KR20200050565A

KR20200050565A - 셀라멕틴을 포함하는 구충제 조성물

Info

Publication number: KR20200050565A
Application number: KR1020180133298A
Authority: KR
Inventors: 조진만; 김지희; 김율아; 김희원
Original assignee: 녹십자수의약품(주)
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: KR102188378B1

Abstract

본 발명은 셀라멕틴을 유효성분으로 포함하는 수의학적 구충제 조성물 및 이를 이용한 동물의 해충 또는 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 개 및 고양이를 포함하는 애완동물에 발생할 수 있는 다양한 기생충 감염 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 향이 첨가되어 기호성이 증진될 수 있다.

Description

셀라멕틴을 포함하는 구충제 조성물 {Antiparisitic Composition comprising selamectin}

본 발명은 셀라멕틴을 유효성분으로 포함하는 수의학적 구충제 조성물 및 이를 이용한 동물의 해충 또는 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

인간뿐만 아니라 애완동물, 예컨대 개 또는 고양이는 귀, 피부 및 구강 질환과 같은 다양한 질환을 가질 수 있으며, 애완동물의 이와 같은 질환은 주로 박테리아, 진균 또는 기생충에 의한 감염을 원인으로 하여 발생할 수 있다. 이와 같은 동물의 질환을 치료하기 위하여 항염증제, 진통제 또는 다른 약제와 병용되는 항생제, 항진균제 또는 살충제를 기반하는 치료를 수행한다.

이들 기생충은 벼룩 및 진드기와 같은 외부 기생충일 수 있고, 예를 들어 선충 또는 회충으로서 묘사되는 기생충 그룹에 의해 가장 빈번하게 발생하는 기생충증을 포함한, 내부 기생충일 수 있다. 이들 기생충은 돼지, 양, 말 및 소에서 심각한 경제적 손실을 초래할 뿐만 아니라, 반려 동물 (예를 들어, 고양이 및 개) 및 가금류에 영향을 미친다. 다른 기생충은 안실로스토마 (Ancylostoma), 네카토르 (Necator), 아스카리스 (Ascaris), 스트론길로이데스 (Strongyloides), 트리키넬라 (Trichinella), 카필라리아 (Capillaria), 톡소카라 (Toxocara), 톡사스카리스 (Toxascaris), 트리쿠리스 (Trichuris), 엔테로비우스 (Enterobius) 를 포함한, 동물 및 인간의 위장관에서 발생하는 것, 및 스트론길로이데스 (Strongyloides), 톡소카라 (Toxocara) 및 트리키넬라 (Trichinella) 의 사상충 및 장외 단계와 같은, 혈액 또는 다른 조직 및 기관에서 발견되는 기생충을 포함한다.

대표적인 기생충에 의한 감염은 심장사상충 (디로필라리아 임미티스(Dirofilariaimmitis)) 에 의한 감염을 들 수 있다. 심장사상충은 모기 물기를 통하여 숙주에서 숙주로 확산되는 기생 회충이다. 확정 숙주는 개이지만, 이는 고양이 및 다른 온혈 동물도 감염시킬 수 있다. 통상적으로 "심장사상충"으로 지칭되기는 하지만, 성충은 실제로는 대개 폐 동맥계 (폐동맥)에 서식하며, 동물의 건강에 대한 일차적 영향은 폐 혈관 및 조직에 대한 손상이다. 때때로, 성체 심장사상충은 우측 심장, 그리고 중증 감염에서는 심지어 대정맥까지 이동한다. 심장사상충 감염은 숙주에 심각한 질환을 초래할 수 있다.

심장사상충 감염은 비소계 화합물로 퇴치될 수 있는데 치료에 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 따라서, 주요 초점은 심장사상충 감염의 예방에 있다. 현재 심장사상충 예방은 전적으로 개, 고양이 또는 다른 온혈 동물에 대한 이베르멕틴, 목시덱틴 또는 밀베마이신 옥심과 같은 마크로시클릭 락톤의 연간 주기적 투여에 의해 수행되고 있다.

셀라멕틴 (Selamectin) 은 C₄₃H₆₃NO₁₁ 의 화학식을 갖는 분자량 769.96 의 물질로, 물에는 잘 녹지 않고 이소프로판올에 매우 잘 녹는 성질을 가지고 있다. 셀라멕틴은 도라멕틴 (Doramectin)의 반-합성 변형제인 한 단당류 옥심 유도체이며, 주로 글루탐산-매개 경로를 거쳐 신경원의 염소 통로의 투과성을 증가시킴으로써 표적 기생충의 근육 신경의 마비를 일으킨다. 포유동물에 있어서 염소 통로는 절지동물과 선충류의 것보다 아버멕틴에 대한 접촉성과 감수성이 낮기 때문에 이 계열의 약물은 넓은 치료 안전 영역을 지니고 있는 특징이 있다.

