KR20200038532A

KR20200038532A - 프로트랜스듀진(protransduzin)-D-유전자 전달(gene transfer)의 개선된 인핸서(enhancer)

Info

Publication number: KR20200038532A
Application number: KR1020207007923A
Authority: KR
Inventors: 울프-조지 포스만; 루돌프 리히터
Original assignee: 파리스 바이오텍 게엠베하
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2020-04-13
Also published as: WO2019043037A1; CN111491944A; CA3080076A1; EP3676286A1; WO2019043037A8; AU2018326439A1; US20210154327A1

Abstract

본 발명은 Z¹-Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z²서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 레트로바이러스(retroviral) 형질감염(transfection)/형질도입(transduction)에 사용된다.

Description

프로트랜스듀진(protransduzin)-D-유전자 전달(gene transfer)의 개선된 인핸서(enhancer)

본 출원은 유전자 전달(gene transfer)의 개선된 인핸서(enhancer), 즉 프로트랜스듀진 D(protransduzin D, PTD-D), 형질도입(transduction) 인핸서 PTD-A 및 PTD-B를 넘어선 개선, 그의 폴리펩티드, N-말단 보호된 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 함유하는 의약, 유전자 치료에 사용하기 위한 상기 폴리펩티드, 유전적으로 조작된 바이러스 구성물(construct)에 의해 세포의 감염을 향상시키는 방법, 및 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)의 증폭을 위한 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

특정 세포 기능을 변화시키기 위한 유전 물질의 도입은 최초의 인간 유전자의 클로닝 및 재조합 생산 이후 생물-의학적 기초 및 응용 연구의 필수적인 도구가 되었다. 유전자 도입 방법에는 지속적인 진전이 있으며, 이는 유전자 전달의 최적화로 이어진다.

형질도입 인핸서의 개발에 대한 연구는 HIV의 바이러스 외피 단백질로부터의 펩티드인 프로트랜스듀진-A(protransduzin-A)의 발견으로 이어 졌는데, 이는 놀랍게도 유전자 물질의 핵으로의 렌티바이러스 형질도입(lentiviral transduction)을 전례 없는 수준 이상으로 개선시키는 데 적합하였다(Yolamanova et al., Nature Nanotechnology). 따라서, 예를 들어, 상이한 농도(1-100㎍/ml)의 프로트랜스듀진 A(protransduzin A, 동의어: EF-C)로 예비배양된 HIV는 골드 표준(gold standard) "레트로넥틴(retronectin)"과 비교하여 10의 몇 배만큼 증가된 리포터 세포에 의한 감염률을 나타내는 것으로 보여질 수 있다. 작용 기전으로서, EF-C는 바이러스에 결합하고 농축하여 바이러스의 세포로의 진입을 증폭시킬 수 있는 섬유질 구조를 형성하는 것으로 가정되었다. 바이러스 입자 감염뿐만 아니라, EF-C는 유전자 치료에 적용되는 다양한 인간 세포 유형(T세포, 아교세포, 섬유아세포, 조혈 줄기세포)에서 고효율로 렌티바이러스(lentiviral) 및 레트로바이러스(retroviral) 입자의 형질도입을 향상시킨다(Jan M

nch et al., Nature Nanotechnology, Vol. 8, No. 2, pp. 130-136). EP 2　452　947 A1 또한 프로트랜듀진 A에 관한 것이다.

시스테인은 극성 중성 아미노산 그룹에 속한다. 또한, 이들의 독특한 기능성 티올기(thiol group) 때문에, 시스테인은 다른 아미노산, 특히 다른 그룹의 아미노산으로부터의 변형 또는 심지어 치환(replacement)이 고려되지 않는 아미노산이다. 시스테인(Cys)과 마찬가지로 Tyr, Asp, Ser, Gly, Gln, Thr 아미노산은 극성이지만 중성 아미노산 그룹에 속한다. 그러나, 교환에 의해 변형된 펩티드의 이차 구조에 대한 이러한 치환의 효과는 예측하기 어렵기 때문에, 당업자는 다른 그룹으로부터의 아미노산으로의 치환을 피할 것이다. 따라서, 당업자는 비극성 소수성 아미노산 그룹으로부터의 아미노산으로 프로트랜스듀진의 Cys를 치환하는 것을 고려하지 않을 것이다.

