KR20200040819A - 항체를 표적화하기 위한 항 ctla-4 프로바디 치료제 - Google Patents

항체를 표적화하기 위한 항 ctla-4 프로바디 치료제 Download PDF

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체타나 라오-나이크
폴 이. 모린
모한 스리니바산
정 린
버지니 라폰트
알라 프리츠커
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Abstract

본 개시내용은 절단가능한 모이어티를 갖는 링커를 통해 중쇄 또는 경쇄 상의 Cys에 부착된 차단 모이어티를 갖는 프로바디에 관한 것이다. 차단 모이어티는 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 억제한다. 절단가능한 모이어티의 절단은 차단 모이어티를 방출시키고, 항체가 그의 항원에 결합하는 능력을 회복시킨다. 항 CTLA-4 항체에 의한 적용.

Description

항체를 표적화하기 위한 항 CTLA-4 프로바디 치료제
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/546,252를 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권 주장하며, 상기 가출원의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본원에 개시된 핵산 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 서열식별번호: 16을 포함하는 파일명 "170731_SEQT_13002WOPCT_YC.txt"의 서열 목록은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 서열 목록은 EFS-Web를 통해 ASCII 텍스트 포맷으로 본원과 함께 제출되었고, 따라서 지면 형태 및 그의 컴퓨터 판독가능한 형태 둘 다를 구성한다. 서열 목록은 2017년 7월 31일에 PatentIn 3.5를 사용하여 처음 생성되었으며, 대략 17 KB 크기이다.
본 출원은 전구약물화가능한 항체, 그의 전구약물, 및 이러한 항체 및 그의 전구약물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
치료 항체는 다양한 질환, 특히 암 및 염증성 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 규제 기관으로부터 시판 승인을 받은 치료 항체의 예는 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®), 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO)®), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)®), 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®), 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)®) 및 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®)을 포함한다. 일반적으로, 치료 항체는 - 다른 항체와 같이 - 그의 치료 작용과 관련된 세포 과정을 개시하기 위해 그의 분자 표적 (항원)에 높은 특이성 및 친화도로 결합함으로써 작용한다.
전구약물은 치료제의 오프-타겟 부작용을 감소시키는데 사용될 수 있다. 전구약물은 덜 활성이지만 표적 조직 또는 기관에서 또는 그 근처에서 활성 치료제로 전환될 수 있는 치료제 버전이다. 통상적으로, 전구약물화는 치료제에 그의 활성을 감소시키는 모이어티를 공유 부착시킴으로써 달성된다. 표적 부위에서 발견되는 인자 또는 작용제 - 낮은 pH, 효소, 무산소증 등 - 에 의해 표적 부위에서 차단 모이어티를 제거함으로써 치료제의 활성을 회복시킨다. 예를 들어, 문헌 [Trouet et al. 2004, Stagliano et al. 2013, Rodeck et al. 2010, 및 Lauermann 2014]을 참조한다.
다른 치료제, 예컨대 소분자 약물의 경우에서와 같이, 치료 항체의 부작용은 질환 치료를 위해 표적화된 조직 또는 기관 이외의 다른 조직 또는 기관에 대한 그의 작용을 방해함으로써 감소 또는 제거되는 것이 바람직하다. 전형적으로, 항체는 도 1에 제시된 바와 같이 Y형 이량체 단백질이고, 각각의 이량체 절반은 중쇄 및 경쇄인 2개의 쇄로 이루어진다. 통상적으로, 2개의 이량체 절반은 동일하고 디술피드 결합에 의해 서로 공유 연결된다. 항체의 그의 항원과의 결합 상호작용은 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)을 통해 일어나며, 이는 각각의 중쇄 및 경쇄 상에서 그의 가변 영역 내에 3개 (CDR1, CDR2 및 CDR3)가 존재한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (도 1에서 각각 VH 및 VL로 표지됨)은 각각의 단백질 쇄의 아미노 말단 근처에 위치한다.
항체의 전구약물화를 위해, VH 및 VL 영역은 항원 상호작용을 담당하는 CDR의 존재로 인해 차단 모이어티의 부착에 대한 잠재적 부위이다. 예를 들어, 문헌 [Polu and Lowman 2014]은 차폐 펩티드를 항체의 경쇄의 N-말단에 부착시킴으로써 항체를 전구약물화하는 것을 개시한다. 항체의 전구약물화에 관련된 다른 개시내용은 문헌 [Stagliano et al. 2016, Williams et al. 2015, Lowman et al. 2014, Lowman et al. 2015b, 및 Daugherty et al. 2015]을 포함한다. 전구약물화된 특이적 항체는 이들 항원: EGFR (Desnoyers et al. 2013, Lowman et al. 2015a, Lowman et al. 2017), JAGGED 1/2 (West et al. 2015), 인터류킨-6 수용체 (West et al. 2016a), 조직 인자 경로 억제제 (Wang et al. 2016), CD3 (Dennis et al. 2016), PDL1 (West et al. 2016b), CD166 (West et al. 2016c), CD71 (Sagert et al. 2016b), PD1 (Tipton et al. 2017), 및 ITGA3 (Sagert et al. 2016a)에 대한 항체를 포함한다.
본원에서 논의된 문헌 중 일부는 제1 저자 또는 발명자 및 공개 연도에 의해 인용된다. 그의 전체 서지정보 인용은 본 명세서의 말미에 참고문헌 섹션에 열거되어 있다.
본 개시내용은 신규 전구약물화된 항체 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 간략하게, 항체는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산이 시스테인 (Cys)으로 부위-특이적 치환됨으로써 변형된다. 치환-도입된 Cys의 측쇄 내의 술프히드릴 (SH) 기는 항체가 그의 항원에 결합하는 능력을 방해하는 차단 모이어티 (BM)를 포함하는 전구약물화 모이어티를 부착시키기 위한 화학적 핸들로서의 역할을 한다. BM은 항체-항원 결합을 입체적으로 억제하는 기일 수 있으며, 항체 또는 항원과 달리 특이적으로 상호작용하지 않는다. 대안적으로, BM은, 예를 들어 정전기 또는 반 데르 발스 힘에 의해 항체와 상호작용할 수 있다. 전구약물화 모이어티는 절단가능한 기를 갖는 링커 모이어티를 추가로 포함하며, 항체의 의도된 작용 부위에서 발견되는 인자에 의한 상기 기의 절단은 차단 모이어티를 방출시키고 항체가 그의 항원에 결합하여 그의 치료 효과를 발휘하는 능력을 회복시킨다. 절단가능한 기는 바람직하게는 의도된 작용 부위에서 또는 그 근처에서 발견되는 인자 - 낮은 pH, 효소, 무산소증 등 (효소가 바람직함)에 의해 절단된다.
일부 경우에, BM은 링커 모이어티의 절단에 의한 그의 방출 후 그 자체의 약리학적 활성을 가질 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 전구약물화된 항체는 말하자면 한번에 2가지 약리학상 활성제: BM 및 항체를 전달할 수 있다.
Cys 치환 부위는 원래 아미노산을 Cys로 대체하는 것이 항체가 그의 항원에 특이적으로 및 강하게 결합하는 능력에 불리하게 영향을 미치지 않도록 선택된다. 추가로, 전구약물화 모이어티의 제거는 Cys에 여전히 공유 부착된 잔류 화학 기를 남길 수 있다. 본 발명자들은 예상외로 이러한 잔류 기가 또한 항체-항원 결합을 방지하지 않는다는 것을 발견하였다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 전구약물화된 항체가 제공된다.
(BM-L)m-Ab (I)
여기서
Ab는 그의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 내의 적어도 1개의 아미노산이 Cys에 의해 대체된 항체이며, 여기서 대체된 아미노산은 (a) 프레임워크 영역 내에 있고; (b) 적어도 30%의 측쇄 노출을 갖고; (c) CDR 아미노산의 10 Å, 바람직하게는 5 Å 이내에 있고;
BM은 Ab가 그의 항원에 결합하는 것을 억제하는 차단 모이어티이고;
각각의 L은 독립적으로 BM 및 Ab에 결합된 링커 모이어티이고, L은 절단가능한 모이어티를 포함하고 상기 Cys에서 Ab에 결합되고;
m은 1, 2, 3 또는 4이다.
바람직한 실시양태에서, 항체 Ab 내의 적어도 1개의 대체된 아미노산은 중쇄 가변 영역의 카바트 위치 1, 3, 5, 19, 23, 25, 43, 46, 68, 72, 74, 75, 76, 82a, 82b, 83, 84, 85 또는 105, 또는 경쇄 가변 영역의 카바트 위치 1, 3, 5, 7, 8, 18, 20, 45, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 69, 77 또는 100에 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 Ab 내의 적어도 1개의 대체된 아미노산은 중쇄의 카바트 위치 23 또는 경쇄의 카바트 위치 67에 있다.
또 다른 실시양태에서, 경쇄의 카바트 위치 67에 Cys를 갖는 항체가 제공된다. 항체는 항-CTLA4 항체 또는 항-CD137 항체일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 중쇄의 카바트 위치 23에 Cys를 갖는 항체가 제공된다. 항체는 항-CTLA4 항체 또는 항-CD137 항체일 수 있다.
도 1은 본원에 개시된 Cys 치환이 이루어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH 및 VL)의 위치를 포함한 항체의 일반적인 아키텍처를 보여준다.
도 2는 본원에 개시된 전구약물화 개념을 예시하기 위해 사용된 항-CLTA4 항체의 중쇄 가변 영역 VH의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)을 보여주며, 서열식별번호: 1과 카바트 시스템에서의 아미노산 넘버링의 상관관계를 나타내고 Cys 치환에 바람직한 위치를 표시하는 주석이 달려있다.
도 3은 도 2의 항-CLTA4 항체의 경쇄 가변 영역 VL의 아미노산 서열 (서열식별번호: 2)을 보여주며, 서열식별번호: 2와 카바트 시스템에서의 아미노산 넘버링의 상관관계를 나타내고 Cys 치환에 바람직한 위치를 표시하는 주석이 달려있다.