이와 같이 셀라멕틴은 개 및 고양이에서 문제되는 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로, 이를 보다 효과적으로 전달하고 동물 체내에서 그 약효를 발휘할 수 있도록 하는 새로운 제제에 대한 연구의 필요성이 있다.

본 발명자들은 셀라멕틴을 간편한 방법으로 투여하고, 이를 통해 대상 동물에서 혈청 중 셀라멕틴의 농도를 적절하게 유지하면서 빠른 초기 흡수율을 나타내는 제제에 대하여 연구하던 중, 본 발명의 제제를 이용하면 셀라멘틴이 적절한 약리동태 패턴을 나타내면서 약효를 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 셀라멕틴 (selamectin), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (Butylated hydroxytoluene), 포비돈 (povidone), 항료, 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르 (Diethylene Glycol Monoethyl Ether), DMSO 를 포함하는 수의학적 구충제 조성물 및 이를 이용한 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 셀라멕틴 (selamectin), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (Butylated hydroxytoluene), 포비돈 (povidone), 항료, 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르 (Diethylene Glycol Monoethyl Ether), DMSO 를 포함하는 수의학적 구충제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계; 를 포함하는 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 개 및 고양이를 포함하는 애완동물에 발생할 수 있는 다양한 기생충 감염 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 향이 첨가되어 기호성이 증진될 수 있다.

도 1은 비교실험군(실험군 A) 및 본 발명의 제제 (실험군 B) 를 나타낸 도이다.
도 2는 셀라멕틴의 검출한계 및 정량한계를 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (상단: 0.2ng/ml, 하단: 1.0ng/ml).
도 3 은 셀라멕틴의 LC-MS/MS 분석 조건 및 이에 따른 질량 스펙트럼을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4 는 무처치 개 혈청시료에 표준 물질을 첨가한 후 간섭물질이 생체 시료에 존재하지 않음을 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (상단: 간섭물질, 하단: 셀라멕틴).
도 5는 개 혈청시료 내 셀라멕틴 분석법 검증을 위하여 1 내지 1000ng/mL 셀라멕틴의 표준 곡선을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 개 혈청에서 셀라멕틴의 시간 농도 곡선의 변화를 LC-MS/MS 를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 셀라멕틴 (selamectin), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (Butylated hydroxytoluene), 포비돈 (povidone), 항료, 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르 (Diethylene Glycol Monoethyl Ether), DMSO 를 포함하는 수의학적 구충제 조성물에 관한 것이다.

상기 수의학적 구충제 조성물은 동물에 감염될 수 있는 다양한 해충 또는 기생충을 효과적으로 방제할 수 있으며, 특히 동물 투여 시 셀라멕틴의 효과가 나타날 수 있는 약물 동태를 나타내고, 빠른 초기 흡수가 가능하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 “셀라멕틴 (selamectin)”은 다음과 같은 화학식을 가지는 물질로 Streptomyces avermitilis 에서 생산된 도라멕틴의 반-합성 변형제이다.

[화학식 1]

셀라멕틴은 흰색 내지 거의 흰색의 분말 형태로 존재하며 물에 잘 녹지 않고 이소프로판올에 매우 잘 녹는다. 셀라멕틴은 몸안으로 흡수되면 혈류에 분포하고, 피지선에 축적되어 장기간 기생충에 대한 살충 능력을 발휘하는 농도로 존속할 수 있는 장점이 있다.

특히 본 발명의 조성을 갖는 수의학적 구충제 조성물을 이용하면, 초기 흡수율이 매우 높음과 동시에 벼룩, 이, 진드기, 응애, 위장관내 선충류 등을 아무런 부작용 없이 안전하게 방제, 예방할 수 있고, 효력이 약 30일간 지속될 수 있다.

본 발명에서는 유효성분인 셀라멕틴 외에 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (Butylated hydroxytoluene), 포비돈 (povidone), 항료, 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르 (Diethylene Glycol Monoethyl Ether), DMSO 를 더 포함하는 수의학적 구충제 조성물을 제공한다.

본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 시판되고 있는 조에티스의 셀라멕틴 구충제와 비교하여, 셀라멕틴을 동일한 양으로 포함할 수 있으나, 디프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 이소프로필 알코올을 포함하지 않는 차이점이 있다. 특히 본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 포비돈, 바람직하게는 포비돈 K30 및 DMSO 를 포함한다.

