KR20200045439A - 재조합 슈도모나스 푸티다 균주 및 이를 이용한 메발론산 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 슈도모나스 푸티다 균주 및 이를 이용한 메발론산 생산 방법에 관한 것으로 슈도모나스 푸티다 균주에 메발론산 생합성 회로를 구축하고, 외부 유전자 안정성 향상, 에탄올 이화작용 회로 조절, 지방산 생합성 회로 조절 등의 연구를 통해 메발론산 생산 수율이 현저히 향상된 재조합 슈도모나스 균주를 제조하였고, 상기 재조합 슈도모나스 균주를 이용하여 고농도로 메발론산을 생산할 수 있다. 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 유기용매 독성 저항력이 강하기 때문에 메발론산을 전구체로 하여 생산되는 테르페노이드에 대해 독성 저항력을 가지며 그에 따라 고농도 테르페노이드 생산을 위한 생촉매로도 이용될 수 있다.

Description

재조합 슈도모나스 푸티다 균주 및 이를 이용한 메발론산 생산 방법{Recombinant Pseudomonas putida strains and method for producing mevalonate using the same}
본 발명은 재조합 슈도모나스 푸티다 균주 및 이를 이용한 메발론산 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유기용매 독성 저항력이 강한 슈도모나스 푸티다 균주 내에 메발론산 생합성 경로를 구축하여 탄소원인 에탄올로부터 메발론산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
메발론산은 화장품, 바이오 플라스틱의 원료이자 매우 다양한 생화학 물질 군인 테르페노이드의 주요 전구체인 물질로써 미생물 전환 공정으로 생산할 경우 안정적으로 대량 생산이 가능하다는 이점이 있는 가치가 높은 물질이다. 메발론산은 생합성 전구체로 Acetyl-CoA를 사용하는데, 기존의 당을 탄소원으로 사용할 경우 해당과정 중간의 물질로부터 생산되는 부산물로 인해 고농도 생산이 힘든 상황이다. 또한 메발론산으로부터 생산되는 테르페노이드는 탄화수소로써 비극성을 띄므로 미생물에 대한 독성이 매우 강하여 미생물 공정 개발의 어려움을 겪고 있다.
본 발명자들은 고농도 생산이 어려운 메발론산를 고농도로 생산할 수 있는 생물공정을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 유기용매 독성 저항력이 강한 슈도모나스 푸티다 균주에 외래 유전자를 도입하여 메발론산 생합성 경로를 구축함으로써 탄소원인 에탄올로부터 메발론산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 재조합 슈도모나스 푸티다 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 메발론산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메발론산의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아세틸 조효소 아세틸전달효소(Acetyl coenzyme A Acetyltransferase)의 핵산서열, 서열번호 2로 표시되는 HMG CoA 합성효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthetase)의 핵산서열 및 서열번호 3으로 표시되는 HMG CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)의 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고, 엔도뉴클레아제 A(endonuclease A, endA) 유전자 및 엔도뉴클레아제 X(endonuclease A, endX) 유전자가 결손된 재조합 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주에 관한 것이다.
본 발명자들은 고농도 생산이 어려운 메발론산을 고농도로 생산할 수 있는 생물공정을 개발하고자 노력하였고 그 결과, 유기용매 독성 저항력이 강한 슈도모나스 푸티다 균주에 외래 유전자를 도입하여 메발론산 생합성 경로를 구축함으로써 탄소원인 에탄올로부터 메발론산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 규명하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 서열번호 1로 표시되는 아세틸 조효소 아세틸전달효소의 핵산서열, 서열번호 2로 표시되는 HMG CoA 합성효소의 핵산서열 및 서열번호 3으로 표시되는 HMG CoA 환원효소의 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 균주로서 상기 아세틸 조효소 아세틸전달효소, HMG CoA 합성효소 및 HMG CoA 환원효소 유전자의 도입에 의해 상부 메발론산 경로(Upper Mevalonate Pathway)를 구축할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 추가적으로 서열번호 4로 표시되는 아세틸 조효소 합성효소(Acetyl coenzyme A synthetase)의 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 상기 아세틸 조효소 합성효소 유전자 도입에 의해 1차적으로 아세트산을 Acetyl-CoA로 전환함으로써 균주 내 아세트산의 축적을 막을 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 엔도뉴클레아제 A(endonuclease A, endA) 유전자 및 엔도뉴클레아제 X(endonuclease A, endX) 유전자가 결손된 균주일 수 있다. 상기 유전자의 결손에 의해 재조합 벡터를 통해 도입된 외부 유전자의 안정성을 향상시킬 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제 A 유전자는 서열번호 5의 핵산 서열로 표시될 수 있고, 엔도뉴클레아제 X 유전자는 서열번호 6의 핵산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 I(Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase I) 유전자 및 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 II(Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase II) 유전자가 추가로 결손된 균주일 수 있다. 상기 유전자의 결손에 의해 에탄올의 세포질(periplasmic) 산화를 방지할 수 있다. 상기 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 I 유전자는 서열번호 7의 핵산 서열로 표시될 수 있고, 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 II 유전자는 서열번호 8의 핵산 서열로 표시될 수 있다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pUC19, pUCP19, pTrc99A, pCM184, pAWP89, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 일 예에서, 재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli DH10B, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 식물세포 및 동물세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아세틸 조효소 아세틸전달효소의 핵산서열, 서열번호 2로 표시되는 HMG CoA 합성효소의 핵산서열 및 서열번호 3으로 표시되는 HMG CoA 환원효소의 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고, 엔도뉴클레아제 A 유전자 및 엔도뉴클레아제 X 유전자가 결손된 재조합 슈도모나스 푸티다 균주를 포함하는 메발론산 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 메발론산 생산용 조성물은 상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주를 포함하는 것으로서 이들 간에 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 메발론산 생산능을 갖는 균주이므로 상기 균주는 메발론산을 생산하기 위한 조성물로 이용될 수 있다.
