KR20200037793A - 이기능성 화합물 - Google Patents

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KR20200037793A
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크리스티안 웬즐 토르노
앤 루이즈 뱅크 코달
스테프 릿츠-런지
레나르트 릭케
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노보 노르디스크 에이/에스
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Abstract

본 출원은 당뇨의 치료, 체중 감량 및/또는 심혈관 질환의 위험 감소에 유용한 화합물을 개시한다. 화합물은 이기능성이며, 따라서 GLP-1 수용체 작용제 및 PCSK9 억제제 둘 다로 치료했을 때 혜택을 받을 수 있는 환자를 위한 간단한 치료제로서 적합하다.

Description

이기능성 화합물
본 발명은 PCSK9를 억제하고 GLP-1 수용체를 자극하는 이기능성 화합물 및 이들의 약학적 용도에 관한 것이다.
높은 LDL-C(저밀도 지단백 콜레스테롤) 수준 및 이상지질혈증은 널리 인지된 심혈관 질환의 원인이다.
스타틴(statin)은 25년 동안 이상지질혈증의 치료용으로 승인되어 왔다. 이러한 부류는 허용 가능한 안전성 프로파일로 심혈관 사건을 상당히 일관되게 감소시킨다는 것을 입증해 왔다. 베스트셀러 스타틴인 아토르바스타틴(LipitorTM)는 지금까지 세계에서 가장 많이 팔린 약물로서, 1996년부터 2012년까지 1,250억 달러 이상의 매출을 기록했다.
스타틴 및 다른 지질 저하제의 이용 가능성 및 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 환자들은 자신들이 목표로 하는 LDL-C 수준에 도달하지 못하고 심혈관 질환 발생의 고위험 상태로 남아있다. PCSK9(프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 타입 9)는 간 LDL-R(LDL 수용체) 분해를 촉진함으로써 간 LDL-R의 표면 발현을 감소시켜 결과적으로 LDL 입자를 제거한다. 역으로, PCSK9를 차단하면 LDL-C뿐만 아니라 다른 죽종형성 지단백(atherogenic lipoprotein)의 제거가 증가된다. 실제로, LDL 수용체는 LDL 이외의 죽종형성 지단백(예: 중간 밀도 지단백)과 잔류 입자의 제거에 기여한다. 중간 밀도 지단백 및 잔류 입자의 제거가 증가되면 LDL 감소에 의해 제공되는 것 이상으로 최료적 이점을 가질 수 있다.
스타틴은 SREBP2 전사 인자를 통한 LDL-R과 PCSK9 발현을 모두 증가시킨다. PCSK9의 발현이 증가하면 순환에서 스타틴이 LDL-C 제거에 미치는 영향을 감소시킬 수 있다. LDL-R에 대한 PCSK9의 결합을 억제하여 LDL-R의 분해를 방지함으로써 스타틴의 효능이 강화된다. 종합하자면, PCSK9 억제는 지질 관리에 대한 신규한 접근법을 제공한다.
LDL-R(LDL-R-(293-332))의 EGF(A)(표피 성장 인자 유사 도메인 A) 서열(40개 아미노산)은 PCSK9의 결합 부위로서 널리 인식되어 있다. 단리된 야생형 EGF(A) 펩티드는 낮은 μM 범위의 IC50으로 PCSK9가 LDL-R에 결합하는 것을 억제하는 것으로 나타났다(Biochemical and Biophysical Research Communication 375 (2008) 69-73 참조). 효능이 이렇게 약해서는 EGF(A) 펩티드가 약학적으로 실제 사용될 수 없게 될 것이다. 또한, 이러한 펩티드의 반감기는 치료적으로 사용하기에는 너무 짧을 것이 예상된다.
WO2012177741 및 J. Mol. Biol. (2012) 422, 685-696은 EGF(A)의 유사체 및 이의 Fc-융합물을 개시하고 있다.
2개의 항PCSK9 항체인 알리로쿠맙(alirocumab)/프랄런트(Praluent)® 및 에볼로쿠맙(evolocumab)/레파타(Repatha)®는 고수준의 LDL-C 치료용으로 최근 승인되었다. 이들은 2주마다 1ml씩 피하 주사에 의해 투여된다.
WO 2015/127273은, GLP-1과 항-PCSK9 항체의 기능을 조합하기 위해 항PCSK9 항체와 GLP-1 작용제를 융합하는 것을 모색한다.
당뇨병 및 심혈관 질환의 치료를 위한 다수의 치료법이 이용 가능하지만 다수의 개별 약물을 조합하는 것이 항상 매력적인 것은 아니며, 효능, 순응성 및 편의성과 같은 치료의 개선에는 두 가지 질환 상태 모두를 다루는 단일 분자가 바람직할 것이다.
본 발명은 LDL-R에 대한 PCSK9의 결합을 억제하여 LDL 콜레스테롤을 감소시키는 능력을 가진 EGF(A) 유사체에 관한 것이다. 이러한 분자를 GLP-1 수용체 작용제와 조합해 추가의 치료 옵션을 제공하는 이기능성 분자를 형성함으로써, 하나의 약물로 당뇨병과 심혈관 질환 둘 다를 다룰 수 있다. 일 양태에서 본 발명은 GLP-1 작용제 및 PCSK9 억제제를 포함하는 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물에 관한 것으로서,
i. 상기 GLP-1 유사체는 서열번호 137에 의해 식별된 GLP-1(7-37)의 유사체이고,
ii. 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 의해 식별된 LDL-R(293-332)의 EGF(A) 도메인의 유사체이다.
일 구현예에서, 이러한 화합물은 2개의 유사체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 2개의 유사체는 이들 사이에 삽입된 스페이서 펩티드에 의해 임의로 연결된다.
화합물은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함할 수 있는데, 이는 GLP-1 유사체, EGF(A) 유사체 또는 스페이서 중 하나의 아미노산 잔기에 부착된 치환기로서 지칭될 수 있다. 일 구현예에서, 화합물은 융합 폴리펩티드의 상이한 아미노산 잔기에 부착된 1개 또는 2개의 치환기를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 본 발명의 화합물의 의학적 용도에 관한 것이다.
본 발명은 GLP-1 수용체를 자극하여 PCSK9를 억제하는 이기능성 화합물에 관한 것이다. 약학적으로 관련성이 있는 화합물을 제조하기 위해서는, 야생형 펩티드에 대해 기능성을 개선하고 동시에 편리한 투여를 가능하게 하는 변형이 필요하다.
본 발명의 일 양태는 GLP-1 수용체 작용제 및 PCSK9 억제제를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 여러 가지 GLP-1 수용체 작용제가 당업계에 공지되어 있으며, 다양한 PCSK9 억제제와 조합될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, GLP-1 수용체 작용제는 인간 GLP-1(7-37)(서열번호 137)의 유사체이거나, 예컨대 GLP-1 수용체 작용제로서 기능하는 것으로도 알려진 엑센딘 4(Exendin 4) 및 이의 유사체일 수 있다.
PCSK9 억제제는 항체 형태로 알려져 있지만, 본 출원은 주로 LDL-R(293-332)(서열번호 1)의 EGF(A) 도메인의 유사체 형태인 PCSK9 억제제에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물에 관한 것으로서, 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(서열번호 137)의 유사체이고 상기 EGF(A) 유사체는 LDL-R(293-332)(서열번호 1)의 EGF(A) 도메인의 유사체이다.
용어 "화합물"은 분자 엔티티를 지칭하도록 본원에서 사용되며, 따라서 "화합물"은 화합물 군의 각 화합물에 대해 정의된 최소 성분 외에 상이한 구조적 성분을 가질 수 있다. 이는, 화합물이 정의된 구조적 및/또는 기능적 성분을 포함하는 한, 폴리펩티드이거나 이의 유도체일 수 있음을 의미한다.
용어 "화합물"은 또한 이의 약학적으로 관련된 형태를 포함하도록 의도되며, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드 또는 에스테르에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같은, 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미드(또는 펩티드) 결합에 의해 상호 연결된 일련의 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 펩티드는 펩티드 결합에 의해 상호 연결된 아미노산으로 구성된다.
용어 "융합" 및 "융합된"은, 펩티드 결합이나 펩티드 스페이서(이 또한 펩티드 결합에 의해 연결됨)에 의해 연결되고 개별적으로 정의된 2개의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드와 관련하여 사용된다. 따라서, 융합 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 연속 구간(continuous stretch)이다.
용어 "유사체"는 일반적으로, 기준 아미노산 서열과 비교했을 때, 하나 이상의 아미노산이 변화된 서열을 가진 펩티드를 의미한다. 특정 명시된 변화를 "포함하는" 유사체는, 이들의 기준 서열과 비교했을 때 추가의 변화를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 유사체는 명시된 변화를 "갖거나" "포함한다". 다른 특정 구현예에서, 유사체는 변화들로 "이루어진다". 용어 "이루어지다(consist 또는 consisting)"가 유사체와 관련하여 사용될 때, 예를 들어, 유사체가 명시된 아미노산 치환의 군으로 이루어지는 경우, 명시된 아미노산 치환이 유사체에서의 유일한 아미노산 치환임을 이해해야 한다. 대조적으로, 명시된 아미노산 치환의 군을 "포함하는" 유사체는 추가의 치환을 가질 수 있다. "유사체"는 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에서 아미노산 늘임(elongation)을 포함하고/하거나 N-말단 및/또는 C-말단 위치에서 절단을 포함할 수도 있다.
일반적으로, 아미노산 잔기는 이들의 완전한 명칭, 이들의 1자 코드 및/또는 3자 코드에 의해 식별될 수 있다. 이 세 가지 방법은 완전히 동등하다.
아미노산은 아미노기 및 카복실산기를 함유하는 분자이며, 종종 측쇄로서 지칭되는 하나 이상의 추가적인 기를 임의로 함유한다.
용어 "아미노산"은 (20개의 표준 아미노산 가운데) 단백질원성(또는 천연) 아미노산뿐만 아니라, 비단백질원성(또는 비천연) 아미노산도 포함한다. 단백질원성 아미노산은 자연적으로 단백질에 통합되는 것이다. 표준 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 것이다. 비단백질원성 아미노산은 단백질에서도 발견되지 않고, 표준 세포 기계(cellular machinery)에 의해 생성되지도 않는다(예를 들어, 번역 후 변형을 거쳤을 수도 있음). 비단백질원성 아미노산의 비제한적인 예에는 Aib(α-아미노이소부티르산 또는 2-아미노이소부티르산), 노르류신, 노르발린뿐만 아니라 단백질원성 아미노산의 D-이성질체도 있다.
다음으로, 광학 이성질체가 언급되지 않은 본 발명의 펩티드의 각 아미노산은 (달리 명시되지 않는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
GLP-1 유사체
본 발명은 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 유사체를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "GLP-1 유사체"는 인간 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1(7-37))의 유사체(또는 변이체)를 지칭하며, 이의 서열은 서열번호 137로서 서열 목록에 포함되어 있다. 서열번호 137의 서열을 갖는 펩티드는 또한 "천연" 또는 야생형 GLP-1로서 지정될 수도 있다.
본 발명의 GLP-1 유사체에서 아미노산 잔기의 넘버링(예: "위치 8")은 천연 GLP-1에 대해 확립된 관습을 따르며, 제1(N-말단) 아미노산 잔기는 위치 번호 7로서 번호가 매겨지거나 부여되고, C-말단 방향으로의 다음 아미노산 잔기들은 8, 9, 10 등으로 마지막 (C-말단) 아미노산 잔기까지 번호가 매겨진다. 천연 GLP-1에서 C-말단 아미노산 잔기는 Gly이며, 번호는 37이다.
서열 목록에서는 넘버링이 상이하게 이뤄지는데, 서열번호 137(His)의 제1 아미노산 잔기에 번호 1이 할당되고, 마지막 번호(Gly)는 31이다. 그러나, 본원에서는 전술한 바와 같이, 당업계의 확립된 넘버링 관습을 따른다.
GLP-1 유사체는 당업계에 알려져 있으며, 2형 당뇨병 및 비만 치료를 위한 여러 가지 GLP-1 유사체가 시장에 공급되고 있다. 전술한 바와 같이, GLP-1 유사체는 야생형 인간 GLP-1 서열의 변이체를 가지므로, 서열번호 137과 비교해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 추가를 포함한다.
GLP-1 유사체 각각은 펩티드는: i) 변하는 아미노산 잔기에 상응하는 천연 GLP-1(7~37) 내의 아미노산 잔기의 수(즉, 인간 GLP-1에서의 상응하는 위치); 및 ii) 실제 변화를 참조하여 기술될 수 있다.
즉, 본 발명의 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37) 펩티드를 참조하여 기술될 수 있으며, 다시 말해, 천연 GLP-1(7-37)(서열번호 137)과 비교했을 때 다수의 아미노산 잔기가 변화된 이의 변이체로서 기술될 수 있다.
이러한 변화는 독립적으로, 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 나타낼 수 있다.
다음은 적절한 유사체 명명법의 비제한적인 예이다. GLP-1 유사체 # 2(서열번호 139)로서 통합되고 화합물 #1에 포함된 GLP-1 유사체는 (8Aib, 34R)GLP-1(7-37)로서 지칭될 수 있다.
이러한 유사체가 천연 GLP-1과 정렬되면, 정렬에 따라 천연 GLP-1의 위치 8에 상응하는 유사체의 위치에 있는 아미노산은 Aib이고, 천연 GLP-1의 위치 34에 상응하는 유사체의 위치에 있는 아미노산은 R인 반면, 이러한 유사체의 모든 다른 아미노산은 천연 GLP-1의 상응하는 아미노산과 동일하다.
특정한 명시된 변화를 "포함하는" 유사체는 야생형 GLP-1(서열번호 137)과 비교했을 때 추가의 변화를 포함할 수 있다. 대조적으로, 용어 "이루어지는"은 유사체가 명시된 변화만을 갖는 특정 구현예, 즉 야생형 GLP-1(서열번호 137)과 비교했을 때 GLP-1 유사체에는 추가의 변화가 없는 구현예를 지칭하도록 사용된다. 위의 예를 다시 참조하여, GLP-1 유사체 #2(서열번호 139)는 8Aib 및 34R로 이루어지는 치환을 갖는 GLP-1 유사체로 지칭되거나, 줄여서 8Aib 및 34R로 이루어진 GLP-1 유사체로 지칭될 수 있다.
"~와 동등한 위치" 또는 "상응하는 위치"라는 표현은 천연 GLP-1(7~37)(서열번호 137)과 같은 기준 서열을 참조하여 변이체 GLP-1(7~37) 서열에서의 변화 부위를 특징화하도록 본원에서 사용된다. 동등하거나 상응하는 위치뿐만 아니라 변화의 회수는, 예를 들어, 간단한 필기와 육안 검사에 의해 쉽게 유추되고/되거나; Needleman-Wunsch 알고리즘에 기초한 "정렬(align)"과 같은 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램이 사용될 수 있다. 이 알고리즘은 Needleman, S.B. 및 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453에서, 그리고 정렬 프로그램은 Myers 및 W. Miller의 "Optimum Aligned in Linear Space" CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988) 4:11-17에서 기술된다. 정렬에 대해, 디폴트 스코어링 매트릭스 BLOSUM62 및 디폴트 동일성 매트릭스가 사용될 수 있고, 갭에서 제1 잔기에 대한 페널티는 -12로, 또는 바람직하게는 -10으로, 갭에서 추가 잔기에 대한 페널티는 -2로, 또는 바람직하게는 -0.5로 설정될 수 있다.
이러한 정렬의 예는 서열번호 137의 천연 GLP-1 및 서열번호 139에 의해 식별된 이의 유사체 아래에 삽입된다: 　
#=======================================
# 정렬된_서열: 2
# 1: 서열번호_137
# 2: 서열번호_139
# 매트릭스: EBLOSUM62
# 갭_페널티: 10.0
# 연장_페널티: 0.5
#
# 길이: 31
# 동일성: 29/31 (93.5%)
# 유사성: 30/31 (96.8%)
# 갭: 0/31 ( 0.0%)
# 점수: 154.0
#=======================================
Figure pct00001
본 정렬에 표시된 위치 번호(예: 서열번호 137에서의 "1" 및 "31")에 6을 더하면 본원에서 사용된 바와 같은 위치 번호를 얻는다. 예를 들어, 야생형 GLP-1(서열번호 137과 동일함)에서는 N-말단 아미노산(H)이 위치 번호 7을 가지며, C-말단 아미노산(G)은 번호 37을 갖는다. GLP-1 유사체 #2(서열번호 139)에 대해, 야생형 GLP-1이 경우, N-말단 아미노산(H)은 번호 7을 가지고 C-말단 아미노산(G)은 번호 37을 가지는 한 편, 잔기 2와 28은 각각 치환되어 8과 34로 번호가 매겨진다.
1자 코돈이 없는 특정 아미노산 잔기 등(예: 2-아미노-2-메틸프로판산(Aib))이 서열에 포함되는 경우, 정렬을 위해 이들을 예를 들어 X로 대체할 수 있다. 원하는 경우, X는 나중에 수동으로 보정할 수 있다.
다음은 위의 정렬로부터 추론할 수 있는 것의 비제한적인 예들이다:
예를 들자면, 서열 2는 서열 1과 비교해 2개의 아미노산 변화를 갖는 것으로 추론할 수 있다(즉, 모든 이들 위치에서 완전한 정지("."), 콜론(":") 또는 수평 하이픈("-")이 정렬에 표시됨).
다음으로, 광학 이성질체가 언급되지 않은 본 발명의 GLP-1 유사체의 모든 아미노산은 (달리 명시되지 않는 한) L-이성질체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 유사체는 26개 내지 36개의 아미노산 잔기로 이루어진 GLP-1(7-37)의 유사체이다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 인간 GLP-1(7-37)과 비교해 최대 10개의 아미노산 치환을 갖는다. 추가 구현예에서, GLP-1 유사체는 인간 GLP-1(7-37)과 비교해 최대 8개, 예컨대, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
풍부한 GLP-1 유사체를 비롯하여 GLP-1 수용체 작용제로서의 이들의 기능은 이전에 기술되었다.
서열번호 137의 야생형 GLP-1 펩티드는 위치 26 및 34에 2개의 Lys 잔기를 포함한다. 아래 본원에서 알 수 있는 바와 같이, Lys 잔기는 Lys 잔기를 통해 부착된 치환기를 포함하는 화합물을 제조할 때 특히 관련된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체는 0개, 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는, 아미노산 치환에 의해 GLP-1 유사체에 도입된 Lys 잔기 및 야생형 Lys 잔기로부터 선택되는 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함한다. 아미노산 치환에 의해 도입된 Lys 잔기는 추가 Lys 잔기로서 지칭될 수 있다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 추가 Lys 잔기를 포함한다. 추가 Lys는, GLP-1 유사체 내의 다양한 위치에, 예컨대 위치 12, 21, 23, 24, 25, 27, 30, 31, 32, 33 및 36K로부터 선택된 하나 이상의 위치에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로부터 선택된 추가 Lys를 포함한다: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K 및 36K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함한다: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K 및 36K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함한다: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K 및 34K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함한다: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K 및 36K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함한다: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K 및 34K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음의 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함한다:
a) 21K 및 26K
b) 23K 및 26K
c) 24K 및 26K
d) 25K 및 26K
e) 27K 및 26K
f) 30K 및 26K
g) 31K 및 26K
h) 32K 및 26K
i) 33K 및 26K
j) 34K 및 26K
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 Lys 잔기 26K 및 34K를 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로부터 선택된 정확히 1개의 Lys 잔기를 포함한다: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K 및 36K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로부터 선택된 정확히 1개의 Lys 잔기를 포함한다: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K 및 34K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 다음으로부터 선택된 정확히 1개의 Lys 잔기를 포함한다: 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 정확히 1개의 Lys 잔기인 26K를 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 26K 및 34K 중 하나 또는 둘 다의 치환 또는 결실을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 26K를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 26K의 결실을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 26K의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 26R을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 34K를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 34K의 결실을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 34K의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 34R 또는 34Q를 포함한다.
위에 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 GLP-1 유사체는 야생형 GLP-1와 길이가 유사하다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 적어도 26개, 예컨대 적어도 28개 또는 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 적어도 31개, 예컨대 적어도 32개 또는 적어도 33개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 C-말단에서 1~5개의 아미노산의 결실을 갖는다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 AA 35-37, AA 34-37 또는 AA 33-37의 결실을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 33L을 포함한다.
위에 언급한 바와 같이, GLP-1 유사체는 야생형 GLP-1과 비교해 1개 이상의 아미노산 치환, 예컨대 최대 5개의 아미노산 치환, 예컨대 최대 4개의 아미노산 치환, 예컨대 최대 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 절단이 없는 경우 서열번호 127에 대해 적어도 75%의 동일성, 예컨대 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90% 또는 심지어 95%의 동일성을 가지며, 이는 각각 서열번호 1에 대해 최대 7, 6, 4, 3 및 1개의 아미노산 치환에 상응한다.
아미노산 치환에 의해 도입된 추가 Lys 잔기에 추가하여 또는 대안적으로, GLP-1 유사체는 야생형 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 치환하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8A의 8G 또는 8W로의 치환과 같은 8A의 아미노산 치환을 포함하는데, 이는 A8G 및 A8W로 지칭될 수도 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8A의 비단백질원성 아미노산 잔기(예: Aib)로의 치환과 같은 8A의 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8A의 G, W, 또는 비단백질원성 아미노산 잔기 Aib로의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 위치 8, 12, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 36에서의 아미노산 치환으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 위치 8, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33 및 34에서의 아미노산 치환으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 위치 8, 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 또는 33에서의 아미노산 치환으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 위치 8, 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 또는 33에서의 야생형 아미노산 잔기는 G, V, A, T, L 또는 I 잔기로 치환된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8A 및 34K의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8Aib 및 34R을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8Aib 및 34R을 포함하고 위치 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 및 33으로부터 선택된 위치에서의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8Aib 및 34R을 포함한다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체는 8Aib 및 34R을 포함하고, 위치 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 및 33으로부터 선택된 위치에서의 치환을 포함하되, 위치 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 또는 33에서의 치환은 G, V, A, T, L 또는 I잔기이다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 1개 또는 2개의 Lys 잔기 및 다음으로부터 선택된 치환 군을 포함한다:
Figure pct00002
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 1개 또는 2개의 Lys 잔기 및 다음으로부터 선택된 치환 군을 포함한다:
Figure pct00003
일 구현예에서, 이러한 GLP-1 유사체는, 전술한 바와 같은 1개 또는 2개의 Lys 잔기, 예컨대 26K 및/또는 34K, 또는 예컨대 26K 및/또는 치환에 의해 K34R과 함께 도입된 Lys를 포함한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 187에 의해 정의된 서열을 가지며: H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37, 여기서
X8은 A, G, W 또는 Aib이고,
X12는 F 또는 K이고,
X21은 E, G 또는 K이고,
X23은 Q, G 또는 K이고,
X24는 A, G, V 또는 K이고,
X25는 A, G, V 또는 K이고,
X26은 K 또는 R이고,
X27은 E, G 또는 K이고,
X29는 I, A 또는 V이고,
X30은 A, G 또는 K이고,
X31은 W, G 또는 K이고,
X32는 L, G, T, V, I 또는 K이고,
X33은 V, G, I, L, K이거나 부재하고,
X34는 K, R, Q이거나 부재하고,
X35는 G이거나 부재하고
X36은 R, Q이거나 부재하고,
X37은 G이거나 부재한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 187에 의해 정의된 서열을 가지며: H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37, 여기서
X8은 A, G, W 또는 Aib이고,
X12는 F 또는 K이고,
X21은 E, G 또는 K이고,
X23은 Q, G 또는 K이고,
X24는 A, G, V 또는 K이고,
X25는 A, G, V 또는 K이고,
X26은 K 또는 R이고,
X27은 E, G 또는 K이고,
X29는 I 또는 V이고,
X30은 A, G 또는 K이고,
X31은 W, G 또는 K이고,
X32는 L, G, T, V, I 또는 K이고,
X33은 V, G, I, L, K이거나 부재하고,
X34는 K, R, Q이거나 부재하고,
X35는 G이거나 부재하고
X36은 R, Q이거나 부재하고,
X37은 G이거나 부재한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 187에 의해 정의된 서열을 가지며: H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37, 여기서
X8은 A, G, W 또는 Aib이고,
X12는 F 또는 K이고,
X21은 E, G 또는 K이고,
X23은 Q, G 또는 K이고,
X24는 A, G, V 또는 K이고,
X25는 A, G, V 또는 K이고,
X26은 K 또는 R이고,
X27은 E, G 또는 K이고,
X29는 I, A 또는 V이고,
X30은 A, G 또는 K이고,
X31은 W, G 또는 K이고,
X32는 L, T, V, I 또는 K이고,
X33은 V, G, I, L, K이거나 부재하고,
X34는 K, R, Q이거나 부재하고,
X35는 G이거나 부재하고
X36은 R, Q이거나 부재하고,
X37은 G이거나 부재한다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 187에 의해 정의된 서열을 가지며: H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37, 여기서
X8은 A, G, W 또는 Aib이고,
X12는 F 또는 K이고,
X21은 E, G 또는 K이고,
X23은 Q, G 또는 K이고,
X24는 A, G, V 또는 K이고,
X25는 A, G, V 또는 K이고,
X26은 K 또는 R이고,
X27은 E, G 또는 K이고,
X29는 I 또는 V이고,
X30은 A, G 또는 K이고,
X31은 W, G 또는 K이고,
X32는 L, V, I 또는 K이고
X33은 V, G, I, L, K이거나 부재하고,
X34는 K, R, Q이거나 부재하고,
X35는 G이거나 부재하고
X36은 R, Q이거나 부재하고,
X37은 G이거나 부재한다.
보이는대로, 본원의 실시예는 40개가 넘은 GLP-1 유사체를 포함하는데, 이는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체 둘 다를 포함하는 화합물의 맥락에서도 고려된다. 이들 유사체는 아래의 표에서 식별되며, (전술한 바와 같은) 야생형 잔기와 비교했을 때의 아미노산 변화가 유사체에 존재하는 Lys 잔기(들)와 함께 표시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 138-186에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다. 　
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 138-142 및 144-186에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 138-142, 144-186, 168 및 169-186에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 138-142, 144-161, 163-166, 168 및 169-186에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 138-142, 145-161, 163-166, 168 및 169-186에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 139 및 147-154에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 138 및 174-182 및 184-186에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 166-170에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 136-166에 의해 정의된 유사체의 군으로부터 선택된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 서열번호 164에 의해 정의된 유사체를 포함하거나 이로 구성된다.
EGF(A) 유사체
본원에서의 용어 "EGF(A) 유사체"는 LDL-R(293-332)(서열번호 1)의 EGF(A) 도메인의 변이체를 지칭한다. 본원의 위에서 GLP-1 유사체에 대해 기술된 바와 같이, 유사한 명명법이 EGF(A) 유사체에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LDL-R의 EGF(A) 도메인", "LDL-R(293~332)", "천연 LDL-R(293-332), "야생형 EGF(A)", "wt EGF(A)", 또는 "천연 EGF(A)"는 서열번호 1의 서열로 이루어진 펩티드를 지칭한다. 　
