KR20200044934A

KR20200044934A - 피부의 항노화용제 및 항노화 관련 유전자 발현 조절용제

Info

Publication number: KR20200044934A
Application number: KR1020207009269A
Authority: KR
Inventors: 요시히사 야마다; 유야 타다
Original assignee: 제네틱바이오랩 가부시키가이샤; 가부시키가이샤 파이널 퓨처 인터내셔널
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2020-04-29
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: EP3677248A4; EP3677248B1; JP2020015672A; US20200237636A1; MY194768A; RU2744251C1; EP3677248A1; JP6555674B1; BR112020006113A2; KR102366340B1; TW202015654A; US11554092B2; TWI747011B; PH12020550395A1; MX2020004602A; WO2020022131A1

Abstract

본 발명은 안전성이 높고, 장기간에 걸쳐 안심하고 사용할 수 있는 피부의 항노화용제, 항노화 관련 유전자 발현 조절용제, 및 이 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 포함하여 이루어진 화장품을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명의 피부의 항노화용제, 항노화 관련 유전자 발현 조절용제, 및 이 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 포함하여 이루어진 화장품은 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물, 바람직하게는 대두 싹 엑기스를 유효성분으로 포함한다. 이 유효성분은 진피 섬유아세포의 기능 부활 작용을 가지므로, 피부의 탱탱함이나 탄력의 저하, 주름이나 처짐과 같은 피부 노화의 예방 또는 개선이 기대된다.

Description

피부의 항노화용제 및 항노화 관련 유전자 발현 조절용제

본 발명은 피부의 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 항노화용제, 항노화 관련 유전자 발현 조절용제, 및 이 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 포함하여 이루어진 화장품에 관한 것이다.

피부는 외계와 접하고 있는 표피, 그 내측에 위치하며 표피와 강한 힘으로 접착하고 있는 진피, 보다 그 내측에 있으며 진피와 근육 사이에 위치하고 있는 피하지방조직으로 크게 나눌 수 있다. 표피와 피하지방조직 사이에 위치하는 진피는 유두층과 진피 망상층, 결합성 섬유조직으로 구성된다. 이 진피의 약 70%는 콜라겐이 차지하며, 그 외에 탄성섬유(엘라스틴), 히알루론산 등의 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 이들 진피를 구성하는 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 등은 진피 망상층에 존재하는 진피 섬유아세포에 의해 생성된다.

일반적으로, 자외선, 건조, 노화 등으로 인해, 이들 섬유가 파괴되고 낡아져서 탄력이 저하되는 동시에 세포외 매트릭스 성분의 산생기능이 저하되는 것이, 피부의 탱탱함이나 탄력의 저하, 주름이나 처짐과 같은 피부 노화의 원인으로 여겨지고 있다. 이와 같이, 피부의 탄력성 저하나 주름 형성 등의 노화 현상에는 진피의 세포외 매트릭스 성분, 특히 콜라겐이나 히알루론산의 감소가 관여하고 있다.

따라서, 진피 섬유아세포의 기능을 부활(賦活)시켜, 상기한 세포외 매트릭스 성분의 산생을 증가시키면, 피부 노화를 예방 또는 개선할 수 있다고 생각된다. 특히, 안면에 형성되는 주름은 노화 마커로서 인간의 외관에 큰 영향을 미친다. 그 때문에, 젊음을 유지하는 수단으로서, 주름의 예방 또는 개선 효과를 갖는 화장품(항노화/항주름 화장품)에 대한 요구가 점점 높아지고 있다(비특허문헌 1).

여기에서, 안전하고 효과가 뛰어난 기능성 식품으로 사용되고 있는 디옥시리보핵산(DNA)은 피부 상태(수분량, 피지량, 피부고랑 밀도, 주름, 기미, 주근깨 등)의 개선 효과가 있음이 보고되고 있다(특허문헌 1, 2).

또한, 대두의 종자, 배아(배) 또는 싹의 추출물은 폴리아민을 많이 포함하며, 피부 구조를 지지하는 엘라스틴, 콜라겐, 히알루론산 등의 세포외 매트릭스 성분의 산생촉진작용을 갖는 것으로 보고되고 있다(특허문헌 3).

그러나, 이들 디옥시리보핵산(DNA)과 대두 추출물의 상호작용에 대해서는, 본 발명자가 아는 한 보고되어 있지 않다.

일본 특허공개공보 2007-291062호 일본 특허공개공보 2008-63315호 일본 특허공개공보 2012-46544호

스즈키 마사토 감수 "노화방지/미백/보습화장품의 기술개발"(보급판) 주식회사 씨엠씨 출판, 2007년 8월 23일 제1쇄 발행

진피 섬유아세포의 기능을 부활시켜 세포외 매트릭스 성분, 특히 콜라겐이나 히알루론산의 산생을 증가시키면, 상기한 바와 같이, 피부 노화의 예방 또는 개선을 기대할 수 있다. 따라서, 본 발명은 보다 우수한 진피 섬유아세포의 부활 효과를 가지며, 또한 안전성이 높고 장기간에 걸쳐 안심하고 사용할 수 있는 피부의 항노화용제, 항노화 관련 유전자 발현 조절용제, 및 이 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 포함하여 이루어진 화장품을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제에 대해 열심히 검토한 결과, 장기간 복용하여도 안전한 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물이, 진피 섬유아세포에 대해 상승적인 부활 작용, 즉 세포증식작용, 콜라겐 산생촉진작용 및 히알루론산 산생촉진작용에 대한 상승적인 효과(상승 효과)를 갖는 것과, 히알루론산 합성에 관련된 유전자 발현을 상승적으로 추진하는 동시에 히알루론산 분해에 관련된 유전자 발현을 감소시키는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 사실들에 기초하여 이룰 수 있는 것이다. 즉, 본 발명은 다음과 같다.

(1) 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 특수 저분자화 DNA는 동식물에서 추출한 DNA의 가수분해처리물이고, 상기 대두 추출물은 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물인 것을 특징으로 하는 피부의 항노화용제.

(2) 항노화가 진피 섬유아세포의 기능 부활이며, 해당 기능 부활이 진피 섬유아세포의 증식촉진작용, I형 콜라겐 산생촉진작용 및 히알루론산 산생촉진작용으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 작용인, (1)에 기재된 항노화용제.

(3) 특수 저분자화 DNA의 함량이 0.001 내지 1질량%이며, 대두 추출물의 함량이 0.001 내지 1질량%인, (1) 또는 (2)에 기재된 항노화용제.

(4) 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 특수 저분자화 DNA는 동식물에서 추출한 DNA의 가수분해처리물이고, 상기 대두 추출물은 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물인 것을 특징으로 하는 피부의 항노화 관련 유전자 발현 조절용제.