도 4는 본원에 개시된 전구약물화 개념을 예시하기 위해 사용된 항-CD137 항체의 중쇄 가변 영역 VH의 아미노산 서열 (서열식별번호: 3)을 보여주며, 서열식별번호: 3과 카바트 시스템에서의 아미노산 넘버링의 상관관계를 나타내고 Cys 치환에 바람직한 위치를 표시하는 주석이 달려있다.
도 5는 도 4의 항-CD137 항체의 경쇄 가변 영역 VL의 아미노산 서열 (서열식별번호: 4)을 보여주며, 서열식별번호: 4와 카바트 시스템에서의 아미노산 넘버링의 상관관계를 나타내고 Cys 치환에 바람직한 위치를 표시하는 주석이 달려있다.
도 6, 도 7, 도 8 및 도 9는 본 발명의 다양한 화합물의 MALDI 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 10a 및 도 10b는 30% 초과의 노출을 갖고 CDR 아미노산의 5 (또는 10) Å 이내에 있는, 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄 내의 Cys 치환 부위를 보여주며, 상기 부위는 카바트 넘버링을 사용하여 확인된다.
도 11a, 도 11b, 도 11c, 도 11d 및 도 11e는 중쇄 또는 경쇄의 다양한 위치에서 전구약물화된 항-CTLA4 항체에 의한 활성화된 CD4+ T-세포에의 결합에 대한 전구약물화 및 후속 전구약물화 기 제거의 효과를 보여준다.
도 12a, 도 12b, 도 13a 및 도 13b는 PBMC 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 CTLA4 항체의 전구약물화 및 탈-전구약물화의 효과를 보여준다.
도 14, 도 15a 및 도 15b는 CD137 항체의 활성에 대한 전구약물화의 효과를 보여준다.
정의
"항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄 변이체를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 3개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL 또는 Vk) 및 1개의 단일 도메인인 CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역 (FR)이 점재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 항체가 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 6 x 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 3 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 항원 X에 결합하는 경우에, 항원 X에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. 항체는 키메라, 인간화, 또는 바람직하게는, 인간일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 글리코실화 유형 또는 정도에 영향을 미치거나, 항체 반감기를 연장시키거나, 이펙터 세포 또는 보체계와의 상호작용을 증진 또는 감소시키거나, 또는 일부 다른 특성을 조정하기 위해 조작될 수 있다. 조작은 1개 이상의 아미노산의 대체, 부가 또는 결실에 의해, 또는 도메인의 또 다른 이뮤노글로불린 유형으로부터의 도메인으로의 대체에 의해, 또는 상기의 조합에 의해 달성될 수 있다.
항체의 "항원 결합 단편" 및 "항원 결합 부분" (또는 간단하게 "항체 부분" 또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 예컨대 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편 (예를 들어, 문헌 [Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', Fv 및 Fd 단편이다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv 또는 (scFv)로 공지됨)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수도 있다; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄된다.
달리 나타내지 않는 한 - 예를 들어 서열식별번호 목록에서의 넘버링을 참조하여 - 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 (VH 또는 VL) 내의 아미노산 위치의 넘버링에 대한 언급은 카바트 시스템 (문헌 [Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991], 이하에서 "카바트")에 따르고, 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 (CH1, CH2, CH3 또는 CL) 내의 아미노산 위치의 넘버링에 대한 언급은 카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다. US 2008/0248028 A1 (Lazar et al.)을 참조하며, 이의 개시내용, 예를 들어 이러한 용법의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 추가로, 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) 정보 시스템 (IMGT)은 그의 웹사이트에 "IMGT 과학적 차트: C 넘버링 사이의 상응도"라는 표제의 표를 제공하며, 이는 중쇄 불변 영역에 대한 그의 넘버링 시스템, EU 넘버링 및 카바트 넘버링 사이의 상응도를 보여준다. 예를 들어, US 2008/0248028 A1 (2008) (Lazar et al.)을 참조한다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다 (예를 들어, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 항원 X 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 항원 X 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 항체는 인간 항원 X에 특이적으로 결합하고, 다른 (비-인간) 항원 X 항원과는 교차-반응하지 않는다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
"모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는, 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 의미한다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다 (및 존재하는 경우에 불변 영역)가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체는 천연 또는 합성 변형을 포함한 후기 변형을 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상으로 그라프팅된 것인 항체는 포함하지 않는다.
"인간 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내며 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"지방족"은 명시된 수의 탄소 원자를 갖거나 (예를 들어, "C3 지방족", "C1-5 지방족", "C1-C5 지방족" 또는 "C1 내지 C5 지방족"에서와 같으며, 후자 3개의 어구는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모이어티에 대한 동의어임) 또는 탄소 원자의 수가 명확하게 명시되지 않은 경우에는 1 내지 4개의 탄소 원자 (불포화 지방족 모이어티의 경우에는 2 내지 4개의 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. 유사한 이해가 C2-4 알켄, C4-C7 시클로지방족 등에서와 같은 다른 유형에서의 탄소의 수에 적용된다. 유사한 맥락에서, "(CH2)1-3"과 같은 용어는 아래첨자가 1, 2 또는 3인 것에 대한 약칭으로서 이해되어야 하며, 따라서 이러한 용어는 CH2, CH2CH2 및 CH2CH2CH2를 나타낸다.
"알킬"은 포화 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C1-C4 알킬 모이어티는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸, 1-부틸, 2-부틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "알킬렌"은 알킬 기의 2가 대응물, 예컨대 CH2CH2, CH2CH2CH2 및 CH2CH2CH2CH2를 의미한다.
"알케닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C2-C4 알케닐 모이어티는 에테닐 (비닐), 2-프로페닐 (알릴 또는 프로프-2-에닐), 시스-1-프로페닐, 트랜스-1-프로페닐, E- (또는 Z-) 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐 (부트-1,3-디에닐) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C2-C4 알키닐 기는 에티닐 (아세틸레닐), 프로파르길 (프로프-2-이닐), 1-프로피닐, 부트-2-이닐 등을 포함한다.
"시클로지방족"은 1 내지 3개의 고리를 가지며, 각각의 고리가 3 내지 8개 (바람직하게는 3 내지 6개)의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. "시클로알킬"은 각각의 고리가 포화된 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알케닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알키닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, 시클로지방족 모이어티는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸 및 아다만틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 시클로알킬 모이어티, 특히 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이다. "시클로알킬렌"은 시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"헤테로시클로지방족"은 그의 적어도 1개의 고리 내에서, 3개 이하 (바람직하게는 1 내지 2개)의 탄소가 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 대체된 것인 시클로지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 5- 내지 6-원 크기인 1개의 고리로 이루어진다. 유사하게, "헤테로시클로알킬", "헤테로시클로알케닐" 및 "헤테로시클로알키닐"은 그의 적어도 1개의 고리가 이렇게 변형된, 각각 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 시클로알키닐 모이어티를 의미한다. 예시적인 헤테로시클로지방족 모이어티는 아지리디닐, 아제티디닐, 1,3-디옥사닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로티오피라닐 술폰, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 술폭시드, 티오모르폴리닐 술폰, 1,3-디옥솔라닐, 테트라히드로-1,1-디옥소티에닐, 1,4-디옥사닐, 티에타닐 등을 포함한다. "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"알콕시", "아릴옥시", "알킬티오" 및 "아릴티오"는 각각 -O(알킬), -O(아릴), -S(알킬) 및 -S(아릴)을 의미한다. 예는 각각 메톡시, 페녹시, 메틸티오 및 페닐티오이다.
보다 좁은 의미가 지시되지 않는 한, "할로겐" 또는 "할로"는 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 의미한다.
"아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 방향족인 모노-, 비- 또는 트리시클릭 고리계 (바람직하게는 모노시클릭)를 갖는 탄화수소 모이어티를 의미한다. 고리계 내의 고리는 서로 융합될 수 있거나 (나프틸에서와 같음) 또는 서로 결합될 수 있으며 (비페닐에서와 같음), 비-방향족 고리에 융합 또는 결합될 수 있다 (인다닐 또는 시클로헥실페닐에서와 같음). 추가 예시로서, 아릴 모이어티는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 비페닐, 페난트릴, 안트라세닐 및 아세나프틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물, 예를 들어 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌 또는 1,4-페닐렌을 의미한다.
"헤테로아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리인 모노-, 비- 또는 트리시클릭 고리계 (바람직하게는 5- 내지 7-원 모노시클릭)를 갖는 모이어티를 의미하며, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있다. 이러한 적어도 1개의 헤테로원자 함유 방향족 고리는 다른 유형의 고리에 융합될 수 있거나 (벤조푸라닐 또는 테트라히드로이소퀴놀릴에서와 같음) 또는 다른 유형의 고리에 직접 결합될 수 있다 (페닐피리딜 또는 2-시클로펜틸피리딜에서와 같음). 추가 예시로서, 헤테로아릴 모이어티는 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐 (티에닐), 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 퀴노잘리닐, 나프티리디닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티오페닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 페노티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 디벤조푸라닐, 카르바졸릴, 디벤조티오페닐, 아크리디닐 등을 포함한다. "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴 기의 2가 대응물을 의미한다.
"비치환 또는 치환된 C1-C5 알킬" 또는 "임의로 치환된 헤테로아릴"에서와 같은 "비치환 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된" 어구의 사용에 의해서와 같이 모이어티가 치환될 수 있는 것으로 나타낸 경우에, 이러한 모이어티는 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 5개 수, 보다 바람직하게는 1 또는 2개 수의 독립적으로 선택된 치환기를 가질 수 있다. 치환기 및 치환 패턴은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 치환기가 부착되는 모이어티를 고려하여, 화학적으로 안정하고 관련 기술분야에 공지된 기술뿐만 아니라 본원에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있는 화합물을 제공하도록 선택될 수 있다. 모이어티가 "비치환 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된" 것으로 확인되는 경우에, 바람직한 실시양태에서 이러한 모이어티는 비치환된다.
