KR20200042022A - 세포의 동결보존 및 캡슐화 방법 - Google Patents

세포의 동결보존 및 캡슐화 방법 Download PDF

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사스카 에이브럼슨
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안트로제네시스 코포레이션
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Abstract

본원은 알기네이트 중에 현탁된 세포를 동결보존하는 방법 및 또한 알기네이트 중에 현탁된 동결보존된 세포를 캡슐화하는 방법을 기재한다. 추가로, 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포를 포함하는 세포 조성물을 제공한다.

Description

세포의 동결보존 및 캡슐화 방법 {METHODS FOR CRYOPRESERVING AND ENCAPSULATING CELLS}
본 출원은 2010년 12월 30일자로 출원된 미국 가출원 제61/428,427호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
1. 기술분야
본원은 알기네이트 중에 현탁된 세포를 동결보존하는 방법 및 또한 알기네이트 중에 현탁된 동결보존된 세포를 캡슐화하는 방법을 기재한다. 추가로, 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포를 포함하는 세포 조성물을 제공한다.
2. 배경기술
동결보존은, 세포를 저온으로 냉각시켜 세포를 보존할 수 있는 방법이다. 이러한 저온에서는, 정상적인 조건하에서는 세포 사멸을 유도하게 되는 생화학적 반응을 비롯한 생물학적 활성이 효과적으로 중지된다. 이와 같이, 동결보존은 추후 사용을 위해서 세포를 저장하는 유용한 수단을 제공한다. 그러나, 냉동 및/또는 해동 과정 동안에 세포에 가해지는 손상 및 적당한 세포 회수를 위해 해동 이후에 세포를 배양할 필요성을 비롯하여, 세포의 동결보존과 관련한 몇가지 결점이 있다. 이러한 결점은, 특히 동결보존된 세포를 해동 직후 또는 해동 후 곧바로 사용하는 것이 바람직한 상황에서 동결보존된 세포의 가치를 제한한다.
3. 요약
본 개시내용의 목적은, 상기 기재된 문제를 해결한 세포의 동결보존 방법 및 동결보존된 세포의 사용 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법은 부분적으로는 세포의 동결보존 이전에 세포에 액체 알기네이트가 첨가되는 경우에는, (i) 동결보존된 세포를 해동 후에 배양할 필요 없이 세포를 해동 후 캡슐화시켜 원하는 목적에 사용할 수도 있고, 또는 (ii) 동결보존된 세포를 해동 후에 배양할 필요 없이 세포를 해동 후 캡슐화되지 않은 형태로 사용할 수도 있다는 발견을 기초로 한다. 상기 방법은 추가로 부분적으로는 동결보존된 세포를 해동 직후에 알기네이트 중에 현탁한 후에 살아있는 상태로 캡슐화하면 캡슐화 직후 사용할 수 있다는 발견을 기초로 한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 액체 알기네이트를 세포에 첨가하여 세포/액체 알기네이트 용액을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액을 생성하고, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 세포를 동결보존 및 해동하여 해동 직후에 캡슐화하고, 이후 세포를 임의의 추가의 배양 없이, 예를 들어 즉시 그의 원하는 목적, 예를 들어 대상체로의 투여에 사용한다. 일부 실시양태에서, 동결보존된 세포의 해동 직후에 세포/액체 알기네이트 용액을 생성하고, 후속적으로 이것을 캡슐화한 후에 임의의 추가의 배양 없이, 예를 들어 즉시 그의 원하는 목적, 예를 들어 대상체로의 투여에 사용한다. 일부 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액을 생성하고, 세포를 동결보존 및 해동하고, 해동 이후에 캡슐화하지 않고 세포를 임의의 추가의 배양 없이, 예를 들어 즉시 사용한다.
한 측면에서, 본원은 동결보존된 세포를 해동하고 알기네이트 중에 캡슐화한 직후에 대상체에게 투여하기에 적합한 동결보존된 캡슐화된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따라, 동결보존된 캡슐화된 세포는 액체 알기네이트 중에 현탁시킨 후에 동결보존하고 해동 직후에 캡슐화한 것이다. 대안적으로, 동결보존된 세포를 해동 직후에 액체 알기네이트 중에 현탁하고 후속적으로 캡슐화한다. 각각의 경우에서, 캡슐화된 세포는 이후에 대상체에게 임의의 추가의 배양 없이 투여될 수 있고, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iv) 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (vi) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (v)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (v) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iv)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포를 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (iii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iv) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단을 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (ii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iii) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포를 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (iii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iv) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (vi) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (v)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단을 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (ii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iii) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (v) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iv)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원은 동결보존된 세포의 해동 직후에 대상체에게 투여하기에 적합한 동결보존된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따라, 동결보존된 세포는 액체 알기네이트 중에 현탁한 후에 동결보존한 것이고, 캡슐화된 세포는 투여 이전에 배양할 필요 없이 해동 직후에 대상체에게 투여될 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계를 포함하고, 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포는 해동 후에 대상체에게 즉시 투여될 수 있는 것인, 대상체에 투여하기에 적합한 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계를 포함하고, 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포는 해동 후에 대상체에게 즉시 투여될 수 있는 것인, 대상체에 투여하기에 적합한 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iv) 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (v) 대상체에게 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iv)의 해동 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 세포 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (iv) 대상체에게 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iii)의 해동 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 세포 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
4. 정의
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자가 결정하는 바와 같이 특정 값에 대해 허용되는 오차를 의미하고, 이것은 부분적으로는 그 값을 측정 또는 결정하는 방법에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3 또는 4의 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20％, 15％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％, 1％, 0.5％ 또는 0.05％ 이내를 의미한다.