(5) 항노화 관련 유전자 발현 조절은 I형 콜라겐 합성효소 유전자, 히알루론산 합성효소 1 유전자 및 히알루론산 합성효소 2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자 발현 촉진, 또는 콜라겐 분해효소 유전자 및/또는 히알루론산 분해효소 유전자의 유전자 발현 감소인, (4)에 기재된 항노화 관련 유전자 발현 조절용제.

(6) 특수 저분자화 DNA의 함량이 0.001 내지 1질량%이며, 대두 추출물의 함량이 0.001 내지 1질량%인, (4) 또는 (5)에 기재된 항노화 관련 유전자 발현 조절용제.

(7) (1) 내지 (3) 중 어느 한 항의 항노화용제, 또는 (4) 내지 (6) 중 어느 한 항의 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 포함하여 이루어진 화장품.

본 발명에 따르면, 유효성분인 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물이, 진피 섬유아세포에 대해 상승적인 부활 작용을 갖기 때문에, 피부의 항노화, 즉 피부의 탱탱함이나 탄력의 저하, 주름이나 처짐과 같은 피부 노화의 예방 또는 개선 등의 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 실시예에서 사용한 가수분해 DNA-Na의 겔 침투 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography : GPC)에 의한 분석결과를 나타낸 도면이다. 도면의 가로축은 유지시간(분), 세로축은 자외영역(파장 260nm)의 흡광도이다.

이하에 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하는데, 이하의 설명은 본 발명의 구현예의 일 예이며, 본 발명은 이하의 기재내용에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 있어 "내지"라는 표현을 사용하는 경우, 그 전후의 수치 또는 물성치를 포함하는 표현으로서 사용하는 것으로 한다. 또한, 유효성분의 함량(%)은 특별히 명시하지 않는 한 질량 퍼센트(wt%)이다.

본 발명의 피부 항노화용제는, 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효성분으로 포함하며, 특수 저분자화 DNA가, 동식물에서 추출한 DNA를 가수분해처리함으로써 조제할 수 있는 성분이고, 대두 추출물이 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물인 것을 특징으로 갖는 것이다.

여기에서, 피부의 항노화란, 진피 섬유아세포의 기능 부활을 의미하며, 상기 기능 부활이란, 진피 섬유아세포의 증식촉진작용, I형 콜라겐 산생촉진작용 및 히알루론산 산생촉진작용으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 작용인 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 피부 항노화 관련 유전자 발현 조절용제는 상기 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효성분으로 포함하며, 특수 저분자화 DNA가, 동식물에서 추출한 DNA를 가수분해처리함으로써 조제할 수 있는 성분이고, 대두 추출물이 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물인 것을 특징으로 갖는 것이다.

여기서, 본 발명에 있어서, 피부의 항노화 관련 유전자란, 하기에 나타내는, 진피 섬유아세포의 콜라겐이나 히알루론산의 합성 또는 분해에 관여하는 어느 하나의 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다.

·I형 콜라겐 합성효소 유전자(Human Collagen Type1 Alpha 1; COL1A1)

·콜라겐 분해효소 유전자(Human Matrix Metallopeptidase 1; MMP1)

·히알루론산 합성효소 1 유전자(Human Hyaluronan Synthase 1; HAS1)

·히알루론산 합성효소 2 유전자(Human Hyaluronan Synthase 2; HAS2)

·히알루론산 분해효소 유전자(Human Hyaluronidase 1; HYAL1)

또한, 유전자 발현 조절이란, 상기한 합성효소 유전자의 발현 촉진(발현양의 증가) 및/또는 분해효소 유전자의 발현 감소(발현양의 감소)를 의미한다. 이들 피부의 항노화 관련 유전자 발현 조절로서는, 바람직하게는 I형 콜라겐 합성효소 유전자(COL1A1), 히알루론산 합성효소 1 유전자(HAS1) 및 히알루론산 합성효소 2 유전자(HAS2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자 발현 촉진, 또는 콜라겐 분해효소 유전자(MMP1) 및/또는 히알루론산 분해효소 유전자(HYAL1)의 유전자 발현 감소인 것을 의미한다.

또한, 상기한 진피 섬유아세포의 기능 부활이란, 진피 섬유아세포에서의 상기 유전자 발현 촉진 또는 상기 유전자 발현 감소일 수 있다.

본 발명의 피부 항노화용제 또는 피부 항노화 관련 유전자 발현 조절용제는 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효성분으로 포함하고, 필요에 따라, 기타 임의 성분을 더 포함하고 있을 수 있다.

본 발명의 특수 저분자화 DNA는 동식물에서 추출한 DNA를 가수분해처리함으로써 조제할 수 있는 성분이다. DNA의 공급원은 동물, 식물, 미생물 등의 다양한 생물일 수 있으며, 또한, DNA로서는 합성 DNA를 사용할 수 있다. 이들 중에서 특히, DNA를 많이 포함하는 것이나 수산가공상의 폐기물을 유효하게 이용할 수 있다는 관점에서, 연어, 송어, 대구 등 어류의 정소(이리) 유래의 DNA를 사용하는 것이 바람직하다.

어류의 정소로부터의 DNA의 추출 및 정제는 통상적인 방법에 따라(예를 들면 일본 특허공개공보 2005-245394호의 기재에 준하여) 수행할 수 있다. 예를 들어, 어류의 정소를 조쇄(粗碎)하고, 조쇄한 어류의 정소에 DNA가 분해되지 않는 조건 하에서 단백질 분해효소(프로테아제) 처리를 실시하며, 효소처리한 용액에 알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올 등)을 첨가하여, DNA를 DNA염(DNA 나트륨염)으로 하여 침전시키고, 이 침전물을 회수한다. 또는 효소처리한 용액에 산(염산, 인산, 구연산 등)을 첨가하여, DNA를 침전시키고, 이 침전물을 회수하며, 수산화 나트륨으로 중화하여 건조시킴으로써 DNA염(DNA 나트륨염)을 얻을 수 있다.

얻어진 DNA염을 뉴클레아제 등의 핵산분해효소를 사용하여 가수분해함으로써, 특수 저분자화 DNA를 얻을 수 있다. 가수분해처리에 사용하는 뉴클레아제로서는 예를 들어, 푸른곰팡이 유래의 뉴클레아제를 사용할 수 있다.

가수분해는, 예를 들어 65℃ 전후로 조정한 온수에, 상기 DNA염(DNA 나트륨염)을 원료로서 투입하고, 교반 후, 다시 70℃로 가온하고, 뉴클레아제를 첨가하여 반응시킴으로써 수행할 수 있다. 가수분해처리시의 온도로는 60 내지 75℃가 바람직하고, 70℃가 보다 바람직하다.

