KR20200037207A

KR20200037207A - 신규한 아마니틴 합성 방법

Info

Publication number: KR20200037207A
Application number: KR1020207000441A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 러츠; 베르너 사이먼; 수잔 베르너-사이먼; 크리스토프 뮐러; 톨스텐 헥슬러; 미하엘 쿨케
Original assignee: 하이델베르크 파마 리서치 게엠베하
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2020-04-08
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: EP3665173B1; DK3665173T3; WO2019030173A1; US20210130412A1; US20200181200A1; ES3033917T3; CN111051310A; CO2020001259A2; NZ760113A; US11702451B2; RU2020105484A; CL2020000304A1; US10961277B2; AU2018314668B2; PL3665173T3; BR112020001345A2; KR102674750B1; CA3066867A1; LT3665173T; PT3665173T

Abstract

본 발명은 중심 트립토판 모이어티(모이어티)에 부착된 히드록시기를 가지는 아마니틴 유도체를 합성하는 신규한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 중심(central) 트립토판 모이어티의 4', 5' 또는 7'의 위치에 부착된 히드록시기를 가지는 신규 아마니틴 유도체들, 이들 아마니틴 유도체들의 신규 컨쥬게이트 (conjugates) 및 이들 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물들에 관한 것이다.

Description

신규한 아마니틴 합성 방법

[0001] 본 발명은 중심 트립토판 모이어티(central tryptophan moiety)에 부착된 히드록시기를 가지는 아마니틴 유도체를 합성하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 중심 트립토판 모이어티의 4', 5' 또는 7'의 위치에 부착된 히드록시기를 가지는 신규한 아마니틴 유도체, 이들 아마니틴 유도체의 신규한 컨쥬게이트(conjugates), 및 이들 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

[0002] 아마톡신(amatoxins)은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides) 버섯에서 발견되는 8 개의 아미노산으로 구성된 고리형 펩티드이다(도 1 참조). 아마톡신은 포유동물 세포의 DNA-의존적 RNA 폴리머라제 II를 특이적으로 억제하며, 이로써, 영향을 받는 세포의 전사 및 단백질 생합성을 또한 억제한다. 세포에서 전사의 억제는 성장 및 증식의 중단을 야기한다. 비록 공유 결합은 아니지만, 아마니틴과 RNA-폴리머라제 II 의 복합체는 매우 단단한 결합체이다 (KD = 3 nM). 상기 효소에서 아마니틴은 매우 느리게 분리되므로 영향을 받는 세포가 회복될 가능성은 거의 없다. 상기 전사 억제가 너무 오래 지속되면, 세포는 프로그램된 세포사멸인 아폽토시스(apoptosis)에 처하게 된다.

[0003] 세포 독성 모이어티(cytotoxic moiety)로서 아마톡신의 사용은 이미 1981년에 디아조 반응(diazotation)을 통해 Trp의 인돌 고리에 부착된 링커(아미노산 4; 도 1 참조)를 이용하여 항-Thy 1.2 항체를 아마니틴에 커플링시키는 시도가 있었다 (Davis & Preston, Science 213 (1981) 1385-1388). Davis & Preston 그룹은 상기 부착 위치가 7'의 위치임을 밝혀내었다. 또한, Morris & Venton 그룹도 T 위치에서의 치환이 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 유지하는 유도체를 생성함을 입증하였다 (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419-430).

[0004] 유럽 특허 출원 EP 1 859 81 1 A1(2007. 11. 28 공개)은 β-아마니틴의 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자가 링커 구조없이 직접 알부민 또는 모노클로날 항체 HEA125, OKT3 또는 PA-1에 결합된 컨쥬게이트에 대해 기재하고 있다. 또한, 유방암 세포(MCF-7), 버킷 림프종 세포(Burkitt's lymphoma cells, Raji) 및 T-림프종 세포(T-lymphoma cells, Jurkat)의 증식과 관련한 이들 컨쥬게이트의 억제 효과를 보여주었다. 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등과 같은 성분을 포함하는 링커들의 용도를 제시하였지만, 그러나 이들 작제물(constructs)은 실제로 제시되지 않았으며, 또한 아마톡신 상의 부착 위치와 같은 자세한 내용도 제공되지 않았다.

[0005] 국제 특허 출원 WO 2010/115629 및 WO 2010/115630(모두 2010. 10. 14 공개)은 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, (ii) 아마톡신 아미노산 4의 6 'C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자를 통해 ((i)-(iii) 각각의 경우에, 직접 또는 항체와 아마톡신 사이의 링커를 통해), 항-EpCAM 항체(예: 인간화 항체 huHEA125)와 같은 항체가 아마톡신에 결합된 컨쥬게이트(conjugates)에 대해 기재하고 있다. 상기 제시된 링커는 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등과 같은 성분을 포함한다. 또한, 이들 컨쥬게이트의 유방암 세포(세포주 MCF-7), 췌장 암종(pancreatic carcinoma, 세포주 Capan-1), 결장암(colon cancer, 세포주 Colo205) 및 담도암(cholangiocarcinoma, 세포주 OZ)의 증식에 대한 억제 효과를 보여주었다.

[0006] 국제 특허 출원 WO 2012/119787은 표적-결합 모이어티들(target-binding moieties)이 트립토판 아미노산 4 상의 추가 부착 부위들 (즉, 1'-N 위치들)에서 링커를 통해, 아마톡신이 이들의 표적인 포유동물 세포의 DNA-의존적 RNA 폴리머 라제 II와의 상호 작용으로 인한 방해없이, 아마톡신에 부착될 수 있음을 기재하고 있다.

[0007] 국제 특허 출원 WO 2014/009025는 γ,δ-디히드록시이소류신(γ,δ-dihydroxyisoleucine)을 위한 신규 신톤(synthon)을 출발 물질의 하나로 사용하여 아마니틴 유도체의 총 합성 방법을 기재하고 있다. 또한, 유럽 국제 특허 출원 PCT/EP2016/078984[WO 2017/089607로 공개]는 쉽게 이용가능한 (2S,3R,4S)-L-4-디히드록시이소류신을 출발 물질의 하나로 사용하여 γ- 및 ε-아마니틴 유도체의 총 합성방법을 기재하고 있다. 그러나, 이들 접근 방법들과 이제껏 추구된 기타 모든 완전한 또는 부분 합성 방법들은 Savige-Fontana에 따른 방법을 사용하여 중심 트립토판 모이어티를 아마톡신 코어(core)에 통합(incorporation)시키는 것이었다. 이 방법에서, 시스-2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌("Hpi")은 선형 아마니틴 전구체 구조로 통합된다. 산-촉매된(acid-catalyzed) Hpi-시스테인 커플링 반응에서, 중심 트립토판 모이어티를 가진 아마니틴 고리 시스템이 형성된다.

[0008] 그러나, Hpi 는 Hpi 의 인돌 모이어티의 페닐 고리에 부착된 어떠한 기능적 모이어티도 갖고 있지 않다. 따라서, Savige-Fontana 에 따른 방법으로 생성된 아마니틴 제품은 어떠한 추가 치환체도 없는 중심 트립토판 모이어티를 포함한다. 그러나, 자연적으로 발생하는 α-, β-, γ 및 ε-아마니틴은 중심 6'-히드록시-트립토판 모이어티를 포함하며, 6'-히드록시기는 아마니틴의 기능화(functionalization) (예: 직접 또는 링커를 통해 표적 모이어티들을 부착함으로써)를 위한 작용기(functional group)로서 성공적으로 사용되어왔다 (참조, 예: WO 2010/115629, WO 2010/115630 및 WO 2012/041504). 따라서 합성 아마니틴의 경우, 기능화는 상기 기재된 바와 같이 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C- 원자를 통하거나, 또는 (ii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자를 통하여 수행되거나, WO 2012/1 19787 에 기재된 바와 같이, 상기 트립토판 모이어티의 질소 원자를 통하여 수행되어야 하였다.

[0009] Hpi 는 트립토판을 과아세트산(peracetic acid)과 반응시키거나 또는 광화학적으로 일중항 산소(singlet oxygen)와 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 그러나, Hpi의 인돌 모이어티의 페닐 고리에 부착된 치환체를 가진 유도체는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

[0010] 완전 합성 경로(fully synthetic routes)를 통한 아마톡신 합성은 치료용으로 필요한 다량의 아마톡신 공급을 위한 한 가지 옵션이 될 수 있고, 적절한 출발 물질들을 빌딩 블록으로 사용하여 다양한 신규 아마톡신 변이체(variants)의 컨스트럭션을 제공할 수도 있으나, 과거에 시도되었던 접근 방식들은, 이들 아마니틴의 코어 트립토판 모이어티에 부착된 6'-히드록시 모이어티가 통합될 수 없어서 천연 구조의 α-, β-, γ 및/또는 ε-아마니틴을 수득할 수 없다는 사실 때문에 그 사용이 이제껏 제한되어 왔다. 따라서, 합성 아마니틴의 기능화를 위한 옵션들은 지금까지 다소 제한되어왔다. 더욱이, 입체 장애 및 반응성과 같은 요소가 합성 아마니틴 및 이의 컨쥬게이트들의 반응성, 생물학적 활성 및/또는 안정성에 큰 영향을 미칠 수 있으므로, 기능화에 사용되는 옵션 범위를 확대하는 것이 매우 바람직할 것으로 생각된다. 그러나, 독성이 강한 아마니틴을 함유하는 컨쥬게이트의 안정성 및 효능은 인체 투여를 위한 치료용 분자(therapeutic molecules)로서 그 용도가 예상되므로 매우 중요한 의미를 가진다.

[0011] 따라서, 상기 중심 트립토판 모이어티의 페닐 고리에 부착된 히드록시기를 가지는 아마톡신을 비용 효율적이며 강력한 합성 방법이 여전히 매우 필요하였다. 특히, 확립된 Savige-Fontana 반응에 사용될 수 있는 출발 물질들 및 이들 히드록시 기들의 통합을 야기할 수있는 방식으로 설정된 출발 물질들을 동정하는 것이 절실히 요구되고 있다.

[0012] 본 발명은 아마니틴 유도체들의 합성 중 히드록시기의 도입을 허용하는 Hpi의 변이체들이 합성될 수 있다는 예상치 못한 관찰에 기초한 것이다.

[0013] 따라서, 본 발명의 일 관점은 하기 화학식 I 에 따른 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체에 관한 것으로서:

여기서 R1 은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴에서 선택되고;

P1 는 수소 또는 보호기로서, 특히 Boc, PhCH₂OCO-, CH₂=CHCH₂O-CO-, 및 트리틸(trityl)에서 선택되는 보호기이고;

P2 는 수소 또는 보호기로서, 특히 보호기이고, 특히 Boc, PhCH₂OCO-, CH₂=CHCH₂O-CO-, 및 트리틸에서 선택되는 보호기이고; 그리고

R2 는 OH, OR1, 및 1 내지 7개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드 사슬 (polypeptide chain)로부터 선택된다.

[0014] 본 발명의 두 번째 관점은 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 전구체의 펩타이드의 합성 시, 본 발명의 어느 하나의 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체를 사용하는 단계를 포함하는, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 전구체의 합성 방법에 관한 것이다.

[0015] 본 발명의 세 번째 관점은,

(i) 본 발명의 상기 선형 전구체의 상기 시스테인 잔기 및 상기 트립토판 모이어티 사이의 결합의 형성을 야기하거나 허용하는 단계; 및

(ii) 본 발명의 상기 선형 분자의 N-말단을 상기 전구체의 C-말단과 반응시킴으로써 아마니틴 유도체의 형성을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하는,

히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴의 합성 방법에 관한 것이다.

[0016] 본 발명의 네 번째 관점은 (i) S-데속시-4'-히드록시-아마닌, 4'-히드록시-아마닌, S-데속시-5'-히드록시-아마닌, 5'-히드록시-아마닌, S-데속시-7'-히드록시-아마닌, 및 7'-히드록시-아마닌, (ii) S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드, 4'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드, 5'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드, 및 7'-히드록시-아마닌아미드 및 (iii) (i)에 따른 아마니틴의 유도체, 에서 선택되는 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체에 관한 것으로서,

여기서 아미노산 1의 유리 카르복실산 모이어티는 카르복실산 에스테르 -C(=O)OR1 또는 모이어티 -C(=O)NH-OR1 로 전환되며, 여기서 R1 은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴에서 선택되는, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체에 관한 것이다.

[0017] 본 발명의 다섯 번째 관점은 (a) 본 발명의 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체; (b) 표적-결합 모이어티; 및 (c) 선택적으로 상기 아마니틴과 상기 표적-결합 모이어티를 연결하는 링커, 를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.

[0018] 본 발명의 여섯 번째 관점은 본 발명의 아마니틴 유도체 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것이다.

[0019] 본 발명의 일곱 번째 관점은 환자의 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 아마니틴 유도체 또는 본 발명의 컨쥬게이트 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것으로서,

특히 여기서 상기 암은 유방암, 췌장암, 담도암(cholangiocarcinoma), 대장암(colorectal cancer), 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군에서 선택된다.

[0020] 본 발명의 여덟 번째 관점은 (a) 본 발명의 아마니틴 유도체; 및 (b) 상기 아마니틴 유도체를 표적-결합 모이어티에 연결하기 위한 반응성 그룹 Y를 가지는 링커 모이어티, 를 포함하는 작제물(construct)에 관한 것이다.

[0021] 도 1은 서로 다른 아마톡신의 구조식을 도시하고 있다. 볼드체의 숫자들(1 내지 8)은 아마톡신을 형성하는 8 개의 아미노산의 표준 번호 매김(standard numbering)을 나타낸다. 또한, 아미노산 1, 3 및 4에서 원자의 표준 명칭들(standard designations)을 도시하고 있다 (각각, 그리스 문자 α에서 γ, 그리스 문자 α에서 δ, 및 숫자 1'에서 7').
[0022] 도 2는 화합물 S-데옥시-a-아마니틴(HDP 30.0735) 및 a- 아마니틴의 구조를 도시하고 있다.
[0023] 도 3은 Boc-L-트립토판을 출발물질로 하여 1 단계 합성에서 Hpi(HDP 30.0079)가 생성됨을 도시하고 있다.
[0024] 도 4는 Hpi 유도체 HDP 30.2555를 통합하는(incorporating) 고상(solid-phase) 펩티드 합성에 의해 화합물 S-데옥시-α-아마니틴(HDP 30.0735)이 생성됨을 도시하고 있다.
[0025] 도 5는 HEK293 세포 및 HEK293 OATP1 B3 세포에서 S-데옥시-α-아마니틴 (HDP 30.0735) 및 S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드 HDP 30.2548 의 세포 독성을 나타내고 있다.
[0026] 도 6은 상기 6'-히드록시기 및 (작제물을 표적-결합 모이어티에 연결하기 위한 반응성기 Y의 일 예로서의) 말단(terminal) 말레이미드기에 부착된 분리가능한 링커를 가지는 S-데옥시-α-아마니틴(HDP 30.0735)에 기초한 작제물을 도시하고 있다.
[0027] 도 7은 아미노산 잔기 1의 카르복실기 및 (작제물을 표적-결합 모이어티에 연결하기 위한 반응성기 Y의 일 예로서의) 말단 말레이미드기에 부착된 분리가능한 링커를 가지는 S-데옥시-α-아마니틴(HDP 30.0735)에 기초한 대안적(alternative) 작제물을 도시하고 있다.
[0028] 도 8은 5'-히드록시-L-트립토판을 출발 물질로 하는 다단계 합성에 의해 히드록실화된 Hpi 유도체 HDP 30.2536 가 생성됨을 도시하고 있다.
[0029] 도 9는 Hpi 유도체 HDP 30.2536을 통합(incorporating)하는 고상 펩티드 합성에 의해 화합물 아마니틴 전구체 HDP 30.2544가 생성됨을 도시하고 있다.
[0030] 도 10은 폐환 반응(ring closure)에 의해 아마니틴 전구체인 HDP 30.2544로부터 아마니틴 화합물 HDP 30.2546이 생성됨을 도시하고 있다.
[0031] 도 11은 아마니틴 HDP 30.2546 에서 보호기를 제거함으로써 아마니틴 HDP 30.2548(S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드)이 생성됨을 도시하고 있다.
[0032] 도 12는 5'-히드록시기 및 (작제물을 표적-결합 모이어티에 연결하기 위한 반응성기 Y의 일 예로서의) 말단 말레이미드기에 부착된 분리가능한 링커를 가지는 아마니틴 유도체 HDP 30.2548 (S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드)에 기초한 대안적(alternative) 작제물을 도시하고 있다.
[0033] 도 13a 내지 도 13c는 (HDP 30.2347, HDP 30.2371 및 HDP 30.2602 와 동일한 분리가능한(cleavable) 링커를 포함하지만, 상기 아마니틴 유도체들 대신에 alpha-아마니틴을 포함하는) HDP 30.1699 ADCs 과 대비하여, A) SKBR-3 세포(HER-2/neu+++) 및 JIMT-1 세포 상의 HER-2/neu(HER-2/neu⁺⁺⁺), B) LnCap 세포(PSMA+++) 및 22rv1 세포 상의 PSMA(PSMA⁺⁺) 및 C) Raji 세포(CD19+++) 및 Nalm-6 세포 상의 CD19(CD19++)을 타겟팅하는 HDP 30.2347, HDP 30.2371 및 HDP 30.2602 ADCs 의 세포 독성을 나타내고 있다.

