KR20200048005A - 유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서 - Google Patents

유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서 Download PDF

Info

Publication number
KR20200048005A
KR20200048005A KR1020180129590A KR20180129590A KR20200048005A KR 20200048005 A KR20200048005 A KR 20200048005A KR 1020180129590 A KR1020180129590 A KR 1020180129590A KR 20180129590 A KR20180129590 A KR 20180129590A KR 20200048005 A KR20200048005 A KR 20200048005A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
urea
parylene
urease
porous membrane
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020180129590A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102200170B1 (ko
Inventor
박민
성건용
김지영
김경희
Original Assignee
한림대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한림대학교 산학협력단 filed Critical 한림대학교 산학협력단
Priority to KR1020180129590A priority Critical patent/KR102200170B1/ko
Priority to US16/666,696 priority patent/US20200129975A1/en
Publication of KR20200048005A publication Critical patent/KR20200048005A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102200170B1 publication Critical patent/KR102200170B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/58—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue
    • A61B5/14525—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue using microdialysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue
    • A61B5/14546—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration or pH-value ; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid or cerebral tissue for measuring analytes not otherwise provided for, e.g. ions, cytochromes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J7/00—Chemical treatment or coating of shaped articles made of macromolecular substances
    • C08J7/12—Chemical modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/301—Reference electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/0004—Gaseous mixtures, e.g. polluted air
    • G01N33/0009—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment
    • G01N33/0027—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector
    • G01N33/0036—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector specially adapted to detect a particular component
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4915—Blood using flow cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/12—Manufacturing methods specially adapted for producing sensors for in-vivo measurements
    • A61B2562/125—Manufacturing methods specially adapted for producing sensors for in-vivo measurements characterised by the manufacture of electrodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/16—Details of sensor housings or probes; Details of structural supports for sensors
    • A61B2562/166—Details of sensor housings or probes; Details of structural supports for sensors the sensor is mounted on a specially adapted printed circuit board
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/20—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons for measuring urological functions restricted to the evaluation of the urinary system
    • A61B5/207—Sensing devices adapted to collect urine
    • A61B5/208—Sensing devices adapted to collect urine adapted to determine urine quantity, e.g. flow, volume
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2300/00—Characterised by the use of unspecified polymers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Combustion & Propulsion (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

본 발명자들은 기상 증착법으로 아민 작용기화된 파릴렌인 파릴렌-A로 코팅한 다공성 PTFE 막을 이용하여 유동 조건에서 사용할 수 있는 휴대용 요소 센서를 제작하였다. 요소로부터 특정 전기화학적 센서 신호를 생성하기 위해 요소를 가수분해하는 효소인 요소분해효소를 글루타르알데하이드를 이용하여 화학 가교결합으로 파릴렌-A가 코팅된 PTFE 막에 고정하였다. 요소가 고정된 막을 PDMS (polydimethylsiloxane) 유체 챔버에 조립하고 스크린 인쇄된 탄소 3 전극 시스템을 전기화학 측정에 사용하였다. 요소분해효소 고정화의 성공은 형광 현미경, 주사 전자 현미경 및 푸리에 변환 적외선 분광법으로 확인하였다. 파릴렌-A가 코팅된 PTFE 막에 고정할 요소분해효소의 최적 농도는 48mg/mL로 결정되었고, PDMS 챔버 내의 막의 최적 수는 8인 것으로 판명되었다. 이러한 최적화된 조건을 이용하여 본 발명자들은 요소 바이오센서를 제조하고 시간대 전류측정법 (chronoamperometry)을 이용하여 유동 조건에서 0.5-10mL/min 범위의 다양한 유속으로 요소 시료를 모니터링했다. 생체 시료에 대한 센서의 적용 가능성을 테스트하기 위해 만성 신부전 환자의 폐 복막 투석액에서 요소 농도를 0.5mL/min의 유속으로 모니터링하는 데 본 발명의 센서를 사용했다.