얻어진 가수분해생성물을, 예를 들면 동결 건조시킴으로써, 분말형태의 특수 저분자화 DNA를 얻을 수 있다. 상기의 수법에 의한 특수 저분자화 DNA는 통상적으로 나트륨염의 상태로 얻을 수 있다. 또한, 염은 나트륨염에 한정되는 것이 아니며, 예를 들어 칼륨염 또는 칼슘염일 수 있다. 또한, 특수 저분자화 DNA는 염이 아니라, 유리체일 수 있다.

특수 저분자화 DNA는 분자량이 12,000 이하인 분획물을 10 내지 80% 함유하는 것이 바람직하고, 분자량이 5,000 이하인 분획물을 10 내지 80% 함유하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 분자량 분포의 측정은 GPC에서 시료를 분자량에 기초하여 분별한 후에 UV 검출기에 의해 정량함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 대두 추출물은 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물이다. 추출 조건은 특별히 한정되지 않지만, 폴리아민을 포함하는 식물 추출물을 얻는 방법, 예를 들면 특허문헌 3에 기재되어 있는 바와 같이, 대두의 종자, 배아(배) 또는 싹을 적당한 매체 중에서 분쇄하여 산성 조건하에서 추출하는 방법이 바람직하다. 또한, 원료로서 사용하는 배아는 종자로부터 분리한 것을 모으면 되며, 대두의 싹은 대두 종자를 적당한 조건에서 발아시킨 싹 부분을 모으면 된다.

여기서, 대두 추출물에는 폴리아민이 많이 포함된다. 폴리아민은 1차 아미노기를 2개 이상 가지는 직쇄 지방족 탄화수소의 총칭으로, 모든 생체 중에 존재하며, 세포 분열이나 단백질 합성에 관여하고 있는 성장인자로서 알려져 있다.

대두 추출물 중의 폴리아민 함량은 특별히 제한되지 않지만, 0.05% 이상이 바람직하고, 0.1% 이상이 보다 바람직하며, 0.15% 이상이 더욱 바람직하고, 0.2% 이상이 특히 바람직하다. 또한, 폴리아민 함량은 고속 액체 크로마토그래프법으로 측정할 수 있다.

대두 추출물, 그 중에서도 대두 싹 부분의 추출물(이하, "대두 싹 엑기스"라고 하는 경우가 있다.)에는 폴리아민(푸토레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스페르미딘(spermidine), 페르민 등)이 많이 포함된다(특허문헌 3). 폴리아민을 많이 포함하는 대두 싹 엑기스를 사용함으로써, 폴리아민이 발휘하는 효과를 기대할 수 있다.

대두 추출물로서는 시판품을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 도요보사제의 대두 싹 엑기스(파이트폴리아민(등록상표)-S(품번 : SPA-301), 파이트폴리아민-SP(품번 : SPA-308)), 콤비주식회사제의 대두 추출물 소재(소이폴리아(등록상표)) 등을 들 수 있다.

항노화용제 중의 유효성분의 함량은 제제의 종류나 형태, 사용 목적, 사용 빈도 등에 따라 다르며, 일률적으로 규정하는 것은 곤란하지만, 각 성분의 함량이나 함량비는 진피 섬유아세포의 부활 작용에 대해 상승 효과를 발휘하는 함량이나 함량비인 것이 바람직하다.

예를 들어 항노화용제를 피부에 적용할(항노화용제가 화장품이다) 경우는 다음과 같다. 특수 저분자화 DNA의 함량은 0.01 내지 10mg/mL(약 0.001 내지 1%)가 바람직하고, 0.01 내지 5mg/mL(약 0.001 내지 0.5%)가 보다 바람직하며, 0.01 내지 2mg/mL(약 0.001 내지 0.2%)가 더욱 바람직하다. 또한, 대두 추출물의 함량은 0.01 내지 10mg/mL(0.001 내지 1%)가 바람직하고, 0.1 내지 5mg/mL(0.01 내지 0.5%)가 보다 바람직하며, 0.1 내지 2mg/mL(0.01 내지 0.2%)가 더욱 바람직하다.

또한, 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물의 함량비에 특별한 제한은 없지만, 질량비로, 특수 저분자화 DNA : 대두 추출물 = 1 : 50 내지 50 : 1이 바람직하고, 1 : 20 내지 10 : 1이 보다 바람직하며, 1 : 10 내지 5 : 1이 더욱 바람직하다.

또한, 항노화용제 중의 폴리아민 농도는 제제의 종류나 제품 형태, 사용 목적, 사용 빈도 등에 따라 결정되며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상적으로는 0.00001 내지 100mM, 바람직하게는 0.00005 내지 75mM, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 50mM가 적당하다.

특수 저분자화 DNA나 대두 추출물의 함량 및 함량비가 바람직한 범위 내이면, 후술하는 실시예에서 구체적으로 나타난 바와 같이, 진피 섬유아세포의 부활 작용(세포 증식, 콜라겐 산생촉진, 히알루론산 산생촉진, 히알루론산 합성효소 유전자 발현 촉진, 히알루론산 분해효소 유전자 발현 감소)에 대해 상승 효과 또는 유의한 효과를 발휘하는 점에서 유리하다.

여기서, 진피 섬유아세포의 부활 작용에서의 상승 효과란, 진피 섬유아세포에 대해 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 병용했을 때, 세포 증식율, 콜라겐 산생율, 히알루론산 산생율 중 어느 하나가, 각각을 단독으로 사용했을 때의 정도를 합한 것보다도 큰(유의적으로 큰) 것, 또는, 진피 섬유아세포에 대해 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 병용했을 때 콜라겐 또는 히알루론산 합성효소 유전자의 발현양, 바람직하게는 히알루론산 합성효소 유전자의 발현양, 콜라겐 또는 히알루론산 분해효소 유전자의 발현 감소량, 바람직하게는 히알루론산 분해효소 발현 감소량 중 어느 하나가, 각각을 단독으로 사용했을 때의 정도를 합한 것보다도 큰(유의적으로 큰) 것을 의미한다. 또한, 유의한 효과란, 음성 대조와 비교했을 때에 유의한 차이가 있는 효과를 의미한다.

본 발명의 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제는 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물, 필요에 따라 기타 성분을 통상적인 방법에 의해 혼합함으로써, 원하는 제형으로 제조할 수 있다. 여기에서, 기타 성분으로는, 후술하는 본 발명의 화장품이 함유할 수 있는 임의 성분과 유사한 성분을 들 수 있다.

본 발명의 화장품은 피부의 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 포함하여 이루어진 것이다. 여기에서 "포함하여 이루어진"이란, 원하는 제품 형태에 따른 생리학적으로 허용될 수 있는 담체나 병용가능한 다른 보조성분 등의 임의 성분을 포함하고 있을 수 있음을 의미한다.