[0034] 이하 본 발명을 하기에 상세히 기재함에 있어서, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않고 다양하게 변경될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예들의 설명을 위한 것으로서, 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.

[0035] 특히, 본원에 사용된 용어들은 "생명 공학 용어의 다국어 용어집: (lUPAC 권장 사항)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 설명된 바와 같이 정의된다.

[0036] 본 명세서 및 후속 청구 범위에 있어서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어 및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수, 조성(물)이나 단계, 또는 정수나 단계의 그룹을 포함하는 것으로 이해되며, 또한, 추가의 정수, 조성(물)이나 단계 또는 정수, 조성(물)이나 단계의 그룹이 존재하지 않는 실시예를 포함한 임의의 추가 정수, 조성(물)이나 단계, 또는 정수, 조성(물)이나 단계의 그룹 역시 존재할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 이러한 후자의 실시 예들에서, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 "...로 구성되는(consisting of)"과 거의 동일한 의미로 사용된다.

[0037] 본 명세서 전반에 걸쳐 몇몇 문헌이 인용되어 있다. (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 명세서, 지침, GenBank Accession Number 시퀀스 제출 등을 포함하는) 본 명세서에 인용된 각 문헌은, 해당 문헌이 상기 또는 하기되어 있든지 상관없이, 각 특허법 상 가능한 범위 내에서 그 전체로서 본 명세서에 참조로 인용된다. 본 명세서의 어떠한 기재도 본 발명이 선행 발명에 의한 상기 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

[0038] 이제 본 발명을 보다 자세히 설명하고자 한다. 이하의 기재에서, 본 발명의 여러가지 관점을 보다 자세히 정의하고자 한다. 이렇게 정의된 각 양상은 달리 명백히 언급되지 않는 한 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합 될 수있다.

[0039] 본 발명은 아마니틴 유도체들의 합성 중 히드록시기들의 도입을 허용하는 Hpi 의 변이체가 합성될 수 있다는 예상치 못한 관찰에 기초한 것이다.

[0040] 따라서, 본 발명의 한 관점은 하기 화학식 I 에 따른 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체에 관한 것으로서:

P1 는 수소 또는 보호기이고;

P2 는 수소 또는 보호기이고; 그리고

R2 는 OH, OR1, 및 1 내지 7개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드 사슬(polypeptide chain)로부터 선택된다.

[0041] 본 발명의 문맥에서, "보호기"라는 용어는, 질소 원자가 화합물 I에 따른 화합물들을 합성 및/또는 추가로 관능화(functionalize)하기 위하여 사용되는 다른 반응물들과 반응하는 것을 차단하기 위해, 중심 헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 모이어티의 1 번 또는 8 번 위치에 있는 질소 원자에 부착된 기를 의미한다. 당업자는 당 분야에서 이용가능하고 상기 질소 원자의 보호가 필요할 때 해당 질소 원자에 부착될 수 있고, N-보호가 더 이상 필요하지 않을 경우 후속적으로 절단될 수 있는 상이한 보호기들에 대해 잘 알고 있다. 특정 실시예들에서, 상기 N-보호는 N-아실화 시약을 사용한다. 따라서, 이러한 실시예들에서, P1 및/또는 P2 는 아실기이다. 특히 다른 실시예들에서, N-보호는 N-알킬화제를 사용한다. 따라서, 이러한 실시예들에서, P1 및/또는 P2 는 알킬기이다.

[0042] 특정 실시예들에서, 상기 보호기 P1 또는 P2는, 이들이 존재하는 경우, Boc, PhCH₂OCO-, CH₂=CHCH₂O-CO-, 및 트리틸로부터 독립적으로 선택된다.

[0043] 특정 실시예에서, 상기 3a 위치의 히드록시기 및 상기 8a 위치의 수소 원자는 2의 위치에 부착된 관능기에 대해 시스-배위(cis-configuration)이다. 다른 특정 실시예에서, 상기 3a 위치의 히드록시기 및 상기 8a 위치의 수소 원자는 2의 위치에 부착된 관능기에 대해 트랜스-배위(trans-configuration)에 있다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 아미노-치환 유도체는 시스-및 트랜스-배위를 갖는 화합물들의 혼합물이다.

[0044] 특정 실시예에서, 상기 치환체 R1-C(=O)-O- 는 화학식 I 에서 4의 위치에 부착된다.

[0045] 특정 실시예에서, 상기 치환체 R1-C(=O)-O- 는 화학식 I 에서 5의 위치에 부착된다.

[0046] 특정 실시예에서, 상기 치환체 R1-C(=O)-O- 는 화학식 I 에서 6의 위치에 부착된다.

[0047] 특정 실시예에서, 상기 치환체 R1-C(=O)-O- 는 화학식 I 에서 7의 위치에 부착된다.

[0048] 본 발명의 두 번째 관점은 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 전구체의 펩타이드의 합성 시, 본 발명의 어느 하나의 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체를 사용하는 단계를 포함하는, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 전구체의 합성 방법에 관한 것이다.

[0049] 본 발명의 세 번째 관점은,

[0050] 본 발명의 추가 관점들은, 실시예들에 나타낸 바와 같이, 합성된 개별 아마니틴 전구체들, 특히 화합물 HDP 30.2569, HDP 30.2572 및 단락 [00145]에 따라 합성된 고상-기반 중간체들에 관한 것이다.

[0051] 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 시스테인 모이어티의 황 원자를 산화시켜 설폭사이드 또는 설폰, 특히 설폭사이드를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

[0052] 본 발명의 네 번째 관점은 (i) S-데속시-4'-히드록시-아마닌, 4'-히드록시-아마닌, S-데속시-5'-히드록시-아마닌, 5'-히드록시-아마닌, S-데속시-7'-히드록시-아마닌, 및 7'-히드록시-아마닌, (ii) S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드, 4'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드, 5'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드, 및 7'-히드록시-아마닌아미드, 및 (iii) (i)에 따른 아마니틴의 유도체, 에서 선택되는 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체에 관한 것으로서,

[0053] 특정 실시예에서, 본 발명의 상기 아마니틴 유도체는 S-데속시-5'-히드록시-아마닌, 5'-히드록시-아마닌, S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드, 및 5'-히드록시-아마닌아미드로부터 선택된다.

[0054] 본 발명의 다섯 번째 관점은 (a) 본 발명의 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체; (b) 표적-결합 모이어티; 및 (c) 선택적으로 상기 아마니틴과 상기 표적-결합 모이어티를 연결하는 링커, 를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.

[0055] 본 발명의 여섯 번째 관점은 본 발명의 아마니틴 유도체 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것이다.

[0056] 본 발명의 일곱 번째 관점은 환자의 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 아마니틴 유도체 또는 본 발명의 컨쥬게이트 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것으로서,

[0057] 본 발명의 여덟 번째 관점은 (a) 본 발명의 아마니틴 유도체; 및 (b) 상기 아마니틴 유도체를 표적-결합 모이어티에 연결하기 위한 반응성 그룹 Y를 가지는 링커 모이어티, 를 포함하는 작제물(construct)에 관한 것이다.

[0058] 본 발명의 문맥에서, 용어 "아마니틴"은 특정 그룹의 아마톡신을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 용어 "아마니틴"은 Wieland, T. 및 Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185-260)에 기재된, Amanita 속에서 분리된 8 개의 아미노산으로 구성된 모든 고리형 펩티드를 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "아마니틴들(amanitins)"은 위치 1의 아스파르트산 또는 아스파라긴 잔기; 프롤린 잔기, 특히 위치 2의 히드록시 프롤린 잔기; 위치 3의 이소류신, 히드록시이소류신 또는 디히드록시이소류신; 위치 4의 히드록시트립토판 잔기; 위치 5 및 7의 글리신 잔기들; 위치 6의 이소류신 잔기; 및 위치 8의 시스테인 잔기, 특히 설폭사이드 또는 설폰 유도체로 산화된 시스테인의 유도체;를 기반으로하는 이환식(bicyclic) 구조를 의미하고 (아마니틴의 번호 매김 및 이들의 대표적 예는 도 1 참고), 또한 이들의 모든 화학적 유도체들; 추가로 이들의 모든 반합성 유사체들; 또한 (고리형, 8 개 아미노산) 천연 화합물들의 마스터 구조에 따라 빌딩 블록으로부터 구축된 이들의 모든 합성 유사체들(analogues); 또한 (상기 트립토판 모이어티의 페닐 고리에 최소한 하나 이상의 히드록시기가 있는 경우) 히드록실화된 아미노산 대신에 비히드록실화된 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체들(analogues); 및 또한 모든 합성 또는 반합성 유사체들을 포함하고, 각각의 경우에 이들 유도체 또는 유사체는 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제함으로써 기능적으로 활성화된다.

[0059] 따라서, 본 발명의 문맥에서, 용어 "아마니틴 유도체의 8 개 아미노산 잔기들"은 이환식(bicyclic) 아마니틴 폴리펩티드 구조를 형성하는 특정 아미노산들을 의미한다.

[0060] 기능적으로, 아마톡신은 포유동물 RNA 폴리머라제 II를 억제하는 펩티드 또는 뎁시펩티드로 정의된다. 바람직한 아마톡신은, 상기 정의된 바와 같이 링커 분자 또는 표적-결합 모이어티와 반응할 수있는, 작용기(예: 카르복실기 또는 카르복사미드 또는 히드록삼산과 같은 카르복실산 유도체, 아미노기, 히드록시기, 티올 또는 티올-포획기(thiol-capturing group))를 갖는 것들이다. 본 발명의 컨쥬게이트로서 특히 적합한 아마톡신들은, 도 1에 도시된 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마눌린, 또는 아마눌린산의 디-디옥시 변이체들 (di-deoxy variants), 또는 아마닌, 아마닌아미드, γ-아마닌, 또는 γ-아마닌아미드의 모노-디옥시 변이체들(mono-deoxy variants) 뿐 아니라, 이들의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체 및 합성 유사체들이다.

[0061] 특정 실시예에서, 본 발명의 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 히드록시-치환된 유도체, 아마니틴 유도체 및/또는 컨쥬게이트는 90%를 초과하는, 상세하게는 95%를 초과하는, 보다 상세하게는 98%를 초과하는, 또는 보다 더 상세하게는 99%를 초과하는 순도(purity)를 가진다.

[0062] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "순도"는 예를 들어 존재하는 컨쥬게이트들의 총량을 의미한다. 예를 들어, 90%를 초과하는 순도는, 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 1 mg에 상기 컨쥬게이트가 90%를 초과, 즉 900 μg을 초과함을 의미한다. 그 나머지 부분, 즉 불순물은 미반응 출발 물질 및 기타 반응물들, 용매들, 절단 생성물들(cleavage products) 및/또는 부산물들을 포함할 수 있다.

[0063] 특정 실시예에서, 본 발명의 상기 히드록시-치환된 유도체, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 상기 아마니틴 유도체, 및/또는 상기 컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 상기 히드록시-치환된 유도체, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체, 및/또는 컨쥬게이트를 100 mg을 초과, 상세하게는 500 mg을 초과, 그리고 더욱 상세하게는 1 g을 초과하는 양을 포함한다. 따라서, 예를 들어 종래 기술의 컨쥬게이트들의 복합 제제에 존재한다고 주장할 수 있는 미량의 본 발명의 컨쥬게이트는 명백히 배제된다.

[0064] 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적-결합 모이어티"는 표적 분자 또는 표적 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 본 출원의 맥락상, 바람직한 표적-결합 모이어티는 (i) 항체 또는 이의 항원-결합 단편; (ii) 항체 유사(antibody-like) 단백질; 및 (iii) 핵산 앱타머 (nucleic acid aptamers) 들이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "표적-결합 모이어티"는 전형적으로 40,000 Da(40kDa) 이상의 분자량을 가진다.

[0065] 본 명세서에서, 하기의 경우, 제 1 화합물(예: 항체)은 제 2 화합물(예: 표적 단백질과 같은 항원)에 "특이적으로 결합"하는 것으로 간주된다: 제 1 화합물이 상기 제 2 화합물에 대한 해리 상수 K_D가 100 μM 이하인 경우, 상세하게는 50 μM 이하, 상세하게는 30 μM 이하, 상세하게는 20 μM 이하, 상세하게는 10 μM 이하, 상세하게는 5 μM 이하, 보다 상세하게는 1 μM 이하, 보다 상세하게는 900 nM 이하, 보다 상세하게는 800 nM 이하, 보다 상세하게는 700 nM 이하, 보다 상세하게는 600 nM 이하, 보다 상세하게는 500 nM 이하, 보다 상세하게는 400 nM 이하, 보다 상세하게는 300 nM 이하, 보다 상세하게는 200 nM 이하, 보다 더 상세하게는 100 nM 이하, 보다 더 상세하게는 90 nM 이하, 보다 더 상세하게는 80 nM 이하, 보다 더 상세하게는 70 nM 이하, 보다 더 상세하게는 60 nM 이하, 보다 더 상세하게는 50 nM 이하, 보다 더 상세하게는 40 nM 이하, 보다 더 상세하게는 30 nM 이하, 보다 더 상세하게는 20 nM 이하, 및 보다 더 상세하게는 10 nM 이하.

[0066] 본원의 문맥에서, 상기 용어 "표적 분자" 및 "표적 에피토프"는 항원-결합 모이어티에 의해 특이적으로 결합되는 항원 및 항원의 에피토프를 각각 의미한다. 특히, 표적 분자는 종양-관련 항원으로서, 특히 비-종양 세포들의 표면과 비교하여, 하나 이상의 종양 세포 유형의 표면에 증가된 농도 및/또는 상이한 입체적 배위(configuration)로 존재하는 항원 또는 에피토프이다. 특히, 상기 항원 또는 에피토프는 하나 이상의 종양 세포 유형의 표면에는 존재하지만 비-종양 세포의 표면에는 존재하지 않는다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 표적-결합 모이어티는 하기 항원 중(PSMA, CD19, CD269, sialyl Lewis3, HER-2/neu 및 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule (EpCAM))에서 선택된 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 항원 또는 에피토프는 자가 면역 질환에 관여하는 세포에서 우선적으로 발현된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 표적-결합 모이어티는 IL-6 수용체(IL-6R)의 에피토프에 특이적으로 결합한다.

