Glu Met Ala Ser Leu Ile 65 70 75 80 Ile Thr Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Arg Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Val Arg Ala Tyr Ser Gly 100 105 110 Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met Leu Leu Val Ser Pro 115 120 125 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 130 135 140 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 145 150 155 160 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys 165 170 175 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 180 185 190 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 195 200 205 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp 210 215 220 Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe 225 230 235 240 Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 245 250 255 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 <210> 57 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 alpha chain (full-length) <400> 57 Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser 1 5 10 15 Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu 20 25 30 Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu 85 90 95 Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 100 105 110 Ile Thr Leu Asn Asn Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val 130 135 140 Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe 145 150 155 160 Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp 165 170 175 Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe 180 185 190 Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys 195 200 205 Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro 210 215 220 Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu 225 230 235 240 Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg 245 250 255 Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg 260 265 270 Leu Trp Ser Ser 275 <210> 58 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 alpha chain (full-length) <400> 58 Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser 1 5 10 15 Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu 20 25 30 Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu 85 90 95 Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 100 105 110 Thr Ser Asn Ala Gly Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr 115 120 125 Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg 130 135 140 Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp 145 150 155 160 Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr 165 170 175 Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser 180 185 190 Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe 195 200 205 Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser 210 215 220 Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn 225 230 235 240 Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu 245 250 255 Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 59 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 alpha chain (full-length) <400> 59 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Asn Glu Gly Asn Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp 115 120 125 Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Phe 305 <210> 60 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 and 2-2 beta chain (full-length) <400> 60 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Gly Ala Arg Gln Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr 115 120 125 Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 130 135 140 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 145 150 155 160 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 165 170 175 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro 180 185 190 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 195 200 205 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 210 215 220 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 225 230 235 240 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 245 250 255 Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val 260 265 270 Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 275 280 285 Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg 290 295 300 Lys Asp Phe 305 <210> 61 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 beta chain (full-length) <400> 61 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Asn Tyr Gly 115 120 125 Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn 130 135 140 Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu 145 150 155 160 Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe 165 170 175 Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val 180 185 190 His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala 195 200 205 Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala 210 215 220 Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 225 230 235 240 Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro 245 250 255 Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly 260 265 270 Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu 275 280 285 Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser 290 295 300 Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 305 310 315 <210> 62 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 alpha chain (full-length) <400> 62 atggaaacac tgctgggcct gctgatcctg tggctgcaac tgcaatgggt gtccagcaag 60 caagaagtga ctcagatccc tgccgctctg tctgtgcctg agggcgaaaa cctggtcctg 120 aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttcaggca ggatccaggc 180 aagggcctga catccctgct gctgattcag agcagccaga gagagcagac cagcggcaga 240 ctgaatgcca gcctggataa gtcctccggc agaagcaccc tgtatatcgc cgcttctcag 300 ccaggcgata gcgccacata tctgtgtgcc gttcggagag gcaacaacga catgagattc 360 ggagccggca ccagactgac cgtgaagccc aacattcaga accccgatcc tgcagtgtac 420 cagctgcggg acagcaagag cagcgacaag agcgtgtgcc tgttcaccga cttcgacagc 480 cagaccaacg tgtcccagag caaggacagc gacgtgtaca tcaccgataa gtgcgtgctg 540 gacatgcgga gcatggactt caagagcaac agcgccgtgg cctggtccaa caagagcgac 600 ttcgcctgcg ccaacgcctt caacaacagc attatccccg aggacacatt cttcccaagc 660 cccgagagca gctgcgacgt gaagctggtg gaaaagagct tcgagacaga caccaacctg 720 aacttccaga acctcagcgt gatcggcttc cggatcctgc tgctgaaggt ggccggcttc 780 aacctgctga tgaccctgcg gctgtggtcc agctga 816 <210> 63 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 alpha chain (full-length) <400> 63 atgagactgg tggccagagt gacagtgttc ctgaccttcg gcaccatcat cgacgccaag 60 accacacagc ccaccagcat ggattgtgcc gagggcagag ctgccaacct gccttgtaat 120 cacagcacca tcagcggcaa cgagtacgtg tactggtaca ggcagatcca ctctcagggc 180 cctcagtaca tcatccacgg cctgaagaac aacgagacaa acgagatggc ctctctgatc 240 atcaccgagg accgcaagag cagcaccctg attctgcctc acgccacact gagagacacc 300 gccgtgtact actgtatcgt gcgggcctac agcggctaca gcacactgac atttggcaag 360 ggcaccatgc tgctcgtgtc cccagacatt cagaaccccg atcctgcagt gtaccagctg 420 cgggacagca agagcagcga caagagcgtg tgcctgttca ccgacttcga cagccagacc 480 aacgtgtccc agagcaagga cagcgacgtg tacatcaccg ataagtgcgt gctggacatg 540 cggagcatgg acttcaagag caacagcgcc gtggcctggt ccaacaagag cgacttcgcc 600 tgcgccaacg ccttcaacaa cagcattatc cccgaggaca cattcttccc aagccccgag 660 agcagctgcg acgtgaagct ggtggaaaag agcttcgaga cagacaccaa cctgaacttc 720 cagaacctca gcgtgatcgg cttccggatc ctgctgctga aggtggccgg cttcaacctg 780 ctgatgaccc tgcggctgtg gtccagctga 810 <210> 64 <211> 831 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 alpha chain (full-length) <400> 64 atgaagtccc tgagagtgct gctggtcatc ctgtggctgc agctgtcttg ggtctggtcc 60 cagcagaaag aggtggaaca gaacagcggc cctctgtctg ttcctgaagg cgctatcgcc 120 tctctgaatt gcacctacag cgacagaggc agccagagct tcttctggta tcggcagtac 180 agcggcaaga gccccgagct gatcatgttc atctacagca acggcgacaa agaggacggc 240 cggtttacag cccagctgaa caaggccagc cagtacgtgt cactgctgat cagagacagc 300 cagcctagcg acagcgccac ctatctgtgt gccgtgatca ccctgaacaa caacgccggc 360 aacatgctga cctttggcgg cggaacacgg ctgatggtta agccccacat tcagaacccc 420 gatcctgcag tgtaccagct gcgggacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc 480 accgacttcg acagccagac caacgtgtcc cagagcaagg acagcgacgt gtacatcacc 540 gataagtgcg tgctggacat gcggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg 600 tccaacaaga gcgacttcgc ctgcgccaac gccttcaaca acagcattat ccccgaggac 660 acattcttcc caagccccga gagcagctgc gacgtgaagc tggtggaaaa gagcttcgag 720 acagacacca acctgaactt ccagaacctc agcgtgatcg gcttccggat cctgctgctg 780 aaggtggccg gcttcaacct gctgatgacc ctgcggctgt ggtccagctg a 831 <210> 65 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 alpha chain (full-length) <400> 65 atgaagtccc tgagagtgct gctggtcatc ctgtggctgc agctgtcttg ggtctggtcc 60 cagcagaaag aggtggaaca gaacagcggc cctctgtccg ttcctgaagg cgccattgct 120 agcctgaatt gcacctacag cgaccggggc agccagagct tcttctggta taggcagtac 180 agcggcaaga gccccgagct gatcatgttc atctacagca acggcgacaa agaggacggc 240 cggtttacag cccagctgaa caaggccagc cagtacgtgt cactgctgat cagagacagc 300 cagcctagcg acagcgccac ctatctgtgt gccgtgacaa gcaatgccgg caagtccaca 360 tttggcgacg gcacaaccct gaccgtgaag cccaacattc agaaccccga tcctgcagtg 420 taccagctgc gggacagcaa gagcagcgac aagagcgtgt gcctgttcac cgacttcgac 480 agccagacca acgtgtccca gagcaaggac agcgacgtgt acatcaccga taagtgcgtg 540 ctggacatgc ggagcatgga cttcaagagc aacagcgccg tggcctggtc caacaagagc 600 gacttcgcct gcgccaacgc cttcaacaac agcattatcc ccgaggacac attcttccca 660 agccccgaga gcagctgcga cgtgaagctg gtggaaaaga gcttcgagac agacaccaac 720 ctgaacttcc agaacctcag cgtgatcggc