Description

유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-A 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서 {Parylene-A-coated insoluble porous membrane-based portable urea biosensor for use in flow conditions}
본 발명은 파릴렌-A 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 흐르는 조건에서 사용 가능한 휴대용 요소 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 약자는 다음과 같다:
PTFE: Polytetrafluoroethylene; PDMS: Polydimethylsiloxane,
PBS: Phosphate buffered saline; SEM: Scanning electron microscopy;
FTIR: Fourier-transform infrared; FITC: Fluorescein isothiocyanate;
AP: Parylene-A-coated PTFE; UAP: Urease-immobilized AP;
LOD: Limit of detection; ESRF: End-stage renal failure.
요소는 간에서 일어나는 단백질의 분해 과정에서 암모니아로부터 합성된 화합물이며, 신진 대사의 최종 질소 생성물이다. 포유동물과 양서류에서 독성이 높은 암모니아는 오르니틴 사이클에 의해 상대적으로 독성이 낮은 요소로 변형된다. 합성된 요소는 신장에 저장되고 소변을 통해 체내에서 배출된다. 요소는 신장 기능의 중요한 지표로서 크레아티닌과 함께 널리 사용된다. 혈액 내 요소와 크레아티닌의 적정 범위는 각각 7-20mg/dL 및 0.7-1.2mg/dL이다 [1-3]. 신장은 생체 폐기물의 배출, 산, 염기 및 전해질의 대사 유지, 혈압 유지, 칼슘 및 인산염 대사를 조절하는 부갑상선 호르몬의 생성 및 활성화 등 많은 기능을 하는 콩 모양의 내분비 기관이다. 신장은 생체에 필수적이며, 심장에서 흘러나오는 혈액의 20-25%가 신장으로 흘러들어간다. 신장에 의해 여과되는 총 혈액량은 하루 180L이다. 혈액에서 여과된 대부분의 물은 재흡수되고, 1-2L만 소변으로 배출된다. 항상성이 유지될 수 없도록 신장 기능이 손상된 상태를 신부전이라고 한다. 신부전증에 걸리면 사구체 여과율이 급격히 떨어지므로 혈청 내 요소 및 크레아티닌 농도가 증가한다. 급성 신부전증은 심한 부상 또는 신장에 혈액 공급 부족으로 인하여 복잡한 수술 후에 발생할 수 있다. 이 경우 신장 기능은 치료 후 정상으로 회복될 수 있다. 반면, 만성 신부전증은 초기 단계에는 특별한 증상이 없고, 고혈압 및 당뇨병과 같은 다양한 증상이 나중에 관찰된다. 만성 신부전이 지속되고 심해지면 말기 신부전 (end-stage renal failure; ESRF)으로 진행할 수 있다. 말기 신부전에는 신장 이식이 수행되어야 하며, 이식이 수행될 때까지 혈액 투석 또는 복막 투석이 필요하다 [14, 15]. 혈액이나 복막에서 요소와 크레아티닌 농도가 투석 진행의 주요 지표이다.
요소의 농도를 모니터링하기 위해 전기 화학적, 열적, 광학적 및 압전적 검출을 기반으로 하는 다양한 분석법 및 바이오 센서가 개발되었다 [16-20]. 이 중에서 전기화학적 요소 바이오센서는 감도가 높고 효율적이고 신속한 분석이 가능하여 널리 개발되어 왔다 [21]. 요소 농도의 전기 화학적 측정을 위해 요소분해효소 기반 바이오센서가 개발되었다 [22]. 요소분해효소는 다양한 박테리아, 진균류, 조류 및 식물에서 발견되는 니켈 함유 금속 효소이다 [23]. 요소분해효소는 요소의 가수 분해를 촉매하여 이산화탄소와 암모니아로 만든다. 요소의 가수분해는 다음과 같다:
(NH2)2CO (요소) + H2O → CO2 + 2NH3
요소분해효소는 요소를 암모니아 및 카바메이트 분자로 가수분해한다. 불안정한 카바메이트는 이어서 제2 암모니아 분자 및 이산화탄소 분자로 분해된다. 수용액에서 암모니아는 전하를 띤 암모늄 이온으로 존재하며, 이는 요소분해효소에 의한 요소의 가수분해 과정에서 전기 화학 신호를 생성한다. 신호의 강도는 존재하는 암모늄 이온의 양에 비례하며, 따라서 요소분해효소 기반 전기 화학적 바이오센서는 정량 분석이 가능하다. 높은 감도를 얻기 위해서는 검출 가능한 양의 암모늄 이온을 생성하기 위해 고농도의 요소분해효소가 필요하다. 따라서, 높은 밀도의 요소분해효소를 고정하는 것이 필수적이다. 이전 연구에서, 요소분해효소는 전기화학적 측정에 사용되는 전극의 표면에 고정화되었다. 그러나, 직접 고정화는 요소분해효소를 고정할 수 있는 영역을 전극 영역으로 제한하고, 전극을 교환할 때마다 요소분해효소를 다시 고정해야 하기 때문에 분석 비용을 증가시킨다. 더 나은 대안으로서, 요소분해효소가 고정될 수 있는 나노 구조물이 전극의 표면상에 구축되었다. 그러나, 이러한 유형의 바이오센서는 또한 각 전극의 교체 후에 요소분해효소의 재 고정을 필요로 한다 [21, 24, 25]. 최근의 논문에서는 전극에 단단히 부착된 별도의 기질에 요소분해효소를 고정화하고, 요소의 농도를 전기화학적으로 측정하였으며, 요소분해효소를 다공질 기질에 고정화하여 고정화 면적을 늘리고 감도를 향상시켰다 [26]. 그러나, 이들 연구에서 요소 측정은 정적 조건 (static condition)에서 수행되었다 [22]. 혈액이나 소변 수집 후 정체 상태에서의 요소 농도 측정은 의학적 진단에 유용하다. 그러나, 혈액 투석이나 복막 투석 중 투석 진행 상황을 모니터링하기 위해서는 흐르는 상태에서 요소 농도를 측정해야 한다. 유동 분석 (flow analysis)을 위한 생물 반응기의 사용이 최근 보고되었다 [27]. 하지만, 이러한 생물 반응기는 복잡한 반응 과정을 거쳐 긴 반응 시간을 필요로 하고 요소의 단일 주입으로부터 단 하나의 광신호만을 측정하기 때문에 생리학적 시료에서 요소를 지속적으로 모니터링하기에는 적합하지 않다고 생각된다. Ohnishi 등은 마이크로 유체 칩을 사용하여 요소 농도를 측정했다 [28]. 이 장치는 흐름 채널을 사용했지만 고정된 상태에서 전위를 측정했으므로 단일 측정에만 사용할 수 있었다. 또, 열 바이오센서가 유동 주입 분석에 사용되었다 [29]. 그러나 검출된 요소 농도 (100mM)는 정상 범위보다 훨씬 높았으며 지속적인 모니터링이 불가능했다. 어쨌거나, 생리학적 시료에서 요소를 실시간으로 모니터링하기 위해서는 흐름 상태에서 요소를 지속적으로 모니터링하는 바이오센서가 개발되어야 한다.
특허 제1871781호 "요소분해효소 고정화 불용성 다공성 지지체를 이용한 휴대형 요소 센서 모듈"
D. Miller et al., Radiology, 167(1988) 607-11. P.K. Dabla, World J Diabetes, 1(2010) 48. S.-H. Lin et al., Am J Kidney Dis, 43(2004) 304-12. S.C. Palmer et al., JAMA, 305(2011) 1119-27. L.A. Stevens et al., N Engl J Med, 354(2006) 2473-83. L. Narasimhan et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(2001) 4617-21. H.J. Chin et al., Korean J Med, 76(2009) 511-4. D.J. Polzin, Nephrology and urology of small animals, (2011) 431-71. D.M. Williams et al., Arch Pediatr Adolesc Med, 156(2002) 893-900. R.C. Atkins et al., Kidney Int, 67(2005) S14-S8. A.M. El Nahas et al., The Lancet, 365(2005) 331-40. J. Hong et al., BioChip Journal, 10(2016) 111-7. K.-H. Kim et al., BioChip Journal, 10(2016) 272-6. D.C. Jin, Journal of the Korean Medical Association/Taehan Uisa Hyophoe Chi, 56(2013). D.-C. Jin et al., Kidney research and clinical practice, 34(2015) 132-9. A. Kaushik et al., Sensors Actuators B: Chem, 138(2009) 572-80. P. Bataillard et al., Biosens Bioelectron, 8(1993) 89-98. O.S. Wolfbeis et al., Biosens Bioelectron, 8(1993) 161-6. P. Bhatia et al., Sensors Actuators B: Chem, 161(2012) 434-8. Z. Yang et al., Biosens Bioelectron, 22(2007) 3283-7. G. Dhawan et al., Biochem Eng J, 44(2009) 42-52. M. Singh et al., Sensors Actuators B: Chem, 134(2008) 345-51. N.E. Dixon et al., J Am Chem Soc, 97(1975) 4131-3. A. Salimi et al., Biophys Chem, 125(2007) 540-8. M. Tyagi et al., Biosens Bioelectron, 41(2013) 110-5. K. Rafiq et al., Sensors Actuators B: Chem, 251(2017) 472-80. M. Pokrzywnicka et al., Talanta, 160(2016) 233-40. N. Ohnishi et al., Sensors Actuators B: Chem, 144(2010) 146-52. G.K. Mishra et al., Appl Biochem Biotechnol, 174(2014) 998-1009. H. Ko et al., Biosens Bioelectron, 30(2011) 56-60.