상기 메발론산 생산용 조성물은 상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주의 배양에 필요한 물질, 예를 들어, 배양 배지를 포함할 수 있다. 상기 배양 배지는 특별히 한정되지 않으며 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산 또는 비타민 등이 함유된 통상의 미생물 배양용 배지를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 메발론산의 생산 방법에 관한 것이다:
상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주를 배양하는 단계; 및
상기 배양 결과물로부터 메발론산을 수득하는 단계.
상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산 또는 비타민 등이 함유된 통상의 미생물 배양용 배지에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 아래 표 3에 기재된 조성의 배양 배지에서 상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주를 배양할 수 있다.
상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주의 배양은 통상의 미생물 배양 조건에서 실시할 수 있고, 예를 들어, 아래 표 4에 기재된 배양 조건 하에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 pH 6.5 내지 pH 7.0 범위에서 배양할 수 있고, 예를 들어, pH 6.75에서 배양할 수 있다.
본 발명은 재조합 슈도모나스 푸티다 균주 및 이를 이용한 메발론산 생산 방법에 관한 것으로 슈도모나스 푸티다 균주에 메발론산 생합성 회로를 구축하고, 외부 유전자 안정성 향상, 에탄올 이화작용 회로 조절, 지방산 생합성 회로 조절 등의 연구를 통해 메발론산 생산 수율이 현저히 향상된 재조합 슈도모나스 균주를 제조하였고, 상기 재조합 슈도모나스 균주를 이용하여 고농도로 메발론산을 생산할 수 있다. 본 발명의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주는 유기용매 독성 저항력이 강하기 때문에 메발론산을 전구체로 하여 생산되는 테르페노이드에 대해 독성 저항력을 가지며 그에 따라 고농도 테르페노이드 생산을 위한 생촉매로도 이용될 수 있다.
도 1은 P. putida 균주 내 에탄올 대사경로를 보여주는 모식도이다.
도 2a는 상부 메발론산 경로에 대한 모식도이다.
도 2b는 pSGP10 벡터 맵이다.
도 3은 pK19mobsacB 매개 Markerless 결손 방법에 대한 모식도이다.
도 4a 및 4b는 P. putida 내 에탄올 이화작용 경로 및 조절에 대한 모식도이다.
도 5는 에탄올 이화작용 조절 유전자 재조합에 대한 모식도이다.
도 6은 지방산 생합성 조절 경로 및 유전자 재조합에 대한 모식도이다.
도 7a는 재조합 균주 ELPP000의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 7b는 재조합 균주 ELPP010의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 8은 엔도뉴클레아제(endA, endX) 결손 여부에 따른 외부 유전자 삽입 벡터의 안정성 증대 효과를 dTomato 형광 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 재조합 균주 ELPP110의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 10a는 재조합 균주 ELPP111의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 10b는 재조합 균주 ELPP211의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 10c는 재조합 균주 ELPP212의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 10d는 재조합 균주 ELPP213의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 11a는 재조합 균주 ELPP221의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 11b는 재조합 균주 ELPP311의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 12는 Nile-red 염색을 통해 재조합 균주 내 지방산을 분석한 그래프이다.
도 13a는 pH 7.0 조건에서 배양한 재조합 균주 ELPP211의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 13b는 pH 6.75 조건에서 배양한 재조합 균주 ELPP211의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
도 13c는 pH 6.5 조건에서 배양한 재조합 균주 ELPP211의 대사 프로파일에 대한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 메발론산 생산 회로를 갖는 균주의 제조
미생물 내에서 에탄올은 아세트알데히드-아세트산을 거치는 산화반응을 통해 Acetyl-CoA로 전환되고 세포 내 주요 중간물질인 Acetyl-CoA는 TCA Cycle 및 지방산 생합성 회로로 유입되어 에너지-세포구성물질 합성 등 다양한 생합성 경로로 유입된다. 따라서, 고효율의 메발론산 생산 촉매 개발을 위해, 미생물 내 Acetyl-CoA를 메발론산 경로로 유입시키는 것이 중요하다.
P. putida 균주 내 메발론산 경로의 중간체인 메발론산까지의 상부 메발론산 경로를 구현함으로써, 미생물 내 Acetyl-CoA 중간체를 얼마나 메발론산 경로로 유입시킬 수 있는지 확인하는 연구를 진행하였다.
상부 메발론산 경로를 구축하고 에탄올로부터 메발론산의 생산 여부를 확인하기 위해 3가지 단계의 유전자 발현을 진행하였다. Acetyl-CoA 두 분자를 Acetoacetyl-CoA로 전환하는 Acetyl-CoA Acetyltransferase 유전자(atoB from Escherichia coli MG1655), Acetoacetyl-CoA 와 Acetyl-CoA를 중합하여 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA(HMG-CoA)를 합성하는 HMG-CoA Synthase 유전자(mvaS from Enterococcus faecalis), HMG-CoA를 환원시켜 메발론산을 합성하는 HMG-CoA Reductase 유전자(mvaE from Enterococcus faecalis)를 Pseudomonas putida의 Codon usage에 따라 코돈 최적화하여 본 발명에서 개발한 pSGP10 E. coli-Pseudomonas Shuttle Expression Vector(Tetracycline Selection Marker, trc Promoter)에 Gibson Assembly를 이용하여 삽입한 후 P. putida에 형질전환하여 재조합 균주를 제작하였다.