"아릴알킬", "(헤테로시클로지방족)알킬", "아릴알케닐", "아릴알키닐", "비아릴알킬" 등은, 예를 들어 벤질, 페네틸, N-이미다조일에틸, N-모르폴리노에틸 등에서와 같이, 경우에 따라 알킬, 알케닐 또는 알키닐 모이어티에서 개방 (비충족) 원자가를 갖는, 경우에 따라 아릴, 헤테로시클로지방족, 비아릴 등의 모이어티로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 모이어티를 의미한다. 반대로, "알킬아릴", "알케닐시클로알킬" 등은, 경우에 따라 예를 들어 메틸페닐 (톨릴) 또는 알릴시클로헥실에서와 같이, 경우에 따라 알킬, 알케닐 등의 모이어티로 치환된 아릴, 시클로알킬 등의 모이어티를 의미한다. "히드록시알킬", "할로알킬", "알킬아릴", "시아노아릴" 등은, 경우에 따라 확인된 치환기 (경우에 따라 히드록실, 할로 등) 중 1개 이상으로 치환된 알킬, 아릴 등의 모이어티를 의미한다.
예를 들어, 허용되는 치환기는 알킬 (특히 메틸 또는 에틸), 알케닐 (특히 알릴), 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로 (특히 플루오로), 할로알킬 (특히 트리플루오로메틸), 히드록실, 히드록시알킬 (특히 히드록시에틸), 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬) (특히 -OCF3), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), -SO2N(알킬)2 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치환될 모이어티가 지방족 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(=O)알킬, -S(시클로알킬), -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(아릴), =O, =NOH, =NO(알킬), -OC(=O)(알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. 페닐, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, C1-C4알콕시, O(C2-C4 알킬렌)OH, 및 O(C2-C4 알킬렌)할로가 특히 바람직하다.
치환될 모이어티가 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(아릴), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), 알킬티오, 아릴티오, -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. C1-C4 알킬, 시아노, 니트로, 할로, 및 C1-C4알콕시가 특히 바람직하다.
"C1-C5 알킬" 또는 "5 내지 10%"에서와 같이 범위가 언급된 경우에, 이러한 범위는 첫 번째 경우에서는 C1 및 C5 및 두 번째 경우에서는 5% 및 10%와 같은 범위의 종점을 포함한다.
특정한 입체이성질체가 구체적으로 (예를 들어, 구조 화학식에서의 관련 입체중심에서 굵은선 또는 파선 결합에 의해, 구조 화학식에서 E 또는 Z 배위를 갖는 것으로서의 이중 결합의 도시에 의해, 또는 입체화학-지정 명명법 사용에 의해) 나타나 있지 않은 한, 모든 입체이성질체는 순수한 화합물뿐만 아니라 그의 혼합물로서 본 발명의 범주 내에 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 및 그의 조합 및 혼합물은 모두 본 발명에 의해 포괄된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 화합물이 본원에 사용된 구조 화학식에 도시된 것들과 등가인 호변이성질체 형태 (예를 들어, 케토 및 엔올 형태), 공명 형태 및 쯔비터이온 형태를 가질 수 있다는 것 및 구조 화학식이 이러한 호변이성질체, 공명 또는 쯔비터이온 형태를 포괄한다는 것을 인지할 것이다.
"제약상 허용되는 에스테르"는 생체내에서 (예를 들어 인간 신체에서) 가수분해되어 모 화합물 또는 그의 염을 생산하거나, 또는 그 자체로 모 화합물의 것과 유사한 활성을 갖는 에스테르를 의미한다. 적합한 에스테르는 C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐 또는 C2-C5 알키닐 에스테르, 특히 메틸, 에틸 또는 n-프로필을 포함한다.
"제약상 허용되는 염"은 제약 제제에 적합한 화합물의 염을 의미한다. 화합물이 1개 이상의 염기성 기를 갖는 경우에, 염은 산 부가염, 예컨대 술페이트, 히드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 말레에이트, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 파모에이트 (엠보네이트), 히드로아이오다이드, 니트레이트, 히드로클로라이드, 락테이트, 메틸술페이트, 푸마레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 메실레이트, 락토비오네이트, 수베레이트, 토실레이트 등일 수 있다. 화합물이 1개 이상의 산성 기를 갖는 경우에, 염은 칼슘 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 메글루민 염, 암모늄 염, 아연 염, 피페라진 염, 트로메타민 염, 리튬 염, 콜린 염, 디에틸아민 염, 4-페닐시클로헥실아민 염, 벤자틴 염, 나트륨 염, 테트라메틸암모늄 염 등과 같은 염일 수 있다. 다형성 결정질 형태 및 용매화물은 본 발명의 범주 내에 또한 포괄된다.
본 명세서의 화학식에서, 결합을 가로지르는 파상선 (
Figure pct00001
) 또는 결합의 말단에서의 별표 (*)는 공유 부착 부위를 나타낸다. 예를 들어, R이
Figure pct00002
이거나 또는 R이 화학식
Figure pct00003
에서의
Figure pct00004
라는 언급은
Figure pct00005
를 의미한다.
본 명세서의 화학식에서, 방향족 고리를 그의 2개의 탄소 사이에서 가로지르는 결합은 결합에 부착된 기가 방향족 고리의 임의의 이용가능한 위치에 위치될 수 있다는 것을 의미한다. 예시로서, 화학식
Figure pct00006
는
Figure pct00007
를 나타낸다.
실시양태
서열식별번호: 1 (여기서 Xaa는 Ala임) 및 서열식별번호: 2 (여기서 Xaa는 Ser임)는 본원에 개시된 전구약물화 개념을 예시하기 위해 VH 또는 VL 영역 내의 Cys 치환이 이루어질 수 있는 인간 항-CTLA4 항체 (이하 "CTLA4 Ab")의 각각 전장 중쇄 및 경쇄 (카파) 아미노산 서열을 제공한다. 그의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 도 2 및 도 3에 제시되어 있고, 여기서 주석은 아미노산의 서열식별번호와 카바트 넘버링의 상관관계를 나타내고 Cys 치환에 바람직한 위치를 보여준다. CTLA4 Ab에서, 2개의 중쇄는 서로 동일하고, 2개의 경쇄는 서로 동일하다.
서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4는 본원에 개시된 전구약물화 개념을 예시하기 위해 VH 또는 VL 영역 내의 Cys 치환이 이루어질 수 있는 항-CD137 항체 (이하 "CD137 Ab")의 각각 전장 중쇄 및 경쇄 (카파) 아미노산 서열을 제공한다. 그의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 도 4 및 도 5에 제시되어 있고, 여기서 주석은 아미노산의 서열식별번호와 카바트 넘버링의 상관관계를 나타내고 Cys 치환에 바람직한 위치를 보여준다. CD137 Ab에서, 2개의 중쇄는 서로 동일하고, 2개의 경쇄는 서로 동일하다. CD137 Ab는 래트 가변 중쇄 및 경쇄 영역 및 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 키메라 항체이다.
본 발명의 전구약물화된 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 본 발명의 전구약물화된 항체는 키메라, 인간화 또는 인간, 바람직하게는 인간일 수 있다.
Cys로의 치환을 위한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 적합한 아미노산은 측쇄가 용매 노출되어 - 바람직하게는 적어도 30% 노출되어 - 치환-도입된 Cys가 차단 모이어티 BM의 부착에 접근가능하도록 하는 프레임워크 아미노산이다. 치환-제거된 아미노산이 CDR 아미노산 근처에 있어서 BM이 항체-항원 결합을 효과적으로 방해할 수 있도록 하는 것이 또한 중요하다. 10 Å 이하의 거리가 바람직하고, 5 Å 이하의 거리가 보다 바람직하다.
Cys 치환을 위한 바람직한 위치는 카바트에 따라 넘버링시, 중쇄 가변 영역 내의 위치 23 및 경쇄 가변 영역 내의 위치 67을 포함한다. 두 위치는 각각의 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 존재한다. Cys는 관련 기술분야에 널리 공지된 부위-특이적 치환 기술에 의해 이들 위치로 치환될 수 있다. 제1 부위에서의 치환은, 약칭 표기법을 사용하여, VL X67C (여기서 X는 치환-제거된 아미노산을 나타냄)로서 지칭될 수 있다. 천연 항체에서, 이러한 부위는 고도로 보존되고 종종 Ser이다. 제2 부위에서의 치환은 유사하게 VH X23C로 지칭될 수 있다.
본 발명의 전구약물화된 항체는 VH 영역 또는 VL 영역 또는 둘 다에서 치환을 가질 수 있다. 항체가 이들 치환 중 하나만을 갖는 경우, 부착될 수 있는 차단 모이어티-링커 화합물의 이론적 최대 개수는 2개이며, 전구약물화된 항체 제제는 부착 과정에서의 화학적 비효율성을 반영하는 더 낮은 개수에 대해서도 통계적으로 검정될 수 있다. 항체가 두 치환을 갖는 경우, 이론적 최대 개수는 4개이다.
본 발명이 전형적 구성 (즉, 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄)의 항체로 입증되었지만, 이는 또한 2개의 상이한 중쇄 및 경쇄 쌍을 갖는 이중특이적 항체에 적용가능하다. 따라서, 본 발명의 전구약물화된 항체는 하나의 중쇄/경쇄 쌍만이 전구약물화된 이중특이적 항체 또는 두 중쇄/경쇄 쌍이 전구약물화된 이중특이적 항체일 수 있다.
항체-약물 접합체를 제조하기 위해 말레이미드 부가 화학에 의한 접합에 적용가능한 술프히드릴 측쇄를 도입하기 위한 목적으로 VH 또는 VL 영역 내의 아미노산을 Cys로 치환하는 것이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Eigenbrot et al. 2007 및 Bhakta et al. 2016]을 참조한다.
