KR20200044543A - 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 b 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 - Google Patents

신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 b 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황색 포도알균 장독소 B (Staphylococcal Enterotoxin B, SEB) 특이적인 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주(#C1, 2d 25-2) 및 이를 이용한 SEB 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 SEB에 대하여 우수한 민감도를 나타내고 다른 병원체 및 방해물질에 대하여 교차반응을 나타내지 않는다.

Description

신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 B 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 {Staphylococcal enterotoxin B diagnostic detection kit using rapid immunochromatography, its specific antibody and antibody-producing cell lines}
본 발명은 황색 포도알균 장독소 B 항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주(#C1, 2d 25-2) 및 상기 항체를 포함하고 민감도와 특이도가 개선된 황색 포도알균 장독소 B 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.
황색 포도알균 (Staphylococcus aureus)은 많은 외독소를 생산하는데, 그 중 하나가 황색 포도알균 장독소 B(Staphylococcal Enterotoxin B, SEB)이다. 상기 독소는 균체로부터 분비되는 물질이기 때문에 외독소라고 하며, 주로 상기 독소가 섭취된 후 장에 영향을 주기 때문에 장독소라고도 한다. SEB는 식중독의 흔한 원인이 되는 발열독소이며, 불결하게 취급된 음식물에서 생성되고 이 음식물을 섭취함으로써 증상을 나타낸다. 상기 독소는 다양한 생물학적 특성을 가지는데, 호흡기를 통해 노출된 경우에 나타나는 증세는 소화기를 통해서 흡수되는 경우와 매우 다른 증세를 나타낸다. 그러나, 어느 쪽 경로로 노출되더라도 인체에 매우 심각한 증세를 유발한다.
SEB는 식중독을 일으키는 원인으로 매우 흔하다. 호흡기계가 이 독소에 노출되었을 때 이 독소로 사망하는 사람은 적지만, 노출된 사람의 80% 이상은 임상적 증상을 나타내고, 1~2주 동안 거동이 힘들기 때문에 이 독소는 1969년 종식된 미국의 생화학 무기 프로그램에서 개발하였던 7가지 무기 중 하나였다.
또한, SEB는 강력하게 면역을 자극하는 슈퍼항원에 속한다. 슈퍼항원은 단핵구의 MHC type Ⅱ 수용체에 결합하여 많은 수의 T-림프구를 직접 자극하는데, 이 자극으로 염증성 사이토카인(종양괴사인자, 인터페론 감마, 인터루킨-1, 인터루킨-2)이 급격하게 생성된다. 그 결과 염증 반응이 매우 강하게 유발되고, 조직 손상이 일어난다. SEB가 일으키는 독성 효과는 분비된 사이토카인 때문에 발생할 것으로 예상되고 있다.
SEB에 의한 중독 증상은 독소 흡입 3시간 내지 12시간 후, 및 섭취 4시간 내지 10시간 후 시작된다. 갑작스럽게 발열, 두통, 오한, 근육통, 마른 기침 등이 나타나며 심한 경우 호흡곤란, 흉골 뒤 동통 등이 나타난다. 독소를 섭취한 경우에는 위장관 증세가 주로 나타나는데, 오심, 구토, 설사 등의 증상이 일어난다. 독소를 흡입한 경우에는 호흡기 증세가 주로 나타나는데, 마른 기침, 흉골 뒤의 통증, 호흡곤란 등의 증상이 일어난다.
호흡기 병리로 염증성 사이토카인이 폐에서 대량으로 발생되어 폐 모세혈관의 유출 및 폐부종이 발생한다. 심한 경우에는 급성 폐부종과 호흡부전이 발생한다. 섭씨 39도 내지 41도에 이르는 발열증상이 5일까지 지속되며, 기침은 4주까지 지속될 수 있으며, 환자는 약 2주간 업무수행에 지장을 받는다. 신체 진찰 소견은 뚜렷하지 않은 경우가 보통이다. 결막 충혈이나 체액 손실에 따른 기립성 저혈압이 나타날 수 있다. 흉부 검사상 소견은 특별한 것이 없지만 드물게 폐 부종 소견을 보일 수 있다. 또한, 심한 환자의 경우, 간질성 음영이 증가하며, 무기폐(atelectasis)나 폐부종으로 발전하거나, 성인호흡곤란증후군을 보이기도 한다.