본 발명의 목적은 유동 조건에서 요소를 민감하고 신속하게 탐지할 수 있는 요소 센서를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 휴대 가능하고 편리한 요소 센서를 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 반복 사용에도 감도가 저하되지 않는 요소 센서를 제공하려는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 다공성 막에 고농도의 요소분해효소를 고정하고 유동 조건에서 사용하기 위해 막을 이용한 실시간 요소 모니터링 바이오센서를 제작했다. 요소분해효소를 고밀도로 고정하기 위해 다공성 막을 아민-관능화된 파릴렌인 파릴렌-A로 코팅하였다. 파릴렌 (poly(p- xylylene))은 실온에서 기상 증착방법으로 다공성 막 위에 코팅될 수 있는 중합체이다. 파릴렌-A는 반복 단위당 하나의 아민기를 함유한다. 따라서, 다공성 막을 우선 파릴렌-A로 코팅하여 표면에 고농도의 아민기를 형성시킨 후, 글루타르알데하이드를 가교제로 사용하여 막에 고농도의 요소분해효소를 고정시켰다 [30]. 다공성 막은 유동 조건에서 유체와의 접촉 면적을 최대화하여 전기 화학 측정의 민감도를 향상시킨다. 마지막으로, 요소분해효소가 고정된 다공성 막을 폴리디메틸실록산 (PDMS) 챔버에 삽입하여 유체 시스템을 형성하였다. 그런 다음 제조된 요소 바이오센서를 사용하여 유동 조건에서 요소의 농도를 모니터링했다.
본 발명은
전기 신호를 차단하지 않는 재질로 이루어진 유체 챔버;
상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막;
상기 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막에 근접하여 위치하며 상기 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용 전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템,
상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및
상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함하며, 흐르는 상태의 시료에 대하여 전기화학적 방법으로 요소 농도를 측정하는 휴대형 요소 바이오센서에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막이 글루타르알데하이드를 이용한 화학 가교결합으로 요소분해효소가 고정된 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 불용성 다공성 막이 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료로 제조된 것임을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 PTFE (Polytetrafluoroethylene) 재질의 불용성 다공성 막을 사용하였으나, PTFE 재질이 아니더라도 물 또는 수용액에 불용성을 나타내며, 통공이 다수 개 형성된 다공성 막이면 특별한 제한은 없으며, 위에 나열한 재질 또한 예시적일 뿐 이러한 재질의 막에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 유체 챔버와 상기 3-전극 시스템을 감싸는 하우징을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 3-전극 시스템의 작용 전극이 아민화된 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 3-전극 시스템을 외부의 전기화학 분석장치와 연결하여 유체 챔버 내의 전기화학 신호를 탐지하는 것을 특징으로 하는 요소 바이오센서에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 아민 작용기화된 파릴렌 필름이 표면에 코팅된 단백질 고정용 불용성 다공성 막에 관한 것이다. 이 막은 요소분해효소를 비록한 다양한 효소 등의 단백질을 고정화하여 센서 등의 용도로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 불용성 다공성 막이 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료로 제조된 것임을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 PTFE (Polytetrafluoroethylene) 재질의 불용성 다공성 막을 사용하였으나, PTFE 재질이 아니더라도 물 또는 수용액에 불용성을 나타내며, 통공이 다수 개 형성된 다공성 막이면 특별한 제한은 없으며, 위에 나열한 재질 또한 예시적일 뿐 이러한 재질의 막에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계; 및
(2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 가교제 글루타르알데하이드 용액으로 반응시켜 활성 알데하이드기로 전환하는 단계;를 포함하는 단백질 고정용 불용성 다공성 막 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (1) 단계를 진공 상태를 유지하며 진행함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
(1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계;
(2) 파릴렌 필름 증착 후 파릴렌 필름 표면의 아민기를 가교제 글루타르알데하이드 용액으로 반응시켜 활성 알데하이드기로 전환하는 단계; 및
(3) 상기 파릴렌 필름 표면의 활성 알데하이드기와 유리 아민기를 가진 요소분해효소를 화학 반응시켜 요소분해효소를 불용성 다공성 막에 고정화하는 단계;를 포함하는 요소분해효소 고정 불용성 다공성 막 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되며, 비특이적 반응의 감소로 요소 농도 측정시 노이즈를 낮추는 효과가 있는 요소 바이오센서용 요소분해효소 고정 불용성 다공성 막에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유체 챔버; 상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막; 상기 불용성 다공성 막에 근접하여 위치하며 상기 불용성 다공성 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용 전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템; 상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및 상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함하는 휴대형 요소 바이오센서를 이용하여 전기화학적 방법으로 흐르는 상태의 시료 내 요소 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 흐르는 상태의 시료가 0.5 내지 10mL/min의 유속으로 흐름을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막을 6~10장 포함함을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 시료 내 요소 농도가 0.6-20mM의 범위임을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 요소 바이오센서는 유동 상태의 시료에서 요소 농도를 높은 감도로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 요소 바이오센서는 요소분해효소가 고정된 다공성 막을 필요에 따라 교체할 수 있으므로 장기간 사용으로 인한 감도 저하를 막을 수 있다.