[0067] 본 명세서에서, 상기 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자들의 면역학적 활성 부분들, 즉 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 분자들을 의미한다. 따라서, 상기 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편들"는 적어도 기능적 항원-결합 도메인을 포함하는 항체의 단편을 의미한다. 또한, 표적 분자(예: PSMA, CD19, CD269, sialyl Lewis3, HER-2/neu 및 EpCAM 로부터 선택된 표적 단백질)에 특이적으로 결합하기 위해 파지 디스플레이(phage display)를 포함하는 기술을 통해 선택된 면역글로불린-유사 단백질들(immunoglobulin-like proteins)이 이에 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자들은 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브 클래스일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체들 및 이들의 항원-결합 단편들"은 폴리클로날, 모노클로날, 1가(monovalent), 이중 특이성(bispecific), 이종 컨쥬게이트 (헤테로conjugate), 다중 특이성(multispecific), 인간, 인간화 (특히 CDR-이식(CDR-grafted), 면역화되지 않거나(deimmunized) 또는 키메라 항체들 (chimeric antibodies), 단일 사슬 항체들(예: scFv), Fab 단편들, F(ab')₂ 단편들, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편들, 디아바디(diabodies) 또는 테트라바디드 (tetrabodies)(Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993) 6444-8), 나노바디(nanobodies), 항-이디오 타입 (anti-idiotypic; anti-Id) 항체들(예를 들어, 본 발명의 항체들에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편들을 포함하나, 이들에 국한되지는 않는다.

[0068] 몇몇 실시예에서, 상기 항원-결합 단편들은 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편들로서 Fab, Fab' 및 F(ab')₂, Fd, 단일 사슬 항체들, 디설파이드-연결된 Fvs (dsFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편들을 포함하나, 이들에 국한되지는 않는다. 단일 사슬 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편들은 가변 도메인(들)을 단독으로 또는 하기한 것들의 전부 또는 일부와 조합하여 포함할 수도 있다: 힌지 영역, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인들. 또한, 가변 도메인(들)과 힌지 영역, CL, CH1, CH2 및 CH3 도메인들의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 단편들이 본 발명에 포함된다.

[0069] 본 발명에서 사용 가능한 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물에서 기원된 것일 수 있다. 특히, 이들 항체는 인간, 설치류(예: 마우스, 쥐, 기니피그 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개에서 유래한 것이다. 특히 상기 항체는 인간 또는 쥐과 동물(murine)에서 기원한 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 "인간 항체들(human antibodies)"은 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 유전자 이식 동물들(transgenic animals)로부터 단리된 항체들로서, 예를 들어 미국 특허 번호 제 5,939,598( Kucherlapati & Jakobovits)에 기재된 바와 같이, 내인성(endogenous) 면역글로불린들을 발현하지 않는 것들을 포함한다.

[0070] 상기 용어 "항체-유사 단백질(antibody-like protein)"은 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 조작된(예를 들어, 루프의 돌연변이 유발에 의해) 단백질을 의미한다. 통상적으로, 이러한 항체-유사 단백질은 단백질 스캐폴드의 양쪽 말단에 부착 된 최소한 하나 이상의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제약(constraint)은 항체-유사 단백질의 결합 친화도를 항체의 그것과 필적하는 수준으로 크게 증가시킨다. 상기 가변 펩티드 루프의 길이는 통상 10 내지 20 개의 아미노산으로 구성된다. 상기 스캐폴드 단백질은 우수한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질일 수있다. 특히, 상기 스캐폴드 단백질은 작은 구상(globular) 단백질이다. 필수-항체-유사 단백질에는 아피보디(affibodies), 안티칼린(anticalins) 및 설계된 안키린 반복 단백질(ankyrin repeat proteins)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다 (리뷰 참조: Binz et al., Nat Biotechnol. 2005, 1257-68). 상기 항체-유사 단백질들은 거대한 돌연변이체 라이브러리(large libraries of mutants)(예: 거대한 파지 디스플레이 라이브러리)로부터 패닝되고(panned) 일반 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질들은 구상 단백질에서 표면 노출된 잔기들의 조합 돌연변이 유발(combinatorial mutagenesis)에 의해 수득될 수 있다.

[0071] 상기 용어 "핵산 압타머(nucleic acid aptamer)"는 반복된 라운드의 시험관(in vitro) 선택 또는 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화; systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 표적 분자에 결합하도록 조작된 핵산 분자를 의미한다 (리뷰 참조: Brody and Gold, J Biotechnol. 74 (2000) 5-13). 상기 핵산 압타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 압타머는 변형 (예: 2'-불소-치환된 피리미딘과 같은 변형된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.

[0072] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "링커(linker)"는 2 개의 구성 요소를 연결하는 구조로서 각 구성 요소가 상기 링커의 한 말단에 부착된 구조를 의미한다. 링커가 하나의 결합(a bond)인 경우, 항체에 대한 아마톡신의 직접적인 연결은 아마톡신이 RNA 폴리머라제 II와 상호 작용하는 능력을 감소시킬 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 상기 2 개의 구성 요소 사이의 거리를 증가시키고, 상기 항체와 아마톡신 사이에 있어서와 같은 입체적 간섭(steric interference)을 경감시킨다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 그 골격(backbone)에 1 내지 30 원자(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 원자)의 연속 사슬을 가진다. 즉, 상기 링커의 길이는 (상기 링커 골격의 한쪽은 아마톡신과 반응하고 다른 쪽은 항체와 반응이 가능하거나 반응한 경우) 상기 아마톡신 모이어티와 상기 항체 사이의 원자 또는 결합(bonds)의 수에 의해 측정되는 가장 짧은 연결로 정의된다. 본 발명의 문맥에서, 링커는 C_1-20-알킬렌, C_1-20-헤테로알킬렌, C_2-20-알케닐렌, C_2-20-헤테로알케닐렌, C_2-20-알키닐렌, C_2-20-헤테로알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 또는 헤테로아랄킬렌기이며, 임의로(optionally) 치환된다. 상기 링커는 카르복사미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 우레아, 티오우레아, 탄화수소 모이어티 등과 같은 하나 이상의 구조적 요소를 포함할 수 있다. 상기 링커는 또한 이들 구조적 요소 중 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 이들 구조적 요소들 각각은 링커에, 예를 들어, 한 번, 두 번, 세 번, 네 번, 다섯 번 또는 여섯 번 이상 존재할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 상기 링커는 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 상기 링커는 단일 단계 또는 둘 이상의 후속 단계에서 아마톡신 및 항체에 부착되어야 하는 것으로 이해된다. 이를 위하여, 상기 링커는 2 개의 기(group)를 특히 근위 및 원위 단부(proximal and distal end)를 가지게 되며, 이는 (i) 연결되는 요소 중 하나에 존재하는 기(group), 특히 아마톡신 또는 표적 결합-펩티드 상의 활성화된 기(group)에 공유 결합을 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 아마톡신 상의 기(group)와 공유 결합을 형성하도록 활성화되거나 활성화될 수 있다. 따라서, 화학 그룹들은 링커의 원위 및 근위 말단에 위치하는 것이 바람직하고, 이는 커플링 반응(예: 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩티드 결합 등)의 결과이다.

[0073] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커 L 은 C, O, N 및 S, 상세하게는 2 내지 19 원자들, 더욱 상세하게는 5 내지 16 원자들, 더욱 더 상세하게는 6 내지 15 원자들, 로부터 독립적으로 선택된 1 내지 20 개의 원자의 선형 사슬이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬에서 상기 원자들의 최소한 60% 이상이 탄소 원자들인다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬의 원자들은 단일 결합으로 연결된다.

[0074] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커 L 은 N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4 개의 헤테로 원자를 포함하는 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 또는 헤테로아랄킬렌 기로서, 상기 링커는 선택적으로(optionally) 치환된다.

[0075] 상기 용어 "알킬렌"은 1 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 2가 직쇄(straight chain) 포화 탄화수소기를 의미하며, 1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 기를 포함한다. 특정 실시예들에서, 알킬렌기는 저가(lower) 알킬렌기일 수 있다. 상기 용어 "저가(lower) 알킬렌"은 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기를 의미하며, 특정 실시예들에서, 1 내지 5개 또는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌기를 의미한다. 알킬렌기의 예로서, 메틸렌(-CH₂-), 에틸렌(-CH₂-CH₂-), n-프로필렌, n-부틸 렌, n-펜틸렌 및 n-헥실렌을 들 수 있으나, 이들에 국한되지 않는다.

[0076] 상기 용어 "알케닐렌"은 2 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 2가 직쇄 (straight chain) 기를 의미하며, 여기서 상기 탄소-탄소 결합 중 적어도 하나는 이중 결합 인 반면, 다른 결합들은 단일 결합 또는 추가 이중 결합일 수있다. 본 명세서에서, 용어 "알키닐렌"은 2 내지 20 개의 탄소 원자를 갖는 기를 의미하며, 여기서 상기 탄소-탄소 결합 중 하나 이상이 삼중 결합인 반면, 다른 결합들은 단일, 이중 또는 추가의 삼중 결합일 수 있다. 알케닐렌기의 예로서, 에테닐렌(-CH=CH-), 1-프로페닐렌, 2-프로페닐렌, 1-부테닐렌, 2-부테닐렌, 3-부테닐렌 등을 들 수 있다. 알케닐렌기의 예로서, 에티닐렌, 1-프로피닐렌, 2-프로피닐렌 등을 들 수 있다.

[0077] 본 명세서에서, 상기 용어 "시클로알킬렌"은 임의의 안정한 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 시스템의 일부인 2가 고리를 의미하는 것으로서, 여기서 상기 고리는 3 내지 12 개의 탄소 원자를 가지나 헤테로 원자는 없고, 또한 상기 고리는 완전히 포화되며, 용어 "시클로알케닐렌"은 임의의 안정한 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 시스템의 일부인 2가 고리를 의미하는 것으로 의도되며, 여기서 상기 고리는 3 내지 12 개의 탄소 원자를 가지나 헤테로 원자는 없고, 또한 상기 고리는 최소한 부분적으로 불포화된다 (그러나, 임의의 아릴렌 고리는 제외됨). 시클로알킬렌의 예로서, 시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌, 및 시클로헵틸렌을 들 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다. 시클로알케닐렌의 예로서, 시클로펜테닐렌 및 시클로헥세닐렌을 들 수 있으나, 이들에 국한되지는 않는다.

[0078] 본 명세서에서, 상기 용어 "헤테로시클로알킬렌" 및 "헤테로시클로알케닐렌"은 임의의 안정한 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 시스템의 일부인 2가 고리를 의미하는 것으로서, 여기서 상기 고리는 3 내지 12 개의 탄소 원자를 가지고, 또한 상기 고리는 탄소 원자들 및 최소한 하나 이상의 헤테로 원자, 특히 완전히 포화된 상기 고리를 의미하는 헤테로시클로알킬렌 및 최소한 부분적으로 불포화된 고리를 의미하는 헤테로시클로알케닐렌을 가지는, N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 최소한 하나 이상의 헤테로 원자로 구성된다(그러나, 임의의 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리는 제외됨).

[0079] 상기 용어 "아릴렌"은 임의의 안정한 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 시스템의 일부인 2가 고리 또는 고리 시스템을 의미하는 것으로서, 여기서 상기 고리 또는 고리 시스템은 3 내지 20 개의 탄소 원자를 가지나 헤테로 원자는 없고, 또한 상기 고리 또는 고리 시스템은 페닐렌을 포함하는, "4n+2" Π 전자규칙(electron rule)에 의해 정의되는 방향족(aromatic) 모이어티로 구성된다.

[0080] 본 명세서에서, 용어 "헤테로아릴렌"은 임의의 안정한 모노- 또는 폴리사이클릭 시스템의 일부인 2가 고리 또는 고리 시스템을 의미하는 것으로서, 여기서 상기 고리 또는 고리 시스템은 3 내지 20 개의 탄소 원자를 가지나 헤테로 원자는 없고, 또한 상기 고리 또는 고리 시스템은 "4n+2" Π 전자규칙(electron rule)에 의해 정의되는 방향족(aromatic) 모이어티로 구성되며, 탄소 원자들 및 하나 이상의 질소, 황, 및/또는 산소 헤테로 원자들을 포함한다.

[0081] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "치환된(substituted)"은 링커의 골격에 존재하는 하나 이상의 수소가, 표시된 기(들)(indicated group(s))로부터 선택에 의해 대체됨을 나타내고자 하며, 상기 표시된 원자의 정상 원자가(normal valency) 또는 치환되는 기의 적절한 원자의 원자가가 초과되지 않으며, 또한 치환의 결과로써 안정한 화합물이 되는 것을 전제로 한다. 용어 "임의로 치환되는(optionally substituted)"은, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 상기 링커가 본 명세서에 정의된 하나 이상의 치환체들로 치환되거나 치환되지 않는 것을 의미한다. 치환체가 케토 (또는 옥소, 즉 ＝O)기, 티오 또는 이미노기 등일 때, 링커 골격 원자상의 2 개의 수소가 대체된다. 상기 치환체들의 예로서는, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 헤테로아랄킬, 아실, 아로일, 헤테로아로일, 카르복실, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시, 아로일옥시, 헤테로아로일옥시, 알콕시카르보닐, 할로겐, (티오)에스테르, 시아노, 포스포릴, 아미노, 이미노, (티오)아미도, 설프히드릴, 알킬티오, 아실티오, 설포닐, a 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 니트로, 아지도, 퍼플루오로알킬(예: 트리플루오로메틸)을 포함하는 할로알킬, 할로알콕시, 알킬설파닐, 알킬설피닐, 알킬설포닐, 알킬설포닐아미노, 아릴설포노아미노, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 알킬카르복시, 알킬카르복시아미드, 옥소, 히드록시, 메르캅토, 아미노 (임의로 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 등에 의해 모노- 또는 디-치환된 것(mono- or di-substituted)), 이미노, 카르복사미드, 카르바모일 (임의로 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 등에 의해 모노- 또는 디-치환된 것(mono- or di-substituted)), 아미디노, 아미노설포닐, 아실아미노, 아로일아미노, (티오)우레이도, (아릴티오)우레이도, 알킬(티오)우레이도, 시클로알킬(티오)우레이도, 아릴옥시, 아랄콕시, 또는 -O(CH₂)_n-OH, -O(CH₂)_n-NH₂, -O(CH₂)_nCOOH, -(CH₂)_nCOOH, -C(O)O(CH₂)_nR, -(CH₂)_nN(H)C(O)OR, 또는 -N(R)S(O)₂R (여기서, n 은 1 -4 이고 R 은 수소, -알킬, -알케닐, -알키닐, -시클로알킬, -시클로알케닐, -(C-연결된-헤테로시클로알킬), -(C-연결된-헤테로시클로알케닐), -아릴, 및 -헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 것으로서, 다수의 치환도 허용된다. 당업자라면, 적절한 경우, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 등과 같은 상기 치환체들 또는 -OH, -NHR 와 같은 작용기들 자체도 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 적절한 경우, 치환된 모이어티들 자체들 또한 치환될 수 있음을 이해할 것이다.

[0082] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커 L 은 하기 모이어티들에서 선택된 하나를 포함한다: 디설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 티오에테르(-S-), 아민(-NH-), 에스테르(-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카르복사미드(-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄(-NH-C(=0)-0- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 우레아 모이어티(-NH-C(=0)-NH-).

[0083] 본 발명의 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커 L 은 하기 목록에서 선택된 다수의 m 기(m groups)로 구성된다 : 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐렌, 헤테로알키닐렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 및 헤테로아랄킬렌, 여기서, 각 기(group)는 임의로 독립적으로 치환될 수 있고, 상기 링커는 하기 모이어티들 중 하나로부터 독립적으로 선택된 다수의 n 모이어티를 추가로 포함한다: 디설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 티오에테르(-S-), 아민(-NH-), 에스테르(-O-C(=O)- 또는 -C(=O)-O-), 카르복사미드(-NH-C(=O)- 또는 -C(=O)-NH-), 우레탄(-NH-C(=0)-0- 또는 -O-C(=O)-NH-), 및 우레아 모이어티(-NH-C(=O)-NH-), 여기서 m = n+1 이다. 특정 실시예들에 있어서, m 은 2이고 n 은 1이거나, m 은 3 이고 n 은 2이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 비치환된 2 개 또는 3 개의 비치환된 알킬렌기들, 및 상기 비치환된 알킬렌기들을 연결하는 각각 1 또는 2 개의 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 또는 우레아 모이어티들을 포함한다.

[0084] 특정 실시예에서, 상기 링커 L 은 헤테로아릴렌기를 포함하지 않는다.