SEB 중독증상은 인플루엔자, 아데노바이러스, 마이코플라즈마와 같은 호흡기 병원체에 의한 것과 유사하기 때문에 조기 진단이 어렵다. SEB에 의한 흡입 중독에 있어 특징적인 것은 단시간(24시간) 내에 다수의 환자가 발생한다는 것이다. 자연적으로 발생한 폐렴 또는 인플루엔자는 상당한 시간에 걸쳐 환자가 발생한다.
독소 항원을 ELISA 검사로 검출하면 진단을 내릴 수 있다. 그러나, 현재로서 SEB 중독증의 치료는 보존적 치료에 국한되어 있다. 환자의 증상을 완화시키기 위하여 해열제인 아세트아미노펜과 진해제를 투여한다.
현재 SEB 중독에 대한 백신은 없으며, 몇 개의 백신 후보물질이 개발 중에 있다. 수동적 면역요법은 SEB 흡입 후 4~8시간 내에 시도되었을 때 사망률을 줄일 수 있다는 사실이 실험적으로 알려져 있다. 그러나, SEB는 실험적으로 5분 내에 MHC 수용체와 결합하므로 실제적인 예방을 위해서 능동적 면역요법이 고려되어야 한다.
따라서, SEB에 의한 생물테러 의심상황 발생 시 현장에서 신속 탐지할 수 있는 기술의 개발은 테러상황 유무를 신속하게 판단하고 대응정책 결정을 위해 매우 중요하다. 이를 위하여 본 발명자는 SEB 독소의 현장 검출을 위한 면역크로마토그래피 기술 기반 신속 탐지키트를 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 생물테러 의심상황 등에서 신속한 대응을 위해, 황색 포도알균 장독소 B(Staphylococcal Enterotoxin B, SEB) 현장 검출을 위한 SEB 탐지 키트를 제공하는 것이다. 이를 위하여 본 발명은 SEB 인지항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주(#C1, 2d 25-2), 및 이를 이용한 SEB 탐지용 면역 크로마토그래피 키트를 제공한다.
본 발명은 황색 포도알균 장독소 B(Staphylococcal Enterotoxin B, SEB) 를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 제공한다.
상기 단일클론 항체는 기탁번호 KCLRF-BP-00443으로 기탁된 세포주 #C1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00444로 기탁된 세포주 2d 25-2에 의하여 생성되고, 황색 포도알균 장독소 B를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00443으로 기탁된 세포주 #C1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00444로 기탁된 세포주 2d 25-2에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 (i) SEB를 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계; (ii) 상기 비장에서 수득한 B림프구와 마이엘로마(Myeloma) 세포를 융합하는 단계; 및 (iii) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 세포주에 관한 것이다.
본 발명은 상기 단일클론 항체를 포함하는 SEB 탐지 키트에 관한 것이다. 상기 키트에서 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅될 수 있다.
상기 키트는 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 기존의 황색 포도알균 장독소 B(Staphylococcal Enterotoxin B, SEB) 탐지키트에 사용되는 항체보다 감도와 특이도가 우수한 항체를 제공함으로써 보다 신속하고 정확하게 SEB를 탐지 및 검출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체를 이용한 탐지키트는 종래의 제품과 비교하여 월등하게 우수한 민감도를 가지며, 타 병원체 및 독소 등에 대한 교차반응이 없어 매우 우수한 특이도를 갖는다.
도 1은 기존 상용화된 탐지키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 본 발명의 신규 항체를 적용한 탐지 키트의 감도를 비교평가한 결과이다.
도 2는 특이도 평가를 위하여 균체 및 독소 9종에 대한 교차반응 유무를 비교 평가한 결과이다.
도 3은 탐지키트가 방해물질에 대한 영향을 받는지 여부를 시험한 결과이다.
도 4는 탐지키트의 재현성을 평가하기 위해 각 항목별 20회의 감도 및 특이도 시험을 실시한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 모든 용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.　 또한 본 명세서에는 바람직한 방법, 시료 등이 기재되어 있으나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.　
본 발명에서 용어, "항체(antibody)"란 항원과 특이적으로 결합하는 단백질이며, 본 발명의 목적상 황색 포도알균 장독소 B(Staphylococcal Enterotoxin B, SEB)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다.
