KR20200048076A - 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 - Google Patents

중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20200048076A
KR20200048076A KR1020180129751A KR20180129751A KR20200048076A KR 20200048076 A KR20200048076 A KR 20200048076A KR 1020180129751 A KR1020180129751 A KR 1020180129751A KR 20180129751 A KR20180129751 A KR 20180129751A KR 20200048076 A KR20200048076 A KR 20200048076A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
virus
sfts
kit
thrombocytopenia syndrome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020180129751A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102238561B1 (ko
Inventor
이형우
배윤희
Original Assignee
주식회사 스콜피오진
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 스콜피오진 filed Critical 주식회사 스콜피오진
Priority to KR1020180129751A priority Critical patent/KR102238561B1/ko
Publication of KR20200048076A publication Critical patent/KR20200048076A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102238561B1 publication Critical patent/KR102238561B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 질환에 대해 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스 감염 질환 진단용 키트{KIT FOR DIAGNOSING INFECTION DUE TO SEVERE FEVER WITH THROMBOCYTOPENIA SYNDROME VIRUS}
본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스 질환에 대해 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.
중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS; Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome)에 의한 심한 열병은 중국, 한국 및 일본에서 흔히 나타나는 신흥 바이러스 질환이다. SFTS에 대한 효과적인 백신이나 특정 치료법은 현재 제공되지 않고 있는 실정이다. SFTS는 고열, 구토, 설사, 혈소판감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다 (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011; 364:1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3).
또한, SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 생각된다 (Zhao L et al. Emerg Infect Dis 2013; 18: 963-5; Niu G et al. Emerg Infect Dis 2013; 19: 756-63).
한국 질병관리본부는 2015년에 중증열성혈소판감소증후군(SFTS) 바이러스에 감염된 환자를 돌보던 대학병원의 의사와 간호사들이 이 바이러스에 2차 감염된 것을 보고하였다. 최초 감염자가 진단된 2013년부터 2015년 7월까지 한국내에서 집계된 SFTS 확진환자는 총 122명이었으며 이중 40명이 사망한 것으로 알려지고 있다.
한편, 중국 공개 특허 공보 제102070704호는 SFTS 바이러스를 이용한 SFTS 바이러스 증폭 및 검출 키트를 개시하고 있다.
하지만, 본 발명자들은 보다 높은 정확도로 검출 가능하고 다양한 변이에 대응할 수 있는 서열의 SFTS에 대한 효과적인 진단용 키트를 고안하였다.
본 발명의 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome; SFTS) 바이러스에 의한 감염병을 진단하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스 질환의 원인 유전자 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스 질환의 진단 마커용 변이유전자를 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
재조합효소 중합효소 증폭(Recombinase polymerase amplification; RPA)은 핵산의 빠른 등온 증폭을 위한 방법이다. 일정한 온도에서 사용되는 효소와 단백질 (재조합효소, 단일 가닥 결합 단백질 및 가닥 이동성 DNA 중합효소(strand displacing DNA polymerase))의 특정 조합에 의존하여 증폭한다. 엑소-프로브를 통해 RPA 증폭산물의 실시간 검출이 가능하다. 형광 물질은 혼성화된 엑소-프로브의 내부 무염기 부위 유사체(abasic site mimic, 예를 들어 테트라하이드로퓨란 (THF)을 들 수 있다)에서 엑소뉴클레아제 III 절삭을 통한 형광단(fluorophore) 및 소광물질(quencher) 등을 사용할 수 있다. 형광 신호는 랩톱 (ESEQuant Tubescanner 장치, Qiagen Lake Constance GmbH, Stockach, Germany)을 포함하는 무게가 1.2kg인 현장 진단 스캐너를 통해 실시간으로 측정된다. 예를 들어, 비오틴 또는 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 역방향 프라이머를 사용하여 분석에 필요한 단계 수를 줄이기 위해 다른 표지 전략의 사용을 조사한 것이다. 사용된 증폭 온도를 최적화하고 표면 차단제를 사용하고자 한 방법이다. 이러한 변화의 조합은 1 * 10-15 M의 검출 한계 (LOD)를 낮추어 훨씬 더 신속한 증폭 및 검출 프로토콜을 용이하게 한 방법이다(J. Clin. Microbiol., 50 (2012), pp. 2234-2238).