서열번호 1은 다음과 같다:
Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu.
본 출원에서, 아미노산 잔기의 넘버링은 LDL-R(LDL-R-(293-332))의 EGF(A) 도메인에 대한 넘버링을 따르며, 첫(N-말단) 아미노산 잔기에는 위치 번호 293이 매겨지거나 부여되고, C-말단 방향으로 연속하는 아미노산 잔기에는 294, 295, 296 등의 번호가 마지막(C-말단) 아미노산 잔기까지 매겨지는데, LDL-R의 EGF(A) 도메인에서 마지막 아미노산 잔기는 Glu이고 번호는 332이다.
서열 목록에서는 넘버링이 상이하게 이뤄지는데, 서열번호 1(Gly)의 첫 아미노산 잔기에는 번호 1이 부여되고, 마지막(Glu)에는 번호 40이 부여된다. 이는 서열 목록의 다른 서열에 대해서도 동일하게 적용되는데, N-말단 아미노산에 할당되는 번호는 LDL-R을 참조하여 치환되는 293Gly 또는 293 아미노산 잔기에 대한 이의 위치와 상관없이 1이다. 그러나, 본원에서 아미노산 위치의 넘버링은 전술한 바와 같이 LDL-R(293-332)을 참조하여 이루어진다.
서열번호 1에 대한 동일성은 서열번호 1에 대해 변하지 않는 아미노산의 수를 결정함으로써 계산할 수 있다. 서열번호 1은 40개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 3개의 아미노산 치환이 도입되면 동일성 수준은 37/40%=92.5%이다. 5개의 아미노산 잔기가 변하는 경우, 동일성 수준은 87.5%이다. 펩티드가 N-말단 또는 C-말단 늘임인 경우, 해당 부분은 일반적으로 비교에 포함되지 않은 반면, 하나 이상의 아미노산의 결실은 비교기를 줄인다. 예를 들어, 위의 실시예에서, N-말단 아미노산이 결실되면, 동일성 수준은 각각 36/39X100% 및 34/39X100%로 약간 감소한다. 유도체의 백본 서열 동일성을 논의할 때, 치환기의 아미노산 잔기, 예를 들어, 치환기가 부착되고 치환기의 아미노산 잔기로도 지칭되는 잔기는 야생형(wt)이거나 치환된 아미노산일 수 있다. 치환기의 아미노산 잔기가 312K와 같은 야생형 잔기인 경우, 이러한 잔기는 동일성 수준의 계산에 포함되는 반면, 293 내지 332의 임의의 다른 위치에 있는 Lys는 아미노산 치환일 것이며, 서열번호 1에 대한 아미노산 동일성을 계산할 때 포함되지 않게 될 것이다.
본 발명의 EGF(A) 유사체 각각은 i) 변하는 아미노산 잔기에 상응하는 천연 EGF(A)(LDL-R(293-332)) 내의 아미노산 잔기의 수(즉, 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)에서의 상응하는 위치), 및 ii) 실제 변화를 참조하여 기술될 수 있다.
즉, EGF(A) 유사체는 천연 LDL-R(293-332) EGF(A) 펩티드를 참조하여, 즉 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)(서열번호 1)와 비교했을 때 다수의 아미노산 잔기가 변화된 이의 변이체로서 기술될 수 있다. 이러한 변화는 독립적으로, 하나 이상의 아미노산 치환을 나타낼 수 있다.
다음은 적절한 유사체 명명법의 비제한적인 예이다:
본원에서 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 유도체의 예시적 화합물 #1에 통합된 EGF(A) 유사체는 다음의 LDL-R(293-332) EGF(A) 유사체로서 지칭될 수 있다: (301Leu, 309Arg, 312Glu, 321Glu) LDL-R(293-332) EGF(A), 또는 (Leu301, Arg309, Glu312, Glu321)-LDL-R(293-332) EGF(A) 또는 (301L, 309R, 312E, 321E) LDL-R(293-332) 또는 (L301, R309, E312, E321) LDL-R(293-332). 이는, 이러한 유사체가 천연 LDL-R(293-332)과 정렬될 때, i) 정렬에 따라, 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)의 위치 301에 상응하는 유사체의 위치에 있는 Leu, ii) 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)의 위치 309에 상응하는 유사체의 위치에 있는 Arg, iii) 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)의 위치 312에 상응하는 유사체의 위치에 있는 Glu, 및 iv) 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)의 위치 321에 상응하는 유사체의 위치에 있는 Glu를 갖는다는 것을 의미한다.
"~와 동등한 위치" 또는 "상응하는 위치"라는 표현은 기준 서열인 천연 LDL-R(293-332) EGF(A)(서열번호 1)를 참조하여 변이체 LDL-R(293-332) EGF(A) 서열에서의 변화 부위를 특성화하는 데 사용될 수 있다.
동등한 위치 또는 상응하는 위치뿐만 아니라 변경의 수는, 예를 들어 간단한 계산에 의해 쉽게 유추되고/유추되거나, Needleman-Wunsch 알고리즘에 기초한 "정렬(align)"과 같은 표준 단백질 또는 펩티드 정렬 프로그램이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해 1~15개의 아미노산 치환을 갖는다. 　 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해 1~10개의 아미노산 치환을 갖는다. 　 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해 1~8개의 아미노산 치환, 예컨대 1~7개, 1~6개, 1~5개의 아미노산 치환을 갖는다. 　 특정 구현예에서, 최대 7개의 아미노산 치환이 존재할 수 있으며, 예를 들어 최대 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환이 EGF(A) 유사체에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 대해 적어도 75%의 동일성, 예컨대 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90% 또는 심지어 95%의 동일성을 갖는다. 결실/절단이 없는 일 구현예에서, 이는 서열번호 1에 대한 최대 10, 8, 6, 4 및 2개의 아미노산 치환에 각각 상응한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 대해 적어도 90%의 동일성, 예컨대 92%, 예컨대 94%, 예컨대 96% 또는 심지어 98%의 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 적어도 35개, 예컨대 36, 37, 38, 39개 또는 적어도 40개의 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는 36개, 예컨대 38 또는 40개의 아미노산으로 이루어진다. 추가의 특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 아미노산으로 이루어진다.
N-말단 및 C 말단 늘임으로서 본원에서 지칭되는 아미노산 추가가 존재하는 경우, EGF(A) 유사체는 최대 60개의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는 35~60, 38~55, 40~50, 40~45, 40~42 또는 40~41개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 40개 또는 41개의 아미노산 잔기로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 Asn301Leu 또는 단순히 301Leu로도 기술되는, 아미노산 잔기 301의 Asn에서 Leu로의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는 치환 301Leu를 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, EGF(A) 유사체는 아미노산 잔기 297Cys, 304Cys, 308Cys, 317Cys, 319Cys 및 331Cys를 포함한다. 이러한 Cys 잔기는 야생형 잔기로서, 이황화 브리지, 예컨대 297Cys와 308Cys 사이, 304Cys와 317Cys 사이, 및 319Cys와 331Cys 사이의 이황화 브리지에 관여할 수 있다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 후술하는 바와 같이 301Leu 및 다수의 추가 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 301Leu, 310Asp를 포함하고, 312Lys의 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 301Leu 및 310Asp를 포함하며, 이 유사체는 299Asp의 Glu, Val 또는 His로의 치환을 갖지 않는다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 301Leu, 309Arg 및 312Glu를 포함한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 301Leu, 309Arg, 312Glu 및 321Glu를 포함한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체가 310Asp의 310Lys로의 치환을 갖지 않을 때, 이 유사체는 301Leu 및 309Arg를 포함한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체가 299Asp의 Glu, Val 또는 His로의 치환을 갖지 않을 때, 이 유사체는 301Leu 및 309Arg를 포함한다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 치환 D310K, D310N, D310Q, D310Q, D310R 및 D310A 중 어느 것도 갖지 않거나, 310Asp의 임의의 치환조차도 갖지 않는다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 1, 2, 3개 또는 4개의 야생형 잔기를 모두 포함한다: 295Asn, 296Glu, 298Leu 및 302Gly.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 1, 2, 3, 4개 또는 5개의 야생형 잔기를 모두 포함한다: 295Asn, 296Glu, 298Leu, 302Gly 및 310Asp.
일 구현예에서, 펩티드는 295Asn을 갖는다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 296Glu를 갖는다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 298Leu를 갖는다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 302Gly를 갖는다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 310Asp를 갖는다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 310Asp, 295Asn 및 296Glu 중 2개 이상을 갖는다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 310Asp, 295Asn 및 296Glu 중 3개를 모두 갖는다.
EGF(A) 유사체는 본원에 기술된 바와 같은 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 유사체는 다음의 위치 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다: 293, 294, 296, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330 및 332.
일 구현예에서, 유사체는 다음의 위치 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다: 293, 294, 299, 300, 303, 305, 306, 309, 311, 312, 313, 314, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330, 331 및 332.
일 구현예에서, 유사체는 다음의 위치 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다: 294, 299, 300, 303, 309, 312, 313, 314, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 328, 329, 330 및 332.
일 구현예에서, 유사체는 다음의 위치 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다: 299, 300, 309, 313, 316, 318, 321, 322, 323, 324, 326, 328, 329, 330 및 332.
일 구현예에서, 유사체는 다음의 위치 군으로부터 선택된 위치(들)에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다: 309, 312, 313, 321, 324, 328 및 332.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 상기 본원에서 명시된 아미노산 잔기에 추가하여 특정한 위치에서 야생형 아미노산 잔기 또는 상이한 잔기, 즉 아미노산 치환을 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 293에서 아미노산 잔기 Gly(G) 또는 Asn(N)을 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 294에서 아미노산 잔기 Trp (W), Thr(T) 또는 Gly(G)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 299에서 아미노산 잔기 Asp(D), Gly(G), Pro(P), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Thr(T), Asn(N), Gln(Q), Ala(A), Ile(I), Leu(L), Met(M), Phe(F), Tyr(Y) 또는 Trp(W)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 299에서 아미노산 잔기 Asp(D), Gly(G), Pro (P), Arg(R), Lys(K), Ser(S), Thr(T), Asn(N), Gln(Q), Ala(A), Met(M), Phe(F), Tyr(Y) 또는 Trp(W)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 299에서 아미노산 잔기 Asp(D), Ser (S), Arg(R), Leu (L), Ala (A), Lys(K) 또는 Tyr(Y)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 299에서 아미노산 잔기 Asp(D) 또는 Ala(A)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 300에서 아미노산 잔기 His(H) 또는 Asn(N)을 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 307에서 아미노산 잔기 Val(V), Ser(S), Thr(T) 또는 Ile(I)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 307에서 아미노산 잔기 Val(V) 또는 Ile(I)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 307에서 Ser(S), Thr(T) 또는 Ile(I)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 307에서 Ile(I)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 309에서 아미노산 잔기 Asn(N) , Glu(E), His(H), Arg(R), Ser(S) 또는 Lys(K)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 위치 309에서 아미노산 잔기 Asn(N), Arg(R), Ser(S) 또는 Lys(K)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 309에서 아미노산 잔기 Asn(N), Arg(R) 또는 Ser(S)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 309에서 아미노산 잔기 Asn(N) 또는 Arg(R)를 포함한다.
하나의 이러한 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 309에서 아미노산 잔기 Lys(K) 또는 Arg(R)를 포함한다.
EGF(A) 유사체는 본원에 기술된 바와 같은 여러 개의 아미노산 치환, 예컨대 다음의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다: 299Ala, 307Ile 및 321Glu.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 321에서 아미노산 잔기 Asp(D), Lys(K) 또는 Glu(E)를 포함한다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 321에서 아미노산 잔기 Asp(D) 또는 Glu(E)를 포함한다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 321에서 아미노산 잔기 Glu(E)를 포함한다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 324에서 아미노산 잔기 Gln(Q) 또는 Gly(G)를 포함한다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 위치 329에서 아미노산 잔기 Arg (R) 또는 His(H)를 포함한다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 300Asn(N)의 Pro(P)로의 치환을 갖지 않는다.
LDL-R의 EGF(A) 도메인은 위치 312에서 본원에 기술된 바와 같은 치환에 유용할 수 있는 리신(Lysine)을 포함한다. 312에 대한 치환기의 부착이 바람직하지 않은 구현예에서, 312Lys는 본원에 기술된 바와 같은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 Lys 잔기를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 위치 312에서의 Lys는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기에 의해 치환된다: Gly, Pro, Asp, Glu, Arg, His, Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe 및 Tyr. 일 구현예에서, 위치 312에서의 Lys는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기에 의해 치환된다: Gly, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Ala, Val, Ile, Leu, Phe 및 Tyr. 일 구현예에서, 위치 312에서의 Lys는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기에 의해 치환된다: Asp, Glu, Thr, Asn, Ile, Leu, Phe 및 Tyr. 일 구현예에서, 312Lys는 312Asp, 312Glu, 312Thr, 312Asn, 312Ile 또는 312Phe로 치환된다. 일 구현예에서, 312Lys는 312Glu, 312Asp, 312Gln 또는 312Arg로 치환된다.
일 구현예에서, 312Lys는 312Glu, 312Thr, 312Asn, 312Ile, 312Phe 또는 312Tyr로 치환된다. 일 구현예에서, 312Lys는 312Glu, 312Asn 또는 312Ile로 치환된다.
일 구현예에서, 312Lys는 312Glu 또는 312Arg로 치환된다. 일 구현예에서, 312Lys는 312Arg로 치환된다. 일 구현예에서, 312Lys는 312Glu로 치환된다.
다양한 위치에서 치환기를 부착하기 위한 옵션을 포함하기 위해, Lys는 서열번호 1의 야생형 잔기의 아미노산 치환에 의하거나 서열번호 1의 펩티드 늘임에 의해(예: 292Lys 또는 333Lys) 도입될 수 있다.
2개 이상의 치환기가 바람직한 경우, 하나는 312Lys를 통하고 다른 하나는 Lys를 통해 서열번호 1의 펩티드 늘임 또는 치환에 의해 도입될 수 있다. 　
일 구현예서, 서열번호 1의 EGF(A) 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 Lys 잔기를 포함한다: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys.
일 구현예서, 서열번호 1의 EGF(A) 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 Lys 잔기를 포함한다: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys.
일 구현예서, 서열번호 1의 EGF(A) 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 Lys 잔기를 포함한다: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys.
일 구현예서, 서열번호 1의 EGF(A) 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 Lys 잔기를 포함한다: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys.
일 구현예서, 서열번호 1의 EGF(A) 유사체는 다음의 군으로부터 선택된 위치에서 적어도 하나의 Lys 잔기를 포함한다: 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 301Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 302Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 307Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 298Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 295Lys, 296Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 296Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 310Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 및 333Lys로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 다음의 치환 중 어느 것도 포함하지 않는다: 296K, 298K, 301K, 302K 및 307K.
일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 다음의 치환 중 어느 하나를 포함한다: 296K, 298K, 301K, 302K, 307K 및 310K.
일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 다음의 치환 중 어느 하나를 포함한다: 296K, 298K, 301K, 302K, 307K, 및 295K.
일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 다음의 치환 중 어느 하나를 포함한다: 296K, 298K, 301K, 302K, 307K 및 295D.
특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는 이러한 Lys 치환 중 1개 또는 2개를 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, EGF(A) 유사체는 312Lys를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 2개의 Lys 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 다음으로 이루어진 쌍으로부터 선택된 2개의 Lys 잔기를 포함한다:
Figure pct00006
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해, 아래에 표시된 군 I-XXIV 중 어느 하나에 의해 식별된 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 구현예에서, EGF(A) 유사체는 아래에 표시된 바와 같은 군 I-XXIV 중 어느 하나에 의해 식별된 아미노산 치환으로 이루어진다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해, 아래에 표시된 군 I-XVI 중 어느 하나에 의해 식별된 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 구현예에서, EGF(A) 유사체는 아래에 표시된 바와 같은 군 I-XVI 중 어느 하나에 의해 식별된 아미노산 치환으로 이루어진다.
I. 301Leu 및 309Arg
II. 301Leu, 309Arg, 312Glu
III. 301Leu, 307Ile 및 309Arg
IV. 301Leu, 307Ile, 309Arg 및 312Glu
V. 301Leu, 309Arg 및 321Glu
VI. 301Leu, 309Arg, 321Glu 및 312Glu
VII. 301Leu, 307Ile, 309Arg 및 299Ala
VIII. 301Leu, 307Ile, 309Arg, 299Ala 및 312Glu
IX. 301Leu 및 309Arg, 및 적어도 하나의 Lys 치환
X. 301Leu, 309Arg, 312Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환
XI. 301Leu, 307Ile 및 309Arg 및 적어도 하나의 Lys 치환
XII. 301Leu, 307Ile, 309Arg 및 312Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환
XIII. 301Leu, 309Arg 및 321Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환
XIV. 301Leu, 309Arg, 321Glu 및 312Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환
XV. 301Leu, 307Ile, 309Arg 및 299Ala 및 적어도 하나의 Lys 치환, 또는
XVI. 301Leu, 307Ile, 309Arg, 299Ala 및 312Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환.
일 구현예에서, EGF(A) 펩티드 유사체는 다음 중 어느 하나에 의해 식별된 아미노산 치환을 포함하거나 이로 이루어진다:
V. 301Leu, 309Arg 및 321Glu
VI. 301Leu, 309Arg, 321Glu 및 312Glu
XIII. 301Leu, 309Arg, 312Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환, 또는
XIV. 301Leu, 309Arg, 321Glu 및 312Glu 및 적어도 하나의 Lys 치환.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해, 아래에 표시된 군 XVII-XX 중 어느 하나에 의해 식별된 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 　
또 다른 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해, 아래에 표시된 바와 같은 군 XVII-XX 중 어느 하나에 의해 식별된 아미노산 치환으로 이루어진다.
XVII. 301Leu 및 309Lys
XVIII. 301Leu, 309Lys 및 312Glu
XIX. 301Leu 및 309Lys 및 적어도 하나의 추가 Lys 치환
XX. 301Leu, 309Lys 및 312Glu 및 적어도 하나의 추가 Lys 치환.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해, 아래에 표시된 군 XXI-XXIV 중 어느 하나에 의해 식별된 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 　
또 다른 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해, 아래에 표시된 바와 같은 군 XXI-XXIV 중 어느 하나에 의해 식별된 아미노산 치환으로 이루어진다.
XXI. 301Leu 및 307Ile,
XXII. 301Leu, 307Ile 및 312Glu
XXIII. 301Leu 및 307Ile 및 적어도 하나의 추가 Lys 치환, 및
XXIV. 301Leu, 3307Ile 및 312Glu 및 적어도 하나의 추가 Lys 치환.
추가의 특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1 내지 114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2~114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 　
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2~47 및 49~114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2~44, 46, 47, 및 49~114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2~44, 46, 47, 49~53, 55, 58~114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다. 　
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2~4, 6~44, 46, 47, 49~53, 55, 58~114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2~4, 6~19, 21~44, 46, 47, 49~53, 55, 58~114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 19, 21, 73, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, 전술한 바와 같은 EGF(A) 유사체는 Lys 잔기를 포함하지 않고, 따라서 EGF(A) 잔기는 서열번호 5, 6, 23, 26, 49, 50, 107~111에 의해 식별된 아미노산 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 5, 6, 23, 26, 49, 50 또는 107에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 일 구현예에서, 예를 들어, EGF(A) 유사체가 서열번호 108, 109, 110 또는 111에 의해 식별된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함되거나 이로 구성되는 경우, EGF(A) 유사체는 312K 잔기와 321D 잔기 둘 다의 돌연변이를 포함하고 Lys 잔기를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 서열번호 108에 의해 식별된 아미노산 서열D을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에서의 실시예는 아미노산 치환, Lys 잔기, 및 서열번호를 포함하여 아래 표에 포함된 다양한 EGF(A) 유사체를 제공한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
융합 폴리펩티드
일 양태에서, 본 발명은 GLP-1 유사체의 아미노산 서열 및 및 EGF(A) 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에서 전술한 바와 같이, GLP-1의 유사체는 (7-37)(서열번호 137)의 변이체를 지칭하고, EGF(A)의 유사체는 LDL-R(293-332)(서열번호: 1)의 EGF(A) 도메인의 변이체를 지칭한다.
융합 폴리펩티드는 본원에서 후술하는 바와 같이 유도체의 제조에서 중간체로서 추가로 고려될 수 있다. 본 발명의 유도체를 지칭할 때, 융합 폴리펩티드는 백본(back-bone)으로서 또는 펩티드 백본으로서 지칭될 수 있다.
융합 단백질 또는 융합 폴리펩티드의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 적절한 숙주에서 융합 폴리펩티드를 발현하기 위한 재조합 벡터를 보통의 일반적인 지식에 따라 제조하여 이종 발현에 의한 융합 단백질의 생산에 사용할 수 있다(Sambrook 등의 Molecular Cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 대안적으로, 짧은 폴리펩티드는 고상 펩티드 합성에 의해 흔히 생산되며, 심지어 연장된 길이의 펩티드도 합성에 의해 생산될 수 있다. 펩티드 성분을 별도로 생산한 다음 자연적인 화학 결합을 거쳐 완전한 융합 폴리펩티드로 생산할 수 있다.
2개의 펩티드 분절이 융합되는 경우, 그 순서가 생성되는 융합 폴리펩티드 및 이를 포함하는 화합물의 기능성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 따른 일 구현예에서, N-말단으로부터 시작하는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체의 순서는 GLP-1 유사체 다음이 EGF(A) 유사체이며, 이들은 임의로 스페이서 펩티드에 분리된다(아래 참조). GLP-1 유사체는 GLP-1 유사체의 C-말단을 통해 EGF(A) 유사체와 융합된다고 말할 수 있다.
대안적인 구현예에서, GLP-1 유사체는 EGF(A) 유사체의 C-말단을 통해 EGF(A) 유사체와 융합되어 EGF(A) 유사체를 N-말단에 위치시킨다. 생성된 융합 폴리펩티드는, 후술하는 바와 같이, GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체 둘 다를 포함하고 임의로 스페이서 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 사슬을 정의하는 "백본" 또는 "펩티드 백본"이란 용어로 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 서열번호 138-187에 의해 정의된 유사체 중 어느 하나를 포함하여, 상기 본원에서 정의된 GLP-1 유사체를 포함한다. 　
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 서열번호 2-114에 의해 정의된 유사체 중 어느 하나를 포함하여, 상기 본원에서 정의된 EGF(A) 유사체를 포함한다. 　
스페이서
흔히, 융합 폴리펩티드는 2개의 펩티드의 말단에 존재하는 임의의 기능이 다른 펩티드의 인접성에 의해 방해받지 않도록 스페이서를 포함한다. 일 구현예에서, 스페이서는 펩티드이며, 본원에서는 스페이서 펩티드 또는 펩티드 스페이서로서 지칭된다. 다양한 스페이서 펩티드가 당업계에 공지되어 있으며, 융합 폴리펩티드를 수득하기 위해 GLP-1 유사체와 EGF(A) 유사체 사이에 위치될 수 있다. 전술한 바와 같이, 생성된 융합 폴리펩티드(스페이서 포함)는 합성에 의하거나 이종 발현에 의해 생산될 수 있다.
스페이서 펩티드는 4~80개 아미노산의 일반적인 펩티드 분절이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 이러한 펩티드의 예는 아래에 포함되어 있다.
Figure pct00013
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 펩티드 스페이서를 포함하며, 펩티드 스페이서는 서열번호 115-136에 의해 식별된 펩티드로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 서열번호 115-136에 의해 식별된 펩티드 스페이서의 군으로부터 선택된 펩티드 스페이서를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 하나 이상의 GQAP 분절, 예컨대 1~20개, 예컨대 1~10개, 예컨대 1~6개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 GQAP 분절을 포함하는 펩티드 스페이서를 포함한다.
일 구현예에서, 펩티이드 스페이서는 서열번호 115-128에 의해 식별된 펩티드 군으로부터 선택된 펩티드 스페이서를 포함한다. 　
일 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115-128에 의해 식별된 서열로부터 선택된다. 　
일 구현예에서, 펩티드 스페이서는 Lys 잔기를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 펩티드 스페이서는 Lys 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 하나 이상의 GQAP 분절을 포함하는 펩티드 스페이서를 포함하며, Lys 잔기는 아미노산 치환에 의해 도입된다. 추가의 이러한 구현예에서, 스페이서는 서열번호 121-128에 이해 식별된 서열 군으로부터 선택될 수 있다. 　
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 글리신이 풍부한(Glycine rich) 펩티드 스페이서, 예컨대 아미노산 잔기의 적어도 절반이 Gly인 펩티드 스페이서, 예컨대 아미노산 잔기의 적어도 3/4이 Gly인 펩티드 스페이서를 포함한다. 이러한 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 130-136에 의해 식별된 펩티드로부터 선택될 수 있다. 　
추가의 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115-117 및 121-136에 의해 식별된 펩티드 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115-117 및 121-128에 의해 식별된 펩티드 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115-128에 의해 식별된 서열로부터 선택된다. 　
추가의 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115-117에 의해 식별된 펩티드 군으로부터 선택된다. 　 추가의 구현예에서, 펩티드 스페이서는 서열번호 116에 의해 식별된다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩티드(펩티드 백본)의 다수의 실시예는 모든 성분, 즉 GLP-1 유사체, EGF(A) 유사체 및 펩티드 스페이서의 가변성을 나타내는 실시예에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명의 유도체의 융합 폴리펩티드 또는 백본 서열은 본원에서 정의된 바와 같은 GLP-1 유사체, EGF(A) 유사체 및 펩티드 스페이서로 구성된다.
본 출원의 실시예는 복수의 이러한 융합 폴리펩티드 및 이러한 융합 폴리펩티드를 펩티드 백본으로서 포함하는 유도체를 포함한다. 융합 폴리펩티드의 동일성은 다음의 표에 따라 서열번호가 개별적으로 할당되는 융합 폴리펩티드를 함께 형성하는 개별 성분들의 서열, 즉 GLP-1 유사체, EGF(A) 유사체, 및 펩티드 스페이서의 서열로부터 추론될 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
EGF(A) 유사체에 대한 C-말단에 GLP-1 유사체가 있는 실시예
Figure pct00021
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 188-384, 386-387.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 188-384.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 193, 226-233 및 381-384.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 379-380.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 193, 219 및 220.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 189, 193, 200-203 및 212-218.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 222-225.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 224-225.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 192-196.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 221, 236, 250, 264, 276, 279, 291, 294, 306, 307, 310, 324, 336, 339, 351, 352, 353, 356, 368 및 369.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 221, 250, 276, 279, 291, 294, 306, 307, 310, 324, 336, 351, 353, 356, 368 및 369.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 217, 218, 219, 220, 221, 310 및 386. 일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 217, 218, 221, 310 및 386. 일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 217, 218, 310 및 386. 일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 221, 310 및 386. 일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 310 및 386. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 310에 의해 정의된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 188 및 370-378.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 190, 191, 197, 198 및 199.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 204-211.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 240-247, 254-261, 268-275, 283-290, 298-305, 314-321, 328-335, 343-350 및 360-367.
