KR20200044711A - 항-l1cam 항체 또는 그의 항원결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

항-l1cam 항체 또는 그의 항원결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L1CAM 항원에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 L1CAM에 대한 특이성 및 친화성이 우수하므로, L1CAM의 고발현과 관련된 다양한 암 및 염증성 질환과 관련된 질병의 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 항-L1CAM 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 T 림프구 등 효과기 세포에 발현시키는 경우 L1CAM과 관련된 다양한 암 및 염증성 질환의 면역 치료방법으로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항-L1CAM 항체 또는 그의 항원결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체{Anti-L1CAM Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, and Chimeric Antigen Receptor Comprising The Same}
본 발명은 L1CAM 항원에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
난소암은 가장 치명적인 부인과 악성종양으로서 부인과 종양에 의한 사인에 주요한 원인이 된다. 수술적인 접근방법 및 세포독성 치료제의 병행 치료법에 상당한 발전이 이루어져 왔음에도 불구하고, 진단 당시 단계가 많이 진행된 대다수의 환자들에서는 결국 재발하는 경우가 많다. 따라서, 난소암에 대한 새로운 치료방법이 절실히 요구되고 있다. 난소암의 발생이 면역적 원인에 의한 것일 수 있다는 것과 난소암이 면역계에 의해 인식되고 공격될 수 있다는 점이 점점 밝혀지면서, 면역요법을 기반으로 한 다양한 치료 방법들이 활발하게 연구되고 있다. 실제로 많은 수의 펩타이드 백신, 수지상 세포 백신 및 양자세포 치료요법들이 임상실험 중에 있다.
특히 최근 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 T 세포(CAR-T)를 이용한 혈액암을 대상으로 한 양자적 치료(adoptive therapy)의 치료적 가능성이 입증되었으며, 시판된 바 있다. 또한, 새롭게 발표되고 있는 연구 결과들은 CAR-T가 고형암에서도 유사한 효과를 나타낼 가능성이 있음을 암시한다. CAR는 T 세포에 HLA-비제한적 방식으로 세포독성 효과기 기능을 부여한다는 점에서 독특하며, 특히 난소암의 진행이 HLA의 하향조절과 상관관계가 있다는 점에서 매우 중요하다. 실제로 난소암과 관련된 인자로 알려진 메소델린(mesothelin), MUC16, 엽산 수용체(folate receptor)에 특이적인 CAR-T를 이용한 난소암 치료가 시도되고 있으나, 아직까지는 치료 효과가 충분하지 않은 실정이다.
한편, L1-세포부착분자(L1-cell adhesion molecule, L1-CAM, L1CAM)는 난소암을 비롯한 다양한 암종에서 높게 발현된다고 알려져 있으며, 이러한 L1CAM의 고발현은 부정적인 임상적 치료 결과와 관련되어 있다. 이전의 연구에 따르면 L1CAM에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 직접 인간 난소암 세포인 SKOV3 세포주에 인 비트로 및 이를 이식한 동물모델(human xenograft model)에 처리한 결과, 종양세포의 성장을 억제하는 결과를 도출한 바 있다. 본 발명자들은 이러한 L1CAM의 다양한 암종에 대한 관련성 및 난소암 등에 대한 치료가능성에 착안하여 본 발명을 하기에 이르렀다.
Hao Hong. L1 Cell Adhesion Molecule-Specific Chimeric Antigen Receptor-Redirected Human T Cells Exhibit Specific and Efficient Antitumor Activity against Human Ovarian Cancer in Mice. (2016). PLoS ONE 11(1): e0146885
본 발명자들은 L1CAM에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 개발된 항-L1CAM 항체가 인간 및 마우스 L1CAM 항원분자에 매우 특이적으로 결합하며 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 CAR-T가 SKOV3 난소암 세포주, SH-SY5Y 신경아세포종 세포주 및 Hela 자궁경부암 세포주에 대해 높은 항암 활성을 나타내는 것을규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 L1CAM 항원에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 효과기 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 대상체에 투여하여 L1CAM의 고발현과 관련된 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서, 본 발명의 일 양태에 따른 항체는 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체 및 친화도 성숙을 거친 이들의 변형 항체이다.
본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 종래의 항-L1CAM 항체와 마찬가지로 L1CAM 항원에 대해서 특이적인 결합능을 가진다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)"는 L1CAM 항원에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfided bond)으로 연결되어 있다. 용어 "중쇄(heavy chain)"는 그의 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하고 항체가 속하는 클래스를 통상 결정하는, 폴리펩티드 쇄의 2개의 종류 중 더 큰 것을 의미한다. 상기 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역(variable region of heavy chain) 도메인 VH 및 3개의 중쇄 불변 영역(constant region of heavy chain) 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다.
용어 "경쇄(light chain)"는 그의 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2개의 종류 중 더 작은 것을 의미한다. 상기 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역(variable region of light chain) 도메인 VL 및 경쇄 불변 영역(constant region of light chain) 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 경쇄의 불변 영역(constant region of light chain)은 카파 및 람다 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
용어 "항원(antigen 또는 Ag)"은 면역반응을 유발하는 분자를 의미한다. 상기 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역-적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 수반할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산서열을 의미한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab(fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric) 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, L1CAM 를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 i), ii), 및 iii)을 포함하는 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH) 및 다음 vi), v), 및 vi)을 포함하는 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
i) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1(complementarity determining region 1 of heavy chain):
X1YAMX5
여기서 서로 독립적으로,
X1은 D, S, 또는 N이고;
X5는 N, H, 또는 S이고;
ii) 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2(complementarity determining region 2 of heavy chain):
AISSX5GX7X8X9YYADSVKG
여기서 서로 독립적으로,
X5는 S 또는 T이고;
X7은 S, 또는 G이고;
X8은 S, 또는 T이고;
X9는 I, T, 또는 K이고;
iii) 서열번호 15 내지 서열번호 23로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3(complementarity determining region 3 of heavy chain);
iv) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1(complementarity determining region 1 of light chain):
RASQSIX7X8X9LN
여기서 서로 독립적으로,
X7은 S 또는 G이고;
X8은 R, N, 또는 S이고;
X9는 D 또는 Y이고;
v) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2(complementarity determining region 2 of light chain):
AX2SX4LQS
여기서 서로 독립적으로,
X2는 A, 또는 T이고;
X4는 S, N, R, 또는 T이고;
vi) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3(complementarity determining region 3 of light chain):
QQSX4SX6PX8T
여기서 서로 독립적으로,
X4는 Y, 또는 E이고;
X6은 T, F, 또는 Y이고;
X8은 Y, W, L, 또는 F이다.
본 명세서에서 사용된 “Xn”및 “Xm”등의 기호는 상기 정의된 일반식에서 위치 n 및 m의 아미노산을 표시하기 위해 사용한 것이다. 여기에서 n 및 m은 상기 서열의 N-말단으로부터 계산되는 상기 서열 내의 아미노산 위치를 표시하는 정수이다. 예컨대 X1 및 X5는 상기 서열의 N-말단으로부터 각각 1번째 및 5번째 위치의 아미노산을 표시하는 것이다.
본 발명의 일 구현예의 경우, 상기 일반식 내의 Xn 또는 Xm이 될 수 있는 가능한 아미노산 잔기의 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 통상의 기술자는 Xn이 가능한 잔기들의 나열된 그룹들의 어느 하나로부터 선택될 수 있다는 것과 이러한 선택이 Xm의 아미노산의 선택과는 독립적으로 이루어지며, 여기서 n과 m은 다르다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 일반식에서 Xn 위치에서 나열된 가능한 아미노산 잔기들 중 어떤 것이라도 다른 다양한 위치(Xm 위치)에서 나열된 가능한 아미노산 잔기들 중 다른 것과 독립적으로 조합될 수 있다.
하기 실시예에서 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체, 그의 변형 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편의 CDRH1, CDRH2, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3는 각각 상기 i), ii), iv), v), 및 vi)으로 표시되며, 상기 일반식은 수많은 랜덤 변형 항체들을 통계적으로 분석한 결과에 기초하여 작성된 것이다. 상기 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 항원 결합 단편과 이들의 변형 항체들은 반복적인 선발 시험에 의해 L1CAM과의 상호작용이 확인되어 선택되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 서로 독립적으로, 상기 CDRH1의 X1은 D 또는 S이고; 상기 X5는 N, H, 또는 S이다.
본 발명의 실시예에서, 상기 일반식으로 나타낸 CDRH1의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 일반식으로 나타낸 CDRH1의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 3, 및 7로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응되며, 이들은 본 발명에서 최종 선별된 4종의 항체의 CDRH1과 대응된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 서로 독립적으로,
상기 CDRH2의 X5는 T, 또는 S이고;
상기 CDRH2의 X7은 S, 또는 G이고;
상기 CDRH2의 X8은 S, 또는 T이고; 및
상기 CDRH2의 X9는 I, 또는 T이다.
본 발명의 실시예에서, 상기 일반식으로 나타낸 CDRH2의 아미노산 서열은 서열번호 8 내지 14로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 일반식으로 나타낸 CDRH2의 아미노산 서열은 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응되며, 이들은 본 발명에서 최종 선별된 4종의 항체의 CDRH2와 대응된다.
또한, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CDRH3의 아미노산 서열은 서열번호 15 내지 17, 및 22로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 대응되며, 이들은 본 발명에서 최종 선별된 4종의 항체의 CDRH3와 대응된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 CDRL1의 아미노산 서열은 서열번호 32 내지 36로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CDRL1의 아미노산 서열은 서열번호 32 내지 34, 및 36으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응되며, 이들은 본 발명에서 최종 선별된 4종의 항체의 CDRL1과 대응된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 서로 독립적으로, 상기 CDRL2의 X2는 A, 또는 T이고; X4는 S, 또는 N이다.
본 발명의 실시예에서, 상기 일반식으로 나타낸 CDRL2의 아미노산 서열은 서열번호 37 내지 42로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 일반식으로 나타낸 CDRL2의 아미노산 서열은 서열번호 37, 38, 및 42로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응되며, 이들은 본 발명에서 최종 선별된 4종의 항체의 CDRL2과 대응된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 서로 독립적으로,
상기 CDRL3의 X4은 Y이고;
상기 CDRL3의 X6은 T 또는 F이고; 및
상기 CDRL3의 X8은 Y 또는 W이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 일반식으로 나타낸 CDRL3의 아미노산 서열은 서열번호 43 내지 47로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 일반식으로 나타낸 CDRL3의 아미노산 서열은 서열번호 43 또는 44의 아미노산 서열에 대응되며, 이들은 본 발명에서 최종 선별된 4종 항체의 CDRL3와 대응된다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서 상기 VH는 서열번호 24 내지 26으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 상기 VH는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)을 포함한다.
또한, 상기 VH는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 FRH2(Framework region 2 of Heavy chain)를 포함한다.
또한, 상기 VH는 서열번호 28 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 FRH3(Framework region 3 of Heavy chain)를 포함한다.
또한, 상기 VH는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 FRH4(Framework region 4 of Heavy chain)를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 VH는 다음 vii)의 아미노산 서열을 포함한다:
vii) EVQLVESGGGLXaQPGGSLRLSCAASGFTFS[CDRH1]WVRQAPGKGLEWVS[CDRH2]RFTISRDNSKNTLYLQXbNSLRAEDTAVYYCAK[CDRH3]WGQGTLVTVSS
여기서 서로 독립적으로,
상기 [CDRH1], [CDRH2], 및 [CDRH3]는 상기에서 정의된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3의 아미노산 서열이고;
상기 Xa는 V, L, 또는 A이고; 및
상기 Xb는 M 또는 I이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, vii)에서 상기 Xa는 V이고, 상기 Xb는 M이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 VH의 아미노산 서열은 서열번호 52 내지 55로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 VL은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FRL1(Framework region 1 of Light chain)을 포함한다.
또한, 상기 VL은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FRL2(Framework region 2 of Light chain)을 포함한다.
또한, 상기 VL은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FRL3(Framework region 3 of Light chain)을 포함한다.
또한, 상기 VL은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FRL4(Framework region 4 of Light chain)을 포함한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 VL은 다음 viii)의 아미노산 서열을 포함한다:
viii) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC[CDRL1]WYQQKPGKAPKLLIY[CDRL2]GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC[CDRL3]FGQGTKVEIK
여기서 서로 독립적으로, 상기 [CDRL1], [CDRL2], 및 [CDRL3]는 상기에서 정의한 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 아미노산 서열이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 VL의 아미노산 서열은 서열번호 56 내지 59로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응된다.
한편, 본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 90%, 93%, 95% 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 링커에 의해 연결될 수 있다.
여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 (G4S)3 또는 (S4G)3 이다.
다른 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이고, 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다:
경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역; 또는
중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역.
본 발명의 가장 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 64 내지 67로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산성, 정제 효율, 생물학적 활성의 향상, 융합단백질의 안정성 증가, 폴딩(folding)의 향상 및/또는 추가적인 기능성을 가진 기능적 모이어티(moiety)와의 결합을 위하여 제조된다. 상기 융합단백질은 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 재조합 융합단백질(recombinant fused protein)로 발현되는 것을 통해 공유결합에 의해 연결되거나, 또는 화학적 컨쥬게이션(conjugation)에 의해 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 연결된 컨쥬게이트(conjugate)의 형태로 구현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 제공한다:
(a) L1CAM 결합 도메인(L1CAM binding domain);
(b) 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM);
(c) 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
(d) 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD).
본 명세서에서, 용어 “키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)”는 효과기 세포 신호전달 또는 효과기 세포 활성화 도메인(e.g. T-세포 신호전달 또는 T-세포 활성화 도메인)에 연결된 타겟 결합 도메인(e.g. 단일쇄 가변 단편(scFv))을 포함하는 인공적으로 제작된 하이브리드 단백질(융합 단백질) 또는 폴리펩타이드이다. 키메라 항원 수용체는 일반적으로 단일클론항체의 항원-결합 성질을 이용하여 비-MHC-제한 방식으로, 선택된 표적에 대한 T-세포 특이성 및 반응성을 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T-세포에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 도피의 주요 메카니즘을 회피시킨다. 또한, CAR은 T-세포에서 발현될 때, 유리하게는 내재성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화되지 않는다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 상술한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포외 항원 결합 도메인으로서 포함한다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항-L1CAM 키메라 항원 수용체(anti-L1CAM CAR), 항-L1CAM CAR 등으로 표현된다.