본 발명은 KCLRF-BP-00443으로 기탁된 세포주 #C1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00444로 기탁된 세포주 2d 25-2에 의해 생산되는, SEB에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.
KCLRF-BP-00443으로 기탁된 세포주 #C1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00444로 기탁된 세포주 2d 25-2에서 생산되는 항체는 기존의 포도상구균 장내독소B 검출키트에 사용된 항체보다 항원에 대한 친화도가 높은 신규한 항체이다. 항원에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주는 표준 기술에 따라 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기한 항체를 포함하는 SEB 탐지 키트에 관한 것이다. 상기의 항체를 포함하는 키트를 이용하여 생물테러 의심상황에서 SEB의 현장 검출을 신속하게 할 수 있다.
이러한 탐지키트에는 본 발명의 단일클론 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구 및 시약은 적합한 담체(carrier), 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제 및 안정화제 등을 포함되나 이에 제한되지 않는다.
적합한 담체(carrier)로는, 가용성 담체, 예를 들어 당해 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리 에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip)에 의해 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
항원-항체 복합체 형성을 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있도록 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
검출 라벨로 이용가능한 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포 프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트, 데카복실라제, β-라타마제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
형광물은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
리간드는 바이오틴 유도체 등을 포함하고, 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 단일클론 항체는 통상의 탐지키트의 재료로 사용되는 멤브레인에 코팅된 것일 수 있으며, 멤브레인은 나이트로 셀룰로스, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다.
본 발명자는, 멤브레인 종류별(제조사별, pore size 별) 및 검사선용 항체 농도별 시험을 실시하여 감도 및 특이도가 높은 멤브레인 및 항체 농도를 선별하였다. 그 결과 본 발명품 키트는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 검사선과 대조선 위치 부위에 항원 특이적 단일클론 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다.
본 발명은 검체 패드 시험을 통해 소, 마우스 혈청과 같은 동물 혈청 처리를 통해 비특이 반응을 제거하며 BSA, Casein등과 같은 안정제 등으로 전처리하여 선별 조건에 최적화된 패드 조성을 선별하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] - 단일클론 항체 제조
1. 면역 및 세포 융합
단일클론 항체 제조를 위해 Sigma-Aldrich에서 구매한 Staphylococcal enterotoxin B (Sigma, S4881) 항원을 Freund's adjuvant로 emulsion을 만든 후 마우스에 면역하였다. 마우스 면역량은 200~400㎍/dose의 농도로 1~2주 간격으로 4~8회 복강면역을 진행하였고, 세포 융합 1~3일 전에 항원을 미정맥으로 접종하였다.
세포 융합 하루 전에 미정맥으로 전채혈을 실시하여 단일클론 항체의 ELISA 검사시 사용하였다. 세포 융합에 사용할 비장은 무균조건 하에서 채취하여 폴리에틸렌글리콜(PEG 1500 시약)을 이용하여, 골수종(myeloma) 세포와의 세포 융합을 유도한 후 HAT 배지 및 HT 배지에서 세포 배양하였다.
2. 스크리닝, 복수생산 및 항체 정제
96 well에 배양된 융합 세포는 ELISA에 의한 1차 및 2차 스크리닝을 통하여 교차반응이 없는 양성 클론을 선별하였다. 그 결과 얻어진 세포주를 2018.08.01.자로 한국세포주은행에 기탁하였다(기탁번호 KCLRF-BP-00443, KCLRF-BP-00444). 이들 세포주를 마우스 복강 접종하여 복수 생산을 하였다. 복강 접종 10~20일 후 복강 내 복수가 생산되면 마우스당 약 2~4㎖의 복수를 채취하였다. 채취한 복수는 원심분리로 혈구 및 피브린 등을 제거하고 이를 정제에 사용하였다. 마우스 복수 정제는 Protein G chromatography gel을 이용하여 protein G에 특이적인 항체인 마우스 IgG를 정제하였다. 마우스 IgM은 특이적인 gel affinity chromatography 방법을 사용하지 않고, 투석 및 DEAE gel 정제 방법으로 IgM을 정제하여 제제화에 사용하였다. 정제된 단일클론 항체 후보군은 골드(gold)를 이용한 스크리닝으로 선별하였다.