본원에서 본원에 기재된 세포의 사용과 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "즉시"는 개입 배양 단계 없이 세포를 사용하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 즉시는 1주 초과의 시간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 즉시는 6일 초과, 5일 초과, 4일 초과, 3일 초과, 2일 초과, 또는 1일 초과의 시간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "즉시"는 약 1일, 약 22시간, 약 20시간, 약 18시간, 약 16시간, 약 14시간, 약 12시간, 약 10시간, 약 8시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 약 30분, 약 20분 또는 약 10분의 시간을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "즉시"는 세포의 사용 전에 원하거나 필요할 수 있는 특정 단계, 예를 들어 세포의 희석, 세포의 세척 및/또는 세포의 저장 (예를 들어, 적절한 배지, 예컨대 하이포써모졸(HypoThermosol)® (미국 워싱턴주 보텔 소재의 바이오라이프 솔루션즈(BioLife Solutions)) 중 세포의 저온 저장)을 배제하는 의미가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알기네이트"는 갈조류의 세포 벽에 광범위하게 분포된 음이온성 폴리사카라이드를 지칭한다. 알기네이트는 알칼리 금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 리튬, 마그네슘, 암모늄, 및 저급 아민, 예컨대 메틸 아민, 에탄올 아민, 디에탄올 아민 및 트리에탄올 아민으로부터 유래된 치환된 암모늄 양이온과 수용성 염을 형성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알기네이트"는 당업자에게 공지된 모든 형태의 알기네이트를 포함하며, 예를 들어 칼슘 알기네이트, 나트륨 알기네이트, 프로필렌-글리콜 알기네이트 및 칼륨 알기네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알기네이트"는 당업자가 알기네이트, 예를 들어 알긴산 및 알긴을 기재하는데 사용하는 모든 용어를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동결방지제"는 생물학적 조직 (예를 들어, 세포)을 냉동 동안 발생하는 손상, 예를 들어 얼음 형성으로 인한 손상으로부터 보호하는데 사용되는 임의의 물질을 지칭한다. 예시적인 동결방지제는 글리콜 (2개 이상의 히드록실기를 함유하는 알콜), 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤; 디메틸 술폭시드 (DMSO); 트레할로스; 및 수크로스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동결방지제"는 알기네이트를 포함하는 의미가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 및 "캡슐화한다"는 액체 알기네이트 중에 현탁시킨 세포를, 세포/액체 알기네이트 현탁액을 2가 양이온, 예를 들어 염화칼슘, 염화아연, 염화구리 및 염화스트론튬에 노출시킨 후에 반투과성 막 내에 밀폐시키는 과정을 지칭한다. 본원에 기재된 캡슐화된 세포는 시험관내 조건 및 생체내 조건 둘 다에서 살아있는 상태로 유지되며, 또한 그의 기능적 특성 및 대사 특성을 보유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 및 "캡슐화한다"는 세포를 알기네이트 중에 단지 냉동시키는 과정을 포함하는 의미가 아니다. 즉, 본원에서 사용된 바와 같이 "캡슐화"에는 알기네이트가 2가 양이온에 노출되는 경우에 발생하는 알기네이트 중합체의 가교가 필요하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동결보존 용액"은 세포를 동결보존시킬 수 있는 용액을 지칭한다. 동결보존 용액은 알기네이트, 동결방지제, 인간 혈청 알부민 (HSA), 물, 단백질, 염, 완충제, 하이포써모졸® (미국 워싱턴주 보텔 소재의 바이오라이프 솔루션즈), 및/또는 덱스트란을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 동결보존 용액은 동결방지제를 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 반드시 무한 증식인 것은 아니지만 예를 들어 최대 약 40회의 집단 2배 증식하는 것과 같이 광범위하게 증식할 수 있고 다수의 세포 유형으로 예를 들어 시험관내 분화하는 것과 같이 분화할 수 있는, 임의의 주어진 세포 집단의 기능적 특성을 규정한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유래된"은 단리되거나 다른 방식으로 정제된 것을 의미한다. 세포와 관련하여, 용어 "유래된"은 조직으로부터 직접 단리된 세포로부터 배양된 세포, 및 1차 단리물로부터 배양되거나 증식된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역국소화"는 면역 단백질, 예를 들어 항체 또는 그의 단편을 예를 들어, 유동 세포계측, 형광 활성화 세포 분류, 자성 세포 분류, 계내 혼성화, 면역조직화학 등에서 사용하여 화합물, 예를 들어 세포 마커를 검출하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 세포"는 그 세포가 유래된 조직의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다. 세포는, 예를 들어 세포의 수집 및/또는 배양 동안에 그 세포가 천연적으로 결합되어 있는 세포의 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 또는 약 99％ 이상이 그 세포로부터 제거되는 경우에 "단리된" 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 세포 집단"은 그 세포 집단이 유래된 조직의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포 집단을 의미한다. 세포 집단은, 그 세포 집단 또는 그 세포 집단으로부터 유래된 세포가 천연적으로 결합되어 있는 세포의 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상 또는 99％ 이상이 그 세포로부터 제거되는 경우에 "단리된" 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포는 특정 마커가 예를 들어 면역국소화에 의해 또는 RT-PCR에 의해 백그라운드보다 높은 수준으로 검출가능한 경우에 그 마커에 대해 "양성"이다. 반대로, 동일 맥락에서, "음성"은 특정 마커가 예를 들어 면역국소화에 의해 또는 RT-PCR에 의해 백그라운드와 유사한 수준인 경우를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 구별없이 사용되며, 동물 (예를 들어, 조류, 파충류 및 포유동물)을 지칭한다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 조류 (예를 들어, 닭 또는 오리)이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 비-영장류 (예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예를 들어, 원숭이, 침팬지 및 인간)을 비롯한 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 가축 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 또는 애완동물 (예를 들어, 개, 고양이 등)이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간 유아이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간 소아이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간 성인이다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1은 7일의 기간에 걸쳐서 4℃ 및 37℃에서 하이포써모졸® (HT) 용액 중에 현탁시킨 캡슐화된 태반 줄기 세포의 생존율을 보여준다. "1× 세포"는 5×105개 세포 밀도에 상응하고, "4× 세포"는 2×106개 세포 밀도에 상응한다.