본 발명의 실시예에서 사용된 “L1-CAR”, “L1CAM-CAR”, “L1-H8-CAR” 등의 용어는 본 발명자들이 발명한 항-L1CAM 키메라 항원 수용체의 코드명칭으로서, 상술한 L1CAM에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 상술한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 L1CAM 결합도메인을 포함하므로 L1CAM 항원을 인식하며 세포의 표면에서 발현된다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포의 표면에서 발현되므로, 막횡단 도메인을 포함한다. 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인, 또는 이들의 전부 또는 일부 서열의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 막횡단 도메인은 CD8, 또는 CD28의 막횡단 도메인이며, 가장 구체적으로는 서열번호 78의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 CD28의 막횡단 도메인, 또는 서열번호 119의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 CD8 알파의 막횡단 도메인이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Toll-like ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 공동자극 도메인은 CD28, OX40, 4-1BB (CD137), 및 ICOS (CD278)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 79의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 CD28의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 80의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 OX40의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 101 또는 서열번호 120의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 102의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 ICOS의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 전부 또는 일부 서열의 조합이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합이다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 가장 구체적으로는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 81의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 121의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 CD3 zeta-iso2M, 서열번호 126의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 CD3 zeta-iso2이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 선행 서열(leader sequence, LS)을 선택적으로 더 포함한다. 상기 선행 서열은 키메라 항원 수용체를 구성하는 재조합 폴리펩티드의 아미노-말단(N-terminal)에 위치한다. 상기 선행 서열은 키메라 항원 수용체의 세포내 프로세스 및 세포막으로 국재화(localization)되면서 항원 결합 도메인으로부터 임의로 절단된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 선행 서열은 hCD8 alpha의 선행 서열, hGM-CSF receptor alpha-chain의 선행 서열, 또는 3E8 항체의 선행 서열일 수 있다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 선행 서열은 서열번호 128 내지 130의 염기서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 선행 서열이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 상기 L1CAM 결합 도메인은 힌지 도메인(또는 스페이서)에 의해 상기 막횡단 도메인에 연결된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 힌지 도메인은 IgG1, IgG2, IgG4, 또는 IgD에서 유래한 힌지, CD8 또는 CD28에서 유래한 힌지, CD28에서 유래한 세포외 도메인(ECD) 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 힌지 도메인은 서열번호 77의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 IgD 힌지, 서열번호 85의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 IgG1 힌지, 서열번호 86의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 IgG1 CH3 힌지, 서열번호 118의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 hCD8 alpha 힌지, 서열번호 124의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 힌지, 서열번호 125의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 hCD28 세포외 도메인 또는 이들의 전부 또는 일부 서열의 조합이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 키메라 항원 수용체 분자를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는 다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다만, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 키메라 항원 수용체의 L1CAM 결합도메인 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 핵산 분자는 서열번호 60 내지 63으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 키메라 항원수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는 상기한 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 전달 벡터와 발현 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 전달 벡터는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 본발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 상기 프로모터는 예컨대 EF-1 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 유전자 전달을 위해 선택된 유전자는 레트로바이러스 벡터 내에 삽입되고, 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합된 레트로바이러스는 인 비보, 또는 인 비트로에서 목적하는 숙주 세포로 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 벡터가 관련 기술분야에 알려져 있으며, 본 발명의 구체적인 구현예에서 상기 레트로바이러스 벡터는 MLV-기반의 레트로바이러스벡터인 pMT 레트로바이러스 벡터이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 유전자 클로닝을 위한 벡터, 단백질의 발현을 위한 벡터, 또는 유전자의 전달을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 이들은 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 한편, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 CAR 폴리펩티드의 발현을 평가하기 위한 선택표지로서 선택가능 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능 마커 유전자로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 리포터 유전자로는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 녹색형광 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기에서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 상기 효과기 세포는 자가 세포 또는 동종이형 세포의 집단을 포함한다. 즉, 상기 효과기 세포는 본 항-L1CAM CAR 폴리펩티드를 발현하는 자가 세포 또는 동종이형 세포의 집단을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "자가"는 개체에게 재도입될 예정인, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 나타낸다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 효과기 세포는 항-L1CAM CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염 또는 형질 도입된 세포의 집단을 포함한다. 상기 형질 감염 또는 형질 도입은 상술한 바와 같이 당업계에 알려진 다양한 수단에 의해 제한없이 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면 본 발명의 효과기 세포, 예컨대 T 림프구, 또는 자연살해 세포로 전달되고, 항-L1CAM CAR 코딩 핵산 분자는 mRNA로 전사되며, 상기 mRNA로부터 항-L1CAM CAR 폴리펩티드가 번역되어 효과기 세포의 표면에 발현된다.
본 발명의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항-L1CAM CAR를 발현하는 효과기 세포는 표면에 L1CAM을 발현하는 암세포주인 SKOV3(난소암세포주), SH-SY5Y(신경아세포종 세포주), HeLa(자궁경부암 세포주)를 효과적으로 사멸시킨다. 따라서, 본 발명의 항-L1CAM CAR를 발현하는 효과기 세포는 다양한 암종에 대한 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 치료 또는 진단용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 상기한 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 "면역치료(immunotherapy)"란, 면역체계가 암을 제거하도록 돕는 암의 치료방법이다. 면역치료는 능동적 면역치료와 수동적 면역치료로 구분된다. 능동적 면역치료는 i) 암세포 또는 암세포에 의해 생성된 물질을 인체에 주입하여 면역체계를 활성화시키는 암 백신 치료(cancer vaccine therapy), ii) 사이토카인(인터페론, 인터류킨 등), 성장인자 등 면역조절제(immune-modulating agents)를 투여하여 특정 백혈구를 활성화시키는 면역조절 치료를 포함한다. 수동적 면역치료는 특정 암세포에 결합하는 치료적 항체(therapeutic antibody)와 면역세포치료(immune cell therapy)를 포함한다. 면역세포치료는 구체적으로 수지상세포 백신 치료(dendritic cell vaccine therapy)와 CAR-T(chimeric antigen receptor T cell) 치료, NK 세포 치료(natural killer cell therapy), CTL 치료(cytotoxic T lymphocyte therapy), 입양 세포 전이(adoptive cell transfer) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 면역치료는 주로 상술한 면역세포치료를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표적세포의 L1CAM 항원에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 포함하므로, L1CAM의 고발현과 관련된 질환의 진단 또는 치료에 효과적이다. 상기 L1CAM의 고발현과 관련된 질환으로는 암과 염증성 질환이 있다.
특히 상기 L1CAM의 고발현과 관련된 암은 고형암이고, 상기 고형암은 위암, 유방암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암(endometrial carcinoma), 위장관 기질암(gastrointestinal stromal tumer) 난소암, 흑색종, 담낭암, 간세포암(hepatocelluloar carcinoma), 담관암(cholangiocarcinoma), 췌관선암(pancreatic ductal adenocarcinoma), 식도암, 신세포암(renal cell carcinoma), 직장암, 결장암, 전립선암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 갑상선암, 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma) 및 성상세포종(astrocytoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 상기 L1CAM의 고발현과 관련된 염증성 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 CAR-발현 효과기 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 효과기 세포를 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 종양 내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 투여될 수 있다.
본 발명을 필요로 하는 대상체는 말초 혈액 줄기세포 이식 이후 고용량 화학요법을 이용한 표준 치료를 받을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명을 필요로 하는 대상체는 상기 말초 혈액 줄기세포 이식 이후에 또는 이식과 동시에, 본 발명의 확장된 CAR T 세포를 투여받을 수 있다. 다른 일 구현예에 있어서, 확장된 세포는 수술 이전 또는 수술 이후에 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"에 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 결정되며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으며, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "항종양"은 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암적 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 104 내지 109 세포/kg 체중, 몇몇 경우에 105 내지 106 세포/kg 체중 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수의 횟수로 투여할 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 이용하여 투여할 수 있다 (예를 들어 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 유효성분 이외에 다른 약제학적 활성 약제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 "조합"은 동시 또는 병용투여로 표현될 수 있다. 본원에 기재된 CAR-발현 효과기 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 별개의 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고 추가의 작용제는 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.
상기 본 발명의 약제학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 치료제로는 당업계에 공지된 1 이상의 화학치료제(예컨대 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등), 1 이상의 표적치료제(예컨대 베바시주맙(bevacizumab), 올라파립(olaparib) 등), PD-1/PD-L1 특이적인 면역관문 억제제(예컨대 옵디보, 키트루다)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 염증성 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법의 대상 질병인 상기 암 및 염증성 질환은 약학적 조성물의 치료 대상 질병과 관련하여 정의한 것과 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.
본 발명의 암 또는 염증성 질환의 치료방법은 유효성분으로서 상술한 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 공통적으로 사용하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 L1CAM 항원에 특이적으로 결합하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이들의 용도를 제공한다. 본 발명의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 L1CAM에 대한 특이성 및 친화성이 우수하므로, L1CAM의 고발현과 관련된 다양한 암 및 염증성 질환과 관련된 질병의 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 항-L1CAM 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 T 림프구 등 효과기 세포에 발현시키는 경우 L1CAM과 관련된 다양한 암 및 염증성 질환의 면역 치료방법으로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 파지 디스플레이 라이브러리 패닝 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 파지 패닝 라운드에 따른 항원 mL1CAM의 파지의 증폭(enrichiment) 정도를 나타낸 그래프이다(위: phage output titer, 아래: Elution titer ratio).
도 3a 내지 도 3c는 파지 패닝 라운드 별 항원 mL1CAM에 대해 특이적으로 결합하는 파지 클론을 선별하기 위하여 단일클론 파지 ELISA (monoclonal phage ELISA)를 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 선별된 9종의 scFv 클론의 선별 빈도를 나타낸 도이다.
도 5는 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 교차 결합하는 항체 발굴을 위해 본 발명에서 선별한 마우스 L1CAM에 결합하는 unique 항-mL1CAM scFv 클론 9종을 대상으로 hL1CAM에 대하여 단일클론 파지 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 정제된 항-mL1CAM scFv 클론의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7a 내지 7c는 도 5의 soluble ELISA 결과에 따른 본 발명의 4종 항-L1CAM scFv 항체의 mL1CAM 및 hL1CAM 항원에 대한 친화성을 나타낸 도이다.
도 7d-7e는 octet system 결과에 따른 본 발명의 4종 항-L1CAM scFv 항체의 mL1CAM 및 hL1CAM 항원에 대한 친화성을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pMT-CAR 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 10a-10b는 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-CAR-001, L1-CAR-002, L1-CAR-003, 및 L1-CAR-004)의 구조를 나타낸 도이다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 4종의 CAR-콘스트럭트(L1-CAR-001, L1-CAR-002, L1-CAR-003, 및 L1-CAR-004)를 도입한 레트로바이러스 벡터를 나타낸 도이다.
도 12는 SKOV3 세포와 293T 세포에서의 L1CAM 발현율을 확인한 도이다.
도 13a 및 도 13b은 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SKOV3 세포(L1CAM 고발현, 도 13a) 및 293T 세포(L1CAM 저발현, 도 13b)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 항-L1CAM CAR(항-L1-CAR) 발현 T 세포의 생체 내 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pMT-CAR-002 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 17은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-002)의 구조를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pMT-CAR-003 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 19은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 20은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-003)의 구조를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 22는 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-004)의 구조를 나타낸 도이다.
도 23a-23d은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 4종의 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001, L1-H8-CAR-002, L1-H8-CAR-003, 및 L1-H8-CAR-004)를 도입한 레트로바이러스 벡터를 나타낸 도이다.
도 24a-24g는 SKOV3 세포, Hela 세포, SH-SY5Y 세포 및 293T 세포에서의 L1CAM 발현율을 확인한 도이다.
도 25는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SKOV3 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 26은 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 293T 세포(L1CAM 저발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 27a-27b는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SH-SY5Y 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 28a-28b는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 Hela 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 29는 본 발명의 항-L1CAM CAR(항-L1-CAR) 발현 T 세포의 생체 내 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 30은 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pMT-CAR-004 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 31은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 32는 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-28BB)의 구조를 나타낸 도이다.
도 33은 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pBHA-ICOS TM+ICD 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 34는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 35는 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-28ICOS)의 구조를 나타낸 도이다.
도 36은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 37은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-28)의 구조를 나타낸 도이다.
도 38은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 39는본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-OX)의 구조를 나타낸 도이다.
도 40은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 41은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-BB)의 구조를 나타낸 도이다.
도 42는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 43은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-ICOS)의 구조를 나타낸 도이다.
도 44a-44f는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 6종의 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-001-28BB, L1-H8-CAR-001-28ICOS, L1-H8-CAR-001-28, L1-H8-CAR-001-OX, L1-H8-CAR-001-BB, 및 L1-H8-CAR-001-ICOS)를 도입한 레트로바이러스 벡터를 나타낸 도이다.
도 45a-45i는 SKOV3 세포, SH-SY5Y 세포, Hela 세포 및 293T 세포에서의 L1CAM 발현율을 확인한 도이다.
도 46은 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SKOV3 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 47는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 293T 세포(L1CAM 저발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 48a-48c는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SH-SY5Y 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 49a-49c는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 Hela 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 50은 본 발명의 항-L1CAM CAR(항-L1-CAR) 발현 T 세포의 생체 내 항암활성능을 나타낸 도이다.
도 51은 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pBHA-3E8LS-H8Rev 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 52는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 53은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-005)의 구조를 나타낸 도이다.
도 54는 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pMT-CAR-005 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 55는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 56은 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-006)의 구조를 나타낸 도이다.
도 57은 본 발명의 선별된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 사용된 pMT-CAR-006 플라스미드의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 58은 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위한, 일련의 PCR 증폭 과정을 나타낸 모식도이다.
도 59는 본 발명의 실시예에서 제작된 항-L1CAM scFv 를 포함하는 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-007)의 구조를 나타낸 도이다.
도 60a-60c는 본 발명의 항-L1CAM scFv 를 포함하는 3종의 CAR-콘스트럭트(L1-H8-CAR-005, L1-H8-CAR-006, 및 L1-H8-CAR-007)를 도입한 레트로바이러스 벡터를 나타낸 도이다.
도 61a-61f는 SKOV3 세포, SH-SY5Y 세포, Hela 세포 및 293T 세포에서의 L1CAM 발현율을 확인한 도이다.
도 62는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SKOV3 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 63은 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 SH-SY5Y 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 64는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 Hela 세포(L1CAM 고발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
도 65는 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T세포의 293T 세포(L1CAM 저발현)에 대한 항암 활성을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)% 이다.
실시예 1: L1CAM 항원에 대한 scFv 항체 선별
1.1. 인간 합성 scFv phage display 항체 라이브러리 패닝
마우스 L1CAM (mouse L1CAM, mL1CAM) 항원에 결합하는 항-mL1CAM scFv 항체를 선별하기 위해, 인간 합성 scFv 파지디스플레이 라이브러리(KscFv-1, KBIO HEALTH)를 이용하여 항원 mL1CAM 단백질에 대한 파지 패닝을 4라운드까지 수행하였다(도1). 항원 mL1CAM 단백질(R&D system, Cat No.5674-NC)을 immunotube에 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 뒤 5% 스킴밀크(skim milk)가 포함된 PBS (MPBS)로 상온에서 1시간 반응하여 블로킹 과정을 진행하였다. KscFv-1에 MPBS를 첨가 후 상온에서 1시간 반응하여 블로킹된 파지(blocked phage)를 준비하였다. 블로킹 된 파지(Blocked phage)를 항원 mL1CAM 단백질이 코팅된 immunotube에 첨가하여 37℃에서 90분간 반응하였다. 0.05% tween20이 포함된 PBS로 세척한 후 100 mM 트리메틸아민(trimethylamine)을 첨가하여 immunotube에 부착된 파지(phage)를 수확(elution)하였다. 수확한 파지(phage)에 1 M Tris-HCl을 첨가하여 중화(neutralization)시킨 후 mid-log phase (OD600 = 0.5~1.0) 상태로 배양한 TG1 E.coli(Lucigen, Cat No. 60502-2)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포 펠렛(cell pellet)을 모아 암피실린(ampicillin)과 2% 글루코스(glucose)가 포함된 TB 배지 플레이트에 접종하였다. 배양된 콜로니를 모아 50% 글리세롤(glycerol)을 첨가하여 -80℃에서 보관하였다. 항원 mL1CAM 단백질(R&D system, Cat No.5674-NC)이 Fc 도메인과 융합 되어있기 때문에 패닝 단계에서 Fc depletion하는 Fc control 패닝도 병행하여 각각의 output titer를 매 라운드마다 비교함으로써 elution titer ratio를 통해 phage의 enrichment를 모니터링 하였다. 상기 Elution titer ratio는 phage output titer (antigen mL1CAM) 값을 Fc control output titer (no antigen mL1CAM)으로 나눈 값이다. 도 2에서 나타낸 것처럼 파지 패닝 2 라운드에서부터 Fc control과 output titer에서 크게 차이를 보이며, 파지 패닝 2 라운드부터 enrichment가 시작되어 파지 패닝 2 라운드에서는 항원 mL1CAM에 대해 control 대비 약 23.9배, 파지 패닝 3 라운드에서는 66.1배, 파지 패닝 4 라운드에서는 141.4배의 차이를 보였다.