그러나, 놀랍게도, 프로트랜스듀진에서 Cys 아미노산은 형질도입 인핸서로서 변형된 폴리펩티드의 유효성의 상당한 변화를 초래하지 않으면서 알라닌으로 치환될 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명에 따르면, 변형된 프로트랜스듀진이 제공되는데, 한편으로는 형질도입 인핸서로서 PTD-A의 것과 비교할 수 있는 효과를 가지며, 보다 높은 저장 안정성을 갖고, 형질도입 인핸서로서의 그의 적용에서 보다 간단한 처리를 보장하며, 이는 GMP 생산에서 엄청난 이점이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 다음 서열과 80% 또는 90% 이상의 서열 동일성(sequence identity), 특히 95%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는다

Z¹-Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z².

Z¹은 서로 독립적으로 폴리펩티드의 N-말단, 또는 서로 독립적으로 Leu 또는 Ser 아미노산, 또는 하기 펩티드이다:

Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile-Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, 또는 Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu,

Z²는 서로 독립적으로 폴리펩티드의 C-말단, 또는 서로 독립적으로 Gly 또는 Glu 아미노산 또는 하기 펩티드이다:

Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu-Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, 또는 Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly.

본 발명에 따른 폴리펩티드에 의해 달성될 수 있는 개선은 치료 용도로 사용될 수 있는 형질도입 인핸서의 증가된 안정성을 수반한다. 치료적 적용을 위한 세포에서의 효율적인 유전자 형질도입은 예를 들어 유전자 형질도입에 사용되는 바이러스 입자의 필요한 양을 감소시킬 수 있다. 또한, 효율적인 형질도입에 필요한 감염주기의 수를 줄일 수 있다. 형질도입 인핸서로서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 사용함으로써, 유전자-변형된 세포를 증식시키기 위한 시험관 내 배양 기간 및 환자로부터 제거될 세포의 양(예: 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의함)이 감소될 수 있고, 일부 경우에, 생체 내 바이러스 부하를 감소시킴으로써 효율적이고 비독성인 생체 내 유전자 형질도입이 가능할 수 있다. 또한, 효율적인 형질도입 인핸서의 신속한 처리는 형질도입될 세포에 대한 부하를 감소시킨다.

이의 개선된 안정성으로 인해, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 물질의 장기간 저장 후에도 형질도입 인핸서의 효과를 더 잘 예측할 수 있게 한다.

안정성이 높기 때문에, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 PTD-A와 비교하여 더 오래 저장될 수 있는 더 큰 펩티드 배치(batches)를 생성할 수 있게 한다. PTD-A와 비교하여 본 발명에 따른 폴리펩티드의 반응성이 낮을수록 세포독성 활성이 낮아진다. 형질도입에서, 이것은 형질도입된 세포의 더 높은 수율로 이어진다.

특히, 본 발명은 다음 서열과 80% 이상의 서열 동일성, 특히 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다

Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln.

본 발명에 따르면, 용어 "본 발명에 따른 폴리펩티드(polypeptide according to the invention)"는 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 폴리펩티드 사슬에서 아미노산을 변화시킴으로써 형성되는 관련된 폴리펩티드를 포함하지만, 여전히 비슷하고 충분한 효과를 가지며, 이는 예를 들어, 하기의 생물 분석에서 결정된다.