또한, 본 발명의 요소 바이오센서는 요소분해효소가 화학결합으로 다공성 막 표면에 고정되므로 노이즈를 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 휴대형 요소 바이오센서는 인공신장 및 휴대용 투석 시스템 등에 적용하기에 적합하다.
또한, 본 발명의 요소 바이오센서는 다공성 막에 요소분해효소를 화학적 방법으로 고정하며, 필요에 따라 요소분해효소가 고정된 막을 다수 개 사용하므로 요소 바이오센서 내의 효소를 높은 농도로 유지할 수 있어 감도가 높다.
본 발명자인 성건용 등의 논문 Sensors 2018, 18, 2607에는 요소분해효소를 고정하는 다공성 막으로서 실크 피브로인을 사용하여 유동 상태의 요소를 측정하는 요소 센서가 공개되었다. 이 센서는 0.5mL/min의 저유속에서만 측정이 가능한 반면, 본 발명의 요소 센서는 10mL/min의 고유속에서도 유체 시료 내의 요소를 측정할 수 있다. 또한, 실크 피브로인 막을 이용한 선행 논문에서는 0.3mM~1.2mM 요소 농도에서 선형을 보인 반면, 본 발명에서는 20mM의 고농도 요소까지 측정이 가능하며, 10mM까지 선형조건을 보이기 때문에 더 넓은 농도의 요소를 좀 더 정확하게 측정할 수 있다. 결론적으로, 상기 논문과 비교할 때 본 발명의 요소 바이오센서는 더 넓은 농도 범위의 요소를 10mL/min 정도의 더욱 빠른 유속 조건 하에서도 더 높은 민감도로 측정 가능하다. 이는 상기 논문 및 선행 특허인 특허 제1871781호와 비교하여 통상의 기술자가 쉽게 예측할 수 없는 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
도 1은 (a) 센서 시스템의 구성 및 (b) 센서 단위의 사진이다.
도 2는 (a) FITC (fluorescein isothiocyanate)-처리된 파릴렌-N 코팅 PTFE 막, (b) FITC-처리된 PTFE 막, (c) FITC-처리된 파릴렌-A 코팅 PTFE 막 및 (d) 플루오레신 처리된 파릴렌-A 코팅 PTFE 막의 형광 현미경 사진이다.
도 3은 (a) PTFE 막, (b) 파릴렌-A 코팅 PTFE 막, (c) 글루타르알데하이드 처리된 파릴렌-A 코팅 PTFE 막 및 (d) 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 PTFE 막의 SEM 현미경 사진이다.
도 4는 (a) PTFE 막, (b) 파릴렌-A 코팅 PTFE 막, (c) 글루타르알데하이드 처리된 파릴렌-A 코팅 PTFE 막 및 (d) 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 PTFE 막의 FTIR 스펙트럼이다.
도 5는 요소분해효소 활성 측정 및 전류계로 요소분해효소 농도를 최적화하는 그래프이다.
도 6은 다양한 수의 UAP 막으로 요소를 탐지한 결과이다.
도 7은 (a) 다양한 유동 속도로 PBS 내에서, (b) 복막 투석액 내에서, (c) 요소 센서 반응에서 UAP 막 기반 바이오센서를 이용하여 요소를 실시간 모니터링한 결과이다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재범위에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
시약
요소분해효소 (Canavalia ensiformis 유래), 요소, 글루타르알데하이드, 인산수소이나트륨 (disodium hydrogen phosphate), 인산이수소칼륨 (potassium dihydrogen phosphate), 플루오레신 (fluorescein), FITC (fluorescein isothiocyanate) 및 암모늄 카바메이트 (ammonium carbamate)는 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 요소 분석 킷트는 BioAssay Systems (CA, US)에서 구입하였다. PBS (Phosphate buffered saline)는 LPS solution (Daejeon, Korea)에서 구입하였고 전기화학적 측정을 위한 지지 전해질로 사용된다. 인산 완충액 (PB)은 20mM 인산수소이나트륨과 20mM 인산이수소칼륨을 혼합하여 제조하였고 (pH = 7.4), 이것을 고정화 완충액으로 사용하였다. 공극 크기 1㎛의 다공성 PTFE (polytetrafluoroethylene) 막은 Advantec MFS (CA, US)에서 구입하였다. 만성 신부전 환자의 폐 복막 투석액은 헬싱키 선언에 따라 서울대학교 병원에서 입수하였다. 이 연구는 서울대학교 병원과 한림대학교의 기관 검토위원회의 승인을 받았다.
PTFE 막에 파릴렌 코팅 및 요소분해효소 고정화
전형적으로, 다공성 PTFE 막을 생검 펀치 (직경 8mm)를 사용하여 펀칭하고, 파릴렌 필름을 아래 절차에 따라 증착시켰다. (1) 아민으로 작용기화된 파릴렌 다이머를 160℃에서 증발시켰다. (2) 다이머는 650℃에서 열분해되어 고도로 반응성인 아민 작용기화된 p-자일렌 라디칼을 생성하였다. (3) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 PTFE 필름상에 균일하게 증착시켰다. 전 코팅 과정 동안 진공상태 (< 5 Pa)를 유지하였다. 파릴렌 필름 증착 후, 필름 표면의 아민기는 인산 완충액 중의 가교 결합제 글루타르알데하이드 10% 용액으로 1시간 동안 격렬하게 진탕하면서 활성 알데하이드기로 전환시켰다. 마지막으로 요소분해효소는 활성 알데하이드기와 요소분해효소의 유리 아민기 사이의 화학 반응을 통해 PTFE 막에 고정하였다.
요소분해효소 활성 측정
시판 요소 분석 킷트를 사용하여 요소 농도를 측정하였다. 요컨대, 요소분해효소 고정 PTFE 막을 16.67mM 요소로 25℃에서 1시간 동안 교반하면서 처리하였다. 요소분해효소 고정 PTFE 막에서 요소분해효소로 요소를 가수분해한 후, 가수분해된 요소 용액 5μL를 96-웰 마이크로 플레이트에 옮기고 200μL의 프탈알데하이드 시약을 20분간 처리하였다. 이어서, 고정화된 요소분해효소의 활성을 520nm의 파장에서의 광학 밀도 측정에 의한 비색법으로 측정하였다.
요소 바이오센서 제작
본 발명에서 제작된 요소 바이오센서는 도 1에 묘사되어 있다. 바이오센서는 하부 하우징, 3-전극 시스템, PDMS (polydimethylsiloxane) 유체 챔버, 요소분해효소 고정화 PTFE 막 (4, 6, 8, 10 또는 12개) 및 상부 하우징으로 구성된다. 하우징은 아크릴로니트릴 폴리부타디엔 스티렌 (ABS) 필라멘트를 사용하여 3D 인쇄되었다. PDMS 유체 챔버를 제작하기 위해 플라스틱 프레임 (폭 = 10.20mm, 길이 = 14mm, 높이 = 5.43mm)에 부착된 Si 웨이퍼에서 PDMS를 응고시켰다. 응고 후, 내경 8mm의 원통형 유체 챔버를 생검 펀치로 천공하였다. 스크린 인쇄된 3-전극 시스템은 직경 4mm의 작용 전극 (DropSens, Llanera, Spain)을 포함하고, 이는 아민화 후에 사용되었다 [26]. 아민화를 위해, 전극을 0.5M 암모늄 카바메이트 용액에 침지하고 순환 전압전류법 (CV)을 수행하였다. 스윕 전위 및 속도는 50 사이클 동안 0.5 내지 1.2V 및 50mV/s 범위의 값으로 각각 설정되었다. 아민화 이후, 전극을 정제수로 세척하였다. 요소 바이오센서의 모든 구획을 준비한 후, 요소분해효소가 고정화된 파릴렌 코팅 PTFE 막을 PDMS 유체 챔버에 넣고 도 1(a)와 같이 다른 부분을 조립하였다.
유동 시스템 구성 및 전기 화학적 측정
도 1(b)에 도시된 바와 같이 유동 조건에서 요소 농도를 검출하기 위해 단일 유동 시스템이 구성되었다. 요소 센서의 유동 셀은 튜브에 연결되어 있으며 흐름을 통해 개방 회로가 만들어졌다. 유속은 입구 튜브에 연결된 개방 회로로부터 연동 펌프 (Ismatec, Wertheim, Germany)를 사용하여 조절하였고, 출구 튜브는 병에 연결되었다. Potentiostats (DropSens, Llanera, Spain)를 센서에 설치된 전극에 연결하여 요소분해효소에 의한 요소의 가수분해로 생성된 전류를 측정했다. 유동 조건에서 요소의 실시간 모니터링을 위해 다양한 유속으로 1.1 V에서 시간대 전류측정법 (chronoamperometry)이 수행되었다.
결과 1: 파릴렌 -A 코팅을 이용한 요소분해효소 고정 PTFE 막 제작
전기화학 반응은 사용된 전극 표면에서 발생한다. 따라서, 효소-기반 전기화학적 바이오센서에서, 효소는 일반적으로 전극의 표면상에 고정화된다. 이러한 유형의 바이오센서에서는 반복 측정으로 인해 효소 활성이 감소할 때 효소와 전극을 동시에 교체해야 하므로, 전극의 수명이 단축되고 바이오센서의 비용이 증가한다. 또한, 이러한 바이오센서의 효소 고정화 영역은 전극의 면적으로 제한된다. 이뿐만 아니라, 고정화 환경은 전극 물질에 의해 결정되므로 효소의 고정화를 매우 특이 적이 되도록 한다.