이와 같은 구성에 의하여 본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 시판 셀라멕틴 구충제와 비교하여, 피부 흡수 촉진 효과가 증가되고, 피부 부착력이 증대될 수 있다. 또한 이소프로필 알코올을 포함하지 않아, 사용시 거부감을 유발하는 알코올 냄새 문제를 해결하였다.

본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 셀라멕틴, 포비돈, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔을 100 내지 130: 30 내지 60: 1 의 중량비로 포함할 수 있으며, 예컨대 바람직하게는 제제 1mL 기준 셀라멕틴 120mg, 포비돈 50mg, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 1mg을 포함할 수 있다. 이 경우 DMSO 는 400mg 포함될 수 있으며, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르가 잔량으로 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 향료를 포함하여 기호성을 증진시킨 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 향료는 구충제 조성물에 사용가능한 것으로 알려진 모든 향료를 제한없이 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 향료가 라벤더, 시나몬, 세이지, 만다린, 티트리, 페퍼민트, 민트 및 레몬으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 향료일 수 있으며, 가장 바람직하게는 라벤더 향료가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 라벤더 향료가 본 발명의 조성물에 포함되는 경우, 이는 모기 기피 효과를 추가적으로 유도할 수 있다. 상기 향료는 제제 1mL 당 80 내지 120mg, 바람직하게는 100mg 포함될 수 있으며, 이와 같이 포함되더라도 유효성분인 셀라멕틴의 약물 동태에는 영향을 미치지 않고, 약물의 흡수를 방해하지 않을 뿐 아니라, 동물 및 사용자의 기호도를 증진시킬 수 있다.

본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 동물, 바람직하게는 애완 동물, 예컨대 개과 또는 고양이과의 동물의 기생충 또는 해충에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 개과 동물은 이에 제한되는 것은 아니나 개, 늑대, 너구리 및 여우일 수 있고, 고양이과 동물은 이에 제한되는 것은 아니나 사자, 표범, 치타, 고양이 및 호랑이일 수 있다.

본 발명의 수의학적 구충제 조성물은 내부 또는 외부 기생충 방제용일 수 있다.

본 발명에 있어 기생충은 내부 또는 외부 기생충, 이를 포함하는 해충을 모두 총칭하며, 내부 기생충은 숙주 신체 내에서 살고 있는 기생충, 바람직하게는 유충, 예컨대 흡충류, 촌충류 및 선충류 및 원생동물을 포함한다. 외부 기생충은 숙주의 피부를 통해 또는 피부 상에서 섭식하는 절지 동물문의 유기체, 바람직하게는 거미류, 곤충 및 갑각류일 수 있다. 예컨대 바람직한 거미류는 응애목일 수 있으며, 응애목의 참진드기 및 좀진드기일 수 있다. 또한, 바람직한 곤충은 깔따구, 벼룩, 모기, 쇠파리, 빈대 및 이를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 애완 동물, 예컨대 개 과 또는 고양이과의 동물의 상기 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하며, 특히 응애, 벼룩, 참진드기류, 진드기, 개선충, 회충, 위장관내 선충, 이 및 심장사상충으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기생충에 의한 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 기생충 감염 또는 이의 체내 침입에 의한 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계; 를 포함하는 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 동물에 치료적 유효량으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 특정 기생충 감염 또는 체내침입을 치료하거나, 특정 기생충 감염 또는 체내침입의 하나 이상의 증상을 약화시키거나, 개선시키거나, 또는 제거하거나, 또는 본 명세서에 기재된 특정 기생충 감염 또는 체내침입의 하나 이상의 증상의 개시를 예방하거나 또는 지연시키는 양으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적을 달성할 수 있는 한, 일반적인 투여 경로를 통하여 제한없이 투여될 수 있다. 즉 목적하는 방법에 따라 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비강내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경피, 내피 또는 경구 투여, 가장 바람직하게는 우수한 피부 흡수율을 바탕으로 하여 경피 또는 내피 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 캡슐, 환약, 정제, 분말, 로젠지, 츄(chew)(경질 및 연질), 다중 및 나노미립자, 겔, 고체 용액, 필름, 스프레이 또는 액체 형태에 의해 경구로 투여될 수 있다. 경구 제형은 추가로 하나 이상의 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글라이콜, N-메틸피롤리돈 또는 기타 피롤리돈, 젤라틴화 및 호화 전분, 프로필렌 글라이콜, 글라이세롤, 전분 글라이콜산나트륨, 메틸셀룰로스, 당(락토스, 덱스트로스, 만노스 등) 또는 적합한 식물성 오일, 및 하나 이상의 유화제, 향미제(예를 들어, 동물(돼지고기, 쇠고기, 돼지) 및 비동물 향미제(연기 및 기타 합성 향미제), 및/또는 현탁제를 추가로 포함한다. 액체 형태는 현탁액, 용액, 시럽, 물약 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 제형은 또한 고체의 재구성에 의해, 예를 들어 사쉐로부터 제조될 수 있다. 경구 물약은 보통 적합한 매질(예를 들어, 트라이에틸렌 글라이콜, 벤질 알코올 등) 중에 셀라멕틴을 용해시키거나 또는 현탁시킴으로써 제조된다. 본 발명의 조성물은 또한 식품 물질, 예를 들어 음식물 혼합물(조류 및 어류용 식품 펠렛)로 제형화될 수 있다. 보존제 및 항산화제(예를 들어, 벤조산나트륨, 뷰틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 뷰틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 시트르산 등)가 또한 제형에 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 피부 또는 점막에 국소로, 즉, 진피로 또는 경피로 투여될 수 있다. 이는 바람직한 투여 방법이고, 본 발명의 조성물이 이러한 제형, 예를 들어 액체 형태에 적합하게 되도록 개발하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위한 전형적인 제형은 푸어-온(pour-on), 스팟-온(spot-on), 멀티-스팟-온, 스트립-온(stripe-on), 콤브-온(comb-on), 롤-온(roll-on), 딥(dip), 스프레이, 무스, 샴푸, 분말 제형, 겔, 하이드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 산포제, 드레싱, 거품, 필름, 피부 패치, 웨이퍼, 이식물, 스펀지, 섬유, 밴드 및 마이크로 에멀전을 포함한다. 리포좀이 또한 담체로서 사용될 수 있다. 전형적인 담체는 알코올, 물, 미네랄 오일, 액체 페트롤라툼, 백색 페트롤라툼, 글라이세린, N-메틸 폼아마이드, 모노 및 다이글라이콜 에터(예를 들어, 다이에틸렌글라이콜 모노메틸 에터(DEGMME), 다이에틸렌글라이콜 모노에틸 에터(DEGMEE) 등), 폴리에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜 등을 포함하고, 침투 향상제가 본 발명의 조성물에 더 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 동물에게 0.01 내지 0.1mL/kg 으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 0.08mL/kg, 더욱 바람직하게는 0.05mL/kg를 1회 투여량으로 하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효성분인 셀라멕틴이 체내에 들어가 약 30일 동안 잔류하며 약효를 달성하도록 할 수 있으므로, 1개월 당 1회 내지 2회 투여되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1개월 당 1회 투여될 수 있다. 다만 본 발명의 조성물이 개의 참진드기류의 감염 예방과 치료를 위하여 사용되는 경우에는 2주 간격으로 2회 내지 4회, 바람직하게는 2주 간격으로 3회 투여될 수 있다.