일 구현예에서, 본 발명은 다음의 서열번호에 의해 정의된 융합 폴리펩티드의 군으로부터 선택된 융합 폴리펩티드에 관한 것이다: 234-235, 237-239, 248-249, 251-253, 262-263, 265-267, 277-278, 280-282, 292-293, 295-297, 308-309, 311-313, 322-323, 325-327, 337-338, 340-342, 354-355 및 357-359.
일 구현예에서, 본 발명은 정확히 1개의 Lys 잔기를 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 최대 2개의 Lys 잔기를 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 2개의 Lys 잔기를 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에서 후술되는 바와 같이, 서열번호 188-384에 의해 정의된 융합 폴리펩티드 또는 펩티드 백본, 또는 상기 정의된 융합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 유도체에 관한 것이다.
GLP-1 기능
수용체 작용제는 수용체에 결합하고 천연 리간드의 전형적인 반응을 유도하는 유사체로서 정의될 수 있다. 완전한 작용제는 천연 리간드와 동일한 크기의 반응을 유도하는 것으로 정의될 수 있다(예를 들어, "Principles of Biochemistry ", AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Second Edition, Worth Publishers, 1993, 763쪽 참조).
따라서, 예를 들어, "GLP-1 수용체 작용제"는 GLP-1 수용체에 결합할 수 있고 이를 활성화할 수 있는 화합물로서 정의될 수 있다.
그리고, "완전한" GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1 수용체 작용제로서 정의될 수 있으며, 이는 천연 GLP-1과 유사한 GLP-1 수용체 반응의 크기를 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 유사체는 GLP-1 수용체 작용제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 유사체는 완전한 GLP-1 수용체 작용제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이기능성 화합물은 GLP-1 수용체 작용제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이기능성 화합물은 완전한 GLP-1 수용체 작용제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 유도체는 GLP-1 수용체 작용제이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 유도체는 완전한 GLP-1 수용체 작용제이다.
이는, GLP-1 수용체에 결합하여, 당업계에 알려진 것과 같은 인슐린 분비 작용 또는 기타 생물학적 효과를 초래하는 신호 전달 경로를 개시하는 화합물(GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물)의 능력을 지칭하는 "GLP-1 활성"을 GLP-1 수용체 작용제가 디스플레이해야 한다는 것이다. 예를 들어, GLP-1 유사체, 이기능성 화합물 및 이의 유도체는 본원의 방법 섹션 C에 기술된 GLP-1 효능 분석법을 사용하여 GLP-1 활성에 대해 시험될 수 있다. 일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물, 즉 GLP-1/EGF(A) 융합 폴리펩티드 및 이의 유도체는 GLP-1 활성을 갖는다.
반치 유효 농도(EC50)는, 투약량 반응 곡선을 참조하여 베이스라인과 최대 값의 절반에 해당하는 반응을 유도하는 농도를 일반적으로 지칭한다. EC50은 화합물의 효능의 척도로서 사용되며, 화합물의 최대 효과의 50%가 관찰되는 농도를 나타낸다.
GLP-1 유사체 및 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 시험관 내 효능은 전술한 바와 같이 결정될 수 있고, 결정된 EC50에 의해 결정될 수 있다. EC50 값이 낮을수록 효능이 더 좋다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물은 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 최대 50 pM, 50~100 pM, 100~250 pM, 또는 250~1000 pM의 EC50을 갖는다. 일 구현예에서, EC50은 최대 500 pM, 예컨대 최대 300 pM, 예컨대 최대 200 pM이다. 일 구현예에서, EC50은 인간 GLP-1(7-37)과 유사하며, 예컨대 최대 50 pM이다. 추가의 구현예에서, EC50은 최대 40 pM, 예컨대 최대 30 pM, 예컨대 최대 20 pM, 예컨대 최대 10 pM이다. 약 10 pM의 EC50을 갖는 화합물의 높은 효능은 세마글루타이드 분자(semaglutide molecule)의 효능과 동등하다.
본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, GLP-1 효능은 EGF(A) 유사체의 효능과 균형을 이루어야 하므로, 일부 구현예에서는, GLP-1 유사체 또는 GLP-1을 포함하는 화합물의 효능이 세마글루타이드와 비교해 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예컨대 적어도 10배, 예컨대 적어도 25배, 예컨대 적어도 50배, 예컨대 적어도 100배 감소되도록 세마글루타이드의 효능보다 적은 GLP-1 효능을 제공하는 GLP-1 유사체를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 야생형 GLP-1와 비교해 효능이 감소되는 것이 더 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(HSA 없이 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 적어도 25 pM, 예컨대 적어도 50 pM, 예컨대 적어도 75 pM, 예컨대 적어도 100 pM, 예컨대 적어도 250 pM, 또는 예컨대 적어도 500 pM이다.
이러한 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(HSA 없는 C1)은 최대 500 pM, 예컨대 최대 400 pM, 예컨대 최대 300 pM, 예컨대 최대 200 pM, 예컨대 최대 100 pM, 또는 예컨대 최대 50 pM이다.
추가 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(HSA 없이 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 20~1000 pM, 예컨대 50~500 pM, 예컨대 100~250 pM, 예컨대 75~100 pM이다.
추가 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(HSA 없이 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 20~800 pM, 예컨대 20~600 pM, 예컨대 20~400 pM, 예컨대 20~200 pM, 또는 예컨대 20~100 pM이다.
대안적으로, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(HSA 없이 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 200~1000 pM, 예컨대 300~800 pM, 예컨대 400~600 pM 또는 250~750 pM 또는 300~500 pM이다.
상기 효능에 대한 고려 사항은 HSA의 존재 하에 효능을 평가할 때에도 관련이 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(1% HSA로 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 적어도 500 pM, 예컨대 적어도 750 pM, 예컨대 적어도 1000 pM, 예컨대 적어도 1500 pM, 또는 예컨대 적어도 2000 pM이다.
이러한 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(1% HSA로 C1)은 최대 2500 pM, 예컨대 최대 2000 pM, 예컨대 최대 1500 pM, 예컨대 최대 1250 pM, 또는 예컨대 최대 1000 pM이다.
추가 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(1% HSA로 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 500~2500 pM, 예컨대 500~2000 pM, 예컨대 500~1500 pM, 예컨대 500~1000 pM이다.
추가 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(1% HSA로 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 750~2500 pM, 예컨대 1000~2500 pM, 예컨대 1500~2500 pM, 예컨대 2000~2500 pM, 또는 예컨대 1800~2500 pM이다.
대안적으로, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 EC50(1% HSA로 C1에 기술된 바와 같이 측정함)은 500~2500 pM, 예컨대 750~2000 pM, 예컨대 1000~2000 pM 또는 1500~2000 pM이다. GLP-1 효능은, 메스꺼움과 같은(이에 한정하는 것은 아님) GLP-1 관련 부작용을 감소시키면서 PCSK9에 대한 완전한 결합을 허용하도록 감소될 수 있다.
GLP-1 유사체 및 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 시험관 내 결합 친화도 C2에 기술된 시험관 내 결합 분석에서 대안적으로 시험될 수 있고, 야생형 GLP-1 또는 세미글루타이드와 동등한 기능을 갖는 화합물에 대한 친화도는 낮은 HSA의 존재 하에 시험할 때 1 nM에 가깝다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물은 시험관 내 결합 분석에서 최대 200nM의 IC50을 가지며, 추가 구현예에서, IC50은 최대 100 nM, 예컨대 최대 75 nM, 예컨대 최대 50 nM, 예컨대 최대 25 nM, 예컨대 최대 10 nM, 예컨대 최대 5 nM이다. 일부 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1을 포함하는 화합물의 결합이 세마글루타이드와 비교해 적어도 5배, 예컨대 적어도 10배, 예컨대 적어도 25배, 예컨대 적어도 50배, 예컨대 적어도 100배 감소되도록, 세마글루타이드의 결합보다 적은 결합을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 야생형 GLP-1와 비교해 결합 친화도가 감소되는 것이 더 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 IC50(HSA 없이 C2에 기술된 바와 같이 측정함)은 적어도 1 nM, 예컨대 적어도 5 nM, 예컨대 적어도 10 nM, 예컨대 적어도 25 nM, 예컨대 적어도 50 nM, 예컨대 적어도 100 nM이다.
이러한 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 IC50(HSA 없는 C2)은 최대 200 nM, 예컨대 최대 100 nM, 예컨대 최대 75 nM, 예컨대 최대 50 nM, 예컨대 최대 25 nM, 예컨대 최대 15 nM, 예컨대 최대 10 nM, 예컨대 최대 5 nM이다.
추가 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물의 IC50(HSA 없이 C2에 기술된 바와 같이 측정함)은 0.1~200 nM, 예컨대 1~100 nM, 예컨대 5~75 nM, 예컨대 5~50 nM이다.
위의 고려 사항은 HSA의 부재 시 결합을 평가할 때 관련이 있다. GLP-1 결합은, 메스꺼움과 같은(이에 한정하는 것은 아님) GLP-1 관련 부작용을 감소시키면서 PCSK9에 대한 완전한 결합을 허용하도록 감소될 수 있다.
GLP-1 효과는 GLP-1 유사체 및 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물이 혈당 및/또는 체중에 미치는 영향을 측정함으로써 생체 내에서 대안적으로 또는 추가적으로 측정될 수 있다. 혈당 및/또는 체중의 감소는 C7에 기술된 바와 같은 db/db 마우스 및 C8에 기술된 바와 같은 DIO 랫트에서와 같이 적절한 모델에서 측정할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물은 본원의 C7에 기술된 바와 같이 db/db 마우스에서 혈당을 감소시키는 능력을 갖는다. 효과는 0에서 24시간까지의 델타 혈당에 대한 곡선 아래 면적(AUC ΔBG24h) 및 AUC ΔBG24h에 대해 계산된 반치(50%) 유효 투약량(ED50, 베이스라인과 최대 효과의 절반에 해당하는 반응을 나타내는 GLP-1 유도체의 투약량)에 기초하여 추정할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물은 15 nmol/kg 미만의 EC50 AUC ΔBG24h를 갖는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, EC50 AUC ΔBG24h는 1~15, 예컨대 2~12 또는 예컨대 5~10 nmol/kg이다.
마찬가지로, 체중을 감소시키는 능력은 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트를 사용하여 평가할 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물을 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때, 상기 유사체 또는 화합물은 베이스라인 BW의 적어도 95%까지 체중을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물을 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때, 상기 유사체 또는 화합물은 베이스라인 체중(BW)의 적어도 90%까지 체중을 감소시킬 수 있다.
EGF(A) 기능 - (PCSK9i)
본원에 기술된 바와 같이, EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 의해 정의된 LDL-R(293-332) EGF(A) 펩티다의 변이체이다. 　 EGF(A) 유사체는 서열번호 1의 유사체인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서 본원에서정의된다. 　
이러한 EGF(A) 유사체는 바람직하게는 PCSK9에 결합하는 능력을 갖는다. 특정 구현예에서, EGF(A) 유사체는, 예를 들어, 천연 LDL-R(293-332)(천연 EGF(A)) 또는 다른 PCSK9-결합 화합물과 비교해 PCSK9에 결합하는 개선된 능력을 갖는다.
EGF(A) 유사체는 LDL-R에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 능력을 추가로 가질 수 있다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 PCSK9 억제제이다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체는 인간 저밀도 지단백 수용체(LDL-R)에 대한 PCSK9의 결합을 억제한다.
이러한 결합은 본원의 섹션 C3에 기술된 분석법을 사용하여 평가될 수 있는데, 이 분석법은 인간 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 경쟁적으로 억제하는 시험 화합물의 능력을 측정한다. LDL-R과 PCSK9의 상호작용을 억제하는 능력으로 인해, 이러한 화합물은 PCSK9 억제제로서 지칭된다.
일 구현예에서, 본 발명의 EGF(A) 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물(융합 폴리펩티드 또는 유도체)는 PCSK9 억제제 화합물 또는 단순히 PCSK9 억제제이다. 일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1의 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물에 관한 것으로서, 상기 유사체는 인간 저밀도 지단백 수용체(LDL-R)에 대한 PCSK9의 결합을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물은 EGF(A) LDL-R(293-332)(서열 번호 1)과 비교해 PCSK9에 결합하는 개선된 능력을 갖는다. 야생형 서열은 비교적 낮은 억제 기능을 가지므로, 비교는 EGF(A) 유사체에 대해서도 이뤄질 수 있다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물은 서열번호 2에 의해 정의된 [299A, 301L, 307I, 309R, 310K]EGF(A)와 비교해 PCSK9에 결합하는 개선된 능력을 갖는다. ELISA 분석에서 측정했을 때의 효능은 EGF(A) 유사체 또는 EGF(A)를 포함하는 화합물에 대해 Ki로서 보고된 겉보기 친화도를 제공하며, C3에 기술된 바와 같이, 낮은 Ki는 강한 억제 기능을 갖는 화합물들에 대한 특징이다.
일 구현예에서, PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석(섹션 C3)에서 측정했을 때, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물의 Ki는 50 nM 미만, 예컨대 25 nM미만 또는 예컨대 10 nM 미만이다. 일 구현예에서, PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석(섹션 C3)에서 측정했을 때, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물의 Ki는 8.0 nM 미만, 예컨대 5.0 nM미만, 예컨대 2.5 nM미만 또는 심지어 2.0 nM 미만이다. 일 구현예에서, PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석(섹션 C3)에서 측정했을 때, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물의 Ki는 0.1~10.0 nM, 예컨대 0.1~8.0 nM 또는 0.1~5.0 nM이다.
EGF(A) 유사체 및 이러한 유사체를 포함하는 화합물의 기능은, 본원의 섹션 C4에 기술된 것과 같이, LDL 흡수를 개선하는 이들의 능력을 추가적인 특징으로 한다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물은 PCSK9의 존재 하에 LDL 흡수를 증가시킨다. 일 구현예에서, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물은 PCSK9가 매개한 LDL 흡수 감소를 역전시키거나 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물은 LDR 흡수 분석에서 측정했을 때 1500 nM 미만, 예컨대 1000 nM 미만, 또는 예컨대 500 nM 미만의 EC50을 갖는다.
EGF(A) 유사체 및 상기 유사체를 포함하는 화합물이 혈중 콜레스테롤에 미치는 효과는 적절한 모델에서, 예컨대 본원의 섹션 C8에 기술된 바와 같은 DIO 랫트에서의 연구에 의해 평가할 수 있다. 본 연구는 시험 화합물을 여러 차례 투여하는 단계를 포함하므로, 효과는 투약량 및 투여 투여 빈도에 따라 달라진다. 본 연구에서는, 낮은 투약량, 높은 투약량 및 매우 높은 투약량 모두의 효과를 투여 후 21일차에 평가하였다.
일 구현예에서 EGF(A) 유사체 또는 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물은, 이들을 30 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때 적어도 0.5 mmol/L만큼 콜레스테롤을 감소시킬 수 있다. 추가 구현예에서, 30 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때 콜레스테롤 수준이 적어도 0.6 mmol/L 또는 예컨대 0.8 mmol/L 감소된다.
일 구현예에서 EGF(A) 유사체 또는 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물은, 이들을 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때 적어도 0.8 mmol/L만큼 콜레스테롤을 감소시킬 수 있다. 추가 구현예에서, 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때 콜레스테롤 수준이 적어도 1.0 mmol/L 또는 예컨대 1.2 mmol/L 감소된다.
이기능성
본원에 전술한 바와 같이, 상이한 기능성은 2개의 유사체, 즉 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체와 관련이 있다. 이들 2개의 유사체를 본 발명의 화합물에서 결합시킬 때, 각 유사체의 기능성이 유지되는 것, 즉 GLP-1 유사체가 GLP-1 수용체를 자극하는 능력을 갖고, EGF(A) 유사체가 PCSK9에 경쟁적으로 결합하며, 또한 2가지 화합물 모두를 포함하는 화합물이 2가지 기능성 모두를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 화합물의 기능성은 GLP-1 및 EGF(A)의 기능성 시험을 위한 본원에 기술된 분석에서 시험될 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은 이기능성 분자로서 지칭된다.
치료적 용도에 적합한 화합물을 얻기 위해서는, PCSK9 억제제와 GLP-1 수용체 작용제 둘 다의 원하는 수준의 활성을 얻도록 기능성이 균형을 이뤄야만 한다. 일 구현예에서, 화합물은 본원에서 전술한 바와 같은 GLP-1 수용체 작용제이다. 일 구현예에서, 화합물은 본원에서 전술한 바와 같은 PCSK9 억제제이다. GLP-1 수용체 효능의 측정은 섹션 C1에 기술되어있고, GLP-1 유사체에 대한 결합 친화도는 섹션 C2에 기술되어 있으며, 이들 기능적 요건은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물에 대해 동등하게 관련이 있다.
마찬가지로, EGF(A) 유사체의 기능성은 본원의 섹션 C3, C4 및 C6에 기술된 EGF(A) 기능 및 분석 섹션에서 기술되어 있다.
GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 본 발명에 따른 화합물은 유사체 각각에 대해 1가이고, 화합물은 1개의 EGF(A) 유사체 및 1개의 GLP-1 유사체를 포함한다. GLP-1 수용체 작용제 기능 및 PCSK9 억제제 기능의 균형을 유지하기 위해, 2가지 활성 모두의 적절한 수준이 획득되도록 유사체를 개별적으로 선택할 수 있다. GLP-1 수용체 작용제의 높은 투약량이 메스꺼움과 같은 부작용을 야기할 수 있다는 것은 잘 알려져 있으므로, 양호한 PCSK9 억제 기능을 유지하면서 GLP-1 효능을 감소시켜 동일한 혈장 농도에서 2가지 활성 모두의 적절한 균형을 얻는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, GLP-1 효능은 본원에서 전술한 바와 같이 GLP-1(3-37) 또는 세마글루타이드와 비교해 감소된다. 이러한 구현예에서, 시험관 내 CRE 루시페라아제 분석(HSA 없이 섹션 C1)에 의해 측정한 EC50은 적어도 10 pM이다.
일 구현예에서, 경쟁 ELISA(섹션 C3)에 의해 측정된 겉보기 Ki는 50 nM 미만이다.
일 구현예에서, 겉보기 EGF(A) Ki(C3) 및 GLP-1 효능(HSA 없이 C1)의 비율은 최대 5000, 예컨대 최대 4000, 예컨대 최대 3000, 예컨대 최대 2000, 또는 예컨대 최대 1000이다.
일 구현예에서, 겉보기 EGF(A) Ki(C3) 및 GLP-1 효능(HSA 없이 C1)의 비율은 최대 1000, 예컨대 최대 800, 예컨대 최대 600, 예컨대 최대 400, 또는 예컨대 최대 200이다.
일 구현예에서, 겉보기 EGF(A) Ki(C3) 및 GLP-1 효능(HSA 없이 C1)의 비율은 최대 200, 예컨대 최대 150, 예컨대 최대 100, 예컨대 최대 50이다.
화합물이 진정한 이기능성임을 확인하기 위해서는, 본원에 기술된 바와 같은 기능성을 평가하는 것이 바람직한데, 이는 본원의 섹션 C8에 기술된 바와 같이, 체중과 콜레스테롤 둘 다에 미치는 효과를 측정할 수 있는 DIO 랫트에서 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 화합물은 본원의 섹션 C8에 기술된 바와 같은 생체 내 랫트 연구에서 콜레스테롤과 체중을 GLP-1/EGF(A) 화합물 #41과 적어도 동등하게 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 화합물을 30 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때, 화합물은 콜레스테롤을 적어도 0.5 mmol/L만큼 감소시킬 수 있다.
추가 구현예에서, 30 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때 콜레스테롤 수준이 적어도 0.6 mmol/L 또는 예컨대 0.8 mmol/L 감소된다.
일 구현예에서, 화합물을 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때, 화합물은 콜레스테롤을 적어도 0.8 mmol/L만큼 감소시킬 수 있다.
추가 구현예에서, 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때 콜레스테롤 수준이 적어도 1.0 mmol/L 또는 예컨대 1.2 mmol/L 감소된다.
일 구현예에서, 화합물을 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때, 상기 화합물은 베이스라인 BW의 적어도 95%까지 체중을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 화합물을 300 nmol/kg/일로 투여하고 투여 후 21일차에 측정했을 때, 상기 화합물은 베이스라인 BW의 적어도 90%까지 체중을 감소시킬 수 있다.
유도체
이기능성 화합물의 맥락에서 사용된 용어 "유도체"는 하나 이상의 치환기가 화합물에 공유 결합된, 화학적으로 변형된 이기능성 화합물을 의미한다.
본원에 기술된 바와 같이, 치환기는 화합물에 공유 부착된다. 치환기를 폴리펩티드에 부착하는 다수의 방법, 예컨대 N-말단, C-말단 또는 내부 아미노산 잔기를 통해 치환기를 부착하는 등의 방법이 알려져 있다.
일 구현예에서, 화합물은 1개 이상의 치환기를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 화합물은 1개 또는 2개의 치환기를 포함한다. 일 구현예에서, 화합물은 1개 또는 2개의 치환기를 갖는다. 일 구현예에서, 화합물은 1개의 치환기를 갖는다. 일 실시예에서, 화합물은 2개의 치환기를 갖는다.
화합물이 2개의 치환기를 갖는 구현예에서, 2개의 치환기는 동일한 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 1개 또는 2개의 치환기는 펩타이드 백본의 질소 원자에 부착된다. 일 구현예에서, 1개 또는 2개의 치환기는 펩티드 백본의 아미노기에 부착된다. 일 구현예에서, 1개 또는 2개의 치환기는 1개 또는 2개의 Lys 잔기의 엡실론 질소에 부착된다.
일 구현예에서, 2개의 치환기는 펩티드 백본의 상이한 Lys 잔기에 부착된다. 일 구현예에서, 2개의 치환기는 펩티드 백본 내의 상이한 Lys 잔기의 엡실론 질소에 부착된다.
본원에 기술된 바와 같이, GLP-1 유사체, 펩티드 스페이서 및 EGF(A) 유사체를 포함하거나 이들로 구성되는 유도체의 융합 폴리펩티드 또는 펩티드 백본은 1개 이상의 Lys 잔기를 가질 수 있다. 상이한 수의 Lys 잔기를 갖는 GLP-1 유사체, 펩티드 스페이서 및 EGF(A) 유사체의 다양한 실시예가 상기 본원에서 설명되었으며, 이러한 서열은 정확히 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 갖는 융합 폴리펩티드 또는 펩티드 백본을 수득하도록 조합될 수 있다.
일 구현예에서, 펩티드 백본은 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 갖는다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 단 1개의 Lys 잔기를 갖는다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 정확히 2개의 Lys 잔기를 갖는다.
일 구현예에서, 펩티드 백본은 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함하는 GLP-1 유사체를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 단 1개의 Lys 잔기를 포함하는 GLP-1 유사체를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함하는 GLP-1 유사체를 포함한다.
일 구현예에서, 펩티드 백본은 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함하는 EGF(A) 유사체를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 단 1개의 Lys 잔기를 포함하는 EGF(A) 유사체를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함하는 EGF(A) 유사체를 포함한다.
일 구현예에서, 펩티드 백본은 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함하는 펩티드 스페이서를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 단 1개의 Lys 잔기를 포함하는 펩티드 스페이서를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드 백본은 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함하는 펩티드 스페이서를 포함한다.
일 구현예에서, 치환기는 펩티드의 기능성을 개선하는 것을 목표로 한다.
일 구현예에서, 치환기가 화합물의 반감기를 증가시켜, 펩티드 백본 및 치환기를 포함하는 유도체의 혈장 반감기는, 본원에 도시된 바와 같은 펩티드 백본의 반감기와 비교해 증가된 반감기를 갖는다(섹션 C5, 표 5).
상이한 종에서 반감기를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에서 미니피그에 대해 예시된다(섹션 C5).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 유도체는 12시간이 넘는 반감기를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 유도체는 피하 또는 정맥 내 투약 후 미니피그에서 측정했을 때, 24시간이 넘는 반감기, 예컨대 36시간이 넘는 반감기, 또는 예컨대 48시간이 넘는 반감기를 갖는다.
치환기
용어 "치환기"는, 일반적으로 동일한 위치에 존재하는 원자를 치환함으로써, 아미노산 잔기를 통해 폴리펩티드에 부착되는 모이어티를 지칭한다. 흔히, 치환기는 수소 원자, 예컨대 아미노기(-NH2)의 수소를 대체한다. 따라서, 치환기는 펩티드 또는 폴리펩티드에 공유 부착된 모이어티이다. 본 발명에 따르면, 모이어티(예: 치환기)는 안정성 증가 또는 반감기 증가와 같은 다른 유익한 특성을 추가하면서 펩티드의 기능성에 영향을 미치지 않거나 최소한의 영향을 미치는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 반감기 연장 치환기는 단백질 모이어티이다. 추가의 이러한 구현예에서, 단백질 모이어티는 인간 알부민, Fc-도메인 또는 비정형 단백질 연장부(unstructured protein extension)를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 모이어티는 유사체 중 하나에 융합될 수 있다. 추가의 구현예에서, 단백질 모이어티는 Fc 도메인이고 Fc 도메인은 GLP-1 유사체 또는 EGF(A) 유사체에 융합된다. Fc 융합이 이뤄지면, 2개의 폴리펩티드가 하나의 Fc 도메인을 형성하게 되므로, 생성되는 화합물은 2가가 된다.
일 구현예에서, 치환기는 단백질 모이어티가 아니다.
일 구현예에서, 치환기는 펩티드 백본에 융합된 단백질 모이어티가 아니다.
또 다른 구현예에서, 치환기는 비-단백질 모이어티이다.
특정 구현예에서, 치환기는 알부민과 함께 비공유 복합체를 형성하여, 혈류 내에서 유도체의 순환을 촉진할 수 있고, 유도체의 작용 시간을 연장하는 효과도 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 치환기는 PCSK9 및/또는 GLP-1 수용체에 대한 유도체의 결합 능력을 실질적으로 감소시키지 않으면서 유도체의 작용 시간을 연장할 수 있다.
일 구현예에서, 유도체는 반감기 연장 치환기를 포함한다. 다양한 반감기 연장 치환기는 당업계에 잘 알려져 있고, 추가로 후술하는 바와 같은 지방산기를 포함하는 특정 알부민 결합제를 포함하며, 이러한 알부민 결합제는 비-단백질 치환기이다.
치환기는 적어도 1개의 지방산기를 포함한다.
특정 구현예에서, 지방산기는 적어도 8개의 연속 -CH2-기를 함유하는 탄소 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, 지방산기는 적어도 10개의 연속 -CH2-기, 예컨대 적어도 12개의 연속 -CH2-기, 적어도 14개의 연속 -CH2-기, 적어도 16개의 연속 -CH2-기, 적어도 18개의 연속 -CH2-기를 포함한다.
일 구현예에서, 지방산 기는 8~20개의 연속 -CH2-기를 포함한다. 일 구현예에서, 지방산 기는 10~18개의 연속 -CH2-기를 포함한다. 일 구현예에서, 지방산 기는 12~18개의 연속 -CH2-기를 포함한다. 일 구현예에서, 지방산 기는 14~18개의 연속 -CH2-기를 포함한다.