1.2. 파지 ELISA 스크리닝(Phage ELISA screening)
파지 패닝에서 얻은 파지들 가운데 항원 mL1CAM 단백질에 특이적으로 부착하는 클론을 선별하기 위해, 패닝 2, 3, 4 라운드에서 얻은 각각 95개의 클론들을 상대로 단일클론 파지 ELISA(monoclonal phage ELISA)를 수행하였다.
구체적으로 96웰 플레이트에 항원 mL1CAM 단백질을 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후 2% MPBS로 37℃에서 2시간동안 블로킹하였다. 항원 mL1CAM 단백질이 Fc 도메인과 융합되어 있기 때문에 Fc control로써 Fc 도 96웰 플레이트에 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후 2% MPBS로 37℃에서 2시간동안 블로킹하였다. 다음으로 상기 96웰 플레이트에 phage(~1011 cfu)를 첨가하였다. 상온에서 90분간 반응한 후, HRP-anti-M13 (Sino Biological, Cat No.11973-MM05)을 PBS에 1:5000으로 희석하여 96웰 플레이트에 첨가하였다. 상온에서 1시간 반응한 후, TMB 기질(TMB substrate) (Sigma, Cat No.T0440)과 2N 농도의 H2SO4 (Merck, Cat No.100731)를 순차적으로 첨가하여 450 nm에서 흡광도(absorbance) (OD)를 측정하였다. 그 결과 항원 mL1CAM에 대해 흡광도 (A450 nm) cut-off를 각각 0.4 이상으로 정하여 선별하였을 때 2 라운드에서 1개, 3 라운드에서 총 26개, 4 라운드에서 총 9개의 클론들이 ELISA에서 항원 mL1CAM에 대해 특이적으로 결합하는 것(양성)으로 확인되었다(도 3).
1.3. 본 발명의 mL1CAM 항원에 대한 unique scFv 클론의 서열 분석
단일클론 파지 ELISA(Monoclonal phage ELISA)에서 양성반응을 보인, 항원 mL1CAM에 대한 36종의 scFv 클론들을 서열분석(sequencing)한 다음 카바트 넘버링(Kabat numbering)을 통해 서열을 정렬(alignment)하여 그룹화(grouping) 한 결과, 총 9종의 unique 항-mL1CAM scFv 클론이 얻어졌다(표 1 및 표 2). 항원 mL1CAM에 대해 얻어진 scFv 클론들의 선별 빈도(frequency)를 보면, 3 라운드 클론(mL1CAM-3R-H8, mL1CAM-3R-E1, mL1CAM-3R-C9)이 각각 33%, 26%, 16%로 다수 클론으로 선별되었고, 나머지 클론이 3~10% 범위로 소수 클론으로 선별되었다(도 4).
본 발명의 선별된 9종의 항-mL1CAM scFv 클론의 중쇄 가변영역 및 링커의 아미노산 서열 (Kabat)
ID FR1_VH CDR1_VH FR2_VH CDR2_VH FR3_VH CDR3_VH FR4_VH VH_Vk_linker
1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYAMN WVRQAPGKGLEWVS AISSTGSTIYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK QSTYFYSYFDV WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVS AISSSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DEGSGLGAFDI WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISSSGSSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DESTGLGAFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVS AISSSGSSKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCAK DESYGWLYAFDL WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISSSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VLELWEGLDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
6 EVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFS NYAMH WVRQAPGKGLEWVS AIYQSGGDTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VRGTYYGSYLDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMN WVRQAPGKGLEWVS RISSSGTTFYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VEEGRYVQAFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYAMH WVRQAPGKGLEWVS AISSSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HGGTWWGRAFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
9 EVQLVESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISSSGGTKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HGSYAFVFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
-1: mL1CAM -3R-H8_: mL1CAM-3R-E6_: mL1CAM-3R-G10_: mL1CAM-3R-B5_: mL1CAM-3R-H3_: mL1CAM-3R-G5_: mL1CAM-3R-C12_: mL1CAM-3R-G8_: mL1CAM-3R-G4_: mL1CAM-4R-D5_
-2: mL1CAM -3R-C9_: mL1CAM-3R-B8_: mL1CAM-3R-B4_: mL1CAM-3R-B6_: mL1CAM-3R-D6_
-3: mL1CAM -3R-E1_: mL1CAM-3R-C6_: mL1CAM-3R-C11_: mL1CAM-3R-H6_: mL1CAM-3R-F3_: mL1CAM-4R-E11_: mL1CAM-4R-F4_: mL1CAM-4R-H6_
-4: mL1CAM -3R-F6_: mL1CAM-3R-G2_: mL1CAM-3R-E7_
-5: mL1CAM-3R-F1_
-6: mL1CAM-3R-G6_
-7: mL1CAM-3R-A2_
-8: mL1CAM-3R-E9_
-9: mL1CAM-2R-F8_
여기에서 상기 볼드체로 표시한 클론 ID는 각 그룹을 대표하는 클론 ID를 의미한다.
본 발명의 선별된 9종의 항-mL1CAM scFv 클론의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 (Kabat)
ID FR1_Vk CDR1_Vk FR2_Vk CDR2_Vk FR3_Vk CDR3_Vk FR4_Vk Frequency
1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISRDLN WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPYT FGQGTKVEIK 10
2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISRYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPWT FGQGTKVEIK 5
3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPWT FGQGTKVEIK 8
4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPLT FGQGTKVEIK 3
5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSESFPYT FGQGTKVEIK 1
6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISRYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSYPFT FGQGTKVEIK 1
7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY ATSRLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPWT FGQGTKVEIK 1
8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSIGSYLN WYQQKPGKAPKLLIY ATSSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPYT FGQGTKVEIK 1
9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPWT FGQGTKVEIK 1
-1: mL1CAM -3R-H8_: mL1CAM-3R-E6_: mL1CAM-3R-G10_: mL1CAM-3R-B5_: mL1CAM-3R-H3_: mL1CAM-3R-G5_: mL1CAM-3R-C12_: mL1CAM-3R-G8_: mL1CAM-3R-G4_: mL1CAM-4R-D5_
-2: mL1CAM -3R-C9_: mL1CAM-3R-B8_: mL1CAM-3R-B4_: mL1CAM-3R-B6_: mL1CAM-3R-D6_
-3: mL1CAM -3R-E1_: mL1CAM-3R-C6_: mL1CAM-3R-C11_: mL1CAM-3R-H6_: mL1CAM-3R-F3_: mL1CAM-4R-E11_: mL1CAM-4R-F4_: mL1CAM-4R-H6_
-4: mL1CAM -3R-F6_: mL1CAM-3R-G2_: mL1CAM-3R-E7_
-5: mL1CAM-3R-F1_
-6: mL1CAM-3R-G6_
-7: mL1CAM-3R-A2_
-8: mL1CAM-3R-E9_
-9: mL1CAM-2R-F8_
여기에서 상기 볼드체로 표시한 클론 ID는 각 그룹을 대표하는 클론 ID를 의미한다.
1.4. 인간 L1CAM(hL1CAM) 및 마우스 L1CAM(mL1CAM)에 교차 결합하는 scFv 항체의 발굴
인간 L1CAM (hL1CAM, R&D system, Cat No.777-NC)과 마우스 L1CAM 에 교차 결합하는 항체 발굴을 위해 항원 hL1CAM에 대한 unique 항-mL1CAM scFv 클론들 총 9종을 상대로 단일클론 파지 ELISA(monoclonal phage ELISA)를 수행하였다. 그 결과 항원 hL1CAM에 대해 흡광도 (A450 nm) cut-off를 각각 0.4 이상으로 정하여 선별하였을 때 총 4개의 클론(mL1CAM-3R-H8, mL1CAM-3R-C9, mL1CAM-3R-E1, mL1CAM-3R-E9)이 hL1CAM에 교차 결합하는 것으로 확인되었다(도 5)(표 3 및 표 4).
본 발명의 최종 선별된 4종의 항-L1CAM scFv 클론의 중쇄 가변영역 및 링커의 아미노산 서열 (Kabat)
ID FR1_VH CDR1_VH FR2_VH CDR2_VH FR3_VH CDR3_VH FR4_VH VH_Vk_linker
1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYAMN WVRQAPGKGLEWVS AISSTGSTIYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK QSTYFYSYFDV WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVS AISSSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DEGSGLGAFDI WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISSSGSSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DESTGLGAFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYAMH WVRQAPGKGLEWVS AISSSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HGGTWWGRAFDY WGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS
-1: mL1CAM -3R-H8_: mL1CAM-3R-E6_: mL1CAM-3R-G10_: mL1CAM-3R-B5_: mL1CAM-3R-H3_: mL1CAM-3R-G5_: mL1CAM-3R-C12_: mL1CAM-3R-G8_: mL1CAM-3R-G4_: mL1CAM-4R-D5_
-2: mL1CAM -3R-C9_: mL1CAM-3R-B8_: mL1CAM-3R-B4_: mL1CAM-3R-B6_: mL1CAM-3R-D6_
-3: mL1CAM -3R-E1_: mL1CAM-3R-C6_: mL1CAM-3R-C11_: mL1CAM-3R-H6_: mL1CAM-3R-F3_: mL1CAM-4R-E11_: mL1CAM-4R-F4_: mL1CAM-4R-H6_
-8: mL1CAM-3R-E9_
여기에서 상기 볼드체로 표시한 클론 ID는 각 그룹을 대표하는 클론 ID를 의미한다.
본 발명의 최종 선별된 4종의 항-L1CAM scFv 클론의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 (Kabat)
ID FR1_Vk CDR1_Vk FR2_Vk CDR2_Vk FR3_Vk CDR3_Vk FR4_Vk Frequency
1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISRDLN WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPYT FGQGTKVEIK 10
2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISRYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPWT FGQGTKVEIK 5
3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSFPWT FGQGTKVEIK 8
8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSIGSYLN WYQQKPGKAPKLLIY ATSSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPYT FGQGTKVEIK 1
-1: mL1CAM -3R-H8_: mL1CAM-3R-E6_: mL1CAM-3R-G10_: mL1CAM-3R-B5_: mL1CAM-3R-H3_: mL1CAM-3R-G5_: mL1CAM-3R-C12_: mL1CAM-3R-G8_: mL1CAM-3R-G4_: mL1CAM-4R-D5_
-2: mL1CAM -3R-C9_: mL1CAM-3R-B8_: mL1CAM-3R-B4_: mL1CAM-3R-B6_: mL1CAM-3R-D6_
-3: mL1CAM -3R-E1_: mL1CAM-3R-C6_: mL1CAM-3R-C11_: mL1CAM-3R-H6_: mL1CAM-3R-F3_: mL1CAM-4R-E11_: mL1CAM-4R-F4_: mL1CAM-4R-H6_
-8: mL1CAM-3R-E9_
여기에서 상기 볼드체로 표시한 클론 ID는 각 그룹을 대표하는 클론 ID를 의미한다.
1.5. 본 발명의 인간 L1CAM 및 마우스 L1CAM에 교차 결합하는 4종 unique scFv 클론의 대장균 발현 및 정제
교차 결합성 평가 및 단일클론 파지 ELISA를 통해 얻어진 총 4종의 unique 항-mL1CAM scFv 클론을 E.coli 발현벡터(pKFAB, KBIO HEALTH)에 클로닝 한 다음, TB 배지 200 mL에서 0.5 μM IPTG를 통해 발현을 유도하고, 30℃에서 하룻밤 배양한 다음, periplasmic protein extraction을 통해 가용성 단백질을 얻은 후, strep tag II 칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 정제를 진행하였다. 정제된 각 클론의 발현은 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다(도 6).
1.6. 친화성(Affinity) 분석
본 발명에서 선별 및 정제된 항-L1CAM scFv (4종) 항체 단백질을 이용한 soluble ELISA를 통해 L1CAM 단백질에 결합하는 각 클론들의 친화성을 비교 분석하였다.
구체적으로 96웰 플레이트에 항원 mL1CAM 단백질 또는 항원 hL1CAM 단백질을 첨가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션 한 후 2% MPBS로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 다음으로 정제된 항-L1CAM scFv 항체 단백질을 첨가하였다. 상온에서 90분간 반응한 후, HRP-anti-StrepMAB (IBA, Cat No.2-1509-001)을 2% MPBS에 1:5000으로 희석하여 첨가하였다. 상온에서 1시간 반응한 후, TMB 기질 (Sigma, Cat No.T0440) 및 2N H2SO4 (Merck, Cat No.100731)를 순차적으로 첨가하여 450 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 각 클론들은 5 nM (mL1CAM-3R-C9) ~ 50 nM (mL1CAM-3R-E1) 범위의 친화성으로 항원 mL1CAM에 결합하는 것으로 나타났다. 또한, hL1CAM 단백질에 대한 친화성을 비교 분석한 결과, 본 발명의 각 클론들은 2 nM (mL1CAM-3R-H8) ~ 20.87 μM (mL1CAM-3R-E9) 범위의 친화성으로 항원 hL1CAM에 결합하는 것으로 나타났다(도 7a-7c). 본 발명의 4종의 교차결합 클론의 결합력을 각각의 L1CAM에 대하여 종합하여 비교해 보았을 때 H8>E1>C9>E9 순으로 높은 것으로 나타났다.
4종의 anti-L1CAM scFv 중 가장 높은 결합력을 나타낸 3R-H8 클론에 대해 conversion 과정을 거쳐 whole IgG1 항체를 확보하였다. 정제된 whole IgG1 항체를 이용한 Octet system (Forte Bio, Model No.QK384)을 통해 항원 hL1CAM (Sino biological, Cat No.10140-H08H) 단백질 또는 mL1CAM (R&D, Cat No.5674-NC) 단백질과의 항원-항체 친화도를 분석하였다. 그 결과, 항원 hL1CAM 단백질과는 4.14E-09 KD(M), 항원 mL1CAM 단백질과는 2.05E-08 KD(M)의 결합력을 가지는 것을 확인하였다(도 7d-7e).