ttccggatcc tgctgctgaa ggtggccggc 780 ttcaacctgc tgatgaccct gcggctgtgg tccagctga 819 <210> 66 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 beta chain (full-length) <400> 66 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgc gccagcaacg agggcaatag cggcaacacc 360 atctacttcg gcgaaggcag ctggctgacc gtggtggaag atctgaacaa agtgttccct 420 ccagaggtgg ccgtgttcga gccttctgag gccgagatca gccacacaca gaaagccaca 480 ctcgtgtgcc tggccaccgg cttttttccc gatcacgtgg aactgtcttg gtgggtcaac 540 ggcaaagagg tgcacagcgg cgtctgtacc gatcctcagc ctctgaaaga gcagcccgct 600 ctgaacgact ccagatactg cctgagcagc aggctgagag tgtccgccac cttctggcag 660 aaccccagaa accacttcag atgccaggtg cagttctacg gcctgagcga gaacgatgag 720 tggacccagg atagagccaa gcctgtgaca cagatcgtgt ctgccgaagc ctggggcaga 780 gccgattgtg gctttacctc cgtgtcctat cagcagggcg tgctgtctgc caccatcctg 840 tatgagatcc tgctgggcaa agccactctg tacgccgtgc tggtgtctgc cctggtgctg 900 atggccatgg tcaagcggaa ggatttt 927 <210> 67 <211> 921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 and 2-2 beta chain (full-length) <400> 67 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagcggcg ccagacagat cccttacaca 360 tttggctccg gcaccagact gaccgtggtg gaagatctga acaaagtgtt ccctccagag 420 gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg 480 tgcctggcca ccggcttttt tcccgatcac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540 gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac 600 gactccagat actgcctgag cagcaggctg agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc 660 agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 720 caggatagag ccaagcctgt gacacagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 780 tgtggcttta cctccgtgtc ctatcagcag ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtatgag 840 atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 900 atggtcaagc ggaaggattt t 921 <210> 68 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 beta chain (full-length) <400> 68 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagctctc tgtctgctgc cggcggaggc 360 tatggctaca ccttcaatta cggctacaca ttcggcagcg gcaccagact gaccgtggtg 420 gaagatctga acaaagtgtt ccctccagag gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag 480 atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg tgcctggcca ccggcttttt tcccgatcac 540 gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct 600 cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac gactccagat actgcctgag cagcaggctg 660 agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc 720 tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc caggatagag ccaagcctgt gacacagatc 780 gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat tgtggcttta cctccgtgtc ctatcagcag 840 ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtatgag atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc 900 gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc atggtcaagc ggaaggattt t 951 <210> 69 <211> 602 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 (beta-P2A-alpha) <400> 69 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Asn Glu Gly Asn Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp 115 120 125 Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys 305 310 315 320 Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Leu Leu 325 330 335 Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser Lys Gln 340 345 350 Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly Glu Asn 355 360 365 Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn Leu Gln 370 375 380 Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ile 385 390 395 400 Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala Ser Leu 405 410 415 Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser Gln Pro 420 425 430 Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Arg Gly Asn Asn Asp 435 440 445 Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile Gln 450 455 460 Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp 465 470 475 480 Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser 485 490 495 Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp 500 505 510 Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn 515 520 525 Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro 530 535 540 Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu 545 550 555 560 Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu 565 570 575 Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn 580 585 590 Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 <210> 70 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 (beta-P2A-alpha) <400> 70 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Gly Ala Arg Gln Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr 115 120 125 Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 130 135 140 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 145 150 155 160 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 165 170 175 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro 180 185 190 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 195 200 205 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 210 215 220 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 225 230 235 240 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 245 250 255 Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val 260 265 270 Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 275 280 285 Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg 290 295 300 Lys Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 305 310 315 320 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Leu Val Ala Arg Val 325 330 335 Thr Val Phe Leu Thr Phe Gly Thr Ile Ile Asp Ala Lys Thr Thr Gln 340 345 350 Pro Thr Ser Met Asp Cys Ala Glu Gly Arg Ala Ala Asn Leu Pro Cys 355 360 365 Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Asn Glu Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln 370 375 380 Ile His Ser Gln Gly Pro Gln Tyr Ile Ile His Gly Leu Lys Asn Asn 385 390 395 400 Glu Thr Asn Glu Met Ala Ser Leu Ile Ile Thr Glu Asp Arg Lys Ser 405 410 415 Ser Thr Leu Ile Leu Pro His Ala Thr Leu Arg Asp Thr Ala Val Tyr 420 425 430 Tyr Cys Ile Val Arg Ala Tyr Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly 435 440 445 Lys Gly Thr Met Leu Leu Val Ser Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro 450 455 460 Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys 465 470 475 480 Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp 485 490 495 Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met 500 505 510 Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe 515 520 525 Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe 530 535 540 Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser 545 550 555 560 Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly 565 570 575 Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr 580 585 590 Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 <210> 71 <211> 605 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 amino acid (beta-P2A-alpha) <400> 71 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Gly Ala Arg Gln Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr 115 120 125 Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 130 135 140 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 145 150 155 160 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 165 170 175 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro 180 185 190 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 195 200 205 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 210 215 220 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 225 230 235 240 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 245 250 255 Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val 260 265 270 Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu 275 280 285 Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg 290 295 300 Lys Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 305 310 315 320 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Ser Leu Arg Val Leu 325 330 335 Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys 340 345 350 Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile 355 360 365 Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe 370 375 380 Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile 385 390 395 400 Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn 405 410 415 Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser 420 425 430 Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Ile Thr Leu Asn Asn Asn Ala 435 440 445 Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Met Val Lys Pro 450 455 460 His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 465 470 475 480 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 485 490 495 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys 500 505 510 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 515 520 525 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 530 535 540 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp 545 550 555 560 Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe 565 570 575 Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 580 585 590 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 605 <210> 72 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 amino acid (beta-P2A-alpha) <400> 72 Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys 20 25 30 Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His 35 40 45 Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Asn Tyr Gly 115 120 125 Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn 130 135 140 Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu 145 150 155 160 Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe 165 170 175 Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val 180 185 190 His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala 195 200 205 Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala 210 215 220 Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 225 230 235 240 Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro 245 250 255 Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly 260 265 270 Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu 275 280 285 Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser 290 295 300 Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Gly Ser Gly 305 310 315 320 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 325 330 335 Pro Gly Pro Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu 340 345 350 Gln Leu Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser 355 360 365 Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr 370 375 380 Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser 385 390 395 400 Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys 405 410 415 Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val 420 425 430 Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu 435 440 445 Cys Ala Val Thr Ser Asn Ala Gly Lys Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr 450 455 460 Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp 465 470 475 <210> 73 <211> 1809 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR1 (beta-P2A-alpha) <400> 73 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgc gccagcaacg agggcaatag cggcaacacc 360 atctacttcg gcgaaggcag ctggctgacc gtggtggaag atctgaacaa agtgttccct 420 ccagaggtgg ccgtgttcga gccttctgag gccgagatca gccacacaca gaaagccaca 480 ctcgtgtgcc tggccaccgg cttttttccc gatcacgtgg aactgtcttg gtgggtcaac 540 ggcaaagagg tgcacagcgg cgtctgtacc gatcctcagc ctctgaaaga gcagcccgct 600 ctgaacgact ccagatactg cctgagcagc aggctgagag tgtccgccac cttctggcag 660 aaccccagaa accacttcag atgccaggtg cagttctacg gcctgagcga gaacgatgag 720 tggacccagg atagagccaa gcctgtgaca cagatcgtgt ctgccgaagc ctggggcaga 780 gccgattgtg gctttacctc cgtgtcctat cagcagggcg tgctgtctgc caccatcctg 840 tatgagatcc tgctgggcaa agccactctg tacgccgtgc tggtgtctgc cctggtgctg 900 atggccatgg tcaagcggaa ggattttggc agcggcgcca ccaactttag cctgctgaaa 960 caggctggcg acgtggaaga gaaccccgga cctatggaaa cactgctggg cctgctgatc 1020 ctgtggctgc aactgcaatg ggtgtccagc aagcaagaag tgactcagat ccctgccgct 1080 ctgtctgtgc ctgagggcga aaacctggtc ctgaactgca gcttcaccga cagcgccatc 1140 tacaacctgc agtggttcag gcaggatcca ggcaagggcc tgacatccct gctgctgatt 1200 cagagcagcc agagagagca gaccagcggc agactgaatg ccagcctgga taagtcctcc 1260 ggcagaagca ccctgtatat cgccgcttct cagccaggcg atagcgccac atatctgtgt 1320 gccgttcgga gaggcaacaa cgacatgaga ttcggagccg gcaccagact gaccgtgaag 1380 cccaacattc agaaccccga tcctgcagtg taccagctgc gggacagcaa gagcagcgac 1440 aagagcgtgt gcctgttcac cgacttcgac agccagacca acgtgtccca gagcaaggac 1500 agcgacgtgt acatcaccga taagtgcgtg ctggacatgc ggagcatgga cttcaagagc 1560 aacagcgccg tggcctggtc caacaagagc gacttcgcct gcgccaacgc cttcaacaac 1620 agcattatcc ccgaggacac attcttccca agccccgaga gcagctgcga cgtgaagctg 1680 gtggaaaaga gcttcgagac agacaccaac ctgaacttcc agaacctcag cgtgatcggc 1740 ttccggatcc tgctgctgaa ggtggccggc ttcaacctgc tgatgaccct gcggctgtgg 1800 tccagctga 1809 <210> 74 <211> 1797 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-1 (beta-P2A-alpha) <400> 74 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagcggcg ccagacagat cccttacaca 360 tttggctccg gcaccagact gaccgtggtg gaagatctga acaaagtgtt ccctccagag 420 gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg 480 tgcctggcca ccggcttttt tcccgatcac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540 gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac 600 gactccagat actgcctgag cagcaggctg agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc 660 agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 720 caggatagag ccaagcctgt gacacagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 780 tgtggcttta cctccgtgtc ctatcagcag ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtatgag 840 atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 900 atggtcaagc ggaaggattt tggctctggc gccaccaact ttagcctgct gaaacaggct 960 ggcgacgtgg aagagaaccc cggacctatg agactggtgg ccagagtgac agtgttcctg 1020 accttcggca ccatcatcga cgccaagacc acacagccca ccagcatgga ttgtgccgag 1080 ggcagagctg ccaacctgcc ttgtaatcac agcaccatca gcggcaacga gtacgtgtac 1140 tggtacaggc agatccactc tcagggccct cagtacatca tccacggcct gaagaacaac 1200 gagacaaacg agatggcctc tctgatcatc accgaggacc gcaagagcag caccctgatt 1260 ctgcctcacg ccacactgag agacaccgcc gtgtactact gtatcgtgcg ggcctacagc 1320 ggctacagca cactgacatt tggcaagggc accatgctgc tcgtgtcccc agacattcag 1380 aaccccgatc ctgcagtgta ccagctgcgg gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgc 1440 ctgttcaccg acttcgacag ccagaccaac gtgtcccaga gcaaggacag cgacgtgtac 1500 atcaccgata agtgcgtgct ggacatgcgg agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg 1560 gcctggtcca acaagagcga cttcgcctgc gccaacgcct tcaacaacag cattatcccc 1620 gaggacacat tcttcccaag ccccgagagc agctgcgacg tgaagctggt ggaaaagagc 1680 ttcgagacag acaccaacct gaacttccag aacctcagcg tgatcggctt ccggatcctg 1740 ctgctgaagg tggccggctt caacctgctg atgaccctgc ggctgtggtc cagctga 1797 <210> 75 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR2-2 amino acid (beta-P2A-alpha) <400> 75 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagcggcg ccagacagat cccttacaca 360 tttggctccg gcaccagact gaccgtggtg gaagatctga acaaagtgtt ccctccagag 420 gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg 480 tgcctggcca ccggcttttt tcccgatcac gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa 540 gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac 600 gactccagat actgcctgag cagcaggctg agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc 660 agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 720 caggatagag ccaagcctgt gacacagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 780 tgtggcttta cctccgtgtc ctatcagcag ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtatgag 840 atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 900 atggtcaagc ggaaggattt tggctctggc gccaccaact ttagcctgct gaaacaggct 960 ggcgacgtgg aagagaaccc cggacctatg aagtccctga gagtgctgct ggtcatcctg 1020 tggctgcagc tgtcttgggt ctggtcccag cagaaagagg tggaacagaa cagcggccct 1080 ctgtctgttc ctgaaggcgc tatcgcctct ctgaattgca cctacagcga cagaggcagc 1140 cagagcttct tctggtatcg gcagtacagc ggcaagagcc ccgagctgat catgttcatc 1200 tacagcaacg gcgacaaaga ggacggccgg tttacagccc agctgaacaa ggccagccag 1260 tacgtgtcac tgctgatcag agacagccag cctagcgaca gcgccaccta tctgtgtgcc 1320 gtgatcaccc tgaacaacaa cgccggcaac atgctgacct ttggcggcgg aacacggctg 1380 atggttaagc cccacattca gaaccccgat cctgcagtgt accagctgcg ggacagcaag 1440 agcagcgaca agagcgtgtg cctgttcacc gacttcgaca gccagaccaa cgtgtcccag 1500 agcaaggaca gcgacgtgta catcaccgat aagtgcgtgc tggacatgcg gagcatggac 1560 ttcaagagca acagcgccgt ggcctggtcc aacaagagcg acttcgcctg cgccaacgcc 1620 ttcaacaaca gcattatccc cgaggacaca ttcttcccaa gccccgagag cagctgcgac 1680 gtgaagctgg tggaaaagag cttcgagaca gacaccaacc tgaacttcca gaacctcagc 1740 gtgatcggct tccggatcct gctgctgaag gtggccggct tcaacctgct gatgaccctg 1800 cggctgtggt ccagctga 1818 <210> 76 <211> 1429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TCR3 amino acid (beta-P2A-alpha) <400> 76 atgggaatta gactgctgtg cagagtggcc ttctgcttcc tggctgttgg cctggtggac 60 gtgaaagtga cccagagcag cagatacctg gtcaagagaa ccggcgagaa ggtgttcctg 120 gaatgcgtgc aggacatgga ccacgagaat atgttctggt acagacagga ccccggcctg 180 ggcctgagac tgatctactt cagctacgac gtgaagatga aggaaaaggg cgacatcccc 240 gagggctaca gcgtgtccag agagaagaaa gagcggttca gcctgatcct ggaaagcgcc 300 agcaccaacc agaccagcat gtacctgtgt gccagctctc tgtctgctgc cggcggaggc 360 tatggctaca ccttcaatta cggctacaca ttcggcagcg gcaccagact gaccgtggtg 420 gaagatctga acaaagtgtt ccctccagag gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag 480 atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg tgcctggcca ccggcttttt tcccgatcac 540 gtggaactgt cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg taccgatcct 600 cagcctctga aagagcagcc cgctctgaac gactccagat actgcctgag cagcaggctg 660 agagtgtccg ccaccttctg gcagaacccc agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc 720 tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc caggatagag ccaagcctgt gacacagatc 780 gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat tgtggcttta cctccgtgtc ctatcagcag 840 ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtatgag atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc 900 gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc atggtcaagc ggaaggattt tggcagcggc 960 gccaccaact ttagcctgct gaaacaggct ggcgacgtgg aagagaaccc cggacctatg 1020 aagtccctga gagtgctgct ggtcatcctg tggctgcagc tgtcttgggt ctggtcccag 1080 cagaaagagg tggaacagaa cagcggccct ctgtccgttc ctgaaggcgc cattgctagc 1140 ctgaattgca cctacagcga ccggggcagc cagagcttct tctggtatag gcagtacagc 1200 ggcaagagcc ccgagctgat catgttcatc tacagcaacg gcgacaaaga ggacggccgg 1260 tttacagccc agctgaacaa ggccagccag