역전사 재조합효소 중합효소 증폭 (reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)은 상기한 RPA 방법에서 역전사 효소를 첨가한 것이다.
본 명세서에 있어서, "프라이머(primer)"란 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스의 Segment M 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "프로브(probe)"란, 목적하는 유전자에 특이적으로 부착되어 목적 유전자를 확인 및/또는 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 광의의 개념이며, 바람직하게는 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스의 Segment M 유전자에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열 5'-GCCCCCCTCATTTCACATCCAACTCCT [FAM-dT] T [THF] C [BHQ-dT] GATGATTGGGCAGGT-[3-block] 또는 5'-TGTAAGCAAGGGAGCGGAAATATGAAGGAA [FAM-dT] G [THF] G [BHQ-dT] C ACAACTGGGAGGGC-[3'-block]의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 용이한 검출을 위한 표지를 하나 이상 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "키트(kit)"란 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스의 RNA를 증폭 및/또는 검출하여 SFTS 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, SFTS 바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 SFTS 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 SFTS 바이러스의 3D 유전자에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브 또는 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 또는 SFTS 바이러스 Segment M에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 형태일 수 있으나, SFTS 바이러스의 RNA를 증폭 및/또는 검출하여 SFTS 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "검출(detection)"이란 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 대상체의 바이러스 감염 여부를 판단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 바이러스의 단백질, 또는 RNA를 확인하여 바이러스 감염 여부를 확인하는 방법을 의미한다.
본 명세서에 있어서, "생물학적 시료(biological sample)"란 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스에 감염된 대상체에서 상기 바이러스의 단백질, 또는 RNA를 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 소변 등일 수 있으나, 상기 바이러스의 단백질, 또는 RNA를 확인할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 6에 대응하는 프라이머 염기쌍 또는 프로브를 포함하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 4 및 5이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 프로브는 5'-GCCCCCCTCATTTCACATCCAACTCCT [FAM-dT] T [THF] C [BHQ-dT] GATGATTGGGCAGGT-[3-block] 또는 5'-TGTAAGCAAGGGAGCGGAAATATGAAGGAA [FAM-dT] G [THF] G [BHQ-dT] C ACAACTGGGAGGGC-[3'-block]이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중증 열성 혈소판 감소 증후군은 SFTS 바이러스에 의한 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머 염기쌍은 검체 내의 SFTS 바이러스를 검출하는 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 검체는 진단 대상의 전혈, 혈장, 혈청 또는 작은소참진드기 중 하나이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 6에 대응하는 프로브 또는 프라이머 염기쌍을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, in-vitro에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브는 5'-GCCCCCCTCATTTCACATCCAACTCCT [FAM-dT] T [THF] C [BHQ-dT] GATGATTGGGCAGGT-[3-block] 또는 5'-TGTAAGCAAGGGAGCGGAAATATGAAGGAA [FAM-dT] G [THF] G [BHQ-dT] C ACAACTGGGAGGGC-[3'-block]이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 4 및 5이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 시료로 역전사 재조합효소 중합효소 증폭 (reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 RT-RPA 단계에서 반응 온도는 37℃ 내지 42℃이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 RT-RPA 단계에서 반응 시간은 5분 내지 20분이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 6에 따른 바이러스를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 아주번트를 추가로 포함하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 진단 키트는 개체에서 SFTS 바이러스 감염에 대하여 효과적이고 빠르게 검출 및 진단하여, SFTS 바이러스 감염에 대한 예방 및 치료 효과를 우수하게 하는 효과가 있다.