Negative Control인 ELPP000의 경우 에탄올을 활용하여 성장 가능하지만 세포 성장이 일어나며 아세트산이 축적이 되어 결국 모든 탄소원을 소모하지 못하고 세포가 사멸하는 결과를 보이는 반면, 메발론산 생산 회로를 구축한 ELPP010 균주의 경우 아세트산이 축적되지 않고 모든 에탄올을 소모하여 약 1.7 g/L의 메발론산을 생산하였다. 하지만 수율이 매우 낮다는 문제가 있으며 이를 극복하기 위해 외부 도입 유전자 안정성 향상 실험을 진행하였다.
실시예 2. 외부 도입 유전자 안정성이 향상된 균주의 제조
P. putida 균주를 이용한 대사공학 연구의 문제점 중 하나는 외부 도입 유전자(플라스미드 벡터)의 안정성이 낮아 오랜 배양시간 동안의 유전자 발현의 유지력이 좋지 않다는 것이다. 이러한 플라스미드 벡터의 낮은 안정성은 P. putida 균주 자체가 외부 유전자를 분해 및 재조합 하는 방어 기작에 기인한다고 알려져 있으며, 본 연구에서는 P. putida의 외부 도입 유전자 안정성을 향상시킨 선행 연구 사례를 참조하여, 외부 유전자를 분해하는 역할을 하는 Endonuclease를 Coding하는 endA 및 endX 를 pK19mobsacB mediated Markerless Deletion 방법을 통해 결손 시켰다.
Endonuclease 유전자를 결손 시킴으로써, 실제로 외부 유전자가 삽입된 벡터의 안정성이 증대되었는지 확인하기 위해 Fluorescence Protein인 dTomato 유전자를 pSGP10 Vector에 삽입하여 Wild-Type과 Endonuclease 결손 균주에 형질전환 하였다.
Endonuclease(endA, endX) 결손으로 인한 외부 유전자 삽입 벡터의 안정성 증대 효과를 알아보기 위해, dTomato Protein을 발현시킨 후 발현 시간에 따른 Fluorescence Intensity의 증가 경향을 확인하였다. Fluorescence Intensity는 Fluorescence Microplate Leader로 측정하였으며 Excitation 파장 544 nm, Emission 파장 590 nm의 조건에서 분석하였다. endA, endX 결손 균주인 ELPP1dT0의 경우 24시간에서 48시간까지의 Fluorescence Intensity의 증가량이 더 컸으며 같은 실험 간의 표준편차의 감소도 확인되어 외부 유전자 삽입 벡터의 안정성 증대 효과를 확인하였다.
Endonuclease(endA, endX) 결손 균주에 메발론산 회로를 구축한 ELPP110을 배양한 결과, 메발론산 생산은 약 2.43 g/L로 증가하였지만 일부 플라스크에서 아세트산이 빠르게 축적되어 세포 대사능력을 잃어버리는 현상이 발생하였다. 이는 Endonuclease의 결손으로 인한 돌연변이 대처 능력 저하로 인한 세포의 생장 능력이 떨어진 상황에서 Ethanol의 Periplasmic Oxidation의 속도가 너무 빠른 것에 기인하는 것으로 생각되어 에탄올 이화작용 회로를 조절하였다.
실시예 3. 에탄올 이화작용 회로를 조절한 균주 제조
에탄올을 메발론산으로 전환하는 배양 중 특정 실험 세트에서 아세트산의 과도한 축적으로 인한 세포활성 저하 및 메발론산 생산 재현성이 감소되는 문제가 발생하였다. 이를 극복하기 위하여 우선적으로 P. putida의 이화작용 경로를 파악한 후 아세트산이 축적되지 않도록 이화작용 경로를 전반적으로 재설계 하였다.
아세트산의 축적을 막기 위해 1차적으로 아세트산을 Acetyl-CoA로 전환하는 Acetyl-CoA Synthetase(acs from Escherichia coli MG1655) 유전자를 Broad-Host Range Vector pAWP89-0에 삽입하여 형질전환 하였다.
또한, P. putida는 E. coli와 다르게 에탄올과 같은 알코올류를 Periplasm에서 빠르게 산화시키는 PQQ(Pyrroloquinoline quinone) Dependent Periplasmic Ethanol Dehydrogenase를 가지고 있어, 에탄올의 산화속도가 매우 빠른데 반해 아세트산을 Acetyl-CoA로 전화하는 속도는 그 속도에 미치지 못해 아세트산이 축적될 것이라 생각하였으며, 에탄올의 Periplasmic 산화를 방지하기 위해 Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase(qedH-I, qedH-II) 유전자를 pK19mobsacB를 이용한 Markerless Deletion을 통해 결손 하였다.
또한, 아세트산을 거치지 않고 Acetaldehyde를 Acetyl-CoA로 바로 전환할 수 있는 Putative Aldehyde Dehydrogenase(eutE from Escherichia coli MG1655)를 추가로 발현시킴으로써, Acetate의 축적을 추가로 방지하고 Acetate를 Acetyl-CoA로 전환하는데 필요한 ATP 소모를 줄이고자 하였다.
아세트산의 축적을 막기 위해 아세트산을 Acetyl-CoA로 전환할 수 있는 acs 유전자를 발현시킨 ELPP111 균주의 경우 메발론산 생산능력이 ELPP110 균주에 비해 소폭 증가하였지만 근본적인 아세트산의 축적 문제를 해결하지 못하였다.