한 실시양태에서, 전구약물화될 수 있는 항체 및 그로부터 제조되고 경쇄의 카바트 위치 67에 Cys를 갖는 전구약물화된 항체는 항-CTLA4 항체이고, 바람직하게는 하기를 갖는다:
(a) 서열식별번호: 1의 아미노산 31-35를 포함하는 중쇄 CDR1;
(b) 서열식별번호: 1의 아미노산 50-66을 포함하는 중쇄 CDR2;
(c) 서열식별번호: 1의 아미노산 99-107을 포함하는 중쇄 CDR3;
(d) 서열식별번호: 2의 아미노산 24-35를 포함하는 경쇄 CDR1;
(e) 서열식별번호: 2의 아미노산 51-57을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 2의 아미노산 90-98을 포함하는 경쇄 CDR3.
보다 바람직하게, 항-CTLA4 항체는 서열식별번호: 1 (여기서 Xaa는 Ala임)의 아미노산 1-118을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 2 (여기서 Xaa는 Cys임)의 아미노산 1-108을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 전구약물화될 수 있는 항체 및 그로부터 제조되고 중쇄의 카바트 위치 23에 Cys를 갖는 전구약물화된 항체는 항-CTLA4 항체이고, 바람직하게는 하기를 갖는다:
(a) 서열식별번호: 1의 아미노산 31-35를 포함하는 중쇄 CDR1;
(b) 서열식별번호: 1의 아미노산 50-66을 포함하는 중쇄 CDR2;
(c) 서열식별번호: 1의 아미노산 99-107을 포함하는 중쇄 CDR3;
(d) 서열식별번호: 2의 아미노산 24-35를 포함하는 경쇄 CDR1;
(e) 서열식별번호: 2의 아미노산 51-57을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 2의 아미노산 90-98을 포함하는 경쇄 CDR3.
보다 바람직하게, 항-CTLA4 항체는 서열식별번호: 1 (여기서 Xaa는 Cys임)의 아미노산 1-118을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 2 (여기서 Xaa는 Ser임)의 아미노산 1-108을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
한 실시양태에서, 전구약물화가능한 항-CTLA4 항체 및 그로부터 제조된 전구약물화된 항체는 IgG1 이소형의 것이다. 바람직하게는, 이는 R214 (EU 인덱스 넘버링; 서열식별번호: 1 내의 아미노산 215), E356 (EU 인덱스 넘버링; 서열식별번호: 1 내의 아미노산 357), 및 M358 (EU 인덱스 넘버링; 서열식별번호: 1 내의 아미노산 359)의 동종이형 조합을 갖고, 이러한 조합은 백인 집단에서 공통적이다.
한 실시양태에서, 링커는 건강한 조직 또는 기관과 비교하여 이환된 조직 또는 기관에서 독특하게 발현 또는 과다발현되는 효소 (프로테아제)에 의해 절단가능한 - 즉, 그에 대한 기질인 - 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 효소는 이환된 조직 또는 기관의 세포외 환경에서 발견된다. 이러한 프로테아제의 예는 하기를 포함한다: 아스파르테이트 프로테아제 (예를 들어, 레닌), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 아스파르트산 카텝신 (예를 들어, 카텝신 D, 카스파제 1, 카스파제 2 등), 시스테인 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B), 시스테인 프로테아제 (예를 들어, 레구마인), 디스인테그린/메탈로프로테이나제 (ADAM, 예를 들어, ADAM8, ADAM9), 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린/메탈로프로테이나제 (ADAMTS, 예를 들어, ADAMTS1), 내재성 막 세린 프로테아제 (예를 들어, 매트립타제 2, MT-SP1/매트립타제, TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4), 칼리크레인-관련 펩티다제 (KLK, 예를 들어 KLK4, KLK5), 매트릭스 메탈로프로테아제 (예를 들어, MMP-1, MMP-2, MMP-9), 및 세린 프로테아제 (예를 들어, 카텝신 A, 응고 인자 프로테아제, 예컨대 엘라스타제, 플라스민, 트롬빈, PSA, uPA, 인자 VIIa, 인자 Xa, 및 HCV NS3/4). 바람직하게는, 프로테아제는 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 (uPA, 우로키나제), MT-SP1/매트립타제, 레구마인, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제 (특히 MMP-1, MMP-2, 및 MMP-9)이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 효소 및 상응하는 절단가능한 펩티드의 선택이 치료될 질환 및 이환된 조직 또는 기관에 의해 발현된 프로테아제(들)에 좌우될 것임을 인지할 것이다.
폴리펩티드 기질-효소 쌍의 예가 표 I에 제공된다.
Figure pct00008
바람직하게는, 절단가능한 펩티드는 LSGRSDNH (서열식별번호: 5), LSGX (서열식별번호: 16) 또는 LSGK (서열식별번호: 16)이다.
적합한 프로테아제 및/또는 그의 기질의 개시내용은 하기를 포함한다: 문헌 [Desnoyers et al. 2013; Stagliano et al. 2013; Stagliano et al. 2014; Waldmann et al. 2013; Lauermann et al. 2014; Lowman et al. 2014; Daugherty et al. 2015; Lowman et al. 2015a; Lowman et al. 2015b; Moore et al. 2015; West et al. 2016a; Wang et al. 2016; Moore et al. 2016; Moore et al. 2017; 및 Dennis et al. 2016]; 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨.
전구약물화된 항체의 그의 항원과의 활성을 방해하거나 차단하는데 사용될 수 있는 차단 모이어티 BM은 하기를 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 알부민 결합 폴리펩티드, 애드넥틴, 펩티드 및 가용성 구상 단백질, 예컨대 알부민 또는 피브리노겐.
한 실시양태에서, BM은 적어도 약 2 kDa의 분자량을 갖는 PEG이고, 2 kDa은 약 45개의 -(CH2CH2O)- 반복 단위를 갖는 PEG에 상응하고, 바람직하게는 적어도 약 5 kDa의 분자량을 갖는 PEG이고, 5 kDa은 약 115개의 -(CH2CH2O)- 반복 단위를 갖는 PEG에 상응한다.
48개의 -(CH2CH2O)- 반복 단위를 갖는 아민-종결 PEG (CAS 등록 번호 32130-27-1)는 퀀타 바이오디자인 리미티드(Quanta Biodesign Ltd.)로부터 입수가능하다. 공칭 분자량 5 kDa을 갖는 아민-종결 PEG는 NOF 아메리카 코포레이션(NOF America Corp.)으로부터 입수가능하다 (CAS 등록 번호 116164-53-5). MALDI-TOF-MS 분석을 사용하여, 본 발명자들은 그것이 약 4.4 kDa 내지 약 6.6 kDa의 분자량 분포를 가지며, 약 100 내지 약 155개의 -(CH2CH2O)- 반복 단위에 상응한다는 것을 결정하였다. 공칭 분자량 10 kDa을 갖는 아민-종결 PEG는 NOF 아메리카 코포레이션으로부터 입수가능하다 (CAS 등록 번호 또한 116164-53-5). MALDI-TOF-MS 분석을 사용하여, 본 발명자들은 그것이 약 9.0 kDa 내지 약 12.0 kDa의 분자량 분포를 가지며, 약 205 내지 약 275개의 -(CH2CH2O)- 반복 단위에 상응한다는 것을 결정하였다. 말단 아민 기는 링커 모이어티에의 부착을 위한 화학적 관능기를 제공한다.
이들 및 다른 차단 모이어티 BM의 개시내용은 하기를 포함한다: 문헌 [Tomasi et al. 1988; Trouet et al. 2004; Waldmann et al. 2014; Lauermann et al. 2014; Lowman et al.2014; Daugherty et al. 2015; Lowman et al. 2015a; West et al. 2016a; 및 Wang et al. 2016]; 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨.
본원 상기에 기재된 바와 같은 Cys를 갖는 항체는 하기 제시된 바와 같이 Cys 술프히드릴 (SH)의 마이클 부가에 의해 말레이미드 말단 기를 갖는 차단 모이어티-링커 모이어티 화합물에 접합될 수 있다. 이러한 접합을 위한 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고; 예를 들어, WO2017/112624 A1 (2017) (Shepard et al.)을 참조한다.
Figure pct00009
항체를 전구약물화는데 상기와 같이 사용될 수 있는 말레이미드 종결 차단 모이어티-링커 화합물의 예는 화학식 (Ia)-(Ih)에 따른 화합물을 포함하고, 이들 각각은 효소 매트립타제에 의해 절단가능한 펩티드를 포함한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
항체와 상기 차단 모이어티-링커 화합물 (Ia)-(Ih)와의 접합은 각각 화학식 (IIa)-(IIh)에 따른 전구약물화된 항체를 제공하며, 여기서 Ab는 상기 정의된 바와 같은 항체이고, m은 1, 2, 3 또는 4이다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 시간 경과에 따라, 말레이미드 기에 대한 티올 부가로부터 생성된 초기 형성된 숙신이미드 구조가 가수분해적으로 고리-개방되어 세코 형태가 될 수 있다는 것 및 숙신이미드와 세코 형태는 기능적으로 동등하다는 것을 인지할 것이다.
Figure pct00017
상기 구조 중 일부로부터 식별될 수 있는 바와 같이, 효소적으로 절단가능한 펩티드는 자기-희생 기와 조합되어 사용될 수 있다. 간략하게, 자기-희생 기의 기능은 펩티드와 항체, 링커 또는 차단 모이어티의 다른 부분 사이의 분리를 제공하여, 이들 중 어느 것도 절단 효소의 작용을 방해하지 않도록 하는 것이다. 절단이 일어난 후, 자기-희생 기는 자기-제거 반응을 겪는다. 자기-희생 기의 용도 및 구조는 US9,527,871 B2 (2016) (Zhang et al.)에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 자기-희생 기는 p-아미노벤질 옥시카르보닐 (PABC) 기이며, 이의 구조는 하기에 제시된다.
Figure pct00018
그의 작용 방식은 하기 반응 순서에 예시된다:
Figure pct00019
상기 반응 순서로부터 알 수 있는 바와 같이, 차단 모이어티-링커에 대한 Cys 결합이 그에 부착된 숙신이미드 잔기 (또는 그의 개환 유도체)에 남아있다는 점에서 펩티드의 절단은 항체 Ab를 그의 원래 구조로 회복시키지 않는다. 이는 자기-희생 기가 사용되었든지 또는 사용되지 않았든지에 관계없이 적용된다. 본 발명자들은 예상외로 숙신이미드 잔기가 항체의 항원 결합 활성의 회복을 방지하지 않는다는 것을 발견하였다.