유도체가 2개의 치환기를 포함하는 상황에서, 증가된 반감기는 짧은 지방산기를 사용하여 얻어질 수 있으므로, 유도체가 2개의 치환기를 포함하는 구현예에서, 지방산기는 적어도 8개의 연속 CH2-기, 예컨대 적어도 10개의 연속 -CH2-기, 예컨대 적어도 12개의 연속 -CH2-기, 예컨대 적어도 14개의 연속 -CH2-기, 예컨대 적어도 16개의 연속 -CH2-기, 예컨대 적어도 18개의 연속 -CH2-기를 포함할 수 있다.
유도체가 2개의 치환기를 포함하는 추가의 구현예에서, 치환기는 8~18개의 연속 -CH2-기를 포함하는 지방산기를 각각 포함한다. 추가의 이러한 구현예에서, 지방산기는 10~18개의 연속 CH2-기, 예컨대 12~18개의 연속 -CH2-기, 예컨대 14~18개의 연속 -CH2-기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "지방산기"는 7 미만의 Pka를 갖는 브뢴스테드-로우리산(Brønsted-Lowry acid)인 적어도 하나의 작용기를 포함하는 화학기로서 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, 치환기는 적어도 8개의 연속 -CH2-기 및 7 미만의 Pka를 갖는 적어도 하나의 작용기(FG)를 포함한다. 브뢴스테드-로우리산인 이러한 작용기의 비제한적인 예는 카복실산(카복시페녹시도 포함함)을 포함한다.
일 구현예에서 지방산기는 작용기(산)의 대향 말단에 카보닐을 포함하는데, 이러한 지방산기는 이산(di-acid)으로서 지칭될 수도 있다.
일 구현예에서, 용어 "연장기(protractor)"는 치환기의 말단부로서, 화합물의 반감기 연장을 담당하는 지방산기를 기술하도록 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 연장기는
화학식 1: HOOC-(CH2)n-CO-*에 의해 정의될 수 있는데(식 중, n은 8~20 범위의 정수임), 이는 C(n+2) 이산(diacid)으로서 지칭되거나
화학식 1b:
Figure pct00022
로서 정의될 수 있다(식 중 n은 8~20 범위의 정수임).
일 구현예에서, 연장기는
화학식 2: HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*에 의해 정의되거나(식 중 m은 8~11 범위의 정수임)
화학식 2b:
Figure pct00023
로서 정의될 수 있다(식 중, 카복시기는 화학식 3의 (C6H4)기의 위치 2, 3, 또는 4에 있고, m은 8~11 범위의 정수임).
일 구현예에서, 연장기는 위에 정의된 바와 같이 화학식 1, 화학식 1b, 화학식 2 또는 화학식 2b에 의해 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 치환기는 하나 이상의 링커 요소를 포함한다. 링커 요소는 아미드 결합에 의해 서로 및 연장기에 연결되어 "Z"로 지칭될 수 있다(자세한 내용은 아래 참조).
본원에서 추가로 정의된 바와 같이, 링커 요소의 수는 최대 6개로서 -Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-으로 지칭될 수 있으며, 여기서 Z1은 연장기(Pro-)와 연결되고 마지막 Z 요소는 펩티드와 연결되며, 이 경우 치환기는 Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-로 지칭될 수 있다. 따라서, 위의 기호 "*"는 아미드 결합을 통해 결합될 때는 질소인 Z1에 대한 부착점을 나타낸다. 일 구현예에서, Z1이 결합인 경우(하기 참조), 기호 *는 이웃하는 Z 요소의 질소에 대한 부착점을 나타낸다.
일 구현예에서, 치환기는 Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-에 의해 정의되며,
식 중 Pro-는 화학식 1, 화학식 1b, 화학식 2 및 화학식 2b로부터 선택되고, n은 8~20 범위의 정수이며, m은 8~11 범위의 정수이다.
특정 구현예에서, n은 화학식 1 또는 화학식 1b에서의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고, m은 8, 9, 10 또는 11이다.
본원에서 사용된 용어 "결합"은 공유 결합을 의미한다. Z1-Z6의 링커 요소가 결합으로서 정의되는 경우, 이는 상기 성분이 부재하는 상황과 등등하다. Z1-Z6 중 어느 하나가 결합이라는 본원의 표시도 임의의 Z1-Z6 중 어느 하나가 부재인 것으로 판독될 수 있다. 논리적으로 "결합" 다음에 "결합"에 이어질 수 없다. 따라서, "결합"(또는 부재)이라는 표시는 이전의 Z 요소가 "결합"이 아닌 다음 Z 요소에 공유 결합된다는 것을 의미한다.
링커 요소 Z1-Z6은 아미노산 유사 모이어티를 포함하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 화학적 모이어티, 예컨대 Glu, γGlu(감마 Glu 또는 gGlu로도 지칭되며 *-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*에 의해 정의됨), Gly, Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep 및 Aeeep, 및 아래에 기술된 것과 같은 추가의 모이어티로부터 개별적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z1 요소는 임의의 요소이며, 하나의 이러한 구현예에서, Z1은 화학식 3: *-NH-CH2-(C6H10)-CO-* 또는 화학식 3b:
Figure pct00024
, 및 결합으로부터 선택된다.
화학식 3은 트라넥사민산인 트랜스-4-(아미노메틸)시클로헥산카복실산을 나타내는 Trx로서 지칭될 수도 있으며, 여기서 화학식 3은 o-(1,2), m-(1,3) 및 p-(1,4) 형태를 포함하는 한 편, 화학식 3b는 p-(1,4) 형태를 지정한다.
일 구현예에서, Z2는 γGlu, Glu, 또는 결합으로부터 선택된다. 일 구현예에서, Z2는 γGlu이다.
일 구현예에서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 Glu, γGlu, Gly, Ser, Ala, Thr, Ado, Aeep 및 Aeeep 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
Glu, Gly, Ser, Ala, Thr은 당업계에 잘 알려진 아미노산 잔기이다.
γGlu는 화학식 4: 4 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되고, *-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*에 의해 정의되는데,
이는 화학식 4b:
Figure pct00025
와 동일하고, γGlu로 지칭될 수도 있다.
Ado는 화학식 5: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*에 의해 정의되는 데, 이는 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산으로 지칭될 수도 있고,
화학식 5b:
Figure pct00026
와 동일하다.
Aeep는 화학식 6: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*에 의해 정의되는데,
이는 화학식 6b:
Figure pct00027
로서 지칭될 수도 있다.
일 구현예에서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 Glu, γGlu, Gly, Ala, Ado, Aeep 및 Aeeep 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 Glu, γGlu, Gly, Ala, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 Glu, γGlu, Gly, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 γGlu, Gly, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 γGlu, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택된다.
일 구현예에서, 치환기(들)는 아래에서 #1 내지 #14로 정의된 치환기 군으로부터 선택된다.
Figure pct00028
치환기 #1은 화학식 6: HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 6b와 동일하다
[화학식 6b]
Figure pct00029
.
치환기 #2는 화학식 7: 7: HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 7b와 동일하다
[화학식 7b]
Figure pct00030
.
치환기 #3은 화학식 8: 8: HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 8b와 동일하다
[화학식 8b]
Figure pct00031
.
치환기 #4는 화학식 9: HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 9b와 동일하다
[화학식 9b]
Figure pct00032
.
치환기 #5는 화학식 10: HOOC-(CH2)18-CO-γGlu-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 10b와 동일하다
[화학식 10b]
Figure pct00033
.
치환기 #6은 화학식 11: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 11b로서 명시된다
[화학식 11b]
Figure pct00034
.
치환기 #7은 화학식 12: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 12b로서 명시된다
[화학식 12b]
Figure pct00035
.
치환기 #8은 화학식 13: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 13b로서 명시된다
[화학식 13b]
Figure pct00036
.
치환기 #9는 화학식 14: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-γGlu-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 14b로서 명시된다
[화학식 14b]
Figure pct00037
.
치환기 #10은 화학식 15: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 15b로서 명시된다
[화학식 15b]
Figure pct00038
.
치환기 #11은 화학식 16: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 16b로서 명시된다
[화학식 16b]
Figure pct00039
.
치환기 #12는 화학식 17: HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 17b로서 명시된다
[화학식 17b]
Figure pct00040
.
치환기 #13은 화학식 18: 4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 18b로서 명시된다
[화학식 18b]
Figure pct00041
.
치환기 #14는 화학식 19: HOOC-(CH2)14-CO-γGlu-Ado-Ado-*에 의해 정의되는데, 이는 화학식 19b로서 명시된다
[화학식 19b]
Figure pct00042
.
이기능성 화합물
다수의 융합 화합물이 본원에서 기술되어 있는데, 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 과제는 2가지 기능성이 유지되고 균형을 이루도록 하는 것이다. 개시된 화합물은 EGF(A) 유사체, 스페이서 및 GLP-1 유사체의 변화 및 이들 요소의 순서 변화를 포함한다.
일 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 GLP-1 유사체를 N-말단에 포함하고 EGF(A) 유사체를 C-말단에 포함하는데, 이는 GLP-1 기능성을 유지하는 데 중요한 것으로 밝혀졌다.
추가의 구현예에서, EGF(A) 유사체는 301L 돌연변이, 및 본원에서 상술되고 서열번호 107 및 108에 의해 식별된 EGF(A) 유사체의 서열에 의해 예시된 309R 및 309I 중 하나 이상을 가장 최소로 포함해야 하는데, 야생형 리신을 제거하기 위해 312E 돌연변이를 포함할 수도 있다.
일 구현예에서, GLP-1 유사체는 본원에서 전술한 바와 같은 돌연변이, 예컨대 잔기 8의 8Aib, 8G 또는 8W로의 돌연변이, 및 잔기 34의 예컨대 34R로의 돌연변이를 포함하는데, 이는 치환기가 K26에 부착될 수 있게 한다. 30G와 같은 추가 돌연변이는 GLP-1 유사체의 효능을 감소시키는 데 유리할 수 있다.
이러한 구현예에서, 화합물은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하되,
i) 상기 GLP-1 유사체는 서열번호 139,140, 141, 142 또는 164에 의해 식별되며
ii) 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 107, 108, 또는 109에 의해 식별된다.
일 구현예에서, 화합물은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하되,
i) 상기 GLP-1 유사체는 서열번호 139 또는 164에 의해 식별되며
ii) 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 107 또는 108에 의해 식별된다.
일 구현예에서, 화합물은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하되,
i) 상기 GLP-1 유사체는 서열번호 164에 의해 식별되며
ii) 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 108에 의해 식별된다.
일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #1~74 및 76~314 중 어느 하나이다.
일 구현예에서 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #1~74, 76~314로서 정의된 화합물의 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #69 및/또는 #306이다. 일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #69이다. 일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #306이다.
일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #41 및/또는 #48이다. 일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #41이다. 일 구현예에서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #48이다.
제조 방법
본원에 기술된 화합물은 공통의 일반 지식을 사용하여 제조될 수 있다. 백본 또는 융합 폴리펩티드는 (방법 섹션 A1에 기술된 바와 같은) 화학적 합성에 의하거나 이종 발현에 의해 제공될 수 있다. 융합 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터는 일반 분자 생물학에 의해 제조될 수 있고, 적절한 숙주가 선택될 수 있다. 방법들을 조합함으로써, 백본의 일부분을 합성에 의해 제조하는 한 편, 백본의 다른 부분은 재조합 기술에 의해 제조할 수도 있다. 치환기는 화학 합성이 진행되는 동안 펩티드 백본에 부착되거나 후속 반응 중에 백본 또는 이의 일부에 부착될 수 있다. 제조 방법과 독립적으로, 화합물은 이들의 요소, 예를 들어, 융합 폴리펩티드(펩티드 백본) 및 하나 이상의 치환기(들)에 의해 정의된다.
본 발명의 일 양태는 본원에 기술된 바와 같은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 유도체의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 유도체는 융합 폴리펩티드에 공유 결합된 1개 이상의 치환기를 추가로 포함한다.
약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 화합물(또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 아미드, 또는 에스테르), 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 제조할 수 있다.
"부형제"라는 용어는 활성 치료 성분 이외의 임의의 성분을 광범위하게 가리킨다. 부형제는 불활성 물질, 비활성 물질, 및/또는 의약적 비활성 물질일 수 있다. 부형제는 다양한 목적, 예를 들어, 담체, 비히클, 희석제, 정제 보조제로서, 및/또는 투여 및/또는 활성 물질의 흡수를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 부형제의 비제한적인 예는 용매, 희석제, 완충액, 보존제, 등장화 조절제, 킬레이트제 및 안정화제이다. 다양한 부형제를 갖는 약학적 활성 성분의 제형은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 19th edition (1995), 및 이후 버전) 참조).
본 발명의 조성물은 액체 제형, 즉 물을 포함하는 수성 제형의 형태일 수 있다. 액체 제형은 용액이거나 현탁액일 수 있다. 대안적으로, 고체 제형, 예를 들어 동결 건조되거나 분무 건조된 조성물일 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여용으로서, 예를 들어, 주사기, 임의로는 펜형 주사기에 의하거나 주입 펌프에 의해 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여가 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료제와 같은 제2 활성 성분을 추가로 포함할 수 있는데, 이는 병용 치료의 경우에 투여를 단순화할 수 있다.
제형의 예는 액체 제형, 즉 물을 포함하는 수성 제형을 포함한다. 액체 제형은 용액이거나 현탁액일 수 있다. 수성 제형은 일반적으로 적어도 50%w/w의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 80%, 또는 심지어 적어도 90%w/w의 물을 포함한다.
대안적으로, 약학적 조성물은 고체 제형, 예를 들어, 동결 건조되거나 분무 건조된 조성물일 수 있으며, 이들은 그대로 사용할 수 있거나, 사용 전에 의사나 환자가 용제 및/또는 희석제를 이에 첨가한다.
수성 제형의 pH는 pH 3 내지 pH 10의 임의의 값일 수 있으며, 예를 들어 약 7.0 내지 약 9.5; 또는 약 3.0 내지 약 7.0, 예컨대 7.0 내지 9.5, 또는 3.0 내지 7.0일 수 있다.
약학적 조성물은 완충액을 포함할 수 있다. 완충액은, 예를 들어, 초산나트륨, 탄산나트륨, 구연산염, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산이수소이나트륨, 인산나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신(bicine), 트리신, 말산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 보존제는, 예를 들어, 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 및 티메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미두레아, 클로로헥시딘, 소듐데하이드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로르페네신(3p-클로로페녹시프로판-1,2-디올), 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 보존제는 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다.
약학적 조성물은 등장화제를 포함할 수 있다. 등장화제는, 예를 들어, 염(예: 염화 나트륨), 당류 또는 당알코올, 아미노산(예: 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예: 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜(예: PEG400) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 프룩토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 크실로오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 알파 및 베타 HPCD, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 카복시메틸셀룰로오스-Na를 포함하는, 단당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸과 같은 임의의 당이 사용될 수 있다. 당알코올은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 덜시톨, 크실리톨 및 아라비톨을 포함한다. 일 구현예에서, 당알코올 첨가제는 만니톨이다.
약학적 조성물은 킬레이트제를 포함할 수 있다. 킬레이트제는, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산, 및 아스파르트산의 염, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 안정화제를 포함할 수 있다. 안정화제는, 예를 들어 하나 이상의 산화 억제제, 응집 억제제, 계면활성제, 및/또는 하나 이상의 프로테아제 억제제일 수 있다. 약학적 조성물은 고분자량 중합체 또는 저분자 화합물로부터 선택된 안정화제를 포함할 수 있다. 안정화제는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(예: PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카복시-/히드록시셀룰로오스 또는 이의 유도체(예: HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 황함유 물질(모노티오글리세롤과, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올), 및 상이한 염(예: 염화나트륨)으로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 추가 안정화제, 예컨대, 메티오닌 산화로부터 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 및 동결-해동 또는 기계적 전단과 연관된 응집으로부터 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
약학적 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분 및 지용성(친유성) 부분으로 이루어진 임의의 분자 또는 이온을 지칭한다. 계면활성제는, 예를 들어 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및/또는 쌍성이온성 계면활성제로부터 선택될 수 있다.
약학적 조성물은 하나 이상의 프로테아제 억제제, 예컨대, EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및/또는 벤즈아미딘HCl을 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 임의의 추가 성분은, 예를 들어, 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예: 인간 혈청 알부민, 젤라틴), 및/또는 쌍성이온(예: 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함한다.
유도체 또는 유사체는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이는 당업계에 공지된 다양한 경로에 의해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어, 비경구(parenteral), 표피(epidermal); 진피(dermal); 경피(transdermal); 결막(conjunctival); 요도(uretal); 질(vaginal); 직장(rectal); 및/또는 안구(ocular), 설상(lingual); 설하(sublingual); 구강(buccal); 구 내(in the mouth); 경구(oral); 복부 내(in the stomach); 장 내(in the intestine); 비강(nasal); 기관지, 폐포를 경유하는 폐(pulmonary), 또는 이들의 조합일 수 있다.
조성물은 여러 가지 투약 형태, 예를 들어 용액; 현탁액; 유화액; 마이크로에멀젼; 복합 유제(multiple emulsion); 발포체; 고약; 페이스트; 반창고; 연고; 정제; 코팅된 정제; 츄잉 껌; 세정제; 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐; 좌약; 직장 캡슐; 점적제; 젤; 스프레이; 분말; 에어로졸; 흡입제; 점안액; 안과 연고; 안과 세정제; 질 페서리; 질 고리; 질 연고; 주사 용액; 인 시튜 겔화, 세팅, 침전 및 인 시튜 결정화와 같은 인 시튜 변환 용액; 주입 용액; 또는 임플란트로서 투여될 수 있다.
조성물은, 예를 들어 안정성, 생체이용률 및/또는 용해도를 개선하기 위해, 약물 담체 또는 약물 전달 시스템에 추가로 배합될 수 있다. 조성물은 조절형, 유지형, 지연형, 지체형 및/또는 서방형 약물 전달 시스템의 제형에 사용될 수 있다.
의료적 사용
일 양태에서, 본 발명은 의약의 제조에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하거나 의약의 제조에 사용하기 위한, 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물 또는 이의 조성물은 심혈관 질환 및/또는 심혈관 질환의 위험을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물 또는 이의 조성물은
i. 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료, 총 혈청 지질의 저하와 같은 지질 파라미터의 개선; LDL-C 저하, HDL 증가; 작고 조밀한 LDL의 저하; VLDL 저하; 중성 지방 저하; 콜레스테롤 저하; 지단백 a(Lp(a))의 혈장 수준 저하; 아포지단백 A(apo(A))의 생성 억제;
ii. 심장 증후군 X, 동맥경화증, 심근경색, 관상동맥 심장 질환, 재관류 손상, 뇌졸중, 내뇌 허혈증, 조기 심장 질환 또는 조기 심혈관 질환, 좌심실 비대증, 관상동맥 질환, 고혈압, 본태성 고혈압, 급성 고혈압 긴급증, 심근증, 심부전, 운동 불내성, 급성 및/또는 만성 심부전, 부정맥, 심장 부정맥, 실신, 협심증, 심장 우회 및/또는 스텐트 재폐색, 간헐적 파행증(동맥경화성 동맥폐쇄), 심장확장성 기능장애, 및/또는 심장수축성 기능장애와 같은 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료; 및/또는 수축기 혈압 강하와 같은 혈압 강하; 심혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 심혈관 질환 및/또는 심혈관 질환의 위험의 치료 또는 예방을 위한 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 (i) 지질이상혈증의 예방 및/또는 치료, 총 혈청 지질의 저하와 같은 지질 파라미터의 개선; LDL-C 저하, HDL 증가; 작고 조밀한 LDL의 저하; VLDL 저하; 중성 지방 저하; 콜레스테롤 저하; 지단백 a(Lp(a))의 혈장 수준 저하; 아포지단백 A(apo(A))의 생성 억제; (ii) 심장 증후군 X, 동맥경화증, 심근경색, 관상동맥 심장 질환, 재관류 손상, 뇌졸중, 내뇌 허혈증, 조기 심장 질환 또는 조기 심혈관 질환, 좌심실 비대증, 관상동맥 질환, 고혈압, 본태성 고혈압, 급성 고혈압 긴급증, 심근증, 심부전, 운동 불내성, 급성 및/또는 만성 심부전, 부정맥, 심장 부정맥, 실신, 협심증, 심장 우회 및/또는 스텐트 재폐색, 간헐적 파행증(동맥경화성 동맥폐쇄), 심장확장성 기능장애, 및/또는 심장수축성 기능장애와 같은 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료; 및/또는 수축기 혈압 강하와 같은 혈압 강하; 심혈관 질환의 치료를 위한 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 화합물의 약학적 활성량이 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 다음의 의학적 치료에 사용될 수 있다:
i. 고혈당증, 제2형 당뇨병, 내당능 장애, 제1형 당뇨병, 비-인슐린 의존성 당뇨병, MODY(연소자의 성인발증형당뇨병), 임신성 당뇨병 및/또는 HbA1C의 감소와 같은 모든 형태의 당뇨병에 대한 예방 및/또는 치료;
ii. 제2형 당뇨병의 진전과 같은 당뇨성 질병 진전의 지연 또는 예방, 내당능 장애(IGT)의 인슐린 요구성 제2형 당뇨병으로의 진전의 지연, 인슐린 내성의 지연 또는 예방, 및/또는 비-인슐린 요구성 제2형 당뇨병의 인슐린 요구성 제2형 당뇨병으로의 진전의 지연;
iii. β-세포 세포자멸사의 감소, β-세포 기능 및/또는 β-세포 질량의 증가, 및/또는 β-세포에 대한 글루코오스 민감도 회복과 같은 β-세포 기능의 개선;
iv. 알츠하이머병, 파킨슨병 및/또는 다발성 경화증과 같은 인지 장애 및/또는 신경퇴행성 장애의 예방 및/또는 치료;
v. 예를 들어 음식 섭취량 감소, 체중 감소, 식욕 억제, 포만감 유발에 의한 섭식 장애(예: 비만)의 예방 및/또는 치료; 향정신 약물 또는 스테로이드의 투여에 의해 유도된 폭식 장애, 신경성 폭식증 및/또는 비만의 치료 또는 예방; 위 운동의 감소; 위 공복의 지연; 신체 운동성의 증가; 및/또는 골관절염 및/또는 요실금과 같은 비만 동반 질환의 예방 및/또는 치료;
vi. 혈관병증과 같은 당뇨병성 합병증; 말초 신경병증을 포함하는 신경병증; 신병증; 및/또는 망막병증의 예방 및/또는 치료;
vii. 이상지질혈증의 예방 및/또는 치료, 총 혈청 지질의 저하와 같은 지질 파라미터의 개선; HDL 증가; 작고 조밀한 LDL의 저하; VLDL 저하; 중성 지방 저하; 콜레스테롤 저하; 인간에서 지단백 a(Lp(a))의 혈장 수준 저하; 시험관 내 및/또는 생체 내 아포지단백 a(apo(a))의 생성 억제;
viii. 증후군 X, 동맥경화증, 심근경색, 관상동맥 심장 질환, 재관류 손상, 뇌졸중, 내뇌 허혈증, 조기 심장 질환 또는 조기 심혈관 질환, 좌심실 비대증, 관상동맥 질환, 고혈압, 본태성 고혈압, 급성 고혈압 긴급증, 심근증, 심부전, 운동 불내성, 급성 및/또는 만성 심부전, 부정맥, 심장 부정맥, 실신, 협심증, 심장 우회 및/또는 스텐트 재폐색, 간헐적 파행증(동맥경화성 동맥폐쇄), 심장확장성 기능장애, 및/또는 심장수축성 기능장애와 같은 심혈관 질환의 예방 및/또는 치료; 및/또는 수축기 혈압 강하와 같은 혈압 강하;
ix. 염증성 장질환, 단장 증후군, 또는 크론병 또는 대장염과 같은 위장 질환; 소화불량 및/또는 위궤양; 및/또는 건선, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 및/또는 전신성 홍반 루푸스와 같은 염증의 예방 및/또는 치료;
x. 중환자, 중증 다발성 신병증(CIPNP) 환자, 및/또는 잠재적 CIPNP 환자의 치료와 같은 심각한 질환의 예방 및/또는 치료; 환자의 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)의 예방, 치료 및/또는 치유; 환자가 입원 중 박테리아 혈증, 패혈증 및/또는 패혈성 쇼크를 앓게 될 가능성의 예방 또는 감소; 및/또는 급성 질환을 앓고 있는 중환자실 환자에서 혈당, 인슐린 균형 및 임의로 대사의 안정화;
xi. 다낭성 난소 증후군(PCOS)의 예방 및/또는 치료;
xii. 뇌허혈, 뇌출혈 및/또는 외상성 뇌 손상과 같은 뇌질환의 예방 및/또는 치료;
xiii. 수면 무호흡증의 예방 및/또는 치료; 및/또는
xiv. 알코올 남용 및/또는 약물 남용과 같은 남용의 예방 및/또는 치료.
일부 구현예에서, 징후는 (i)~(xiv)로 이루어진 군, 예컨대 징후 (i)~(viii), (x)~(xiii), 및/또는 (xiv)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 또는 어떤 식으로든 당뇨병과 관련이 있다.
일부 구현예에서, 징후는 (i)~(iii) 및 (v)~(viii), 예컨대, 징후 (i), (ii), 및/또는 (iii); 또는 징후 (v), 징후 (vi), 징후 (vii), 및/또는 징후 (viii)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 징후는 (i)이다. 추가의 특정 구현예에서, 징후는 (v)이다. 추가의 또 다른 특정 구현예에서, 징후는 (viii)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 섭식 장애, 심혈관 질환, 위장 질환, 당뇨성 합병증 및/또는 다낭성 난소 증후군을 포함하는 모든 형태의 당뇨병 치료 및/또는 예방; 및/또는 지질 매개변수의 개선, β-세포 기능의 개선 및/또는 당뇨성 질환 진행의 지연 또는 예방에 사용될 수 있다.
다음의 징후가 특히 바람직하다: 제2형 당뇨병 및/또는 비만.