에탄올의 Periplasmic Oxidation을 막기 위한 qedH 유전자 결손 균주에 메발론산 회로와 acs 유전자를 발현시킨 ELPP211 균주의 경우 안정적으로 높은 농도의 메발론산을 생산 할 수 있음을 확인하였고, 약 4.07 g/L의 메발론산을 생산하였다.
아세트산을 거치지 않고 아세트알데히드를 Acetyl-CoA로 직접 전환 가능한 eutE 유전자를 acs 없이 발현시킨 균주(ELPP212)의 경우 오히려 아세트산의 축적을 야기시키는 결과를 보였으며, 이는 세포 내 아세트알데히드 농도가 매우 낮기 때문에 Reversible Enzyme인 eutE 가 오히려 Acetyl-CoA를 아세트알데히드로 전환시킨 후 다시 아세트산으로 산화되는 과정을 유도했을 것으로 예상 할 수 있다. acs와 eutE를 같이 발현시킨 균주(ELPP213)의 경우 eutE 가 없는 ELPP211 균주와 크게 다르지 않은 결과를 보였고, 이를 통해 acs 유전자의 발현이 에탄올 대사에 중요한 요소임을 확일 할 수 있었다.
실시예 4. 지방산 생합성 경로를 조절한 균주 제조
메발론산의 생산 수율을 높이기 위해 Acetyl-CoA를 전구체로 사용하는 경쟁 회로 중 하나인 지방산 생합성 경로를 조절하여, Acetyl-CoA를 메발론산 생합성으로 더 많이 유입되도록 하였다. 지방산 생합성 경로 조절의 모식도는 다음 그림과 같다.
첫번째로, 지방산 생합성으로 유입되는 Malonyl-CoA를 Acetoacetyl-CoA로 전환하여 메발론산 회로로 유입시키는 역할을 할 수 있는 Acetoacetyl-CoA Synthase(nphT7 from Streptomyces sp. CL190)를 pSGP11 벡터(atoB, mvaS, mvaE 삽입 벡터)에 추가 삽입하여 발현시켰다.
또한, Pseudomonas putida는 자체적으로 탄소원을 지방산으로 합성한 후 중합하여 저장한다고 알려져 있다. 이러한 Polyhydroxyalkanoate(PHA) 생합성을 막고 탄소원의 불필요한 소모를 막기 위해 PHA 생합성의 주요 단계인 (R)-3-hydroxydecanoyl-ACP : CoA transacylase(phaG) 유전자를 결손시켰다.
지방산 생합성 경로로 유입되는 Malonyl-CoA와 Acetyl-CoA를 중합하여 Acetoacetyl-CoA를 합성하는 nphT7 유전자를 발현시킨 ELPP212 균주의 경우 매우 큰 생장 저해가 발생하였으며 이를 통해 Malonyl-CoA의 지방산 생합성으로의 흐름을 너무 과도하게 메발론산 합성으로 가져오는 역효과가 일어났음을 알 수 있으며, nphT7 유전자의 발현을 조금 더 세밀하게 조절할 수 있는 메커니즘이 필요함을 확인할 수 있었다.
PHA 생합성 회로의 주요 단계인 phaG 유전자를 결손시킨 ELPP311 균주의 경우 기존의 ELPP211 균주에 비해 메발론산 생산량이 증가하지 않았다. phaG 유전자를 결손시킴으로써 PHA 축적이 정말 저해됐는지, 그렇다면 왜 메발론산 생산량이 증가하지 않았는지 확인하기 위해 기존 논문에 알려진 방법을 참고하여 Nile-red 염색 후 세포 파괴 없이 Fluorescence Analysis를 통해 세포 내 지방산 성분의 정량적 차이를 확인하였다. Fluorescence Intensity는 Fluorescence Microplate Leader로 측정하였으며 Excitation 파장 530 nm, Emission 파장 590 nm의 조건에서 분석하였다.
Nile-red 염색을 통한 세포 내 지방산 성분 분석 결과 메발론산 회로가 없는 ELPP000 균주의 경우 배양시간이 지남에 따라 지방산 함량이 증가함을 확인할 수 있으나, 메발론산 회로가 도입된 ELPP211과 ELPP311 균주는 phaG 결손과 상관없이 세포 내 지방산 함량이 일정하게 유지되거나 감소하는 경향을 보였다. 따라서 메발론산 회로를 구축함으로써 자연스럽게 세포 내 지방산(PHA) 축적을 저해시킬 수 있고 이러한 이유로 ELPP311 균주의 메발론산 생산량이 증가하지 않은 이유를 확인할 수 있었다.
상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 재조합 균주에 대한 정보는 표 1과 같다.
Strain, plasmid Genotype or properties 메발론산 생산량
Strains
P. putida KT2440 Wild-Type -
E. coli DH10B F-endA1recA1 galE15 galK16 nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ-T1R -
ELPP000(- con) P. putida KT2440 harboring pSGP10, pAWP89-0 -
ELPP010 P. putida KT2440 harboring pSGP11, pAWP89-0 1.7 g/L
ELPP0dT0 P. putida KT2440 harboring pSGP1dT, pAWP89-0 -
ELPP1dT0 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX harboring pSGP1dT, pAWP89-0 -
ELPP110 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX harboring pSGP11, pAWP89-0 2.43 g/L
ELPP111 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX harboring pSGP11, pAWP89-1 2.88 g/L
ELPP211 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX ΔqedH-I ΔqedH-II harboring pSGP11, pAWP89-1 4.07 g/L
ELPP212 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX ΔqedH-I ΔqedH-II harboring pSGP11, pAWP89-2 0.68 g/L
ELPP213 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX ΔqedH-I ΔqedH-II harboring pSGP11, pAWP89-3 3.94 g/L
ELPP221 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX ΔqedH-I ΔqedH-II harboring pSGP12, pAWP89-1 0.78 g/L
ELPP311 P. putida KT2440 ΔendA ΔendX ΔqedH-I ΔqedH-II ΔphaG harboring pSGP11, pAWP89-1 3.88 g/L
상기 표 1의 재조합 균주 제조에 이용된 플라스미드에 관한 정보는 표 2와 같다.