본 발명에서는 표면적이 큰 다공질 막에 우선 요소분해효소를 고정화시킨 후 유동 조건에서 요소를 모니터링하기 위해 요소분해효소가 고정된 막을 기반으로 하는 센서를 제작했다. 요소분해효소를 고정하기 위해 내약품성이 우수한 PTFE 막을 선택했다. 요소분해효소 고정 부위를 생성하기 위해, 파릴렌-A를 기상 증착으로 막 위에 코팅하였다. 파릴렌은 뛰어난 내화학성과 기계적 성질을 가지고 있다. 클로라이드기 함유 파릴렌 C는 FDA (Food and Drug Administration)에 의해 승인된 바 있다. 본 발명에서, 파릴렌-A는 다공성 PTFE 막의 표면상에 실온에서 기상 증착에 의해 균일하게 코팅되었다. 파릴렌-A는 반복 단위당 하나의 아민기를 갖는다. 따라서, 파릴렌-A를 PTFE 막 위에 증착시킴으로써, 막 표면을 아민 작용기로 변형시킬 수있다. 이어서, 막을 다이알데하이드 가교제인 글루타르알데하이드로 처리하여 아민과 알데하이드의 반응을 통해 알데하이드기로 표면을 작용기화하였다. 이어서, 요소분해효소는 효소의 아민기와 막 표면상의 알데하이드기의 반응을 통해 막 상에 고정화되었다. 막 상에 요소분해효소의 화학적 가교 결합은 유동 조건에서의 물리적 흡착보다 더 안정한 것으로 생각된다. 따라서, 이러한 효소 고정화 전략은 요소분해효소의 생분해를 방지하고 요소 센서의 내구성을 향상시켜 장기간 사용을 가능하게 한다. 파릴렌-A 코팅에 의한 아민 작용기화는 형광 현미경을 사용하여 분석되었다 (도 2). 여기에서, 100mg의 파릴렌 다이머를 사용하여 다공성 PTFE 막 상에 100nm 두께의 코팅을 얻었다. 아민기는 아민과 아이소티오시아네이트기 사이의 특이적 반응을 통해 FITC를 사용하여 가시화되었다. 도 2(a)에 나타난 바와 같이, 작용기화되지 않은 파릴렌-N이 피복된 PTFE 막이 1㎍/mL의 FITC로 처리된 경우 형광은 관찰되지 않았다. 그러나, FITC 처리된 다공성 PTFE 막에서는 약한 형광이 관찰되었으며 (도 2(b)), 이는 FITC와 PTFE 사이의 비특이적 결합에 기인한 것일 수 있다. PTFE 막은 친수성을 띠기 때문에 비특이적으로 결합한다. 그러나 소수성 고분자인 파릴렌은 비특이적 결합을 차단한다. 따라서, 파릴렌-A로 코팅된 PTFE (AP) 막을 FITC로 처리하면 강하고 균일한 형광이 관찰된다 (도 2(c)). 대조적으로, 작용기화되지 않은 플루오레신이 AP 막에 적용된 경우, 형광 신호는 검출되지 않았다 (도 2(d)). 따라서, 도 2(b)를 도 2(a) 및 도 2(d)와 비교하면, 파릴렌 코팅은 비특이적 결합을 방지한다는 것이 확인되었다. 이것은 파릴렌 코팅이 유동 상태에서 주입된 다양한 생체 분자가 요소분해효소 고정화 AP (UAP) 막에 결합하는 것을 막아 바이오센서의 노이즈 즉, 불필요한 정보를 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 도 2(c)와 도 2(a) 및 2(d)의 비교는 아민 함유 파릴렌 층 및 ITC-접합 플루오레신만이 서로 반응하고, 파릴렌-N 및 FITC 또는 파릴렌-A 및 플루오레신 사이에는 반응이 일어나지 않음을 말해준다. 이것은 ITC가 아민 특이적인 결합기이고, 파릴렌-A 코팅이 고밀도의 활성 아민기로 PTFE 막의 표면을 균일하게 작용기화시키고 비특이적 결합을 차단한다는 것을 나타낸다.
요소분해효소 고정화된 PTFE 막을 배율 5,000배의 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 관찰하였다. 파릴렌-A의 증착 후 PTFE 막의 미세 다공성 구조 (도 3(a))는 유지되었다 (도 3(b)). 또한, 글루타르알데하이드 처리 (도 3(c))와 요소분해효소 고정화 (도 3(d)) 후 PTFE 막의 미세 구조는 변하지 않았다. 따라서, PTFE 막에 파릴렌-A의 증착은 막의 미세 다공성 구조에 영향을 미치지 않았다. 또한, 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과, PTFE 막 위에 균일한 파릴렌-A 층이 형성되었음을 확인하였다. 이뿐만 아니라, 가교제 및 요소분해효소로 수행한 화학적 처리는 PTFE 막의 미세 다공성 구조에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로, 손상되지 않은 미세 다공성 구조를 갖는 UAP 막의 제조가 확인되었다. UAP 막은 PDMS 유체 챔버 내에 쌓아놓아야 하기 때문에 다공성 구조의 유지는 요소 시료의 흐름에 필수적이다. 요소분해효소 고정화 동안 막 표면상 작용기의 변화를 푸리에 - 변환 적외선 분광법 (FTIR)을 이용하여 분석하였다. 도 4(a)와 같이, PTFE 막의 스펙트럼은 1205cm-1과 1150cm-1에서 두 개의 CF2 스트레칭 피크를 보였다. 막이 파릴렌-A로 코팅된 후 기록된 스펙트럼에서는 N-H 굴곡 및 방향족 C=C 스트레칭에 해당되는 추가 피크가 각각 1622cm-1 및 1513cm-1에서 관찰되었다 (도 4(b)). 따라서, 페닐기 함유 백본 (p-자일릴렌)에 아민기를 갖는 파릴렌-A로 PTFE 막이 코팅되었음을 확인하였다. AP 막을 글루타르알데하이드로 처리하면 아민 피크가 사라지고 알데하이드기에 해당하는 새로운 C-H 스트레칭 피크가 2919cm-1 및 2850cm-1에 나타났고 (도 4(c)), 이는 파릴렌-A 코팅의 아민기가 글루타르알데하이드의 알데하이드기와 반응하고, 파릴렌-A-코팅된 PTFE 막의 표면이 알데하이드기로 작용기화된 것을 나타낸다. 파릴렌-A 층의 두께는 100㎚이며, 이는 IR 침투 깊이인 수 ㎛보다 훨씬 얕다. 따라서, CF2 스트레칭 피크는 아민 또는 알데하이드 피크보다 훨씬 강했다. 요소분해효소 고정화 후, 아마이드 A, 아마이드 B, 아마이드 I 및 아마이드 II로 인한 추가 피크는 각각 3270, 2925, 1652 및 1559cm-1에서 관찰되었다 (도 4(d)). 이러한 아마이드 피크는 단백질에 전형적인 피크이며, AP 막에 요소분해효소가 고정화되었음을 확인해 준다. 이들 데이터로부터, 요소분해효소는 다음 단계를 통해 고정화된 것으로 확인되었다: (1) 파릴렌-A의 증착에 의해 다공성 PTFE 막의 표면을 활성 아민기로 개질 하였다. (2) 이어서, 글루타르알데하이드로 처리하여 AP 막의 표면을 알데하이드기로 개질시켰다. (3) 자유 아민기 함유 요소분해효소는 화학적 가교에 의해 AP 막에 고정화되었다. 본 발명의 요소 바이오센서는 이와 같이 제조된 UAP 막을 사용하여 감도를 강화하고 노이즈를 감소시킬 수 있다. 감도의 향상은 막의 다공성 구조로 인해 효소 고정화 영역이 최대화된 것에 기인하며, 노이즈 감소는 파릴렌-A에 의한 비특이적 결합의 차단에 기인한다.
결과 2: 요소분해효소-고정화 PTFE 막 기반 요소 센서의 최적화
UAP 막을 기반으로 하여 제조된 요소 바이오센서는 도 1(a)에 도시되었다. UAP 막은 PDMS 유체 챔버 내에 놓였다. 전극 시스템은 UAP 막과 접촉한 상태로 챔버의 바닥에 두었다. 요소 시료는 PDMS 챔버 내로 주입하였고, 시료는 UAP 막의 기공을 통해 PDMS 챔버를 통과하여 흘렀다. 이어서, 시료에 존재하는 요소는 AP 막 상에 고정화된 요소분해효소에 의해 가수분해되어 센서 신호를 생성하였다. 생성된 신호는 탄소 작업 전극과 상대 전극 및 은 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3 전극 시스템을 사용하여 측정되었다. 사용 전, 감도와 안정성을 향상시키기 위해 작업 전극을 카바믹산으로 처리하여 아민화하였다. 요소 고정화 효율을 시험하고 고정화에서 요소분해효소 농도를 최적화하기 위해 0, 4, 32, 48, 64 및 128mg/mL 농도의 요소분해효소를 이용하였다. 고정화 후, 요소분해효소 활성 분석 킷트를 사용하여 고정화된 요소분해효소의 활성을 시험하였다. 표준 요소 시료 (16.67mM)를 UAP 막에 가하고, 25℃에서 1시간 후 잔류 요소 농도를 측정하였다. 고정화된 요소분해효소의 활성은 가수분해된 요소의 양에 따라 계산되었다. 1U의 요소분해효소는 pH 7.0과 25℃에서 분당 1.0μmol의 NH3를 유리시킨다. 고정화에 사용된 요소분해효소의 농도가 증가함에 따라 고정화된 요소분해효소 (■)의 활성이 증가하였고 (도 5), 48mg/mL의 요소분해효소를 사용하였을 때 최대 활성 137.5mU로 나타났다. 그러나, 더 높은 농도에서는 고정화된 요소분해효소의 활성이 감소하였다. 이것은 48mg/mL의 요소분해효소로 글루타르알데하이드 가교 결합을 통해 AP 막에 최대 양의 요소분해효소가 고정됨을 말해준다. 더 높은 요소분해효소 농도의 사용은 요소 가수분해 에피토프의 감소 또는 후크 효과로 인해 UAP 막의 활성을 감소시키는 결과를 초래했다. 요소분해효소 농도 최적화는 전기화학적 측정으로 시험하였다. 다양한 농도의 요소분해효소로 처리된 UAP 막을 PDMS 챔버에 삽입하고, 1.1V의 인가 전압에서 전류 측정기를 사용하여 10mM의 정지된 요소를 모니터링하였다. 도 5와 같이, 처리에 사용된 요소분해효소의 농도가 증가함에 따라 전류 (●)가 증가하고, 48mg/mL 요소분해효소 처리로 얻은 UAP 막에서 4.46μA의 최대값이 측정되었다. 더 높은 농도에서는 전류가 감소하였다. 이 데이터는 요소분해효소 활성 분석 결과와 완벽하게 일치했다. 이는 AP 막에 고정화된 요소분해효소의 활성이 증가함에 따라 요소 바이오센서의 감도가 증가함을 나타낸다. 요소분해효소 고정화를 위한 최적 농도는 요소분해효소 활성 분석 및 전기화학적 측정에 의해 48mg/mL로 확인되었다. 본 발명에서는 다공성 PTFE 막의 내구성과 표면적을 높이기 위해 파릴렌-A 층을 코팅하여 요소분해효소의 고정화를 시도하였다. 요소분해효소 최적 농도 48mg/mL를 가교제인 글루타르알데하이드를 이용하여 AP 막에 고정화하고, 이와 같이 최적화된 UAP 막을 이용하여 유동 조건에서 요소를 실시간 모니터링하는 요소 바이오센서를 제작하였다.