[0085] 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬의 탄소 원자들은 R₂는 독립적으로 임의로 치환된 메틸렌기(-CH₂-)의 부분이다. 이들 특정 실시예들에 있어서, 상기 임의의 치환체들은 독립적으로 할로겐 및 C_1-6-알킬, 특히 메틸로부터 독립적으로 선택된다.

[0086] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커 L 은 안정한 링커(stable linker)이다.

[0087] 본 발명의 문맥에서, 용어 "안정한 링커(stable linker)"는 (i) 효소의 존재하에 및 (ii) 세포 내 환원 환경에서 안정한 링커를 의미한다.

[0088] 특정 실시예들에 있어서, 상기 안정한 링커는 (i) 효소-절단 가능한 하부 구조(enzyme-cleavable substructure) 및/또는 (ii) 디설파이드기를 포함하지 않는다. 이들 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 최대 12 개, 상세하게는 2 내지 10 개, 보다 상세하게는 4 내지 9 개, 가장 상세하게는 6 내지 8 개의 원자의 길이를 가진다.

[0089] 다른 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 절단 가능한 링커이다.

[0090] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "절단 가능한 링커(cleavable linker)"는 (i) 효소에 의해 절단이 가능하거나 또는 (ii) 환원성 링커인 링커를 의미한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 용어는 효소에 의해 절단 가능한 링커만을 의미한다 (환원 링커는 의미하지 않음).

[0091] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "효소에 의해 절단 가능한 링커(linker that is cleavable ... by an enzyme)"은 효소, 특히 "카텝신 B"와 같은 리소좀 펩티다제(lysosomal peptidase)에 의해 절단이 가능하여, 내재화(internalization) 이후 표적화 항체(targeting antibody)에 결합된 독소 카고(toxin cargo)의 세포 내 방출을 초래하는 링커를 의미한다(참조: Dubowchik et al., Bioconjug Chem. 13 (2002) 855-69). 특정 실시예들에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 하기로부터 선택된 디펩티드(dipeptide)를 포함한다; Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit 및 Val-Cit, 특히, 여기서 상기 절단 가능한 링커는 상기 디펩티드와 아마톡신 사이에 p-아미노벤질(PAB) 스페이서를 추가로 포함한다.

[0092] 이들 특정 실시예들에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 L¹-L^*-L² 구조를 포함하며, 여기서 L^* 는 p-아미노벤질 디펩티드 모이어티이고, L¹은 L^*를 아마톡신에 연결하는 링커의 일부로서, 특히 여기서 L¹은 NH- 또는 -O- 기, 특히 -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-O- 또는 -C(=O)-O- 기를 통하여 L^*에 연결되며, 또한 여기서, L² 는 L^*를 상기 표적-결합 모이어티에 연결하는 링커의 일부로서, 특히 여기서 L² 는 -(CH₂)_m- 모이어티를 통하여 L^* 에 연결되거나(여기서, m 은 1 내지 8, 특히 1 내지 5에서 선택되는 정수), 또는 -(CH₂CH₂O)_n- 모이어티(여기서, n 은 1 내지 3, 특히 1 내지 2에서 선택되는 정수)를 통하여 L^* 에 연결된다. 예를 들어, 디펩티드 Val-Ala를 포함하는 절단 가능한 링커의 경우, 상기 L¹-L^*-L²의 구조는 다음과 같다:

L¹

L¹-L^*-L²

[0093] 특히 다른 이러한 실시예들에 있어서, L^* 는 디펩티드 Val-Lys를 포함하고 하기의 구조를 갖는다:

[0094] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커 L¹은 C, O, N 및 S, 상세하게는 1 내지 3 개의 원자, 보다 상세하게는 1 내지 2 개의 원자, 및 보다 더 상세하게는 단지 1 개의 원자로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 원자의 선형 사슬이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬의 원자들의 최소한 50% 이상이 C 원자이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬의 원자들은 단일 결합으로 연결되어 있다.

특정 실시예에서, L¹은 아마톡신의 일부인 -NH- 또는 -O- 기이다. 특정 실시예들에 있어서, L¹은 중심 트립토판 모이어티의 4', 5', 6' 또는 7'의 위치에 부착된 히드록시기에서 유래된 -O- 기이다. 특정 실시예들에 있어서, L¹은 본 발명에 따른 아마닌 유도체의 아미노산 잔기 1의 카르복실산기의 일부인 히드록시기로부터 유래된 -O- 기이다. 특정 실시예들에 있어서, L¹은 본 발명에 따른 아마닌아미드 유도체의 아미노산 잔기 1의 카르복사미드기의 일부인 아미노기에서 유래하는 -NH- 기이다. 특정 실시예들에 있어서, L¹은 본 발명에 따른 아마닌 또는 아마닌아미드 유도체의 아미노산 잔기 3의 일부인 히드록시기로부터 유래된 -O- 기이다.

[0095] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "환원성 링커(reducible linker)"는 세포 내 환원 환경에서 절단될 수 있는 링커, 특히 디설파이드기를 포함하는 링커로서, 세포 내 환원 환경에 의한 내재화(internalization) 이후 표적-결합 모이어티에 결합된 독소 카고(toxin cargo)의 세포 내 방출을 초래하는 링커를 의미한다(참조: Shen et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 10905-10908). 특정 실시예들에 있어서, 상기 환원성 링커는 모이어티를 포함하며,

여기서 R1 내지 R4 는 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택된다.

[0096] 이들 특정 실시예들에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 최대 20 개, 상세하게는 6 내지 18 개, 보다 상세하게는 8 내지 16 개, 가장 상세하게는 10 내지 15 개의 원자의 길이를 가진다. 이들 특정 실시예들에 있어서, 본 발명에 따른 아마톡신을 연결하는 상기 링커의 부분 및 상기 절단 가능한 디설파이드기는 3 또는 4 개의 탄소(C) 원자, 특히 3 개의 탄소(C) 원자의 선형 사슬이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬의 3 또는 4 개의 탄소(C) 원자들은 단일 결합에 의해 연결된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 n-프로필렌이다.

[0097] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커가 존재하고 상기 링커의 일 측은 상기 중심 트립토판 모이어티의 페닐 고리에 부착된 히드록시기(즉, 4', 5', 또는 7' 히드록시 치환체에)에 연결된다.

[0098] 다른 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커가 존재하고 상기 링커의 일 측은 본 발명의 아마니틴 유도체의 한 위치에 연결되며, 여기서 상기 위치는 하기로 부터 선택된다:

(i) S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드, 4'-히드록시- 아마닌아미드, S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드, 5'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드, 및 7'-히드록시-아마닌아미드의 경우, 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자에 있는 카르복사미드기의 질소 원자 (아미드 결합(linkage));

(ii) S-데속시-4'-히드록시-아마닌, 4'-히드록시-아마닌, S-데속시-5'-히드록시-아마닌, 5'-히드록시-아마닌, S-데속시-7'-히드록시-아마닌, 7'-히드록시-아마닌의 경우, 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자에 있는 산기(acid group)의 산소 원자 (에스테르 결합(linkage));

(iii) 본 발명의 아마니틴의 유도체(여기서 상기 아미노산 1의 유리 카르복실산 모이어티는 -C(=O)NH-OR1 로 변환됨)의 경우, 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자에 있는 히드록삼산기의 산소 원자;

(iv) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자에 있는 히드록시기의 산소 원자, 특히 에스테르 결합(linkage), 에테르 결합(linkage) 또는 우레탄 결합(linkage)에 의함; 또는

(v) 아미노산 4의 고리 질소(ring nitrogen).

[0099] 상기 링커와 표적-결합 모이어티의 커플링은 당업자, 특히 항체-약물 컨쥬 게이트(ADCs) 분야의 당업자에게 잘 알려진, 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.

[00100] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커는 우레아 모이어티(...-링커-NH-C(= O)-NH-표적-결합 모이어티)를 통해 표적-결합 모이어티에 연결된다. 이들 특정 실시예들에 있어서, 상기 우레아 모이어티는, 카르밤산(carbamic acid) 유도체......-linker-NH-C(O)-Z[여기서 Z 는 1차 아민으로 대체될 수 있는 이탈기(leaving group)]를 가지는, 라이신 측쇄의 아미노기와 같은 표적-결합 모이어티에 존재하는 1차 아민의 반응에서 비롯된다.

[00101] 다른 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커가 존재하고 티오에테르 모이어티 (...-링커-S-표적-결합 모이어티)를 통해 상기 표적-결합 모이어티에 연결된다. 따라서, 이들 실시예에서, 본 발명은 하기 일반 화학식(generic formula)의 컨쥬게이트에 관한 것이다:

아마니틴-L-X^*-S-Tbm,

여기서, 상기 아마니틴은 본 발명에 따른 아마니틴 유도체이고, L 은 링커이고, X^*는 티올기와 티올-반응성기(티올-반응성기)의 커플링에서 비롯되는 모이어티이며, S 는 상기 티올기의 황 원자, 특히 시스테인 아미노산 잔기의 티올기이고, Tbm 은 표적-결합 모이어티, 특히 상기 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 기능성 항체 단편이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 시스테인 아미노산 잔기는 (i) CL, CH1, CH2 및 CH3 로부터 선택된 항체 도메인에 위치하고; (ii) 상기 항체 도메인의 서열과 가장 유사한 상동성을 나타내는 생식선 서열(germline sequence)이 시스테인과 상이한 아미노산 잔기를 포함하는 위치에 존재하며; 또한 (iii) 용매-노출된(solvent-exposed) 위치에 존재한다.

[00102] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "티올-반응성기(thiol-reactive group)"는

예를 들어, 항체의 유리 시스테인(free cysteine)의, 상세하게는 6.0 내지 8.0 범위의 pH 값, 보다 상세하게는 6.5 내지 7.5 범위의 pH 값을 가지는, 티올기와 선택적으로 반응하는 기(group)를 의미한다. 여기서, 상기 용어 "선택적으로"는 티올-반응성기를 포함하는 분자와 하나 이상의 유리 시스테인 잔기를 포함하는 항체의 커플링 반응의 10% 미만, 상세하게는 5 % 미만, 보다 상세하게는 2% 미만이 상기 항체의 비-시스테인(non-cysteine) 잔기들(예: 라이신 잔기들)과의 커플링 반응임을 의미한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 티올-반응성기는 브로모아세트아미드, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 및 위치 3에 이탈기를 갖는 말레이미드로부터 선택되는 것으로서; 특히 -Br 및 치환된 티올(참조, 예: 미국 특허번호 제 9,295,729), 및 위치 4에 이탈기를 갖는 1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온에서 선택된 이탈기, 특히 -Br 및 치환된 티올(참조, 예: 미국 특허번호 제 9,295,729), 및 메틸설포닐 벤조티아졸, 메틸설포닐 페닐테트라졸, 메틸설포닐 페닐옥사디아졸 (참조: Toda et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52 (2013) 12592-6), 3-아릴프로피오니트릴 (참조: Kolodych et al., Bioconjugate Chem. 2015, 26, 197-200), 및 5-니트로-피리딘-2-일-디설피드(...-L-S-S-(5-니트로-피리딘-2-일)로부터 선택된 이탈기를 의미한다.

[00103] 특정 실시예들에 있어서, 상기 링커와 연결되는 일 측에 위치하고 표적-결합 모이어티에 존재하는 위치 또는 작용기에 직간접적으로 연결될 수 있는 상기 위치 또는 작용기는, 하나의 표적-결합 모이어티 또는 2 개의 표적-결합 모이어티에 존재하는 2 개의 티올기와 반응할 수있는 모이어티이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 티올-반응성기는 위치 3 및 4에 2 개의 이탈기를 갖는 말레이미드이고, 특히 3,4-디브로모말레이미드, 3,4-비스(아릴티오)-말레이미드, 특히 3,4-디페닐티오-말레이미드, 및 3,4-비스(헤테로아릴티오)-말레이미드, 특히 3,4-비스(2- 피리디닐-설파닐)-말레이미드이다. 다른 특정 실시예들에 있어서, 상기 티올-반응성기는 위치 4 및 5에 2 개의 이탈기를 갖는 1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온이고, 특히 4,5-브로모-1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온, 및 4,5-비스(아릴티오)-1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온, 특히 4,5-디페닐티오-1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온, 및 4,5-비스(헤테로아릴티오)-1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온, 특히 4,5-비스(2-피리디닐-설파닐)-1,2-디하이드로피리다진-3,6-디온에서 선택된다.

[00104] 특정 실시예들에 있어서, 티올기와 티올-반응성기의 커플링으로 비롯된 모이어티는 하기로부터 선택된다: 티올-치환된 아세트아미드; 티올-치환된 숙신이미드; 티올-치환된 숙시남산(succinamic acid); 티올-치환된 헤테로아릴, 특히 티올-치환된 벤조티아졸, 티올-치환된 페닐테트라졸 및 티올-치환된 페닐옥사디아졸; 및 디설파이드(disulphide), 여기서 하나의 황 원자는 항체의 시스테인 잔기로부터 유래된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 티올기와 티올-반응성기의 커플링으로 비롯된 모이어티는 티올-치환된 숙신이미드이다.

[00105] 특정 실시예들에 있어서, 상기 단락 [00101]의 일반 화학식(generic formula)에 존재하는 상기 모이어티 L-X^*-S 의 링커 L 은 하기 모이어티 그룹으로부터 선택된다:

(아마니틴 측(side)) -(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측(side));

(아마니틴 측) -(CH₂)3-S-S-(CH₂)2-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -(CH₂)2-S-S-(CH₂)3-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -(CH₂)3-S-S-(CH₂)3-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -(CH₂)4-S-S-(CH₂)4-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -(CH₂)2-CMe₂-S-S-(CH₂)2-X-S (Tbm 측);

(아마니틴 측) -(CH₂)2-S-S-CMe₂-(CH₂)2-X-S (Tbm 측);

(아마니틴 측) -(CH₂)3-S-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Cit-Val-CO(CH₂)₅-X-S- (Tbm 측)

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Ala-Val-CO(CH₂)₅-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Ala-Val-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Ala-Phe-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Lys-Phe-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Cit-Phe-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Val-Val-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-lle-Val-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-His-Val-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH₂-C₆H₄-NH-Met-Val-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측);

(아마니틴 측) -CH2-C₆H₄-NH-Asn-Lys-CO(CH₂)₂-X-S- (Tbm 측); 그리고,

여기서 디펩티드 서열(dipeptide sequences)을 플랭킹(flanking)하는 -NH- 및 -CO- 는 상기 디펩티드의 카르복시- 및 아미노-말단에 각각 아미드 결합을 형성하는 상기 링커의 아미노 및 카르보닐 모이어티를 나타낸다.

[00106] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "티올기와 티올-반응성기의 커플링으로 비롯된 모이어티(a moiety resulting from coupling of a thiol group to a thiol-reactive group)"는 (i) 시스테인 잔기의 황 원자에 의해 티올-반응성기에 존재하는 이탈기 Y의 친핵성 치환(nucleophilic substitution), 예로는 브로모아세트아미드기, 요오도아세트아미드, 4,6-디클로로-1,3,5-트리아진-2-일아미노기, 알킬설폰 또는 헤테로아릴설폰; (ii) 시스테인 잔기의 HS 기를 티올-반응성기(예: 말레이미드)의 활성화된 이중 결합에 추가, 또는 (iii) 활성화된 디설파이드 또는 메탄티오설포네이트를 시스테인 잔기의 황 원자와 디설파이드 교환(exchange), (예: 피리딘-2-티올, 5-니트로피리딘-2-티올 또는 메탄설피네이트를 이탈기로 하여 수행); 또는 (iv) 시스테인 잔기의 황 원자와 티올-반응성기의 일부인 반응성 모이어티 사이에 안정적인 결합을 야기하는 임의의 기타 화학 반응, 으로부터 비롯되는 구조를 의미한다.

[00107] 상기 티올기의 커플링으로 인한 1 차 모이어티는 임의로 추가로 유도체화될(derivatized) 수 있다. 예를 들면, 말레이미드로부터 생성된 숙신이미 딜 티오에테르는 하기 일반 구조를 가지는 숙신남산 티오에테르로 가수분해 될 수 있다.