Plasmids
pUCP19 E. coli-Pseudomonas Shuttle Expression Vector, P lac , Amp R
pUC19 E. coli Expression Vector, lacI, P lac , Amp R
pTrc99A E. coli Expression Vector, lacI, P trc , Amp R
pCM184 Allelic Exchange Vector, Amp R , Tet R , loxP-Kan R -loxP
pAWP89 Broad Host Range Expression Vector, P tac -dTomato, Kan R
pK19mobsacB Allelic Exchange Vector, sacB, Kan R
pK19mobsacB (::lacI) pK19mobsacB -lacI (derived from pTrc99A)
pSGP10 E. coli-Pseudomonas Shuttle Expression Vector (pUCP19 derived), lacI + P trc derived from pTrc99A, Tet R derived from pCM184
pSGP1dT pSGP10 -dTomato (derived from pAWP89)
pSGP11 pSGP10 -mvaE_opti -mvaS_opti -atoB_opti
pSGP12 pSGP10 -mvaE_opti -mvaS_opti -atoB_opti -nphT7_opti
pAWP89-0 Broad Host Range Expression Vector (pAWP89 derived), P lac drived from pUC19, MCS from MEV Vector
pAWP89-1 pAWP89-0 -acs_opti
pAWP89-2 pAWP89-0 -eutE_opti
pAWP89-3 pAWP89-0 -acs_opti -eutE_opti
상기 표 2의 플라스미드 제조에 이용된 프라이머에 관한 정보는 표 3과 같다.
Primer Sequence 서열번호
F-lacI (pK19mobsacB) TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGACACCATCGAATGGTGC 11
R-lacI (pK19mobsacB) AAAACGACGGCCAGTGAATTCTCACTGCCCGCTTTCC 12
F-endA-upstream CTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTGCTGCTCTTGAAATGAACC 13
R-endA-upstream TTTGAAACGGGGGGAAAACATATTTCAGGTTG 14
F-endA-downstream TGTTTTCCCCCCGTTTCAAAGGCTGCG 15
R-endA-downstream TGCACCATTCGATGGTGTCTCTAGAATGAAGAAGCGAATCGTCCT 16
F-endX-upstream CTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGTGCTTCCCCCTCAGGG 17
R-endX-upstream GGCCTGAGGAGCGCAGTCAATCTTCCTTCG 18
F-endX-downstream TTGACTGCGCTCCTCAGGCCAGCGTTTG 19
R-endX-downstream TGCACCATTCGATGGTGTCTCTAGAACCAGTAAAAGTGGCGCCG 20
F-qedH-I-upstream CTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGTGGCCATGAACTGGCG 21
R-qedH-I-upstream CCGCTGCAGGGGTTGCAGTTCCCAGTGGA 22
F-qedH-I-downstream AACTGCAACCCCTGCAGCGGGGAGC 23
R-qedH-I-downstream TGCACCATTCGATGGTGTCTCTAGAATGAATATCGTGTTGGTCGATGAC 24
F-qedH-II-upstream CTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGTGGCCATGAACTGGCG 25
R-qedH-II-upstream TAGGCAGGCGGACGGCTACCTTTGGTTTTTTTG 26
F-qedH-II-downstream GGTAGCCGTCCGCCTGCCTACTGCCG 27
R-qedH-II-downstream TGCACCATTCGATGGTGTCTCTAGATTAGAAGAAGCCCAGCGGAT 28
F-phaG-upstream CTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGTGTCTGCAGTGAAACCCG 29
R-phaG-upstream GCCGAGCCGCGTCATCGACTCCTGGCGC 30
F-phaG-downstream AGTCGATGACGCGGCTCGGCGCC 31
R-phaG-downstream TGCACCATTCGATGGTGTCTCTAGACTAACCCTGTTCGGTCACTTG 32
F-Confirm1-upstream (Universal) CGATTCATTAATGCAGCTGGC 33
R-Confirm1-downstream (Universal) TCCACTTTTTCCCGCGTTTTC 34
R-Confirm1-upstream (endA) GGCACGATGTGTTCCCAC 35
F-Confirm1-downstream (endA) AAGCCAGAGGCCAAACCAA 36
R-Confirm1-upstream (endX) TTTACAGCCGCAATAAAACTCGG 37
F-Confirm1-downstream (endX) AAGCCTGGGAGCGGCAA 38
R-Confirm1-upstream (qedH-I) TGGCCGCTGTTGCCA 39
F-Confirm1-downstream (qedH-I) CGTGGGCTACGGCGG 40
R-Confirm1-upstream (qedH-II) GCATCGAGCATGCGCAAG 41
F-Confirm1-downstream (qedH-II) ATCTCCAGGTCCGCCGC 42
R-Confirm1-upstream (phaG) GCCGTGGTGGCCAGC 43
F-Confirm1-downstream (phaG) CCCGCAATGTCATGCTGG 44
F-Confirm2-endA TGCTGCTCTTGAAATGAACC 45
R-Confirm2-endA ATGAAGAAGCGAATCGTCCT 46
F-Confirm2-endX GCAACGTCACCGACACC 47
R-Confirm2-endX-R AGCTCTGCGGTGGAGC 48