결과 3: 유동 조건에서 요소 농도의 실시간 모니터링
최적화된 UAP 막을 도 1(a)와 같이 PDMS 유체 챔버에 조립하였다. 제작된 요소 센서는 유속 10mL/min의 유체 챔버에서 다양한 수의 UAP 막을 사용하여 시험하였다. 챔버의 높이는 5.43mm이었고, 삽입 가능한 막의 최대 개수는 12개였다. 도 6과 같이, 4, 6, 8, 10 및 12개의 UAP 막을 요소 바이오센서에 삽입하고 일정 전압 1.1V에서 시간대 전류측정법 (chronoamperometry)을 이용하여 요소 시료를 모니터링하였다. 4장의 막을 넣은 경우를 제외한 모든 경우에 전류는 요소 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 이것은 유동 조건에서 요소 모니터링이 6개 이상의 UAP 막을 사용하는 시간대 전류측정법으로 실현될 수 있음을 나타낸다. 4개의 막만 사용했을 때 (▲), 전류는 8mM 이상의 요소 농도에서 감소했다. PDMS 챔버의 높이는 4개 막의 전체 두께보다 훨씬 높았다. 따라서, 막은 요소 시료의 흐름으로 인해 전극 (시스템)과 접촉하지 않았을 수 있다. 또한, 4개의 UAP 막 구성에서는 다른 구성보다 고정화된 총 요소분해효소가 더 적게 존재한다. 따라서, 전류의 감소는 고정화된 요소분해효소의 부족과 전극과 막 사이의 장거리에 의한 것으로 보인다. 8개의 UAP 막 구성 (■)은 주어진 요소 농도에서 가장 높은 전류 값을 보였다. 막의 수가 증가함에 따라 전류가 증가하고, 구성에 대한 최대값이 측정되었다. 그러나, 막의 수가 더 증가함에 따라 전류는 감소하였다. 12막 센서 (▼)에서 측정된 전류는 6막 센서 (●)에서 측정된 것보다 훨씬 낮았다. 더 많은 수의 UAP 막에서의 전류 감소는 전극 근처의 요소 시료 흐름의 감소로 인한 것으로 생각된다. 많은 수의 막이 삽입되었을 때, 막은 PDMS 챔버를 과충전시켰다. 결과적으로, 요소 시료는 다공성 UAP 막에 침투하지 않고 유체를 통해 흘렀다. 이것은 요소 분자가 고정화된 요소분해효소와 접촉하는 것을 방지하여 측정된 전류를 감소시키는 결과를 초래하였다. UAP 막의 최적화된 수는 8인 것으로 확인되었다. 따라서, 이후에서는 8개의 UAP 막으로 제조된 요소 센서를 요소 모니터링을 위해 사용하였다. 유동 조건에서 요소 농도의 실시간 모니터링을 시험하기 위해 요소 시료를 PBS에 넣고 20분 동안 0.5, 1 및 10mL/min의 유속으로 PDMS 챔버로 흐르게 했다. 이어 시간대 전류측정법을 수행하였다. 혈액 내 정상 요소 범위는 7-20mg/dL (1.2-3.3mM)이다. 그러므로, 측정을 위해 요소 농도는 0.6-20mM의 범위로 고정되었다. 본 발명의 요소 센서는 혈액 및 복막액과 같은 생리학적 시료에서 요소 농도를 모니터링하기 위해 제작되었다. 따라서, 요소의 최대 농도는 20mM로 설정하였다. 요소의 최소 농도는 정상 최소 농도의 약 절반인 0.6mM로 설정하였다. 따라서, 이와 같은 작은 값을 하한치로 고정하는 것은 투석 중의 요소 모니터링에 유리하다. 도 7(a)와 같이, 모든 범위에서 최대 전류는 유속 0.5mL/min (적색)으로 측정되었으며 응답 시간은 10분 미만으로 계산되었다. 유속 1mL/min (검은색) 및 10mL/min (파란색)의 경우 낮은 요소 농도 (0.6 및 1.2mM)에 대해 측정된 전류는 비례하지 않았다. 어쨌거나, UAP 막을 기반으로 한 요소 센서는 다른 유속에서 명확하게 농도 의존적인 전류값을 나타내었다. 실제 시료를 분석하기 위해 복막 투석 후 만성 신부전 환자에서 채취한 복강액을 사용하였다. 폐 복막 투석액 중의 요소 농도는 20mM로 계산되었다. 그리하여 모니터링용 시료를 만들기 위해 PBS로 희석하였다. 이 시료들을 유속 0.5mL/분으로 PDMS 챔버에 주입하고 시간대 전류측정법을 사용하여 모니터링하였다. 실제 시료 분석에서 최소 요소 농도는 1.2mM로 선택되었다. 도 7(b)와 같이, UAP 막을 기반으로 한 요소 센서는 실제 시료에 대한 농도 의존적인 전류값을 명확히 보여주었다. 요소 농도를 변화시키면 전류값이 즉시 변화하고 3분 이내에 안정화되었는데, 이는 유동 조건에서도 UAP 기반 요소 센서의 반응 시간이 3분임을 나타낸다. 이와 같은 빠른 반응은 생리적 유체에서 요소 농도를 실시간으로 효율적으로 모니터링할 수 있게 해준다. 요소 농도 (0.6-10mM)에 대한 전류값을 도 7(c)에 도시하였다. 모든 유속에서 결과는 R-square 값 (>0.99)의 양호한 선형성을 나타내었다. 0.5mL/min의 유속에서, PBS (■) 및 폐 복막 투석액 (▼)에서 검출 한계 (LOD)는 각각 0.6mM 및 1.2mM 미만이었다. 또한, 유속 1mL/min (●) 및 10mL/min (▲)에 해당하는 검출 한계는 동일하게 4mM였다. PBS에서 유속 0.5, 1 및 10mL/min에 해당하는 감도는 각각 4.05, 1.31 및 0.46mA·M-1·cm-2로 계산되었고 실제 시료 분석의 경우 감도 (▼)는 2.4mA·M-1·cm-2로 계산되었다. 그러나, 이 감도는 종래 보고된 것과 비교하여 유의하게 높지는 않았다. 어쨌거나, 이 값은 0.6-20mM 범위의 요소 농도를 모니터링하는데 적합하다고 생각된다. 또한, 유동 조건에서의 요소 농도의 측정방법은 현재까지 보고된 바 없다. 따라서 본 발명에서 얻은 민감도와 검출한계가 중요하다고 생각한다. 이러한 데이터로부터 유동 조건에서 적절한 감도로 작동하는, UAP 막을 기반으로 제작된 요소 바이오센서의 적용 가능성을 확인하였다. 본 발명의 바이오센서는 0.5mL/min의 낮은 유속에서 0.6-20mM의 농도 범위의 요소 모니터링에 사용할 수 있는 것으로 확인되었다. 1mL/min보다 높은 유속에서, 요소 바이오센서의 동작 범위 (dynamic range)는 4-20mM인 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명에서 제작된 요소 센서는 유동 조건에서 적절한 감도와 동작 범위로 생리학적 유체인 폐 복막 투석액에서 기능하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 요소 바이오센서는 외과 수술, 투석 또는 인공 신장을 유지하는 동안 요소 농도를 모니터링하는 데 적용 가능할 것으로 보인다.
결론
본 발명에서는 유동 조건에서 요소 농도를 모니터링하기 위해 파릴렌-A가 코팅된 다공성 PTFE 막을 기반으로 휴대용 요소 센서가 제작되었다. 파릴렌-A의 100 nm 두께 코팅을 기상 증착을 통해 다공성 PTFE 막에 적용하였다. 이 파릴렌-A 코팅은 다공성 PTFE 막의 표면을 아민기로 작용기화했다. 이 코팅은 비특이적 결합을 감소시킴으로써 노이즈를 감소시키는데 유리하며, 활성 아민기로 막 표면을 작용기화하여 형광현미경 관찰이 용이해지는 것으로 확인되었다. 요소 가수분해효소인 요소분해효소는 글루타르알데하이드 가교를 통해 AP 막에 고정화되어 특정 전기화학 신호를 생성한다. 요소분해효소 고정화 공정의 성공은 SEM 및 FTIR 분광법을 사용하여 측정되었다. 이러한 분석을 통해 UAP 막이 다공성 미세 구조를 가지고 있으며 요소분해효소가 화학 결합으로 표면에 고정되어 있음을 확인했다. 바이오 센서 제작을 위해 UAP 막을 PDMS 유체 챔버에 삽입했다. 스크린 인쇄된 탄소 전극 (시스템)을 사용하여 전위를 적용하고 전기화학적 신호를 검출하였다. 최대 신호 생성을 위해, 요소분해효소 활성 분석 및 전기화학적 측정 결과, 48mg/mL 요소분해효소를 처리하는 것이 최적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 요소 바이오센서에서 UAP 막의 개수를 달리하여 효과를 시험한 결과, 8개의 UAP 막 구성이 주어진 요소 농도에서 최대 전류를 나타내었다. 최적화된 조건하에서, 요소 시료를 다른 유속으로 흐르게 하면서 모니터링하였다. 0.5, 1 및 10mL/min의 유속에서 감도는 각각 4.05, 1.31 및 0.46mA·M-1·cm-2로 나타났다. 본 발명에서 제작된 요소 바이오센서는 0.5 내지 10mL/min의 유속에서 요소 실시간 모니터링에 적합한 것으로 확인되었다. 또한, 신부전증 환자의 체액을 유속 0.5mL/min에서 시험한 결과, 민감도는 2.4mA·M-1·cm-2로 계산되었다. 본 발명의 요소 센서는 바람직하게는 폭 4cm 미만, 길이 3cm 미만, 높이 2cm 미만으로서, 인공신장 및 휴대용 투석 시스템 등에 적용하기에 적합할 것으로 예상된다.