tacgtgtcac tgctgatcag agacagccag 1320 cctagcgaca gcgccaccta tctgtgtgcc gtgacaagca atgccggcaa gtccacattt 1380 ggcgacggca caaccctgac cgtgaagccc aacattcaga accccgatc 1429 <210> 77 <211> 8298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence pRRLSIN-P2A-aWPRE-PST1 <400> 77 tcgagggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct agcttaagta acgccatttt 60 gcaaggcatg gaaaatacat aactgagaat agagaagttc agatcaaggt taggaacaga 120 gagacagcag aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca 180 gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat 240 cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac 300 caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag 360 cccacaaccc ctcactcggc gcgccggcca ccatgagcaa ccaggtgctg tgctgcgtgg 420 tgctgtgttt cctgggcgcc aacaccgtgg acggcggcat cacccagagc cccaagtacc 480 tgttccggaa agagggccag aacgtcaccc tgagctgcga gcagaacctg aaccacgacg 540 ccatgtactg gtacagacag gaccccggac agggcctgcg gctgatctac tacagccaga 600 tcgtgaacga cttccagaag ggagatatcg ccgagggcta cagcgtgtcc agagagaaga 660 aagagtcctt cccactgacc gtgaccagcg cccagaagaa ccccaccgcc ttctacctgt 720 gcgccagctc tcctggcgcc ctgtacgagc agtacttcgg ccctggcacc cggctgacag 780 tgaccgagga cctgaagaac gtgttccccc cagaggtggc cgtgttcgag cctagcgagg 840 ccgagatcag ccacacccag aaagccaccc tcgtgtgcct ggccaccggc ttttaccccg 900 accacgtgga actgtcttgg tgggtcaacg gcaaagaggt gcacagcggc gtctgcaccg 960 acccccagcc cctgaaagag cagcccgccc tgaacgacag ccggtactgt ctgagcagca 1020 gactgagagt gtccgccacc ttctggcaga acccccggaa ccacttcaga tgccaggtgc 1080 agttctacgg cctgagcgag aacgacgagt ggacccagga ccgggccaag cccgtgaccc 1140 agatcgtgtc tgctgaggcc tggggcagag ccgattgcgg cttcaccagc gagagctacc 1200 agcagggcgt gctgagcgcc accatcctgt acgagatcct gctgggcaag gccaccctgt 1260 acgccgtgct ggtgtccgcc ctggtgctga tggccatggt caagcggaag gacagccggg 1320 gcggttccgg agccacgaac ttctctctgt taaagcaagc aggagacgtg gaagaaaacc 1380 ccggtcccat gaccagcatc cgggccgtgt tcatcttcct gtggctgcag ctggacctcg 1440 tcaacggcga gaacgtggaa cagcacccca gcaccctgag cgtgcaggaa ggcgacagcg 1500 ccgtcatcaa gtgcacctac agcgactccg ccagcaacta cttcccctgg tacaagcagg 1560 aactgggcaa gcggccccag ctgatcatcg acatccggtc caacgtgggc gagaagaagg 1620 accagcggat cgccgtgacc ctgaacaaga ccgccaagca cttcagcctg cacatcaccg 1680 agacacagcc cgaggactcc gccgtgtact tctgtgccgc caccgaggac taccagctga 1740 tctggggagc cggcaccaag ctgatcatta agcccgacat ccagaacccc gaccctgcag 1800 tgtaccagct gcgggacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc accgacttcg 1860 acagccagac caacgtgtcc cagagcaagg acagcgacgt gtacatcacc gataagtgcg 1920 tgctggacat gcggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg tccaacaaga 1980 gcgacttcgc ctgcgccaac gccttcaaca acagcattat ccccgaggac acattcttcc 2040 caagccccga gagcagctgc gacgtgaagc tggtggaaaa gagcttcgag acagacacca 2100 acctgaactt ccagaacctc agcgtgatcg gcttccggat cctgctgctg aaggtggccg 2160 gcttcaacct gctgatgacc ctgcggctgt ggtccagctg agtcgacaat caacctctgg 2220 attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 2280 gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 2340 tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 2400 ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 2460 ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 2520 aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 2580 attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca 2640 cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 2700 ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 2760 agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt 2820 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 2880 actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc 2940 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 3000 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 3060 ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag 3120 tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag 3180 tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 3240 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 3300 tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 3360 tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 3420 tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcgtcgag 3480 acgtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac 3540 aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 3600 ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 3660 gcagcctgaa tggcgaatgg cgcgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 3720 tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 3780 ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg 3840 ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt 3900 agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt 3960 tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta 4020 tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa 4080 atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt 4140 cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 4200 acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 4260 aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 4320 attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 4380 tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 4440 gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 4500 cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 4560 tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 4620 agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 4680 tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 4740 tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 4800 tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 4860 acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 4920 accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 4980 tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 5040 cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 5100 tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 5160 actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 5220 tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 5280 cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 5340 gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 5400 tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 5460 gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 5520 gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 5580 ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 5640 acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 5700 agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 5760 cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 5820 tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 5880 gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 5940 ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 6000 ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 6060 cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 6120 ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat 6180 taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 6240 tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga 6300 ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc tgcaagctta 6360 atgtagtctt atgcaatact cttgtagtct tgcaacatgg taacgatgag ttagcaacat 6420 gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg tggaagtaag gtggtacgat 6480 cgtgccttat taggaaggca acagacgggt ctgacatgga ttggacgaac cactgaattg 6540 ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acaataaacg ggtctctctg 6600 gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 6660 tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 6720 taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 6780 aacagggacc tgaaagcgaa agggaaacca gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct 6840 gaagcgcgca cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact 6900 agcggaggct agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt 6960 agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa 7020 catatagtat gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa 7080 acatcagaag gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca 7140 gaagaactta gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata 7200 gagataaaag acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag 7260 accaccgcac agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa 7320 ttggagaagt gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc 7380 caccaaggca aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt 7440 gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcctcaa tgacgctgac 7500 ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc 7560 tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc 7620 aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg 7680 ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc 7740 tctggaacag atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta 7800 cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca 7860 agaattattg gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg 7920 gctgtggtat ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt 7980 ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca 8040 gacccacctc ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg 8100 agagagagac agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcggttaac 8160 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 8220 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttat 8280 cgatcacgag actagccg 8298 <210> 78 <211> 2949 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Human BRAF <400> 78 cgcctccctt ccccctcccc gcccgacagc ggccgctcgg gccccggctc tcggttataa 60 gatggcggcg ctgagcggtg gcggtggtgg cggcgcggag ccgggccagg ctctgttcaa 120 cggggacatg gagcccgagg ccggcgccgg cgccggcgcc gcggcctctt cggctgcgga 180 ccctgccatt ccggaggagg tgtggaatat caaacaaatg attaagttga cacaggaaca 240 tatagaggcc ctattggaca aatttggtgg ggagcataat ccaccatcaa tatatctgga 300 ggcctatgaa gaatacacca gcaagctaga tgcactccaa caaagagaac aacagttatt 360 ggaatctctg gggaacggaa ctgatttttc tgtttctagc tctgcatcaa tggataccgt 420 tacatcttct tcctcttcta gcctttcagt gctaccttca tctctttcag tttttcaaaa 480 tcccacagat gtggcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg ttagagtctt 540 cctgcccaac aaacagagga cagtggtacc tgcaaggtgt ggagttacag tccgagacag 600 tctaaagaaa gcactgatga tgagaggtct aatcccagag tgctgtgctg tttacagaat 660 tcaggatgga gagaagaaac caattggttg ggacactgat atttcctggc ttactggaga 720 agaattgcat gtggaagtgt tggagaatgt tccacttaca acacacaact ttgtacgaaa 780 aacgtttttc accttagcat tttgtgactt ttgtcgaaag ctgcttttcc agggtttccg 840 ctgtcaaaca tgtggttata aatttcacca gcgttgtagt acagaagttc cactgatgtg 900 tgttaattat gaccaacttg atttgctgtt tgtctccaag ttctttgaac accacccaat 960 accacaggaa gaggcgtcct tagcagagac tgccctaaca tctggatcat ccccttccgc 1020 acccgcctcg gactctattg ggccccaaat tctcaccagt ccgtctcctt caaaatccat 1080 tccaattcca cagcccttcc gaccagcaga tgaagatcat cgaaatcaat ttgggcaacg 1140 agaccgatcc tcatcagctc ccaatgtgca tataaacaca atagaacctg tcaatattga 1200 tgacttgatt agagaccaag gatttcgtgg tgatggagga tcaaccacag gtttgtctgc 1260 taccccccct gcctcattac ctggctcact aactaacgtg aaagccttac agaaatctcc 1320 aggacctcag cgagaaagga agtcatcttc atcctcagaa gacaggaatc gaatgaaaac 1380 acttggtaga cgggactcga gtgatgattg ggagattcct gatgggcaga ttacagtggg 1440 acaaagaatt ggatctggat catttggaac agtctacaag ggaaagtggc atggtgatgt 1500 ggcagtgaaa atgttgaatg tgacagcacc tacacctcag cagttacaag ccttcaaaaa 1560 tgaagtagga gtactcagga aaacacgaca tgtgaatatc ctactcttca tgggctattc 1620 cacaaagcca caactggcta ttgttaccca gtggtgtgag ggctccagct tgtatcacca 1680 tctccatatc attgagacca aatttgagat gatcaaactt atagatattg cacgacagac 1740 tgcacagggc atggattact tacacgccaa gtcaatcatc cacagagacc tcaagagtaa 1800 taatatattt cttcatgaag acctcacagt aaaaataggt gattttggtc tagctacagt 1860 gaaatctcga tggagtgggt cccatcagtt tgaacagttg tctggatcca ttttgtggat 1920 ggcaccagaa gtcatcagaa tgcaagataa aaatccatac agctttcagt cagatgtata 1980 tgcatttgga attgttctgt atgaattgat gactggacag ttaccttatt caaacatcaa 2040 caacagggac cagataattt ttatggtggg acgaggatac ctgtctccag atctcagtaa 2100 ggtacggagt aactgtccaa aagccatgaa gagattaatg gcagagtgcc tcaaaaagaa 2160 aagagatgag agaccactct ttccccaaat tctcgcctct attgagctgc tggcccgctc 2220 attgccaaaa attcaccgca gtgcatcaga accctccttg aatcgggctg gtttccaaac 2280 agaggatttt agtctatatg cttgtgcttc tccaaaaaca cccatccagg cagggggata 2340 tggtgcgttt cctgtccact gaaacaaatg agtgagagag ttcaggagag tagcaacaaa 2400 aggaaaataa atgaacatat gtttgcttat atgttaaatt gaataaaata ctctcttttt 2460 ttttaaggtg aaccaaagaa cacttgtgtg gttaaagact agatataatt tttccccaaa 2520 ctaaaattta tacttaacat tggattttta acatccaagg gttaaaatac atagacattg 2580 ctaaaaattg gcagagcctc ttctagaggc tttactttct gttccgggtt tgtatcattc 2640 acttggttat tttaagtagt aaacttcagt ttctcatgca acttttgttg ccagctatca 2700 catgtccact agggactcca gaagaagacc ctacctatgc ctgtgtttgc aggtgagaag 2760 ttggcagtcg gttagcctgg gttagataag gcaaactgaa cagatctaat ttaggaagtc 2820 agtagaattt aataattcta ttattattct taataatttt tctataacta tttcttttta 2880 taacaatttg gaaaatgtgg atgtctttta tttccttgaa gcaataaact aagtttcttt 2940 ttataaaaa 2949 <210> 79 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence AP1M1 <400> 79 Val Ile Glu Lys His Ser His Ser Arg Ile Glu Tyr Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Lys Ser Gln Phe Lys Arg Arg Ser Thr Ala Asn 20 25 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence AP1M1 <400> 80 Val Ile Glu Lys His Ser His Ser Arg Ile Glu Tyr Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Lys Ser Gln Phe 20 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence AP1M1 <400> 81 Ser Arg Ile Glu Tyr Met Leu Lys Ala Lys Ser Gln Phe Lys Arg Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ala Asn 20 <210> 82 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence DCAF6 <400> 82 Glu Gln Phe Leu Gln Pro Ser Thr Ser Ser Thr Met Ser Thr Gln Ala 1 5 10 15 His Ser Thr Ser Ser Pro Thr Glu Ser Pro His 20 25 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence DCAF6 <400> 83 Glu Gln Phe Leu Gln Pro Ser Thr Ser Ser Thr Met Ser Thr Gln Ala 1 5 10 15 His Ser Thr Ser 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence DCAF6 <400> 84 Thr Ser Ser Thr Met Ser Thr Gln Ala His Ser Thr Ser Ser Pro Thr 1 5 10 15 Glu Ser Pro His 20 <210> 85 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GTF2H4 <400> 85 Phe Ile Val Val Glu Thr Asn Tyr Arg Leu Tyr Ala Tyr Met Glu Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ile Ala Leu Ile Ala Leu Phe Ser 20 25 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GTF2H4 <400> 86 Phe Ile Val Val Glu Thr Asn Tyr Arg Leu Tyr Ala Tyr Met Glu Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ile 20 <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GTF2H4 <400> 87 Tyr Arg Leu Tyr Ala Tyr Met Glu Ser Glu Leu Gln Ile Ala Leu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Phe Ser 20 <210> 88 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NBPF12 <400> 88 Asp Ser Cys Gln Pro Tyr Arg Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Gly Glu Lys 1 5 10 15 His Val Gly Phe Ser Leu Asp Val Gly Glu Ile 20 25 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NBPF12 <400> 89 Asp Ser Cys Gln Pro Tyr Arg Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Gly Glu Lys 1 5 10 15 His Val Gly Phe 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NBPF12 <400> 90 Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Gly Glu Lys His Val Gly Phe Ser Leu Asp 1 5 10 15 Val Gly Glu Ile 20 <210> 91 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ORC3 <400> 91 Glu Ser Phe Ala Thr Lys Val Leu Gln Asp Phe Ile Ile Leu Ser Ser 1 5 10 15 Gln His Leu His Glu Phe Pro Leu Ile Leu Ile 20 25 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ORC3 <400> 92 Glu Ser Phe Ala Thr Lys Val Leu Gln Asp Phe Ile Ile Leu Ser Ser 1 5 10 15 Gln His Leu His 20 <210> 93 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ORC3 <400> 93 Leu Gln Asp Phe Ile Ile Leu Ser Ser Gln His Leu His Glu Phe Pro 1 5 10 15 Leu Ile Leu Ile 20 <210> 94 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ROR1 <400> 94 Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Ser Lys Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu Pro Met Asn Asn 20 25 <210> 95 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ROR1 <400> 95 Leu Val Pro Thr Ser Ser Trp Asn Ile Ser Ser Glu Leu Ser Lys Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Leu Thr 20 <210> 96 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ROR1 <400> 96 Asn Ile Ser Ser Glu Leu Ser Lys Asp Ser Tyr Leu Thr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Pro Met Asn Asn 20 <210> 97 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence SF3B1 <400> 97 Gln Met Gly Gly Ser Thr Pro Val Leu Thr Pro Gly Lys Ala Pro Ile 1 5 10 15 Gly Thr Pro Ala Met Asn Met Ala Thr Pro Thr 20 25 <210> 98 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence SF3B1 <400> 98 Gln Met Gly Gly Ser Thr Pro Val Leu Thr Pro Gly Lys Ala Pro Ile 1 5 10 15 Gly Thr Pro Ala 20 <210> 99 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence SF3B1 <400> 99 Val Leu Thr Pro Gly Lys Ala Pro Ile Gly Thr Pro Ala Met Asn Met 1 5 10 15 Ala Thr Pro Thr 20 <210> 100 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence UNKL <400> 100 Ala His Gly Pro Leu Asp Leu Arg Pro Pro Val Cys Asp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Gln Glu Ala Leu Gln Asn Gly Gln 20 25 <210> 101 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence UNKL <400> 101 Ala His Gly Pro Leu Asp Leu Arg Pro Pro Val Cys Asp Ile Arg Glu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Gln 20 <210> 102 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence UNKL <400> 102 Arg Pro Pro Val Cys Asp Ile Arg Glu Leu Gln Ala Gln Glu Ala Leu 1 5 10 15 Gln Asn Gly Gln 20 <210> 103 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ZNF700 <400> 103 Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Lys Cys Asp Lys Ala Leu His Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Tyr His Arg His Glu Arg Ser His 20 25 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ZNF700 <400> 104 Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Lys Cys Asp Lys Ala Leu His Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Tyr 20 <210> 105 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ZNF700 <400> 105 Ser Lys Cys Asp Lys Ala Leu His Ser Ser Ser Ser Tyr His Arg His 1 5 10 15 Glu Arg Ser His 20 <210> 106 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NVL <400> 106 Ala Pro Cys Ile Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ala Ile Pro Pro Lys 1 5 10 15 Arg Glu Val Ala Ser Lys Asp Met Glu Arg Arg 20 25 <210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NVL <400> 107 Ala Pro Cys Ile Ile Phe Ile Asp Glu Ile Asp Ala Ile Pro Pro Lys 1 5 10 15 Arg Glu Val Ala 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NVL <400> 108 Asp Glu Ile Asp Ala Ile Pro Pro Lys Arg Glu Val Ala Ser Lys