실시예 2. 항- L1CAM -CAR 유전자 발현 T 세포 제작 및 효능 확인
2.1. 항-L1CAM-CAR 유전자 확보
2.1.1. 항-mL1CAM scFv 항체 유전자의 확보
본 발명에서 선별된 항-L1CAM scFv의 클론을 포함하고 있는 파게미드(phagemid)로부터 Lac 프로모터-정방향 프라이머(Lac promoter-forward primer)를 이용한 서열분석을 통해 항-L1CAM scFv 클론의 염기서열을 확보하였다(표 5). 분석된 염기서열을 바탕으로 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)를 제작하였으며, 상기 파게미드(phagemid)를 주형으로 PCR 방법으로 증폭하여 PCR 생성물을 확보하였다. 확보한 항-L1CAM scFv 항체의 PCR 생성물을 주형으로 서열번호 68(표 6)의 프라이머와 서열번호 69(표 6)의 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 항-L1CAM scFv 항체 가변 중쇄(variable heavy chain; VH)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 마우스의 단일클론 IgG인 3E8 항체의 선행 서열(leader sequence; LS)의 12개 염기서열을 가지고, 항-L1CAM scFv 항체 가변 경쇄(variable light chain; VL)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 IgD hinge의 12개 염기서열을 가진다. 따라서 상기 프라이머에 의해 증폭된 PCR 생성물은 3E8 LS-scFv-IgD hinge 염기서열을 가지게 된다. 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭 과정에 사용하였다.
본 발명의 최종 선별된 4종의 항-L1CAM scFv 클론을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 (Kabat)
ID Nucleotide sequence
1 GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGAATTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTACTGGTTCTACTATCTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGTCTACTTACTTTTACTCTTACTTTGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTGATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
2 GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTTCTTATGCAATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTTCTGGTGGTTCTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAAGATGAAGGTTCTGGTCTGGGTGCATTTGATATCTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCAATCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTGGACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
3 GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTTCTTATGCAATGTCTTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTTCTGGTTCTTCTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAAGATGAATCTACTGGTCTGGGTGCATTTGATTACTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTAATTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCAATCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTTTTCCGTGGACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
8 GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGCACTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTTCTGGTGGTTCTACTTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACATGGTGGTACTTGGTGGGGTCGTGCATTCGATTACTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCGGTTCTTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAACTTCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
서열번호 프라이머명 염기서열
68 3E8 VH_LS+ L1 ScFv(F) GGTGTCCACTCCGAAGTACAGTTGGTC
69 L1 ScFv+ hIgD hinge(R) ACCTGGCCAGCGTTTAATTTCCACTTT
70 Mlu 1+3E8 VH(F) ACGCGTATGGAATGGAGCTGGGTC
71 3E8 VH+L1 ScFv(R) CAACTGTACTTCGGAGTGGACACCTGT
72 L1 ScFv+ hIgD hinge(F) GTGGAAATTAAACGCTGGCCAGGTTCT
73 XhoI+CD3zeta(R) CCGCTCGAGTTAGCGAGGGGGCAGGGC
74 T7(F) TATACGACTCACTATAGGG
75 SP6(R) ATTTAGGTGACACTATAG
2.1.2. 3E8 항체의 선행 서열(leader sequence) 유전자 확보
3E8 항체의 선행 서열을 포함하는 pMT-CAR 플라스미드(도 8)를 주형으로 서열번호 70(표 6)의 프라이머와 서열번호 71(표 6)의 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열을 가지고, 3E8 선행 서열(LS)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 항-L1CAM scFv 항체 가변 중쇄의 12개 염기서열을 가진다. 따라서, 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-scFv의 염기서열을 가지게 된다. 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
2.1.3. 인간 IgD의 힌지 영역, 막횡단도메인, 세포내 신호전달도메인, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ의 유전자 확보
본 발명의 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 인간 IgD의 힌지(Hinge) 영역, CD28의 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM)과 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD), 공동 자극 도메인(costimulatory domain)인 OX40 및 CD3ζ 유전자를 확보하였다.
먼저 pMT-CAR 플라스미드(도 8)를 주형으로 서열번호 72(표 6)의 프라이머와 서열번호 73(표 6)의 프라이머을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 이 때, 인간 IgD 힌지 영역의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 항-L1CAM scFv 항체 가변 경쇄의 12개 염기서열을 포함하고, CD3ζ의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 XhoI 제한효소 염기서열을 포함한다. 따라서, 상기 프라이머들에 의해 증폭된 PCR 생성물은 scFv-IgD hinge-CD28 TM-ICD-OX40-CD3ζ-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 7). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
본 발명의 CAR 컨스트럭트 구축에 사용된 선도서열(leading sequence), 힌지(Hinge), 막횡단 영역(TM), 세포내영역(ICD), 및 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
Mlu I-start codon-3E8 LS ACGCGTATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
ScFv (표 5 참조)
IgD hinge CGCTGGCCAGGTTCTCCAAAGGCACAGGCCTCCTCCGTGCCCACTGCACAACCCCAAGCAGAGGGCAGCCTCGCCAAGGCAACCACAGCCCCAGCCACCACCCGTAACACAGGTAGAGGAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAAGAGGAACAAGAAGAGAGAGAGACAAAGACACCAGGTTGTCCG
CD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
CD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
OX40 GCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
CD3ζ-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CTCGAG
2.1.4. pGemT-L1CAM-CAR 벡터 제조
상기 2.1.2에서 증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-scFv와, 상기 2.1.1에서 증폭한 PCR 생성물인 3E8 LS-scFv-IgD hinge를 주형으로 서열번호 70(표 6)의 프라이머와 서열번호 69(표 6)의 프라이머를 이용하여 OE-PCR (overlap extension PCR) 방법으로 증폭하였다.
그 결과로 증폭된 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-scFv-IgD hinge과 상기 2.1.3에서 증폭한 PCR 생성물인 scFv-IgD hinge-CD28 TM-ICD-OX40-CD3ζ-Xho I을 주형으로 서열번호 70(표 6)의 프라이머와 서열번호 73(표 6)의 프라이머를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 9). 그 결과로 증폭된 PCR 생성물은 MluI-3E8 LS-scFv-IgD hinge-CD28 TM-ICD-OX40-CD3ζ-XhoI의 염기서열을 가지게 된다. 증폭한 PCR 생성물을 직선형 DNA의 양 끝에 다중 T 서열을 가지는 pGemT EASY 벡터 (Promega, WI, USA)에 라이게이션하여 CAR 콘스트럭트 pGemT-L1-CAR-001, pGemT-L1-CAR-002, pGemT-L1-CAR-003, 및 pGemT-L1-CAR-004를 획득하였다. 획득한 CAR 콘스트럭트 서열분석을 통해 원본서열과 동일함을 확인하였다(도 10). 상기 서열 분석에는 서열번호 74 및 75(표 6)의 프라이머 쌍을 사용하였다.
2.1.5. pMT-L1-CAR 레트로바이러스 벡터 제조
4종의 pGemT-L1-CAR 벡터에 Mlu I과 Xho I 제한효소 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 획득한 DNA 절편을 미리 Mlu I과 Xho I 제한효소로 처리된 pMT 레트로바이러스 벡터(미국 등록특허 제 US7,049,143호)에 결찰하여 4 종의 pMT-L1-CAR 레트로바이러스 벡터를 제작하였다(도 11). 이렇게 제조된 pMT-L1-CAR 레트로바이러스 벡터는 MLV LTR 프로모터의 조절 하에서 항-L1-CAR를 코딩하는 서열을 포함한다.
2.2. 항-L1-CAR 유전자 발현 T 세포 제조
2.2.1. 항-L1-CAR 유전자 발현 레트로바이러스(항-L1-CAR 레트로바이러스) 제조
항-L1-CAR 유전자의 전달을 위한 레트로바이러스는 플라스미드 DNA 형질전환법을 이용하여 제작하였다(Soneoka Y et al., 1995). TransIT 293 형질전환시스템(Mirus Bio LLC, WI, USA)을 이용하였고, 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 전날 60 mm 접시에 1×106개로 파종한 293T 세포주에 상기 2.1에서 제작한 각 pMT-L1-CAR 레트로바이러스 벡터(pMT-L1-CAR-001, pMT-L1-CAR-002, pMT-L1-CAR-003, 및 pMT-L1-CAR-004), gag- pol 발현 벡터 및 RD114 env 발현 벡터를 형질전환 후 세포를 약 48시간 배양하였다. 배양완료 후 세포배양액을 모두 수확하여 0.45 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 생산된 4종의 항-L1-CAR 레트로바이러스는 레트로바이러스 역가 측정 키트(retrovirus titer set) (TaKaRa, JAPAN)를 이용하여 real-time PCR로 역가를 측정한 후 사용 전까지 -80℃에 냉동 보관하였다.
2.2.2. 항-L1-CAR 유전자 발현 T 세포 제조
공여받은 사람 혈액을 SepMateTM-50 (STEMCELL)과 Ficoll-Paque PLUS (GE healthcare, Sweden)를 이용하여 단핵세포를 획득하였다. 단핵세포는 5% 사람 혈청이 포함된 AIMV 배지(Invitrogen)를 배양액으로 사용하고 100 mm 접시에 1Х107개로 분주한 후, 항-CD3 (OKT3, eBioscience) 항체를 mL당 50 ng 첨가하여 T 세포를 활성화하였다. T 세포의 성장을 위해 배양액에 사람 IL-2 (R&D)를 mL당 300 U 첨가하여 배양하였다. 48시간 배양 후 활성화된 T 세포를 수확하여 4종의 항-L1-CAR 레트로바이러스 전달에 사용하였다.
6웰 플레이트에 10 μg/mL 농도로 준비된 레트로넥틴(retronectin, TaKaRa, Japan)을 웰당 2 mL 첨가한 후 상온에서 2시간 반응하여 플레이트에 코팅하였다. 반응 후 잔여 레트로넥틴은 제거하고 2.5% BSA (bovine serum albumin)가 포함된 PBS (phosphate-buffered saline)를 웰당 2 mL 첨가하여 상온에서 30분 반응하여 블로킹 하였다. 반응 후 블로킹에 사용한 용액을 제거하고, 1M HEPES가 2.5% 포함된 HBSS을 웰당 3 mL 첨가하여 세척하였다. 항-L1-CAR 레트로바이러스를 웰당 3Х1010 copies로 5% 사람 혈청이 포함된 AIMV 배지로 희석하여 4 mL 첨가 후 2000xg, 32℃조건으로 2시간 동안 원심분리하여 레트로바이러스를 레트로넥틴에 고정하였다. 대조군으로 사용할 웰에는 레트로바이러스 희석에 사용한 배지를 동량 첨가하였다. 반응 후 잔여 레트로바이러스를 제거하고 활성화된 T 세포를 웰당 2Х106개로 첨가 후 1000xg로 15분간 원심분리하여 T 세포에 항-L1-CAR 레트로바이러스를 전달하였다. 전달효율을 높이고자 다음날 전달과정을 1회 더 반복하여 총 2회 진행하였다. 전달 24시간 후, T 세포를 모두 수확하여 5% 사람 혈청과 사람 IL-2가 300 U/mL 포함된 AIMV 배지로 mL당 5Х105개로 T 플라스크에 계대 배양하였다. 3~4일 간격으로 mL당 5Х105개로 계대 배양하고, mL당 2x106개를 넘지 않도록 유지하였다.
항-L1-CAR 레트로바이러스를 전달한 활성화 T 세포(항-L1-CAR 발현 T)에서 항-L1-CAR가 발현하는지 확인하고자 하였다. 배양 8일째와 20일째에 1Х106개의 세포를 준비하여 biotin이 부착된 protein L (Genescript, Cat No.M00097)과 4℃에서 45분간 반응하였다. 반응 후, phycoerythrin가 부착된 streptavidin (BD, Cat No.554061)과 4℃에서 30분간 반응하여 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용하여 항-L1-CAR 발현율을 확인하였다. 그 결과, 공여자에 따라 차이가 있으나 배양 8일째에는 약 19.9% ~ 67.2%의 항-L1-CAR 발현율을 확인하였으며, 배양 20일째에는 약 34.5% ~ 94.9%의 항-L1-CAR 발현율을 확인하였다(표 8).
항-L1-CAR 발현 T 세포 표면에서의 항-L1-CAR 발현율 확인
공여자
번호		 배양일 대조군 L1-CAR-001 L1-CAR-002 L1-CAR-003 L1-CAR-004
30 8일 1.1% 51.6% 43.1% 24.7% 26.3%
20일 2.0% 65.7% 59.7% 58.4% 36.2%
32 8일 3.4% 67.2% 46.8% 63.7% 59.7%
20일 4.6% 84.6% 73.1% 94.9% 61.9%
34 8일 1.3% 36.6% 40.1% 20.9% 19.9%
20일 2.0% 53.9% 54.9% 40.8% 34.5%
2.3. 항-L1-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능 확인
2.3.1. 타겟세포에서의 L1CAM 발현율 확인
사람 난소선암 세포주인 SKOV3는 본 발명의 항원인 L1CAM을 높게 발현하는 것으로 알려져 있어 본 발명의 항-L1CAM-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 확인하기에 적합한 세포주이다. 이를 확인하기 위해 SKOV3 세포주를 PBS 100 μL에 5 x 105개로 준비하여 anti-hCD171-PE(5G3 clone) (eBioscience, Cat No.12-1719-42) 항체를 0.25 μg 첨가한 후 4℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한 후 유동 세포 분석법을 이용하여 L1CAM 발현을 확인하였다. 그 결과, SKOV3암세포에서 약 74%의 L1CAM 발현율을 확인하였다. 반면, 동일한 방법을 이용하여 사람 배아 신장 세포주인 293T에서 L1CAM의 발현을 확인한 결과 약 3%의 발현율을 확인하였다(도12).
2.3.2. 타겟 세포에 대한 L1CAM 발현 T 세포의 항암활성능 확인
타겟 세포(target 세포, T)에 대한 본 발명의 항-L1CAM-CAR (항-L1-CAR) 발현 T 세포(effector 세포, E)의 항암활성능을 확인하기 위해 xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) 분석법을 사용하였다. xCELLigence RTCA 분석법은 골드 마이크로전극 바이오센서(gold microelectrode biosensor)가 코팅된 플레이트에 전기전도성 용액 (예: 배양배지)을 포함하는 경우 전자흐름이 index 값으로 수치화하여 나타나게 되며, 타겟세포가 플레이트에 부착하는 경우 전자흐름을 방해하여 index 값이 변화하게 된다. CAR 발현 T 세포(CAR-T) 첨가시 세포살상능에 의해 부착된 타겟 세포는 플레이트에서 떨어지게 되고 index 값의 변화를 분석함으로써 항암활성능(cytotoxicity)을 확인할 수 있다. 타겟 세포를 배양배지 50 μL에 1x104개로 준비하고, 분석용 플레이트에 첨가하였다. 21시간 후 항-L1-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 μL에 1x104개, 5x104개, 1x105개 (E:T 비율= 1, 5, 10)로 준비하여 타겟 세포를 포함한 웰에 첨가하여 50시간 동안 실시간으로 cell index 값을 확인하였다. 또한 타겟 세포만 포함한 웰을 준비하여 항-L1-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 아래와 같이 계산하였다.