도 1은 SFTS 바이러스에 대한 프라이머 및 프로브의 효율을 평가한 그래프이다.
도 2는 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 실시한 이미지이다. 도 2의 A는 RT-PRA 산물을 5μl 로딩한 것이고, B는 RT-PRA 산물을 2.5μl 로딩한 것이며, C는 RT-PRA 산물을 1.0μl 로딩한 것이고, D는 RT-RPA 반응의 시약 조성을 나타낸다.
도 3은 다른 농도의 프라이머를 가지고 기본 RT 키트를 사용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 실시한 도면이다. 도 3의 A는 RT-PRA 산물을 1.0μl 로딩한 것이고, B는 RT-PRA 산물을 5.0μl 로딩한 것이며, C는 각각 프라이머를 10pM 첨가한 것의 조성을 나타내고, D는 각각 프라이머를 7pM 첨가한 것의 조성을 나타내며, E는 각각 프라이머를 3pM 첨가한 것의 조성을 나타내는 것이다. 겔 이미지에서의 짝수 번호 레인은 반응 혼합물에 SFTS DNA를 10pg 첨가한 것이고 홀수 번호 레인은 증류수만을 첨가한 것이다.
도 4는 반응 시간에 따라 기본 RT 키트를 이용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 비교한 것을 나타내는 도면이다. 도 4의 A는 RPA 반응에 의해 생성된 증폭산물을 아가로스겔 전기영동으로 확인한 것이다. 도 4의 B는 RT-RPA 반응의 조성 성분을 나타낸 것이다. 1.0μl의 RT-PRA 산물을 각 레인에 로딩하였다.
도 5는 반응 온도에 따라 기본 RT 키트를 이용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 비교한 것을 나타내는 도면이다. 도 5의 A는 각각 5℃ 내지 55℃의 온도 범위에서 20분간 실시한 것을 아가로스겔 전기영동으로 확인한 것이다. 도 5의 B는 각각 37℃에서부터 42℃의 온도 범위에서 실시한 것을 나타낸 것이다. 1.0μl의 RT-PRA 산물을 각 레인에 로딩하였다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: SFTS 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트
SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 하기에 정리하였다.
- 포워드 프라이머(서열번호 1)(본원에서 1891 F라고도 표기함) :
5'-ATCAACCTAAAATGTAAGAAGTCATCATCATATTT-3'
- 리버스 프라이머 (서열번호 2)(본원에서 2194 R이라고도 표기함) :
5'-CACATGGAGATACTTTCCAGATGATCCCATGTG-3'
- 프로브 (본원에서 38 P라고도 표기함) :
5'-GCCCCCCTCATTTCACATCCAACTCCT [FAM-dT] T [THF] C [BHQ-dT] GATGATTGGGCAGGT-[3-block]
실시예 2: SFTS 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트
SFTS 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 하기에 정리하였다.
- 포워드 프라이머(서열번호 4)(본원에서 1 F라고도 표기함) :
5'-TCGATGAGATGGTCCATGCTGATTCTAAACTTGTT-3'
- 리버스 프라이머 (서열번호 5)(본원에서 197 R이라고도 표기함) :
5'-TGCATTTCAGGTTAATCCTCTTAACTTTGATTTTG-3'
- 프로브 (본원에서 38 P라고도 표기함) :
5'-TGTAAGCAAGGGAGCGGAAATATGAAGGAA [FAM-dT] G [THF] G [BHQ-dT] C ACAACTGGGAGGGC-[3'-block]
본원 발명자들은 보다 높은 정확도로 SFTS에 대한 검출이 가능하고 다양한 변이에 대응할 수 있는 서열(실시예 1은 서열번호 3이고 실시예 2는 서열번호 6이다) 및 이의 서열을 포함하는 효과적인 진단용 키트를 고안하였다. 서열번호 3 또는 서열번호 6의 유전자를 0.01pg부터 10ng까지 연속 희석(serial dilution)하였다. EXO RT 키트 (TwistDx Co. UK)에 상기 프라이머 및 프로브를 혼합하여, 역전사 재조합효소 중합효소 증폭 (reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)을 실시하였다. 하지만, 상기한 키트에 한정되는 것은 아니다. 이 RT-RPA 반응은 T8 UV 스캐너 상에서 39℃에서 20분간 반응시켰다. RT-RPA 반응은 0.01 pg까지 희석한 SFTS 막 당단백질 유전자(membrane glycoprotein gene)를 잘 증폭하였다. 0.01 pg부터 10 ng까지 희석한 모든 샘플이 10분 이내에 양성반응을 보였다(도 1).
서열번호 3: ctcaaaatta aggttaagag gatcaaccta aaatgtaaga agtcatcatc atattttgtt cctgatgccc ggtccaggtg tacatcagtg aggagatgtc gttgggcagg agactgccag tctgggtgcc cccctcattt cacatccaac tccttttctg atgattgggc aggtaagatg gacagggctg gtctaggatt cagtggctgc tctgatggat gtggaggagc agcctgcggc tgctttaatg cggccccttc atgcatcttc tggaggaaat gggtagagaa tccacatggg atcatctgga aagtatctcc atgtgccgca tgggtcccat cagcagtcat