F-Confirm2-qedH-I GCATCGAGCATGCGCAAG 49
R-Confirm2-qedH-I ATCTCCAGGTCCGCCGC 50
F-Confirm2-qedH-II CACCGCCTGAGGTTGCT 51
R-Confirm2-qedH-II AGCCACGGTGCCTTCG 52
F-Confirm2-phaG TCCGCAACACCGTACCG 53
R-Confirm2-phaG GCCGATCAGGATCGGCC 54
F-lacI+P trc (pSGP10) GTGCGGTATTTCACACCGCATATGGGCTTCACCTTCAACCCAACAC 55
R-lacI+P trc (pSGP10) CGATGGTGTCGAGCGTCAGACCCCGTAG 56
F-ori+Tet R (pSGP10) TCTGACGCTCGACACCATCGAATGGTGCA 57
R-ori+Tet R (pSGP10) GACCTGCAGGCATGCAAGCTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA 58
F-dTomato TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAG 59
R-dTomato TGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCTACTTGTACAGCTCGTCCATG 60
F-mvaE_opti AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATTTAAGGAGAACTTTATATGAAGACCGT 61
R-mvaE_opti AAAGTGTCTAGGATTATTGCTTACGCAAATCGTTCA 62
F-mvaS_opti GCGTAAGCAATAATCCTAGACACTTTCACCATAAGGA 63
R-mvaS_opti TACCCAGCGGACTTTAGTTGCGATAGCTGCGC 64
F-atoB_opti CTATCGCAACTAAAGTCCGCTGGGTAGACTAAGG 65
R-atoB_opti GCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGTCAGTTCAGGCGCTCGATC 66
R-atoB_opti (pSGP12) CTACAGAACTTAATCAGTTCAGGCGCTCGATC 67
F-nphT7_opti GCGCCTGAACTGATTAAGTTCTGTAGGGCCGAGAC 68
R-nphT7_opti GCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGTCACCACTCGATCAGCGC 69
F-acs_opti TTTCACACAGGAAACAGCGGGCCCCTGAGAATAGCCCTCAACTACGT 70
F-acs_opti (pAWP89-3) CATCGTGTGACTGAGAATAGCCCTCAACTACGT 71
R-acs_opti GATAGTCTAGAAGGTACCAGAATTCTCAGCTCGGCATGGCG 72
F-eutE_opti TTTCACACAGGAAACAGCGGGCCCAGAAAGACAAGAGATAAGGAGGT 73
R-eutE_opti GATAGTCTAGAAGGTACCAGAATTCTCACACGATGCGGAAGGC 74
R-eutE_opti (pAWP89-3) CTATTCTCAGTCACACGATGCGGAAGGC 75
실시예 5: 재조합 균주를 이용한 메발론산 생산
실시예 1 내지 4에서 제조한 균주들은 -80℃에서 글리세롤 25%의 냉동 Stock 형태로 보관하였으며, LB(kanamycin 75 mg/L, tetracyclin 30 mg/L)에서 약 14시간정도 Seed Culture 후 M9D(Dextrose 12 g/L)에 2% 접종하여 24시간 배양한 후 M9E(Ethanol 200 mM)에 O.D.=1 이 되도록 수확하여 접종하였다. 배양에 사용된 M9 Media의 조성은 표 4, 세부 배양조건은 표 5와 같다.
- M9D M9E
Phosphate Buffer K2HPO4 16.0 g/L
KH2PO4 8.0 g/L
Nitrogen Source (NH4)2SO4 4.7 g/L
Carbon Substrate Dextrose 12 g/L Ethanol 200mM
(11.7 mL/L)
Dextrose 1 g/L
MgSO47H2O 0.12 g/L
NaCl 0.5 g/L
FeSO47H2O 6 mg/L
CaCO3 2.7 mg/L
ZnSO4H2O 2.0 mg/L
MnSO4H2O 1.16 mg/L
CuSO45H2O 0.33 mg/L
CoSO47H2O 0.37 mg/L
H3BO3 0.08 mg/L
HCl 0.01 mL
Media Composition Physiological Condition
M9E Media
Ethanol 200 mM (9.2 g/L)
O.D. = 1.0 Inoculation
from M9D (Dextrose 12 g/L)
Culture		 Baffled Flask
Working Volume : 50 mL
Agitation : 230rpm
Temperature : 30℃
IPTG Induction : 0.1 mM
기질인 에탄올과 부산물인 아세트산, 생산물인 메발론산 모두 HPLC 분석을 통해 정량화하였고, 그 조건은 표 6과 같다.
HPLC 분석 조건
Instrument LC-20A Prominence Series (Shimazu)
Column Hi Plex-H Column
Temperature 40℃
Mobile Phase 0.1N H2SO4
Flow Rate 0.6 mL/min
Analysis Time 25 min
Scale-Up 가능성과 pH에 따른 메발론산 생산 경향 분석을 위해 P. putida 생장 최적 pH로 알려진 pH 7.0에서 pH 6.5까지(pH 7.0, pH 6.75, pH 6.5) 3가지 조건에서 1L 회분배양을 진행하였다. pH 7.0 조건은 생장 속도가 가장 빠르고 에탄올 소모속도도 빨랐으나 세포 생장이 많아 메발론산 생산량은 pH 6.75조건보다 낮았으며, pH 6.5 조건은 발효 중간부터 아세트산이 급격히 축적되어 세포 활성을 잃게 됨을 확인하였고, 따라서 pH 6.75의 조건이 메발론산 생산에 최적화된 pH임을 확인하였다. 하지만 플라스크 발효(4.07 g/L from 200 mM of Ethanol - Yp/x = 0.41 g/g)에 비해 회분배양의 메발론산의 수율이 낮았는데(4.60 g/L from 300 mM of Ethanol - Yp/x = 0.32 g/g) 이는 휘발성 탄소원인 에탄올이 직접적인 공기 분사로 인해 증발되어 누출되었음을 확인하였으며 이는 추후 배출가스 처리 등의 공정의 보완을 통해 극복될 수 있을 것으로 판단된다.