도 2는 동결보존 및 해동하고 알기네이트 중에 현탁시켜 캡슐화하여 개입 배양 단계 없이 하이포써모졸® 중에 저장한 태반 줄기 세포의 생존율을 보여준다. 생존율은 캡슐화후 제4시간 및 제24시간에 평가하였다. "1×"는 3.75×106개 세포/mL를 나타내고, "0.5×"는 1.88×106개 세포/mL를 나타내고, "0.25×"는 0.94×106개 세포/mL를 나타낸다.
6. 상세한 설명
본원은 세포를 알기네이트 중에 동결보존하는 방법 및 본원에 기재된 방법에 따라 동결보존된 세포를 투여하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 알기네이트 중에 동결보존된 세포는 해동 이후에 캡슐화된다. 본원에 기재된 방법은 동결보존된 세포의 즉각적인 사용을 허용하며, 따라서 동결보존된 세포를 해동 후에 배양하거나 다른 방식으로 처리할 필요가 없다는 사실로 인해 공지된 동결보존 방법에 비해 유리하다.
또한, 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 동결보존된 세포를 포함하는 세포 조성물을 제공한다.
6.1 동결보존 방법
한 측면에서, 본원은 동결보존된 세포를 해동하고 알기네이트 중에 캡슐화한 직후에 대상체에게 투여하기에 적합한 동결보존된 캡슐화된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따라, 동결보존된 캡슐화된 세포는 액체 알기네이트 중에 현탁시킨 후에 동결보존하고 해동 직후에 캡슐화한 것이다. 대안적으로, 동결보존된 세포를 해동 직후에 액체 알기네이트 중에 현탁하고 후속적으로 캡슐화한다. 각각의 경우에서, 캡슐화된 세포는 이후에 대상체에게 임의의 추가의 배양 없이 투여될 수 있고, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다. 이러한 방법에 사용되는 세포는 하기 섹션 6.1.2에 기재된 임의의 세포를 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iv) 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (vi) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (v)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (v) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iv)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포를 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (iii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iv) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단을 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (ii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iii) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계를 포함하는, 대상체에 투여하기에 적합한 캡슐화된 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 해동 및 후속적인 캡슐화 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용되며, 예를 들어 세포는 캡슐화 직후 사용된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포를 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (iii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iv) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (v) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (vi) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (v)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단을 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (ii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iii) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계, 및 (v) 대상체에게 캡슐화된 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iv)의 캡슐화 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 측면에서, 본원은 동결보존된 세포의 해동 직후에 대상체에게 투여하기에 적합한 동결보존된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 측면에 따라, 동결보존된 세포는 액체 알기네이트 중에 현탁한 후에 동결보존한 것이고, 캡슐화된 세포는 투여 이전에 배양할 필요 없이 해동 직후에 대상체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어 세포는 해동 직후 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 세포는 하기 섹션 6.1.2에 기재된 임의의 세포를 포함할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계를 포함하고, 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포는 해동 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용될 수 있고, 예를 들어 세포가 해동 직후에 사용될 수 있는 것인, 대상체에 투여하기에 적합한 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계를 포함하고, 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포는 해동 이후에 임의의 추가의 배양 없이 사용될 수 있고, 예를 들어 세포가 해동 직후에 사용될 수 있는 것인, 대상체에 투여하기에 적합한 세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (iv) 대상체에게 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iii)의 해동 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 세포 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포의 집단을 수득하는 단계, (ii) 상기 세포 집단에 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (iii) 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iv) 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (v) 대상체에게 세포/액체 알기네이트 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 단계 (iv)의 해동 이후에 상기 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포 배양 없이 수행되는 것인, 대상체에게 캡슐화된 세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
6.1.1 캡슐화된 세포 집단
추가로, 본원은 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 캡슐화된 세포의 집단을 제공한다. 이러한 캡슐화된 세포는 임의의 원하는 목적, 예를 들어 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 캡슐화된 세포는 섹션 6.3에 기재된 바와 같이 사용된다.