실시예
본 발명의 실시는 추가로 하기 실시예를 참조하여 이해될 수 있고, 이는 제한이 아니라 예시로 제공된다.
실시예 1 - 화합물 (Ia)
프로테인 테크놀로지스(Protein Technologies)의 프리루드(PRELUDE)™ 펩티드 합성기를 사용하여 표준 Fmoc 화학을 사용하여 선형 전구체를 제조하였다.
Figure pct00020
수지 로딩: 디클로로메탄 (DCM, 18.58 mL) 중 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (3.34 mmol, 1.567 g) 및 디이소프로필에틸 아민 (DIPEA, 8.36 mmol, 1.457 mL)을 바이오라드(Biorad) 정제용 칼럼 내의 2-클로로트리틸 수지 (1.5 mmol/g, 2.79 mmol, 1.81 g, DCM으로 사전-팽윤됨)에 첨가하였다. 수지를 실온 (RT)에서 18시간 동안 진탕시켰다. 용매를 여과에 의해 제거하고, 고체 수지를 DCM (5 x 10 mL)으로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켜 수지 1 (2.713 g, 로딩 0.81 mmol/g)을 수득하였다.
Figure pct00021
프리루드™ 장치 상에서의 표준 아미노산 커플링: 수지를 상부 세척 기능에 의해 DMF로 팽윤시키고 (8 mL x 10분), 30초마다 N2의 완만한 스트림과 혼합하였다. 용매를 배수시키고, 수지를 N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘의 용액으로 세척하고 (DMF, 세척당 5분에 걸쳐 10 mL x 2), 30초마다 N2의 완만한 스트림과 혼합하였다. 수지를 DMF로 세척하였다 (세척당 60초에 걸쳐 15 mL x 6). Fmoc 보호된 아미노산을 수지에 첨가하고 (Fmoc-AA, DMF 중 0.1 M 용액, 3 당량), 이어서 HATU (DMF 중 0.2M 용액, 3 당량) 및 N-메틸 모르폴린 (DMF 중 0.8 M, 5 당량)을 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 60분 동안 질소의 완만한 스트림에 의해 교반하였다.
이러한 표준 절차를 P4-P1 커플링에 사용하였다. 최종 P1 아미노산의 커플링 후 및 Fmoc 기의 제거 후에, 수지를 아세트산 무수물/DIPEA/DMF의 용액으로 캡핑하였다 (1:1:3, 10분에 걸쳐 5 mL x 2). 수지 - Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (P5) - Fmoc-L-Gly-OH (P4) - Fmoc-L-Ser (트리틸)-OH (P3) - Fmoc-Leu-OH (P2) - Fmoc-Glu-OAll (P1)
Figure pct00022
화합물 3. 수지 2 (0.956 g, 1.0 mmol)를 DCM (16 ml)과 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (HFP, 4 ml)의 혼합물로 처리하고, 실온에서 10분 동안 진탕시켰다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 수지를 추가의 DCM (16 ml) 및 HFP (4 mL)로 처리하고, 10분 동안 진탕시켰다. 혼합물을 여과하였다. 합한 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 이 물질을 DCM에 녹이고, 진공 하에 농축시켜 (4x), N2-N-(((S)-4-아세트아미도-5-(알릴옥시)-5-옥소펜타노일)-L-류실)-O-트리틸-L-세릴글리실-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신을 수득하였다. MS(ESI+) (M + H)+ 957.8
Figure pct00023
화합물 4. DMF 중 펩티드 3의 용액 (2.5 ml)에 2,4,6-콜리딘 (198 μl, 1.5 mmol)에 이어서 (4-아미노페닐)메탄올 (148 mg, 1.2 mmol) 및 HATU (456 mg, 1.2 mmol)를 첨가하였다. 투명한 오렌지색 용액을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 H2O (50 mL)의 교반 플라스크에 첨가하고, 생성된 침전물을 진공 여과에 의해 수집하였다 (3 x 10 mL H2O로 세척함) . 프릿 상에서 공기 건조시킨 후, 고체를 Et2O (3 x 10 mL)로 세척하였다. 이어서, 고체를 DCM과 MeOH의 혼합물 (총 ~100 mL) 중에 용해시키고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 알릴 N2-아세틸-N5-((S)-1-(((S)-1-((2-(((S)-6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-1-옥소-3-(트리틸옥시)프로판-2-일)아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)-L-글루타미네이트 (785 mg, 0.739 mmol, 73.9% 수율)를 갈색 고체로서 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1061.8 (M + H)+.
Figure pct00024
화합물 5. DMF (3695 μl) 중 중간체 4 (785 mg, 0.739 mmol)의 용액에 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (337 mg, 1.108 mmol) 및 DIPEA (193 μl, 1.108 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물에 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 히드로클로라이드 (261 mg, 1.478 mmol) 및 DIPEA (386 μL, 2.217 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 이를 Et2O (50 mL)에 첨가하였다. 생성된 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, Et2O (2 x 5 mL)로 세척하여, 알릴 N2-아세틸-N5-((S)-1-(((S)-1-((2-(((S)-6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-((4-((((2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)카르바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-1-옥소-3-(트리틸옥시)프로판-2-일)아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)-L-글루타미네이트 (1.1 g)를 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1228.7 (M + H)+.
Figure pct00025
화합물 6. MeCN (6109 μl)과 H2O (1527 μl)의 혼합물 중 중간체 5 (938 mg, 0.764 mmol)의 탈기된 용액에 아세트산 (218 μl, 3.82 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (337 μl, 3.05 mmol)에 이어서 아세트산팔라듐(II) (86 mg, 0.382 mmol) 및 트리페닐포스핀-3,3',3"-트리술폰산 삼나트륨 염 (434 mg, 0.764 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 역상 플래쉬 크로마토그래피 (50 g 레디셉 골드 C18 칼럼; 24분에 걸쳐 선형 구배 20-100% B-A; A = 0.05% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.05% v/v TFA 함유 5% H2O-MeCN)에 의해 정제하여 N2-아세틸-N5-((S)-1-(((S)-1-((2-(((S)-6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-((4-((((2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)카르바모일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-1-옥소-3-(트리틸옥시)프로판-2-일)아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)-L-글루타민 (286 mg)을 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1187.6 (M + H)+.
Figure pct00026
화합물 7. DMF (3008 μl) 중 중간체 6 (286 mg, 0.241 mmol)의 용액에 HATU (101 mg, 0.265 mmol)에 이어서 m-dPEG48-아민 (퀀타 바이오디자인, CAS# 32130-271, 568 mg, 0.265 mmol) 및 DIPEA (84 μl, 0.481 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 역상 플래쉬 크로마토그래피 (50 g 레디셉 골드 C18 칼럼; 선형 구배 10-100% B-A; A = 0.05% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.05% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O)에 의해 정제하여 화합물 7 (509 mg)을 수득하였다.
Figure pct00027
화합물 (Ia). DCM (724 μl) 중 화합물 7 (150 mg, 0.045 mmol)의 용액에 TFA (181 μl)에 이어서 트리이소프로필실란 (13.94 μl, 0.068 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 농축시키고, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 25분에 걸쳐 선형 구배 10-90% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 254 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 (Ia) (86 mg)를 백색 고체로서 수득하였다. MS(ESI+) m/z 991.2 (M/3 + H)+.
실시예 2 - 화합물 (Ib)
Figure pct00028
화합물 10. DMF (400 μl) 중 중간체 6 (20 mg, 0.017 mmol)의 용액에 HATU (8.32 mg, 0.022 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 후, DMF (400 μl) 중 메톡시-PEG-(CH2)3-NH2 (NOF, 카탈로그 # 선브라이트(SUNBRIGHT)® MEPA-50H, CAS#: 116164-53-5, 168 mg, 0.034 mmol)의 용액을 첨가하였다. 이어서 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반한 후, 이를 MeOH 중에 희석하고, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 25분에 걸쳐 선형 구배 5-80% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 10 (39.1 mg, 6.34 μmol, 37.6% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00029
화합물 (Ib). 아세토니트릴 (0.1 mL) 중 화합물 10 (39.1 mg, 5.83 μmol)의 용액에 DCM 중 20% TFA (0.5 mL)를 첨가하였다. 이어서 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 이를 진공 하에 농축시켰다. 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 25분에 걸쳐 선형 구배 0-80% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 (Ib) (13.5 mg)를 수득하였다. MALDI 질량 스펙트럼은 Δ MS 828로, 5k PEG 화합물의 정확한 변형을 나타냈다 (도 6).
실시예 3 - 화합물 (Ic)
Figure pct00030
중간체 3을 제조하는데 사용된 것과 유사한 화학에 따라 프로테인 테크놀로지스의 프리루드 펩티드 합성기 상에서의 표준 Fmoc 화학을 사용하여 펩티드 11을 제조하였다. 수지 - Fmoc-L-Arg(Boc)2-OH (P5) - Fmoc-L-Gly-OH (P4) - Fmoc-L-Ser (트리틸)-OH (P3) - Fmoc-Leu-OH (P2) - m-dPEG8-산 (퀀타 바이오디자인, CAS# 1093647-41-6) (P1). MS(ESI+) m/z 1269.6 (M + H)+.
Figure pct00031
화합물 12. DMF (175 μl) 중 중간체 11 (89 mg, 0.07 mmol)의 용액에 (4-아미노페닐)메탄올 (10.35 mg, 0.084 mmol)에 이어서 HATU (31.9 mg, 0.084 mmol) 및 2,4,6-콜리딘 (13.88 μl, 0.105 mmol)을 첨가하였다. 투명한 오렌지색 용액을 실온에서 30분 동안 교반하고, H2O (4 mL)의 교반된 바이알에 첨가하였다. 생성된 침전물을 진공 여과에 의해 수집하였다 (2x1 mL H2O로 세척함). 프릿 상에서 공기 건조시킨 후, 고체를 Et2O (3 x 5 mL)로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 화합물 12 (69 mg, 72%)를 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1372.6 (M + H)+.