형질도입 효율은 예를 들어 표적 세포로서 3일 동안 CD3/CD28 비드와 배양된 1차 활성화된 CD4+/CD8+ 풍부한 T세포 및 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)을 암호화하는 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 사용하여 시험될 수 있다. PTD-D는 예를 들어, 형질도입 인핸서의 골드 표준(gold standard)으로서 PTD-A 및 레트로넥틴에 대해 시험될 수 있다.

PTD-A 및 PTD-D는 예를 들어 25㎍/ml의 농도로 분석에 사용된다. 표적 세포는 특히 10³ 내지 10⁶cells/ml의 농도로 사용된다. 혼합물을 8 내지 16시간 동안 배양한 후, 세포를 세척한다. 그 다음, 세포를 예를 들어, 4일 동안 배양한다. 이어서, 7일째에, GFP+T세포의 비율을 유동 원심분리에 의해 결정하고, 세포 수 및 생존력을 결정한다.

특히, 상동 펩티드는 아미노산의 치환 또는 결실이 언급된 정도로 수행된 본 발명에 따른 폴리펩티드의 서열과 관련된 폴리펩티드이다. 특히, 유사한 특성, 예를 들어, 유사한 극성을 갖는 아미노산의 교환이 가능하다. 따라서, 아르기닌 및 리신, 글루탐산 및 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴 및 트레오닌, 글리신, 알라닌 및 프롤린, 류신, 이소류신 및 발린, 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 뿐만 아니라 세린 및 트레오닌의 교환이 널리 퍼져있다.

서열의 1번 위치에는 글루타민 아미노산이 바람직하다. 3 및 5번 위치에는 바람직하게는 염기성 아미노산, 바람직하게는 리신이 있다. 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12번 위치에는 대부분 중성 아미노산이 있다. 서열은 N-말단 및/또는 C-말단으로 연장되거나 절단될(truncated) 수 있다. 단량체의 서열은 C-말단 부분 또는 전체 아미노산 서열 NH₂-Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu-COOH에 의해 N-말단 연장될 수 있다. 단량체의 서열은 N-말단 부분 또는 전체 아미노산 서열 NH₂-Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly-COOH에 의해 C-말단 연장될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 수용액에서 불용성 응집체를 형성하는 공통 특성을 공유한다. 단량체는 4 내지 25개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 20개 아미노산으로 구성된다.

또한, 상동성 분자는 수용액에서 불용성 응집체를 형성하고 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터로 표적 세포의 형질도입을 향상시키는 공통의 특성을 공유한다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 사슬의 N-말단은 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기와 같은 하나 또는 두 개의 알킬기, 아세틸 또는 프로피오닐기와 같은 아실기 또는 N-말단을 형성하는 피로글루탐산 아미노산,

으로 구성된 그룹에서 선택되는 화학기(chemical group)로 변형된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 의약에 관한 것이다.

본 발명은 또한 유전자 치료(gene therapy)로 치료 가능한 질병을 치료하기 위한 유전자 치료(gene therapy)에 사용하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 바이러스에 의한 세포의 감염을 향상시키는 방법에 관한 것이다:

- 유기용매에 용해된 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제공하는 단계;

- 폴리펩티드의 불용성 응집체를 형성하기 위해 폴리펩티드를 수용액에 첨가하는 단계;

- 마지막 이전 단계(the last preceding step)로부터의 용액을 혼합하는 단계; 및

- 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재 하에서 세포를 배양하는 단계.

본 발명은 또한 바이러스에 의한 세포의 감염을 향상시키기 위한 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 펩티드는 예를 들어, Fmoc-보호된 아미노산을 갖는 메리필드(Merrifield)에 따른 방법에 의해 제조될 수 있다.

이 방법은 메리필드(Merrifield) 원리에 따라 단계적 고상 합성에서, 특히 합성기 ABI-433상의 고체 지지체로서 Fmoc-L-글루타민(0.59mmol/g, 100-200 mesh)이 사전로드된 Wang 수지에서 Fmoc-보호된 유도체, 즉, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-보호된 아미노산과 함께 작동한다.