<110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> Recombinant Pseudomonas putida strains and method for producing mevalonate using the same <130> PN180366P <150> KR 18/0125997 <151> 2018-10-22 <160> 75 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetyl-CoA acetyltransferase <400> 1 agtccgctgg gtagactaag gaggttatag tatgaagaac tgcgtgatcg tgagcgccgt 60 gcgcaccgcc atcggcagct tcaacggcag cctggccagc accagcgcca tcgatctggg 120 tgccaccgtg atcaaagccg ccatcgagcg tgccaagatc gacagccagc acgtggacga 180 ggtgatcatg ggcaacgtgc tgcaagccgg tctgggtcag aacccagcgc gtcaggccct 240 gctgaaaagc ggtctggccg aaaccgtgtg cggcttcacc gtgaacaagg tgtgcggcag 300 cggtctgaag tcggtggccc tggccgcgca agccatccaa gcgggtcaag cccagagcat 360 cgtggccggt ggcatggaaa acatgtcgct ggccccatac ctgctggacg ccaaagcgcg 420 tagcggctac cgcctgggtg acggccaggt gtacgacgtg atcctgcgcg acggcctgat 480 gtgcgcgacc cacggctacc acatgggcat caccgccgag aacgtggcca aagagtacgg 540 catcacccgc gagatgcagg acgagctggc cctgcacagc 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540 aggccgtggc cggtcgcatc atcgacagca acagccgtct ggtcatcacc agcgacgagg 600 gcgtgcgtgc cggtcgtagc atcccgctga agaagaacgt cgacgacgcg ctgaaaaacc 660 cgaacgtgac cagcgtggaa cacgtggtgg tgctgaaacg caccggtggc aagatcgact 720 ggcaagaggg tcgcgatctg tggtggcacg acctggtgga acaggccagc gaccagcacc 780 aggccgagga aatgaacgcg gaggacccgc tgttcatcct gtacaccagc ggcagcaccg 840 gcaagccgaa gggcgtgctg cataccaccg gtggttacct ggtgtatgcc gcgctgacct 900 tcaagtacgt gttcgactac catccgggtg acatctactg gtgcaccgcc gatgtcggtt 960 gggtcaccgg tcacagctac ctgctgtacg gtccgctggc gtgcggtgcg accaccctga 1020 tgttcgaagg cgtgccgaac tggccgaccc cagcgcgtat ggcccaggtg gtggacaagc 1080 accaggtgaa catcctgtat accgcgccaa ccgccatccg tgcgctgatg gccgaaggcg 1140 acaaggccat cgaaggcacc gaccgcagca gcctgcgtat cctgggcagc gtgggcgagc 1200 cgatcaaccc cgaagcctgg gagtggtact ggaagaagat cggcaacgag aagtgcccag 1260 tggtcgacac ctggtggcag accgaaaccg gtggcttcat gatcacccca ctgccaggtg 1320 ccaccgagct gaaagccggt agcgcgaccc gtccgttctt cggcgtgcag ccagcgctgg 1380 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22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-qedH-I-upstream <400> 22 ccgctgcagg ggttgcagtt cccagtgga 29 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-qedH-I-downstream <400> 23 aactgcaacc cctgcagcgg ggagc 25 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-qedH-I-downstream <400> 24 tgcaccattc gatggtgtct ctagaatgaa tatcgtgttg gtcgatgac 49 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-qedH-II-upstream <400> 25 ctatgaccat gattacgcca agcttgtggc catgaactgg cg 42 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-qedH-II-upstream <400> 26 taggcaggcg gacggctacc tttggttttt ttg 33 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-qedH-II-downstream <400> 27 ggtagccgtc cgcctgccta ctgccg 26 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-qedH-II-downstream <400> 28 tgcaccattc gatggtgtct ctagattaga agaagcccag cggat 45 <210> 29 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-phaG-upstream <400> 29 ctatgaccat gattacgcca agcttgtgtc tgcagtgaaa cccg 44 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-phaG-upstream <400> 30 gccgagccgc gtcatcgact cctggcgc 28 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-phaG-downstream <400> 31 agtcgatgac gcggctcggc gcc 23 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-phaG-downstream <400> 32 tgcaccattc gatggtgtct ctagactaac cctgttcggt cacttg 46 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm1-upstream <400> 33 cgattcatta atgcagctgg c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm1-upstream <400> 34 tccacttttt cccgcgtttt c 21 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm1-upstream <400> 35 ggcacgatgt gttcccac 18 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm1-downstream <400> 36 aagccagagg ccaaaccaa 19 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm1-upstream <400> 37 tttacagccg caataaaact cgg 23 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm1-downstream <400> 38 aagcctggga gcggcaa 17 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm1-upstream <400> 39 tggccgctgt tgcca 15 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm1-downstream <400> 40 cgtgggctac ggcgg 15 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm1-upstream <400> 41 gcatcgagca tgcgcaag 18 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm1-downstream <400> 42 atctccaggt ccgccgc 17 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm1-upstream <400> 43 gccgtggtgg ccagc 15 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm1-downstream <400> 44 cccgcaatgt catgctgg 18 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm2-endA <400> 45 tgctgctctt gaaatgaacc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm2-endA <400> 46 atgaagaagc gaatcgtcct 20 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm2-endX <400> 47 gcaacgtcac cgacacc 17 <210> 48 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm2-endX-R <400> 48 agctctgcgg tggagc 16 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm2-qedH-I <400> 49 gcatcgagca tgcgcaag 18 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm2-qedH-I <400> 50 atctccaggt ccgccgc 17 