Asp 1 5 10 15 Met Glu Arg Arg 20 <210> 109 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence MATN1 <400> 109 Ser Arg Ser Pro Asp Ile Ser Lys Val Val Ile Val Val Pro Asp Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gln Asp Ser Val Gln Asp Val Ser Ala 20 25 <210> 110 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence MATN1 <400> 110 Ser Arg Ser Pro Asp Ile Ser Lys Val Val Ile Val Val Pro Asp Gly 1 5 10 15 Arg Pro Gln Asp 20 <210> 111 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence MATN1 <400> 111 Lys Val Val Ile Val Val Pro Asp Gly Arg Pro Gln Asp Ser Val Gln 1 5 10 15 Asp Val Ser Ala 20 <210> 112 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CTNNA2 <400> 112 Val Arg Gln Ala Leu Gln Asp Leu Leu Ser Glu Tyr Met His Asn Thr 1 5 10 15 Gly Arg Lys Glu Lys Gly Asp Pro Leu Asn Ile 20 25 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CTNNA2 <400> 113 Val Arg Gln Ala Leu Gln Asp Leu Leu Ser Glu Tyr Met His Asn Thr 1 5 10 15 Gly Arg Lys Glu 20 <210> 114 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CTNNA2 <400> 114 Leu Leu Ser Glu Tyr Met His Asn Thr Gly Arg Lys Glu Lys Gly Asp 1 5 10 15 Pro Leu Asn Ile 20 <210> 115 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GET4 <400> 115 Arg Tyr Met Ser Gln Ser Lys His Thr Glu Ala Arg Glu Arg Met Tyr 1 5 10 15 Ser Gly Ala Leu Leu Phe Phe Ser His Gly Gln 20 25 <210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GET4 <400> 116 Arg Tyr Met Ser Gln Ser Lys His Thr Glu Ala Arg Glu Arg Met Tyr 1 5 10 15 Ser Gly Ala Leu 20 <210> 117 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence GET4 <400> 117 His Thr Glu Ala Arg Glu Arg Met Tyr Ser Gly Ala Leu Leu Phe Phe 1 5 10 15 Ser His Gly Gln 20 <210> 118 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NTNG1 <400> 118 Thr Val Thr Asp Leu Arg Ile Arg Leu Leu Arg Pro Ala Ile Gly Glu 1 5 10 15 Ile Phe Val Asp Glu Leu His Leu Ala Arg Tyr 20 25 <210> 119 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NTNG1 <400> 119 Thr Val Thr Asp Leu Arg Ile Arg Leu Leu Arg Pro Ala Ile Gly Glu 1 5 10 15 Ile Phe Val Asp 20 <210> 120 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence NTNG1 <400> 120 Arg Leu Leu Arg Pro Ala Ile Gly Glu Ile Phe Val Asp Glu Leu His 1 5 10 15 Leu Ala Arg Tyr 20 <210> 121 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence SPTBN5 <400> 121 Thr Leu Leu Leu Asp Ala Trp Leu Thr Thr Lys Ala Ala Ile Ala Glu 1 5 10 15 Ser Gln Asp Tyr Gly Gln Asp Leu Glu Gly Val 20 25 <210> 122 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence SPTBN5 <400> 122 Thr Leu Leu Leu Asp Ala Trp Leu Thr Thr Lys Ala Ala Ile Ala Glu 1 5 10 15 Ser Gln Asp Tyr 20 <210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence SPTBN5 <400> 123 Leu Thr Thr Lys Ala Ala Ile Ala Glu Ser Gln Asp Tyr Gly Gln Asp 1 5 10 15 Leu Glu Gly Val 20 <210> 124 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence DPP6 <400> 124 Leu Leu Val Ile Leu Val Ile Cys Ser Leu Ile Val Thr Leu Val Ile 1 5 10 15 Leu Leu Thr Pro Ala Glu Asp Asn Ser Leu Ser 20 25 <210> 125 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence DPP6 <400> 125 Leu Leu Val Ile Leu Val Ile Cys Ser Leu Ile Val Thr Leu Val Ile 1 5 10 15 Leu Leu Thr Pro 20 <210> 126 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence DPP6 <400> 126 Cys Ser Leu Ile Val Thr Leu Val Ile Leu Leu Thr Pro Ala Glu Asp 1 5 10 15 Asn Ser Leu Ser 20 <210> 127 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HIAT1 <400> 127 Val Lys Gly Leu Leu Ser Phe Leu Ser Ala Pro Leu Ile Cys Ala Leu 1 5 10 15 Ser Asp Val Trp Gly Arg Lys Ser Phe Leu Leu 20 25 <210> 128 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HIAT1 <400> 128 Val Lys Gly Leu Leu Ser Phe Leu Ser Ala Pro Leu Ile Cys Ala Leu 1 5 10 15 Ser Asp Val Trp 20 <210> 129 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence HIAT1 <400> 129 Leu Ser Ala Pro Leu Ile Cys Ala Leu Ser Asp Val Trp Gly Arg Lys 1 5 10 15 Ser Phe Leu Leu 20 <210> 130 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ITGA4 <400> 130 Gly Ser Gly Ala Val Met Asn Ala Met Glu Thr Asn Leu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe Gly Glu Ser Ile 20 25 <210> 131 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ITGA4 <400> 131 Gly Ser Gly Ala Val Met Asn Ala Met Glu Thr Asn Leu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Asp Lys Tyr Ala 20 <210> 132 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence ITGA4 <400> 132 Ala Met Glu Thr Asn Leu Phe Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe 1 5 10 15 Gly Glu Ser Ile 20 <210> 133 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence MYO1A <400> 133 Ser Val Arg Phe Lys Glu Asn Ser Val Ala Val Lys Val Ile Gln Gly 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Asp Asn Ser Lys Leu Arg Tyr 20 25 <210> 134 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence MYO1A <400> 134 Ser Val Arg Phe Lys Glu Asn Ser Val Ala Val Lys Val Ile Gln Gly 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly 20 <210> 135 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence MYO1A <400> 135 Ser Val Ala Val Lys Val Ile Gln Gly Pro Ala Gly Gly Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Leu Arg Tyr 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TRAC-gRNA-1 <400> 136 agagtctctc agctggtaca 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequenceTRAC-gRNA-2 <400> 137 tgtgctagac atgaggtcta 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TRBC-gRNA-1 <400> 138 gcagtatctg gagtcattga 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence TRBC-gRNA-2 <400> 139 ggagaatgac gagtggaccc 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence B2M-gRNA <400> 140 cgcgagcaca gctaaggcca 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence PD-1-gRNA <400> 141 ggccaggatg gttcttaggt 20 <210> 142 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence sgRNA Forward Oligo: TRAC_sgRNA_pLenti_F1 <400> 142 caccggagaa tcaaaatcgg tgaat 25 <210> 143 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence sgRNA Reverse Oligo: TRAC_sgRNA_pLenti_R1 <400> 143 aaacattcac cgattttgat tctcc 25 <210> 144 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence PD1_sgRNA_F1 <400> 144 caccgcagtt gtgtgacacg gaag 24 <210> 145 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence PD1_sgRNA_R1 <400> 145 aaaccttccg tgtcacacaa ctgc 24 <210> 146 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CTLA4_sgRNA_F1 <400> 146 caccggcaaa ggtgagtgag acttt 25 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence CTLA4_sgRNA_R1 <400> 147 aaacaaagtc tcactcacct ttgcc 25 <210> 148 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence LAG3_sgRNA_F1 <400> 148 caccggtttc tgcagccgct ttggg 25 <210> 149 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence LAG3_sgRNA_R1 <400> 149 aaaccccaaa gcggctgcag aaacc 25

Claims (93)

  1. (a) 서열 번호 29 내지 32 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 5개 이하의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 가지는 서열 번호 29 내지 32 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) α 쇄 가변 (Vα) 도메인, 및 TCR β 쇄 가변 (Vβ) 도메인;
    (b) 서열 번호 33 내지 35 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 5개 이하의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 가지는 서열 번호 33 내지 35 중 어느 하나에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 Vα 도메인 및 Vβ 도메인; 또는
    (c) (a)의 Vα 도메인 및 (b)의 Vβ 도메인을 포함하고,
    BRAFV600E 돌연변이를 함유하는 BRAF 펩티드를 포함하는 세포 표면상의 HLA 복합체에 특이적으로 결합할 수 있고, BRAFV600E 돌연변이를 함유하지 않는 BRAF 펩티드를 포함하는 세포 표면상의 HLA 복합체에 결합하지 않는,
    결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) Vα 도메인은 서열 번호 29의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) Vα 도메인은 서열 번호 30의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) Vα 도메인은 서열 번호 31의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) Vα 도메인은 서열 32의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (e) Vα 도메인은 서열 번호 29의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) Vα 도메인은 서열 번호 29의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) Vα 도메인은 서열 번호 30의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) Vα 도메인은 서열 번호 30의 CDR3 아미노산을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (i) Vα 도메인은 서열 번호 31의 CDR3 아미노산을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) Vα 도메인은 서열 번호 31의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 번호 35의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나;
    (k) Vα 도메인은 서열 32의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 33의 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (l) Vα 도메인은 서열 32의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고, Vβ 도메인은 서열 34의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는,
    결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 Vα 도메인을 포함하고, 서열 번호 5 내지 7 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 Vβ 도메인을 포함하되, (a) CDR 중 적어도 3개 또는 4개는 돌연변이를 갖지 않고, (b) 돌연변이를 갖는 CDR은 3개 이하만의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는, 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인이 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ 도메인이 서열 5 내지 7 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TCR, TCR의 항원 결합 단편 또는 키메라 항원 수용체인, 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, TCR의 항원-결합 단편이 단일쇄 TCR (scTCR)을 포함하는, 결합 단백질.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 키메라 항원 수용체인, 결합 단백질.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TCR, TCR의 항원 결합 단편 또는 키메라 항원 수용체가 키메라, 인간화 또는 인간인, 결합 단백질.