일부 구현예에서, 본 발명은 체중 관리 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 식욕 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 음식 섭취량 감소 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 비만으로 고통받는 모든 대상체는 또한 과체중으로 고통받는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 유도체 또는 유사체를 사용하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 비만으로 고통받는 대상체는 성인 인간 또는 (영아, 어린이, 및 청소년을 포함하는) 소아 인간과 같은 인간이다. 체질량 지수(BMI)는 키와 체중을 기준으로 한 체지방의 척도이다. 산출 공식은 BMI = 체중(kg)/신장(m)2이다. 비만으로 고통받는 인간 대상체는 30 이상의 BMI를 가질 수 있으며; 이러한 대상체는 비만으로도 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 비만으로 고통받는 인간 대상체는 35 이상의 BMI 또는 30 이상 내지 40 미만 범위의 BMI를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비만은 중증 비만 또는 병적 비만이며, 인간 대상체는 40 이상의 BMI를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 적어도 하나의 체중 관련 동반 질병의 존재 하에, 과체중의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 임의로 적어도 하나의 체중 관련 동반 질병의 존재 하에, 과체중의 치료 또는 예방을 위해 본 발명의 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 과체중으로 고통받는 대상체는 성인 인간 또는 (영아, 어린이, 및 청소년을 포함하는) 소아 인간과 같은 인간이다. 일부 구현예에서, 과체중으로 고통받는 인간 대상체는 25 이상의 BMI, 예컨대 27 이상의 BMI를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 과체중으로 고통받는 인간 대상체는 25 이상 내지 30 미만의 범위 또는 27 이상 내지 30 미만의 범위의 BMI를 갖는다. 일부 구현예에서, 체량-관련 동반 질병은 고혈압, (제2형 당뇨병과 같은) 당뇨병, 이상지질혈증, 고콜레스테롤, 및 폐색성 수면 무호흡증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 체중 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 체중 감소를 위해 본 발명의 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따라 체중 감소의 대상이 되는 인간은 25 이상의 BMI, 예컨대 27 이상의 BMI 또는 30 이상의 BMI를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 체중 감소의 대상이 되는 인간은 35 이상의 BMI 또는 40 이상의 BMI를 가질 수 있다. 용어 "체중 감소"는 비만 및/또는 과체중의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 당뇨병 및 심혈관 질환 또는 심혈관 질환의 위험의 치료 또는 예방에 있어서 본 발명에 따른 화합물의 사용하여, 하나의 약물로 2가지 질환 또는 장애를 해결하는 것에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 치료 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
투여될 투약량은 개별적으로 결정될 수 있고, 특정 약물 화합물 및 선택된 투약 처방에 따라 주당 50 mg 미만, 예컨대 주당 10~15 mg, 또는 월당 70~100 mg일 수 있다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 구현예는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해해야 한다.
구현예
1. GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물로서,
i. 상기 GLP-1 유사체는 서열번호 137에 의해 식별된 GLP-1(7-37)의 유사체이고,
ii. 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 의해 식별된 LDL-R(293-332)의 EGF(A) 도메인의 유사체인, 화합물.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 적어도 1개의 Lys 잔기를 갖는, 화합물.
3. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 적어도 2개의 Lys 잔기를 갖는, 화합물.
4. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 정확히 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 갖는, 화합물.
5. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 정확히 1개의 Lys 잔기를 갖는, 화합물.
6. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 정확히 2개의 Lys 잔기를 갖는, 화합물.
7. 구현예 1에 있어서, 상기 화합물은 융합 폴리펩티드를 포함하는, 화합물.
8. 구현예 7에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는, 화합물.
9. 구현예 8에 있어서, 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1 유사체의 C-말단 아미노산 잔기를 통해 EGF(A) 유사체에 융합되는, 화합물.
10. 구현예 8에 있어서, 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 GLP-1 유사체를 포함하고 C-말단에서 EGF(A) 유사체를 포함하는, 화합물.
11. 구현예 8에 있어서, EGF(A) 유사체는 EGF(A) 유사체의 C-말단 아미노산 잔기를 통해 GLP-1 유사체에 융합되는, 화합물.
12. 구현예 8에 있어서, 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 EGF(A) 유사체를 포함하고 C-말단에서 GLP-1 유사체를 포함하는, 화합물.
13. 구현예 7 내지 12중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 펩티드 스페이서를 포함하는, 화합물.
14. 구현예 13에 있어서, 펩티드 스페이서는 4~80개의 아미노산 잔기로 이루어지는, 화합물.
15. 구현예 14에 있어서, 펩티드 스페이서는 4~20개의 아미노산 잔기로 이루어지는, 화합물.
16. 구현예 14에 있어서, 펩티드 스페이서는 Lys 잔기를 포함하는, 화합물.
17. 구현예 14에 있어서, 펩티드 스페이서는 Lys 잔기를 포함하지 않는, 화합물.
18. 구현예 14에 있어서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115~126에 의해 식별된 펩티드 군으로부터 선택되는, 화합물.
19. 구현예 14에 있어서, 펩티드 스페이서는 서열번호 115~136에 의해 식별된 펩티드 군으로부터 선택되는, 화합물.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 GLP-1 수용체 작용제인, 화합물.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 1~50 pM, 10~100 pM, 50~100 pM, 100~250 pM 또는 250~1000 pM인 EC50을 갖는, 화합물.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 완전한 GLP-1 수용체 작용제인, 화합물.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 야생형 GLP-1과 비슷한 EC50을 갖는, 화합물.
24. 구현예 23에 있어서, GLP-1 유사체는 최대 50 pM의 EC50을 갖는, 화합물.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 세마글루타이드와 비슷한 EC50을 갖는, 화합물.
26. 구현예 25에 있어서, GLP-1 유사체는 5~15 pM의 EC50을 갖는, 화합물.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C1(1% HSA)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 최대 2500 pM인 EC50을 갖는, 화합물.
28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C1(1% HSA)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 적어도 500 pM인 EC50을 갖는, 화합물.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C7에 기술된 바와 같이 db/db 마우스에서 혈당을 감소시키는 능력을 갖는, 화합물.
30. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C7에 기술된 바와 같이 db/db 마우스에서 혈당을 감소시키는 능력을 가지고, EC50 AUC ΔBG24h는 15 nmol/kg 미만인, 화합물.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C7에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 체중을 감소시키는 능력을 갖는, 화합물.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 체중을 감소시키는 능력을 가지고, GLP-1 유사체는 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정할 때 베이스라인 BW의 적어도 95%까지 체중을 감소시킬 수 있는, 화합물.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 체중을 감소시키는 능력을 가지고, GLP-1 유사체는 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정할 때 베이스라인 BW의 적어도 90%까지 체중을 감소시킬 수 있는, 화합물.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 서열번호 137에 대해 적어도 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%, 예컨대 95% 동일한, 화합물.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 서열번호 137과 비교해 최대 6개의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물. 137.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 8A의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
37. 구현예 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 8A의 G 또는 W로의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 위치 8에서 비단백질원성 아미노산 잔기를 포함하는, 화합물.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 위치 8에서 비단백질원성 아미노산 잔기 Aib를 포함하는, 화합물.
40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 8A의 G, W, 또는 비단백질원성 아미노산 잔기 Aib로의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
41. 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 8Aib를 포함하는, 화합물.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 0, 1, 또는 2개의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K 및 36K.
44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 Lys 잔기 26K 및 34K를 포함하는, 화합물.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 26K 및 34K 중 하나 또는 둘 다의 치환 또는 결실을 치환을 포함하는, 화합물.
46. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 26K를 포함하지 않는, 화합물.
47. 구현예 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 26K의 결실을 포함하는, 화합물.
48. 구현예 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 26K의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 26R을 포함하는, 화합물.
50. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 추가의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K 및 36K.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 다음으로부터 선택된 정확히 1개의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물: 12K, 21K, 23K, 24K, 25K, 26K, 27K, 30K, 31K, 32K, 33K, 34K 및 36K.
53. 구현예 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 다음의 쌍으로부터 선택된 정확히 2개의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물:
a) 21K 및 26K
b) 23K 및 26K
c) 24K 및 26K
d) 25K 및 26K
e) 27K 및 26K
f) 30K 및 26K
g) 31K 및 26K
h) 32K 및 26K
i) 33K 및 26K
j) 34K 및 26K
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 34K를 포함하지 않는, 화합물.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 34K의 결실을 포함하는, 화합물.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 34K의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 34R 또는 34Q를 포함하는, 화합물.
58. 구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 아미노산 잔기 35~37, 34~37 또는 33~37의 결실을 포함하는, 화합물.
59. 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 33L을 포함하는, 화합물.
60. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 적어도 26개, 예컨대 적어도 27개 또는 적어도 28개의 아미노산 잔기를 포함하는, 화합물.
61. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 아미노산 잔기 21, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 31, 32 및 33 중 1개의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
62. 구현예 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 다음과 같이 정의된 서열을 갖는, 화합물: H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37(서열번호 187)(식 중,
X8은 A, G, W 또는 Aib이고,
X12는 F 또는 K이고,
X21은 E, G 또는 K이고,
X23은 Q, G 또는 K이고,
X24는 A, G, V 또는 K이고,
X25는 A, G, V 또는 K이고,
X26은 K 또는 R이고,
X27은 E, G 또는 K이고,
X29는 I, A 또는 V이고,
X30은 A, G 또는 K이고,
X31은 W, G 또는 K이고,
X32는 L, G, T, V, I 또는 K이고,
X33은 V, G, I, L, K이거나 부재하고,
X34는 K, R, Q이거나 부재하고,
X35는 G이거나 부재하고
X36은 R 또는 K이거나 부재하며,
X37은 G이거나 부재함)
63. 구현예 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 서열번호 138~186, 예컨대 139~146, 155~162, 164~173, 예컨대 서열번호 139~142, 155~162, 164~173, 예컨대 서열번호 139, 142, 155~162, 164~173, 예컨대 서열번호 139, 155~162, 164~173, 예컨대 155~162, 164~173, 또는 예컨대 서열번호 139 및 164에 의해 식별된 GLP-1 유사체의 군으로부터 선택되는, 화합물.
64. 구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 PCSK9 억제제인, 화합물.
65. 구현예 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 의해 식별된 LDR-R(293~332)의 EGF(A) 도메인과 비교해 인간 PCSK9에 대한 결합 친화도가 증가한, 화합물. 　
66. 구현예 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 섹션 C3에 기술된 바와 같이 PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석에서 측정했을 때, 50 nM 미만, 예컨대 25 nM 미만, 또는 예컨대 10 nM 미만의 Ki로 PCSK9에 결합하는, 화합물.
67. 구현예 1 내지 66 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 섹션 C3에 기술된 바와 같이 PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석에서 측정했을 때, 5 nM 미만의 Ki로 PCSK9에 결합하는, 화합물.
68. 구현예 1 내지 67 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 LDL 흡수를 증가시키는, 화합물.
69. 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 인간 PCSK9의 존재 하에 LDL 흡수를 증가시키는, 화합물.
70. 구현예 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 섹션 C4에 기술된 LDL 흡수 분석에서 측정했을 때, 1000 nM 미만의 EC50을 갖는, 화합물.
71. 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 섹션 C4에 기술된 LDL 흡수 분석에서 측정했을 때, 500 nM 미만의 EC50을 갖는, 화합물.
72. 구현예 1 내지 71 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 혈중 콜레스테롤을 감소시키는, 화합물.
73. 구현예 1 내지 72 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 섹션 C8에 기술된 바와 같이 평가했을 때, DIO 랫트에서 혈중 콜레스테롤을 감소시키는, 화합물.
74. 구현예 1 내지 73 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 30 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.5 mmol/L 감소시키는, 화합물.
75. 구현예 1 내지 74 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.8 mmol/L만큼 감소시키는, 화합물.
76. 구현예 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 예컨대 95% 동일한, 화합물. 　
77. 구현예 1 내지 76 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 서열번호 1과 비교해 1~15개의 아미노산 치환(들)을 포함하는, 화합물. 　
78. 구현예 1 내지 77 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 301L을 포함하는, 화합물.
79. 구현예 1 내지 78 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 301L 및 309R을 포함하는, 화합물.
80. 구현예 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 (야생형) 아미노산 잔기 295N(Asn), 296E(Glu), 298L(Leu), 302G(Gly) 및 310D(Asp) 중 하나 이상을 포함하는, 화합물.
81. 구현예 1 내지 80 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 임의의 K 잔기를 포함하지 않는, 화합물.
82. 구현예 1 내지 81 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 312K를 포함하지 않는, 화합물.
83. 구현예 1 내지 82 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 312E, 312D, 312Q 또는 312R을 포함하는, 화합물.
84. 구현예 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 301L, 309R을 포함하고, 312E와 같은 312K의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
85. 구현예 1 내지 84 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 301L, 310D를 포함하고, 312E와 같은 312K의 아미노산 치환을 포함하는, 화합물.
86. 구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 301L 및 310D를 포함하고, 펩티드는 299D의 G, V, 또는 H로의 치환을 갖지 않는, 화합물.
87. 구현예 1 내지 86 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 321D 또는 321E를 포함하는, 화합물.
88. 구현예 1 내지 87 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체는 301L, 309R, 312E 및 321E를 포함하는, 화합물.
89. 구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, EGF(A) 유사체 서열은 서열번호 19, 21, 73, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 및 114, 예컨대 107, 108, 109, 110 및 111, 예컨대 107 및 108 중 어느 하나에 의해 결정되는, 화합물.
90. 구현예 7 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 융합 폴리펩티드는 GLP-1 유사체, 스페이서 펩티드 및 EGF(A) 유사체를 포함하는, 화합물.
91. 구현예 90에 있어서, GLP-1 유사체는 구현예 20 내지 63 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은, 화합물.
92. 구현예 90 또는 91에 있어서, EGF(A) 유사체는 구현예 64 내지 89 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은, 화합물.
93. 구현예 90, 91 또는 92에 있어서, 스페이서 펩티드는 구현예 14 내지 19 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은, 화합물.
94. 구현예 90에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 188~384에 의해 식별된 서열 군으로부터 선택되는, 화합물.
95. 구현예 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 융합 폴리펩티드는 최대 2개의 리신 잔기를 포함하는, 화합물.
96. 구현예 1 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 최대 2개의 치환기를 포함하는, 화합물.
97. 구현예 1 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 최대 2개의 반기 연장 치환기를 포함하는, 화합물.
98. 구현예 1 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 펩티드 백본 이에 부착된 및 최대 2개의 치환기를 포함하는, 화합물.
99. 구현예 98에 있어서, 펩티드 백본은 구현예 7 내지 94 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 융합 펩티드인, 화합물.
100. 구현예 96 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치환기가 GLP-1 유사체, EGF(A) 유사체 및/또는 스페이서에 부착되는, 화합물.
101. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 GLP-1 유사체에 부착되는, 화합물.
102. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
103. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 스페이서에 부착되는, 화합물.
104. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 Lys/K 아미노산 잔기를 통해 부착되는, 화합물.
105. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 Lys/K 아미노산 잔기를 통해 GLP-1 유사체에 부착되는, 화합물.
106. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 Lys/K 아미노산 잔기를 통해 GLP-1 유사체에 부착되는, 화합물: 12K, 21K, 24K, 25K, 26K, 27K, 31K, 32K 및 36K.
107. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 26K를 통해 GLP-1 유사체에 부착되는, 화합물.
108. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
109. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 299Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 315Lys, 316Lys, 318Lys, 320Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 또는 333Lys를 통해 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
110. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 309Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 또는 333Lys를 통해 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
111. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 312Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys, 321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 또는 333Lys를 통해 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
112. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 292Lys, 293Lys, 294Lys, 300Lys, 303Lys, 305Lys, 306Lys, 311Lys, 313Lys, 314Lys, 316Lys, 318Lys,321Lys, 322Lys, 323Lys, 324Lys, 325Lys, 326Lys, 327Lys, 328Lys, 329Lys, 330Lys, 332Lys 또는 333Lys를 통해 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
113. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 313Lys, 321Lys, 324Lys, 328Lys 또는 333Lys를 통해 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
114. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 펩티드 스페이서에 부착되는, 화합물.
115. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 Lys 잔기를 통해 펩티드 스페이서에 부착되는, 화합물.
116. 구현예 100에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 Lys 잔기를 통해 펩티드 스페이서에 부착되고, 스페이서는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에서 Lys를 갖는 서열번호 116의 변이체인, 화합물.
117. 구현예 96-116 중 어느 하나에 있어서, 상기 화합물은 융합 펩티드에 부착된 정확히 2 개의 치환기를 포함하는, 화합물.
118. 구현예 117에 있어서, 하나의 치환기는 구현예 105~107에서 정의된 바와 같이 GLP-1 유사체를 통해 부착되고, 하나의 치환기는 구현예 115~116 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 스페이서에 부착되는, 화합물.
119. 구현예 117에 있어서, 하나의 치환기는 구현예 109~113 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 EGF(A) 유사체를 통해 부착되고, 하나의 치환기는 구현예 115~116 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 펩티드 스페이서에 부착되는, 화합물.
120. 구현예 117에 있어서, 하나의 치환기는 구현예 105~117 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 GLP-1 유사체를 통해 부착되고, 하나의 치환기는 구현예 109~113 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 EGF(A) 유사체에 부착되는, 화합물.
121. 구현예 117에 있어서, 2개의 치환기는 구현예 105~108 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 GLP-1 유사체를 통해 부착되는, 화합물.
122. 구현예 117에 있어서, 2개의 치환기는 실시예 109~113 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 EGF(A) 유사체를 통해 부착되는, 화합물.
123. 구현예 96 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 치환기(들)는 지방산기(AB)를 포함하는, 화합물.
124. 구현예 123에 있어서, 치환기(들)는 화학식 1 -C(=O)-(CH2)n-COOH(n은 8~20 범위의 정수임) 및 화학식 2 -HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-* (m은 8~11 범위의 정수임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산기를 포함하는, 화합물.
125. 구현예 123에 있어서, 치환기(들)는 이산-C(=O)-(CH2)n-COOH(n은 14~20임)로부터 선택된 지방산기를 포함하는, 화합물.
126. 구현예 123에 있어서, 치환기(들)는 이산(-HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*)(n은 8~11 범위의 정수임)로부터 선택된 지방산기를 포함하는, 화합물.
127. 구현예 123 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 적어도 하나의 링커 요소를 추가로 포함하는, 화합물.
128. 구현예 123 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 -Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-로서 지칭되는 최대 6개의 링커 요소를 추가로 포함하는, 화합물.
129. 구현예 123 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 -Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-로서 지칭되는 최대 6개의 링커 요소를 추가로 포함하고, Z1은 지방산기와 연결되고, 마지막 Z 요소는 펩티드 백본과 연결되는, 화합물.
130. 구현예 128 및 129 중 어느 하나에 있어서, -Z1은 *-NH-CH2-(C6H10)-CO-* 또는 결합인, 화합물.
131. 구현예 128 및 130 중 어느 하나에 있어서, -Z2-는 γGlu, Glu 또는 결합인, 화합물.
132. 구현예 128 및 130 중 어느 하나에 있어서, -Z2-는 γGlu인, 화합물.
133. 구현예 128 및 132 중 어느 하나에 있어서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 Glu, γGlu, 및 Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택되는, 화합물.
134. 구현예 128 및 132 중 어느 하나에 있어서, Z3, Z4, Z5 및 Z6은 γGlu, Ado 및 결합으로부터 서로 독립적으로 선택되는, 화합물.
135. 구현예 123 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 -γGlu-Ado-Ado-를 포함하는 링커를 포함하는, 화합물.
136. 구현예 123에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 치환기 #1~13, 예컨대 치환기 #1~4, #5~12, #6~12로부터 선택되거나, 치환기 #1, #5 및 #6로 이루어진 치환기 군으로부터 선택되는, 화합물.
137. 구현예 1 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 이기능성인, 화합물.
138. 구현예 1 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 GLP-1 수용체 작용제인, 화합물.
139. 구현예 137 또는 구현예 138에 있어서, 화합물은 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 1~50 pM, 10~100 pM, 50~100 pM, 100~250 pM 또는 250~1000 pM인 EC50을 갖는, 화합물.
140. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 완전한 GLP-1 수용체 작용제인, 화합물.
141. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 야생형 GLP-1과 비슷한 EC50을 갖는, 화합물.
142. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 최대 50 pM의 EC50을 갖는, 화합물.
143. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 세마글루타이드와 비슷한 EC50을 갖는, 화합물.
144. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C1(HSA 없음)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 5~15 pM의 EC50을 갖는, 화합물.
145. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C1(1% HSA)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 최대 2500 pM인 EC50을 갖는, 화합물.
146. 구현예 137 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C1(1% HSA)에 기술된 GLP-1 시험관 내 효능 분석에서 적어도 500 pM인 EC50을 갖는, 화합물.
147. 구현예 137 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C7에 기술된 바와 같이 db/db 마우스에서 혈당을 감소시키는 능력을 갖는, 화합물.
148. 구현예 137 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C7에 기술된 바와 같이 db/db 마우스에서 혈당을 감소시키는 능력을 가지고, EC50 AUC ΔBG24h는 15 nmol/kg 미만인, 화합물.
149. 구현예 137 내지 146 중 어느 하나에 있어서, GLP-1 유사체는 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 체중을 감소시키는 능력을 갖는, 화합물.
150. 구현예 137 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 체중을 감소시키는 능력을 가지고, GLP-1 유사체는 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정할 때 베이스라인 BW의 적어도 95%까지 체중을 감소시킬 수 있는, 화합물.
151. 구현예 137 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 체중을 감소시키는 능력을 가지고, GLP-1 유사체는 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정할 때 베이스라인 BW의 적어도 90%까지 체중을 감소시킬 수 있는, 화합물.
152. 구현예 1 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 PCSK9 억제제인, 화합물.
153. 구현예 137 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 서열번호 1에 의해 식별된 LDR-R(293~332)의 EGF(A) 도메인과 비교해 인간 PCSK9에 대한 결합 친화도가 증가한, 화합물. 　
154. 구현예 137 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 섹션 C3에 기술된 바와 같이 PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석에서 측정했을 때, 50 nM 미만, 예컨대 25 nM 미만, 또는 예컨대 10 nM 미만의 Ki로 PCSK9에 결합하는, 화합물.
155. 구현예 137 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 섹션 C3에 기술된 바와 같이 PCSK9-LDL-R 결합 경쟁 ELISA 분석에서 측정했을 때, 5 nM 미만의 Ki로 PCSK9에 결합하는, 화합물.
156. 구현예 137 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 LDL 흡수를 증가시키는, 화합물.
157. 구현예 137 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 인간 PCSK9의 존재 하에 LDL 흡수를 증가시키는, 화합물.
158. 구현예 137 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 섹션 C4에 기술된 LDL 흡수 분석에서 측정했을 때, 1000 nM 미만의 EC50을 갖는, 화합물.
159. 구현예 137 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 섹션 C4에 기술된 LDL 흡수 분석에서 측정했을 때, 500 nM 미만의 EC50을 갖는, 화합물.
160. 구현예 1 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 섹션 C8에 기술된 바와 같이 DIO 랫트에서 평가했을 때, 혈중 콜레스테롤을 감소시키는, 화합물.
161. 구현예 160에 있어서, 화합물은 30 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.5 mmol/L 감소시키는, 화합물.
162. 구현예 160에 있어서, 화합물은 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.8 mmol/L만큼 감소시키는, 화합물.
163. 구현예 1 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 이전 구현예 139~144 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 GLP-1 수용체 작용제이고 이전 구현예 153~159 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 PCSK9 억제제인, 화합물.
164. 구현예 160에 있어서, 화합물은 최대 5000, 예컨대 최대 4000, 예컨대 최대 3000, 예컨대 최대 2000, 또는 예컨대 최대 1000인 겉보기 EGF(A) Ki(C3) 및 GLP-1 효능(HSA 없이 C1)의 비율을 갖는, 화합물.
165. 구현예 160에 있어서, 화합물은 최대 1000, 예컨대 최대 800, 예컨대 최대 600, 예컨대 최대 400, 또는 예컨대 최대 200인 겉보기 EGF(A) Ki(C3) 및 GLP-1 효능(HSA 없이 C1)의 비율을 갖는, 화합물.
166. 구현예 160에 있어서, 화합물은 최대 200, 예컨대 최대 150, 예컨대 최대 100, 예컨대 최대 50, 25 및 10인 겉보기 EGF(A) Ki(C3) 및 GLP-1 효능(HSA 없이 C1)의 비율을 갖는, 화합물.
167. 구현예 137 내지 166 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 본원의 섹션 C8에 기술된 바와 같이 생체 내 랫트 연구에서 콜레스테롤과 체중을 GLP-1/EGF(A) 화합물 #41과 적어도 동등하게 감소시킬 수 있는, 화합물.
168. 구현예 167에 있어서, 화합물은 30 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.5 mmol/L 감소시킬 수 있는, 화합물.
169. 구현예 167에 있어서, 화합물은 30 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.6, 예컨대 0.7 또는 예컨대 0.8 mmol/L 감소시킬 수 있는, 화합물.
170. 구현예 167에 있어서, 화합물은 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 0.8 mmol/L 감소시킬 수 있는, 화합물.
171. 구현예 167에 있어서, 화합물은 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 혈중 콜레스테롤을 적어도 1.0, 또는 예컨대 1.2 mmol/L 감소시킬 수 있는, 화합물.
172. 구현예 167 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 베이스라인 BW의 적어도 95%까지 체중을 감소시킬 수 있는, 화합물.
173. 구현예 167 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 300 nmol/kg/일로 투여되는 경우, 투여 후 21일차에 측정했을 때 베이스라인 BW의 적어도 90%까지 체중을 감소시킬 수 있는, 화합물.
174. 구현예 1 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 화합물은 GLP-1/EGF(A) 화합물 #1 내지 #314로 정의된 화합물 군으로부터 선택되는, 화합물.
175. GLP-1 수용체 작용제 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물로서, 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 의해 식별된 LDL-R(293-332)의 EGF(A) 도메인의 유사체인, 화합물.
176. 구현예 175에 있어서, EGF(A) 유사체는 이전 구현예 64 내지 89 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은, 화합물.
177. GLP-1/EGF(A) 화합물 #1 내지 #305로 정의된 화합물 군으로부터 선택된 화합물.
178. GLP-1/EGF(A) 화합물 #1 내지 #314로 정의된 화합물 군으로부터 선택된 화합물.
179. GLP-1/EGF(A) 화합물 #1, 2, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 32, 41, 48, 51, 52, 53,54, 69, 82, 86, 221, 230, 287, 298 및 306으로 정의된 화합물 군으로부터 선택된 화합물.
180. GLP-1/EGF(A) 화합물 #1, 2, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 32, 48, 52, 53, 54, 69 및 306으로 정의된 화합물 군으로부터 선택된 화합물.
181. GLP-1/EGF(A) 화합물 #41, #48, #69 및 #306, 예컨대 #306 및 #69, 또는 #306 또는 #69로 정의된 화합물 군으로부터 선택된 화합물.
182. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 의약의 제조를 위한 화합물의 용도.
183. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 의약의 제조에 사용하기 위한, 화합물.
184. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 치료 방법에 사용하기 위한, 화합물.
185. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 당뇨병 및/또는 과체중의 치료 방법에 사용하기 위한, 화합물.
186. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 심혈관 질환 및/또는 심혈관 질환의 위험을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 화합물.
187. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 지질 파라미터를 개선하기 위한 치료 방법에 사용하기 위한, 화합물.
188. 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 있어서, 당뇨병 및 심혈관 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 화합물.