서열번호 6: gatgagatgg tccatgctga ttctaaactt gtttcgtgta agcaagggag cggaaatatg aaggaatgtg tcacaactgg gagggcgctc cttcctgcag tgaacccagg acaagaggca tgtctgcact tcacggcaca tgggagcccg gactcaaaat gtcacaaaat caaagttaag aggattaacc tgaaatg
실시예 3: RT-RPA 반응 혼합물 조성 및 반응 조건
기본 RT 키트를 사용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 실시하였다. SFTS는 0.0001 ng에서 10 ng으로 연속 희석하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 50 ㎕ 반응액 중에서 단 1 ㎕씩만 로딩하여도 충분히 육안으로 겔 상에서 관찰 가능하였다. 이로부터 20분 안에 충분한 RPA 증폭이 일어남을 알 수 있었다. RT-RPA 반응에 의해 생성된 증폭산물(amplicon)은 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다(도 2).
또한, 다른 농도의 프라이머를 가지고 기본 RT 키트를 사용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 실시하였다. RT-RPA 반응에 의해 생성된 증폭산물은 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다(도 3). 각각 개별적으로 RT-PRA 산물을 1.0μl(도 3의 A 참고), 및 5.0μl(도 3의 B 참고)를 로딩하였다. 각각 프라이머를 10pM, 7pM, 및 3pM로 변화시켜서 첨가하였다(도 3의 C 내지 E 참고). 도 3에서 나타낸 바와 같이, 겔 이미지에서의 짝수 번호 레인은 반응 혼합물에 SFTS DNA를 10pg 첨가한 것이고 홀수 번호 레인은 증류수만을 첨가한 것으로 표시하였다.
또한, 반응 시간에 따라 기본 RT 키트를 이용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 비교하였다. 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, RT-RPA 반응의 조성 성분을 준비하였다. 1.0μl의 RT-PRA 산물을 각 레인에 로딩하였다. RPA 반응에 의해 생성된 증폭산물을 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다(도 4의 A 참고). 기본 RT를 이용한 RT-RPA 반응은 시간이 5분 후부터 겔 상에서 증폭된 산물을 관찰할 수 있었다. 특히, 20분까지 반응시킨 샘플에서 가장 진한 밴드를 확인할 수 있었다.
또한, 반응 온도에 따라 기본 RT 키트를 이용하여 SFTS 바이러스를 검출하기 위한 RT-RPA 반응을 비교하였다. 도 5의 C에 나타낸 바와 같이, RT-RPA 반응의 조성 성분과 같이 준비하였다. 1.0μl의 RT-PRA 산물을 각 레인에 로딩하고, 각각 5℃ 내지 55℃의 온도 범위에서 20분간 실시하였다(도 5의 A). 온도가 35℃ 및 45℃인 레인에서 밴드를 확인할 수 있었다. 그 후에, 1.0μl의 RT-PRA 산물을 각 레인에 로딩하고, 각각 37℃ 내지 42℃의 온도 범위에서 20분간 다시 실시하였다(도 5의 B). 그 결과, RT-RPA반응은 5, 15, 25, 55℃에서는 반응하지 않았다. 그러나, 37℃에서부터 42℃까지는 RT-RPA반응에서 크게 차이는 보이지 않고, 모두 잘 반응한 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로, 본원에 따른 방법은 실시간 PCR기기, T8 UV 스캐너, 또는 T16 스캐너를 이용할 수 없는 실험실에서 활용가능하다는 장점이 있다. 온도가 37℃에서부터 42℃이고, 바람직하게는 39℃에서, 5분 이상, 바람직하게는 5분 내지 20분간 반응하면 0.1 pg까지의 유전자 샘플을 검출할 수 있을 것으로 기대되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Scorpiogen Co. <120> KIT FOR DIAGNOSING INFECTION DUE TO SEVERE FEVER WITH THROMBOCYTOPENIA SYNDROME VIRUS <130> PDPB187214 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 atcaacctaa aatgtaagaa gtcatcatca tattt 35 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 cacatggaga tactttccag atgatcccat gtg 33 <210> 3 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 ctcaaaatta aggttaagag gatcaaccta aaatgtaaga agtcatcatc atattttgtt 60 cctgatgccc ggtccaggtg tacatcagtg aggagatgtc gttgggcagg agactgccag 120 tctgggtgcc cccctcattt cacatccaac tccttttctg atgattgggc aggtaagatg 180 gacagggctg gtctaggatt cagtggctgc tctgatggat gtggaggagc agcctgcggc 240 tgctttaatg cggccccttc atgcatcttc tggaggaaat gggtagagaa tccacatggg 300 atcatctgga aagtatctcc atgtgccgca tgggtcccat cagcagtcat 350 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 tcgatgagat ggtccatgct gattctaaac ttgtt 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 tgcatttcag gttaatcctc ttaactttga ttttg 35 <210> 6 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 gatgagatgg tccatgctga ttctaaactt gtttcgtgta agcaagggag cggaaatatg 60 aaggaatgtg tcacaactgg gagggcgctc cttcctgcag tgaacccagg acaagaggca 120 tgtctgcact tcacggcaca tgggagcccg gactcaaaat gtcacaaaat caaagttaag 180 aggattaacc tgaaatg 197