전형적으로 10배 몰 과량으로 사용된 Fmoc-L-아미노산의 활성화는 실온에서 N-메틸-2-피롤리디논(NMP) 중 0.5M의 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 및 2M의 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 첨가한 [(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트](HBTU, 100mmol/l)로 수행된다.

개별적인 아실화 반응은 45분이 걸리고, 20%의 피페리딘으로 Fmoc 탈보호에는 15분이 걸린다.

하기 아미노산 유도체 및 관련된 직교의(orthogonal) 산-절단 가능한 곁사슬 보호기가 합성에 사용된다:

Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Ala(Trt), L-pGlu, Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Ile, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-L-Met and Fmoc-L-Trp(Boc).

94%의 트리플루오로아세트산(TFA), 3%의 에탄디티올(EDT) 및 3%의 탈염수로 펩티딜 수지로부터 수지 지지체를 절단한 후, 미가공 펩티드는 차가운 tert-부틸 메틸 에테르에 침전되고, 미가공 펩티드는 펠렛으로서 원심분리되고, 상등액은 제거된다.

미가공 펩티드의 후속 크로마토그래피 정제는 구배 용리에 의해 제조 방식(preparative way)으로 수행된다.

EP 2　452　947 A1에 따른 프로트랜스듀진 A 및 프로트랜스듀진 D의 차이는 프로트랜스듀진 D가 본 발명에 따라 Cys2/알라닌으로 치환되어 있다는 사실에 있다. WO 2014/177635 A1에 따른 프로트랜스듀진 B 및 프로트랜스듀진 D의 차이는 프로트랜스듀진 D가 본 발명에 따라 Cys2/알라닌으로 치환되고 합성 L-피로글루탐산(pGlu)이 합성 L-글루타민(Gln)과 교환하여 N-말단에 삽입된다는 사실에 있다. 원래의 글루타민은 고리 폐쇄에 의해 변형되어 락탐을 형성한다.

실시예:

형질도입 효율은 활성화된 CD3+ T세포에서 검사되었다. 5개의 상이한 PTD 배치를 상이한 대조군 및 레트로넥틴에 대해 시험하였다.

형질도입을 위해, 동결보존된 CD4+/CD8+ 풍부한 T세포를 사용하였다. 이것을 해동시키고, CD3/CD28 비드와 함께 3일 동안 배양하였다. 3일 후 비드를 제거한 후, T세포를 GFP 벡터로 형질도입하였고, 이는 생산자 세포주 HG820#4E912#4.3에 의해 수득되었다. 2개의 상이한 MOI가 사용되었다. 이어서 세포를 추가 4일 동안 배양하였다. 7일째에, 누클레오 카운터(Nucleo counter) NC-200을 사용하여 세포 수 및 세포의 생존력을 결정하였다. GFP+ T세포의 비율은 유동 원심분리에 의해 결정되었다.

사전자극(prestimulation), 비드 제거, 형질도입, 팽창

CD4+/CD8+ T세포를 Barkey Plasmatherm 장치를 사용하여 0일에 해동하고 1xPBS로 1회 세척하였다. 세포를 1x10⁶ 생존 세포(viable cells)/ml의 밀도로 450IU/ml IL-7 및 50IU/ml IL-15를 첨가하여 세포 배양 배지 X-vivo 15 + 2mM Glutamax + 5% CTS "면역 세포 혈청 대체(Immune Cell Serum Replacement)"를 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 세포를 활성화시키기 위해, 세포 당 3(세)개의 CD3/CD28 다이나비드(Dynabeads)를 첨가하고, 3일까지 배양하였다.

3일째에, 비드는 Eppendorf의 MixMate와 Baxter의 MaxSep 자석으로 제거되었다. 원심분리에 의해 농축한 후, 세포를 MOI 2 또는 MOI 4의 농도로 GFP 벡터로 형질도입하였다. 대조를 위해, 레트로넥틴과 함께 및 바이러스와 함께 및 첨가없는 형질도입을 수행하였다. 형질도입되지 않은 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다.