  10. 제6항 또는 제9항에 있어서, TCR인, 결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, TCR이 서열 번호 25의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 α 쇄 불변 (Cα) 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, Cα 도메인이 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 서열 번호 26의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 β 쇄 (Cβ) 불변 도메인을 포함하는, 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, Cβ 도메인이 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TCR α 쇄가 서열 번호 55 내지 58 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, TCR β 쇄가 서열 번호 59 내지 61 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, BRAFV600E 펩티드가 약 7 내지 약 27 개의 아미노산, 약 10 내지 약 25 개의 아미노산, 또는 약 12 내지 약 20 개의 아미노산, 또는 약 15 내지 약 19개의 아미노산을 포함하는, 결합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, BRAFV600E 펩티드가 서열 번호 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, HLA 복합체가 HLA-DQ를 포함하는, 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, HLA 복합체가 HLA-DQB1*0301, *0302 또는 *0303을 포함하는, 결합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, HLA 복합체가 HLA-DQB1*0302를 포함하는, 결합 단백질.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HLA 복합체가 HLA-DQA1*03을 포함하는, 결합 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항에 있어서, 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제24항 또는 제25항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 벡터가 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 전달할 수 있는, 발현 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 숙주 세포가 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 발현 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 면역계 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의 조합인, 발현 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 면역계 세포가 CD4+ T 세포인, 발현 벡터.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, T 세포가 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합인, 발현 벡터.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  34. 제24항 또는 제25항에 따른 이종 폴리뉴클레오티드 또는 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하고, 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 결합 단백질을 그의 세포 표면에서 발현하는 숙주 세포.
  35. 제34항에 있어서,
    (a) Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분이 서열 번호 18 내지 21 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일하고; 및/또는
    (b) Vβ 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분은 서열 번호 22 내지 24 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한, 숙주 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분이 서열 번호 18 내지 21 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분이 서열 22 내지 24 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분이 TCR α 쇄 불변 도메인을 암호화하는 부분에 연결되고, α 쇄 불변을 암호화하는 부분은 서열 번호 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ 도메인을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 부분이 TCR β 쇄 불변 도메인을 암호화하는 부분에 연결되고, β 쇄 불변을 암호화하는 부분은 서열 번호 28의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인을 암호화하는 부분이 서열 번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 22의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  41. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인을 암호화하는 부분이 서열 번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 23의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  42. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인을 암호화하는 부분이 서열 번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 23의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  43. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 도메인을 암호화하는 부분이 서열 번호 21의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, Vβ 도메인을 암호화하는 부분은 서열 번호 24의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 일부가 자기 절단 펩티드를 암호화하고, TCR α 쇄-암호화 부분과 TCR β 쇄-암호화 부분 사이에 배치된, 숙주 세포.
  45. 제44항에 있어서, 자기 절단 펩티드를 암호화하는 부분이 서열 번호 44 내지 48 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  46. 제45항에 있어서, 암호화된 자기 절단 펩티드가 서열 번호 49 내지 52 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 숙주 세포.
  47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 면역계 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의 조합인, 숙주 세포.
  49. 제47항에 있어서, 면역계 세포가 T 세포인, 숙주 세포.
  50. 제47항에 있어서, T 세포가 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합인, 숙주 세포.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포인, 숙주 세포.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, T 세포에 의해 발현된 결합 단백질 또는 TCR이 내인성 TCR과 비교하여 CD3 단백질과 더 효율적으로 회합할 수 있는, 숙주 세포.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 유전자; LAG3 유전자; TIM3 유전자; CTLA4 유전자; HLA 성분 유전자; TCR 성분 유전자, 또는 이들의 임의 조합의 염색체 유전자 녹아웃을 포함하는, 숙주 세포.
  54. 제53항에 있어서, 염색체 유전자 녹아웃이 α1 마크로글로불린 유전자, α2 마크로글로불린 유전자, α3 마크로글로불린 유전자, β1 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 유전자로부터 선택된 HLA 성분 유전자의 녹아웃을 포함하는, 숙주 세포.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 염색체 유전자 녹아웃이 TCR α 가변 영역 유전자, TCR β 가변 영역 유전자, TCR 불변 영역 유전자 또는 이들의 조합으로부터 선택된 TCR 성분 유전자의 녹아웃을 포함하는, 숙주 세포.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 TCR과 비교하여 T 세포에서의 결합 단백질 또는 TCR 표면 발현이 더 높은 숙주 세포.
  57. 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  58. 유효량의 (i) 제34항 내지 제52항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 (ii) 제57항에 따른 조성물을 포함하고, 임의로 숙주 세포의 용량은 약 107 세포/m2 내지 약 1011 세포/m2인, 단위 용량.
  59. 제58항에 있어서, (i) 적어도 약 30% 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을 (ii) 적어도 약 30% 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1의 비로 조합하여 포함하고, 실질적으로 나이브 T 세포를 함유하지 않는, 단위 용량.
  60. 과증식성 장애의 치료를 필요로 하는 인간 대상에게 (i) 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 BRAFV600E 펩티드:HLA 복합체에 특이적인 결합 단백질을 포함하는 조성물; (ii) 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포; (iii) 제57항에 따른 조성물; 또는 (iv) 제58항 또는 제59항에 따른 단위 용량을 투여하는 것을 포함하는, 과증식성 장애를 치료하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 과증식성 장애가 암인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 암이 모발 세포 백혈병, 흑색종, 잘 분화되지 않은 갑상선암과 같은 갑상선암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 유두암, 비호지킨 림프종, 교모세포종, 및 털모양별아교세포종으로부터 선택되는, 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 포함하는, 방법.
  64. 유효량의 제34항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제57항에 따른 조성물 또는 제58항 또는 제59항에 따른 단위 용량을 과증식성 장애를 갖는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상의 세포에서 BRAFV600E 발현을 특징으로 하는 상태를 치료하기 위한 입양 면역요법 방법.
  65. 제64항에있어서, 숙주 세포가 생체 외에서 변형된, 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 숙주 세포가 대상에 대한 동종이계 세포, 동계 세포 또는 자가 세포인, 방법.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 면역계 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의 조합인, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 면역계 세포가 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합인, 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 세포가 CD4+ T 세포인, 방법.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 과증식성 장애가 암인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 암이 모발 세포 백혈병, 흑색종, 잘 분화되지 않은 갑상선암과 같은 갑상선암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 유두암, 비호지킨 림프종, 교모세포종, 및 털모양별아교세포종, 유방암, 난소암, 랑게르한스 세포 조직구증 또는 육종 (예를 들어, 섬유육종 (섬유모세포 육종), 융기성 피부섬유 육종 (DFSP), 골육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 위장관 기질 종양, 평활근육종; 맥관육종 (혈관육종), 카포시육종, 지방 육종, 다형세포 육종 또는 윤활막 육종)으로부터 선택되는, 방법.
  73. 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 비경구적으로 투여되는, 방법.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 용량의 숙주 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 복수 용량이 약 2 내지 약 4주의 투여 간격으로 투여되는, 방법.
  76. 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 약 107 세포/㎡ 내지 약 1011 세포/㎡의 용량으로 대상에게 투여되는, 방법.
  77. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 사이토카인이 IL-2, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의 조합물인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 사이토카인이 IL-2이고 숙주 세포와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 사이토카인이 순차적으로 투여되되, 사이토카인 투여 전에 적어도 3 또는 4회 숙주 세포가 대상에게 투여된, 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인이 IL-2이고 피하 투여되는, 방법.
  82. 제64항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 면역 억제 요법을 추가로 받고 있는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 면역 억제 요법이 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 프로드럭, 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  84. 제64항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 비골수증식성 또는 골수증식성 조혈 세포 이식을 받은, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 대상에게 비골수증식성 조혈 세포 이식 후 적어도 3개월에 숙주 세포가 투여된, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 대상에게 골수증식성 조혈 세포 이식 후 적어도 2개월에 숙주 세포가 투여된, 방법.
  87. 제64항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제 작용제의 억제제를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 면역억제 작용제의 억제제가 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, 아데노신, A2aR, 면역 억제성 사이토카인, IDO, 아르기나제, VISTA, TIGIT, PVRIG, PVRL2, KIRs, LAIR1, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, CD160, Treg 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 억제하는, 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 면역억제 작용제의 억제제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질, 소분자, RNAi 분자, 리보자임, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 면역억제 작용제의 억제제가 피딜리주맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MEDI0680, AMP-224, BMS-936558 BMS-936559, 더발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, MPDL3280A, LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 아바타셉트, 벨라타셉트, 에노블리투주맙, 376.96, 항-B7-H4 항체 또는 항원 결합 단편, 리릴루맙, 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트, 엡셀렌, 인독시모드, NLG919, 1-메틸-트립토판 (1-MT)-티라-파자민, N(오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-1-아르기닌 (nor-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥산산 (ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인 (BEC), CA-170, COM902, COM701 또는 이들의 항원 결합 단편 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 방법.