본 발명의 화장품은, 예를 들어 기초 화장품이나 두피 및 모발에 도포하여 사용하기 위한 두발용 화장품 등으로서 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어 화장품이란, 약사법의 화장품뿐만 아니라, 의약 부외품도 포함된다.

본 발명의 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제를 화장품으로서 제공하는 경우, 취할 수 있는 제형은 피부에 적용가능한 것이면 특별히 제한은 없다. 구체적으로는, 액상, 유제형태, 겔 형태, 크림 형태, 연고 형태, 폼 형태, 미스트 형태, 에어로졸 형태 등의 제형으로, 로션, 유액, 크림, 젤, 젤리, 에센스, 립 크림, 팩, 마스크 등의 형태로 제공할 수 있다.

이들 화장품이 함유할 수 있는 기타 임의 성분으로는 특별히 제한은 없고, 통상적인 화장품에 배합될 수 있는 첨가제 등을 사용할 수 있다. 이러한 첨가제로서는, 예를 들면, 물, 유지류, 왁스류, 탄화수소류, 지방산류, 알코올류, 에스테르류, 계면활성제, 향료, 수렴제, 살균/항균제, 미백제, 자외선 흡수제, 보습제, 세포부활제, 소염/항알레르기제, 산화방지제, 비타민제, 천연추출물 등을 들 수 있다. 이들 기타 임의 성분의 함량에도 특별히 제한은 없고, 원하는 제형 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 항노화용제 또는 항노화 관련 유전자 발현 조절용제는 섭취하여 사용하기 위한 음식품으로서 제공할 수 있다. 음식품에는 건강식품(예를 들어, 기능성 식품, 영양보조식품, 건강보조식품, 영양강화식품, 영양조정식품, 서플리먼트 등), 건강기능식품(예를 들어, 특정 보건용 식품, 영양기능식품, 기능성 표시 식품 등), 특별용도식품(예를 들어, 환자용 식품, 영유아용 조정 분유, 임산부 또는 수유부용 분유 등) 외에, 진피 섬유아세포의 기능저하에 기인하는 질환 또는 상태(증상)의 리스크 저감, 예방 또는 개선의 표시를 붙인 음식품과 같은 분류의 것도 포함된다.

이들 음식품이 함유할 수 있는 기타 임의 성분으로는 특별히 제한이 없고, 통상적인 음식품에 배합될 수 있는 첨가제 등을 사용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 세포증식작용, 콜라겐/히알루론산 산생촉진작용

1. 시험의 목적 및 개요

피부 내의 콜라겐이나 히알루론산은 피부의 탱탱함, 피부의 유연성이나 보습에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 그래서, 진피 섬유아세포의 증식 작용이나 콜라겐/히알루론산 산생촉진작용에 의해 피시험 물질(특수 저분자화 DNA와 대두 추출물)의 상승 효과를 평가하였다.

2. 재료와 시험방법

2-1. 세포

인간 신생아 유래의 진피 섬유아세포주 NB1RGB 세포(RIKEN BRC, Japan)를 사용하고, CO₂ 배양기(CO₂ 농도 5%, 37℃) 내에서 배양하였다.

2-2. 배지

0.1%(v/v) Fetal Bovine Serum(FBS, Hyclone, UK) 및 1.0%(v/v) 항진균제(Invitrogen, USA)를 포함하는 Eagle's Minimal Essential Medium(EMEM, Wako, Japan)을 사용하였다.

2-3. 피시험 물질

(1) 특수 저분자화 DNA

닛세이바이오(주)제의 가수분해 DNA-Na(분말)을 사용하였다. 본 제품은 상기한 방법으로 연어과 어류의 정소(이리)에서 DNA의 Na염을 추출하여, 이를 가수분해함으로써 조제한 것이다.

또한, 사용한 닛세이바이오(주)제의 가수분해 DNA-Na의 젤 파미에이션 크로마토그래피(GPC)에 의한 분석결과를 도 1에, 유지시간과 분자량의 관계는 표 1에 나타낸다. 분자량 기준 12,000은 Cytochromec(MW 12,400)의 유지시간을 기준으로 하였다.

상기 분석결과에 따라, 닛세이바이오(주)제의 가수분해 DNA-Na의 분자량에 따른 분획물은 다음과 같다.

분자량 12,000 내지 5,000의 분획물(용출시간 20분 내지 25분 미만) : 32.0%

분자량 5,000 이하의 분획물(용출시간 25분 이후) : 32.4%

이상으로부터, 닛세이바이오(주)제의 가수분해 DNA-Na의 분자량 12,000 이하인 분획물은 64.4%이다.

30μM L-아스코르브산(CAS No.50-81-7, Wako, Japan) 및 0.1% FBS 함유 EMEM에 의해, 3.0mg/mL로 조정한 피시험 물질(가수분해 DNA-Na)을, 공비 10으로 연속희석하여 총 2농도(0.03mg/mL, 0.3mg/mL)로 용시조제하였다(최종 농도는 0.01mg/mL, 0.1mg/mL).

(2) 대두 추출물

도요보사제의 파이트폴리아민(등록상표)-SP(품번 : SPA-308, 배합 비율 : 대두 싹 엑기스 약 70%, 구연산 Na 약 30%)를 사용하였다.

30μM L-아스코르브산(CAS No.50-81-7, Wako, Japan) 및 0.1% FBS 함유 EMEM에 의해, 0.39mg/mL, 0.81mg/mL 및 1.53mg/mL의 피시험 물질(SPA-308)을 용시조제하였다(최종 농도는 0.13mg/mL, 0.27mg/mL 및 0.51mg/mL).

(3) 혼합용액(병용)

상기한 2종의 피시험 물질을 사용하였다.

30μM L-아스코르브산(CAS No.50-81-7, Wako, Japan) 및 0.1% FBS 함유 EMEM에 의해, 0.81mg/mL로 조정한 SPA-308 함유 EMEM에 의해, 3.0mg/mL로 조정한 가수분해 DNA-Na를 공비 10으로 연속희석하여 총 2농도(0.03mg/mL, 0.3mg/mL)로 용시조제하였다[SPA-308의 최종 농도는 0.27mg/mL, 가수분해 DNA-Na의 최종 농도는 0.01mg/mL, 0.1mg/mL].

2-4. 시험 구성

세포증식, 콜라겐 산생 및 히알루론산 산생의 산출에는 하나의 처리군당 3웰의 평균값을 사용하였다. 또한, 1플레이트당 피시험 물질 투여군, 조작 대조군을 각각 1군씩 마련하여 시험을 실시하였다. 피시험 물질 조제를 포함하여, 시험과 관련된 조작은 특별히 기재가 없는 한 실온에서 실시하였다.