구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계, (iii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 해동하는 단계, 및 (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계의 방법에 따라 생성되는, 캡슐화된 세포의 집단을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포를 동결보존 용액 중에 동결보존하는 단계, (ii) 동결보존된 세포를 해동하는 단계, (iii) 해동된 세포에 액체 알기네이트를 포함하는 용액을 첨가하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (iv) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 캡슐화하는 단계의 방법에 따라 생성되는, 캡슐화된 세포의 집단을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (i) 세포 집단, 및 액체 알기네이트를 포함하는 동결보존 용액을 합하여 세포/액체 알기네이트 조성물을 생성하는 단계, 및 (ii) 상기 세포/액체 알기네이트 조성물을 동결보존하는 단계의 방법에 따라 생성되고, 상기 동결보존된 세포/액체 알기네이트 조성물 중의 세포는 해동 후 임의의 추가의 배양 없이 사용될 수 있고, 예를 들어 상기 세포는 해동 직후에 사용될 수 있는 것인, 세포 집단을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포이다.
6.1.2 세포
대상체로부터 직접 단리된 초대 세포 및 당업자에게 공지된 세포주를 포함하는 임의의 세포 유형이 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다. 즉, 상기 기재된 방법에 사용되는 세포는 결합 조직, 상피 조직, 근육 조직 및/또는 신경 조직을 포함하는 임의의 공지된 조직으로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 세포의 공급원은 태반 (제대 포함), 골수, 간질, 중간엽, 피부, 뼈, 혈액, 폐, 간, 뇌, 신장, 담낭, 방광, 심장, 비장, 위, 췌장, 고환, 난소, 결장, 소장 및 대장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 세포는 줄기 세포, 예를 들어 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포, 및 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기 세포)이다. 태반 조직 (제대 포함)으로부터 단리되거나 유래된 줄기 세포를 수득하는 예시적인 방법은 미국 특허 제7,468,276호, 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호 및 미국 특허 출원 공개 제2010/0124569호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 세포 또는 세포 집단은 태반으로부터 단리된 태반 줄기 세포이다. 태반 줄기 세포 및 태반 줄기 세포 집단은 예를 들어 미국 특허 제7,468,276호 및 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
태반 줄기 세포는 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD200을 발현하고 HLA-G를 발현하지 않거나; CD73, CD105 및 CD200을 발현하거나; CD200 및 OCT-4를 발현하거나; CD73 및 CD105를 발현하고 HLA-G를 발현하지 않거나; CD73 및 CD105를 발현하고, 배아양-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배양하는 경우에 상기 집단 중에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; OCT-4를 발현하고, 배아양-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배양하는 경우에 상기 집단 중에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 다른 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD44, CD90, HLA-ABC 또는 HLA-P 중 1종 이상을 발현하고/거나 CD45, CD119, CD133, KDR, CD80, CD86, HLA-DR, SSEA3, SSEA4 또는 CD38 중 1종 이상을 발현하지 않는다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 세포 또는 세포 집단은 "양막 유래 부착성 세포" 또는 "AMDAC"라고 지칭되는, 태반으로부터 단리된 줄기 세포이다. 이러한 세포 및 세포 집단은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2010/0124569호에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
AMDAC는 세포 및 유전자 마커의 상이한 조합에 의해 확인될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 예를 들어 AMDAC는 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 결정가능한 바와 같이 OCT-4-이다. 또 다른 실시양태에서, AMDAC는 유동 세포계측으로 결정가능한 바와 같이 CD49f+이다. 또 다른 실시양태에서, AMDAC는 RT-PCR 및 유동 세포계측 각각으로 결정가능한 바와 같이 OCT-4- 및 CD49f+이다. 또 다른 실시양태에서, AMDAC는 예를 들어 유동 세포계측과 같은 면역국소화로 결정가능한 바와 같이 CD49f+, CD105+ 및 CD200+이다. 또 다른 실시양태에서, AMDAC는 RT-PCR로 결정가능한 바와 같이 OCT-4-이고, 예를 들어 유동 세포계측과 같은 면역국소화로 결정가능한 바와 같이 CD49f+, CD105+ 및 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 예를 들어 유동 세포계측과 같은 면역국소화로 결정가능한 바와 같이 VEGFR1/Flt-1 (혈관 내피 성장 인자 수용체 1) 및/또는 CD309 (또한 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2)/KDR이라고 공지됨)에 대해 양성이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 유동 세포계측으로 결정가능한 바와 같이 CD90+ 및/또는 CD117-이고/거나, RT-PCR로 결정가능한 바와 같이 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 AMDAC는 RT-PCR로 결정가능한 바와 같이 OCT-4- 및 HLA-G-이고, 유동 세포계측으로 결정가능한 바와 같이 CD49f+, CD90+, CD105+ 및 CD117-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 임의의 상기 AMDAC는 예를 들어 유동 세포계측과 같은 면역국소화로 결정가능한 바와 같이 추가로 CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+ (안지오포이에틴 수용체), TEM-7+ (종양 내피 마커 7), CD31-, CD34-, CD45-, CD133-, CD143-, CD146- 또는 CXCR4- (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4) 중 1종 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 임의의 상기 AMDAC는 예를 들어 유동 세포계측과 같은 면역국소화로 결정가능한 바와 같이 추가로 CD9+, CD10+, CD44+, CD54+, CD98+, Tie-2+, TEM-7+, CD31-, CD34-, CD45-, CD133-, CD143-, CD146- 및 CXCR4-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 단기 신경 분화 검정으로 결정가능한 바와 같이 GFAP+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, AMDAC는 단기 신경 분화 검정으로 결정가능한 바와 같이 베타-튜불린 III (Tuj1)+이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 세포는 중간엽 줄기 세포 또는 "중간엽-유사" 줄기 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 골수 유래 중간엽 줄기 세포이다.