식
Cytotoxicity(%)={(타겟세포 well의 index값)-(타겟세포와 T 세포 반응 well의 index값)}/(타겟세포 well의 index 값) x 100
그 결과, 본 발명의 4종의 항-L1-CAR 발현 T세포 중 L1-CAR-004는 CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SKOV3 세포에서 높은 세포살상능을 보였다. L1-CAR-001는 공여자에 따른 차이가 있었으나 대조군에 비해SKOV3세포에서 세포살상능을 보였다(도 13a). 또한 낮은 L1CAM 발현율을 보이는 293T 세포에서는 4종 모두 대조군보다 낮은 세포살상능을 보였다(도 13b). 따라서, 본 발명의 항-L1-CAR 발현 T 세포는 L1CAM 항원을 높은 수준으로 발현하는 타겟 암세포에 대하여 항암활성을 나타내므로 항암용도의 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 3. 생체 내에서의 항- L1CAM -CAR 유전자 발현 T 세포의 효능 확인(In vivo)
생체 내에서의 항-L1CAM-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능을 확인하기 위하여 암발생 동물모델을 이용하였다. T 세포, B 세포, 자연살해 세포(NK 세포)가 결손된 NOD/SCID 마우스(7주령, 암컷)의 오른쪽 옆구리 피하(subcutaneous, SC)에 Matrigel과 1:1로 섞은 SKOV3 암세포(Target, T) 3 x 106개를 투여하여 암을 발생시켰다. In vitro에서 효능이 확인된 항-L1CAM-CAR 발현 T 세포 2종인 L1-CAR-002와L1-CAR-004, 대조군 T 세포를 암세포 투여 3일 후에 각각의 NOD/SCID 마우스에 1일 1회 총 3회 투여하였다. 투여 회당 2 x 107개의 T 세포를 꼬리 정맥(intravenous, IV)으로 투여하였고, 암의 크기를 25일까지 측정하였다. 그 결과, 대조군 T 세포 투여군에 비해 항-L1CAM-CAR 발현 T 세포 2종 모두에서 암 성장 속도가 저해되었음을 확인하였다(도 14). 특히 L1-CAR-002와 비교하여 L1-CAR-004에서 암 성장 속도가 크게 저해되는 것을 통해 생체 내에서 L1-CAR-004의 효능이 더 우수함을 확인하였다.
실시예4 . 다양한 spacer domain 구조의 항- L1CAM -CAR 유전자 발현 T세포 제작 및 효능 확인
4.1. 다양한 spacer domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 확보
4.1.1. anti-mL1CAM scFv 항체 유전자 선정
실시예 3에서 선행된 항암활성능 확인 실험을 통해 L1-CAR-004의 암 성장 속도 저해 효과가 가장 우수함이 확인되었다. L1-CAR-004(도 10)의 L1CAM 특이적 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 확보하여 다음 유전자를 확보하는데 사용하였으며, 이후 pMT-L1-CAR-004를 pMT-L1-H8-CAR-001로 표기하였다.
4.1.2. L1-H8-CAR-002 유전자 확보
4.1.2.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), anti-mL1CAM scFv 항체 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 9)와 서열번호 69(표 9)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, L1-H8 scFv의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hIgD hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge의 염기서열을 가지게 된다(표 10). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
사용한 프라이머의 염기서열 정보
서열번호 프라이머명 염기서열
70 Mlu 1+3E8 VH(F) ACGCGTATGGAATGGAGCTGGGTC
69 L1 ScFv+ hIgD hinge(R) ACCTGGCCAGCGTTTAATTTCCACTTT
72 L1 ScFv+ hIgD hinge(F) GTGGAAATTAAACGCTGGCCAGGTTCT
73 XhoI+CD3zeta(R) CCGCTCGAGTTAGCGAGGGGGCAGGGC
83 L1-H8 scFv+ IgG1 hinge(R) AGATTTGGGCTCTTTAATTTCCACTTT
84 L1-H8 scFv+ IgG1 hinge(F) GTGGAAATTAAAGAGCCCAAATCTTGT
LS, L1-H8 scFv, Hinge, CH3, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
Mlu I-start codon-3E8 LS ACGCGT ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
L1-H8 scFv(L1CAM-3R-H8 ) GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGAATTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTACTGGTTCTACTATCTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGTCTACTTACTTTTACTCTTACTTTGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTGATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
IgD hinge CGCTGGCCAGGTTCTCCAAAGGCACAGGCCTCCTCCGTGCCCACTGCACAACCCCAAGCAGAGGGCAGCCTCGCCAAGGCAACCACAGCCCCAGCCACCACCCGTAACACAGGTAGAGGAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAAGAGGAACAAGAAGAGAGAGAGACAAAGACACCAGGTTGTCCG
IgG1 hinge GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
IgG1 CH3 GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
CD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
CD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
OX40 GCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
CD3ζ-iso1-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CTCGAG
4.1.2.2. Hinge, CH3, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Human IgD의 Hinge와 IgG1의 hinge, CH3, CD28의 TM과 ICD, 공동 자극 도메인인 OX40 및 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-CAR-002 플라스미드(도 15)를 주형으로 프라이머 서열번호 72(표 9)과 서열번호 73(표 9)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hIgD hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 L1-H8 scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 10). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
4.1.2.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, CH3, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-IgD hinge와 L1-H8-scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 9)와 서열번호 73(표 9)를 이용하여 OE-PCR 방법(overlap extension PCR method)으로 증폭하였다(도 16). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-002의 구조를 가지게 된다(도 17).
4.1.3. L1-H8-CAR-003 유전자 확보
4.1.3.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), anti-mL1CAM scFv 항체 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 9)와 서열번호 69(표 9)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, L1-H8 scFv의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hIgD hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge의 염기서열을 가지게 된다(표 10). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
4.1.3.2. Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Human IgD의 Hinge와 IgG1의 hinge, CD28의 TM과 ICD, 공동 자극 도메인인 OX40 및 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-CAR-003 플라스미드(도 18)를 주형으로 프라이머 서열번호 72(표 9)과 서열번호73(표 9)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hIgD hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 L1-H8 scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I염기서열을 가지게 된다(표 10). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
4.1.3.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-IgD hinge와 L1-H8-scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 9)와 서열번호 73(표 9)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 19). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-003의 구조를 가지게 된다(도 20).
4.1.4. L1-H8-CAR-004 유전자 확보
4.1.4.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), anti-mL1CAM scFv 항체 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 9)와 서열번호 83(표 9)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, L1-H8 scFv의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hIgG1 hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgG1 hinge의 염기서열을 가지게 된다(표 10). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
4.1.4.2. Hinge, CH3, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
IgG1의 hinge, CH3, CD28의 TM과 ICD, 공동 자극 도메인인 OX40 및 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-CAR-002 플라스미드(도 15)를 주형으로 프라이머 서열번호 84(표 9)과 서열번호73(표 9)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hIgG1 hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 L1-H8 scFv-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I염기서열을 가지게 된다(표 10). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
4.1.4.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, CH3, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-IgG1 hinge와 L1-H8 scFv-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 9)와 서열번호 73(표9)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 21). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-004의 구조를 가지게 된다(도 22).
4.1.5. pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터 제조
3종의 증폭한 PCR 생성물을 Mlu I과 Xho I 제한효소 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 획득한 DNA 절편을 미리 Mlu I과 Xho I 제한효소로 처리된 pMT 레트로바이러스 벡터((미국 등록특허 제 US6,451,595호)에 결찰하여 3 종의 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터를 제작하였다(도 23). 이렇게 제조된 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터는 MLV LTR 프로모터의 조절 하에서 L1-H8-CAR를 코딩하는 서열을 포함한다.
4.2. 다양한 spacer domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 레트로바이러스(L1-H8-CAR 레트로바이러스) 제조
L1-H8-CAR 유전자의 전달을 위한 레트로바이러스는 플라스미드 DNA 형질전환법을 이용하여 제작하였다(Soneoka Y et al., 1995). TransIT 293 형질전환시스템(Mirus Bio LLC, WI, USA)을 이용하였고, 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 전날 60 mm 접시에 1 Х 106개로 파종한 293T 세포주에 4종의 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터, gag-pol 발현 벡터 및 RD114 env 발현 벡터를 형질전환 후 세포를 약 48시간 배양하였다. 배양완료 후 세포배양액을 모두 수확하여 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. 생산된 4종의 L1-H8-CAR 레트로바이러스는 retrovirus titer set kit (TaKaRa, JAPAN) 이용하여 real-time PCR로 역가를 측정한 후 사용 전까지 -80℃에 냉동 보관하였다.
4.3. 다양한 spacer domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포 제조
공여받은 사람 혈액을 SepMateTM-50 (STEMCELL)과 Ficoll-Paque PLUS (GE healthcare, Sweden)를 이용하여 단핵세포를 획득하였다. 단핵세포는 5% 사람혈청이 포함된 AIMV 배지(Invitrogen)를 배양액으로 사용하고 100 mm 접시에 1 Х 107개로 분주한 후, 항-CD3 (OKT3, eBioscience) 항체를 mL당 50 ng 첨가하여 T 세포를 활성화하였다. T 세포의 성장을 위해 배양액에 사람 IL-2 (R&D)를 mL당 300 U 첨가하여 배양하였다. 48시간 배양 후 활성화된 T 세포를 수확하여 4종의 L1-H8-CAR 레트로바이러스 전달에 사용하였다.
6 well 플레이트에 10 ug/mL 농도로 준비된 레트로넥틴(retronectin, TaKaRa, Japan)을 well당 2 mL 첨가한 후 상온에서 2시간 반응하여 플레이트에 코팅하였다. 반응 후 레트로넥틴은 제거하고 2.5% 사람 알부민이 포함된 PBS (phosphate-buffered saline)를 well당 2 mL 첨가하여 상온에서 30분 반응하여 blocking 하였다. 반응 후 blocking에 사용한 용액을 제거하고, 1M HEPES가 2.5% 포함된 HBSS을 well당 3 mL 첨가하여 세척하였다. L1-H8-CAR 레트로바이러스를 well당 3 Х 1010 copies로 5% 사람혈청이 포함된 AIMV 배지로 희석하여 4 mL 첨가 후 2000xg, 32℃조건으로 2시간 동안 원심분리하여 레트로바이러스를 레트로넥틴에 고정하였다. 대조군으로 사용할 well에는 레트로바이러스 희석에 사용한 배지를 동량 첨가하였다. 반응 후 레트로바이러스를 제거하고 활성화된 T 세포를 well당 2 Х 106개로 첨가 후 1000xg로 15분간 원심분리하여 T 세포에 L1-H8-CAR 레트로바이러스를 전달하였다. 전달효율을 높이고자 다음날 전달과정을 1회 더 반복하여 총 2회 진행하였다. 전달 24시간 후, T 세포를 모두 수확하여 5% 사람 혈청과 사람 IL-2가 300 U/mL 포함된 AIMV 배지로 mL당 5 Х 105개로 T 플라스크에 계대 배양하였다. 3~4일 간격으로 mL당 5 Х 105개로 계대 배양하고, mL당 2 x 106개를 넘지 않도록 유지하였다.
L1-H8-CAR 레트로바이러스를 전달한 활성화 T 세포(L1-H8-CAR 발현 T)에서 L1-H8-CAR가 발현하는지 확인하고자 하였다. 배양 1주째와 2주째에 1 Х 106개의 세포를 준비하여 FITC가 부착된 protein L (ACROBiosystems, Cat No.RPL-PF141)과 4℃에서 30분간 반응하여 유동 세포 분석법(flow cytometry)를 이용하여 L1-H8-CAR 발현율을 확인하였다. 그 결과, 공여자에 따라 차이가 있으나 배양 8일째에는 약 16.4% ~ 52.4%의 L1-H8-CAR 발현율을 확인하였으며, 배양 15일 또는 18일째에는 약 29.6% ~ 69.2%의 L1-H8-CAR 발현율을 확인하였다(표 11).
L1-H8-CAR 발현 T 세포 표면에서의 L1-H8-CAR 발현율 확인
공여자 번호 배양일 대조군 L1-H8-CAR-001 L1-H8-CAR-002 L1-H8-CAR-003 L1-H8-CAR-004
45 8일 1.64% 33.6% 40.5% 34.1% 16.4%
18일 0.37% 52.4% 64.7% 54.5% 30.0%
36 8일 1.26% 33.6% 44.8% 42.2% 21.6%
15일 1.00% 50.5% 69.2% 63.1% 29.6%
43 8일 1.84% 42.7% 52.4% 50.6% 27.6%
15일 0.64% 52.6% 60.0% 63.8% 33.2%
4.4. 다양한 spacer domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능 확인(In vitro)
4.4.1. 타겟 세포에서의 L1CAM 발현율 확인
사람 난소선암 세포주인 SKOV3는 L1CAM을 높게 발현하는 것으로 알려져 있어 항-L1CAM-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 확인하기에 적합한 세포주이다. 이를 확인하기 위해 SKOV3 세포주를 PBS 100 uL에 5 x 105개로 준비하여 anti-hCD171-PE(5G3 clone)(eBioscience, Cat No.12-1719-42) 항체를 0.25 ug 첨가한 후 4℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한 후 유동 세포 분석법을 이용하여 L1CAM 발현을 확인하였다. 그 결과, SKOV3암세포에서 약 93.4~99.2%의 L1CAM 발현율을 확인하였다(도 24a-24c). 동일한 방법을 이용하여 사람 자궁경부암 세포주인 HeLa와 사람 신경아세포종 세포주인 SH-SY5Y, 사람 배아 신장 세포주인 293T에서 L1CAM의 발현을 확인한 결과 HeLa에서는 약 99.9%(도 24f), SH-SY5Y에서는 약 89.6%(도 24g), 293T에서는 약 0.57~0.61%(도 24d-24e)의 발현율을 확인하였다.
4.4.2. 타겟 세포에 대한 L1CAM 발현 T 세포의 항암활성능 확인(In vitro)
4.4.2.1. xCelligence assay를 이용한 항암활성능 확인
타겟 세포(target 세포, T)에 대한 항-L1CAM-CAR (L1-H8-CAR)발현 T 세포(effector 세포, E)의 항암활성능을 확인하기 위해 xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) 분석법을 사용하였다. xCELLigence RTCA 분석법은 gold microelectrode biosensor가 코팅된 플레이트에 전기전도성 용액 (예: 배양배지)을 포함하는 경우 전자흐름이 index 값으로 수치화하여 나타나게 되며, 타겟세포가 플레이트에 부착하는 경우 전자흐름을 방해하여 index 값이 변화하게 된다. CAR 발현 T세포 첨가시 세포살상능에 의해 부착된 타겟 세포는 플레이트에서 떨어지게 되고 index 값의 변화를 분석함으로써 항암활성능(cytotoxicity)을 확인할 수 있다. 타겟 세포를 배양배지 50 uL에 1 x 104개로 준비하고, 분석용 플레이트에 첨가하였다. 약 21시간 후 L1-H8-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 1 x 104개, 5 x 104개, 1 x 105개(E:T 비율= 1, 5, 10)로 준비하여 타겟 세포를 포함한 well에 첨가하여 약 30시간 동안 실시간으로 cell index 값을 확인하였다. 또한 타겟 세포만 포함한 well을 준비하여 L1-H8-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 아래와 같이 계산하였다.