Figure pct00032
화합물 13. DMF (251 μl) 중 중간체 12 (69 mg, 0.050 mmol)의 용액에 비스(4-니트로페닐)카르보네이트 (22.92 mg, 0.075 mmol) 및 DIPEA (13.12 μl, 0.075 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 히드로클로라이드 (17.74 mg, 0.100 mmol) 및 DIPEA (26.2 μl, 0.151 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반한 다음, Et2O (15 mL)의 바이알에 적가하였다. 생성된 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, Et2O (3 x 3 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 화합물 13 (60 mg, 78%)을 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1539.8 (M + H)+.
Figure pct00033
화합물 (Ic). DCM (273 μl) 중 중간체 13 (60 mg, 0.039 mmol)의 용액에 TFA (117 μl)에 이어서 트리이소프로필실란 (16.01 μl, 0.078 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 이를 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 20분에 걸쳐 선형 구배 10-90% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 254 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 (Ic) (4.2 mg, 8.9% 수율)를 백색 고체로서 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1096.9 (M + H)+.
실시예 4 - 화합물 (Id)
Figure pct00034
적절한 출발 물질로부터 수지 2에 대해 기재된 유사한 화학에 따라 프로테인 테크놀로지스의 프리루드™ 펩티드 합성기 상에서의 표준 Fmoc 화학을 사용하여 수지 17을 제조하였다. 수지 - Fmoc-L-Gly-OH (P9)-Fmoc-L-His(트리틸)-OH (P8)-Fmoc-L-Asn(트리틸)-OH(P7)-Fmoc-L-Asp(tBu)-OH (P6)-Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(P5)-Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (P4) - Fmoc-L-Gly-OH (P3) - Fmoc-L-Ser (tBu)-OH (P2) - Fmoc-Leu-OH (P1).
Figure pct00035
화합물 18. 수지 17 (158 mg, 0.75 mmol/g)에 DMF (0.5 mL) 중 6-말레이미도카프로산 (47.0 mg, 0.222 mmol) 및 HATU (52.0 mg, 0.137 mmol)의 용액에 이어서 2,4,6-콜리딘 (0.392 mL, 0.359 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 진탕시킨 후, 용매를 배수시켰다. 수지를 DMF (6 mL x 3) 및 DCM (6 mL x 2)으로 세척한 다음, 15분 동안 DCM (8 mL) 중 20% HFP로 처리하였다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켜 Na-(N2-((S)-4-(tert-부톡시)-2-((S)-3-(tert-부톡시)-2-((S)-2-(2-((S)-3-(tert-부톡시)-2-((S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-4-메틸펜탄아미도)프로판아미도)아세트아미도)-5-(3-((2,2,4,6,7-펜타메틸-2,3-디히드로벤조푸란-5-일)술포닐)구아니디노)펜탄아미도)프로판아미도)-4-옥소부타노일)-N4-트리틸-L-아스파라기닐)-Nt-트리틸-L-히스티딜글리신 (33.8 mg, 19.37% 수율)을 수득하였다.
Figure pct00036
화합물 19. DMF (200 μl) 중 중간체 18 (38.3 mg, 0.019 mmol)의 용액에 HATU (10.71 mg, 0.028 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, m-dPEG48-아민 (72.5 mg, 0.034 mmol) 및 DIPEA (3.28 μl, 0.019 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 추가로 10분 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 15분에 걸쳐 선형 구배 25-100% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 19를 백색 고체로서 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1389.0 (M/3+H)+. (14 mg, 17.9% 수율).
Figure pct00037
화합물 (Id). 바이알에 중간체 19 (14 mg, 3.36 μmol)에 이어서 TFA (50 μL, 0.649 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 이를 아세토니트릴로 희석하고, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 15분에 걸쳐 선형 구배 5-85% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 (Id)를 백색 고체로서 수득하였다. MS(ESI+) m/z 1087.8.0 (M/3 + H)+. (2.8 mg, 23.5% 수율).
실시예 5 - 화합물 (Ie)
Figure pct00038
DMF (200 μl) 중 중간체 18 (21 mg, 0.01 mmol)의 용액에 HATU (4.7 mg, 0.012 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, DMF (0.3 mL) 중 메톡시-PEG-(CH2)3-NH2 (NOF, 카탈로그 # 선브라이트® MEPA-50H, CAS#: 116164-53-5, 51.5 mg, 0.034 mmol)의 용액 및 DIPEA (3.6 μl, 0.021 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 15분에 걸쳐 선형 구배 25-100% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 20을 백색 고체 (28 mg, 38.7% 수율)로서 수득하였다.
Figure pct00039
화합물 (Ie). 바이알에 중간체 20 (28 mg)에 이어서 TFA/H2O (97:3, 1 mL)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 60분 동안 교반한 후, 이를 진공 하에 농축시켰다. 이어서 잔류물을 물 (2 mL)에 녹이고, 멸균 필터 (0.45 uM)를 통해 여과하였다. 여과물을 동결건조시켜 링커 6을 백색 고체 (20 mg, 78% 수율)로서 수득하였다. MALDI 질량 스펙트럼은 5k PEG 화합물의 정확한 변형을 나타냈다 (도 7).
실시예 6 - 화합물 (If)
Figure pct00040
화합물 22. 수지 17 (600 mg, 0.6 mmol/g)에 DMF (0.5 mL) 중 (S)-3-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)프로판산 (185 mg, 0.650 mmol) (Nat. Biotech. 2014, 1059-1062) 및 HATU (185 mg, 0.487 mmol)의 용액에 이어서 2,4,6-콜리딘 (1.240 mL, 1.137 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 진탕시킨 후, 이를 배수시켰다. 수지를 DMF (8 mL x 3), DCM (8 mL x 2)에 의해 세척하였다. 이어서 수지를 DCM (8 mL) 중 20% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올로 15분 동안 처리하였다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켜 화합물 22 (136 mg)를 수득하였다, MS(ESI+) m/z 1057.0 [M/2+H]+.
Figure pct00041
화합물 23. DMF (0.3 mL) 중 중간체 22 (134.2 mg, 0.063 mmol)의 교반 용액에 HATU (29.0 mg, 0.076 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, DMF (0.4 mL) 중 m-dPEG48-아민 (136 mg, 0.063 mmol)의 용액에 이어서 DIPEA (0.033 mL, 0.190 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 15분에 걸쳐 선형 구배 30-100% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 화합물 23 (45.1 mg, 16.75% 수율)을 수득하였다, MS(ESI+) m/z 1413.8 [M/3+H]+.
Figure pct00042
화합물 (If). 바이알에 중간체 23 (46.5 mg, 10.96 μmol)에 이어서 TFA (500 μL, 6.49 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 이를 진공 하에 농축시킨 다음, 정제용 HPLC (페노메넥스 루나 C18 30 x 100 mm 칼럼; 15분에 걸쳐 선형 구배 0-80% B-A; A = 0.1% v/v TFA 함유 5% MeCN-H2O; B = 0.1% v/v TFA 함유 95% MeCN-H2O; 30 mL/분; 220 nm 검출)에 의해 정제하여 (15.3 mg, 38.3% 수율)을 수득하였다, MS(ESI+) m/z 1078.6 [M/3+H]+.
실시예 7 - 화합물 (Ig)
Figure pct00043
화합물 (If)를 제조하는데 사용된 유사한 화학에 따라 중간체 22 및 메톡시-PEG-(CH2)3-NH2 (NOF, 카탈로그 # 선브라이트® MEPA-50H, CAS#: 116164-53-5)로부터 화합물 (Ig)를 제조하였다. MALDI 질량 스펙트럼은 5k PEG 화합물의 정확한 변형을 나타냈다 (도 8).
실시예 8 - 화합물 (Ih)
Figure pct00044
화합물 (Ig)를 제조하는데 사용된 유사한 화학에 따라 중간체 22 및 메톡시-PEG-(CH2)3-NH2 (NOF, 카탈로그 # 선브라이트® MEPA-10T, CAS#: 116164-53-5)로부터 화합물 (Ih)를 제조하였다. MALDI 질량 스펙트럼은 10k PEG 화합물의 정확한 변형을 나타냈다 (도 9).
실시예 9 - 노출 및 CDR 아미노산으로부터의 거리의 계산
항체 가변 도메인 (VH 및 VL)의 구조 또는 모델을 사용하여, 모든 아미노산 측쇄에 대해 접근가능한 표면적 (ASA)을 계산하였다. ASA는 리(Lee) 및 리차드(Richards) [Lee and Richards 1971]에 의해 처음 개발된 솔루션을 사용하여 구조 또는 분자 모델의 표면 상에서 롤링될 때 물 분자의 반경 (1.4 Å)을 갖는 구체의 중심에 의해 추적된 표면으로서 정의된다. 잔기 X의 측쇄 노출을 확장된 입체형태의 주쇄를 갖는 Gly-X-Gly 트리펩티드로부터 결정된 이상적 표면적과 비교하였다 (Miller et al. 1987). 이어서 문헌 [Miller et al., 1987]에 보고된 바와 같이 ASA를 주어진 아미노산 유형에 대한 최대 ASA로 나누어 노출을 정규화하였다. 측쇄 노출은 측쇄 노출 = 잔기 ASA/최대 ASA인 백분율로서 기록된다.
주어진 항체에 대한 CER 잔기의 목록을 확인하기 위해, 본 발명자들은 구조 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 예컨대 FAB의 X선 구조) 또는 항체의 Fv 영역의 상동성 모델을 사용하였다. 모든 아미노산에 대한 측쇄 노출을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 측쇄 노출은 가장 가까운 CDR 잔기에 대한 거리와 조합되어 주어진 항체에 대한 바람직한 CER 잔기의 목록을 생성한다. 접근가능한 표면적, CDR 배정 및 소정 잔기로부터 가장 가까운 CDR까지의 거리 계산을 포함한 모든 계산은 MOE. 2015에 따라 사용하여 카바트, 코티아 및 IMGT CDR 정의의 연합인 CCG CDR 정의를 사용하여 수행하였다.