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm2-qedH-II <400> 51 caccgcctga ggttgct 17 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm2-qedH-II <400> 52 agccacggtg ccttcg 16 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-Confirm2-phaG <400> 53 tccgcaacac cgtaccg 17 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-Confirm2-phaG <400> 54 gccgatcagg atcggcc 17 <210> 55 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-lacI+Ptrc (pSGP10) <400> 55 gtgcggtatt tcacaccgca tatgggcttc accttcaacc caacac 46 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-lacI+Ptrc (pSGP10) <400> 56 cgatggtgtc gagcgtcaga ccccgtag 28 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-ori+TetR (pSGP10) <400> 57 tctgacgctc gacaccatcg aatggtgca 29 <210> 58 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-ori+TetR (pSGP10) <400> 58 gacctgcagg catgcaagct tcatggtctg tttcctgtgt gaa 43 <210> 59 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-dTomato <400> 59 tgcatgcctg caggtcgact ctagaatggt gagcaagggc gag 43 <210> 60 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-dTomato <400> 60 tgaattcgag ctcggtaccc gggctacttg tacagctcgt ccatg 45 <210> 61 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-mvaE_opti <400> 61 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga atttaaggag aactttatat gaagaccgt 59 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-mvaE_opti <400> 62 aaagtgtcta ggattattgc ttacgcaaat cgttca 36 <210> 63 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-mvaS_opti <400> 63 gcgtaagcaa taatcctaga cactttcacc ataagga 37 <210> 64 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-mvaS_opti <400> 64 tacccagcgg actttagttg cgatagctgc gc 32 <210> 65 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-atoB_opti <400> 65 ctatcgcaac taaagtccgc tgggtagact aagg 34 <210> 66 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-atoB_opti <400> 66 gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggtc agttcaggcg ctcgatc 47 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-atoB_opti (pSGP12) <400> 67 ctacagaact taatcagttc aggcgctcga tc 32 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-nphT7_opti <400> 68 gcgcctgaac tgattaagtt ctgtagggcc gagac 35 <210> 69 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-nphT7_opti <400> 69 gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggtc accactcgat cagcgc 46 <210> 70 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-acs_opti <400> 70 tttcacacag gaaacagcgg gcccctgaga atagccctca actacgt 47 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-acs_opti (pAWP89-3) <400> 71 catcgtgtga ctgagaatag ccctcaacta cgt 33 <210> 72 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-acs_opti <400> 72 gatagtctag aaggtaccag aattctcagc tcggcatggc g 41 <210> 73 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-eutE_opti <400> 73 tttcacacag gaaacagcgg gcccagaaag acaagagata aggaggt 47 <210> 74 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-eutE_opti <400> 74 gatagtctag aaggtaccag aattctcaca cgatgcggaa ggc 43 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-eutE_opti (pAWP89-3) <400> 75 ctattctcag tcacacgatg cggaaggc 28

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아세틸 조효소 아세틸전달효소(Acetyl coenzyme A Acetyltransferase)의 핵산서열, 서열번호 2로 표시되는 HMG CoA 합성효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthetase)의 핵산서열 및 서열번호 3으로 표시되는 HMG CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)의 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고, 엔도뉴클레아제 A(endonuclease A, endA) 유전자 및 엔도뉴클레아제 X(endonuclease A, endX) 유전자가 결손된 재조합 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4로 표시되는 아세틸 조효소 합성효소(Acetyl coenzyme A synthetase)의 핵산서열을 추가적으로 포함하는 것인, 재조합 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 균주는 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 I(Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase I) 유전자 및 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 II(Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase II) 유전자가 추가로 결손된 것인, 재조합 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주.
  4. 서열번호 1로 표시되는 아세틸 조효소 아세틸전달효소(Acetyl coenzyme A Acetyltransferase)의 핵산서열, 서열번호 2로 표시되는 HMG CoA 합성효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthetase)의 핵산서열 및 서열번호 3으로 표시되는 HMG CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)의 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되고, 엔도뉴클레아제 A(endonuclease A, endA) 유전자 및 엔도뉴클레아제 X(endonuclease A, endX) 유전자가 결손된 재조합 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 균주를 포함하는 메발론산(mevalonate) 생산용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 4로 표시되는 아세틸 조효소 합성효소(Acetyl coenzyme A synthetase)의 핵산서열을 추가적으로 포함하는 것인, 메발론산 생산용 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 균주는 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 I(Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase I) 유전자 및 퀴노단백질 에탄올 탈수소효소 II(Quinoprotein Ethanol Dehydrogenase II) 유전자가 추가로 결손된 것인, 메발론산 생산용 조성물.
  7. 다음 단계를 포함하는 메발론산의 생산 방법:
    상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 재조합 슈도모나스 푸티다 균주를 배양하는 단계; 및
    상기 배양 결과물로부터 메발론산을 수득하는 단계.
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