2-5. 시험 조작

(1) 세포 배양

96웰 플레이트(Lot.3595, Corning, USA)에 1웰당 2.0×10⁴cells/200μL의 NB1RGB 세포를 파종하고, CO₂ 배양기 내에서 24시간 배양하였다. 또한, 배양시의 건조를 막기 위해, 시험에 사용하지 않는 웰에 Phosphate buffer saline(PBS(-) Lot.198601, Nissui, Japan)을 200μL 첨가하였다.

24시간 후, 96웰 플레이트에 피시험 물질 및 음성 대조를 100μL 첨가하여 CO₂ 배양기 내에서 48시간 배양하였다. 음성 대조에는 30μM L-아스코르브산 및 0.1% FBS 함유 EMEM을 사용하였다.

48시간 후, 배양 상청을 새로운 96웰 플레이트에 분주/냉동보존(-20℃)하였다. 이 배양 상청 중의 콜라겐량 및 히알루론산량을 2-5. (3) 및 (4)에 나타낸 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)를 이용하여 측정하였으며, 피시험 물질의 콜라겐/히알루론산 산생촉진작용을 평가하였다. 또한, 배양 상청을 제거한 96웰 플레이트의 세포수를 2-5. (2)에 나타내는 방법에 의해 측정하여, 피시험 물질의 세포증식작용을 평가하였다.

(2) 세포증식작용

진피 섬유아세포의 증식에 미치는 피시험 물질의 효과를 다음과 같이 평가하였다.

배지를 제거한 96웰 플레이트의 각 웰을 37℃로 가온한 PBS(-) 300μL로 조용히 2회 세척하였다. 이어, 0.5mg/mL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ul)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, CAS No.298-93-1, Sigma-Aldrich, USA) 용액을 1웰당 100μL 첨가하여, CO₂ 배양기 내에서 2시간 배양하였다.

배양 종료후, MTT 용액을 제거하고, 200μL의 PBS(-)로 세척하였다. 생성된 불용성 포르마잔을 가용화하기 위해, 0.04N 염산(CAS No.7647-01-0, Kanto Chemical, Japan)을 포함하는 2-프로판올(CAS No.67-63-0, Kanto Chemical, Japan)을 200μL 첨가하고, 차광 하에서 1시간 정치(靜置)하였다.

96웰 플레이트를 270rpm으로 10초간 진탕하고, 웰 내의 색소를 균일하게 분산한 후, 마이크로 플레이트 리더(SPARK^TM 10M, TECAN, Switzerland)를 사용하여 570nm의 흡광도(OD₅₇₀)를 측정하였다.

음성 대조의 OD₅₇₀을 100%로 한 피시험 물질 투여군의 OD₅₇₀을 세포증식율(%)로 산출하였다. 음성 대조와 피시험 물질 투여군의 세포증식율(%)을 대응이 없는 2군의 검정(Student's t-test)으로 유의차 검정을 실시하였다. 검정은 모두 양측에서 유의 수준을 5% 미만으로 하였다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).

(3) 콜라겐 산생촉진작용

피부에 탱탱함과 탄력을 주는 것으로 여겨지고 있는 I형 콜라겐의 산생량에 대한 피시험 물질의 효과를 경합(competitive) ELISA로 다음과 같이 평가하였다.

배양 상청중의 콜라겐량의 측정에는 Human Collagen type I ELISA kit(Lot. EC1-E105, ACEL, Japan)를 사용하였다.

Dilution buffer에 의해 콜라겐 표준액을 공비 2로 연속희석하여 총 7농도로 조제하였다. 또한, Dilution buffer에 의해 배양 상청을 2배로 희석하였다.

126μL의 콜라겐 표준액 및 2배 희석한 배양 상청에 14μL의 비오틴 표지 콜라겐 항체 용액을 첨가하고 탭핑에 의해 혼합하였다.

200μL의 Wash buffer에 의해 콜라겐 고상화 마이크로타이터 플레이트를 3회 세척하고, 50μL의 비오틴 표지 콜라겐 항체를 함유한 표준액과 배양 상청을 첨가하여, 약 270rpm으로 1시간 진탕하였다.

1시간 후, 200μL의 Wash buffer로 3회 세척하고, 50μL의 퍼옥시다제 표지 아비딘 용액을 첨가하여, 약 270rpm으로 1시간 진탕하였다. 1시간 후, 200μL의 Wash buffer로 3회 세척하고, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine 기질 용액을 1웰당 50μL 첨가한 후, 15분간 정치하였다.

이어, Stop solution을 1웰당 50μL 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 270rpm으로 1분간 진탕하여 웰 내의 색소를 균일하게 한 후, 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 450nm의 흡광도(OD450)를 측정하였다.

콜라겐 표준액의 OD₄₅₀으로부터 검량선을 4-Parameter logistic model에 의해 회귀하였다. 회귀식으로부터 얻어진 값에 희석 배율을 곱하여 음성 대조 및 피시험 물질의 콜라겐 산생량(μg/mL)을 산출하였다.

음성 대조의 콜라겐 산생량을 100%로 하여, 피시험 물질의 콜라겐 산생율(%)을 산출하였다. 음성 대조와 피시험 물질 첨가의 콜라겐 산생율(%)을 대응이 없는 2군의 검정(Student's t-test)으로 유의차 검정을 실시하였다. 검정은 모두 양측에서 유의 수준을 5% 미만으로 하였다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).

(4) 히알루론산 산생촉진작용

콜라겐이나 엘라스틴 사이에서 수분을 떠안는 것으로 여겨지고 있는 히알루론산의 산생량에 대한 피시험 물질의 효과를 샌드위치 ELISA로 다음과 같이 평가하였다.

배양 상청중의 히알루론산량의 측정에는 Hyaluronan Quantikine ELISA kit(Lot.DHYAL0, R&D Systems, USA)를 사용하였다.

Dilution buffer에 의해 히알루론산 표준액을 공비 2로 연속희석하여 총 7농도로 조제하였다. 또한, Dilution buffer에 의해 배양 상청을 8배 희석하였다.

아그레칸 고상화 마이크로타이터 플레이트에 비오틴 표지 히알루론산 항체 용액을 1웰당 50μL 첨가하였다. 또한, 희석한 배양 상청을 50μL 첨가하여 약 270rpm으로 1시간 진탕하였다.

1시간 후, 400μL의 Wash buffer로 5회 세척하고, 100μL의 퍼옥시다제 표지 아비딘 용액을 첨가하여 약 270rpm으로 1시간 진탕하였다. 1시간 후, 400μL의 Wash buffer로 5회 세척하고, 1웰당 100μL의 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine 기질 용액을 첨가하여, 차광 하에서 30분간 정치하였다.