식
Cytotoxicity(%)={(타겟세포 well의 index값)-(타겟세포와 T 세포 반응 well의 index값)}/(타겟세포 well의 index 값) x 100
그 결과, 4종의 L1-H8-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SKOV3 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도25).
동일한 실험 방법을 이용하여 293T 세포에 대한 살상능을 확인하였다. 타겟세포를 배양배지 50 uL에 2.5 x 104개로 첨가하였고, 약 21 시간 후 L1-H8-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 2.5 x 104개, 1.25 x 105개, 2.5 x 105개(E:T 비율= 1, 5, 10)로 준비하여 타겟 세포를 포함한 well에 첨가하여 약 30시간동안 실시간으로 cell index 값을 확인하였다. 또한 타겟 세포만 포함한 well을 준비하여 L1-H8-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 위의 실험과 동일하게 계산하였다. 그 결과, 낮은 L1CAM 발현율을 보이는 293T 세포에서는 4종 모두 대조군과 유사한 세포살상능을 보였다(도 26).
4.4.2.2. CellToxTM Green dye를 이용한 항암활성능 확인
타겟세포(target 세포, T)에 대한 항-L1CAM-CAR (L1-H8-CAR)발현 T 세포(effector 세포, E)의 항암활성능을 확인하기 위해 CellToxTM Green dye를 사용하였다. CellToxTM Green dye는 죽은 세포에서 방출되는 DNA에 부착하여 형광을 나타내는 염료로 항암활성능(cytotoxicity)을 확인하는데 사용된다. 타겟세포를 배양배지 50 uL에 1x104개로 준비하고, CellToxTM Green dye를 0.2 uL 첨가하여 검은색 96 well 플레이트에 첨가하였다. L1-H8-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 5x103개, 1x104개, 5x104개, 1x105 (E:T 비율=0.5, 1, 5, 10)로 준비하여 타겟세포를 포함한 well에 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 24시간 동안 반응하였다. CellToxTM Green dye와 타겟 세포의 배양배지를 포함한 well에 L1-H8-CAR 발현 T 세포만 첨가한 군을 준비하여 반응시간 동안 죽는 L1-H8-CAR 발현 T 세포에서 방출되는 DNA에 부착하여 발생하는 염료의 반응 값을 제외시켜주었다. 또한 타겟 세포만 포함한 well을 준비하여 low control (spontaneous DNA release) 값을 보정하였고, 타겟세포만 포함한 well에 lysis solution을 첨가하여 high control (maximum DNA release) 값을 보정하였다. 타겟 세포에 대한 살상능은 아래의 방법으로 계산하였다.
식2
Cytotoxicity(%)={(Target세포와 Effector세포의 반응값)-(Effector세포의 반응값)}-(Low control)/(High control - Low control) X 100
그 결과, 4종의 L1-H8-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SH-SY5Y 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도 27a-27b).
동일한 실험 방법을 이용하여 HeLa 암세포에 대한 살상능을 확인하였다. 타겟세포를 배양배지 50 uL에 3.5 x 103개로 준비하고, CellToxTM Green dye를 0.2 uL 첨가하여 검은색 96 well 플레이트에 첨가하였다. L1-H8-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 1.75 x103개, 3.5 x 103개, 1.75 x 104개, 3.5 x 104개 (E:T 비율=0.5, 1, 5, 10)로 준비하여 타겟세포를 포함한 well에 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 24시간 동안 반응하였다. 타겟세포에 대한 살상능은 동일한 방법으로 보정하여 계산하였다. 그 결과, 4종의 L1-H8-CAR-001, -002, -003, -004 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 HeLa 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다 (도 28a-28b).
4.5. 다양한 spacer domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능 확인(In vivo)
생체내에서의 항-L1CAM-CAR(L1-H8-CAR) 유전자 발현 T 세포의 항암활성능을 확인하기 위하여 암발생 동물모델을 이용하였다. T 세포, B 세포, 자연살해 세포(NK 세포)가 결손된 NOD/SCID 마우스(7주령, 암컷)의 오른쪽 옆구리 피하(subcutaneous, SC)에 Matrigel과 1:1로 섞은 SKOV3 암세포(Target, T) 3 x 106개를 투여하여 암을 발생시켰다. In vitro에서 효능이 확인된 L1-H8-CAR 발현 T 세포4종과 대조군 T 세포를 암세포 투여 후 3일 후와 5일 후에 각각의 NOD/SCID 마우스에 1일 1회 총 2회 투여하였다. 투여 회당 2 x 107개의 T 세포를 꼬리 정맥(intravenous, IV)으로 투여하였고, 암의 크기를 25일까지 측정하였다. 그 결과, 대조군 T 세포 투여군에 비해 항-L1CAM-CAR 유전자 발현 T 세포 투여군 2종 모두에서 암 성장 속도가 저해되었음을 확인하였다. 특히 L1-H8-CAR-003의 암 성장 저해 효능이 가장 우수함을 확인하였다(도 29).
실시예 5. 다양한 costimulatory domain 구조의 항- L1CAM -CAR 발현 T세포 제작 및 효능 확인
5.1. 다양한 costimulatory domain 구조의 L1CMA-CAR 유전자 확보
5.1.1. L1-H8-CAR-001-28BB 유전자 확보
5.1.1.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 87(표 12)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD28 ICD의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 4-1BB의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-4-1BB의 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
사용한 프라이머의 염기서열 정보
서열번호 프라이머명 염기서열
70 Mlu 1+3E8 VH(F) ACGCGTATGGAATGGAGCTGGGTC
87 CD28 ICD+41BB(R) TCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGC
88 CD28 ICD+41BB(F) GCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAG
73 XhoI+CD3zeta(R) CCGCTCGAGTTAGCGAGGGGGCAGGGC
89 CD28 ICD+ICOS ICD (R) GGATGAATACTTGGAGCGATAGGCTGC
90 CD28 ICD+ICOS ICD (F) GCCTATCGCTCCAAGTATTCATCCAGT
91 ICOS ICD+CD3zeta(R) GAACTTCACTCTGGTCACATCTGTGAG
92 ICOS ICD+CD3zeta(F) ACAGATGTGACCAGAGTGAAGTTCAGC
93 CD28 ICD+CD3zeta(R) GAACTTCACTCTGGAGCGATAGGCTGC
94 CD28 ICD+CD3zeta(F) GCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGC
95 CD28 TM+OX40(R) CAGGTACAGGGCCACCCAGAAAATAAT
96 CD28 TM+OX40(F) ATTTTCTGGGTGGCCCTGTACCTGCTC
97 CD28 TM+41BB(R) TCTGCCCCGTTTCACCCAGAAAATAAT
98 CD28 TM+41BB(F) ATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAG
99 CD28TM+ICOS ICD(R) TGGATGAATACTTCACCCAGAAAATAATA
100 CD28TM+ICOS ICD(F) ATTTTCTGGGTGAAGTATTCATCCAGT
LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
Mlu I-start codon-3E8 LS ACGCGT ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
L1-H8 scFv(L1CAM-3R-H8 ) GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGAATTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTACTGGTTCTACTATCTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGTCTACTTACTTTTACTCTTACTTTGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTGATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
IgD hinge CGCTGGCCAGGTTCTCCAAAGGCACAGGCCTCCTCCGTGCCCACTGCACAACCCCAAGCAGAGGGCAGCCTCGCCAAGGCAACCACAGCCCCAGCCACCACCCGTAACACAGGTAGAGGAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAAGAGGAACAAGAAGAGAGAGAGACAAAGACACCAGGTTGTCCG
CD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
CD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
OX40 GCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
4-1BB Aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
ICOS AAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACC
CD3ζ-iso1-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CTCGAG
5.1.1.2. 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
공동 자극 도메인인 4-1BB와 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-CAR-004 플라스미드(도 30)를 주형으로 프라이머 서열번호 88(표 12)과 서열번호 73(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, 4-1BB의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD28 ICD의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 CD28 ICD-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.1.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-4-1BB와 CD28 ICD-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 73(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 31). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-001-28BB의 구조를 가지게 된다(도 32).
5.1.2. L1-H8-CAR-001-28ICOS 유전자 확보
5.1.2.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 89(표 12)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD28 ICD의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 ICOS의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD의 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.2.2. 공동 자극 도메인 ICOS 유전자 확보
공동 자극 도메인인 ICOS의 TM과 ICD 구조를 합성하였다. 유전자 합성을 통해 확보된 pBHA-ICOS TM+ICD(도 33)를 주형으로 프라이머 서열번호 90(표 12)과 서열번호 91(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, ICOS ICD의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD28 ICD의 12개 염기서열을 가지고, ICOS ICD의 3' 부위에 결합하는 프라이머 CD3ζ-iso1 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.2.3. CD3ζ 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 92(표 2)과 서열번호 73(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, CD3ζ-iso1의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 ICOS ICD의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.2.4. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD와 CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 91(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 34). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.2.5. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3 ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1 와 ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 73(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 34). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-001-28ICOS의 구조를 가지게 된다(도 35).
5.1.3. L1-H8-CAR-001-28 유전자 확보
5.1.3.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 93(표 12)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD28 ICD의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 CD3ζ-iso1의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-CD3ζ-iso1의 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.3.2. CD3ζ 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 94(표 12)과 서열번호 73(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, CD3ζ-iso1의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD28 ICD의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 CD28 ICD-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.3.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-CD3ζ-iso1와 CD28 ICD-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 73(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 36). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-001-28의 구조를 가지게 된다(도 37).
5.1.4. L1-H8-CAR-001-OX 유전자 확보
5.1.4.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv, Hinge, TM 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 95(표 12)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD28 TM의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 OX40의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-OX40의 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.4.2. 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001을 주형으로 프라이머 서열번호 96(표 12)과 서열번호 73(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, OX40의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD28 TM의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 CD28 TM-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.4.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-OX40와 CD28 TM-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 73(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 38). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-001-OX의 구조를 가지게 된다(도 39).
5.1.5. L1-H8-CAR-001-BB 유전자 확보
5.1.5.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv, Hinge, TM 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 97(표 12)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD28 TM의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 4-1BB의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-4-1BB의 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.5.2. 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-004(도 30)를 주형으로 프라이머 서열번호 98(표 12)과 서열번호 73(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, 4-1BB의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD28 TM의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 CD28 TM-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.5.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-4-1BB와 CD28 TM-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 73(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 40). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-001-BB의 구조를 가지게 된다(도 41).
5.1.6. L1-H8-CAR-001-ICOS 유전자 확보
5.1.6.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv, Hinge, TM 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 99(표 12)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD28 TM의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 ICOS-ICD의 13개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD의 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.6.2. 공동 자극 도메인 ICOS 유전자 확보
pBHA-ICOS TM+ICD(도 33)를 주형으로 프라이머 서열번호 100(표 12)과 서열번호 91(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, ICOS ICD의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD28 TM의 12개 염기서열을 가지고, ICOS ICD의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 CD3ζ-iso1 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.6.3. CD3ζ 유전자 확보
pMT-L1-H8-CAR-001를 주형으로 프라이머 서열번호 92(표 12)과 서열번호 73(표 12)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, CD3ζ-iso1의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 ICOS ICD의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.6.4. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, 공동 자극 도메인 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD와 CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 91(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 42). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1 염기서열을 가지게 된다(표 13). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
5.1.6.5. 3E8 LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1와 ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 12)와 서열번호 73(표 12)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 42). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-001-ICOS의 구조를 가지게 된다(도 43).
5.1.7. pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터 제조
6종의 증폭한 PCR 생성물을 Mlu I과 Xho I 제한효소 처리하여 DNA 절편을 확득하였다. 획득한 DNA 절편을 미리 Mlu I과 Xho I 제한효소로 처리된 pMT 레트로바이러스 벡터((미국 등록특허 제 US6,451,595호)에 결찰하여 6 종의 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터를 제작하였다(도 44). 이렇게 제조된 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터는 MLV LTR 프로모터의 조절 하에서 L1-H8-CAR를 코딩하는 서열을 포함한다.
5.2. 다양한 costimulatory domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 레트로바이러스(L1-H8-CAR 레트로바이러스) 제조
실시예 4.2와 동일한 방법으로 7종의 L1-H8-CAR-001과 L1-H8-CAR-001-28BB, -28ICOS, -28, -OX, -BB, -ICOS 유전자 발현 레트로바이러스를 제조하였다
5.3. 다양한 costimulatory domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포 제조
실시예 4.3.과 동일한 방법으로 7종의 L1-H8-CAR-T를 제조하였다. 그 결과, 공여자에 따라 차이가 있으나 배양 7일 또는 8일째에는 약 7.7% ~ 88.4%, 배양 11 일째에는 약 9.0% ~ 82.4%, 15일 또는 17일째에는 약 6.7% ~ 89.8%의 L1-H8-CAR 발현율을 확인하였다(표 14).
L1-H8-CAR 발현 T 세포 표면에서의 L1-H8-CAR 발현율 확인
공여자 번호 배양일 대조군 L1-H8-CAR-001 L1-H8-CAR-001-28BB L1-H8-CAR-001-28ICOS L1-H8-CAR-001-28 L1-H8-CAR-001-OX L1-H8-CAR-001-BB L1-H8-CAR-001-ICOS
39 8일 1.14% 76.8% 68.7% 75.4% 31.9% 88.4% 63.6% 67.4%
15일 0.96% 79.0% 72.4% 74.6% 33.3% 89.8% 59.3% 65.6%
37 7일 1.87% 66.1% 65.2% 68.8% 76.7% 7.7% 52.7% 62.5%
11일 0.39% 64.8% 46.4% 58.6% 74.0% 9.0% 31.8% 52.6%
17일 0.41% 62.4% 58.3% 62.5% 83.2% 6.7% 35.2% 50.5%
40 7일 2.21% 60.0% 59.8% 64.3% 76.3% 11.3% 50.5% 55.3%
11일 0.90% 70.7% 53.2% 67.1% 82.4% 12.2% 39.9% 59.2%
17일 0.32% 86.3% 82.4% 80.6% 88.5% 33.9% 65.5% 67.4%
5.4. 다양한 spacer domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능 확인(In vitro)
5.4.1. 타겟 세포에서의 L1CAM 발현율 확인
실시예 4.4.1.과 동일한 방법으로 타겟세포에서의 L1CAM 발현율을 확인하였다. 그 결과, SKOV3암세포에서 약 80.4~98.5%의 L1CAM 발현율을 확인하였다(도 45a-45c). 동일한 방법을 이용하여 사람 자궁경부암 세포주인 HeLa와 사람 신경아세포종 세포주인 SH-SY5Y, 사람 배아 신장 세포주인 293T에서 L1CAM의 발현을 확인한 결과 HeLa에서는 약 99.6~99.9%(도 45f-45g), SH-SY5Y에서는 약 52.1~98.1%(도 45h-45i), 293T에서는 약 0.023~4.72%의 발현율을 확인하였다(도 45d-45e).
5.4.2. 타겟 세포에 대한 L1CAM 발현 T 세포의 항암활성능 확인(in vitro)
5.4.2.1. xCelligence assay를 이용한 항암활성능 확인
실시예 4.4.2.1과 동일한 방법으로 SKOV3에 대한 7종 L1-H8-CAR의 효능을 확인하였다. 그 결과, 7종의 L1-H8-CAR-001과 L1-H8-CAR-001-28BB, -28ICOS, -28, -OX, -BB, -ICOS발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SKOV3 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도 46).