또는

[00108] 다른 특정 실시예들에 있어서, 부위-특이적 결합(site-specific coupling)은 부위-결합 모이어티에 존재하는 디설파이드 다리(bridge)를 감소시킴으로써, 및 2 개의 시스테인 잔기를 아마니틴-L-X^* 작제물(construct)에 존재하는 가교(bridging) 모이어티 X^*와 반응시킴으로써 달성될 수 있다 (참조: Badescu et al. Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (2014) 1 124-1 136).

[00109] 유사 실시예에서, 부위-특이적 결합(site-specific coupling)은 부위-결합 모이어티에 존재하는 디설파이드 다리(bridge)를 감소시킴으로써, 및 2 개의 시스테인 잔기를 아마니틴-L-X^* 작제물(construct)에 존재하는 가교(bridging) 모이어티 X^*와 반응시킴으로써 달성될 수 있으며, 특히 여기서 X^* 는 하기와 같다

(참조: Bryden et al., Bioconjug Chem, 25 (2014) 61 1 -617; Schumacher et al., Org Biomol Chem, 2014, 7261 -7269).

[00110] 다른 특정 실시예에서, 커플링은 상기 링커에 존재하는 아미노기를 상기 표적-결합 모이어티에 존재하는 글루타민 잔기에 트랜스아미나제를 통한 위치 특이적(regiospecific) 커플링, 특히 항체의 글루타민 Q295 에 커플링함으로써 달성된다.

[00111] 특정 실시예에서, 커플링은 N-글리칸 측쇄(N-glycan side chain)를 포함하는 표적-결합 모이어 티에 부위-특이적 결합(site-specific conjugation)에 의해 달성된다. 특히, N-글리칸 측쇄는 효소적으로 분해된 후, 아지도-갈락토스 (azido-galactose)로 글리코실 전이반응(trans-glycosylation)될 수 있다. 클릭 화학(click chemistry)을 이용하여, 이러한 변형된(modified) 표적-결합 모이어티는 적절히 변형된 작제물(constructs)인 '아마니틴-L-X^*' 에 결합될 수 있으며, 여기서 X^* 는, 예를 들어, 디벤조-시클로옥틴(dibenzo-cyclooctyne, DIBO) 또는 C-C 삼중 결합을 포함하는 유사 모이어티이다. 예를 들어, 상기 작제물 '아마니틴-L-NH₂' 는 히드록시 숙신이미드 모이어티의 친핵성 치환(nucleophilic substitution)에 의해 DIBO-SE 에 결합될 수 있다.

DIBO-SE

이어서, 상기 결과물인 DIBO-변형된 링커 작제물은 상기 언급된 아지도 유도체에 결합될 수 있다. 대안적 실시예에서, 상기 표적-결합 모이어티는 클릭-화학을 허용하는 비-천연 아미노산의 통합(incorporation), 특히 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF)의 통합에 의해 변형될 수 있다.

[00112] 특정 실시예들에 있어서, 상기 -L-X^* 에서 링커 L 은 C, O, N 및 S 로부터 독립적으로 선택된 최소한 5 개, 상세하게는 최소한 10 개, 보다 상세하게는 10 개 내지 20 개의 원자의 선형 사슬이고; 상세하게는 10 개 내지 18 개, 보다 상세하게는 10 개 내지 16 개, 그리고 보다 상세하게는 10 개 내지 15 개의 원자의 선형 사슬이다. 특정 실시예들에 있어서, 선형 사슬의 원자들의 최소한 60%는 탄소 원자들이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 선형 사슬의 원자들은 단일 결합에 의해 연결된다.

[00113] 대안적 실시예들에서, 표적-결합 모이어티에 존재하는 위치 또는 작용기에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있는 위치 또는 작용기는 에티닐기, 또는 보다 일반적으로, 알키닐기가 아니거나, 또는 1,3-쌍극성 고리 첨가(1,3-dipolar cycloaddition)에서 1,3 쌍극자(1,3-dipole)와 반응할 수 있는 기(group)가 아니다 (클릭 화학).

[00114] 다른 특정 실시예들에 있어서, 아마니틴-L-X^* 작제물의 표적-결합 모이어티 에 대한 부위-특이적 커플링(site-specific coupling)은, 상기 변형된 표적-결합 모이어티를 아마니틴-L-X^* 작제물(여기서, X^* 는 히드록실아민 모이어티)과 반응시켜, 케토기를 포함하는 비-천연 성분(특히 p-아세틸페닐알라닌 (pAcPhe))의 표적-결합 모이어티로의 통합에 의해 달성될 수 있다.

[00115] 추가 실시예에 있어서, 알데히드 태그(aldehyde tag)를 생성하기 위해 인식 서열(recognition sequence) CxPxR에서 시스테인기에 대해 고선택적인(highly selective) 포르밀글리신 생성 효소(FGE)에 의해 포르밀기가 도입될 수 있다. 상기 알데히드 태그는 아마니틴-L-X^* 작제물에 존재하는 적절한 기(group) X^*와 반응할 수 있으며, 특히 여기서 X^*는

이다 (참조: Agarwal et al., Bioconjugate Chem 24 (2013) 846-851).

[00116] 본 발명의 두 번째 관점은 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

[00117] 본 발명의 세 번째 관점은 환자의 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 특히 여기서 상기 암은 유방암, 췌장암, 담도암 (cholangiocarcinoma), 대장암(colorectal cancer), 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군에서 선택된다.

[00118] 본 명세서에서, 질병(disease) 또는 장애(disorder)와 관련하여 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)" 의 용어들은 하기 중 하나 이상을 성취한 것을 의미한다: (a) 장애의 심각성을 경감시키는 것; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상들의 발생을 제한 또는 예방하는 것; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상들의 악화를 억제하는 것; (d) 이전에 장애(들)이 있었던 환자들에서 해당 장애(들)의 재발을 제한 또는 예방하는 것; 및 (e) 이전에 장애(들)과 관련된 증상이 있었던 환자들에서 증상들의 재발을 제한 또는 예방하는 것.

[00119] 본 명세서에서, 상기 치료는 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 "투여(administering)"는 생체 내(in vivo) 투여뿐만 아니라 정맥 이식편(vein grafts)과 같은 생체 외(ex vivo) 조직에 직접 투여하는 것을 포함한다.

[00120] 특정 실시예들에 있어서, 본 발명의 컨쥬게이트가 치료적 유효량 (therapeutically effective amount)으로 사용된다.

[00121] 상기 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 양의 치료제(therapeutic agent)이다. 특정 치료제의 유효량은 치료제의 특성(nature), 투여 경로, 치료제를 투여받을 동물의 크기 및 종(species), 그리고 투여 목적과 같은 요소들에 따라 변할 수 있다. 각 개별 경우에서의 유효량은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

[00122] 본 발명의 또 다른 관점은 본 발명에 따른 아마니틴 유도체, 또는 아마니틴 유도체와 표적-결합 모이어티를 갖는 본 발명의 컨쥬게이트, 및 추가적으로 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제, 충진제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제; 및/또는 방부제를 하나 이상 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것이다.

[00123] 상기 용어 "약학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable)"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 (U.S. Pharmacopeia) 또는 동물, 특히 인체 사용에 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재됨을 의미한다.

[00124] 특정 실시예들에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 투여되는 약제의 형태로 사용된다. 이것은 주사제(injectables) 및 주입제(infusions)를 포함하는 비경구 투여를 포함한다. 상기 주사제는 앰퓰 형태 또는 즉시 사용가능한 (ready-to-use) 주사제[예: 즉시 사용 가능한 주사기 또는 일회용 주사기, 및 이 외에도 다수의 인출을 위해 구멍을 뚫을 수 있는 플라스크(puncturable flasks for multiple withdrawal)]로 제제화된다. 주사제의 투여는 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 피내 투여의 형태일 수 있다. 특히, 결정(crystals), 용액, 나노입자 또는 콜로이드 분산 시스템(예; 하이드로졸)의 현탁액으로서 각각 적합한 주사 제형을 생산하는 것이 가능하다.

[00125] 주사용 제제는 추가적으로 농축물로 제조될 수 있으며, 이는 수성 등장성 희석제와 함께 용해되거나 분산될 수 있다. 또한, 주입제(infusion)는 등장성 용액, 지방 에멀젼, 리포좀 제형 및 마이크로 에멀젼의 형태로 제조될 수 있다. 주사제와 유사하게, 주입 제형(infusion formulations)은 희석을위한 농축물의 형태로 제조 될 수도 있다. 주사용 제형은 또한 입원 환자 및 외래 치료(ambulant therapy) 환자 모두의 치료에 영구 주입(permanent infusions) 형태(예: 미니 펌프 방식)로 적용될 수 있다.

[00126] 비경구 약물 제제에 알부민, 혈장, 팽창제, 표면-활성 물질, 유기 희석제, pH-영향 물질, 복합 물질(complexing substances) 또는 중합체 물질 [특히, 단백질 또는 중합체에 대한 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 컨쥬게이트(toxin conjugates)의 흡착에 영향을 미치는 물질]을 추가하는 게 가능하며, 또한 이들은 주입 기기 또는 포장 재료(예: 플라스틱 또는 유리)와 같은 물질에 대한 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 컨쥬게이트의 흡착을 감소시키기 위해 추가될 수 있다.

[00127] 표적-결합 모이어티를 포함하는 본 발명의 아마니틴 유도체들은 다음과 같은 비경구에서 마이크로 캐리어 또는 나노 입자(예: 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리아미노산 또는 폴리에테르 우레탄에 기초하여 미세하게 분산된 입자)에 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 컨쥬게이트가 미세 분산, 분산 및 현탁된 형태로 각각 도입되는 경우, 비경구 제제들은 저장소(depot) 제제[예:"복수 단위 원리(multiple unit principle)"를 토대로]로 변형될 수 있고, 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 컨쥬게이트가 제제(예: 후속적으로 이식되는 정제 또는 막대)에 동봉된(enclosed) 경우, 상기 비경구 제제들은 "단일 단위 원리(single unit principle)"를 토대로 약제에 있는 결정(crystals)의 현탁액으로 변형될 수 있다. 단일 단위 및 다중 단위 제제의 이러한 임플란트 또는 저장소 약제는 종종 소위 생분해성 중합체(예: 유산 및 글리콜산의 폴리에스테르, 폴리에테르 우레탄, 폴리아미노산, 또는 다당류)로 구성된다.

[00128] 비경구용으로 제제화된 본 발명의 약학적 조성물의 생산 시 첨가되는 보조제 및 담체들은 특히 살균수(aqua sterilisata; sterilized 물), pH 값 영향 물질(예: 유기산 또는 무기산 또는 이들의 염, pH 값 조절용 완충 물질, 등장성 물질(예: 염화나트륨, 탄산 수소 나트륨, 포도당 및 과당, 텐시드(tensides) 및 계면활성제 등)), 유화제(예: 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산의 부분 에스테르(예: 트윈(Tween)^®), 또는 폴리옥시에틸렌의 지방산 에스테르(예: 크렘포(Cremophor)^®), 지방유(예: 땅콩유, 콩기름 또는 피마자유), 지방산 합성 에스테르(예: 올레산 에틸(ethyl oleate), 이소프로필 미리스테이트 및 중성 오일(예: 미글리올(Miglyol^®)), 중합체 보조제(예: 젤라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈), 유기 용매의 용해도를 증가시키는 첨가제(예: 프로필렌 글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜 또는 복합체 형성 물질(예: 구연산염 및 우레아)), 보존제(예: 벤조산 히드록시프로필 에스테르 및 메틸 에스테르, 벤질 알코올), 항산화제(예: 아황산 나트륨) 및 안정화제(예: EDTA)이다.

[00129] 바람직한 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 현탁액으로 제제화할 경우, 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 컨쥬게이트의 경화(setting)를 방지하기 위한 증점제, 또는 침전물 및/또는 복합체 형성제(complex forming agents)(예: EDTA)의 재현 탁성을 보장하기 위한 텐시트(tensides) 및 고분자 전해질이 첨가된다. 또한, 다양한 고분자를 가지는 활성 성분의 복합체를 달성하는 것도 가능하다. 이러한 고분자의 예로는 폴리스티렌, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 플루로닉스 (Pluronics^®) 또는 폴리에틸렌 글리콜 소르비트 지방산 에스테르를 들 수 있다. 상기 본 발명의 표적-결합 모이어티 독소 컨쥬게이트는 포접 화합물(inclusion compound)(예: 시클로 덱스트린)의 형태로 액체 제제에 통합될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 분산제는 추가 보조제로서 첨가될 수 있다. 동결건조제 생산을 위해서는, 스캐폴딩제(scaffolding agents)(예: 만나이트(mannite), 덱스트란, 사카로스, 인간 알부민, 락토스, PVP 또는 다양한 젤라틴)가 사용될 수 있다.

실시예

[00130] 이하, 비제한적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다:

A. S-데속시-a-아마니틴 HDP 30.0735 의 총합성

HDP 30.0735

1. N-( tert -부톡시카르보닐)-L-6-아세톡시트립토판 HDP 30.2550 의 제조

HDP 30.2550

[00131] 590.0 mg(2.68 mmol)의 6-히드록시-L-트립토판(CAS: 13567-14-1)을 30 mL의 1,4-디옥산/물(1:1, v,v)에 현탁하였다. 2.68 mL(2.68 mmol)의 아르곤 하에서, 1 N NaOH 를 주변 온도(ambient temperature)에서 즉시 첨가하였다. 생성된 노란 용액을 574.6 μL(2.68 mmol)의 Boc 무수물(Boc₂O)로 처리 후 실온에서 24시간 교반하였다. 상기 용액을 1 N 염산으로 pH 2.4로 산성화하고 25 mL의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 혼합한 에틸 아세테이트 추출물들을 포화 NaCl 용액으로 세척 후, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과 및 증발 건조하여 785.0 mg의 미정제(crude) 물질을 수득하였다. 상기 미정제 물질 N-Boc-6-히드록시-L-트립토판을 4.91 mL(4.91 mmol)의 1 N NaOH에 용해시킨 후 463.2 mL(500.3 mg, 4.90 mmol)의 무수아세트산(acetanhydride)으로 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 아르곤 하에서 3시간 동안 교반한 후 5% 구연산으로 산성화하였다. 상기 수상(aqueous phase)을 25 mL의 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 포화 NaCl로 세척 후, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과 및 증발 건조하여 635 mg의 미정제(crude) 고체를 수득하였다.

[00132] 상기 미정제 생성물을 330 g의 실리카 겔 컬럼 상에서 플래쉬 크로마토그래피로 [CH₂Cl₂ + 1% 아세트산]에서 [CH₂Cl₂/메탄올(15:1) + 1% 아세트산]의 구배로 정제하고(검출 파장 254 nm), 톨루엔으로 공동 증발시킨 후, 564.4 mg(수율: 56%)의 백색 분말을 수득하였다.

MS (ESr) found: 361.08 [M-H]^-; calc.: 362.15 (C₁₈H₂₂N₂O₆)

2. Cis , trans -1-( tert -부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-6-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 cis -HDP 30.2555 및 trans- HDP 30.2555 ( cis , trans -6-아세톡시-Hpi)의 제조

광산소화(Photooxygenation)

[00133] 광산소화(photo-oxygenation)를 400 W 고압 나트륨 증기 램프(Sirius X400 lamp 230 V, 400 W; 55000 루멘(lumen), 거리: 1.3 m) 또는 텅스텐-할로겐 램프(500 W)를 사용하여 수행하였다. 텅스텐-할로겐 램프에는 λ<490 nm의 빛 차단 필터 용액(CuCl₂-CaCO₃)을 사용하였다.

[00134] 메틸렌 블루 또는 로즈 벵갈(Rose Bengal)을 염료 감응제(dye sensitizer)로 사용하였다.

[00135] 상기 반응은 GL 18 쓰레드(thread)를 갖는 2 개의 커넥터를 갖는 DURAN^®; 붕규산(borosilicate) 유리, 평평한 바닥 및 평평한 실험실용 플랜지(DN)로 제조된 열교환 자켓(jacket)을 갖는 500 mL 원통형 반응 용기에서 수행되었다. 램프로부터 반응 용기까지의 거리는 15 cm 였고, 반응 온도 범위는 3-4℃ 였다.