이어, Stop solution을 1웰당 100μL 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 270rpm으로 1분간 진탕하여 웰 내의 색소를 균일하게 한 후, 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 450nm의 흡광도(OD₄₅₀)를 측정하였다.

히알루론산 표준액의 OD₄₅₀으로부터 검량선을 4-Parameter logistic model에 의해 회귀하였다. 회귀식으로부터 얻어진 값에 희석 배율을 곱하여 음성 대조 및 피시험 물질의 히알루론산 산생량(ng/mL)을 산출하였다.

음성 대조의 히알루론산 산생량을 100%로 하여 피시험 물질의 히알루론산 산생율(%)을 산출하였다. 음성 대조와 피시험 물질 첨가의 히알루론산 산생율(%)을 대응이 없는 2군의 검정(Student's t-test)으로 유의차 검정을 실시하였다. 검정은 모두 양측에서 유의 수준을 5% 미만으로 하였다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).

3. 시험 결과

3-1. 특수 저분자화 DNA

(1) 세포증식작용

음성 대조의 세포증식량(OD₅₇₀)을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na) 0.01mg/mL 및 0.1mg/mL의 세포증식률±표준편차는 각각 101.3±6.8% 및 102.6±3.3%이었다.

(2) I형 콜라겐 산생촉진작용

음성 대조의 콜라겐 산생량을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na) 0.01mg/mL 및 0.1mg/mL의 콜라겐 산생율±표준편차는 각각 126.4±7.9%(p<0.01) 및 134.0±3.6%(p<0.01)이었다.

(3) 히알루론산 산생촉진작용

음성 대조의 히알루론산 산생량을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na) 0.01mg/mL 및 0.1mg/mL의 히알루론산 산생율±표준편차는 각각 102.2±5.0% 및 102.9±7.5%이었다.

3-2. 대두 추출물

(1) 세포증식작용

음성 대조의 세포증식량(OD₅₇₀)을 100%로 했을 때의 피시험 물질(SPA-308) 0.13mg/mL, 0.27mg/mL 및 0.51mg/mL의 세포증식률±표준편차는 각각 111.6±1.0%(p <0.01), 123.7±2.4%(p<0.01) 및 137.0±6.9%(p<0.01)이었다.

(2) I형 콜라겐 산생촉진작용

음성 대조의 콜라겐 산생촉진작용을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질(SPA-308) 0.13mg/mL, 0.27mg/mL 및 0.51mg/mL의 콜라겐 산생촉진율±표준편차는 각각 135.1±1.3%(p<0.01), 174.1±6.3%(p<0.01) 및 199.9±11.8%(p<0.01)이었다.

(3) 히알루론산 산생촉진작용

음성 대조의 히알루론산 산생량을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질 (SPA-308) 0.13mg/mL, 0.27mg/mL 및 0.51mg/mL의 히알루론산 산생율±표준편차는 각각 113.1±4.7%(p<0.01), 123.3±3.8%(p<0.01) 및 137.8±10.3%(p<0.01)이었다.

3-3. 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물의 병용

(1) 세포증식작용

음성 대조의 세포증식량(OD₅₇₀)을 100%로 하여 산출한 피시험 물질(가수분해 DNA-Na+SPA-308) 0.01mg/mL+0.27mg/mL 및 0.1mg/mL+0.27mg/mL의 세포증식률±표준편차는 각각 133.0±4.8%(p<0.01) 및 140.8±5.7%(p<0.01)이었다.

(2) I형 콜라겐 산생촉진작용

음성 대조의 콜라겐 산생량을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na+SPA-308) 0.01mg/mL+0.27mg/mL 및 0.1mg/mL+0.27mg/mL의 콜라겐 산생율±표준편차는 각각 178.1±5.5%(p<0.01) 및 230.6±9.9%(p<0.01)이었다.

(3) 히알루론산 산생촉진작용

음성 대조의 히알루론산 산생량을 100%로 하여 산출했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na+SPA-308) 0.01mg/mL+0.27mg/mL 및 0.1mg/mL+0.27mg/mL의 히알루론산 산생율±표준편차는 각각 132.7±7.6%(p<0.01) 및 139.8±2.9%(p<0.01)이었다.

상기의 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2 중, 'DNA-Na'는 '가수분해 DNA-Na'이다. 표 2로부터, 특수 저분자화 DNA(가수분해 DNA-Na)와 대두 추출물(SPA-308)을 병용한 경우의 세포 증식율, 콜라겐 산생율, 히알루론산 산생율은 각각을 단독으로 사용한 경우의 정도(율)를 합한 경우보다 현저하게 큰 것을 알 수 있다. 이에, 진피 섬유아세포의 기능 부활 작용(세포증식작용, 콜라겐 산생촉진작용 및 히알루론산 산생촉진작용)에 대한 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물의 상승 효과를 확인할 수 있다.

[실시예 2] 히알루론산 합성 또는 분해효소 유전자 발현 조절

1. 시험의 목적 및 개요

피부 내의 콜라겐이나 히알루론산은 피부의 탱탱함, 유연성이나 보습에 중요한 역할을 하고 있으며, 특히 진피 내의 히알루론산량의 감소가 피부의 탄력 저하나 주름 형성에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 그래서, 본 실시예에서는 진피 섬유아세포에 의한 히알루론산의 합성이나 분해 등, 항노화에 관련된 유전자의 발현에 대한 피시험 물질(특수 저분자화 DNA와 대두 추출물)의 효과를 실시간 PCR법에 의해 평가하였다.

2. 재료와 시험방법

2-1. 세포

실시예 1의 2-1과 동일한 세포를 동일한 조건에서 배양하여 사용하였다.

2-2. 배지

FBS(Fetal Bovine Serum)의 함량을 10.0%(v/v)로 바꾼 것을 제외하고는 실시예 1의 2-2와 동일한 조성의 배지(EMEM)를 사용하였다.

2-3. 피시험 물질

(1) 특수 저분자화 DNA용액

실시예 1의 2-3. (1)과 동일한 특수 저분자화 DNA(가수분해 DNA-Na)를 사용하였다.

10% FBS 함유 EMEM에 의해, 1mg/mL로 조정한 피시험 물질(가수분해 DNA-Na)을 공비 10으로 연속희석하여 총 2농도로 용시조제하였다(최종농도는 0.01mg/mL, 0.1mg/mL).

(2) 대두 추출물 용액

실시예 1의 2-3. (2)와 동일한 대두 추출물(SPA-308)을 사용하였다.

10% FBS 함유 EMEM에 의해, 2.7mg/mL로 조정한 피시험 물질(SPA-308)을 공비 10으로 연속희석하여 총 2농도로 용시조제하였다(최종농도는 0.027mg/mL, 0.27mg/mL).

(3) 혼합용액(병용)

상기한 2종의 피시험 물질을 사용하였다.