  91. 제64항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제의 치료적 유효량를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 작용제가 우렐루맙, MEDI6469, MEDI6383, MEDI0562, 레날리도미드, 포말리도미드, CDX-1127, TGN1412, CD80, CD86, CP-870,893, rhuCD40L, SGN-40, IL-2, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8, 또는 이들의 임의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  93. 제64항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 항체, 화학요법제, 방사선요법, 수술 또는 이들의 임의 조합 중 하나 이상을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
KR1020207006074A 2017-08-11 2018-08-10 Braf 특이적 tcr 및 그의 용도 Ceased KR20200035104A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762544695P 2017-08-11 2017-08-11
US62/544,695 2017-08-11
PCT/US2018/046350 WO2019033057A1 (en) 2017-08-11 2018-08-10 SPECIFIC BRAF TCR AND USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200035104A true KR20200035104A (ko) 2020-04-01

Family

ID=65272504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207006074A Ceased KR20200035104A (ko) 2017-08-11 2018-08-10 Braf 특이적 tcr 및 그의 용도

Country Status (9)

Country Link
US (1) US12398191B2 (ko)
EP (1) EP3665191A4 (ko)
JP (2) JP2020533962A (ko)
KR (1) KR20200035104A (ko)
CN (1) CN111212848A (ko)
AU (1) AU2018314242A1 (ko)
CA (1) CA3070855A1 (ko)
MX (1) MX2020001287A (ko)
WO (1) WO2019033057A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025127905A1 (ko) * 2023-12-14 2025-06-19 ㈜지아이이노베이션 Cd80 단백질과 il-2 단백질을 포함하는 융합단백질 및 키메라 항원 수용체를 발현하는 t 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109679917B (zh) * 2018-09-30 2020-09-25 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种lrfft2细胞
GB201819540D0 (en) * 2018-11-30 2019-01-16 Adaptimmune Ltd T cell modification
CN111057690A (zh) * 2019-12-23 2020-04-24 维塔恩(广州)医药有限公司 肿瘤相关基因braf突变相关抗原短肽及其应用
CN115803062B (zh) * 2020-06-03 2025-09-09 博泰康医药公司 滋养层细胞表面抗原2(trop-2)抗体
WO2021243695A1 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Guangdong Tcrcure Biopharma Technology Co., Ltd. Tcr-t cell therapy targeting epstein-barr virus
EP4612169A1 (en) * 2022-10-31 2025-09-10 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Hla-a3-restricted t cell receptors against braf with v600e mutation
WO2025245169A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Fred Hutchinson Cancer Center Immunotherapy cells equipped with a collagen-targeting payload

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA15704A (en) 1882-10-26 Jordan, Robert G. Improvements on furniture castors
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
GB9518220D0 (en) 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Checkpoint gene
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US20060078552A1 (en) 2002-03-15 2006-04-13 Sylvain Arnould Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
US20060153826A1 (en) 2003-01-28 2006-07-13 Sylvain Arnould Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof
JP2008527001A (ja) 2005-01-13 2008-07-24 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 前立腺幹細胞抗原ワクチンおよびその使用
WO2007002811A2 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating melanoma
CA2891996A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Duke University Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and dna-binding affinity
KR101319499B1 (ko) 2008-02-22 2013-10-17 엘지디스플레이 주식회사 화학적 자기조립 방법을 이용한 나노선 혹은탄소나노튜브의 적층 및 패턴형성 방법과, 이를 적용한액정표시장치의 제조방법
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
EP2210903A1 (en) 2009-01-21 2010-07-28 Monoclonal Antibodies Therapeutics Anti-CD160 monoclonal antibodies and uses thereof
EP2258719A1 (en) 2009-05-19 2010-12-08 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Multiple target T cell receptor
JP6208580B2 (ja) 2010-05-17 2017-10-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用
JP6120848B2 (ja) 2011-08-15 2017-04-26 メディミューン，エルエルシー 抗ｂ７−ｈ４抗体およびその使用
WO2013170066A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Peptides for the treatment of cancer
EP3241902B1 (en) 2012-05-25 2018-02-28 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
CA2881981A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2014093718A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
AU2013361275B2 (en) 2012-12-19 2016-11-24 Amplimmune, Inc. Anti-human B7-H4 antibodies and their uses
EP3760719A1 (en) 2013-11-18 2021-01-06 CRISPR Therapeutics AG Crispr-cas system materials and methods
CN113354744A (zh) 2013-12-20 2021-09-07 弗雷德哈钦森癌症研究中心 带标签的嵌合效应分子及其受体
US10202640B2 (en) * 2014-05-07 2019-02-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell analysis of T cells using high-throughput multiplex amplification and deep sequencing
JP6943760B2 (ja) 2014-09-12 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ４抗体及び免疫複合体
JP2017531427A (ja) 2014-10-03 2017-10-26 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）抗体およびその使用法
MX389823B (es) * 2014-10-27 2025-03-20 Fred Hutchinson Cancer Center Composiciones y metodos para reforzar la eficacia de inmunoterapia celular adoptiva.
US10227408B2 (en) 2015-02-19 2019-03-12 Compugen Ltd. Anti-PVRIG antibodies and methods of use
AU2016242967B2 (en) 2015-04-01 2021-07-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
EP4012415A3 (en) 2015-12-04 2022-12-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions related to toxicity associated with cell therapy
US11026969B2 (en) * 2015-12-23 2021-06-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity T cell receptors and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2025127905A1 (ko) * 2023-12-14 2025-06-19 ㈜지아이이노베이션 Cd80 단백질과 il-2 단백질을 포함하는 융합단백질 및 키메라 항원 수용체를 발현하는 t 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CA3070855A1 (en) 2019-02-14
CN111212848A (zh) 2020-05-29
JP2023105045A (ja) 2023-07-28
WO2019033057A1 (en) 2019-02-14
EP3665191A4 (en) 2021-05-05
MX2020001287A (es) 2020-08-20
US20210238250A9 (en) 2021-08-05
US20200223899A1 (en) 2020-07-16
EP3665191A1 (en) 2020-06-17
US12398191B2 (en) 2025-08-26
AU2018314242A1 (en) 2020-02-13
JP2020533962A (ja) 2020-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7037577B2 (ja) 高親和性ｍａｇｅ－ａ１特異的ｔｃｒ及びその使用
KR20200035104A (ko) Braf 특이적 tcr 및 그의 용도
US20210214415A1 (en) Immunoresponsive cells expressing dominant negative fas and uses thereof
JP2020195393A (ja) 養子細胞療法用の操作された細胞
KR20200005655A (ko) 비시스트론성 키메라성 항원 수용체 및 이의 용도
WO2019133969A2 (en) Enhanced chimeric antigen receptors and uses thereof
US20250152717A1 (en) Binding proteins and engineered cells specific for neoantigens and uses thereof
KR20210049119A (ko) Kras 또는 her2 항원을 표적으로 하는 면역요법
JP2020535796A (ja) ｓｔｒｅｐタグ特異的キメラ受容体およびその使用
JP2021534752A5 (ko)
TW202317602A (zh) 嵌合多肽
WO2024093056A1 (zh) Kras_g12v突变抗原特异性tcr及其与cd8共表达重定向cd4 t细胞
JP2022525099A (ja) 高アビディティｗｔ１ｔ細胞受容体とその使用
CN113286815B (zh) 间皮素特异性t细胞受体及其在免疫治疗中的应用
US20250177531A1 (en) Binding proteins specific for ras neoantigens and uses thereof
JP7737978B2 (ja) Ｗｔ－１に特異的なｔ細胞免疫療法
JPWO2020041501A5 (ko)
Mueller et al. CRISPR-mediated insertion of a chimeric antigen receptor produces nonviral T cell products capable of inducing solid tumor regression
HK40086029B (zh) Kras_g12v突变抗原特异性tcr及其与cd8共表达重定向cd4 t细胞
HK40086029A (zh) Kras_g12v突变抗原特异性tcr及其与cd8共表达重定向cd4 t细胞
HK40101993A (zh) Kras_g12v突变抗原特异性tcr及其与cd8共表达重定向cd4 t细胞
HK40060048B (zh) 间皮素特异性t细胞受体及其在免疫治疗中的应用
HK40040021B (zh) 增强的嵌合抗原受体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20200228

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210804

Comment text: Request for Examination of Application

N231 Notification of change of applicant
PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20221107

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20230913

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20231220

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20230913

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I