[실시예 2] - 황색 포도알균 장독소 B 탐지키트의 제조
나이트로셀룰로스 멤브레인의 검사선과 대조선 위치에 선별된 항원 특이적 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다. 선별된 항체를 접합한 금접합체를 패드에 분주하여 건조한 후 절단하여 골드패드를 제조하였다. 라미네이터를 이용하여 플라스틱 카드에 멤브레인, 골드패드, 검체패드, 흡습패드를 부착하여 키트를 제조하였다.
[시험예 1] - 감도(검출한계) 시험
황색 포도알균 장독소 B(Staphylococcal Enterotoxin B, SEB)의 검출 한계를 시험하기 위하여, SEB의 농도를 희석하면서 감도 평가를 실시하였다. 기존 상용화된 SD 탐지 키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 실시예 2에서 제조된 탐지키트의 감도 비교평가를 실시하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 총 10회 반복 시험한 결과 검출한계가 0.6 ng/ml로 측정되어, 기존 제품 5ng/ml 대비 감도가 8배 정도 개선되었음을 확인할 수 있었다.
[시험예 2] - 특이도 시험
특이도 평가를 위하여 페스트, 리신, 브루셀라 등 균주 및 독소 10종에 대한 교차 반응(cross reactivity)을 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.
Figure pat00001
상기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 다른 검체와의 교차 반응이 발생하지 않음을 확인할 수 있었다.
[시험예 3] - 방해물질 시험
탐지키트의 성능에 영향을 미칠 수 있는 소 혈청, 사람 혈청, 설탕, 밀가루, 토양 등을 포함한 10종의 예상 방해물질을 선정하여 특이도 테스트를 진행하여, 방해물질의 영향 유무를 확인하였다.
상기 실험결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.
Figure pat00002
상기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 10종의 방해물질로부터 방해 작용을 받지 않음을 확인하였다.
[시험예 4] - 재현성 시험
실시예 2에서 제조된 탐지키트가 재현성이 있는지 확인하기 위해 총 20회의 감도 및 특이도 시험을 진행하였다. 감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성검체로 하여 실험하였다.
상기 실험결과를 도 4에 나타냈으며, 모두 재현성이 있는 것으로 확인되었다.
[시험예 5] - 가속 안정성 시험
실시예 2에서 제조된 탐지키트의 유효기간 설정을 위해, 스트립을 55℃, 7주간 보관한 후 1주차 간격으로 꺼내 실온 보관한 스트립과의 감도 및 특이도 비교시험을 실시하였다.
감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성 검체로 하여 실험을 진행하였다. 실험결과 7주간의 가속 안정성 시험 이후에도 감도와 특이도 모두 이상 없음을 확인하였다.
[시험예 6] - 교차반응 시험
탐지키트가 다른 균주 또는 독소와의 교차반응이 있는지 확인하기 위해 24종의 균주 혹은 독소와의 교차 테스트를 진행하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 교차반응 시험 균주 및 물질 24종에 대하여 교차가 없음을 확인 할 수 있었다.
Figure pat00003
한국세포주연구재단 KCLRFBP00443 20180801 한국세포주연구재단 KCLRFBP00444 20180801

Claims (6)

  1. 기탁번호 KCLRF-BP-00443으로 기탁된 세포주 #C1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00444로 기탁된 세포주 2d 25-2에 의하여 생성되고, 황색 포도알균 장독소 B를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  2. 기탁번호 KCLRF-BP-00443으로 기탁된 세포주 #C1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00444로 기탁된 세포주 2d 25-2.
  3. 제2항에 있어서, 하기 단계로 생산되는 것을 특징으로 하는 세포주:
    (i) 황색 포도알균 장독소 B를 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계;
    (ii) 상기 비장에서 수득한 B 림프구와 마이엘로마(Myeloma) 세포를 융합하는 단계; 및
    (iii) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계.
  4. 제1항의 단일클론 항체를 포함하는 황색 포도알균 장독소 B 탐지키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅된 것을 특징으로 하는 황색 포도알균 장독소 B 탐지키트.
  6. 제4항에 있어서, 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 황색 포도알균 장독소 B 탐지키트.
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