10% FBS 함유 EMEM에 의해, 0.27mg/mL로 조정한 SPA-308 함유 EMEM에 의해, 1mg/mL로 조정한 가수분해 DNA-Na을 공비 10으로 연속희석하여 총 2농도로 용시조제하였다(SPA-308의 최종농도는 0.27mg/mL, 가수분해 DNA-Na의 최종농도는 0.01mg/mL, 0.1mg/mL).

2-4. 유전자 발현 분석

TaqMan Assay(Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 하기의 효소를 코딩하는 유전자에 대해 발현 분석을 실시하였다.

·히알루론산 합성효소 1(Human Hyaluronan Synthase 1(HAS1), Assay ID. Hs00758053_m1)

·히알루론산 합성효소 2(Human Hyaluronan Synthase 2(HAS2), Assay ID. Hs00193435_m1)

·히알루론산 분해효소(Human Hyaluronidase 1(HYAL1), Assay ID. Hs00201046_m1)

내부 표준 유전자로서, 글리세르알데하이드-3-인산 디하이드로게나제(Human Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase(GAPDH), Assay ID. Hs02786624_g1) 유전자를 사용하였다.

2-5. 시험 구성

유전자 발현양의 분석에는 1개의 처리군당 3개의 35mm 접시(Cat No. 150318, Thermo Scientific, USA)의 평균값을 사용하였다. 피시험 물질 조제를 포함하여, 테스트와 관련된 조작은 특별히 기재가 없는 한 실온에서 실시하였다.

2-6. 시험방법

(1) 세포 배양 및 피시험 물질 첨가

35mm 접시에 5.0×10⁵cells/2mL의 NB1RGB 세포를 파종하여 CO₂ 배양기 내에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 35mm 접시의 배지를 제거하여 피시험 물질 및 음성 대조 함유 배지를 추가하고, CO₂ 배양기 내에서 24시간 배양하였다.

(2) RNA 추출/정제 및 정량

PureLink^TM RNA Mini Kit(Cat No.12183018A, Invitrogen, USA)를 사용하여 RNA 추출/정제를 다음과 같이 실시하였다.

24시간 배양 후, 배지를 제거한 35mm 접시를 37℃로 가온한 PBS(-) 2mL로 2회 세척하였다. 여기에 600μL의 2M Dithiothreitol(CAS No.27565-41-9, Invitrogen, USA) 함유 Lysis Buffer를 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 라이세이트를 회수하였다.

또한, Homogenizer(Cat No.12183-026, Invitrogen, USA)를 사용하여, 회수한 라이세이트 중의 세포를 분쇄하였다.

세포 파쇄액에 600μL의 70% 에탄올(CAS No.64-17-5, Japan Alcohol, Japan) 용액을 첨가하고, 실리카 멤브레인 장착 컬럼에 옮긴 후, 12,000×g, 실온에서 15초간 원심분리하여, 여과액은 폐기하였다.

실리카 멤브레인에 700μL의 구아니딘 이소티오시아네이트 함유 Wash Buffer I 및 500μL의 에탄올 함유 Wash Buffer II를 첨가하여 세척한 후, 12,000×g, 실온에서 15초간 원심분리하고, 건조시켰다. 이에, RNase-Free Water를 30μL 첨가하여 실온에서 1분간 정치한 후, 12,000×g, 실온에서 15초간 원심분리하였다. 이를 2회 반복하여 멤브레인으로부터 RNA를 용출시켰다.

용출시킨 RNA의 일부를 UV 투과성 96웰 플레이트(Cat No.8404, Thermo Scientific, USA)로 분취하여 Tris-EDTA Buffer(TE(pH8.0), Cat No.310-90023, NIPPON GENE, Japan)에 의해 25배 희석한 후, 마이크로 플레이트 리더(SPARK^TM10M TECAN, Switzerland)를 사용하여 260nm의 흡광도(OD₂₆₀)를 측정하였다.

OD₂₆₀을 사용하여 음성 대조 및 피시험 물질의 RNA 농도를 하기 식에 의해 산출하고, TE Buffer에 의해 희석하여 RNA 농도를 10μg/mL로 조정하였다.

RNA 농도(μg/mL) = A×K×0.3(광로 길이 : cm)×25(희석배율)

A : 음성 대조 또는 피시험 물질의 OD₂₆₀

K : K=40, RNA의 흡광계수

(3) 실시간 PCR법에 의한 유전자 발현 분석

SuperScript^TM IV VILO^TM Master Mix with ezDNase(Cat No.11766050, Invitrogen, USA)를 사용하여 RNA의 역전사를 다음과 같이 실시하였다.

8연 튜브(AB1182, Thermo Scientific, USA)에 1웰당 1μL의 10×ezDNase Buffer, 1μL의 ezDNase enzyme, 6μL의 Nuclease-free Water 및 2μL의 10μg/mL RNA를 첨가하여, 37℃에서 2분 동안 배양하였다. 2분 후, 8연 튜브에 1웰당 4μL의 SuperScript^TM IV VILO^TM Master Mix 및 6μL의 Nuclease-free Water를 첨가하고, 실시간 PCR(QuantStudio^TM3, Applied Biosystems, USA)을 사용하여 25℃에서 10분간, 50℃에서 10분간, 85℃에서 5분간 가열하여 cDNA를 합성하였다.

PCR 플레이트(Cat No.N8010560, Thermo Scientific, USA)에 1웰당 10μL의 TaqMan^TM Fast Advanced Master Mix(Cat No.4444557, Applied Biosystems, USA), 1μL의 TaqMan Gene Expressior, 7μL의 UltraPure^TM Distilled Water(Invitrogen, Cat No.10977-015, USA) 및 2μL의 cDNA를 첨가하여, 플레이트 실링(Cat No.4360954, Thermo Scientific, USA)에 의해 밀봉하였다.

플레이트 원심기를 사용하여 용액을 스핀 다운하고, 기포를 제거한 후, 실시간 PCR 시스템을 이용하여 Real-Time qPCR을 실시하며, 음성 대조 및 피시험 물질에서의 각 유전자의 형광신호가 임의의 임계치에 도달할 때의 사이클수인 Threshold Cycle(Ct)값을 산출하였다. 내부 표준 유전자에 의해 Ct값을 보정하여, ΔCt값으로 하였다. 음성 대조의 ΔCt값의 평균에 의해 ΔCt값을 보정하고, 이를 ΔΔCt값으로 하였다. ΔΔCt법에 의해 1사이클당 검출의 차로 2배량의 차가 된다고 가정하고, 2^-ΔΔCt에 대입하여 음성 대조의 유전자 발현양을 1로 했을 경우의 피시험 물질의 유전자 발현양을 분석하였다. 음성 대조와 피시험 물질 첨가의 유전자 발현양을 대응이 있는 2군의 검정(paired t-test)으로 유의차 검정을 실시하였다. 검정은 모두 양쪽에서 유의 수준을 5% 미만으로 하였다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).