189. 당뇨병 및/또는 과체중의 치료 방법으로, 상기 방법은 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
190. 심혈관 질환 및/또는 심혈관 질환의 위험을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
191. 지질 파라미터를 개선하기 위한 치료 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
192. 당뇨병 및 심혈관 질환의 치료 방법으로, 상기 방법은 구현예 1 내지 181 중 어느 하나에 따른 화합물의 약학적 활성량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
방법 및 실시예
약어 목록
Aib: α-아미노이소부티르산 (2-아미노이소부티르산)
AcOH: 아세트산
Ado: 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산
API: 활성 약학 성분
AUC: 곡선 아래 면적
BG: 혈당
BHK: 아기 햄스터 신장
BW: 체중
Boc: t-부틸옥시카보닐
BSA: 소 혈청 알부민
Bzl: 벤질
CAS: 케미컬 애브스트랙트 서비스
Clt: 2-클로로트리틸
collidine: 2,4,6-트리메틸피리딘
DCM: 디클로로메탄
Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥시리덴)에틸
DesH: 데스-아미노 히스티딘 (이미다조프로피온산 또는 3-(이미다졸-5-일)프로판산), Imp)
DIC: 디이소프로필카보디이미드
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
DooaSuc: 8-아미노-3,6-디옥사옥틸 숙시남산
DTT: 1,4-디티오트레이톨
EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산
EGF: 표피 성장 인자-유사체
EGF(A): 표피 성장 인자-유사 도메인 A
EGTA: 에틸렌 글리콜 테트라아세트산
FCS: 소 태아 혈청
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카보닐
HATU: (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)
HBTU:(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄
헥사플루오로포스페이트)
HEPES: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산
HFIP: 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 또는 헥사플루오로이소프로판올
HOAt: 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
hPCSK9: 인간 PCSK9
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
HSA: 인간 혈청 알부민
IBMX: 3-이소부틸-1-메틸크산틴
IC50: 반치 억제 농도
Imp: 이미다조프로피온산 또는 3-(이미다졸-5-일)프로판산(데스-아미노 히스티딘(DesH)으로도 지칭됨)
Inp: 이소니페코트산
i.v. 정맥 내
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸
IVGTT: 정맥 내 포도당 내성 시험
LCMS: 액체 크로마토그래피 질량 분광법
LDL-R 또는 LDLr: LDL 수용체
LDL: 저밀도 지단백
LDL-C: LDL 콜레스테롤
LYD: 3원(랜드레이스 요크셔 두록) 교잡돈
MALDI-MS: MALDI-TOF MS 참조
MALDI-TOF MS: 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광학
MeOH: 메탄올
Nmt: 4-메톡시트리틸
MRT: 평균 체류 시간
Mtt: 4-메틸트리틸
NMP: N-메틸 피롤리돈
ND: 미 결정
OBz: 벤조일 에스테르
Ado: 8-아미노-3,6-디옥사옥타논산(Ado로 지침됨)
OPfp: 펜타플루오로페녹시
OPnp: 파라-니트로페녹시
OSu: O-숙신이미딜 에스테르(히드록시숙신이미드 에스테르)
OtBu: 터트 부틸 에스테르
Oxyma Pure®: 시아노-히드록시이미노-아세트산 에틸 에스테르
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐
PBS: 인산 완충 식염수
PD: 약력학
Pen/Strep: 페니실린/스트렙토마이신
PK: 약동학
QC: 품질 관리
RP: 역상
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
RT: 실온
Rt: 보유 시간
s.c.: 피하
SD: 표준 편차
SEC-HPLC: 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피
SEM: 평균의 표준 오차
SPA: 섬광 근접 분석
SPPS: 고상 펩티드 합성
tBu: 터트 부틸
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS 또는 TIPS: 트리이소프로필실란
Tos: 토실레이트(또는 파라-톨루엔설포닐)
TotaGlyc: 13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실 디글리콜아미드산
Tris: 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-
프로판-1,3-디올
Trt: 트리페닐메틸(트리틸)
Trx: 트라넥사민산
TtdSuc: 13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실 숙신산
UPLC: 초고성능 액체 크로마토그래피
특수 물질
에이코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르
도코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르
4-(10-카복시데실옥시) 벤조산 터트-부틸 에스테르
Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타논산
Fmoc-트라넥사민산
Fmoc-Lys(Mtt)-OH
Boc-His(Trt)-OH
Fmoc-Aib-OH
에이코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르, 도코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르, 및 4-(10-카복시데실옥시) 벤조산 터트-부틸 에스테르의 제조 방법은 아래 섹션 2에 기술되어 있으며, 마지막에 언급된 5가지 물질은 상업적으로 입수 가능하다.
방법
본 섹션은 다음의 3가지로 나누어져 있다: 섹션 A는 본 발명의 화합물의 일반적인 제조 방법에 관한 것이고; 섹션 B는 본 발명의 다수의 특정 화합물의 제조 방법에 관한 것이며; 섹션 C는 본 발명의 화합물의 특징 분석에 관한 것으로, 다수의 특정 예시적인 화합물에 대한 결과도 포함한다.
A1. 일반적인 제조 방법
본 섹션은 고상 펩티드 합성 방법(SPPS 방법으로서, 아미노산의 탈보호 방법, 수지로부터 펩티드를 절단하고 정제하는 방법을 포함함)뿐만 아니라 생성된 펩티드를 검출하고 특징을 분석하는 방법(LCMS 및 UPLC 방법)에 관한 것이다.
펩티드의 고상 합성은, 경우에 따라 산성 조건, 예컨대 2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질 또는 2,4,6-트리메톡시벤질(이들로 한정되지 않음) 하에서 절단될 수 있는 기를 갖는 디-펩티드 아미드 결합 상에서 보호된 디-펩티드를 사용함으로써 개선될 수 있다. 세린 또는 트레오닌이 펩티드에 존재하는 경우, 슈도프롤린 디-펩티드(예를 들어, Novabiochem으로부터 입수 가능함)를 사용할 수 있다(W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403 참조). 사용된 Fmoc-보호된 아미노산 유도체가 권장 표준이다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 또는 Fmoc-Val-OH 등(예를 들어, Anaspec, Bachem, Iris Biotech, 또는 Novabiochem에서 공급함). 다른 것들이 지정되지 않는 경우, 아미노산의 천연 L-형태가 사용된다. N-말단 아미노산은 알파 아미노기에서 Boc 보호된다(예: N-말단에 His를 갖는 펩티드의 경우, Boc-His(Boc)-OH, 또는 Boc-His(Trt)-OH). SPPS를 사용하는 모듈형 알부민 결합 모이어티 부착의 경우, Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥타논산, Fmoc-트라넥사민산, Fmoc-이소니페코트산, Fmoc-Glu-OtBu 및 헥사데칸산 모노-터트-부틸 에스테르와 같은, 그러나 이들로 한정되지 않는 적절하게 보호된 빌딩 블록(building block)이, 예를 들어 Anaspec, Bachem, Iris Biotech, 또는 Novabiochem으로부터 공급된다. 에이코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르, 도코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르 및 4-(10-카복시데실옥시) 벤조산 터트-부틸 에스테르는 아래에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 아래 언급된 모든 작업은 400-μmol 또는 450-μmol 합성 규모로 수행된다.
1. 수지 결합된 보호된 펩티드 하이드라지드의 합성
방법: SPPS_P
SPPS_P는 Protein Technologies(미국 아리조나주 투산 85714 소재)의 Prelude 또는 SymphonyX 고상 펩티드 합성기(Solid Phase Peptide Synthesizer)를 이용해 수지 첨가(예: 0.49 mmol/g의 Fmoc-하이드라조노-피루빌-아미노메틸폴리스티렌 수지(독일 마르크트레드비츠 95615 소재 Iris Biotech의 PYV1000))에 비해 5배 과량의 Fmoc-아미노산(300 mM Oxyma Pure®가 포함된 DMF 중 300 mM)을 사용해 400-μmol 또는 450-μmol 규모로 수행된다. Fmoc-탈보호는 DMF 중 20% 피페리딘 또는 0.1 M Oxyma Pure®가 포함된 DMF 중 20% 피페리딘을 사용해 수행된다. 결합은 DMF 중 아미노산/Oxyma Pure®/DIC/콜리딘을 5 : 5 : 5 : 5로 사용하여 수행된다. 탈보호 단계와 결합 단계 중간에 DMF 상부 세척(9 ml 6사이클)을 수행한다. 결합 시간은 일반적으로 120분이다. Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH 또는 Boc-His(Trt)-OH를 포함하되 이들로 한정되지 않는 일부 아미노산은 "이중 결합"되는데, 이는 첫 결합(예: 60분) 후 수지를 배출시키고 더 많은 시약(아미노산, Oxyma Pure®, DIC, 및 콜리딘)을 첨가하여, 혼합물을 다시 반응(예: 60분)시킨다는 것을 의미한다.
2. 수지 결합된 보호된 Cys-펩티드산의 합성
SPPS_P는 동일한 결합 절차를 사용하여 저 첨가량의 Fmoc-Glu(OtBu)-Wang(0.32 mmol/g) 수지을 사용해 전술한 바와 같이 수행된다.
3. 알부민 결합제의 합성
에이코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르는 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어 WO 2010102886 A1에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
에이코산디오익산 모노-터트-부틸 에스테르는 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어 WO2015000942 A1에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
4-(10-카복시데실옥시) 벤조산 터트-부틸 에스테르는 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어 WO2006082204 A1에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
4. 수지 결합된 보호된 펩티드 백본에 대한 측쇄의 부착
리신 측쇄 상에 아실화가 존재할 때, 아실화될 리신의 엡실론 아미노기는 Mtt로 보호된다. 헥사플루오로이소프로판올/DCM(75:25, 3 x 10 ml, 각각 5분, 25분 및 25분)을 사용해 Mtt를 제거한 다음, DCM(4x 10 ml), DMF(2x 9 ml), 0.1 M Oxyma Pure®가 포함된 DMF 중 20% 피페리딘(1x 9 ml), DMF(4x 9 ml)로 수지를 세척한다. 연장 모이어티 및/또는 링커는 수지 결합된 펩티드의 아실화에 의하거나 (WO2010029159 A1에 기술된 바와 같이) 비보호 펩티드 용액에서의 아실화에 의해 펩티드에 부착될 수 있다. 보호된 펩티드 수지에 연장 모이어티 및/또는 링커를 부착하는 경우, 부착은 SPPS 및 적절하게 보호된 빌딩 블록을 사용하는 모듈식일 수 있다.
방법: SC_P
N-ε리신 보호기를 전술한 바와 같이 제거하고, 전술한 바와 같이 적절하게 보호된 빌딩 블록을 사용해 Prelude 또는 SymphonyX 펩티드 합성기 상에서 하나 이상의 자동화 단계에 의해 리신의 화학적 변형을 수행한다. SPPS_P에 기술된 바와 같이 결합당 1시간의 이중 결합 또는 결합당 2시간의 단일 결합을 수행한다.
5. 부착된 측쇄의 유무와 상관없이, 수지 결합된 펩티드의 절단 및 정제
방법: CP_M1
합성 후 수지를 DCM으로 세척하고, TFA/TIS/물/DTT(92.5/2.5/2.5/2.5 또는 90/5/2.5/2.5)로 2~3시간 처리하여 펩티드를 수지로부터 절단한 후, 디에틸 에테르로 침전시킨다. 펩티드를 적절한 용매(예: 물/아세토니트릴)에 용해시키고 아세토니트릴/물/TFA를 사용해 C18, 5 μm 컬럼 상에서 표준 RP-HPLC로 정제한다. UPLC와 LCMS 방법을 조합하여 분획을 분석하고, 적절한 분획을 풀링하고 동결건조시킨다.
원하는 경우, 당업계에 알려진 방법을 사용해 펩티드 카운터 이온을 나트륨으로 교환할 수 있다. 예를 들자면, 5 g의 Sep-pak C18 컬럼을 50 ml의 2-프로판올, 50 ml 아세토니트릴 및 50 ml의 물로 세척한다. 21 ml 50 Mm HEPES-완충액(pH 7.2) 중 대략 70 mg의 단백질 용액을 Sep-pak 컬럼 상에 첨가하고, 50 ml의 물, 50 ml의 0.1 M 염화나트륨(aq) 및 50 ml의 물로 세척한다. 단백질의 나트륨 염을 100 ml의 물/아세토니트릴(30:70)로 용리시키고 동결 건조시킨다.
6. Cys-펩티드를 갖는 펩티드 하이드라지드의 천연 화학 결합 및 정제
방법: NCL_M1
펩티드 하이드라지드(1.0당량)를 4.0 mM의 최종 농도가 될 때까지 0.2 M 인산이나트륨/6.0 M 구아니딘 염산(aq, pH 3)에 용해시키고 -10℃까지 냉각시킨다. 아질산 나트륨(물 중 0.2 M, 5당량)을 첨가하고, 혼합물을 -10℃에서 20분 동안 교반한다. 0.2 M 인산이나트륨/6.0 M 구아니딘 염산(7.0으로 pH 조정됨) 중 0.2 M 4-메르캅토페닐아세트산(50당량)을 용액에 첨가한 다음, Cys-펩티드(1.1당량)를 첨가한다. 수산화나트륨(1.0 M, aq)으로 용액의 pH를 6.7까지 조정하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 교반한다. 1,4-디티오트레이톨(100당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 30분 동안 교반한 후, 농축 염산(aq)으로 pH를 3.0까지 조정한다. EMD Millipore(미국 매사추세츠 빌레리카 01821 소재)의 Ultracel-3 막이 구비된 Amicon Ultra-15 원심분리기 필터 유닛을 사용해, 한외 여과(ultrafiltration)에 의해 반응 혼합물을 농축시킨다. 농축된 용액을 0.05 M 인산이나트륨/6.0 M 구아니딘 염산(aq, pH 3.0)으로 희석하고, 한외 여과에 의해 다시 농축시킨다. 이러한 과정을 4-메르캅토페닐아세트산의 농도가 0.1 mM 미만(1000배 초과 희석에 상응함)이 될 때까지 반복한다. 농축된 용액을 50 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 5 mM 염화칼슘, 3 mM 시스테인, 0.3 mM 시스틴(aq, pH 8.2)의 교반 용액에 적가하여, 단백질 농도를 약 0.1 mg/ml로 만든다. 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반한다. 농축 염산(aq)으로 배수 혼합물의 pH를 약 3까지 조정한 후, 아세토니트릴/물/TFA를 사용해 C18, 5 μm 칼럼 상에서 표준 RP-HPLC에 의해 정제한다. UPLC와 LCMS 방법을 조합하여 분획을 분석하고, 적절한 분획을 풀링하고 동결건조시킨다.
7. 융합 단백질의 재조합 발현
관심 융합 단백질은 적절한 숙주를 사용하는 이종 발현에 의해 제공된다. 발현 플라스미드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 발현되고 정제된 융합 단백질 및 공지된 기술을 사용하여 작제된다. 요약하자면, 세포를 수확하고, 세포 파쇄기(cell disruptor)로 pH 7의 1X PBS 완충액에 용해시킨다. 융합 단백질을 함유하는 불용성 분획을 수집하여 동일한 완충액에서 2회 세척한다(6,000g/20분). 그런 다음, 20 mM 에탄올아민, 2 M 우레아, pH 10.5를 사용해 실온(22~26℃에서 10 mg/mL의 농도가 될 때까지 봉입체를 가용화시킨다. 1시간 후, 용액을 탈염수로 3회 희석하여 pH를 8.5까지 조정한다. 엔테로키나아제 절단을 1:1,000의 비율로 20시간 동안 동일한 온도에서 수행한다. 그 후, 재접힘(refolding)을 위해 최종 농도 10 mM의 CaCl2 및 5 mM의 시스테인을 첨가한다. pH를 3.0까지 조정한 후, SP 패스트 플로우 세파로스(fast flow sepharose)로 단백질을 포획한다. 포획한 샘플을 pH 7.5의 역상 FeF 컬럼 상에 적용한다. Source 30Q 컬럼(20 mM 트리스, 5 mM CaCl2, pH 9.0)을 최종 연마 단계로 선택한다.
8. 비단백질원성 아미노산의 재조합 단백질로의 혼입
N-말단 His-Aib 디펩티드는 Fmoc-His-Aib-OH를 사용해 아실화에 의해 용액에 도입할 수 있고, 이어서 (WO2013098191 A1에 기술된 바와 같이) Fmoc-보호기를 제거한다.
A2. 검출 및 특징 분석을 위한 일반적인 방법
1. LC-MS 방법
방법: LCMS01
LCMS01은 Micromass의 Waters Acquity UPLC 시스템 및 LCT Premier XE 질량 분석기로 구성된 환경에서 수행한다. 용리제: A: 물 중 0.1% 포름산; B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산. 적절한 볼륨의 샘플(바람직하게는 2~10 μl)을 컬럼 상에 주입하고 A와 B의 구배로 용리함으로써 실온에서 분석을 수행한다. UPLC 조건, 검출기 설정 및 질량 분석기 설정은 다음과 같다: 컬럼: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7 μm, 2.1 mm x 50 mm. 구배: 4.0분(대안적으로는 8.0분) 동안 5%~95% 아세토니트릴의 선형 구배, 0.4ml/분. 검출: 214 nm(TUV(Tunable UV 검출기)에서의 유사체 출력) MS 이온화 모드: API-ES. 스캔: 100~2000 amu(대안적으로는 500~2000 amu), 0.1 amu 단계.
방법: LCMS34
LCMS34는 Waters Acquity UPLC 시스템 및 Xevo G2-XS Qtof 질량 분석기로 구성된 환경에서 수행한다. 용리제: A: 물 중 0.1% 포름산; B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산. 적절한 볼륨의 샘플(바람직하게는 2~10 μl)을 컬럼 상에 주입하고 A와 B의 구배로 용리함으로써 실온에서 분석을 수행한다. UPLC 조건, 검출기 설정 및 질량 분석기 설정은 다음과 같다: 컬럼: Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7 μm, 2.1 mm x 50 mm. 구배: 4.0분(대안적으로는 8.0분) 동안 5%~95% 아세토니트릴의 선형 구배, 0.4ml/분. 검출: 214 nm(TUV(Tunable UV 검출기)에서의 유사체 출력) MS 이온화 모드: API-ES. 스캔: 100~2000 amu(대안적으로는 500~2000 amu), 0.1 amu 단계.
방법: LCMS27
LCMS27은 Agilent Jet Stream 소스 이온화가 구비된 Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230(G6230A) 검출기 및 Agilent 1290 Infinity 시리즈로 구성된 환경에서 수행한다. 용리제: A: 물 중 0.02% TFA; B: 아세토니트릴 중 0.02% TFA. 적절한 볼륨의 샘플(바람직하게는 2~10 μl)을 컬럼 상에 주입하고 A와 B의 구배로 용리함으로써 실온에서 분석을 수행한다. UPLC 조건, 검출기 설정 및 질량 분석기 설정은 다음과 같다: 컬럼: Aeris Widepore, C-18, 3.6 μm, 2.1 mm x 50 mm. 구배: 4.0분 동안 5%~95% 아세토니트릴의 선형 구배, 0.4 ml/분. 검출: 214 nm(TUV(Tunable UV 검출기)에서의 유사체 출력). 스캔: 100~3200 amu.
2. UPLC 방법
방법: UPLC01
RP-분석은 이중 밴드 검출기가 장착된 Waters UPLC 시스템을 사용해 수행한다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm x 150 mm 컬럼을 사용해 40℃에서 수집한다. UPLC 시스템은 다음을 함유하는 2개의 용리제 저장조에 연결된다: A: 99.95% H2O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 다음의 선형 구배가 사용된다: 16분에 걸쳐 0.40 ml/분의 유속으로 95% A, 5% B 내지 40% A, 60% B.
방법: UPLC02
RP-분석은 이중 밴드 검출기가 장착된 Waters UPLC 시스템을 사용해 수행한다. 214 nm 및 254 nm에서의 UV 검출은 ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130Å, 1.7 um, 2.1 mm x 150 mm 컬럼을 사용해 40℃에서 수집한다. UPLC 시스템은 다음을 함유하는 2개의 용리제 저장조에 연결된다: A: 99.95% H2O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 다음의 선형 구배가 사용된다: 16분에 걸쳐 0.40 ml/분의 유속으로 95% A, 5% B 내지 5% A, 95% B.
A3. 선택된 중간체의 특징 분석
펩티드 하이드라지드:
Figure pct00043
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #1 (HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)를 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L]EGF(A)(293-303) 하이드라지드.
제조 방법: SPPS_P; CP_M1
LCMS34: m/3 = 1970.3, m/4 = 1478.0, m/5 = 1182.6
UPLC02: Rt = 9.3분
Cys-펩티드:
Figure pct00044
[309R, 312E, 321E]EGF(A)(304-332)
제조 방법: SPPS_P; CP_M1
LCMS01: m/3 = 1119.8, m/4 = 840.1, m/5 = 672.3
UPLC02: Rt = 8.4분
B1. 특이적 화합물 - EGF(A) 유사체 및 유도체
EGF(A) 유사체 및 유도체(EGF(A) 화합물 1-159)의 요약표
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
B2. 특이적 화합물 - GLP-1/EGF(A) 화합물
전술한 바와 같이 화합물의 제조를 수행하였다. 화합물의 동일성은 본원의 다른 곳에서 제공된 바와 같이 각 요소의 아미노산 서열과, 1개 또는 2개의 치환기의 특이적 부착점을 참조하여 제공된다. 몇 가지 실시예가 아래에 보이고, 요약 표가 아래에 제공된다.
GLP-1/EGF(A) 화합물 # 1
Figure pct00054
이는 다음과 같이 기술될 수도 있다:
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 다음의 치환기 #1을 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)
Figure pct00055
또는
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #1 (HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)
또는
서열번호 193의 위치 20([8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K와 같음)에서 리신(K)(의 엡실론 질소)을 통해 부착된 치환기 #1을 갖는 서열번호 193.
GLP-1/EGF(A) 화합물 # 23
Figure pct00056
이는 다음과 같이 기술될 수도 있다:
치환기 #6을 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)
Figure pct00057
또는
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #6(HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)
또는
서열번호 193의 위치 20에서 리신(K)을 통해 부착된 치환기 #6을 갖는 서열번호 193.
GLP-1/EGF(A) 화합물 # 41
Figure pct00058
이는 다음과 같이 기술될 수도 있다:
[8Aib, 34R]GLP-1의 26K(의 엡실론 질소) 및 [301L, 309R, 312E, 321E, 333K]EGF(A)의 333K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 다음의 치환기 #1을 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)
Figure pct00059
또는
[8Aib, 34R]GLP-1의 26K(의 엡실론 질소) 및 [301L, 309R, 312E, 321E, 333K]EGF(A)의 333K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 [8Aib, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 321E, 333K]EGF(A)
또는
[8Aib, 34R]GLP-1의 26K(의 엡실론 질소) 및 [301L, 309R, 312E, 321E, 333K]EGF(A)의 333K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 서열번호 190
또는
위치 20 및 80에서 Lys를 통해 부착된 치환기 #1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 서열번호 190.
GLP-1/EGF(A) 화합물 # 42
Figure pct00060
이는 다음과 같이 기술될 수 있다:
[301L, 309R, 312E, 313K, 321K]EGF(A)의 313K 및 321K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 다음의 치환기 #13을 갖는 [8Aib, 26R, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 313K, 321K]EGF(A)
Figure pct00061
또는
[301L, 309R, 312E, 313K, 321K]EGF(A)의 313K 및 321K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #13(4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 [8Aib, 26R, 34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L, 309R, 312E, 313K, 321K]EGF(A)
또는
[301L, 309R, 312E, 313K, 321K]EGF(A)의 313K 및 321K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #13(4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 서열번호 380
또는
서열번호 380의 위치 60 및 68에서 Lys를 통해 부착된 치환기 #13을 갖는 서열번호 380.
GLP-1/EGF(A) 화합물 # 75
Figure pct00062
이는 다음과 같이 기술될 수도 있다:
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 다음의 치환기 #1을 갖는 [301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)-GQAPGQAP-[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)
[치환기 #1]
Figure pct00063
또는
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)를 갖는 [301L, 309R, 312E, 321E]EGF(A)-GQAPGQAP-[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)
또는
[8Aib, 34R]GLP-1(7-37)의 26K(의 엡실론 질소)를 통해 부착된 치환기 #1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)을 갖는 서열번호 386
또는
서열번호 386의 위치 68(7-37)에서 Lys를 통해 부착된 치환기 #1을 갖는 서열번호 386.
추가 화합물의 동일성은 본원의 다른 곳에서 제공된 바와 같이 각 요소의 아미노산 서열과, 1개 또는 2개의 치환기의 특이적 부착점을 참조하여 제공된다.
GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 유도체(GLP-1/EGF(A) 화합물)의 요약 표
치환기의 부착은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 참조하여 각각 표시된다. 전술한 바와 같이, 26K는 GLP-1(7-37) 서열에서의 위치 20과 같고, EGF(A) 유사체의 324K는 LDL-R(293-332) 유사체의 EGF(A) 도메인의 위치 32에서의 아미노 치환이다. 다른 부착 부위에 대한 특정 위치는 유사한 방식으로 추론될 수 있다. 펩티드 백본과 관련된 치환기(들)의 특정 위치(들)는 스페이서의 길이 및 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체의 가능한 절단들에 따라 달라질 것이다.
Figure pct00064
Figure pct00065
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화합물의 선택에 대한 분석 데이터가 아래 표에 제공된다.
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
C. 특징 분석을 위한 일반적인 방법
화합물을 특징을 분석하기 위해, 다양한 분석에서 기능성을 테스트할 수 있다.
C1 - GLP-1 시험관 내 효능
이 분석의 목적은 GLP-1 유사체를 포함하는 유도체와 같은 화합물의 GLP-1 활성(또는 효능)을 시험관 내에서 시험하기 위한 것이다. 시험관 내 효능은 전세포 분석에서 인간 GLP-1 수용체 활성화의 척도이다.
GLP-1/EGF(A) 화합물의 유도체의 효능을 후술하는 바와 같이 결정하였으며, 비교를 위해 GLP-1(7-37) 및 세마글루타이드에 대한 데이터를 포함시켰다.
원리
시험관 내 효능은 리포터 유전자 분석에서 인간 GLP-1 수용체의 반응을 측정하여 결정한다. 분석은 안정하게 형질감염된 BHK 세포주에서 수행하는데, 상기 세포주는 인간 GLP-1 수용체를 발현하고, 프로모터에 결합된 cAMP 반응 요소(CRE)에 대한 DNA 및 반딧불이 루시페라아제(CRE 루시페라아제)에 대한 유전자를 함유한다. 인간 GLP-1 수용체가 활성화되면 cAMP가 생성되며, 결과적으로는 루시페라아제 단백질이 발현된다. 분석 인큐베이션이 완료되면 루시페라아제 기질(루시페린)을 첨가하고, 효소는 루시페린을 옥실루시아린으로 전환시켜 생물발광을 생성한다. 발광은 분석에 대한 판독 값으로서 측정된다.
세포 배양 및 제조
본 검정에 사용된 세포(클론 FCW467-12A/KZ10-1)는 부모 세포주가 BHKTS13인 BHK 세포이다. 세포는 인간 GLP-1 수용체를 발현하는 클론(FCW467-12A)으로부터 유도되고, CRE 루시페라아제에 의한 추가 형질감염에 의해 확립되어 현재의 클론을 수득한다.