카바트 체계 (Kabat et al., 1991)는 동일한 도메인 유형의 서열들 사이의 높은 서열 변이의 영역의 위치에 기초하여 개발되었다. 이는 항체 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL Vk 및 Vλ) 가변 도메인을 넘버링한다. 코티아 체계 (Al-Lazikani, 1997)는 카바트와 유사하지만, 삽입이 구조적 루프에 상응하도록 제1 VH 상보성 결정 영역 (CDR) 주위에 주석달리는 위치를 교정한다. 본 발명자들은 카바트 및 코티아 CDR 정의를 조합함으로써 VH 및 VL CDR을 정의한다.
도 10a 및 10b는 목적하는 측쇄 노출 및 CDR 아미노산에 대한 근접성을 갖는 CTLA4 Ab 잔기를 열거하는 표를 보여준다. 따라서, 한 실시양태에서, Cys 치환 부위는 도 10a에 도시된 바와 같이, 중쇄의 카바트 번호 1, 3, 25, 46, 68, 72, 76, 82a 또는 83, 또는 경쇄의 카바트 번호 1, 3, 5, 7, 8, 45, 57, 60, 63, 65, 66, 67 및 69에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, Cys 치환 부위는 도 10b에 제시된 바와 같이, 중쇄의 카바트 번호 5, 19, 23, 43, 74, 75, 82b, 84, 85 또는 105, 또는 경쇄의 카바트 번호 18, 20, 77 또는 100에 존재한다.
실시예 10 - 접합
선택된 Cys 치환을 갖는 항체를 Expi-CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피에 의한 표준 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 정제된 항체를 37℃에서 1-3시간 동안 2 mM EDTA를 함유하는 pH 7.2의 완충 수용액 중 과량 (10 몰 당량)의 환원제 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)로 처리하였다. 환원된 변이체 항체를 세파덱스 G-25 또는 이온-교환 칼럼에 통과시킴으로써 TCEP를 제거하였다. 분석용 역상 HPLC 시스템 상에서 항체의 환원을 확인하였다. 정제된 환원된 항체를 4℃ 또는 실온에서 0.5-24시간 동안 완충 수용액 (pH 7.0) 중 과량의 디술피드 재-산화 시약 (10 몰 당량), 예컨대 dhAA (데히드로아스코르브산), CuSO4 (황산구리(II)), 공기, H2O2 (과산화수소), N-CS (N-클로로숙신이미드) 또는 O2 (분자 산소)로 처리하였다. 280 nm에서의 단백질 용액의 흡수로부터 단백질 농도를 결정하고, 단백질과 DTDP (디티오디피리딘)와의 반응으로부터 티올 농도를 결정함으로써, 항체당 유리 티올의 비를 추정하였다. 분석용 역상 HPLC 상에서 항체의 재-산화를 모니터링하고, 분석용 크기-배제 칼럼 상에서 응집 수준을 모니터링하였다.
상기 기재된 바와 같은 환원 및 재-산화 후에, 완충 수용액 (pH 7) 중의 항체를 시스테인-반응성 관능기 (말레이미드, 아이오도아세트아미드 또는 유사한 반응기)를 함유하는 항체의 티올당 3 몰 당량의 BM-링커로 처리하였다. 전형적으로 탈이온수 중에 용해된 BM-링커를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 진행하도록 하였다. 그 후, 접합체를 단백질 A, 이온 교환, 크기 배제 또는 다수 유형의 크로마토그래피의 조합에 의해 정제하였다. 분석 시험, 예컨대 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, HIC, 역상 HPLC 및 질량 분광측정법을 수행하여 조작된 위치에서의 BM 링커의 부착을 확인하였다.
실시예 11 - 링커 모이어티의 매트립타제 절단
링커 모이어티가 매트립타제 절단가능한 펩티드 서열을 갖는 전구약물화된 항체의 매트립타제 절단에 대한 검정을 위해 하기 절차를 사용하였다.
전구약물화된 항체 (40 μg)를 100 mM 트리스 완충제 (pH 7.6) 중 1.3 μg의 h매트립타제 (30:1, 알앤디 시스템(R&D system), 3946-SE-010)와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 시점에, 10 μL의 샘플을 10 μL의 켄칭 완충제 (4M GdnCl 및 0.4M TCEP 함유 100 mM 포스페이트 완충제, pH 2.5)와 혼합하여, 동시에 효소를 탈활성화시키고 전구약물화된 항체를 환원시켰다. 켄칭된 샘플을 LC/MS 분석에 적용하였다.
실시예 12 - 활성화된 CD4+ T-세포에 대한 결합
전구약물화 및 탈-전구약물화 (즉, 링커 모이어티가 절단됨) 항체의 연속 희석물을 시험하고, APC 표지된 항-인간 IgG 2차 항체에 의해 결합을 검출하였다. 칸토(Canto) 유동 세포측정기를 사용하여 유동 세포측정 분석을 수행하고, 플로우조(FlowJo) 분석 소프트웨어를 사용하여 기하 평균 형광 강도 (GMFI)를 결정하였다. 두 시험 물품의 결합을 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 비전구약물화 CTLA4 Ab의 결합과 비교하였다.
예시적 결과가 도 11a 및 11b에 제공된다. 도 11a에서, "CTLA4 Ab"로 표지된 결합 곡선은 어떠한 Cys 치환도 없는 서열식별번호: 1의 천연 CTLA4 Ab에 대한 것이다. "S67C CTLA4 - 비절단"으로 표지된 결합 곡선은 VL S67C 치환을 갖고 이어서 5 kDa PEG를 포함하는 차단/링커 모이어티 (Ie)로 전구약물화된 CTLA4 Ab에 대한 결합 곡선이다. 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이, CD4+ T-세포에 대한 결합은 실질적으로 억제된다. 마지막으로, "S67C CTLA4 - 절단" 곡선은 매트립타제에 의한 차단/링커 모이어티의 절단으로 5 kDa PEG를 방출할 때 결합이 본질적으로 완전히 회복된다는 것을 보여준다.
도 11b는 CTLA4 Ab가 VH A23C에서 전구약물화된 유사한 실험에 대한 결과를 보여준다. 다시, 전구약물화시 결합의 상실 및 링커의 절단시 결합의 회복이 명백하다.
추가의 결합은 도 11c 내지 11e에 제시된 바와 같이 그래프화된다.
실시예 13 - IL-2 분비 검정
포도상구균 장독소 B (SEB)를 사용하는 시험관내 기능적 검정에 의해 전구약물화 및 탈-전구약물화 항체의 활성을 특징화하였다. SEB는 T 세포를 강하게 활성화시키고 시토카인 분비를 자극하는 초항원이다. 신선한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 2명의 건강한 인간 공여자로부터 단리하고, 여러 농도의 전구약물화 및 탈-전구약물화 항체로 처리하였다. 동시에, 준최적 농도 (85 ng/mL)의 SEB를 첨가하여 세포를 자극하였다. T-세포 활성화를 모니터링하고, 시토카인 IL-2의 분비를 제3일의 인큐베이션/처리 후에 측정하였다.
하기 절차를 사용하였다: 2가지 백혈구 연층을 스탠포드 혈액 센터에서 2명의 건강한 공여자 (각각 도 12a/b 및 13a/b에서의 공여자 1 및 공여자 2)로부터 수집하였다. 20 mL 백혈구 연층에 대해 15 mL 피콜을 깔아놓고 중단 없이 2000 rpm으로 20분 동안 회전시키는 표준 피콜-파크 분리 방법을 사용하여 백혈구 연층으로부터 전체 PBMC를 단리하였다. 백색 계면을 조심스럽게 분리하고, PBS로 여러 회 세척하여 여분의 피콜 및 혈소판을 제거하였다. 이어서 세포를 T-세포 검정 배지로 재현탁시켰다. 전구약물화 및 탈-전구약물화 항체에 대한 양성 대조군 항체 (CTLA4 Ab)의 (40 μg/mL 내지 0.01 μg/mL) 및 8 μg/mL 내지 0.01 μg/mL의 연속 희석물을 만들고, 96-웰 편평-바닥 조직 배양 플레이트에 삼중으로 플레이팅하였다. 단리된 PBMC를 1x105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하고, 초항원 SEB에 의해 85 ng/mL (SEB를 적정하고 T-세포 증식에 대한 자극을 관찰함으로써 결정된 SEB의 준최적 농도)로 자극하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 상청액 중 IL-2 농도를 균질 시간-분해 형광 (HTRF)에 의해 측정하였다. HTRF 데이터를 소프트맥스 프로(Softmax Pro)를 사용하여 분석하고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 그래프화하였다.
결과는 공여자 1에 대해 도 12a 및 도 12b 및 공여자 2에 대해 도 13a 및 13b에 제시된다. 각각의 경우에, VL S67C 또는 VH A23C에서의 CTLA4 Ab 전구약물화는 감소된 IL-2 유도를 유발하고, 탈-전구약물화는 IL-2 유도를 회복시키는 것으로 보인다. 도 12a/b 및 13a/b에서의 대조군, 전구약물화 및 탈-전구약물화 항-CTLA4 항체는 이전 CD4+ T 세포 실시예 및 도 11a/b에 기재된 것과 동일하였다.