Claims (14)

  1. 서열번호 3 또는 서열번호 6에 대응하는 프라이머 염기쌍 또는 프로브를 포함하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 진단 키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 4 및 5인, 진단 키트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 프로브는 5'-GCCCCCCTCATTTCACATCCAACTCCT [FAM-dT] T [THF] C [BHQ-dT] GATGATTGGGCAGGT-[3-block] 또는 5'-TGTAAGCAAGGGAGCGGAAATATGAAGGAA [FAM-dT] G [THF] G [BHQ-dT] C ACAACTGGGAGGGC-[3'-block]인, 진단 키트.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 중증 열성 혈소판 감소 증후군은 SFTS 바이러스에 의한 것인, 진단 키트.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 염기쌍은 검체 내의 SFTS 바이러스를 검출하는 것인, 진단 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 검체는 진단 대상의 전혈, 혈장, 혈청 또는 작은소참진드기 중 하나인, 진단 키트.
  7. 서열번호 3 또는 서열번호 6에 대응하는 프로브 또는 프라이머 염기쌍을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는, in-vitro에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 검출하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 프로브는 5'-GCCCCCCTCATTTCACATCCAACTCCT [FAM-dT] T [THF] C [BHQ-dT] GATGATTGGGCAGGT-[3-block] 또는 5'-TGTAAGCAAGGGAGCGGAAATATGAAGGAA [FAM-dT] G [THF] G [BHQ-dT] C ACAACTGGGAGGGC-[3'-block]인, 검출 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 4 및 5인, 검출 방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 시료로 역전사 재조합효소 중합효소 증폭 (reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA)하는 단계를 포함하는, 검출 방법.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 RT-RPA 단계에서 반응 온도는 37℃ 내지 42℃인, 검출 방법.
  12. 제 7항에 있어서,
    상기 RT-RPA 단계에서 반응 시간은 5분 내지 20분인, 검출 방법.
  13. 서열번호 3 또는 서열번호 6에 따른 바이러스를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물.
  14. 제 13에 있어서,
    상기 조성물은 아주번트를 추가로 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
KR1020180129751A 2018-10-29 2018-10-29 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트 Expired - Fee Related KR102238561B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180129751A KR102238561B1 (ko) 2018-10-29 2018-10-29 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180129751A KR102238561B1 (ko) 2018-10-29 2018-10-29 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200048076A true KR20200048076A (ko) 2020-05-08
KR102238561B1 KR102238561B1 (ko) 2021-04-12