6.1.3 캡슐화
예를 들어 세포/액체 알기네이트 현탁액을 2가 양이온에 노출함으로써 액체 알기네이트 중에 현탁된 세포를 캡슐화하는 것에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법이 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다. 일반적으로, 본원에 포함되는, 알기네이트 중에 세포를 캡슐화하는 방법은 세포를 액체 알기네이트 중에 현탁시켜 세포/액체 알기네이트 현탁액을 형성하고; 세포/액체 알기네이트 현탁액을, 예를 들어 적가 방식으로 (예를 들어, 시린지를 통해) 소적으로서 분산시키고; 분산된 현탁액, 예를 들어 세포/액체 알기네이트 현탁액의 소적을 2가 양이온 (예를 들어, 칼슘, 바륨, 구리, 아연 또는 스트론튬)을 포함하는 용액에 노출시킴으로써, 세포/액체 알기네이트 현탁액 중의 알기네이트 중합체를 가교시켜서 캡슐화된 세포를 형성하는 것을 포함한다. 본원에 포함되는 캡슐화 방법은 세포/액체 알기네이트 현탁액을 단순히 알기네이트 중에 동결시키는 방법은 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 세포가 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 비드가 형성된다. 구체적인 실시양태에서, 세포가 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 형성된 비드는 히드로겔 구조를 형성한다. 세포가 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 형성된 비드는 그의 크기가 원하는 요구를 충족시키도록 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포가 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 형성된 비드는 크기가 약 100 ㎛, 약 200 ㎛, 약 300 ㎛, 약 400 ㎛, 약 500 ㎛, 약 600 ㎛ 또는 약 700 ㎛이다. 다른 실시양태에서, 세포가 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 형성된 비드는 크기가 약 100-200 ㎛, 약 100-300 ㎛, 약 200-400 ㎛, 약 200-500 ㎛, 약 300-500 ㎛, 약 300-600 ㎛, 약 400-600 ㎛, 약 500-600 ㎛, 또는 약 500-700 ㎛이다. 구체적인 실시양태에서, 세포가 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 형성된 비드는 크기가 500 ㎛ 미만이다.
세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 원하는 결과, 예를 들어 알기네이트 용액의 원하는 점도에 기초하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 0.5％ 미만이다. 다른 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 약 0.5％, 약 0.6％, 약 0.7％, 약 0.75％, 약 0.8％, 약 0.9％, 약 1.0％, 약 1.1％, 약 1.2％, 약 1.3％, 약 1.4％, 약 1.5％이다. 다른 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 1.5％ 초과이다. 다른 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 약 0.5％ 내지 약 1.0％, 약 0.75％ 내지 약 1.5％, 또는 약 1.0％ 내지 약 1.5％이다. 구체적인 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 0.75％이다. 구체적인 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트의 양은 ≥ 0.009 Pa.s의 점도를 얻기에 충분하다.
세포/액체 알기네이트 용액의 분산은 액침, 침수, 분무, 소적으로서, 예를 들어 시린지를 통한 분산, 정전 발생, 또는 원자화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
알기네이트를 가교하여 세포를 캡슐화하는데 사용되는 2가 양이온은 상기 기술 달성과 관련하여 당업계에 공지된 임의의 2가 양이온일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트를 가교하는데 사용되는 2가 양이온은 염화칼슘 (CaCl2), 염화바륨 (BaCl2), 염화스트론튬 (SrCl2), 염화구리 (CuCl2) 또는 염화아연 (ZnCl2)이다. 구체적인 실시양태에서, 세포/액체 알기네이트 용액 중의 알기네이트를 가교하는데 사용되는 2가 양이온은 염화칼슘 (CaCl2)이다. 특정 실시양태에서, 2가 양이온의 용액은 약 0.5％, 약 0.75％, 약 1.0％, 약 1.25％, 약 1.5％, 약 1.75％ 또는 약 2.0％ 2가 양이온을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 2가 양이온의 용액은 1.5％ 2가 양이온, 예를 들어 CaCl2를 포함한다.
6.1.4 동결보존
세포를 동결보존하는 것과 관련하여 당업계에 공지된 임의의 방법이 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다. 세포는 작은 용기 (예를 들어, 앰플); 동결보존을 위한 적합한 백; 또는 동결보존을 위한 임의의 다른 적합한 용기 중에서 본원에 기재된 동결보존 용액 중에 동결보존될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 시판되는 동결보존 배지, 예를 들어 시판되는 세포 냉동 배지, 예를 들어 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 카탈로그 번호 C2695, C2639 (세포 냉동 배지-혈청 무함유 1X, DMSO 무함유) 또는 C6039 (최소 필수 배지(Minimum Essential Medium), 글리세롤, 송아지 혈청 및 소 혈청을 함유하는 세포 냉동 배지-글리세롤 1X)로 표시되는 세포 냉동 배지, 론자(Lonza) 프로프리즈(PROFREEZE)™ 2X 배지, 또는 혈장용해물 중에 동결보존된다.