본 발명자들은 상기 항체가 이소형 항-KLH (키홀 림펫 헤모시아닌) 대조군 항체에 의해 도출된 IL-2 분비와 비교하였을 때 상이한 공여자에서 용량 의존성 활성을 나타냈다는 것을 관찰하였다. CTLA4 Ab와 비교하였을 때, 전구약물화된 항체는 감소된 기능적 활성을 나타냈다. 탈-전구약물화시, CTLA4 Ab의 양성 대조군과 유사하게 탈-전구약물화된 항체의 최고 농도에서 IL-2 분비의 대략 3배 증가가 존재하였다. 이러한 결과는 차단 모이어티의 부착에 의해 항체의 결합을 감소시키는 것이 기능적 T 세포 검정에서 활성을 감소시킨다는 것 및 이러한 활성이 차단 모이어티의 제거시 회복된다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 14 - CD137 항체의 전구약물화
본 실시예에서 하기 4종의 상이한 CD137 항체를 사용하였다: (a) 적절한 CD137 Ab (서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4); (b) 2 kDa PEG를 갖는 차단 모이어티-링커 (If)에 VL S67C 치환-도입된 Cys를 통해 접합된 CD137 Ab; (c) 10 kDa PEG를 갖는 차단 모이어티-링커 (Ih)에 VL S67C 치환-도입된 Cys를 통해 접합된 CD137 Ab; (d) 차단 모이어티를 갖지 않고 "펩티드 대조군"으로서의 역할을 하는 링커 (III) (하기 구조)에 VL S67C 치환-도입된 Cys를 통해 접합된 CD137 Ab.
Figure pct00045
2종의 상이한 검정을 수행하였다. 제1 검정에서, CD8+ ConA 활성화된 비장세포에 대한 CD137 Ab 및 그의 변이체 (u)-(d)의 결합을 2차 알렉사 488 접합된 염소 항-인간 항체를 사용한 유동 세포측정법에 의해 평균 형광 단위를 사용하여 비교하였다. 결과는 도 14에 제시된다. 이들은 CD137 Ab 및 변이체 (d)가 효과적으로 결합하지만, 변이체 (b) 및 (c)는 그렇지 않다는 것을 보여준다. (인비트로젠(Invitrogen) 마우스 이소형 대조군 항체, 카탈로그 #: MA1-10406은 이소형 대조군으로서의 역할을 하였다.) 따라서, (III)과 같은 소형 펩티드의 부착은 CDR 아미노산에 대한 VL S67C 부위의 근접성에도 불구하고 결합을 효과적으로 억제하기에 불충분하다. 그러나, 상당한 크기, 예컨대 2 kDa 또는 10 kDa PEG의 차단 모이어티의 존재는 억제를 유발한다.
제2 검정은 기능적 검정이었다. 제1 측면에서, 도 15a에 제시된 바와 같이, 활성화된 CD8 T 세포로부터의 IFNg (인터페론-감마)의 분비를 측정하였다. OT-1 CD8+ T 세포에 대한 결과와 같이, SIIQFEKL 펩티드는 비장세포 결합을 활성화시켰고, CD137 Ab 및 변이체 (d)는 효과적이었지만, 변이체 (b) 및 (c)는 그렇지 않았으며, 이는 그의 활성의 억제를 입증한다. 제2 측면은 도 15b에 제시되며: Q4 펩티드를 OT-1 세포에 첨가하여 세포의 표면 상의 CD137 수용체의 발현을 유도하였다. 이어서 CD137의 그의 수용체에 대한 결합은 CD8 T 세포 증식을 유도한다. CD137 Ab 및 변이체 (d)는 추가로 항원 특이적 CD8 T 세포 증식을 유도하였지만, 변이체 (c) 및 (d)는 그렇지 않았다. 항-KLH 항체, 카탈로그 #: MA1-10406b, "펩티드 부재" 및 Q4 단일점은 음성 대조군이었다.
상기 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정한 부분 또는 측면과 주로 또는 독점적으로 관련된 구절을 포함한다. 이는 명확성 및 편의성을 위한 것이고, 특정한 특색은 그것이 개시된 구절을 넘어 관련될 수 있으며, 본원의 개시내용은 상이한 구절에서 발견된 정보의 모든 적절한 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 본원의 다양한 도면 및 설명은 본 발명의 구체적 실시양태와 관련되어 있지만, 구체적 특색이 특정한 도면 또는 실시양태의 문맥에서 개시되는 경우에, 이러한 특색은 또한 적절한 정도로, 또 다른 도면 또는 실시양태의 문맥에서, 또 다른 특색과 조합되어, 또는 본 발명에서 일반적으로 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
추가로, 본 발명이 특정의 바람직한 실시양태의 면에서 구체적으로 기재되기는 하였지만, 본 발명이 이러한 바람직한 실시양태로 제한되는 것은 아니다. 오히려, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 정의된다.
참고문헌
본 명세서서 제1 저자 (또는 발명자) 및 앞선 날짜에 의해 약기 방식으로 인용된 하기 참고문헌에 대한 전체 인용이 하기에 제공된다. 각각의 이들 참고문헌은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
서열의 표
하기 표는 본 명세서에 개시된 서열을 요약한다.
Figure pct00049
SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> PRODRUGGABLE ANTIBODIES, PRODRUGS THEREOF, AND METHODS OF USE AND MAKING <130> 13002-WO-PCT <150> US 62/546252 <151> 2017-08-16 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CTLA4 antibody heavy chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(118) <223> Variable region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Ala or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(35) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(66) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(107) <223> CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(448) <223> Constant region <220> <221> MISC_FEATURE <222> (215)..(215) <223> R214 (EU) allotype <220> <221> MISC_FEATURE <222> (357)..(357) <223> E356 (EU) allotype <220> <221> MISC_FEATURE <222> (359)..(359) <223> M358 (EU) allotype <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys 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<222> (3)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ala or Ser <400> 14 Asp Glu Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease cleavable peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ala or Ser <400> 15 Asp Leu Xaa Xaa Xaa Thr Xaa 1 5 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease cleavable peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Arg or Lys <400> 16 Leu Ser Gly Xaa 1

Claims (20)

  1. 화학식 (I)에 따른 전구약물화된 항체이며,
    (BM-L)m-Ab (I)
    여기서
    Ab는 그의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 내의 적어도 1개의 아미노산이 Cys에 의해 대체된 항체이며, 여기서 대체된 아미노산은 (a) 프레임워크 영역 내에 있고; (b) 적어도 30%의 측쇄 노출을 갖고; (c) CDR 아미노산의 10 Å, 바람직하게는 5 Å 이내에 있고;
    BM은 Ab가 그의 항원에 결합하는 것을 억제하는 차단 모이어티이고;
    각각의 L은 독립적으로 BM 및 Ab에 결합된 링커 모이어티이고, L은 절단가능한 모이어티를 포함하고 상기 Cys에서 Ab에 결합되고;
    m은 1, 2, 3 또는 4인
    전구약물화된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체 Ab 내의 적어도 1개의 대체된 아미노산이 중쇄 가변 영역의 카바트 위치 1, 3, 5, 19, 23, 25, 43, 46, 68, 72, 74, 75, 76, 82a, 82b, 83, 84, 85 또는 105, 또는 경쇄 가변 영역의 카바트 위치 1, 3, 5, 7, 8, 18, 20, 45, 57, 60, 63, 65, 66, 67, 69, 77 또는 100에 있는 것인 전구약물화된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항체 Ab 내의 적어도 1개의 대체된 아미노산이 중쇄의 카바트 위치 23 또는 경쇄의 카바트 위치 67에 있는 것인 전구약물화된 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항체 Ab 내의 적어도 1개의 대체된 아미노산이 중쇄의 카바트 위치 23에 있는 것인 전구약물화된 항체.
  5. 제1항에 있어서, 항체 Ab 내의 적어도 1개의 대체된 아미노산이 경쇄의 카바트 위치 67에 있는 것인 전구약물화된 항체.
  6. 제1항에 있어서, 차단 모이어티 BM이 폴리(에틸렌 글리콜)인 전구약물화된 항체.
  7. 제5항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 적어도 약 2 kDa의 분자량을 갖는 것인 전구약물화된 항체.
  8. 제1항에 있어서, L 내의 절단가능한 모이어티가 효소적으로 절단가능한 펩티드인 전구약물화된 항체.
  9. 제8항에 있어서, 효소적으로 절단가능한 펩티드가 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 (uPA, 우로키나제), MT-SP1/매트립타제, 레구마인 및 매트릭스 메탈로프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 효소에 의해 절단가능한 것인 전구약물화된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 효소가 매트립타제인 전구약물화된 항체.
  11. 제8항에 있어서, 효소적으로 절단가능한 펩티드가 LSGRSDNH (서열식별번호: 5), LSGX (서열식별번호: 16) 또는 LSGK (서열식별번호: 16)인 전구약물화된 항체.
  12. 제1항에 있어서, 화학식 (IIa) 내지 (IIh)에 따른 구조를 갖는 전구약물화된 항체.
    Figure pct00050

    Figure pct00051

    Figure pct00052
  13. 경쇄의 카바트 위치 67에 Cys를 갖는 항체.
  14. 제13항에 있어서, 항-CTLA4 항체인 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항-CTLA4 항체가
    (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 31-35를 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열식별번호: 1의 아미노산 50-66을 포함하는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열식별번호: 1의 아미노산 99-107을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열식별번호: 2의 아미노산 24-35를 포함하는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열식별번호: 2의 아미노산 51-57을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 2의 아미노산 90-98을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 갖는 것인 항체.
  16. 제14항에 있어서, 서열식별번호: 1 (여기서 Xaa는 Ala임)의 아미노산 1-118을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 2 (여기서 Xaa는 Cys임)의 아미노산 1-108을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체.
  17. 중쇄의 카바트 위치 23에 Cys를 갖는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 항-CTLA4 항체인 항체.
  19. 제18항에 있어서, 항-CTLA4 항체가
    (a) 서열식별번호: 1의 아미노산 31-35를 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열식별번호: 1의 아미노산 50-66을 포함하는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열식별번호: 1의 아미노산 99-107을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열식별번호: 2의 아미노산 24-35를 포함하는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열식별번호: 2의 아미노산 51-57을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열식별번호: 2의 아미노산 90-98을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 갖는 것인 항체.
  20. 제18항에 있어서, 서열식별번호: 1 (여기서 Xaa는 Cys임)의 아미노산 1-118을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 2 (여기서 Xaa는 Ser임)의 아미노산 1-108을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체.
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