Family

ID=70677485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180129751A Expired - Fee Related KR102238561B1 (ko) 2018-10-29 2018-10-29 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102238561B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220030408A (ko) * 2020-08-31 2022-03-11 고려대학교 산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 루프매개등온증폭반응 프라이머 세트
USD1009816S1 (en) * 2021-08-29 2024-01-02 Applied Materials, Inc. Collimator for a physical vapor deposition chamber

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150042419A (ko) * 2013-10-11 2015-04-21 서울대학교산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 sfts 진단 방법 및 키트
CN105296674A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 江苏省疾病预防控制中心 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150042419A (ko) * 2013-10-11 2015-04-21 서울대학교산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 sfts 진단 방법 및 키트
CN105296674A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 江苏省疾病预防控制中心 发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒及制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220030408A (ko) * 2020-08-31 2022-03-11 고려대학교 산학협력단 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 검출용 루프매개등온증폭반응 프라이머 세트
USD1009816S1 (en) * 2021-08-29 2024-01-02 Applied Materials, Inc. Collimator for a physical vapor deposition chamber

Also Published As

Publication number Publication date
KR102238561B1 (ko) 2021-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6258360B2 (ja) 抗生物質耐性細菌を検出するための方法およびキット
Mota et al. Recombinase polymerase amplification in the molecular diagnosis of microbiological targets and its applications
AU2002219707A1 (en) Testing endosymbiont cellular organelles and compounds identifiable therewith
CN102066573A (zh) 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应
JP2017530710A (ja) 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ
JPWO2017212904A1 (ja) 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法
KR102405994B1 (ko) 마이코플라스마 갈리셉티쿰의 야외주와 백신주를 동시에 구별하여 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출방법
JP2016019495A (ja) 核酸増幅法
JP2011083286A (ja) 核酸の迅速な検出方法
KR20090100950A (ko) 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법
US20160060684A1 (en) Rapid salmonella serotyping assay
KR102238561B1 (ko) 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 진단용 키트
US9932642B2 (en) Rapid Salmonella serotyping assay
US20040176584A1 (en) Methods for detecting, enumerating, quantifying, classifying and/or identifying total organismal DNA in a sample
Mohammed et al. Review on polymerase chain reaction and its diagnostic merit over conventional techniques in animal disease
KR20120031952A (ko) 개선된 병원체 검출 및 스크리닝
JP6226460B2 (ja) 核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ｄｎａチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法
KR20200048082A (ko) 쯔쯔가무시균 감염 질환 진단용 키트
KR101911017B1 (ko) 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법
RU2802929C1 (ru) Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок коронавируса кошек/вируса инфекционного перитонита кошек (FCoV, FIP)
JP6873903B2 (ja) 強毒型クロストリジウムディフィシル株の存在を検出するための方法
US10190176B2 (en) Primers, probes, and methods for mycobacterium tuberculosis specific diagnosis
JP2021023243A (ja) 異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、検査キット及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法
US20100311049A1 (en) PCR-Based Kit For Detecting Chlamydia Trachomatis and Nelsseria Gonorrhoeae
JP2018033377A (ja) 核酸検出方法、試薬およびキット

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

AMND Amendment
P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

St.27 status event code: N-2-6-B10-B15-exm-PE0601

X091 Application refused [patent]
T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

T13-X000 Administrative time limit extension granted

St.27 status event code: U-3-3-T10-T13-oth-X000

AMND Amendment
E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PX0901 Re-examination

St.27 status event code: A-2-3-E10-E12-rex-PX0901

PX0701 Decision of registration after re-examination

St.27 status event code: A-3-4-F10-F13-rex-PX0701

X701 Decision to grant (after re-examination)
R17-X000 Change to representative recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R17-oth-X000

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

PC1903 Unpaid annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U13-oth-PC1903

Not in force date: 20240406

Payment event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

PC1903 Unpaid annual fee

St.27 status event code: N-4-6-H10-H13-oth-PC1903

Ip right cessation event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

Not in force date: 20240406