실시예 4.4.2.1과 동일한 실험 방법을 이용하여 293T 세포에 대한 살상능을 확인하였다. 그 결과, 낮은 L1CAM 발현율을 보이는 293T 세포에서는 7종 모두 대조군과 유사한 세포살상능을 보였다(도 47).
5.4.2.2. CellToxTM Green dye를 이용한 항암활성능 확인
실시예 4.4.2.2과 동일한 실험 방법을 이용하여 SH-SY5Y 세포에 대한 살상능을 확인하였다. 그 결과, 7종의 L1-H8-CAR-001과 L1-H8-CAR-001-28BB, -28ICOS, -28, -OX, -BB, -ICOS 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SH-SY5Y 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도 48a-48c).
실시예 4.4.2.2과 동일한 실험 방법을 이용하여 HeLa세포에 대한 살상능을 확인하였다. 그 결과, 7종의 L1-H8-CAR-001과 L1-H8-CAR-001-28BB, -28ICOS, -28, -OX, -BB, -ICOS 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 HeLa 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다 (도 49a-49c).
5.5. 다양한 costimulatory domain 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능 확인(In vivo)
생체 내에서의 항-L1CAM-CAR(L1-H8-CAR) 유전자 발현 T 세포의 항암활성능을 확인하기 위하여 암발생 동물모델을 이용하였다. T 세포, B 세포, 자연살해 세포(NK 세포)가 결손된 NOD/SCID 마우스(7주령, 암컷)의 오른쪽 옆구리 피하(subcutaneous, SC)에 Matrigel과 1:1로 섞은 SKOV3 암세포(Target, T) 3 x 106개를 투여하여 암을 발생시켰다. In vitro에서 효능이 확인된 L1-H8-CAR 발현 T 세포 7종과 대조군 T 세포를 암세포 투여 후 3일 후와 5일 후에 각각의 NOD/SCID 마우스에 1일 1회 총 2회 투여하였다. 투여 회당 2 x 107개의 T 세포를 꼬리 정맥(intravenous, IV)으로 투여하였고, 암의 크기를 25일까지 측정하였다. 그 결과, 대조군 T 세포 투여군에 비해 항-L1CAM-CAR 유전자 발현 T 세포 7종 투여군 모두에서 암 성장 속도가 저해되었음을 확인하였다. 특히 L1-H8-CAR-001-28ICOS의 암 성장 저해 효능이 가장 우수함을 확인하였다(도 50).
실시예 6. 다양한 구조의 항- L1CAM -CAR 발현 T세포 제작 및 효능 확인
6.1. 다양한 구조의 L1CMA-CAR 유전자 확보
6.1.1. L1-H8-CAR-005 유전자 확보
6.1.1.1. 3E8 항체의 선행 서열(LS), L1-H8 scFv_reverse 유전자 확보
3E8 LS와 L1-H8 scFv의 항체 가변 경쇄(VL), Linker, L1-H8 scFv의 항체 가변 중쇄(VH)의 구조를 합성하였다. 유전자 합성을 통해 확보된 pBHA-3E8 LS-H8Rev(도 51)를 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 15)과 서열번호 103(표 15)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, 3E8 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 3E8 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, L1-H8 scFv-Reverse의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hIgD hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge의 염기서열을 가지게 된다(표 16). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
사용한 프라이머의 염기서열 정보
서열번호 프라이머명 염기서열
70 Mlu 1+3E8 VH(F) ACGCGTATGGAATGGAGCTGGGTC
103 L1-H8 HC+IgD hinge(R) ACCTGGCCAGCGCGATGAGACGGTCAC
104 L1-H8 HC+IgD hinge(F) ACCGTCTCATCGCGCTGGCCAGGTTCT
73 XhoI+CD3zeta(R) CCGCTCGAGTTAGCGAGGGGGCAGGGC
105 AS+MluI+2173-CD8a_LS(F) CGACGCGTATGGCCCTCCCTGTCACCG
106 2173-CD8a_LS+C9 ScFv(R) CAACTGTACTTCGGGCCGAGCGGCGTG
107 2173-CD8a_LS+C9 ScFv(F) GCCGCTCGGCCCGAAGTACAGTTGGTC
108 C9 ScFv+hCD8a_Hinge(R) TGGGGTAGTGGTTTTAATTTCCACTTT
109 C9 ScFv+hCD8a_Hinge(F) GTGGAAATTAAAACCACTACCCCAGCA
110 AS+Xho1+2173-CD3 zeta(R) CCGCTCGAGTTACCGAGGCGGCAGGGC
111 AS+MluI+GMCSF rec.a LS(F) CGACGCGTATGCTTCTCCTGGTGACAA
112 GMCSF rec.a LS+L1-H8 scFv(R) CAACTGTACTTCTGGGATCAGGAGGAA
113 GMCSF rec.a LS+L1-H8 scFv(F) CTCCTGATCCCAGAAGTACAGTTGGTC
114 L1-H8 scFv+hinge+hCD28(R) AATTGCGGCCGCTTTAATTTCCACTTT
115 L1-H8 scFv+hinge+hCD28(F) GTGGAAATTAAAGCGGCCGCAATTGAA
116 AS+Xho1+CD3-ζ (R) CCGCTCGAGTTATTAGCGAGGGGGCAGG
LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
Mlu I-start codon-3E8 LS ACGCGT ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC
L1-H8 scFv-Rev(L1CAM-3R-H8Rev ) GACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTGATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGAATTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTACTGGTTCTACTATCTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGTCTACTTACTTTTACTCTTACTTTGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCG
IgD hinge CGCTGGCCAGGTTCTCCAAAGGCACAGGCCTCCTCCGTGCCCACTGCACAACCCCAAGCAGAGGGCAGCCTCGCCAAGGCAACCACAGCCCCAGCCACCACCCGTAACACAGGTAGAGGAGGAGAAGAGAAGAAGAAGGAGAAGGAGAAAGAGGAACAAGAAGAGAGAGAGACAAAGACACCAGGTTGTCCG
IgG1 hinge GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA
CD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
CD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
OX40 GCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
CD3ζ-iso1-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA CTCGAG
6.1.1.2. Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Human IgD의 Hinge와 IgG1의 hinge, CD28의 TM과 ICD, 공동 자극 도메인인 OX40 및 CD3ζ-iso1을 포함하는 pMT-L1-H8-CAR-003(도 23) 플라스미드를 주형으로 프라이머 서열번호 104(표 15)과 서열번호 73(표 15)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hIgD hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 항체 가변 중쇄(VH)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso1의 3' 부위에 결합하는 프라이머 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I염기서열을 가지게 된다(표 16). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.1.3. 3E8 LS, L1-H8 scFv-Rev, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge와 L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 70(표 15)와 서열번호 73(표 15)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 52). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-005의 구조를 가지게 된다(도 53).
6.1.2. L1-H8-CAR-006 유전자 확보
6.1.2.1. CD8 alpha의 선행 서열(LS) 유전자 확보
CD8 alpha의 LS를 포함하는 pMT-CAR-005(도 54) 플라스미드를 주형으로 프라이머 서열번호 105(표 15)과 서열번호 106(표 15)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 이 때, CD8 alpha 선행 서열(LS)의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열과 CD8 alpha 선행서열(LS)의 18개 염기서열을 가지고, CD8 alpha 선행 서열(LS)의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 항체 가변 중쇄(VH)의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-hCD8α LS-L1-H8 scFv의 염기서열을 가지게 된다(표 17). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
Mlu I-start codon-hCD8α LS ACGCGT ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
L1-H8 scFv(L1CAM-3R-H8 ) GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGAATTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTACTGGTTCTACTATCTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGTCTACTTACTTTTACTCTTACTTTGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTGATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
hCD8a hinge ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
hCD8a TM ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
4-1BB AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
CD3ζ-iso2M-stop codon-Xho I CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAA CTCGAG
6.1.2.2. L1-H8 scFv 유전자 확보
L1-H8 scFv를 포함하는 pMT-L1-H8-CAR-001(도 23)플라스미드를 주형으로 프라이머 서열번호 107(표 15)과 서열번호 108(표 15)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, L1-H8 scFv의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 CD8 alpha LS의 12개 염기서열을 가지고, L1-H8 scFv 3' 부위에 결합하는 프라이머는 hCD8alpha Hinge의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 hCD8α LS-L1-H8 scFv-hCD8α hinge 염기서열을 가지게 된다(표 17). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.2.3. Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Human CD8 alpha의 hinge와 TM, 공동 자극 도메인인 4-1BB 및 CD3ζ -iso2M을 포함하는 pMT-CAR-005(도 54) 플라스미드를 주형으로 프라이머 서열번호 109(표 15)과 서열번호 110(표 5)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, hCD8α hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 항체 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso2M의 3' 부위에 결합하는 프라이머 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 L1-H8 scFv-hCD8α hinge-hCD8α TM-4-1BB-CD3ζ-iso2M-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 17). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.2.4. CD8α LS, L1-H8 scFv 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-hCD8α LS-L1-H8 scFv와 hCD8α LS-L1-H8 scFv-hCD8α hinge를 주형으로 프라이머 서열번호 105(표 15)와 서열번호 108(표 15)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 55). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-hCD8α LS-L1-H8 scFv-CD28 hinge염기서열을 가지게 된다. 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.2.5. CD8α LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-hCD8α LS-L1-H8 scFv-hCD8αhinge와 L1-H8 scFv-hCD8α hinge-hCD8α TM-4-1BB-CD3ζ-iso2M-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 105(표 15)와 서열번호 110(표 15)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 55). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-hCD8αLS-L1-H8 scFv-hCD8α hinge-hCD8α TM-4-1BB-CD3ζ-iso2M-Xho I염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-006의 구조를 가지게 된다(도 56).
6.1.3. L1-H8-CAR-007 유전자 확보
6.1.3.1. hGM-CSF receptor alpha-chain의 신호 서열 유전자 확보
hGM-CSF rec.α의 신호 서열을 포함하는 pMT-CAR-006 플라스미드(도 57)를 주형으로 프라이머 서열번호 111(표 15)과 서열번호 112(표 15)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다.이 때 hGM-CSF rec.α의5' 부위에 결합하는 프라이머는 Mlu I 제한효소 염기서열을 가지고, hGM-CSF rec.α의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 가변 중쇄(VH)의 12개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv의 염기서열을 가지게 된다(표 18). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
LS, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD, 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 서열
ID Nucleotide sequence
Mlu I-start codon-hGM-CSF rec.a LS ACGCGT atgcttctcctggtgacaa gccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca
L1-H8 scFv(L1CAM-3R-H8 ) GAAGTACAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTGGCCTCGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCTCGGGTTTTACTTTCTCTGATTATGCAATGAATTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGCAAGGGTCTCGAATGGGTTTCAGCAATCTCTTCTACTGGTTCTACTATCTACTATGCCGATTCAGTGAAGGGTCGCTTTACCATTTCCCGTGACAACTCTAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCGCTGCGTGCCGAAGACACGGCCGTCTATTATTGCGCCAAACAGTCTACTTACTTTTACTCTTACTTTGATGTTTGGGGTCAGGGCACTTTAGTGACCGTCTCATCGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGGACATTCAAATGACGCAGAGTCCCTCCTCACTGAGTGCTAGCGTGGGCGATCGTGTGACAATTACTTGTCGCGCTAGCCAGTCTATCTCTCGTGATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCGCCAAAATTGCTGATTTACGCAGCATCCTCTCTGCAGTCTGGTGTACCGTCCCGTTTCTCTGGCAGCGGTTCTGGTACGGATTTTACCCTGACCATCTCAAGCCTCCAGCCTGAAGATTTTGCCACCTATTATTGTCAGCAATCTTACTCTACTCCGTACACGTTCGGGCAGGGAACTAAAGTGGAAATTAAA
hinge GCGGCCGCA
hCD28 pECD ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC
hCD28 TM TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
hCD28 ICD AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
CD3ζ-iso2-stop codon-Xho I AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATAATAA CTCGAG
6.1.3.2. L1-H8 scFv 유전자 확보
L1-H8 scFv를 포함하는 pMT-L1-H8-CAR-001(도 23)플라스미드를 주형으로 프라이머 서열번호 113(표 15)과 서열번호 114(표 15)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때, L1-H8 scFv의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 hGM-CSF rec.α LS의 12개 염기서열을 가지고, L1-H8 scFv 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Hinge의 9개 염기서열과 hCD28 pECD의 3개 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 hGM-CSF rec.α LS-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD염기서열을 가지게 된다(표 18). 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.3.3. Hinge, TM, ICD공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
Hinge, hCD28의 pECD와 TM, ICD 및 hCD3ζ-iso2를 포함하는 pMT-CAR-006 플라스미드(도 57)를 주형으로 프라이머 서열번호 115(표 13)와 서열번호 116(표 13)을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 사용하였다. 이 때 Hinge의 5' 부위에 결합하는 프라이머는 L1-H8 scFv 가변 경쇄(VL)의 12개 염기서열을 가지고, CD3ζ-iso2의 3' 부위에 결합하는 프라이머는 Xho I 제한효소 염기서열을 가져서 증폭된 PCR 생성물은 L1-H8 scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I 염기서열을 가지게 된다(표 16). 증폭한 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.3.4. hGM-CSF receptor alpha-chain의 신호 서열, L1-H8 scFv 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv와 hGM-CSF rec.α LS-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD를 주형으로 프라이머 서열번호 111(표 15)와 서열번호 114(표 15)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 58). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD 염기서열을 가지게 된다. 증폭한 PCR 생성물은 다음 PCR 증폭과정에 사용하였다.
6.1.3.5. hGM-CSF receptor alpha-chain의 신호 서열, L1-H8 scFv, Hinge, TM, ICD공동 자극 도메인 및 CD3ζ 유전자 확보
증폭한 PCR 생성물인 Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD와 L1-H8 scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I을 주형으로 프라이머 서열번호 111(표 15)와 서열번호 116(표 15)를 이용하여 OE-PCR 방법으로 증폭하였다(도 58). 증폭된 PCR 생성물은 Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I 염기서열을 가지게 되며, L1-H8-CAR-007의 구조를 가지게 된다(도 59).
6.1.4. pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터 제조
3종의 증폭한 PCR 생성물을 Mlu I과 Xho I 제한효소 처리하여 DNA 절편을 확득하였다. 획득한 DNA 절편을 미리 Mlu I과 Xho I 제한효소로 처리된 pMT 레트로바이러스 벡터(미국 등록특허 제 US6,451,595호)에 결찰하여 3 종의 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터를 제작하였다(도 60). 이렇게 제조된 pMT-L1-H8-CAR 레트로바이러스 벡터는 MLV LTR 프로모터의 조절 하에서 L1-H8-CAR를 코딩하는 서열을 포함한다.
6.2. 다양한 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 레트로바이러스(L1-H8-CAR 레트로바이러스) 제조
실시예 4.2.와 동일한 방법으로 4종의 L1-H8-CAR-003, -005, -006, -007 유전자 발현 레트로바이러스를 제조하였다.