[00136] 최종 생성물을 330 g의 실리카 레디 세프트 플래시(Silica Redi Sept Flash) 컬럼(Teledyne ISCO Cat. No. 69-2203-330)을 갖는 Teledyne ISCO 플래시 크로마토그래피 시스템 상에서 정제하였다. 용매 CH₂Cl₂, CH₃OH, CH₃COOH 는 표준 HPLC 또는 BP 등급이었다.

[00137] 건조 산소(순도 99.5%)를 분당 2-4 L의 속도로 반응 혼합물을 통해 버블링시켰다.

[00138] 943.0 mg(2.60 mmol)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-6-아세톡시트립토판 HDP 30.2550 와 100 mg의 로즈 벵갈(Rose Bengal)을 500 mL의 메탄올에 용해한 후, 글리콜/물을 냉각 매질로 하여 Huber 저온 유지 장치(Huber cryostat)를 사용하여 3℃로 냉각하였다. 반응 용액에 400 W 고압 나트륨 증기 램프를 조사(irradiation)하였다. 조사를 진행하는 동안, 산소 스트림을 천천히 반응 용액을 통과하게 하여 버블링시켰다. 5 시간의 조사 후, 산소화 및 냉각을 중단하고 상기 반응 매질을 10 mL의 디메틸 설파이드로 처리하였다. 상기 혼합물을 2 시간 동안 교반하고 35℃의 수조 온도를 갖는 회전 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 진한 적색 잔류물을 추가로 고진공 하에서 건조하여 1.20 g의 결정질 고체를 수득하였다. 미정제 생성물을 330 g의 실리카 겔 컬럼(검출 파장: 254 nm) 상에서 [CH₂Cl₂ + 5% 아세트산]에서 [CH₂Cl₂/메탄올(30:1) + 5% 아세트산]의 구배로 정제하였다. 380 mg의 cis-HDP 30.2555 와 290 mg의 trans-HDP 30.2555 를 용출시킨 후 톨루엔으로 공동 증발시켰다. tert-부탄올에서 동결건조 후, 두 이성질체를 모두 오프-화이트(off-white) 색깔의 분말로 수득하였다.

cis-1-(tert-부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-6-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 ( cis -HDP 30.2555)

380 mg cis -HDP 30.2555 수율: 39%

¹ H-NMR (400 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 1.22, 1.44, 1.54 [s, 9H, C(CH₃)₃]; 2.23 (s, 3H, OCOCH₃); 2.46-2.63 (m, 2H, CH₂); 4.14-4.29 (m, 1H, 2-H); 5.35 (s, 1H, 8a-H); 6.39-6.46 (m, 2H, 7-H, 5-H); 7.20-7.24 (m, 1H, 4-H)

¹³ C-NMR (100 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 20.93, 28.45, 31.12, 42.80, 61.12, 69.44, 82.21, 85.82, 87.93, 104.97, 112.98, 124.84, 129.42, 151.51, 154.04, 155.97, 171.34, 175.79

MS(ESI⁺) found: 378.92 [MH]⁺; calc: 378.14 (C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS(ESI⁺) found: 401.17 [M+Na]⁺; calc: 401.14 (C₁₈H₂₂N₂NaO₇)

UV/VIS (CH₃OH): λ_max = 296 nm, 239 nm, 215 nm

λ_min = 266 nm, 227 nm

trans-1-(tert-부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-6-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 ( trans -HDP 30.2555)

290 mg trans -HDP 30.2555 수율: 30%

¹ H-NMR (400 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 1.22, 1.45, 1.54 [s, 9H, C(CH₃)₃]; 2.22 (s, 3H, OCOCH₃); 2.55-2.73 (m, 2H, CH₂); 4.51-4.57 (m, 1H, 2-H); 5.21-5.24 (s, 1H, 8a-H); 6.36-6.41 (m, 2H, 7-H, 5-H); 7.17-7.18 (m, 1H, 4-H)

¹³ C-NMR (100 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 20.95, 28.50, 31.12, 42.47, 60.97, 69.44, 82.06, 84.84, 87.54, 104.74, 112.67, 125.03, 128.70, 152.31, 154.22, 156.00, 171.23, 174.67

MS(ESI⁺) found: 379.00 [MH]⁺; calc: 378.14 (C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS(ESI⁺) found: 401.17 [M+Na]⁺; calc: 401.14 (C₁₈H₂₂N₂NaO₇)

MS(ESI⁺) found: 779.00 [2M+Na]⁺; calc: 779.28 (C₃₆H₄₄N₄Na₂O₁₄)

UV/VIS (CH₃OH): λ_max = 299 nm, 241 nm, 215 nm

λ_min= 268 nm, 228 nm

3. S-데속시-a-아마니틴 HDP 30.0735 의 제조

단계 1: HDP 30.0013

[00139] FmocHypOH(10.0 g, 28.3 mmol)를 100 mL의 80% 메탄올에 현탁 후 CS₂CO₃ (4.6 g, 14.1 mmol)를 첨가하였다. 상기 현탁액이 완전히 용해되도록 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축 건조시킨 후 100 mL DMF 에 다시 용해시켰다. 알릴브로마이드(1.6 mL, 3.6 g, 29.7 mmol)를 적가한 후 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 증류 제거 후 잔류물을 tert-부틸 에스테르 에테르에 용해시켰다. 침전물을 여과하고 맑은 용액을 셀 라이트 전 컬럼 크로마토그래피(Celite prior column chromatography)에 흡수시켰다. 상기 화합물을 n-헥산/에틸 아세테이트 구배로 220 g 실리카 겔 상에서 정제하였다.

수율: 11.5 g, 100%

단계 2: HDP 30.0400

[00140] HDP 30.0013(5.0 g, 14.1 mmol)와 피리디늄 4-톨루엔설포네이트(1.33 g, 5.3 mmol)를 40 mL의 디클로로에탄 중의 1,3-디하이드로-2H-피란-2-일-메톡시메틸수지(5.0 g, 1.0 mmol/g THP-수지)의 현탁액에 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 밤새 교반하였다. 냉각 후, 상기 수지를 여과하고 디클로로에탄, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 tert-부틸메틸 에테르로 광범위하게 세척하였다.

[00141] 로딩 양은 0.62 mmol/g 이었다 (탈보호(deprotection) 이후 플루오렌 메틸기의 UV-분광법에 의해 결정하였다).

단계 3: HDP 30.2569 (고상(solid phase) 합성)

수지 전처리(Resin pre-treatment)

[00142] HDP 30.0400(0.31 g, 0.25 mmol)를 N,N-디메틸바르비투르산(241 mg, 1 .55 mmol) 및 Pd(PPh₃)₄(35 mg, 0.03 mmol)로 처리하였다. 상기 수지는 실온에서 밤새 흔들었다. 이후, 상기 수지를 디클로로메탄, DMF, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 tert-부틸메틸 에테르로 광범위하게 세척 후 감압 하에 건조시켰다.

결합 과정(Coupling Procedure):

[00143] 모든 반응물 및 시약을 디클로로메탄/DMF (1:1, v/v)에 용해시켰다. HDP 30.0477[참조: WO 2014/009025](102 mg, 0.30 mmol)을 6.0 mL의 디클로로메탄/N,N-디메틸포름아미드에 용해한 후, 4.0 mL의 0.2 N 용액 PyBOP/HOBt 및 2 mL의 DIEA (40% in DMF)로 처리하였다. 2.0 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가 후, 반응물을 마이크로파 조사(20 W, CEM 마이크로파 반응기)에 의해 8분 동안 50℃까지 가열하고, 결합 후 N,N-디메틸포름아미드로 세척하였다.

Fmoc-탈보호(Fmoc-Deprotection) :

[00144] 50℃에서 10분 동안 N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘(6.0 mL)을 첨가하여 탈보호를 수행하였다. 상기 수지를 N,N-디메틸포름아미드로 세척하였다 (최종 아미노산의 결합 후 탈보호 없음).

[00145] 다른 모든 아미노산은 상기 프로토콜에 따라 결합되었으며, 가중치 (weightings)는 하기와 같다:

(0.102 g, 0.30mmol 1 .5 당량 HDP 30.0477 MW: 339.6, 상기 참조)

0.72 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocAsn(Trt)OH MW: 599.7

0.71 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocCys(OTrt)OH MW: 586.7

0.36 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocGlyOH MW: 297.3

0.36 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocIleOH MW: 353.4

0.36 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocGlyOH MW: 297.3

0.114 g, 0.30 mmol 1.5 당량 HDP 30.2555 MW: 378.4

[00146] 탈보호의 완료 후, 상기 수지를 최종적으로 바닥 프릿(bottom frit)이 있는 주사기로 옮긴 후, DCM으로 세척하고, 감압 하에 건조시켰다.

수지 배출(Resin Release) 및 B-고리 형성(B-Ring Formation)

[00147] 5 mL TFA, 5 mL DCM 및 10% 메탄올의 용액을 수지에 흡인한(aspirated) 후 주변 온도에서 15분 동안 교반하였다. 상기 용액을 50 mL 반응 플라스크에 분배하고, 상기 수지를 (TFA DCM(1:1) + 10% 메탄올)로 1회 세척 후, 상기 플라스크에 부어 넣었다. 상기 반응 플라스크를 16 시간 동안 교반 후, 트리이소프로필실란(0.5 mL)을 첨가하고 반응물을 진공상태에서 농축시켰다. 잔류물을 500 μL 의 메탄올에 용해시킨 후 펩티드은 50 mL의 빙냉(ice-cold) TBME 에 침전되었다. 원심분리 후, 상청액을 따라내고, 침전물을 50 mL의 TBME 로 1회 세척 후, 감압 하에서 건조하였다.

[00148] 상기 침전물을 2 mL의 메탄올에 용해시킨 후 분취용 역상 컬럼 크로마토 그래피(preparative reverse phase column chromatography)로 정제하였다. 메탄올을 감압 하에 증류하여 제거하고, 잔류 수상(aqueous phase)을 동결건조시켰다.

수율: 136.5 mg, 62.5%

MS (ESI⁺) found: 1047.4 [M+H]⁺; calc: 1047.4 (C₄₅H₆₃N₁₀O₁₇S)

HPLC: 91.9 면적%

단계 4: 고리화반응(Cyclisation) (A-고리 형성 HDP 30.2572)

[00149] 상기 동결건조된 단환식(monocyclic) 중간체(136 mg, 130 μmol)를 16 mL의 DMF에 용해시키고 디페닐포스포릴아지드(DPPA, 131 μL, 1300 μmol, 10 당량) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 162 μL, 1300 μmol, 10 당량)으로 처리하였다. 상기 반응물 을 16 시간 동안 교반하였고, 반응의 완료와 더불어 500 μL의 물로 켄칭(quenching)하였다. 전환(conversion)은 HPLC로 모니터링하였다. 상기 혼합물을 감압 농축 후, 1 mL의 메탄올에 재용해시키고, 분취용 역상 컬럼 크로마토 그래피(preparative reverse phase column chromatography)로 정제하였다.

수율: 55.3 mg. 41 %

MS (ESI⁺) found: 1029.33 [M+Na]⁺; calc: 1030.10 (C₄₅H₆₁N₁₀O₁₆S)

HPLC: 99.2 면적%

단계 5: 아세테이트-탈보호(Acetate-Deprotection) (HDP 30.0735)

[00150] HDP 30.2572(55.3 mg, 53.7 μmol)을 7 N 메타놀릭 NH₃ 용액(3.0 mL)에 용해한 후 교반하였다. 전환(conversion) HPLC/MS로 확인하였다. 종료 후(6 - 8 시간), 반응물을 진공에서 농축시키고, 100 μL의 메탄올에 재현탁 후, prep-HPLC로 정제하였다.

수율: 14.1 mg, 29%

HPLC: 100 %

MS (ESI⁺) found: 903.3 [M+H]⁺; calc.: 902.9 (C₃₉H₅₄N₁₀O₁₃S) found: 925.33 [M+Na]⁺

4. 6'-((3-말레이도프로판아미도)-Val-Ala-PAB)-S-데옥시-a-아마니틴(HDP 30.2371)의 제조

단계 1: HDP 30.2364

[00151] S-데속시-α-아마니틴 HDP 30.0735(30 mg, 33.2 μmol) 및 HDP 30.1690(WO 2016/142049, 78 mg, 133 μmol = 4.0 당량)을 1500 μL의 건조 디메틸아세트아미드(DMA)에 용해하였다. 물(199 μL, 1.2 당량) 중 0.2 M 탄산 수소 세슘 용액을 한 부분(portion)에 첨가 후 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1.5 시간 및 4 시간 후, 99 μL(0.6 당량)의 탄산 세슘 용액을 각각 추가로 첨가하였다.

[00152] 18 시간 후, 상기 용매를 고진공에서 증발시켰다.

[00153] 잔류물을 400 μL의 메탄올에 용해시키고 빙냉 MTBE(10 mL)에 적가하였다. 0℃에서 10분 동안 방치 후, 생성된 침전물을 원심 분리(4 분, 4000g)에 의해 분리 하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 다시 MTBE(10 mL)에 재현탁시킨 후 다시 원심 분리를 하였다. 진공 건조된 미정제 생성물을 400 μL의 메탄올에 용해시킨 후 prep-HPLC(Phenomenex Luna-C₁₈(2), 10 μm 컬럼(250 × 21.2 mm), 수 중(in water) 5% 에서 100% 메탄올 구배)로 정제하였다. 생성물 분획물들을 병합 후, 환원하여 23 mg(70%)의 무정형 고체 생성물을 수득하였다.

MS (ESI⁺) [M+Na]⁺ found: 1430.58; calc: 1430.65 (C₆₅H₉₇N₁₃NaO₁₈SSi)

[00154] 초기 용출 피크의 증발에 의해 5 mg(17 %)의 출발물질들을 회수하였다.

단계 2: HDP 30.2366

[00155] HDP 30.2364(9.47 mg, 6.72 μmol)를 750 μL의 트리플루오로 아세트산 (TFA)에 용해하였다. 2분 후, 휘발물을 진공에서 제거하고 잔류물을 750 μL의 물에 용해한 후, pH 10에 도달하여 침전이 발생할 때까지 3% 암모니아를 적가하였다.

[00156] 상기 용액을 동결건조한 후 prep-HPLC[(Phenomenex Luna-C₁₈(2), 10 μm 컬럼(250 × 21.2 mm)을 사용하여, 물 중 5-100%의 메탄올(0.05% TFA) 구배])로 정제하여 생산물 7.72mg(TFA염 기반 89%)를 얻었다.

MS (ESI⁺) [MH]⁺ found: 1 178.42; calc: 1 178.53 (C₅₄H₇₆N₁₃O₁₅S)

단계 3: HDP 30.2371

HDP 30.2366(4.01 mg, 3.10 μmol)을 500 μL의 건조 DMF 에 용해하였다.

[00157] 3-(말레이미도)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(BMPS, 1.65 mg, 2 당량)을 100 μL의 DMF 에 용해한 후 2.1 μL의 DIPEA 을 첨가하였다.

[00158] 1 시간 동안 교반 후, 반응 혼합물을 10 mL의 빙냉된 메틸-tert-부틸 에테르에 적가하였다. 튜브를 얼음 위에 10분간 정치시킨 후 4000 ×g에서 원심분리하였다. 상청액을 제거한 후 펠릿을 10 mL의 신선한 메틸-tert-부틸 에테르로 세척 하였다.

[00159] 진공 건조된 펠렛을 물 중 5-100% 메탄올 구배로 RP-18 HPLC를 사용하여 정제하였다. 순수 분획물들을 증발 건조시킨 후, 1 mL의 tert-부탄올/물로부터 동결건조하여 2.70 mg(65 %)의 무색 분말 생성물을 수득하였다.