Claims (16)

  1. 전기 신호를 차단하지 않는 재질로 이루어진 유체 챔버;
    상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막;
    상기 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막에 근접하여 위치하며 상기 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용 전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템,
    상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및
    상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함하며, 흐르는 상태의 시료에 대하여 전기화학적 방법으로 요소 농도를 측정하는 휴대형 요소 바이오센서.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막은 글루타르알데하이드를 이용한 화학 가교결합으로 요소분해효소가 고정된 것임을 특징으로 하는 요소 바이오센서.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 불용성 다공성 막은 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료로 제조된 것임을 특징으로 하는 요소 바이오센서.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 유체 챔버와 상기 3-전극 시스템을 감싸는 하우징을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 요소 바이오센서.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 3-전극 시스템의 작용 전극은 아민화된 것임을 특징으로 하는 요소 바이오센서.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 3-전극 시스템은 외부의 전기화학 분석장치와 연결하여 유체 챔버 내의 전기화학 신호를 탐지하는 것을 특징으로 하는 요소 바이오센서.
  7. 아민 작용기화된 파릴렌 필름이 표면에 코팅된 단백질 고정용 불용성 다공성 막.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 불용성 다공성 막은 푸코이단, 콜라겐, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 생체 적합성 재료로 제조된 것임을 특징으로 하는 단백질 고정용 불용성 다공성 막.
  9. (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계; 및
    (2) 파릴렌 필름 증착 후, 파릴렌 필름 표면의 아민기를 가교제 글루타르알데하이드 용액으로 반응시켜 활성 알데하이드기로 전환하는 단계;를 포함하는 단백질 고정용 불용성 다공성 막 제조방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 (1) 단계는 진공 상태를 유지하며 진행함을 특징으로 하는 단백질 고정용 불용성 다공성 막 제조방법.
  11. (1) 아민 작용기화된 파릴렌 필름을 상온에서 불용성 다공성 막에 균일하게 증착시키는 단계;
    (2) 파릴렌 필름 증착 후 파릴렌 필름 표면의 아민기를 가교제 글루타르알데하이드 용액으로 반응시켜 활성 알데하이드기로 전환하는 단계; 및
    (3) 상기 파릴렌 필름 표면의 활성 알데하이드기와 유리 아민기를 가진 요소분해효소를 화학 반응시켜 요소분해효소를 불용성 다공성 막에 고정화하는 단계;를 포함하는 요소분해효소 고정 불용성 다공성 막 제조방법.
  12. 청구항 11의 방법으로 제조되며, 비특이적 반응의 감소로 요소 농도 측정시 노이즈를 낮추는 효과가 있는 요소 바이오센서용 요소분해효소 고정 불용성 다공성 막.
  13. 유체 챔버; 상기 유체 챔버 내에 위치하며, 요소분해효소가 화학결합에 의해 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막; 상기 불용성 다공성 막에 근접하여 위치하며 상기 불용성 다공성 막에서 발생하는 전기화학적 신호를 감지하는 작용 전극, 상대 전극 및 기준 전극을 포함하는 스크린 인쇄된 3-전극 시스템; 상기 유체 챔버 내로 흐르는 상태의 시료를 유입하는 시료 유입구; 및 상기 유체 챔버로부터 외부로 시료가 흘러나가는 시료 유출구;를 포함하는 휴대형 요소 바이오센서를 이용하여 전기화학적 방법으로 흐르는 상태의 시료 내 요소 농도를 측정하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 흐르는 상태의 시료는 0.5 내지 10mL/min의 유속으로 흐름을 특징으로 하는 요소 농도를 측정하는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 요소분해효소가 고정된 파릴렌-A 코팅 불용성 다공성 막은 6~10장을 포함함을 특징으로 하는 요소 농도를 측정하는 방법.
  16. 청구항 13에 있어서,
    상기 시료 내 요소 농도는 0.6-20mM의 범위임을 특징으로 하는 요소 농도를 측정하는 방법.
KR1020180129590A 2018-10-29 2018-10-29 유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서 Active KR102200170B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180129590A KR102200170B1 (ko) 2018-10-29 2018-10-29 유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서
US16/666,696 US20200129975A1 (en) 2018-10-29 2019-10-29 Parylene-a-coated insoluble porous membrane-based portable urea biosensor for use in flow conditions