상이한 프로트랜스듀진 펩티드를 DMSO에 10mg/ml(스톡 용액)로 용해시켰다. 스톡 용액을 1xPBS로 1mg/ml의 농도로 희석하고, PTD 피브릴이 형성될 수 있도록 적어도 10분 동안 배양하였다. 바이러스 상등액을 배지 및 혈청 대체물(Medium and Serum Replacement)과 혼합하여 필요한 농도를 얻었다. 이어서, 다른 PTD를 첨가하여 50㎍/ml의 농도를 얻었다. 혼합물을 실온에서 최소 5분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 첨가하여 5x10⁵cells/ml의 세포 밀도 및 25μl/ml의 최종 PTD 농도를 수득하였다. 세포를 6-웰 플레이트에서 37℃ 5% CO₂ 및 고습도 하에서 4일까지 16 +/- 4시간 동안 배양하였다.

4일째에, 세포 수 및 생존력이 결정되었고, 이는 이전 유사체와 비교하여 PTD에서 개선된 결과를 산출한다. 세포를 5ml의 세포 배양 배지와 함께 T-25 배양 병으로 옮기고, 37℃ 5% CO₂ 및 고습도 하에서 배양하였다.

5일째에, 10ml의 새로운 세포 배양 배지를 첨가하였다.

7일째에, 각 배양 병의 배양 배지의 부피를 측정하였다. 이어서, FACS 분석에 의해 세포 수, 생존력 및 형질도입 속도를 측정하였다.

세포 수와 생존력 결정

세포 수 및 생존력은 일회용 Via1 카세트를 사용하는 누클레오카운터(NucleoCounter) NC-200에 의해 결정되었다.

유세포 분석기(flow cytometry)에 의한 GFP 발현 결정

GFP+ T세포(CD3+)의 수는 FACSVerse Flow Cytometer에 의해 결정되었다. 측정을 위해, 1.5 x 10⁶ 생존 세포를 1xPBS로 세척하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 1xPBS 300㎕ 및 FVS780 용액 3㎕에 녹였다. 시험 당, 2개의 FACS 튜브가 염색되었다:

튜브 1: GFP/FVS 780/BV421-염색되지 않음(CD3-BV421의 FMO 제어)

튜브 2: GFP/FVS 780/CD3-BV421 [5μl]

각각의 튜브에 대해, 1x10⁶cells를 첨가하고, 15분 동안 어둠 속에서 실온에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 염색 완충제 BSA와 혼합하고 원심 분리하였다. 이어서, 세포를 350㎕의 염색 완충제 BSA에 흡수시키고, 180분 이내에 유세포 분석기에 의해 분석시켰다(anaklysed). T-25 배양 병에서 GFP+ 세포의 절대 수를 계산하기 위해, 결과는 형질도입되지 않은 대조군에 대해 보정되었다.