MS (ESI⁺) [MH]⁺ found: 1329.3; calc: 1329.6 (C₆₁H₈₁N₁₄O₁₈S)

[M+Na]⁺ found: 1351.5; calc: 1351.5 (C₆₁H₈₀N₁₄NaO₁₈S)

B. S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드 HDP 30.2548 의 총합성

HDP 30.2548

1. N-( tert -부톡시카르보닐)-L-5-아세톡시트립토판 HDP 30.2531 의 제조

HDP 30.2531

[00160] 800.0 mg(3.63 mmol)의 5-히드록시-L-트립토판(CAS: 4350-09-8)을 40 mL의 1,4-디옥산/물(1:1, (v:v)) 혼합물에 현탁하였다. 3.64 mL(3.64 mmol)의 아르곤 하에서 1 N NaOH 를 즉시 주변 온도에서 첨가하였다. 그 후, 생성된 황색 용액을 779.0 μL(794.0 mg, 3.63 mmol)을 Boc 무수물(B0C2O)로 처리한 후, 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 1 N 염산을 사용하여 pH 2.4로 산성화한 후 35 mL의 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 병합한 에틸 아세테이트 추출물들을 포화 NaCl 용액으로 세척한 후 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과 및 증발 건조시켜 1.26 g의 미정제 물질을 수득하였다. 상기 미정제 N-Boc-6-히드록시-L-트립토판을 7.87 mL(7.87 mmol)의 1 N NaOH 에 용해한 후 743.0 μL(802.4 mg, 7.86 mmol)의 무수아세트산으로 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 아르곤 하에서 3시간 동안 교반 후 5% 구연산으로 산성화하였다. 수성 상(aqueous phase)을 25 mL의 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 포화 NaCl 로 세척 후, MgSO₄상에서 건조시키고, 여과 및 증발시켰다.

[00161] 상기 미정제 고체를 [CH₂Cl₂ + 1% 아세트산]에서 [CH₂Cl₂/메탄올(15:1) + 1% 아세트산]의 구배로, 330 g 실리카 겔 컬럼상에서 플래쉬 크로마토 그래피에 의해 정제하고(검출 파장: 254 nm), 톨루엔으로 공동 증발시킨 후, 1020.0 mg(수율: 78 %)의 백색 분말을 수득하였다.

MS (ESI^-) found: 361.08[M-H]^-; calc: 362.15 (C₁₈H₂₂N₂O₆)

¹ H-NMR (400 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 1.39 (s, 9H, C(CH₃)₃); 2.27 (s, 3H, OCOCH₃); 3.08-3.31 (m, 2H, CH₂); 4.39-4.41 (m, 1H, 2-H); 6.81-6.83; 7.13; 7.24-7.26 (m, 2H, 6-H, 7-H); 7.30-7.32 (1H, 4-H)

2. Cis,trans -1-( tert -부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-5-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 cis -HDP 30.2536 및 trans- HDP 30.2536 ( cis,trans -5-아세톡시-Hpi)의 제조

광산소화(Photooxygenation)

[00162] 광산소화(photo-oxygenation)를 400 W 고압 나트륨 증기 램프(Sirius X400 lamp 230 V, 400 W; 55000 루멘(lumen), 거리: 1.3 m) 또는 텅스텐-할로겐 램프(500 W)를 사용하여 수행하였다. 텅스텐-할로겐 램프에는 λ<490 nm의 빛 차단 필터 용액(CuCl₂-CaCO₃)을 사용하였다.

[00163] 메틸렌 블루 또는 로즈 벵갈(Rose Bengal)을 염료 감응제(dye sensitizer)로 사용하였다.

상기 반응은 GL 18 쓰레드(thread)를 갖는 2 개의 커넥터를 갖는 DURAN^®; 붕규산 (borosilicate) 유리, 평평한 바닥 및 평평한 실험실용 플랜지(DN)로 제조된 열교환 자켓(jacket)을 갖는 500 mL 원통형 반응 용기에서 수행되었다. 램프로부터 반응 용기까지의 거리는 15 cm 였고, 반응 온도 범위는 3-4℃ 였다.

[00164] 최종 생성물을 330 g의 실리카 레디 세프트 플래시(Silica Redi Sept Flash) 컬럼(Teledyne ISCO cat. 69-2203-330)을 갖는 Teledyne ISCO 플래시 크로마토그래피 시스템 상에서 정제하였다. 용매 CH₂Cl₂, CH₃OH, CH₃COOH 는 표준 HPLC 또는 BP 등급이었다.

건조 산소(순도 99.5%)를 분당 2-4 L의 속도로 반응 혼합물을 통해 버블링시켰다.

[00165] 1.20 g(3.17 mmol)의 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-5-아세톡시트립토판 HDP 30.2531과 100 mg의 로즈 벵갈(Rose Bengal)을 500 mL의 메탄올에 용해 후, 글리콜/물을 냉각 매질로 하여 Huber 저온 유지 장치(Huber cryostat)를 사용하여 3℃로 냉각하였다. 반응 용액에 400 W 고압 나트륨 증기 램프를 조사(irradiation)하였다. 조사를 진행하는 동안, 산소 스트림을 천천히 반응 용액을 통과하게 하여 버블링시켰다. 4 시간의 조사 후, 산소화 및 냉각을 중단하고 상기 반응 매질을 20 mL의 디메틸 설파이드로 처리하였다. 상기 혼합물을 2 시간 동안 교반하고 35℃의 수조 온도를 갖는 회전 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 진한 적색 잔류물을 추가로 고진공 하에서 건조하여 1.20 g의 결정질 고체를 수득하였다. 미정제 생성물을 330 g의 실리카 겔 컬럼(검출 파장: 254 nm) 상에서 [CH₂Cl₂ + 5% 아세트산]에서 [CH₂Cl₂/메탄올(30:1) + 5% 아세트산]의 구배로 정제하였다.

[00166] 178 mg의 cis -HDP 30.2536 와 132 mg의 trans -HDP 30.2536 을 용출시킨 후 톨루엔으로 공동 증발시켰다. tert-부탄올에서 동결건조 후, 두 이성질체를 모두 오프-화이트(off-white) 색깔의 분말로 수득하였다.

cis-1-(tert-부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-5-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 ( cis -HDP 30.2536)

178 mg cis -HDP 30.2536 수율: 15%

¹ H-NMR (400 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 1.44, 1.54 (s, 9H, C(CH₃)₃); 2.23 (s, 3H, OCOCH₃); 2.45-2.62 (m, 2H, CH₂); 4.18-4.33 (m, 1H, 2-H); 5.37 (s, 1H, 8a-H); 6.63-6.67; 6.82-6.84; (m, 2H, 7-H, 6-H); 6.96-6.98 (m, 1H, 4-H)

¹³ C-NMR (100 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 20.86, 28.46, 31 .1 2, 42.81 , 61 .21 , 82.14, 85.60, 111.49, 117.83, 123.98, 132.77, 144.99, 148.03, 156.07, 172.01, 175.89

MS (ESI⁺) found: 379.00 [MH]⁺; calc.: 378.14 (C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS (ESI⁺) found: 401.17 [M+Na]⁺; calc: 401.14 (C₁₈H₂₂N₂NaO₇)

MS (ESI^-) found: 377.17 [M-H]^-; calc: 378.14 (C₁₈H₂₂N₂O₇)

UV/VIS (CH₃OH): λ_max= 299 nm, 242 nm, 207 nm λ_min = 270 nm, 222 nm

trans-1-(tert-부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-5-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌 ( trans -HDP 30.2536)

132 mg trans -HDP 30.2536 수율: 11%

¹ H-NMR (400 MHz, CD3OD, δ = ppm)

δ = 1.47, 1.54 [s, 9H, C(CH₃)₃]; 2.21 (s, 3H, OCOCH₃); 2.50-2.70 (m, 2H, CH₂); 4.51-4.56 (m, 1H, 2-H); 5.22-5.26 (s, 1H, 8a-H); 6.58-6.63; 6.80-6.81 (m, 6-H, 7-H); 6.92 (s, 1H, 4-H )

¹³ C-NMR (100 MHz, CD₃OD, δ = ppm)

δ = 20.88, 28.50, 31.12, 42.60, 61.11, 82.05, 85.38, 111.26, 117.88, 124.07, 131.94, 144.66, 148.95, 156.11, 172.01, 174.81

MS(ESI⁺) found: 379.00 [MH]⁺; calc: 378.14 (C₁₈H₂₂N₂O₇)

MS(ESI⁺) found: 401.17 [M+Na]⁺; calc: 401.14 (C₁₈H₂₂N₂NaO₇)

MS (ESI^-) found: 377.17 [M-H]^-; calc: 378.14 (C₁₈H₂₂N₂O₇)

UV/VIS (CH₃OH): λ_max= 302 nm, 244 nm, 208 nm

λ_min = 272 nm, 224 nm

3. S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드 HDP 30.2548 의 제조

단계 1: HDP 30.0013

[00167] FmocHypOH(10.0 g, 28.3 mmol)를 100 mL의 80% 메탄올에 현탁 후 CS₂CO₃ (4.6 g, 14.1 mmol)를 첨가하였다. 상기 현탁액이 완전히 용해되도록 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축 건조시킨 후 100 mL의 DMF 에 재용해시켰다. 알릴브로마이드(1.6 mL, 3.6 g, 29.7 mmol)를 적가한 후 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. DMF를 증류 제거한 후 잔류물을 tert-부틸 에스테르 에테르에 용해시켰다. 침전물을 여과하고 맑은 용액을 셀 라이트 전 컬럼 크로마토그래피 (Celite prior column chromatography)에 흡수시켰다. 상기 화합물을 n-헥산/에틸 아세테이트 구배로 220 g 실리카 겔 상에서 정제하였다.

수율: 11.5 g, 100%

단계 2: HDP 30.0400

[00168] HDP 30.0013(5.0 g, 14.1 mmol)와 피리디늄 4-톨루엔설포네이트(1.33 g, 5.3 mmol)를 40 mL의 디클로로에탄 중의 1,3-디하이드로-2H-피란-2-일-메톡시메틸수지(5.0 g, 1.0 mmol/g THP-수지)의 현탁액에 첨가하였다. 반응물을 80℃에서 밤새 교반 하였다. 냉각 후, 상기 수지를 여과하고 디클로로에탄, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 tert-부틸메틸 에테르로 광범위하게 세척하였다.

[00169] 로딩 양은 0.62 mmol/g 이었다(탈보호(deprotection) 후, 플루오렌 메틸기의 UV-분광법에 의해 결정되었다).

단계 3: HDP 30.2544 (고상(Solid Phase) 합성)

수지 전처리(Resin pre-treatment):

[00170] HDP 30.0400(0.31 g, 0.25 mmol)를 N,N-디메틸바르비투르산(241 mg, 1.55 mmol) 및 Pd(PPh₃)₄(35 mg, 0.03 mmol)로 처리하였다. 상기 수지는 실온에서 밤새 흔들었다. 이후, 상기 수지를 디클로로메탄, DMF, 아세토니트릴, 디클로로메탄 및 tert-부틸메틸 에테르로 광범위하게 세척 후 감압 하에 건조시켰다.

결합 과정(Coupling Procedure):

[00171] 모든 반응물 및 시약을 디클로로메탄/DMF(1:1, v/v)에 용해시켰다. HDP 30.0477[참조: WO 2014/009025](102 mg, 0.30 mmol)을 6.0 mL의 디클로로메탄/N,N-디메틸포름아미드에 용해한 후, 4.0 mL의 0.2 N 용액 PyBOP/HOBt 및 2 mL의 DIEA (40% in DMF)로 처리하였다. 2.0 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가 후, 반응물을 마이크로파 조사(20 W, CEM 마이크로파 반응기)에 의해 8분 동안 50℃까지 가열하고, 결합 후 N,N-디메틸포름아미드로 세척하였다.

Fmoc-탈보호(Fmoc-Deprotection) :

[00172] 50℃에서 10분 동안 N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘(6.0 mL)을 첨가하여 탈보호를 수행하였다. 상기 수지를 N,N-디메틸포름아미드로 세척하였다 (최종 아미노산의 결합 후 탈보호 없음).

[00173] 다른 모든 아미노산은 상기 프로토콜에 따라 결합되었으며, 가중치 (weightings)는 하기와 같다:

(0.102 g, 0.30mmol 1 .5 당량 HDP 30.0477 MW: 339.6, 상기 참조)

0.72 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocAsn(Trt)OH MW: 599.7

0.71 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocCys(OTrt)OH MW: 586.7

0.36 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocGlyOH MW: 297.3

0.36 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocIleOH MW: 353.4

0.36 g, 1.2 mmol 5.0 당량 FmocGlyOH MW: 297.3

0.114 g, 0.30 mmol 1.5 당량 HDP 30.2536 MW: 378.4

[00174] 탈보호의 완료 후, 상기 수지를 최종적으로 바닥 프릿(bottom frit)이 있는 주사기로 옮긴 후, DCM으로 세척하고, 감압 하에 건조시켰다.

수지 배출(Resin Release) 및 B-고리 형성(B-Ring Formation)

[00175] 5 mL TFA, 5 mL DCM 및 10% 메탄올의 용액을 수지에 흡인(aspirated) 후 주변 온도에서 15 분 동안 교반하였다. 상기 용액을 50 mL 반응 플라스크에 분배하고, 상기 수지를 (TFA DCM (1:1) + 10% 메탄올)로 1회 세척 후, 상기 플라스크에 부어 넣었다. 상기 반응 플라스크를 16 시간 동안 교반 후, 트리이소프로필실란 (0.5 mL)을 첨가하고 반응물을 진공상태에서 농축시켰다. 잔류물을 500 μL 의 메탄올에 용해시킨 후 펩티드는 50 mL의 빙냉(ice-cold) TBME 에 침전되었다. 원심분리 후, 상청액을 따라내고, 침전물을 50 mL의 TBME 로 1회 세척 후, 감압 하에서 건조하였다.

[00176] 상기 침전물을 2 mL의 메탄올에 용해시킨 후 분취용 역상 컬럼 크로마토 그래피(preparative reverse phase column chromatography)로 정제하였다. 메탄올을 감압 하에 증류하여 제거하고, 잔류 수상(aqueous phase)을 동결건조시켰다.

수율: 75.1 mg, 35.9%

HPLC: 99.3 면적%

단계 4: 고리화반응(Cyclisation) A-고리 형성 HDP 30.2546

[00177] 상기 동결건조된 단환식(monocyclic) 중간체(49.4 mg, 47.2 μmol)를 3 mL의 DMF 에 용해시키고 디페닐포스포릴아지드(DPPA, 13 μL, 237 μmol, 5 당량) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA, 40 μL, 237 μmol, 5 당량)으로 처리하였다. 반응물을 16 시간 동안 교반하였고, 반응의 완료와 더불어 500 μL의 물로 켄칭 (quenching)하였다. 전환(conversion)은 HPLC로 모니터링하였다. 상기 혼합물을 감압 농축 후, 1 mL의 메탄올에 재용해시키고, 분취용 역상 컬럼 크로마토 그래피(preparative reverse phase column chromatography)로 정제하였다.

수율: 32.5 mg, 67.9%

MS (ESI⁺) found: [M+H]⁺ 1029.33 [MH]⁺ 1051.3 [M+Na]⁺; calc: 1029.39; 1051.42 (C₄₅H₆₁N₁₀O₁₆S; C₄₅H₆₀N₁₀O₁₆SNa)

HPLC: 88.3 면적%

단계 5: 아세테이트-탈보호(Acetate-Deprotection) (HDP 30.2548)

[00178] HDP 330.2546 (23.4 mg, 22.7 μmol)을 7 N 메타놀릭 NH₃ 용액(2.3 mL)에 용해한 후 교반하였다. 전환(conversion)은 HPLC/MS로 확인하였다. 종료 후(6 - 8 시간), 반응물을 진공에서 농축시키고, 100 μL의 메탄올에 재현탁 후, prep-HPLC로 정제하였다.

수율: 12.5 mg, 53.3%

HPLC: 99%

MS (ESI⁺) found: 903.4 [M+H]⁺; calc.: 902.9 (C₃₉H₅₄N₁₀O₁₃S)

found: 925.4 [M+Na]⁺

5. 5'-((3-말레이도프로판아미도)-Val-Ala- p -아미니노벤질옥시)-S-디옥시-아마닌아미드 (HDP 30.2602)의 제조

단계 1: HDP 30.2563

[00179] S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드 HDP 30.2548(9.66 mg, 10.7 μmol) 및 HDP 30.1690(WO 2016/142049, 50.2 mg, 85.6 μmol = 8.0 당량)을 500 μL의 건조 디메틸아세트아미드(DMA)에 용해하였다. 물(17.12 μL, 1.6 당량) 중 1.0 M 탄산 수소 세슘 용액을 한 부분(portion)에 첨가 후 혼합물을 실온에서 교반하였다.