6.3. 다양한 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포 제조
실시예 4.3.과 동일한 방법으로 4종의 L1-H8-CAR-T를 제조하였다. 그 결과, 공여자에 따라 차이가 있으나 배양 8일째에는 약 22.1%~74.1%, 배양 11 일째에는 약 27.1%~77.1%, 14일 째에는 약 24.6%~76.6%, 배양 16 일째에는 약 29.8%~81.9%의 L1-H8-CAR 발현율을 확인하였다(표 19).
L1-H8-CAR 발현 T 세포 표면에서의 L1-H8-CAR 발현율 확인
공여자
번호		 배양일 대조군 L1-H8-CAR-003 L1-H8-CAR-005 L1-H8-CAR-006 L1-H8-CAR-007
37 8일 1.07% 67.1% 22.1% 71.4% 63.4%
11일 1.75% 65.7% 27.1% 72.8% 61.2%
14일 1.01% 60.0% 24.6% 64.5% 52.7%
16일 0.81% 69.5% 29.8% 78.3% 70.7%
50 8일 1.36% 73.2% 34.5% 74.1% 63.3%
11일 1.73% 75.6% 39.0% 77.1% 68.3%
14일 0.87% 76.6% 35.4% 69.8% 62.5%
16일 0.59% 81.9% 43.9% 81.8% 74.3%
6.4. 다양한 구조의 L1-H8-CAR 유전자 발현 T 세포의 항암활성능 확인(In vitro)
6.4.1. 타겟 세포에서의 L1CAM 발현율 확인
실시예 4.4.1.과 동일한 방법으로 타겟세포에서의 L1CAM 발현율을 확인하였다. 그 결과, SKOV3암세포에서 약 67.1%~87.0%의 L1CAM 발현율을 확인하였다. 동일한 방법을 이용하여 사람 자궁경부암 세포주인 HeLa와 사람 신경아세포종 세포주인 SH-SY5Y, 사람 배아 신장 세포주인 293T에서 L1CAM의 발현을 확인한 결과 HeLa에서는 약 98.4%, SH-SY5Y에서는 약 65.0~70.9%, 293T에서는 약 0.082%의 발현율을 확인하였다(도 61a-61f).
6.4.2. 타겟 세포에 대한 L1CAM 발현 T 세포의 항암활성능 확인(in vitro)
6.4.2.1. xCelligence assay를 이용한 항암활성능 확인
실시예 4.4.2.1과 동일한 방법으로 SKOV3에 대한 4종 L1-H8-CAR의 효능을 확인하였다. 그 결과, 4종의 L1-H8-CAR-003과 L1-H8-CAR-005, -006, -007 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SKOV3 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도 62).
실시예 4.4.2.1.과 동일한 실험 방법을 이용하여 SH-SY5Y 세포에 대한 살상능을 확인하였다. 타겟세포를 배양배지 50 uL에 1.0 x 105개로 첨가하였고, 약 21 시간 후 L1-H8-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 5.0 x 104개, 1.0 x 105개, 5.0 x 105개(E:T 비율= 0.5, 1, 5)로 준비하여 타겟 세포를 포함한 well에 첨가하여 약 30시간 동안 실시간으로 cell index 값을 확인하였다. 또한 타겟 세포만 포함한 well을 준비하여 L1-H8-CAR 발현 T 세포의 항암활성능을 위의 실험과 동일하게 계산하였다. 그 결과, 4종의 L1-H8-CAR-003과 L1-H8-CAR-005, -006, -007 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 SH-SY5Y 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도 63).
6.4.2.2. CellToxTM Green dye를 이용한 항암활성능 확인
실시예 4.4.2.2.과 동일한 방법으로 HeLa 세포에 대한 4종 L1-H8-CAR의 효능을 확인하였다. 그 결과, 4종의 L1-H8-CAR-003과 L1-H8-CAR-005, -006, -007 발현 T 세포는 L1-H8-CAR를 발현하지 않는 T 세포(대조군)에 비해 HeLa 세포에 대해 높은 세포살상능을 보였다(도64).
실시예 4.4.2.2.과 동일한 실험 방법을 이용하여 293T 암세포에 대한 살상능을 확인하였다. 타겟세포를 배양배지 50 uL에 1.0 x 104개로 준비하고, CellToxTM Green dye를 0.2 uL 첨가하여 검은색 96 well 플레이트에 첨가하였다. L1-H8-CAR 발현 T 세포를 사람 혈청과 사람 IL-2가 포함된 AIMV 배지 50 uL에 5.0 x103개, 1.0 x 104개, 5.0 x 104개, 1.0 x 105개 (E:T 비율=0.5, 1, 5, 10)로 준비하여 타겟세포를 포함한 well에 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 24시간 동안 반응하였다. 타겟세포에 대한 살상능은 동일한 방법으로 보정하여 계산하였다.
그 결과, 낮은 L1CAM 발현율을 보이는 293T 세포에서는 4종 모두 대조군과 유사하거나 보다 낮은 세포살상능을 보였다(도 65).
<110> Helixmith Co., Ltd <120> Anti-L1CAM Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, and Chimeric Antigen Receptor Comprising The Same <130> PN180329P <150> KR 10-2018-0125538 <151> 2018-10-19 <160> 130 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-H8 <400> 1 Asp Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-C9 <400> 2 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-E1, mL1CAM-3R-F1, and mL1CAM-2R-F8 <400> 3 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-F6 <400> 4 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-G6 <400> 5 Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-A2 <400> 6 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of mL1CAM-3R-E9 <400> 7 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of mL1CAM-3R-H8 <400> 8 Ala Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of mL1CAM-3R-C9, mL1CAM-3R-F1, and mL1CAM-3R-E9 <400> 9 Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of mL1CAM-3R-E1 <400> 10 Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of mL1CAM-3R-F6 <400> 11 Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of mL1CAM-3R-G6 <400> 12 Ala Ile Tyr Gln Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 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ggtcagggca ctttagtgac cgtctcatcg 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcggacat tcaaatgacg 420 cagagtccct cctcactgag tgctagcgtg ggcgatcgtg tgacaattac ttgtcgcgct 480 agccagtcta tctctcgtta cctgaactgg tatcagcaga aaccgggcaa ggcgccaaaa 540 ttgctgattt acgcagcatc caatctgcag tctggtgtac cgtcccgttt ctctggcagc 600 ggttctggta cggattttac cctgaccatc tcaagcctcc agcctgaaga ttttgccacc 660 tattattgtc agcaatctta ctcttttccg tggacgttcg ggcagggaac taaagtggaa 720 attaaa 726 <210> 62 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of scFv of mL1CAM-3R-E1 <400> 62 gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60 agctgcgccg cctcgggttt tactttctct tcttatgcaa tgtcttgggt tcgtcaggcg 120 ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttctt ctggttcttc tacttactat 180 gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240 ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaagatgaa 300 tctactggtc tgggtgcatt tgattactgg ggtcagggca ctttagtgac cgtctcatcg 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcggacat tcaaatgacg 420 cagagtccct cctcactgag tgctagcgtg ggcgatcgtg tgacaattac ttgtcgcgct 480 agccagtcta tctctaatta cctgaactgg tatcagcaga aaccgggcaa ggcgccaaaa 540 ttgctgattt acgcagcatc caatctgcag tctggtgtac cgtcccgttt ctctggcagc 600 ggttctggta cggattttac cctgaccatc tcaagcctcc agcctgaaga ttttgccacc 660 tattattgtc agcaatctta ctcttttccg tggacgttcg ggcagggaac taaagtggaa 720 attaaa 726 <210> 63 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of scFv of mL1CAM-3R-E9 <400> 63 gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60 agctgcgccg cctcgggttt tactttctct gattatgcaa tgcactgggt tcgtcaggcg 120 ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttctt ctggtggttc tacttactat 180 gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240 ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaacatggt 300 ggtacttggt ggggtcgtgc attcgattac tggggtcagg gcactttagt gaccgtctca 360 tcgggtggag gcggttcagg cggaggtgga tccggcggtg gcggatcgga cattcaaatg 420 acgcagagtc cctcctcact gagtgctagc gtgggcgatc gtgtgacaat tacttgtcgc 480 gctagccagt ctatcggttc ttacctgaac tggtatcagc agaaaccggg caaggcgcca 540 aaattgctga tttacgcaac ttcctctctg cagtctggtg taccgtcccg tttctctggc 600 agcggttctg gtacggattt taccctgacc atctcaagcc tccagcctga agattttgcc 660 acctattatt gtcagcaatc ttactctact ccgtacacgt tcgggcaggg aactaaagtg 720 gaaattaaa 729 <210> 64 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of scFv of mL1CAM-3R-H8 <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Ser 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HC+IgD hinge(R) <400> 103 acctggccag cgcgatgaga cggtcac 27 <210> 104 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for L1-H8 HC+IgD hinge(F) <400> 104 accgtctcat cgcgctggcc aggttct 27 <210> 105 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for AS+MluI+2173-CD8a_LS(F) <400> 105 cgacgcgtat ggccctccct gtcaccg 27 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for 2173-CD8a_LS+C9 ScFv(R) <400> 106 caactgtact tcgggccgag cggcgtg 27 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for 2173-CD8a_LS+C9 ScFv(F) <400> 107 gccgctcggc ccgaagtaca gttggtc 27 <210> 108 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for C9 ScFv+hCD8a_Hinge(R) <400> 108 tggggtagtg gttttaattt ccacttt 27 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for C9 ScFv+hCD8a_Hinge(F) <400> 109 gtggaaatta aaaccactac cccagca 27 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for AS+Xho1+2173-CD3 zeta(R) <400> 110 ccgctcgagt taccgaggcg gcagggc 27 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for AS+MluI+GMCSF rec.a LS(F) <400> 111 cgacgcgtat gcttctcctg gtgacaa 27 <210> 112 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for GMCSF rec.a LS+L1-H8 scFv(R) <400> 112 caactgtact tctgggatca ggaggaa 27 <210> 113 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for GMCSF rec.a LS+L1-H8 scFv(F) <400> 113 ctcctgatcc cagaagtaca gttggtc 27 <210> 114 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for L1-H8 scFv+hinge+hCD28(R) <400> 114 aattgcggcc gctttaattt ccacttt 27 <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for L1-H8 scFv+hinge+hCD28(F) <400> 115 gtggaaatta aagcggccgc aattgaa 27 <210> 116 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for AS+Xho1+CD3-zeta (R) <400> 116 ccgctcgagt tagcgagggg gcagg 25 <210> 117 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mlu I-start codon-hCD8a LS <400> 117 acgcgtatgg ccctccctgt caccgccctg ctgcttccgc tggctcttct gctccacgcc 60 gctcggccc 69 <210> 118 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD8a hinge <400> 118 accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60 tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120 gacttcgcct gcgat 135 <210> 119 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD8a TM <400> 119 atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60 actctttact gt 72 <210> 120 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB <400> 120 aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60 actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120 gaactg 126 <210> 121 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta-iso2M <400> 121 cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60 tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120 cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180 gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240 agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300 tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336 <210> 122 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta-iso2M-stop codon-Xho I <400> 122 cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60 tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120 cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180 gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240 agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300 tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcggtaac tcgag 345 <210> 123 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mlu I-start codon-hGM-CSF rec.a LS <400> 123 acgcgtatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60 ctcctgatcc ca 72 <210> 124 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge <400> 124 gcggccgca 9 <210> 125 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD28 pECD <400> 125 attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60 catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117 <210> 126 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta-iso2 <400> 126 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339 <210> 127 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta-iso2-stop codon-Xho I <400> 127 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat aactcgag 348 <210> 128 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3E8 leader sequence <400> 128 gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacaggt gtccactcc 49 <210> 129 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD8 alpha leader sequence <400> 129 gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60 60 <210> 130 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGM-CSF receptor alpha-chain leader sequence <400> 130 cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt cctcctgatc 60 cca 63

Claims (31)

  1. 다음 i), ii), 및 iii)을 포함하는 중쇄 가변영역(heavy chain variable region, VH) 및 다음 vi), v), 및 vi)을 포함하는 경쇄 가변영역(light chain variable region, VL)을 포함하는 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    i) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1(complementarity determining region 1 of heavy chain):
    X1YAMX5
    여기서 서로 독립적으로,
    X1은 D, S, 또는 N이고;
    X5는 N, H, 또는 S이고;
    ii) 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2(complementarity determining region 2 of heavy chain):
    AISSX5GX7X8X9YYADSVKG
    여기서 서로 독립적으로,
    X5는 S 또는 T이고;
    X7은 S, 또는 G이고;
    X8은 S, 또는 T이고;
    X9는 I, T, 또는 K이고;
    iii) 서열번호 15 내지 서열번호 23로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3(complementarity determining region 3 of heavy chain);
    iv) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1(complementarity determining region 1 of light chain):
    RASQSIX7X8X9LN
    여기서 서로 독립적으로,
    X7은 S 또는 G이고;
    X8은 R, N, 또는 S이고;
    X9는 D 또는 Y이고;
    v) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2(complementarity determining region 2 of light chain):
    AX2SX4LQS
    여기서 서로 독립적으로,
    X2는 A, 또는 T이고;
    X4는 S, N, R, 또는 T이고;
    vi) 다음 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3(complementarity determining region 3 of light chain):
    QQSX4SX6PX8T
    여기서 서로 독립적으로,
    X4는 Y, 또는 E이고;
    X6은 T, F, 또는 Y이고;
    X8은 Y, W, L, 또는 F이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 7로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CDRH2는 서열번호 8 내지 14로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CDRL1은 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 CDRL2는 서열번호 37 내지 42로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 CDRL3는 서열번호 43 내지 47로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 24 내지 26으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 FRH2(Framework region 2 of Heavy chain)를 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 28 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 FRH3(Framework region 3 of Heavy chain)를 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 상기 VH는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 FRH4(Framework region 4 of Heavy chain)를 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, 상기 VL은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FRL1(Framework region 1 of Light chain)을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, 상기 VL은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FRL2(Framework region 2 of Light chain)을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제1항에 있어서, 상기 VL은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FRL3(Framework region 3 of Light chain)을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, 상기 VL은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FRL4(Framework region 4 of Light chain)을 포함하는 것인, 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제1항의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질.
  16. 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드:
    (a) L1CAM 결합 도메인(L1CAM binding domain);
    (b) 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM);
    (c) 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
    (d) 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD).
  17. 제16항에 있어서, 상기 L1CAM 결합도메인은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  18. 제16항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  19. 제16항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Toll-like ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  20. 제16항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 60 내지 63으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  23. 제21항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  24. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효과기 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효과기 세포.
  27. 제1항의 항-L1CAM 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 치료 또는 진단용 약제학적 조성물.
  28. 제16항의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 치료용 약제학적 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 암은 고형암인, 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 고형암은 위암, 유방암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암(endometrial carcinoma), 위장관 기질암(gastrointestinal stromal tumer) 난소암, 흑색종, 담낭암, 간세포암(hepatocelluloar carcinoma), 담관암(cholangiocarcinoma), 췌관선암(pancreatic ductal adenocarcinoma), 식도암, 신세포암(renal cell carcinoma), 직장암, 결장암, 전립선암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 갑상선암, 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma) 및 성상세포종(astrocytoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약제학적 조성물.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)인, 약제학적 조성물.


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