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180129590A KR102200170B1 (ko) 2018-10-29 2018-10-29 유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200048005A true KR20200048005A (ko) 2020-05-08
KR102200170B1 KR102200170B1 (ko) 2021-01-07

Family

ID=70328002

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180129590A Active KR102200170B1 (ko) 2018-10-29 2018-10-29 유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20200129975A1 (ko)
KR (1) KR102200170B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI770655B (zh) * 2020-10-30 2022-07-11 國立雲林科技大學 可校正之尿素生醫感測裝置及其方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12227728B2 (en) 2021-01-26 2025-02-18 Applied Membrane Technology, Inc. Surface modified separation media
GB2621635A (en) * 2022-08-19 2024-02-21 Univ Stellenbosch An electrochemical lateral flow device
WO2024186834A2 (en) * 2023-03-06 2024-09-12 The University Of Chicago Field-effect transistor biosensors integrated with porous sensing membrane

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100114238A (ko) * 2009-04-15 2010-10-25 임현우 소수성과 친수성 표면을 이용한 생체분자 분석용 고감도 어레이 칩 및 이의 제조방법
US20150360195A1 (en) * 2010-04-14 2015-12-17 Cornell University Device for recovery and isolation of biomolecules
KR20170097800A (ko) * 2016-01-18 2017-08-29 한림대학교 산학협력단 요소분해효소 고정화 불용성 다공성 지지체를 이용한 휴대형 요소 센서 모듈

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100114238A (ko) * 2009-04-15 2010-10-25 임현우 소수성과 친수성 표면을 이용한 생체분자 분석용 고감도 어레이 칩 및 이의 제조방법
US20150360195A1 (en) * 2010-04-14 2015-12-17 Cornell University Device for recovery and isolation of biomolecules
KR20170097800A (ko) * 2016-01-18 2017-08-29 한림대학교 산학협력단 요소분해효소 고정화 불용성 다공성 지지체를 이용한 휴대형 요소 센서 모듈
KR101871781B1 (ko) 2016-01-18 2018-07-31 한림대학교 산학협력단 요소분해효소 고정화 불용성 다공성 지지체를 이용한 휴대형 요소 센서 모듈

Non-Patent Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Kaushik et al., Sensors Actuators B: Chem, 138(2009) 572-80.
A. Salimi et al., Biophys Chem, 125(2007) 540-8.
A.M. El Nahas et al., The Lancet, 365(2005) 331-40.
Biosensors and Bioelectronics, vol.30, pp.56-60 (2011)* *
D. Miller et al., Radiology, 167(1988) 607-11.
D.-C. Jin et al., Kidney research and clinical practice, 34(2015) 132-9.
D.C. Jin, Journal of the Korean Medical Association/Taehan Uisa Hyophoe Chi, 56(2013).
D.J. Polzin, Nephrology and urology of small animals, (2011) 431-71.
D.M. Williams et al., Arch Pediatr Adolesc Med, 156(2002) 893-900.
G. Dhawan et al., Biochem Eng J, 44(2009) 42-52.
G.K. Mishra et al., Appl Biochem Biotechnol, 174(2014) 998-1009.
H. Ko et al., Biosens Bioelectron, 30(2011) 56-60.
H.J. Chin et al., Korean J Med, 76(2009) 511-4.
J. Hong et al., BioChip Journal, 10(2016) 111-7.
K. Rafiq et al., Sensors Actuators B: Chem, 251(2017) 472-80.
K.-H. Kim et al., BioChip Journal, 10(2016) 272-6.
L. Narasimhan et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(2001) 4617-21.
L.A. Stevens et al., N Engl J Med, 354(2006) 2473-83.
M. Pokrzywnicka et al., Talanta, 160(2016) 233-40.
M. Singh et al., Sensors Actuators B: Chem, 134(2008) 345-51.
M. Tyagi et al., Biosens Bioelectron, 41(2013) 110-5.
N. Ohnishi et al., Sensors Actuators B: Chem, 144(2010) 146-52.
N.E. Dixon et al., J Am Chem Soc, 97(1975) 4131-3.
O.S. Wolfbeis et al., Biosens Bioelectron, 8(1993) 161-6.
P. Bataillard et al., Biosens Bioelectron, 8(1993) 89-98.
P. Bhatia et al., Sensors Actuators B: Chem, 161(2012) 434-8.
P.K. Dabla, World J Diabetes, 1(2010) 48.
R.C. Atkins et al., Kidney Int, 67(2005) S14-S8.
S.C. Palmer et al., JAMA, 305(2011) 1119-27.
S.-H. Lin et al., Am J Kidney Dis, 43(2004) 304-12.
Z. Yang et al., Biosens Bioelectron, 22(2007) 3283-7.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI770655B (zh) * 2020-10-30 2022-07-11 國立雲林科技大學 可校正之尿素生醫感測裝置及其方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102200170B1 (ko) 2021-01-07
US20200129975A1 (en) 2020-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102200170B1 (ko) 유동 조건에서 사용 가능한, 파릴렌-a 코팅된 불용성 다공성 막을 기반으로 하는 휴대용 요소 바이오센서
Qiao et al. A wearable electrochemical sensor based on anti-fouling and self-healing polypeptide complex hydrogels for sweat monitoring
Dhawan et al. Recent developments in urea biosensors
US6063637A (en) Sensors for sugars and other metal binding analytes
EP3749199B1 (en) Multilayer electrochemical analyte sensors and methods for making and using them
US20090198117A1 (en) Analyte sensors having nanostructured electrodes and methods for making and using them
Hamdan In vivo electrochemical biosensor for brain glutamate detection: A mini review
Tiwari et al. Chitosan-g-polyaniline: a creatine amidinohydrolase immobilization matrix for creatine biosensor
ES3038379T3 (en) Creatinine/creatine biosensors comprising outer membrane compositions
Fapyane et al. Urea biosensor based on a CO2 microsensor
Liu et al. Enzyme biosensors for point-of-care testing
CN111693588A (zh) 柔性可植入纤维状有机电化学晶体管及其制备方法
Li et al. Phospholipid bilayer integrated with multifunctional peptide for ultralow-fouling electrochemical detection of HER2 in human serum
Sun et al. Hemocompatible and antibiofouling PU-F127 nanospheres platform for application to glucose detection in whole blood
Rhemrev-Boom et al. On-line continuous monitoring of glucose or lactate by ultraslow microdialysis combined with a flow-through nanoliter biosensor based on poly (m-phenylenediamine) ultra-thin polymer membrane as enzyme electrode
Han et al. The design of anti-fouling and anti-hydrolysis cyclic peptides for accurate electrochemical antigen testing in human blood
KR102519720B1 (ko) 고효율로 고정화된 효소 고정용 다공성막 및 상기 효소 고정용 다공성막을 기반으로 하는 유동 조건에서 사용 가능한 휴대용 요소 바이오센서
KR101871781B1 (ko) 요소분해효소 고정화 불용성 다공성 지지체를 이용한 휴대형 요소 센서 모듈
Collins et al. Interference elimination in glutamate monitoring with chip integrated enzyme microreactors
Park et al. Parylene-Coated PTFE-Membrane-Based Portable Urea Sensor for Use in Fast Flow Conditions
Salem et al. Supramolecular host–guest carrier based on maltose-modified hyperbranched polymer and polyelectrolyte multilayers: toward stable and reusable glucose biosensor
KR101311776B1 (ko) 효소 및 자성나노입자가 집적된 미세튜브를 포함한 전해재 및 이를 이용한 온오프형 바이오센서 및 바이오연료전지
Han et al. Microchip-based organophosphorus detection using bienzyme bioelectrocatalysis
Liu et al. Amperometric oxygen biosensor based on hemoglobin encapsulated in nanosized grafted starch particles
Ramakrishna et al. Polymer nanofibers for biosensor applications

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

AMND Amendment
P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

St.27 status event code: N-2-6-B10-B15-exm-PE0601

AMND Amendment
E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PX0901 Re-examination

St.27 status event code: A-2-3-E10-E12-rex-PX0901

PX0701 Decision of registration after re-examination

St.27 status event code: A-3-4-F10-F13-rex-PX0701

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

U11 Full renewal or maintenance fee paid

Free format text: ST27 STATUS EVENT CODE: A-4-4-U10-U11-OTH-PR1001 (AS PROVIDED BY THE NATIONAL OFFICE)

Year of fee payment: 5