[00180] 1.5 시간 후, 17.12 μL(1.6 당량)의 탄산 세슘 용액을 추가로 첨가하였다.

[00181] 8 시간 후, 상기 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 원심 필터(0.2 μm)를 통과시킨 후, HPLC[Phenomenex Luna-C₁₈(2), 10 μL 컬럼(250 × 21.2 mm) 및 수중(in water) (5-100%)의 아세토니트릴의 구배]로 정제하였다. 생성물 분획물들을 병합 후 환원시켜 4.00 mg(26 %)의 무정형 고체 생성물을 수득하였다.

MS (ESI⁺) [M+Na]⁺ found: 1430.58; calc.: 1430.65 (C₆₅H₉₇N₁₃NaO₁₈SSi)

단계 2: HDP 30.2378

[00182] HDP 30.2563(7.53 mg, 5.34 μmol)을 500 μL의 트리플루오로 아세트산/ 물/이소프로필실란(95:5:5) 혼합물에 용해하였다. 5분 후, 휘발물들을 진공 하에 제거하고 잔류물을 1000 μL의 물에 용해시킨 후, pH 10에 도달할 때까지 3% 암모니아를 적가하였다.

[00183] 상기 용액을 동결건조한 후 prep-HPLC(Phenomenex Luna-C₁₈(2), 10 μL 컬럼(250 × 21.2 mm) 및 수중(in water) 아세토니트릴(0.05% TFA)의 16분 내 20-30%의 구배로 정제하여, 3.95 mg(TFA 염 기준 57%)의 생성물을 수득하였다.

MS (ESI⁺) [M+H]⁺ found: 1 178.50; calc: 1 178.53 (C₅₄H₇₆N₁₃O₁₅S)

단계 3: HDP 30.2602

[00184] HDP 30.2578(3.95 mg, 3.06 μmol)을 400 μL의 건조 DMF 에 용해하였다.

[00185] 3-(말레이미도)프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(BMPS, 1 .63 mg, 2 당량)을 81.4 μL의 DMF 에 용해한 후, 2.1 μL(2 당량)의 DIPEA 를 첨가하였다.

[00186] 2 시간 동안 교반 후, 상기 반응 혼합물을 원심 필터(0.2 μm)에 통과시키고, 5-70%의 수 중(in water) 아세토니트릴 + 0.05 % TFA의 구배로 RP-18 HPLC 을 사용하여 정제하였다. 순수한 분획물들을 증발 건조시킨 후, 2 mL의 아세토니트릴/물 (1 :1)로 동결건조시켜 2.73 mg(67%)의 무색 분말 생성물을 수득하였다.

MS (ESI⁺) [M+H]⁺found: 1329.33; calc.: 1329.56 (C₆₁H₈₁N₁₄O₁₈S)

C. S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드의 총합성

1. Cis,trans -1-( tert -부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-4-아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌; cis- 및 trans ( cis,trans -4-아세톡시-Hpi) 합성의 개략도

2. S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드 합성의 개략도

D. S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드의 총합성

1. Cis,trans -1-( tert -부톡시카르보닐)-2-카르복시-3a-히드록시-4- 아세톡시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌; ( cis,trans -4-아세톡시- Hpi)의 합성

[00187] Cis,trans-7-아세톡시-Hpi의 합성은 4-히드록시-L-트립토판 대신에 시판 중인 7-히드록시-L-트립토판을 출발물질로 하는 cis,trans-4-아세톡시-Hpi의 합성과 유사하게 수행된다.

2. S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드 합성의 개략도

[00188] S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드의 합성은 cis,trans-4-아세톡시-Hpi 대신에 cis,trans-7-아세톡시-Hpi 를 사용하여 S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드를 합성하는 것과 유사하게 수행된다.

6. S-데속시-a-아마니틴 HDP 30.0735 및 S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드 HDP 30.2548 의 실험실 내 세포 독성( in vitro cytotoxicity)

HEK293 및 HEK293 OATP1 B3 세포들에 대한 BrdU 세포 증식 분석.

[00189] HEK293-OATP1 B3 세포 배양 플레이트를 폴리-D-라이신으로 코팅하였다.

폴리-D-라이신 코팅:

o 50 mL 멸균수 중 5 mg의 폴리-D-라이신

o 96-웰 플레이트의 각 웰에 50μL

o 실온에서 1 시간 배양

o 200μL의 멸균수로 웰 세척

o 최소 2시간 건조(실온)

[00190] 10% FCS 및 보충제를 포함하는 투명한 바닥을 갖는 블랙 96-웰 플레이트 [(2.0×10³ HEK293 + HEK293 OATP1 B3 세포) + 90 μL 성장 배지/웰]를 제작하였다.

대조군: "블랭크(blank)"를 세포 없이 100 μL 배지로 설정하고, 100 μL 배지에서 "바탕(background)" 및 "100%"를 세포로 설정하였다.

● 37℃ 및 5% CO₂하에서 24시간 배양

HDP 30.0735, HDP 30.2548 및 alpha-아마니틴의 희석 계획(scheme):

[00191] 원액(stock solution)을 배지에서 1:1000 (1:10 및 1:100 희석)으로 희석 하였다:

10 μL의 아마니틴 유도체 원액(1.0×10^-2 M) + 90 μL PBS =

100 μL의 1.0×10^-3 M

2 μL의 희석액 + 198 μL 배지 = 200 μL의 1.0×10 ^-5 M

추가 희석:

A: 200 μL의 1.0×10^-5 M

B: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 A (1:5 희석)

C: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 B (1:5 희석)

D: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 C (1:5 희석)

E: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 D (1:5 희석)

F: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 E (1:5 희석)

G: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 F (1:5 희석)

H: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 G (1:5 희석)

[00192] 각 용액 10 μL 를 3중 웰(well triplicates)에 넣었다.

최종 부피: 100 μL/웰.

최종 복용량(dose): 1.0×10 ^-6 M 부터 시작하여; 1:5 연속 희석.

● 37℃ 및 5% CO₂하에서 96시간 배양.

● 96시간 후: 제조업체 지침에 따라 발광되는 로슈 세포 증식 분석

(Roche Cell proliferation assay).

● EC₅₀-농도는 Graphpad Prism 4.0 데이터 분석 소프트웨어로 결정하였다.

7. HDP 30.2347, HDP 2371 및 30.2602 컨쥬게이트들의 합성

실시예: T-D265C-30.2371 합성:

[00193] PBS 버퍼에 용해된 10 mg의 Thiomab T-D265C 를 HDP 30.2371 의 결합을 위해 사용하였다.

항체 용액을 1 mM EDTA 로 조정:

2 mL의 항체 용액(10.0 mg) + 20 μL의 100 mM EDTA, pH 8.0

항체 용량: 10 mg = 6.9×10^-8 mol

[00194] 항체와 40 당량의 TCEP의 반응에 의한 시스테인 캡핑 해제(uncapping):

- 2 mL의 항체 용액(6.9×10^-8 mol) + 55.2 μL의 50 mM TCEP 용액(2.76×10^-6 mol)

- 37℃ 쉐이커(shaker) 상에서 3시간 배양.

- 4℃, 2.0 l 1 × PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette 20,000 MWCO 에서 2회 연속 투석(dialyses)(1차 투석: 4시간; 2차 투석: 하룻밤 동안)

[00195] 항체와 20 당량의 디히드로아스코르빈산(dhAA)의 반응에 의한 산화:

- ca. 20 mL의 항체 용액(6.9×10^-8mol) + 27.6 μL 신선한 50 mM dhAA 용액 (1.38 ×10^-6 mol)

- 실온에서 쉐이커(shaker) 상에서 3시간 배양.

[00196] 6 당량의 HDP 30.2371 을 이용한 아마니틴과의 결합 및 25 당량의 N-아세틸-L-시스테인을 이용한 켄칭:

2 mg의 HDP 30.2371 를 200 μL의 DMSO 에 용해 = 10 μg/μL

- ca. 2 mL의 항체 용액 (= 9.5 mg; 6.53×10^-8 mol) + 52.1 μL의 HDP 30.2371

(= 520.8 μg; 3.92×10^-7 mol).

- 실온에서 1시간 배양.

- 16.3 μL의 100 mM N-아세틸-L-시스테인을 첨가하여 켄칭(1.63×10^-6 mol).

- 실온에서 15분간(또는 4℃에서 하룻밤 동안) 배양.

- 1× PBS, pH 7.4로 평형화된 1× PD-10 컬럼으로 반응 혼합물을 정제한다.

parafilm 상에서 Bradford 시약으로 단백질 함유 분획물들을 식별하고 단백질 함유 분획물들을 함께 모은다.

- 2.0 l PBS, pH 7.4 및 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 20,000 MWCO 에서 4℃에서 하룻밤 동안 항체 용액의 투석.

LC-ESI-MS 분석에 의해 DAR 결정.

[00197] 단백질 농도를 5.0 mg/mL(3.4×10^-5 M)로 조정한 후 여과를 통해 멸균 조건 달성. 4℃에 저장.

[00198] 상이한 항체 또는 상이한 아마니틴을 갖는 ADCs를 상기에 따라 제조하였다. 항체의 분자량은 각각의 항체의 분자량(MW)에 따라 계산되었다. 링커 독소, TCEP, dhAA, N-아세틸-L-시스테인의 양은 각각의 등가물에 도달하도록 조정되었다.

8. HDP 30.2347, HDP 2371 및 30.2602 컨쥬게이트들의 실험실 내 세포 독성( in vitro cytotoxicity)

SKBR-3, JIMT-1, LnCap, 및 22rv1 세포들에 대한 BrdU 세포 증식 분석:

[00199] 상기 분석은 상기 (6.)에 기재된 바와 같이 하기 변화를 갖도록 수행하였다:

[00200] 세포배양 플레이트들은 폴리-D-라이신으로 코팅하지 않았다.

● ADCs 의 희석 계획(scheme):

● 원액들(stock solutions)을 성장 배지에서 1.0×10^-6 M로 희석하였다.

추가 희석:

A: 100 μL의 1.0×10^-6 M

B: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 A (1:5 희석)

C: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 B (1:5 희석)

D: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 C (1:5 희석)

E: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 D (1:5 희석)

F: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 E (1:5 희석)

G: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 F (1:5 희석)

H: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 G (1:5 희석)

● 각 용액 10 μL 를 3중 웰(well triplicates)에 넣었다.

최종 부피: 100 μL/웰.

최종 복용량(dose): 1.0×10 ^-7 M 부터 시작하여; 1:5 연속 희석.

WST-I assay on Raji 세포 및 Nalm-6 세포에 대한 WST-I 분석:

● 10% FCS 및 보충제를 포함하는 웰당 2.0×10³의 세포 및 웰당 90 μL의 각각의 성장 배지를 갖는 투명한 F-바닥 96-웰 플레이트를 제작하였다.

대조군: "블랭크(blank)"를 세포 없이 100 μL 배지로 설정하였고; "세포들 단독(cells only)"을 100 μL 배지에서 세포로 설정하였다.

● 37℃및 5% CO₂하에서 24시간 배양.

● ADCs 의 희석 계획(scheme):

추가 희석:

A: 100 μL의 1.0×10^-6 M

B: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 A (1:5 희석)

C: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 B (1:5 희석)

D: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 C (1:5 희석)

E: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 D (1:5 희석)

F: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 E (1:5 희석)

G: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 F (1:5 희석)

H: 80 μL의 성장 배지 + 20 μL의 용액 G (1:5 희석)

● 각 용액 10 μL 를 3중 웰(well triplicates)에 넣었다.

최종 부피: 100 μL/웰.

최종 복용량(dose): 1.0×10 ^-7 M 부터 시작하여; 1:5 연속 희석.

● 37℃및 5% CO₂하에서 96시간 배양.

● 96시간 후: 제조업체 지침에 따라 발광되는 로슈 WST-1 세포 증식 분석

(Roche WST-1 Cell proliferation assay).

Claims

하기 화학식 I 에 따른 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체,

여기서 R1 은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴에서 선택되고;
P1은 수소 또는 보호기이고;
P2는 수소 또는 보호기, 특히 보호기이고; 그리고
R2 는 OH, OR1, 및 1 내지 7개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드에서 선택된다.
제1항에 있어서,
상기 보호기는, 이의 존재 시, Boc, PhCH₂OCO-, CH₂=CHCH₂O-CO-, 및 트리틸에서 독립적으로 선택되는, 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 치환체 R1-C(=O)-O- 는 상기 화학식 I의 위치 5에 부착되는, 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 치환체 R1-C(=O)-O- 는 상기 화학식 I의 위치 6에 부착되는, 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체.
히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 전구체의 펩티드의 합성 시 제1항 내지 제5항의 어느 한 항의 2-카르복시-3a-히드록시-1,2,3,3a,8,8a-헥사히드로피롤로[2,3-b]인돌의 히드록시-치환된 유도체를 사용하는 단계를 포함하는, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 8 개의 아미노산 잔기를 포함하는 선형 전구체의 합성 방법.
(i) 제5항의 상기 선형 전구체의 상기 시스테인 잔기 및 상기 트립토판 모이어티 사이의 결합의 형성을 야기하거나 허용하는 단계; 및
(ii) 제5항의 상기 선형 분자의 N-말단을 상기 전구체의 C-말단과 반응시킴으로써 아마니틴 유도체의 형성을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하는,
히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체의 합성 방법.
제6항에 있어서,
상기 시스테인 모이어티의 황 원자를 산화하여 설폰, 특히 설폭 사이드를 형성하는 단계를 더 포함하는, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴유도체의 합성 방법.
히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체에 있어서,
(i) S-데속시-4'-히드록시-아마닌,, 4'-히드록시-아마닌, S-데속시-5'-히드록시-아마닌, 5'-히드록시-아마닌, S-데속시-7'-히드록시-아마닌, 및 7'- 히드록시-아마닌, (ii) S-데속시-4'-히드록시-아마닌아미드, 4'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드, 5'-히드록시-아마닌아미드, S-데속시-7'-히드록시-아마닌아미드, 및 7'-히드록시-아마닌아미드 및 (iii) (i)에 따른 아마니틴의 유도체에서 선택되며,
여기서 아미노산 1의 유리 카르복실산 모이어티는 카르복실산 에스테르 -C(=O)OR1 또는 모이어티 -C(=O)NH-OR1 로 전환되며, 여기서 R1 은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴에서 선택되는, 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체.
제8항에 있어서,
S-데속시-5'- 히드록시-아마닌, 5'-히드록시-아마닌, S-데속시-5'-히드록시-아마닌아미드, 및 5'-히드록시-아마닌아미드에서 선택되는, 아마니틴 유도체.
(a) 제8항 또는 제9항의 히드록실화된 트립토판 모이어티를 포함하는 아마니틴 유도체;
(b) 표적-결합 모이어티; 및
(c) 임의로 상기 아마니틴과 상기 표적-결합 모이어티를 연결하는 링커, 를 포함하는 컨쥬게이트(conjugate).
제8항 또는 제9항의 아마니틴 유도체 또는 제10항의 컨쥬게이트(conjugate)를 포함하는 약학적 조성물.
환자의 암 치료에 사용하기 위한 제8항 또는 제9항의 아마니틴 유도체, 제10항의 컨쥬게이트(conjugate) 또는 제11항의 약학적 조성물에 있어서,
특히 여기서 상기 암은 유방암, 췌장암, 담도암(cholangiocarcinoma), 대장암(colorectal cancer), 폐암, 전립선암, 난소암, 전립선암, 위암, 신장암, 악성 흑색종, 백혈병 및 악성 림프종으로 이루어진 군에서 선택된다.
(a) 제8항 또는 제9항에 따른 아마니틴 유도체; 및
(b) 상기 아마니틴 유도체를 표적-결합 모이어티에 연결하기 위한 반응성 그룹 Y를 가지는 링커 모이어티, 를 포함하는 작제물(construct).