세포는 5% CO2 하에 세포 배양 배지에서 배양한다. 이들을 분취하여 액체 질소 중에 저장된다. 각각의 분석 전에, 분취물을 취하여 PBS에서 2회 세척한 후 분석 특이적 완충액에서 원하는 농도로 현탁시킨다. 96-웰 플레이트의 경우, 최종 농도가 웰당 5x103개의 세포가 되도록 현탁액을 만든다.
물질
다음의 화학 물질이 분석에 사용된다: Pluronic F-68(10%)(Gibco 2404), 인간 혈청 알부민(HSA)(Sigma A9511), 오브알부민(Sigma A5503), 페놀 레드가 없는 DMEM(Gibco 11880-028), 1 M Hepes(Gibco 15630), Glutamax 100x (Gibco 35050) 및 steadylite plus (PerkinElmer 6016757).
완충액
세포 배양 배지는 10% FBS(소 태아 혈청; Invitrogen 16140-071), 1 mg/ml G418(Invitrogen 15140-122), 240 nM MTX(메토트렉세이트; Sigma M9929) 및 1% pen/strep(페니실린/스트렙토마이신; Invitrogen 15140-122)이 포함된 DMEM 배지이다.
분석 매질은 페놀 레드가 없는 DMEM, 10 mM Hepes 및 1x Glutamax이다. 분석 완충액은 분석 매질 중 2% 오브알부민 및 0.2% Pluronic F-68로 구성하였다.
절차
1) 세포 모액을 37℃수조에서 해동한다.
2) 세포를 PBS에서 3회 세척한다.
3) 분석 매질 중에서 세포를 계수하여 5x103세포/50 μl(1x105세포/ml)까지 조정한다. 50 μl의 세포 분취물을 분석 플레이트 내의 각 웰에 옮긴다.
4) 분석 완충액 중에서 시험 화합물 및 기준 화합물의 모액을 0.2 μM의 농도까지 희석시킨다. 화합물을 10배로 희석하여 다음의 농도를 얻는다: 2x10-7 M, 2x10-8 M; 2x10-9 M, 2x10-10 M, 2x10-11 M, 2x10-12 M, 2x10-13 M, 및 2x10-14 M.
5) 50 μl 화합물 분취물 또는 블랭크를 희석 플레이트에서 분석 플레이트로 옮긴다. 다음의 최종 농도에서 화합물을 시험한다: 1x10-7 M, 1x10-8 M; 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 및 1x10-14 M.
6) 분석 플레이트를 5% CO2하에 37℃의 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
7) 분석 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내고, 15분 동안 실온에 방치한다.
8) 100 μl의 Steadylite Plus 시약을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가한다(시약은 빛에 민감함).
9) 각 분석 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단하고, 실온에서 30분 동안 진탕한다.
10) 각 분석 플레이트를 Packard ToPcount NXT 기기에서 판독한다.
계산 및 결과
전술한 바와 같은 시험관 내 효능 분석은 HSA의 포함 여부와 상관없이 일련의 화합물을 이용해 수행하였다. TopCount 기기의 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어로 전송한다. 소프트웨어는 비선형 회귀(로그(작용제) 대 반응)를 수행한다. 소프트웨어에 의해 계산되어 pM 단위로 보고된 EC50 값은 아래 표 1에 나타나 있다.
각 샘플에 대해 최소 2회의 반복 값을 측정하였다. 보고된 값은 반복 값의 평균이다.
[표 1]
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
GLP-1/EGF(A) 화합물의 대부분은 GLP-1 활성을 나타낸다. (HSA가 있거나 없는 모든 경우의) 특이적 효능은 유사체 내의 아미노산 변이 및 스페이서를 비롯한 치환기의 동일성에 의해 영향을 받는다. 위의 데이터는 GLP-1(7-37) 및 세마글루타이드와 유사하거나 이들에 비해 감소된 효능을 갖는 화합물을 수득할 수 있음을 입증한다.
또한, EGF(A) 유사체가 GLP-1 유사체의 C-말단에 부착(화합물 1, 서열번호 193)되는 대신, GLP-1 유사체의 N-말단에 부착(화합물 75, 서열번호 386)될 때 GLP-1 효능의 상당한 손실이 관찰된다.
C2 - GLP-1 - 시험관 내 수용체 결합
본 실시예의 목적은 GLP-1 유도체의 수용체 결합을 시험관 내에서 시험하기 위한 것이다. 수용체 결합은 인간 GLP-1 수용체에 대한 유도체의 친화도의 척도이다.
원리
인간 GLP-1 수용체에 대한 수용체 결합은 경쟁적 결합 분석에서 측정된다. 이러한 유형의 분석에서는, 표지된 리간드(이 경우 125I-GLP-1)가 수용체에 결합된다. 각각의 유도체/화합물을 인간 GLP-1 수용체를 함유하는 단리된 막에 일련의 농도로 첨가하고, 표지된 리간드의 변위를 모니터링한다. 수용체 결합은 표지된 리간드의 절반이 수용체로부터 변위되는 농도인 IC50 값으로서 보고된다. GLP-1 (7-37)과 세마글루타이드를 비교 화합물로서 포함한다.
물질
다음의 화학 물질이 분석에 사용된다: 인간 혈청 알부민(HSA)(Sigma A1653), 페놀 레드가 없는 DMEM(Gibco 11880-028), Pen/strep(Invitrogen 15140-122), G418(Invitrogen 10131-027), 1 M Hepes(Gibco 15630), EDTA(Invitrogen 15575-038), PBS(Invitrogen 14190-094), 소 태아혈청(Invitrogen 16140-071), EGTA, MgCl2(Merck 1.05832.1000), Tween 20(Amresco 0850C335), SPA 입자(맥 배아 응집소(WGA) SPA 비드, Perkin Elmer RPNQ0001), [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(자체 생산), OptiPlateTM-96(Packard 6005290).
완충액 1은 20 mM Na-HEPES + 10 mM EDTA로 이루어지고 pH는 7.4로 조정한다. 완충액 2는 20 mM Na-HEPES + 0.1 mM EDTA로 이루어지고 pH는 7.4로 조정한다. 분석 완충액은 5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 0.005% Tween 20으로 보충되고, pH가 7.4로 조정된 50 mM HEPES로 이루어진다. 8% 알부민 모액은 분석 완충액 중 8%(w/v)로 용해된 HSA로 이루어진다. 0.02% 알부민 모액은 분석 완충액 중 0.02%(w/v)로 용해된 HSA로 이루어진다.
세포 배양 및 막 제조
본 분석에 사용된 세포(클론 FCW467-12A)는 부모 세포주가 BHKTS13인 BHK 세포이다. 세포는 인간 GLP-1 수용체를 발현한다.
세포를 5% CO2 하에 DMEM, 10% 소 태아 혈청, 1% Pen/Strep(페니실린/스트렙토마이신) 및 1.0 mg/ml의 선택 표지 G418에서 성장시킨다. 막을 제조하기 위해, 세포를 대략 80%의 컨플루언스(confluence)까지 성장시킨다. 세포를 인산염 완충 식염수 내에서 2회 세척하고 수확한다. 간단한 원심분리(brief centrifugation)를 사용해 세포를 펠릿화하고 세포 펠릿을 얼음에 보관한다. 적절한 양의 완충액 1(예: 10 ml) 중에서 ULTRA-THURRAX? 분산 기기로 세포 펠릿을 20~30초 동안 균질화시킨다. 균질물을 15분 동안 원심분리한다. 펠릿을 10 ml의 완충액 2에 재현탁하고(균질화시켜) 원심분리한다. 이 단계는 한번 반복된다. 생성된 펠릿을 완충액 2에 재현탁하고 단백질 농도를 결정한다. 막을 분취하여 영하 80℃에서 보관한다.
절차
1) 수용체 결합 분석의 경우, 낮은 HSA의 존재(0.005%) 하에 50 μl의 분석 완충액을 분석 플레이트의 각 웰에 첨가한다.
2) 시험 화합물을 연속 희석하여 다음 농도를 얻는다: 8x10-7 M, 8x10-8 M, 8x10-9 M, 8x10-10 M, 8x10-11 M, 8x10-12 M 및 8x10-13 M. 25 μl를 분석 플레이트에서 적절한 웰에 첨가한다.
3) 세포막 분취물을 해동하고, 이들의 작동 농도까지 희석시킨다. 50 μl를 분석 플레이트에서 각 웰에 첨가한다.
4) WGA SPA 비드를 20 mg/ml의 분석 완충액 중에 현탁시킨다. 현탁액을 분석 완충액 중에서 10 mg/ml까지 희석한 직후 분석 플레이트에 첨가한다. 50 μl를 분석 플레이트에서 각 웰에 첨가한다.
5) [125I]-GLP-1]-(7-36)NH2의 480 pM 용액 25 μl를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가함으로써 인큐베이션이 시작된다. 웰당 총 계수를 측정하기 위해 25μl 분취물을 따로 두었다.
6) 분석 플레이트를 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
7) 분석 플레이트를 10분 동안 원심분리한다.
8) 분석 플레이트를 Packard ToPcount NXT 기기에서 판독한다.
계산
TopCount 기기의 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어로 전송한다. 소프트웨어로 비선형 회귀를 수행하였다. IC50 값을 소프트웨어에 의해 계산하여 nM 단위로 보고한다.
결과
다음의 결과를 얻었다:
[표 2]
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
위의 데이터는 GLP-1 결합인 특이적 서열 및 치환기에 따라 달라지며, GLP-1 (7-37) 또는 세마글루타이드와 비슷하거나 이들에 비해 감소된 수용체 결합을 갖는 화합물을 제조하기 위해 다양한 수준의 GLP-1 결합 활성을 얻을 수 있음을 입증한다. 또한, EGF(A) 유사체가 GLP-1 유사체의 C-말단에 부착(화합물 1, 서열번호 193)되는 대신, GLP-1 유사체의 N-말단에 부착(화합물 75, 서열번호 386)되었을 때 GLP-1 결합의 상당한 손실이 관찰되었다.
C3 - PCSK9-LDL-R 결합 경쟁(ELISA)
본 분석은 LDL-R과 경쟁하여 PCSK9에 대한 겉보기 결합 친화도를 측정한다. 특히, 분석은 PCSK9에 대한 EGF(A) 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물, 예컨대 GLP-1/EGF(A) 화합물의 겉보기 결합 친화도를 평가하는 데 사용된다.
분석은 다음과 같이 수행된다. 실험 전날, 재조합 인간 저밀도 지단백 수용체(rhLDL-R; NSO-유래; R & D 시스템 # 2148-LD)를 50 mM 탄산나트륨, pH 9.6에 1 μg/ml로 용해시킨 다음, 용액 100 μl를 분석 플레이트(Maxisorp 96, NUNC # 439454)의 각 웰에 첨가하여 4℃에서 밤새 코팅한다. 실험 당일, 비오탄화된 PCSK9(0.5 ug/ml, BioSite/BPSBioscience cat#71304)를 함유하는 EGF(A) 화합물의 8점 농도 곡선을 이중으로 만들었다. 시험 화합물과 비오틴화된 PCSK9의 혼합물을 제조하여 25 mM Hepes, pH 7.2(15630-056, 100 ml, 1M), 150 mM NaCl (Emsure 1.06404.1000), 1% HSA (Sigma A1887-25G), 0.05% Tween 20(Calbiochem 655205), 2 mM CaCl2(Sigma 223506-500G)를 함유하는 분석 완충액 중에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그런 다음, 코팅된 분석 플레이트를 200 μl 분석 완충액 중에서 4회 세척한 다음, 시험 화합물과 비오틴화된 PCSK9의 혼합물 100 μl를 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 200 μl 분석 완충액 중에서 4회 세척한 다음, 스트렙트에바딘-HRP(25 ng/ml; VWR # 14-30-00)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 50 μl TMB-on(KEM-EN-TEC)을 첨가하여 반응을 검출하고, 암소에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, 50 μl 4 M H3PO4를 전자 다중 피펫팅에 의해 혼합물에 첨가하여 반응을 중단시킨다. 그런 다음, 1시간 이내에 Spectramax 중에서 450 및 620 nm에서 플레이트를 판독한다. 620 nm에서의 판독은 백그라운드를 빼는 데 사용한다. IC50 값을 비선형 회귀 로그(억제제) 대 반응-변수 기울기(4개의 파라미터)에 의해 Graphpad Prism을 사용해 계산하고, 다음의 식을 사용해 Ki 값으로 변환한다: Ki=IC50/(1+(비오틴-PCSK9)/(kd(비오틴-PCSK9))), (식 중, 비오틴-PCSK9의 Kd는 1.096727714 μg/ml이고, [비오틴-PCSK9] = 0.5 μg/ml임).
결과를 아래의 표 3.1 내지 3.6에 나타냈다. Ki 값이 높을수록 PCSK9에 대한 겉보기 결합 친화성이 낮아짐을 반영하며, 그 반대도 동일하다. 관찰된 결합이 특이지 않음을 나타내는, EGF66에 대해 측정한 값보다 실질적으로 더 높은 Ki(예: 500 nM를 초과하는 값)를 나타내는 화합물은 거의 없음을 알 수 있다. 펩티드의 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 측쇄 유도 둘 다는 LDL-R에 대한 결합 상실에 기여할 수 있다. 일반적으로, 시험된 많은 EGF(A) 화합물이 PCSK9가 hLDL-R에 결합하는 것을 억제하는 능력을 나타냈다.
PCSK9 억제제
처음에, 다양한 아미노산 치환을 포함하는 EGF(A) 유사체의 군을 전술한 바와 같이 시험하였으며, 그 결과는 표 3.1에 나타나 있다.
[표 3.1]
Figure pct00101
WO 2012177741에서 가장 강력한 펩티드 변이체로서 확인된 EGF66(EGF(A) 화합물 #48)은 5개의 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이의 몇 개는 C3에 기술된 분석에서 결정된 Ki 값에 그렇게 중요하지 않다는 것이 밝혀졌다. 특히, 위치 310에서 야생형 잔기 Asp(D)를 포함하는 화합물은 310K를 갖는 화합물보다 높은 효능이 있음이 밝혀졌다. 주된 아미노 치환은 바람직하게는 309R과 조합된 301L이라는 것도 밝혀졌다. 마지막으로, 307I 및 299A는 EGF(A) 유사체의 친화도에 적당한 정도로만 기여하였다.
치환기의 N-말단 부착
후속 실험에서, 반감기 연장제(예: 펩티드에 대한 치환기)의 부착이 C3에 기술된 분석에 의해 결정했을 때 Ki에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 본원에 기술된 바와 같이, 치환기는 상이한 기술에 의해 부착될 수 있고, 치환기는 초기에 아실화 또는 알킬화에 의해 펩티드의 N-말단 아미노산의 질소 원자에 부착하였다.
표 3.2에서 알 수 있듯이, 시험된 모든 화합물은 3.0 nM 미만의 Ki 값을 갖는데, 이는 다양한 연장제 및 링커 요소의 내성이 양호함을 시사한다. 이는 이례적인 것이었는데, GLP-1과 같은 펩티드에 대해 이전에 관찰된 바와 같이, 일반적으로 효능은 측쇄의 부착에 의해 부정적인 영향을 받기 때문이다.
[표3.2]
Figure pct00102
치환기의 Lys 부착PCSK9 억제제 펩티드에 치환기를 연결하기 위한 대안적인 위치를 평가하기 위해 일련의 화합물을 제조하였다. 3개의 아미노산 치환(N301L, N309R 및 K312E)를 포함하는 백본 펩티드를 다양한 위치에서 Lys 치환과 조합하여 사용하였으며, EGF(A) 화합물 # 58, 29 및 4는 이에서 제외하였다. 시험된 모든 화합물에 6개의 시스테인 아미노산을 위치 297, 304, 308, 317, 319, 331에 포함시켰는데, 이들은 일반적으로 시스테인 이황화 브리지에 관여한다. 야생형 312K에 대한 부착이 확보되는 EGF(A) 화합물 # 4를 제외하고는 부위 특이적 치환을 보장하기 위해 312E를 포함시켰다. 하나의 Lys로 펩티드를 연장하는 것을 또한 시험한다(EGF(A) 화합물 75 및 3). C18 이산 연장기 및 γGlu-2xAdo 링커를 포함하는, 전술한 바와 같은 동일한 치환기를 모든 화합물에 사용하고 아실화를 통해 부착하였다. 그 결과가 표 3.3에 포함된다.
[표3.3]
Figure pct00103
Figure pct00104
이 분석은 PCSK9 억제제 펩티드의 대부분이 기능성을 유지함을 보여주었다. 예외는 위치 298, 301, 302 및 307 중 어느 하나에서의 Lys 치환과 유도체였으며, 이들은 비기능성 펩티드를 생성하였다. 위치 296, 299, 315 및 320K에서 Lys 도입 및 치환이 겉보기 친화도를 감소시킨 것도 관찰되었다.
따라서 데이터는 표 3.1의 결과를 확인하는 것이며, 이는 Asn(N) 301의 Leu(L)로의 아미노산 치환이 결합에 필수적임을 시사한다.
위치 295 및 310에서는 Lys 도입 및 치환에 대해 데이터가 관찰되지 않았다. 전술한 바와 같이, Asp를 310에 유지하는 것이 310K 치환보다 바람직했다는 것은 이전에 밝혀졌다. 아래에서 알 수 있는 바와 같이, Asp(D)를 위치 295(EGF(A) 예시적 화합물 70)에 도입함으로써 결합이 폐쇄된다는 것도 밝혀졌다.
요약하면, PCSK9 펩티드의 위치 295, 298, 302, 307 및 310 중 어느 하나 또는 위치 295, 296, 298, 299, 302, 307, 310, 315 및 320 중 어느 하나에서 부착된 치환기를 포함하지 않는 화합물은 일반적으로 기능성인 것으로 결론을 내렸다. 위치 295, 298, 302, 및 310 중 어느 하나에서의 아미노산 치환은 일반적으로 매력적이지 않은 것으로 추가로 결론을 내렸다. 표 3.1과 3.2에서 알 수 있는 바와 같이, V307I 돌연변이는 그럼에도 불구하고 허용 가능한 것처럼 보이거나 301Leu와 조합하면 심지어 매력적인 것처럼 보인다.
추가로, 위치 295, 296, 298, 302, 310 중 하나에서 아미노산 치환을 갖는 펩티드는 낮은 기능성을 가질 가능성이 있는 반면, 299, 315 및 320에서의 치환은 기능성을 약간만 낮추는 것으로 간주된다. 한 편, 이는 또한, Lys 치환과 측쇄의 부착이 대부분의 다른 아미노산 치환이 펩티드에 영향을 미치는 만큼 펩티드에 영향을 미칠 것이므로, 나머지 아미노산 잔기에 대해 높은 유연성이 존재할 수 있음을 시사한다.
2개의 치환기를 갖는 PCSK9 억제제
2개의 치환기를 갖는 일련의 화합물을 제조하였다. 이중 치환은 아실화, 알킬화 또는 N-말단이나 Lys(K) 잔기에서 이들의 조합에 의해 얻을 수 있다. 다시, N-말단은 아미노산 293G이거나, 292A, 293G, 293K 및 294T와 같은 변이체 아미노산 잔기일 수 있다(293G가 결실된 경우). 개별 화합물 상의 2개의 치환기가 동일하더라도, 화합물은 상이한 치환기로 제조하였다. 본 연구에 사용된 백본은, 특정 아실화/알킬화를 얻기 위해 필요한 다양한 N-말단 및/또는 Lys 치환 및 N309R과 조합하여 N301L 아미노산 치환에 다시 포함시켰다.
[표3.4]
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
다시, 발명자들은 치환기가 다양한 위치 및 조합에서 더 좋은 내성을 갖는다는 결론을 내렸다.
추가 EGF(A) 유도체
EGF(A) 서열에서 다양한 아미노산 치환의 역할을 추가로 탐색하기 위해, 표
3.5에 보이는 바와 같은 추가의 화합물을 제조하고 시험하였다. 모든 화합물은 하나의 치환기를 포함하는데, 이는 333K와의 아미노산 치환 또는 연장에 의해 도입된 Lys 잔기를 통해 부착된다. 백본 펩티드는 모두 N301L 아미노산 치환을 포함하고 임의로 N309R 및 I312E 중 하나 이상을 포함한다. 치환기는 모두 16~20개의 탄소 원자 및 링커를 포함하는 지방이산(fatty diacid)을 포함하되, 링커는 γGlu 한 가지이거나 Ado-Ado 및/또는 트라넥사믹산(Trx) 모이어티로 연장된 것일 수 있다.
[표 3.5]
Figure pct00108
Figure pct00109
위의 표 3.5에서의 결과는, 위치 312에서 내부 야생형 리신이 Glu(E)뿐만 아니라 Gln(Q), Arg(R) 또는 Asp(D)로도 치환될 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 변수에 기초하면, 광범위한 아미노산 잔기가 펩티드의 억제 기능을 방해하지 않고 위치 312에서 내성을 가지게 될 것으로 여겨진다.
G293N, T294G, D299A, N300H, H306Y, H306D, N309S, Q324G 및 R329H를 포함하여, 여러 개의 다른 아미노산 치환도 내성이 좋은 것으로 입증되었지만, 전술한 바와 같이, N295D 및 N300P는 매력적인 아미노산 치환이 아니다.
GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물의 PCSK9 결합
PCSK9 결합 기능을 GLP-1 수용체 작용제 활성과 조합할 수 있는지 여부를 더 자세히 알아보기 위해, GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물을 동일한 분석에서 시험하여 그 결과를 아래 표 3.6에 포함시켰다.
[표 3.6]
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
데이터는 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물이, 화합물의 EGF(A) 유사체와 연관된 PCSK9 결합 활성을 유지함을 보여준다. 또한 데이터는, 매우 적은 변화만이 존재하고, GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체의 배향이 PCSK9 결합에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
C4 - HepG2 세포에서의 LDL 흡수 분석
PCSK9 펩티드 및 이의 유도체의 억제 효능을 결정하기 위한 대안적인 분석법은 HepG2 세포에서 LDL의 흡수를 측정하는 것이다.
분석 원리: LDL 흡수는 주로 내인성으로 발현된 hLDLR에 의해 매개되고, 따라서 LDL 흡수 능력은 LDLR 발현의 간접적인 척도이다. hLDLR은 외인성 PCSK9와 함께 용량 의존적 방식으로 인큐베이션함으로써 하향 조절될 수 있다. 따라서, PCSK9 인큐베이션은 LDL 분자를 흡수하는 세포의 능력을 감소시키게 된다. 이 경우, PCSK9/LDLR 결합을 중화시키거나 억제하는 화합물을 첨가함으로써 LDL 흡수의 이러한 하향 조절을 길항시킬 수 있다. 결과적으로, PCSK9 억제제는 PCSK9의 존재 하에 LDL 흡수를 증가시키고, 예를 들어, PCSK9 매개 hLDLR 하향 조절에 대항하는 이들의 능력에 기초하여 특징을 분석할 수 있다.
10% 지단백 결핍 소 태아 혈청(Sigma Aldrich #S5394)에서 성장시킨 HepG2 세포(Sigma Aldrich ECACC: 수탁번호 85011430)를 사용하여 분석을 수행하고, BODIPY 형광 표지된 LDL 입자(Life technologies Europe BV #L3483)를 흡수하는 세포의 능력을 측정한다.
분석 프로토콜: 96 웰 플레이트(Perkin Elmer, ViewPlate-96 Black #60005182)를 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 폴리-D-리신(PBS에 용해된 10 mg/L, Sigma Aldrich #P6407 Gibco #14190-094)으로 코팅한다. 그런 다음, 플레이트를 100 μl PBS(Gibco #14190-094)에서 2회 세척한다. EGF(A) 화합물의 8점 농도 곡선을 위한 시험 조성물은 모두 분석 배지(DMEM(Gibco #31966-021), 10% 지단백 결핍 소 태아 혈청(Sigma Aldrich #S5394) 및 1% Pen Strep(Cambrex #DE17-602E)에서 희석된 PCSK9(10 ug/ml)를 함유하도록 제조하고, 50ul/웰의 부피로 플레이트 상에 첨가한다.
30~60분 후 분석 배지에서 희석시킨 50.000 HepG2 세포(Sigma-Aldrich: ECACC: Atcc no. 85011430 lot: 13B023)를 50 μl/웰의 부피로 첨가하고, CO2 투과성 플라스틱 백(Antalis Team, LDPE 백 120/35x300x0,025 mm #281604)에 플레이트를 담아 20시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2). 이제부터, 플레이트를 비운 직후, 분석 배지 중 10 μg/ml의 농도로 50 μl의 FL-LDL(Life technologies Europe BV #L3483)을 각 웰에 첨가하고, 빛을 차단하기 위해 검정 덮개를 씌운 CO2 투과성 플라스틱 백에 플레이트를 담아 2시간 동안(37℃, 5% CO2) 인큐베이션한다. 플레이트를 비우고 100 μl의 PBS(Gibco #14190-094)로 2회 세척한다. 그런 다음, 100 μl의 PBS(Gibco #14190-094)를 첨가한 후 15분 이내에, SpecktrAmax M4(Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies) 상에서 다음 필터들 Ex(515 nm)/Em(520 nm)을 사용해 플레이트를 판독한다(바닥 판독). EC50 값은 GraphPad Prism, 비선형 회귀 곡선 피팅, S자형 투여량-반응(가변 기울기)을 사용해 계산한다.
결과
HepG2 세포에서의 LDL 흡수는 일련의 화합물에 대해 전술한 바와 같이 수행하였다.
결과를 아래의 표 4.1에 나타냈다. EC50 값이 낮을수록 PCSK9 매개 LDL 흡수의 하향 조절을 역전하는 능력이 더 크다는 것을 반영하는 것이며, 반대로 높은 EC50 값은 PCSK9 매개 LDL 흡수의 하향 조절을 억제하는 능력이 낮은 화합물을 나타내는 것이다.
알 수 있는 바와 같이, 대부분의 화합물은 LDL 흡수 분석에서 100~500의 EC50을 나타내는데, 이는 PCSK9 매개 LDL 흡수의 하향 조절을 역전시키는, 즉 LDL 흡수를 증가시키는 능력이 높은 화합물임을 나타내는 것이다.
[표 4.1]
Figure pct00113
Figure pct00114
LDL 흡수를 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 GLP-1/EGF(A) 화합물에 대해 추가로 평가하였으며, 이를 통해 GLP-1 유사체와의 결합이 EGF(A) 유사체의 기능성을 방해하지 않았음을 다시 확인하였다(표 4.2 참조).
[표 4.2]
Figure pct00115
C5 - 미니피그에서의 약동학(PK)
본 연구의 목적은 미니피그에게 GLP-1 유도체를 정맥 내(i.v.) 투여한 후 GLP-1 유도체의 생체 내 연장성, 즉 체 내에서 이들의 잔류 시간 연장 및 이에 따른 작용 시간을 결정하는 것이다. 이는 약동학(PK) 연구에서 수행되며, 여기서 해당 유도체의 최종 반감기가 결정된다. 말단 반감기는 말단 제거 단계에서 특정 혈장 농도를 절반으로 하는 데 걸리는 시간을 의미한다.