일부 실시양태에서, 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 형태인, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포는 1종 이상의 성분, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 5％, 약 10％, 약 15％, 약 20％, 약 25％, 약 30％, 약 35％, 약 40％, 약 45％, 약 50％, 약 55％ 또는 약 60％ HSA를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 용액은 약 5％ 내지 약 25％, 약 10％ 내지 약 30％, 약 20％ 내지 약 40％, 약 30％ 내지 약 50％, 약 40％ 내지 약 60％, 또는 약 50％ 내지 약 60％ HSA를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 용액은 40％ HSA를 포함한다.
다른 실시양태에서, 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 형태인, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포는 1종 이상의 동결방지제, 예를 들어 DMSO를 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 1％, 약 1.5％, 약 2％, 약 2.5％, 약 3％, 약 4％, 약 5％, 약 6％, 약 7％, 약 8％, 약 9％ 또는 약 10％ DMSO를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 용액은 약 1％ 내지 약 3％, 약 2％ 내지 약 4％, 약 3％ 내지 약 5％, 약 4％ 내지 약 6％, 약 5％ 내지 약 7％, 약 6％ 내지 약 8％, 약 7％ 내지 약 9％, 또는 약 8％ 내지 약 10％ DMSO를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 용액은 2.5％ DMSO를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 용액은 5％ DMSO를 포함한다.
다른 실시양태에서, 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 형태인, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포는 세포를 저장하는데 사용하기 위한 1종 이상의 용액, 예컨대 하이포써모졸® (미국 워싱턴주 보텔 소재의 바이오라이프 솔루션즈))을 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용액은 약 25％, 약 30％, 약 35％, 약 40％, 약 45％, 약 50％, 약 55％, 약 60％, 약 65％ 또는 약 70％ 하이포써모졸®을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 용액은 약 25％ 내지 약 50％, 약 40％ 내지 약 60％, 약 50％ 내지 약 60％, 약 50％ 내지 약 70％, 또는 약 60％ 내지 약 70％ 하이포써모졸®을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 용액은 55％ 하이포써모졸®을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 용액은 57.5％ 하이포써모졸®을 포함한다.
다른 실시양태에서, 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 형태인, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포는 1종 이상의 부형제, 예컨대 덱스트란, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 실리카 겔, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 및/또는 글리콜을 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존될 수 있다. 추가로, 캡슐화되거나 캡슐화되지 않은 형태인, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포는 특정 배지, 예를 들어 PBS 또는 DMEM을 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존될 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포는 40％ HSA, 5％ DMSO 및 55％ 하이포써모졸®을 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 용액 중의 세포가 캡슐화되고 상기 용액 중에 동결보존된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 용액 중의 세포는 캡슐화되지 않고 상기 용액 중에 동결보존된다.
세포는 동결보존 동안 예를 들어 약 1℃/분으로 냉각될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결보존 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 또는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 동결보존된 세포는 사용을 위해 해동 전에 액체 질소의 증기상으로 이송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 세포가 약 -80℃에 도달하면 이들은 액체 질소 저장 구역으로 이송된다. 동결보존은 또한 속도 조절(controlled-rate) 동결기를 이용하여 수행될 수 있다. 동결보존된 세포는 예를 들어 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도, 전형적으로 약 37℃의 온도에서 해동될 수 있다.
6.2 제약 조성물
본원은 상기 섹션 6.1.1에 기재된 세포 조성물 중의 세포를 포함하는, 본원에서 제공되는 방법에 따라 처리된 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물 중의 세포는 상기 섹션 6.1.2에 기재된 세포 유형이다.
본원에서 제공되는 제약 조성물은 생체내 투여를 위해 제제화된 세포/액체 알기네이트 용액 중에 캡슐화된 세포의 집단 또는 캡슐화되지 않은 세포의 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 허용되는 제약 조성물을 대표하는 동결보존 용액 중에 동결보존되기 때문에 세포를 해동 후에 대상체에게 바로 투여하는 것이 허용되며, 예를 들어 세포는 섹션 6.1.4에 기재된 성분 중 1종 이상을 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존된다. 다른 실시양태에서, 세포는 허용되는 제약 조성물을 대표하는 동결보존 용액 중에 동결보존되고, 상기 용액은 알기네이트를 포함하고, 상기 세포를 해동 직후에 캡슐화한 후에 상기 캡슐화된 세포를 대상체에게 바로 투여한다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 중의 세포는 용기 중에 세포를 포함하는 조성물의 형태로 대상체에게 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 용기는 백, 플라스크, 바이알 또는 단지(jar)이다. 상기 세포를 용기에서 꺼내고, 당업계에 공지되거나 하기 섹션 6.3.1에 기재된 임의의 적절한 수단, 예를 들어 주사를 이용하여 대상체에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용기는 적어도 또는 최대 약 1×102개 세포, 1×103개 세포, 1×104개 세포, 1×105개 세포, 1×106개 세포, 5×106개 세포, 1×107개 세포, 5×107개 세포, 1×108개 세포, 5×108개 세포, 1×109개 세포, 5×109개 세포, 1×1010개 세포 또는 1×1011개의 세포를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물 중의 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물 중의 세포는 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물 중의 세포는 AMDAC이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 95％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 90％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 80％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 75％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 50％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 제약 조성물은 살아있는 세포를 40％ 이상 포함하는 세포 집단을 포함한다.