서열목록

<110> Pharis Biotec GmbH

<120> Protransduzin-D - Improved Enhancer of Gene Transfer

<130> 182448WO

<150> EP17188384.6

<151> 29.08.2017

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> human

<400> 1

Gln Ala Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> human

<400> 2

Ser Asn Asn Ile

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> human

<400> 3

Ser Asn Asn Ile Thr

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> human

<400> 4

Asn Ile Thr Leu

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> human

<400> 5

Asn Asn Ile Thr Leu

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> human

<400> 6

Ser Asn Asn Ile Thr Leu

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> human

<400> 7

Glu Val Gly Lys

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> human

<400> 8

Glu Val Gly Lys Ala

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> human

<400> 9

Glu Val Gly Lys Ala Met

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> human

<400> 10

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> human

<400> 11

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> human

<400> 12

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> human

<400> 13

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> human

<400> 14

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> human

<400> 15

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> human

<400> 16

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> human

<400> 17

Pro Ile Glu Gly

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> human

<400> 18

Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> human

<400> 19

Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> human

<400> 20

Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> human

<400> 21

Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> human

<400> 22

Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> human

<400> 23

Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> human

<400> 24

Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> human

<400> 25

Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> human

<400> 26

Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly

<110> Pharis Biotec GmbH <120> Protransduzin-D - verbesserter Enhancer des Gentransfers <130> 182448WO <150> EP17188384.6 <151> 2017-08-29 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> human <400> 1 Gln Ala Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> human <400> 2 Ser Asn Asn Ile 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 3 Ser Asn Asn Ile Thr 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> human <400> 4 Asn Ile Thr Leu 1 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 5 Asn Asn Ile Thr Leu 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> human <400> 6 Ser Asn Asn Ile Thr Leu 1 5 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> human <400> 7 Glu Val Gly Lys 1 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 8 Glu Val Gly Lys Ala 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> human <400> 9 Glu Val Gly Lys Ala Met 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> human <400> 10 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> human <400> 11 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 12 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 13 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> human <400> 14 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> human <400> 15 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> human <400> 16 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> human <400> 17 Pro Ile Glu Gly 1 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 18 Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> human <400> 19 Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> human <400> 20 Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> human <400> 21 Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 22 Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 23 Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> human <400> 24 Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> human <400> 25 Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> human <400> 26 Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Glu Gly 1 5 10

Claims

다음 서열과 80% 또는 90% 이상의 서열 동일성(sequence identity), 특히 95%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 폴리펩티드:
Z¹-Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Z²,
여기서, Z¹은 폴리펩티드의 N-말단, 또는 서로 독립적으로 Leu 또는 Ser 아미노산, 또는 하기 펩티드를 나타내며:
Ser-Asn, Ser-Asn-Asn, Ser-Asn-Asn-Ile, Ser-Asn-Asn-Ile-Thr, Thr-Leu, Ile-Thr-Leu, Asn-Ile-Thr-Leu, Asn-Asn-Ile-Thr-Leu, 또는 Ser-Asn-Asn-Ile-Thr-Leu,
Z²는 폴리펩티드의 C-말단, 또는 서로 독립적으로 Gly 또는 Glu 아미노산 또는 하기 펩티드를 나타냄:
Glu-Val, Glu-Val-Gly, Glu-Val-Gly-Lys, Glu-Val-Gly-Lys-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu, Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Glu-Gly, Ile-Glu-Gly, Pro-Ile-Glu-Gly, Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly, 또는 Glu-Val-Gly-Lys-Ala-Met-Tyr-Ala-Pro-Pro-Ile-Glu-Gly.
제1항에 있어서, 다음 서열과 90% 이상의 서열 동일성(sequence identity), 특히 95%의 상동성(homology)을 갖는 폴리펩티드:
Gln-Ala-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N-말단은 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸기와 같은 하나 또는 두 개의 알킬기, 아세틸 또는 프로피오닐기와 같은 아실기 또는 N-말단을 형성하는 피로글루탐산(pyroglutamic acid) 아미노산으로 구성된 그룹에서 선택되는 화학기(chemical group)로 변형된 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 함유하는 의약.
유전자 치료(gene therapy)로 치료 가능한 질병을 치료하기 위한 유전자 치료(gene therapy)에 사용하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드.
다음 단계를 포함하는 바이러스에 의한 세포의 감염을 향상시키는 방법:
- 유기용매에 용해된 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제공하는 단계;
- 폴리펩티드의 불용성 응집체를 형성하기 위해 폴리펩티드를 수용액에 첨가하는 단계;
- 마지막 이전 단계(the last preceding step)로부터의 용액을 혼합하는 단계; 및
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 존재 하에서 세포를 배양하는 단계.
바이러스에 의한 세포의 감염을 향상시키기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 함유하는 키트.