암컷 괴팅겐(Goettingen) 미니피그를 Ellegaard Goettingen 미니피그(덴마크 데일모제 소재)로부터 수득하는데, 대략 8~12개월령이고 체중이 대략 20~30 kg인 것들이 연구에 사용된다. 미니피그(영구 카테터 함유 돼지)를 짚을 깔아 둔 펜스 내에 개별적으로 수용하고, Altromin 9030 미니피그 사료(Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG)를 하루에 한 번 제한적으로 먹였다.
3주의 순응 기간 후, 2개의 영구 중심 정맥 카테터를 각 동물의 대정맥 뒷면에 이식하였다. 수술 후 동물들에게 1주일의 회복 기간을 주고, 이어서 약동학 연구에 이들을 사용하였으며, 연속 투약 사이에는 적절한 장 세척 기간을 두었다.
50 mM 인산염, 70 nM 염화 나트륨 및 0.05% 폴리소르베이트 80, pH 7.4가 포함된 완충액에 유도체를 용해시킨다.
유도체의 정맥 내 주입(0.05 ml/kg 및 2 nmol/kg의 투약량에 상응하는 부피)은 하나의 카테터를 통해 이루어지며, 투약 후 최대 14일차까지 소정의 시점에 혈액을 (바람직하게는 다른 하나의 카테터를 통해) 샘플링한다.
혈액 시료(예: 0.8 ml)를 EDTA(8 mM)가 코팅된 관에서 수집한 다음 4℃및 1942g에서 10분 동안 원심 분리하였다.
혈장을 드라이아이스 상의 마이크로닉 튜브에 피펫팅하고 LOCI를 사용하여 유도체의 혈장 농도를 분석할 때까지 -20℃에서 유지하였다. 개별 혈장 농도-시간 프로파일을 Phoenix v. 6.4(Pharsight Inc., Mountain View, CA, 미국)에서 비구획 약동학 방법에 의해 분석하였으며, 최종 반감기(조화 평균)를 결정하였다.
결과
약동학 연구는 전술한 바와 같이 미니피그를 사용하여 수행하였다.
최종 반감기에 대한 다음 결과를 얻었다:
[표 5]
Figure pct00116
시험된 화합물은 인간 GLP-1(7-37)에 비해 증가된 최종 반감기를 갖는다.
GLP-1 유사체를 포함하고 위치 8에서 G를 갖는 화합물 21은 2시간의 최종 반감기를 갖는데, 이는 위치 8에서 비천연 아미노산 Aib를 갖는 다른 화합물의 반감기보다 10~25배 짧다.
C6 - hPCSK9 접종 모델
본 연구의 목적은 EGF(A) 유사체 또는 본원에 기술된 바와 같은 EFG(A)를 포함하는 화합물과 함께 정맥 내 주입된 hPCSK9의 작용을 억제하는 것에 반응하여 마우스 간에서 LDL 수용체 발현 수준이 변화하는 것을 보여주고자 하는 것이다.
방법
건강한 수컷 BalBC 또는 NMRI 마우스(Charles River, 독일)에rp EGF(A) 유사체(또는 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물)를 s.c. 또는 i.v. 주입하고, 15~120분 후에 hPCSK9(Sino Biologicals, 중국)를 0.4mg/kg의 투약량으로 꼬리 정맥에 정맥 내 주입한다. hPCSK9를 주입한 후 60분차에, 이소플루란으로 동물을 마취시키고 경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 안락사시킨다. 그런 다음, 신속하게 간을 절제하여 액체 질소에서 순간 동결시킨다. 분석 시까지 간을 -80℃에서 유지시킨다.
LDL-R 웨스턴 블롯팅:
간 조직 샘플(100 mg)을 포스파타아제 억제제 칵테일인 PhosStop(Roche, 04 906 837 001) 및 프로테아제 억제제 칵테일인 compelate(Roche, 04 693 159 001)가 포함된 500 μl 용해 완충액(Life Technology, FNN0011)에서 균질화시킨다. 1개의 스틸 비드를 첨가한 후 조직을 30 Hz에서 2.5분 동안 균질화시킨다. 5000xg에서 5분 동안 원심 분리한 후, BCA 단백질 분석 키트(Pierce, 23225)를 사용해 총 단백질 함량을 결정한다. 샘플 완충액(Life Technology, NP0007) 중 동일한 양의 단백질(60 μg)을 10분 동안 끓이고 14000 rpm으로 2분 동안 회전시킨 후 Criterion XT 3~8 % 트리스-아세테이트 겔(BioRad#345-0131) 상에 첨가하여 SDS-PAGE를 실시한다. 단백질을 제조자(Life Technology)의 지침에 따라 니트로셀룰로오스 막(iBlot 2 NC Regular stacks, novex # IB23001)에 옮긴다. 막의 Ponceau S(Sigma, P7170) 염색에 의해 동일한 단백질이 전달되었음을 확인되고, 차단 완충액(TBS-T, 2% Tween)에서 막을 추가로 차단한다. LDL-r 단백질을 일차 토끼 항LDLr 항체(Cayman Chemical Company #10012422)로 검출하는 한 편, 베타-액틴 단백질은 1차 토끼 항베타-액틴 항체(abcam # ab6276)를 사용해 검출한다. 두 단백질 모두를 WesternBright Quantum Chemiluminscent(Advansta # K-12042-D10)를 사용하여 퍼옥시다아제-접합된 염소 항토끼 이차 항체(Biorad #170-6516)로 추가로 가시화시키고 CCD 카메라(LAS3000, FujiFilm)를 사용하여 영상화한다. 웨스턴 블롯으로부터의 화학발광 신호의 정량 분석은 MultiGauge 소프트웨어(Fujifilm)로 수행한다.
결과
LDL-R 발현 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하였고, 발현 수준을 비교하였다. 발현은, hPCSK9 한 가지만 주입한 군을 나타내는 "비히클-hPCSK9"에 의해 감소된다. EGF(A) 화합물 -hPCSK9"를 주입한 군은 발현이 적어도 90%로 복귀하면서 LDL-R의 발현이 정상화되었음을 보여주었다.
결과는, hPCSK9가 LDL-R의 발현 수준을 감소시키고 이러한 효과가 시험된 EGF(A) 화합물에 의해 억제된다는 것을 보여준다. 데이터는 표 6.1 및 6.2에 요약되어 있으며, 건강한 대조군 동물에서의 베이스라인 수준(100%로 설정)과 hPCSK9 한 가지에 의해 하향 조절된 후의 수준(0%로 설정) 간의 윈도우와 관련하여 백분율 변화로서 제시된다. 시험한 6개의 EGF(A) 화합물은 LDL-R 발현 수준에 대한 hPCSK9의 작용을 억제할 수 있으며, 관찰된 억제 수준은 대조 분자인 알리로쿠맙을 사용하여 관찰된 억제 수준과 유사하다.
[표 6.1]
Figure pct00117
[표 6.2]
Figure pct00118
결론
여러 가지 화합물 실시예는 hPCSK9에 의한 LDL-R 발현 수준의 하향 조절을 억제하는 데 있어 효능을 나타냈다.
C7 - db/db 마우스에서의 약력학 연구
이 분석의 목적은 당뇨 환경에서 혈당(BG) 및 체중(BW)에 대한 급성 효과를 확인하는 것이다.
화합물을, 후술하는 바와 같이, 비만, 당뇨병 마우스 모델(db/db 마우스)에서의 단일 투약량 연구에서 시험한다. 유도체를 상이한 투여량, 즉 0.3, 1.0, 3.0, 10, 30 및 100 nmol/kg 또는 1.0, 3.0, 10, 30, 100 및 300 nmol/kg으로 시험한다. 출생 시점부터 규정식 NIH31(NIH31M Rodent Diet, 미국 Taconic Farms, Inc.으로부터 상업적으로 이용 가능함. www.taconic.com)을 먹인 마우스(Taconic, 덴마크)를 대략 10주령일 때 연구에 등록한다. 동물 유닛에 도착하면, 마우스가 표준식(예: Altromin 1324, Brogaarden, 덴마크 겐토프테 소재)과 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하고 24℃로 유지한다. 1~2주의 순응 기간 후, 매일 2회씩 기저 혈당을 평가한다. 베이스라인 혈당 수치가 15 mM을 초과하는 마우스만 포함시킨다. 부합하는 혈당 수준과 체중을 기준으로 마우스를 치료군으로 할당한다((그룹 당 N=5~7마리).
다음과 같은 치료를 받도록 동물을 그룹화된다: 비히클 피하 주입, 또는 GLP-1/PCSK9i 유도체(0.3, 1.0, 3.0, 10, 30 또는 100 nmol/kg 또는 1.0, 3.0, 10, 30, 100 및 300 nmol/kg) 피하 주입(비히클은 50 mM 인산나트륨, 70 mM 염화나트륨, 0.05% 폴리소르베이트 80, pH 7.4임).
GLP-1/EGF(A) 화합물을 0.05, 0.17, 0.5, 1.7, 5.0 또는 17 nmol/ml 또는 0.17, 0.5, 1.7, 5.0, 17 또는 50 nmol/ml의 투약 농도가 되도록 비히클에 용해시킨다. 실험 시작 시, 6 ml/kg(즉, 마우스 50 g당 300 μl)의 투약 부피를 동물에게 1회 s.c. 투약한다.
투약 당일 아침에, 투약 30분 전에 혈당을 평가하고, 이후 마우스를 칭량한다. GLP-1/EGF(A) 화합물을 대략 0시간차에 투약한다. 투약 당일에는, 투약 후 1, 2, 4 및 8시간차에 혈당을 평가한다.
다음 날부터는, 24시간, 48시간, 72시간, 및 96시간차에 혈당을 평가한다. 매일, 혈당 샘플링에 이어서 마우스를 칭량한다.
마우스는 디지털 계량 저울 상에서 개별적으로 칭량한다.
혈당 측정용 샘플은 의식이 있는 마우스의 꼬리 끝 모세혈관으로부터 얻는다. 혈액 5 μl를 헤파린화 모세관에 수집하고 250 μl 글루코오스 완충액(EKF system solution, 독일 엡펜도르프 소재)에 옮긴다. 글루코오스 농도는 글루코오스 산화효소 방법(글루코오스 분석기 Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, 독일 바르레벤 소재)을 사용해 측정한다. 분석 시점까지, 샘플을 실온에서 최대 1시간 동안 보관하거나, 4℃에서 최대 24시간 동안 보관한다.
베이스라인 차감 혈당 및 베이스라인 차감 체중을 마우스에서 계산한다.
결과
전술한 바와 같이, 단일 투약량 연구에서 GLP-1/EGF(A) 화합물 1, 2, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29 및 32를 시험하였다. 유도체를 상이한 투약량, 즉 0.3, 1.0, 3.0, 10, 30 및 100 nmol/kg(화합물 2, 21, 22, 23, 25 및 26) 또는 1.0, 3.0, 10, 30, 100 및 300 nmol/kg(화합물 1, 27, 29 및 32)으로 시험하였다.
표 7.1은 최고 투약량이 투약 후 24시간차에 델타 혈당 및 델타 체중에 미치는 최대 효과(Emax)에 대한 개요를 제공한다. 2가지 최고 투약량 수준이 유사한 효과를 주지 못하여, 실제 Emax에 도달할 수 없었던 경우, 별표(*)로 값을 표시된다.
[표 7.1]
Figure pct00119
GLP-1/PCSK9i 유도체가 혈당 및 체중에 미치는 효과에 대한 표시를 얻기 위해, 0에서 24시간까지의 델타 혈당에 대한 곡선 아래 면적(AUC ΔBG24h) 및 투약 후 24시간차의 델타 체중 증가율(ΔBW24h)을 계산하였다. 이들 파라미터에 대한 투약량 반응 곡선에 기초하여, AUC ΔBG24h 및 ΔBW24h에 대한 유효 투약량 50%(ED50, 베이스라인과 최대 효과의 절반에 상응하는 반응을 얻게되는 GLP-1 유도체의 투약량)를 계산하였다. ED50은 GLP-1/PCSK9i 유도체의 효능의 추정치로 사용될 수 있다. 다음의 결과를 얻었다(모든 개별 결정의 평균).
[표 7.2]
Figure pct00120
시험한 화합물은 투약량 의존적으로 혈당뿐만 아니라 체중을 감소시키는 생체 내 효과를 나타냈다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
C8 - DIO 랫트에서의 약력학 연구
이 분석의 목적은 비만 환경에서 체중(BW) 및 총 콜레스테롤 수준에 대한 아만성 효과(subchronic effect)를 검증하는 것이다. 다음에 기술되는 바와 같이, 정규식 유도 비만(DIO) 랫트 모델에서 21일 동안의 아만성 투약량 연구에서 화합물을 시험한다. 유도체를 상이한 투약량, 즉 30 및 300 nmol/kg으로 시험하며, 일부 경우에는 300 nmol/kg 그룹에게 표시된 시간 동안 900 nmol/kg의 더 높은 투약량을 주입하였다.
6주령부터 60% 고지방 정규식(D12492, Research Diets, Inc.로부터 상업적으로 입수 가능함)을 먹인 스프래그다울리 랫트(Charles River, 프랑스)가 22주령이 되어서 동물 유닛에 도착한다. 동물 유닛에 도착한 후, 랫트가 45% 고지방 정규식(D12451, Research Diets, Inc.에서 상업적으로 입수 가능함)과 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하고, 랫트에 대해 조명 조건(12시간:12시간 명/암 사이클; 조명은 06:00~18:00에 켬) 및 온도 조건(22±2℃을 조절한다. 2~3주간의 순응화 후, 랫트를 부합하는 체중 및 지방 백분율에 기초하여 치료군에 할당한다(그룹 당 N=10마리).
다음과 같은 치료를 받도록 동물을 그룹화된다: 비히클을 피하 주입하거나, GLP-1/EGF(A) 화합물(30 또는 300 nmol/kg, 일부 경우에는 300 nmol/kg 그룹의 랫트에게 표시된 기간(일) 동안 900 nmol/kg을 주입함) 피하 주입하되, 비히클은 50 mM 인산염, 70 mM 염화 나트륨, 0.007% 폴리소르베이트 20, pH 7.4이다. GLP-1/EGF(A) 화합물을 15(상향 적정용), 50(상향 적정용), 150, 500(상향 적정용) 또는 1500 nmol/ml의 투약 농도가 되도록 비히클에 용해시킨다.
동물에게 0.2 ml/kg의 투약량을 22일 동안 매일 아침에 1회 피하 투여한다. 투여량은 서서히 상향 적정되므로, 랫트에게는 첫 날에 3 nmol/kg이 투여되고, 2일차에는 10 nmol/kg, 3일차에는 30 nmol/kg, 해당할 경우 4일차에는 100 nmol/kg, 5일차에는 300 nmol/kg이 투여된다. 30 nmol/kg 투여 그룹에게는 3일차부터 실험의 끝날 때까지 최대 투약량이 투여된다. 300 nmol/kg 투여 그룹에게는 5일차부터 실험의 끝날 때까지 최대 투약량이 투여된다. 300 nmol/kg의 GLP-1/EGF(A) 화합물 41을 투여한 랫트에게는 16일차부터 실험이 끝날 때까지 900 nmol/kg이 투여된다. 300 nmol/kg의 GLP-1/EGF(A) 화합물 48을 투여한 랫트에게는 20일차부터 실험이 끝날 때까지 900 nmol/kg이 투여된다. 900 nmol/kg 투약량은 1500 nmol/ml 용액의 투약 부피를 0.6 ml/kg까지 증가시킴으로써 달성된다.
투약 직전에, 디지털 계량 저울 상에서 랫트를 매일 칭량한다. 먹이 소비량을 계산하기 위해 먹이 용기도 매일 칭량한다. 신체 조성은 투약 개시 전과 20일 또는 21일차에 MR 스캔으로 평가한다(Echo MRI 700, 미국 텍사스 휴스톤 소재). 설하 혈액 샘플을 의식이 있는 랫트로부터 투약 개시 5일 전과 연구 종료 시점에 채혈한다. 혈액 샘플들을 EDTA 튜브에 수집하고 뒤집어서 완전히 혼합한다. EDTA 튜브는 채혈 직후 얼음 위에 둔다. EDTA 혈액 샘플을 4℃에서 6000 G로 5분 동안 원심 분리하고, 혈장 샘플을 분석 시까지 -80℃에서 보관한다. 샘플을 Cobas 분석기(Cobas6000, Roche Diagnistics, 미국)를 이용해 총 콜레스테롤 수준에 대해 분석한다.
베이스라인 차감 체중 및 베이스라인 차감 총 콜레스테롤 수준을 각 랫트에 대해 계산하고 그룹당 평균을 낸다.
결과
전술한 바와 같이, 아만성 투약량 연구에서 GLP-1/EGF(A) 화합물 41, 48 및 69를 시험하였다. 유도체를 상이한 투여량, 즉 30 및 300 nmol/kg(GLP-1/EGF(A) 화합물 69)으로 시험하거나, 30 및 300 nmol/kg에서 마지막 2일 동안(GLP-1/EGF(A) 화합물 41) 또는 마지막 7일 동안(GLP-1/EGF(A) 화합물 48) 900 nmol/kg까지 증가시켜 시험하였다.
표 8.1은 그룹당 베이스라인 체중(평균 ± SEM)과 비교했을 때의 평균 체중의 백분율 및 베이스라인 수준(평균 ± SEM)과 비교했을 때의 평균 델타 혈장 총 콜레스테롤 수준에 대한 개요를 제공한다.
[표 8.1]
Figure pct00121
C9 - 화학적 안정성
제형을 GLP-1/EGF(A) 화합물 69 및 313으로 제조하여 EGF(A) 유사체의 잠재적 안정화 효과(이성질체 형성 감소)를 조사하되, 여기서 321D는 321E로 치환된다. 20 mM 트리스, pH 7.4, 18.4 mg/ml 프로필렌 글리콜, 0.43 mM CaCl2로 이루어진 제형에서 화합물의 농도는 2 mg/mL이다. 제형은, 동결 건조된 물질을 트리스, 프로필렌 글리콜, 및 CaCl2를 함유하는 MQ 물에 용해시켜 최종 농도로 제조한다. pH는 0.1N HCl(aq) 및 0.1N NaOH(aq)를 사용해 조정한다. 각 제형을 멸균 여과하여 HPLC 유리 바이알에 채우고, 37℃로 온도 제어된 캐비넷에 조용히 보관한다. 선택된 시점(시간 0, 1주, 2주, 4주)에 샘플을 HPLC 바이알에서 빨아들여 이어지는 UPLC-MS 분석을 위해 동결시킨다.
BEH C4 컬럼(300Å, 1.7 um, 1.0x150 mm, 물) 및 물 중 0.1 % 포름산(용리액 A)/아세토 니트릴 중 0.1% 포름산(용리액 B) 용매 시스템에 기초하여 안정성을 나타내는 순도 방법을 사용해 열-응력 제형의 순도 손실을 평가한다. 다음 조건이 사용된다: 컬럼 온도: 50℃, 유속: 0.30 mL/분; UV 검출기의 파장: 215 nm. 구배는 41분에 걸쳐 31%에서 39% B까지이다. LC 흐름은 양이온 모드로 작동하는 전기분무 인터페이스가 장착된 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기(Thermo Fischer Scientific)에 온라인으로 주입된다. 순도 방법은 전술한 제형과 양립할 수 있는 것으로 표시되며, 함량/유사체 손실이 관찰되지 않는다. 형성된 이성질체의 양은 다양한 샘플(시간 0, 및 2주 및 4주 동안 37℃에서 인큐베이션한 샘플)의 총 이온 크로마토그램에 대해 질량-기반 추출로부터 결정하고, 각 샘플에서의 이성질체의 백분율은 주요 피크(API) 면적에 대한 이성질체 피크 면적을 통합하여 계산한다.
[표 9.1]
Figure pct00122
표 9.1의 결과는 321D를 321E로 대체하면 37℃에서 인큐베이션 후 4주차에 이성질체 형성량을 20.2%에서 4.2%로 상당히 감소시킨다는 것을 보여준다.
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> 이기능성 화합물 <130> 170010WO01 <160> 388 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 1 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 2 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Ala Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Ile Cys 1 5 10 15 Arg Lys Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 3 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 4 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 4 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 35 40 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 5 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Pro Leu Gly Gly Cys Ser His Ile Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 6 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 7 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Lys Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 8 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 8 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu 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Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Lys Cys Glu Lys 35 40 <210> 17 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 17 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Lys Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 35 40 <210> 18 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 18 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 35 40 <210> 19 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 19 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 35 40 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 20 Gly Thr Asp Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly 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합성 서열 <400> 44 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Lys Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 45 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 45 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Lys Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 46 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 46 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Lys Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 47 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 47 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Ser Asp Leu Arg Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 35 40 <210> 48 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 48 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Ser Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 35 40 <210> 49 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 49 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser Tyr Val Cys 1 5 10 15 Ser Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 50 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 50 Asn Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Ser Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 51 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 51 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser Lys Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 52 <211> 40 <212> PRT 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Glu 35 40 <210> 64 <211> 40 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 64 Gly Lys Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 65 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 65 Lys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val 1 5 10 15 Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe 20 25 30 Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 35 40 <210> 66 <211> 39 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 66 Gly Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu 20 25 30 Val Ala Lys Arg Arg Cys Glu 35 <210> 67 <211> 41 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 서열 <400> 67 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser Asp Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gly 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg 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인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 130 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 131 Gly Glu Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 132 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 133 Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 134 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 135 <211> 8 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 135 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ser 1 5 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <400> 136 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ser 1 5 10 <210> 137 <211> 31 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 137 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 138 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 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Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Lys Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 179 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 179 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 180 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 180 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 181 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 181 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Lys Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 182 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 182 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 183 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 183 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 184 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 184 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 185 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 185 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 186 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 186 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 187 <211> 31 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> 변이체 <222> (2)..(2) <223> X는 A, G, W 또는 Aib임 <220> <221> 변이체 <222> (6)..(6) <223> X는 F 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (15)..(15) <223> X는 E, G 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (17)..(17) <223> X는 Q, G 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (18)..(18) <223> X는 A, G, V 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (19)..(19) <223> X는 A, G, V 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (20)..(20) <223> X는 K 또는 R임 <220> <221> 변이체 <222> (21)..(21) <223> X는 E, G 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (23)..(23) <223> X는 I, A 또는 V임 <220> <221> 변이체 <222> (24)..(24) <223> X는 A, G 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (25)..(25) <223> X는 W, G 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (26)..(26) <223> X는 L, G, T, V, I 또는 K임 <220> <221> 변이체 <222> (27)..(27) <223> X는 V, G, I, L, K이거나 부재함 <220> <221> 변이체 <222> (28)..(28) <223> X는 K, R, Q이거나 부재함 <220> <221> 변이체 <222> (29)..(29) <223> X는 G이거나 부재함 <220> <221> 변이체 <222> (30)..(30) <223> X는 R, R이거나 부재함 <220> <221> 변이체 <222> (31)..(31) <223> X는 G이거나 부재함 <400> 187 His Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 188 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 188 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 189 <211> 75 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 189 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser 35 40 45 His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu 50 55 60 Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 190 <211> 80 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 190 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Lys 65 70 75 80 <210> 191 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 191 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Lys Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 192 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 192 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 193 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 193 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 194 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 194 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 195 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 195 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser Tyr Val Cys Asn Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 196 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 196 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp His Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 197 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 197 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 198 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 198 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Lys Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 199 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 199 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Lys Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 200 <211> 83 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 200 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys 35 40 45 Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile 50 55 60 Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg 65 70 75 80 Arg Cys Glu <210> 201 <211> 95 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 201 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 65 70 75 80 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg 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Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 65 70 75 80 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 85 90 95 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 100 105 110 Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg 115 120 125 Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu 130 135 140 Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 145 150 <210> 204 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 204 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Lys 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 205 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> 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Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Lys Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 208 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 208 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Lys Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 209 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 209 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu 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Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 383 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 383 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 384 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 384 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 385 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> GTNECLDNLGGCSHVCRDLEIGYECLCPEGFQLVAQRRCEGQAPGQAPHXEGTFTSDVSSYLEGQ AAKEFIAWLVKGRG <222> (50)..(50) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Aib <400> 385 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 50 55 60 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 65 70 75 <210> 386 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Aib <400> 386 Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu Gly Gly Cys Ser His Val Cys 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Glu Gly Phe Gln 20 25 30 Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 50 55 60 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 65 70 75 <210> 387 <211> 79 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <400> 387 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Gly Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 35 40 45 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 50 55 60 Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 65 70 75 <210> 388 <211> 111 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 388 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly 50 55 60 Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Leu 65 70 75 80 Gly Gly Cys Ser His Val Cys Arg Asp Leu Glu Ile Gly Tyr Glu Cys 85 90 95 Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu 100 105 110

Claims (15)

  1. GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 화합물로서,
    i. 상기 GLP-1 유사체는 서열번호 137에 의해 식별된 GLP-1(7-37)의 유사체이고,
    ii. 상기 EGF(A) 유사체는 서열번호 1에 의해 식별된 LDL-R(293-332)의 EGF(A) 도메인의 유사체인, 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 화합물은 이기능성인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 화합물은 GLP-1 유사체 및 EGF(A) 유사체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 N-말단에서 GLP-1 유사체를 포함하고 C-말단에서 EGF(A) 유사체를 포함하는, 화합물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 펩티드 스페이서, 예컨대 서열번호 115-136에 의해 정의된 스페이서의 군으로부터 선택된 스페이서를 포함하는, 화합물. 　
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 1개 또는 2개의 Lys 잔기를 포함하는, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, GLP-1 유사체는 서열번호 138 내지 187, 예컨대 서열번호 139~146, 155~162 및 164~173, 예컨대 서열번호 139~142, 155~162 및 164~173, 예컨대 서열번호 139, 142, 155~162 및 164~173, 예컨대 서열번호 139, 155~162 및 164~173, 예컨대 서열번호 155~162 및 164~173, 예컨대 서열번호 139 및 164 또는 예컨대 서열번호 139 또는 164에 의해 정의된 GLP-1 유사체의 군으로부터 선택되는, 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, EGF(A) 유사체는 서열번호 2 내지 114, 예컨대 서열번호 2~4, 6~19, 21~44, 46, 47, 49~53, 55 및 58~114, 예컨대 서열번호 19, 21, 73, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 및 114, 예컨대 서열번호 107 및 108 또는 서열번호 108에 의해 정의된 EGF(A) 유사체의 군으로부터 선택되는, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 188~384 및 387~388에 의해 정의된 서열군에서 선택되는, 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 적어도 하나의 반감기 연장 치환기를 포함하는, 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 지방산기 및 링커를 포함하는 적어도 하나의 치환기를 포함하는, 화합물.
  12. 제11항 또는 제12항에 있어서, 적어도 하나의 치환기는 lys 잔기(들)를 통해 부착되는, 화합물.
  13. GLP-1/EGF(A) 화합물 #41, #48, #69 및 #306, 예컨대 #306 및 #69, 또는 #306 또는 #69로 정의된 화합물 군으로부터 선택된 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨, 비만 및/또는 심혈관 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 화합물.
  15. 당뇨병, 비만 및/또는 심혈관 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 약학적 유효 투약량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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