6.3 용도
본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포 및 그의 제약 조성물은 치료 용도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 목적에 유용하다. 세포 및 그의 제약 조성물은 (i) 해동되고 후속적으로 캡슐화된 후 또는 (ii) 해동 후에 후속적인 캡슐화 단계 없이 대상체에게 투여될 수 있다는 사실로 인해 특히 유용하다. 각 경우에, 세포 및 그의 제약 조성물은 해동 후 및 투여 전에 임의의 개입 배양 단계에 대한 필요 없이 대상체에게 투여될 수 있다는 점에서 유용하며, 예를 들어 세포는 즉시 투여될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포 및 그의 제약 조성물은 이것들이 대상체에게 국부 투여될 수 있다는 점에서 유용하다. 따라서, 본원은 대상체에게 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포 또는 그의 제약 조성물을 투여 (예를 들어, 국부 투여)하는 방법을 제공한다.
6.3.1 투여량 및 투여 경로
대상체에게 본원에 기재된 방법에 따라 처리된 세포 (예를 들어, AMDAC 또는 태반 줄기 세포) 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것은 세포의 투여에 적합한 임의의 의학적으로 허용되는 경로에 의해 수행될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 세포는 예를 들어 투여 목적과 관련이 있는 대상체 신체의 특정 부위에 국부 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 볼루스 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 두개내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 근육내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 복강내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 피내 또는 피하 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 피하 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 흉골내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 활액낭내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 안내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 유리체내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 뇌내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 뇌실내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 경막내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 골내 주입에 의해 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 방광내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 경피 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 뇌조내 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 경막외 투여된다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 대상체에게 1회 투여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 대상체에게 2회 이상의 별개의 투여로 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×102 내지 1×103개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×103 내지 1×104개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×104 내지 1×105개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×105 내지 1×106개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×106 내지 1×107개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×107 내지 1×108개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×108 내지 1×109개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×109 내지 1×1010개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×1010 내지 1×1011개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×104 내지 약 2×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 2×104 내지 약 3×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 3×104 내지 약 4×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 4×104 내지 약 5×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 5×104 내지 약 6×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 6×104 내지 약 7×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 7×104 내지 약 8×104개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 8×104 내지 약 9×104개의 세포; 또는 대상체 1 킬로그램 당 약 9×104 내지 약 1×105개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×105 내지 약 2×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 2×105 내지 약 3×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 3×105 내지 약 4×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 4×105 내지 약 5×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 5×105 내지 약 6×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 6×105 내지 약 7×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 7×105 내지 약 8×105개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 8×105 내지 약 9×105개의 세포; 또는 대상체 1 킬로그램 당 약 9×105 내지 약 1×106개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 투여는 대상체 1 킬로그램 당 약 1×106 내지 약 2×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 2×106 내지 약 3×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 3×106 내지 약 4×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 4×106 내지 약 5×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 5×106 내지 약 6×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 6×106 내지 약 7×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 7×106 내지 약 8×106개의 세포; 대상체 1 킬로그램 당 약 8×106 내지 약 9×106개의 세포; 또는 대상체 1 킬로그램 당 약 9×106 내지 약 1×107개의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 투여되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여되는 세포는 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 투여되는 세포는 AMDAC이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 단일 단위 투여로 대상체에게 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 세포의 단일 단위 투여는 다양한 실시양태에서 적어도 또는 최대 약 1×105개, 5×105개, 1×106개, 5×106개, 1×107개, 5×107개, 1×108개, 5×108개, 1×109개, 5×109개, 1×1010개, 5×1010개, 1×1011개 또는 그보다 많은 수의 세포를 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 단일 단위 투여로 투여되는 세포는 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단일 단위 투여로 투여되는 세포는 태반 줄기 세세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단일 단위 투여로 투여되는 세포는 AMDAC이다.
7. 실시예
7.1 실시예 1: 캡슐화된 태반 줄기 세포의 생존율
본 실시예는 알기네이트 중에 캡슐화되는 경우에 태반 줄기 세포가 살아있다는 것을 입증한다.
7.1.1 25℃ 및 37℃에서의 저장
태반 줄기 세포 (5×105개 세포/mL)를 0.75％ 알기네이트 용액 중에 현탁시키고, 이러한 세포/액체 알기네이트 용액을 CaCl2 (1.5％ w/v)의 용액에 적하함으로써 상기 세포를 캡슐화하였다. 캡슐화된 세포를 25℃ 또는 37℃에서 7일 동안 저장하고, 죽은 세포는 아이오딘화프로피듐으로 표지하고 살아있는 세포는 칼세인 아세토메톡시 (AM)로 표지함으로써 다양한 시점에 세포 생존율을 측정하였다.
캡슐화된 태반 줄기 세포는 37℃에서 7일 동안 및 25℃에서 2일 동안 살아있는 상태를 유지하였다.