3. 시험 결과

3-1. 특수 저분자화 DNA

(1) 히알루론산 합성효소 1 유전자(HAS1) 발현

음성 대조의 HAS1 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na) 0.01mg/mL 및 0.1mg/mL의 HAS1 발현양±표준편차는 각각 1.11±0.04 및 1.02±0.07이었다.

(2) 히알루론산 합성효소 2 유전자(HAS2) 발현

음성 대조의 HAS2 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na) 0.01mg/mL 및 0.1mg/mL의 HAS2 발현양±표준편차는 각각 1.25±0.09(p<0.05) 및 1.49±0.05(p<0.001)이었다.

(3) 히알루론산 분해효소 유전자(HYAL1) 발현

음성 대조의 HYAL1 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na) 0.01mg/mL 및 0.1mg/mL의 HYAL1 발현양±표준편차는 각각 1.06±0.12 및 1.34±0.14이었다.

3-2. 대두 추출물

(1) 히알루론산 합성효소 1 유전자 (HAS1) 발현

음성 대조의 HAS1 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(SPA-308) 0.027mg/mL 및 0.27mg/mL의 HAS1 발현양±표준편차는 각각 1.03±1.2 및 0.99±0.16이었다.

(2) 히알루론산 합성효소 2 유전자 (HAS2) 발현

음성 대조의 HAS2 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(SPA-308) 0.027mg/mL 및 0.27mg/mL의 HAS2 발현양±표준편차는 각각 1.88±0.46(p<0.05) 및 1.50±0.11(p<0.01)이었다.

(3) 히알루론산 분해효소 유전자(HYAL1) 발현

음성 대조의 HYAL1 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(SPA-308) 0.027mg/mL 및 0.27mg/mL의 HYAL1 발현양±표준편차는 각각 0.97±0.08 및 0.84±0.06이었다.

3-3. 특수 저분자화 DNA와 대두 추출물의 병용

(1) 히알루론산 합성효소 1 유전자(HAS1) 발현

음성 대조의 HAS1 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na+SPA-308) 0.01mg/mL+0.27mg/mL 및 0.1mg/mL+0.27mg/mL의 HAS1 발현양±표준편차는 각각 0.99±0.08 및 1.51±0.26(p<0.05)이었다.

(2) 히알루론산 합성효소 2 유전자(HAS2) 발현

음성 대조의 (HAS2) 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na + SPA-308) 0.01mg/mL+0.27mg/mL 및 0.1mg/mL+0.27mg/mL의 (HAS2) 발현양±표준편차는 각각 1.41±0.10(p<0.01) 및 1.54±0.07(p<0.001)이었다.

(3) 히알루론산 분해효소 유전자 (HYAL1) 발현

음성 대조의 (HYAL1) 발현양을 1로 했을 때의 피시험 물질(가수분해 DNA-Na+SPA-308) 0.01mg/mL+0.27mg/mL 및 0.1mg/mL+0.27mg/mL의 (HYAL1) 발현양±표준편차는 각각 0.58±0.11(p<0.01) 및 0.93±0.05이었다.

상기한 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3 중, 'DNA-Na'는 '가수분해 DNA-Na'이다. 표 3으로부터, 특수 저분자화 DNA(가수분해 DNA-Na)와 대두 추출물(SPA-308)을 병용한 경우, 히알루론산 합성효소-1 유전자(HAS1)의 발현양이 상승적으로 증가하고, 히알루론산 합성효소-2 유전자(HAS2)의 발현양은 음성 대조에 비해 유의적으로 증가함을 알 수 있다. 또한, 히알루론산 분해효소 유전자(HYAL1) 발현양은 상승적으로 감소하고 있음을 알 수 있다. 이로부터, 특수 저분자화 DNA(가수분해 DNA-Na)와 대두 추출물(SPA-308)을 병용함으로써, 히알루론산 합성에 관련된 유전자 발현의 촉진과 분해에 관련된 유전자 발현의 감소가 동시에 일어나는 것을 확인할 수 있다.

이상의 결과로부터, 실시예 1에서 나타난 특수 저분자화 DNA(가수분해 DNA-Na)와 대두 추출물(SPA-308)을 병용한 경우의 콜라겐과 히알루론산의 상승적인 산생 증가는 콜라겐과 히알루론산의 합성에 관련된 유전자 발현의 촉진과 분해에 관련된 유전자 발현의 감소가 동시에 발생한 데에 따른 것으로 추정된다.

본 발명의 피부 항노화용제는 종래의 항노화제와는 다른 작용/기능을 가지고 있어, 종래의 항노화제보다 효율적으로 피부의 노화를 예방 및/또는 개선할 수 있기 때문에, 특히 화장품 분야에서 유용하다.

Claims

특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 진피 섬유아세포의 기능 부활제로서,
상기 특수 저분자화 DNA는 어류의 정소(이리)에서 추출한 DNA의 가수분해처리물이며, 또한 분자량이 12,000 이하인 분획물을 10 내지 80% 함유하고,
상기 대두 추출물은 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물이며,
상기 기능 부활은 진피 섬유아세포의 증식촉진작용, I형 콜라겐 산생촉진작용 및 히알루론산 산생촉진작용으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 작용인 것을 특징으로 하는 진피 섬유아세포의 기능 부활제.
제 1 항에 있어서,
특수 저분자화 DNA의 함량이 0.001 내지 1질량%이며, 대두 추출물의 함량이 0.001 내지 1질량%인, 진피 섬유아세포의 기능 부활제.
특수 저분자화 DNA와 대두 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 진피 섬유아세포의 유전자 발현 조절제로서,
상기 특수 저분자화 DNA는 어류의 정소(이리)에서 추출한 DNA의 가수분해처리물이며, 또한 분자량이 12,000 이하인 분획물을 10 내지 80% 함유하고,
상기 대두 추출물은 대두의 종자, 배아 및 싹으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 추출물이며,
상기 유전자 발현 조절은 진피 섬유아세포의 히알루론산 합성효소 1 유전자 및 히알루론산 합성효소 2 유전자 중 어느 한 쪽 또는 양쪽의 유전자 발현 촉진, 또는 히알루론산 분해효소 유전자의 유전자 발현 감소인 것을 특징으로 하는 진피 섬유아세포의 유전자 발현 조절제.
제 3 항에 있어서,
특수 저분자화 DNA의 함량이 0.001 내지 1질량%이며, 대두 추출물의 함량이 0.001 내지 1질량%인, 진피 섬유아세포의 유전자 발현 조절제.