7.1.2 저온 저장
태반 줄기 세포 (5×105개 세포/mL 및 2×106개 세포/mL)를 0.75％ 알기네이트 용액 중에 현탁시키고, 이러한 세포/액체 알기네이트 용액을 CaCl2 (1.5％ w/v)의 용액에 적하함으로써 상기 세포를 캡슐화하였다. 하이포써모졸® (미국 워싱턴주 보텔 소재의 바이오라이프 솔루션즈) 저장 용액을 캡슐화된 태반 줄기 세포에 첨가하고, 상기 세포를 4℃ 또는 37℃에서 7일 동안 저장하였다 (즉, 상기 세포를 100％ 하이포써모졸® 중에 저장함). 죽은 세포는 아이오딘화프로피듐으로 표지하고 살아있는 세포는 칼세인 AM으로 표지함으로써, 또는 대사 활성 세포의 존재를 신호전달하는 ATP 존재량의 정량 결과를 기초로 하여 배양액 중 살아있는 세포의 수를 결정할 수 있게 하는 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega))을 이용하여 ATP의 수준을 측정함으로써 다양한 시점에 세포 생존율을 측정하였다.
37℃에서 배양된 하이포써모졸® 중의 캡슐화된 태반 줄기 세포는 예상되는 바와 같이 3일의 시간 후 죽었다. 그러나, 4℃에서 배양된 하이포써모졸® 중의 캡슐화된 태반 줄기 세포는 최대 7일 동안 생존하였다. 도 1을 참조한다.
7.2 실시예 2: 동결보존된 태반 줄기 세포의 캡슐화
본 실시예는 동결보존된 태반 줄기 세포가 해동 후 캡슐화될 수 있고, 해동 후 세포를 배양할 필요 없이 살아있는 상태를 유지할 수 있다는 것을 입증한다.
7.2.1 해동 후 알기네이트의 첨가 및 해동 후 캡슐화
40％ HSA, 55％ 덱스트란 40 및 5％ DMSO를 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존된 태반 줄기 세포 (7.5×106개 세포/mL)를 해동하고, 임의의 개입 배양 단계 없이 1.5％ 알기네이트 (PBS 중)와 1:1 비율로 혼합하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 세포를 캡슐화하였다. 캡슐화 후에 임의의 개입 배양 단계 없이, 하이포써모졸® (미국 워싱턴주 보텔 소재의 바이오라이프 솔루션즈) 저장 용액을 캡슐화된 태반 줄기 세포에 첨가하고, 상기 세포를 7일 동안 시린지 중에 4℃에서 저장하였다 (즉, 상기 세포를 100％ 하이포써모졸® 중에 저장함). 바이-셀(Vi-CELL)® 세포 생존율 분석기 (미국 캘리포니아주 브레아 소재의 벡크만 쿨터(Beckman Coulter))를 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여, 캡슐화된 태반 줄기 세포의 생존율을 분석하였다. 캡슐화 직후, 태반 줄기 세포는 대략 80％가 살아있었다. 저온 저장에서 7일이 지난 후, 태반 줄기 세포의 대략 45％가 살아있었다.
별개의 실험에서, 40％ HSA, 55％ 덱스트란 40 및 5％ DMSO를 포함하는 동결보존 용액 중에 동결보존된 태반 줄기 세포 (7.5×106개 세포/mL)를 해동하고, 임의의 개입 배양 단계 없이 1.5％ 알기네이트 (PBS 중)와 1:1 비율로 혼합하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 세포를 캡슐화하였다. 캡슐화 후에 임의의 개입 배양 단계 없이, 캡슐화된 태반 줄기 세포를 3종의 별개의 희석률 (1×, 0.5× 및 0.25×)로 성장 배지 중에 희석시키고, 셀타이터-글로® 발광 세포 생존율 검정 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가)을 이용하여 캡슐화후 제4시간 및 제24시간의 생존율을 평가하였다. 캡슐화된 태반 줄기 세포는 이들 두 시점 모두에서 살아있었으며, 생존율은 캡슐화후 제4시간 내지 제24시간 사이에서 비교적 일정하게 유지되었다. 도 2를 참조한다.
종합하면, 이들 실험은 동결보존된 태반 줄기 세포가 해동 후에 알기네이트 중에 현탁되고 후속적으로 캡슐화될 수 있으면서 해동 후 배양할 필요 없이 그의 생존율을 유지한다는 것을 입증한다. 첫번째 실험은 해동 직후에 알기네이트 중에 현탁되고 후속적으로 캡슐화된 태반 줄기 세포가 생존율을 유지하면서 짧은 기간의 시간 동안 저온 저장될 수 있다는 것을 추가로 입증한다.
7.2.2 동결보존전 알기네이트의 첨가 및 해동 후 캡슐화
5％ DMSO, 40％ 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 55％ 알기네이트 (1.5％ 농도)를 포함하는 동결보존 용액 중에 태반 줄기 세포 (7.5×106개 세포/mL)를 동결보존하였다. 동결보존된 태반 줄기 세포를 후속적으로 해동한 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 태반 줄기 세포를 캡슐화하였다. 캡슐화된 태반 줄기 세포의 생존율을 상기 기재된 바와 같은 바이-셀로 평가하였다. 캡슐화된 태반 줄기 세포는 캡슐화후 최대 7시간 동안 95％ 초과의 생존율을 유지하였고, 캡슐화후 25℃에서 제24시간에 대략 90％ 생존율을 유지하였다.
본 실험은 액체 알기네이트 중에 동결보존된 태반 줄기 세포가 해동 후 캡슐화될 수 있고, 해동되고 캡슐화된 세포가 배양할 필요 없이 그의 생존율을 유지한다는 것을 입증한다.
균등물:
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되고, 그 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims (1)

  1. 캡슐화된 세포의 집단의 용도.
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