체중에 따른 도포용량의 예시는 다음과 같다.

본 발명의 조성물 또는 제제는 직사광선을 피하여 실온 (1 내지 30℃) 에 밀폐하여 보관하는 것이 바람직하며, 제조일로부터 36개월 동안 함량이 유지되므로, 장기 보관하여 사용이 가능하다.

본 발명의 조성물은 동물에서 기생충 또는 해충 방제를 위한 목적의 다른 유효물질과 함께 또는 순차적으로 투여가 가능하며, 이에 따라 유리한 효과가 제공될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 셀라멕틴 투여 제형의 제조 및 투여 방법 설정

1.1 셀라멕틴 대조군

셀라멕틴 (시그마 알드리치, Lot no. BCBR7280V) 은 백색의 분말 형태이며, 769.96g/mol 의 분자량을 가진다. 본 실험에서는 시판 중인 셀라멕틴 제제와 동일한 조건으로 대조군을 설정하기 위하여 제제 1ml 중 셀라멕틴 120mg, 디프로필렌 글리콜 메틸 에테르 112.56mg, 이소프로필 알코올 613.64mg, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 0.8mg 을 포함하는 조성을 제조하였다. 제조된 셀라멕틴 대조군 조성은 미황색, 약한 점도의 맑은 액 특징을 나타내었다.

1.2 실험군 A, 실험군 B 의 제조

실험군 A 는 본제 1ml 중 셀라멕틴 120mg, 이소프로필 알코올 75mg, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 1mg, 포비돈 K30 50mg, 이소프로필 미리스테이트 100mg, 라벤더향 100mg, 잔량의 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르를 포함하는 조성으로 제조하였다. 제조된 실험군 A 의 조성은 미황색, 1.078의 비중, 맑은 액 특징을 나타내었다.

실험군 B 는 본제 1ml 중 셀라멕틴 120mg, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 1mg, 포비돈 K30 50mg, 라벤더향 100mg, DMSO 400mg, 잔량의 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르를 포함하는 조성으로 제조하였다. 제조된 실험군 A 의 조성은 미황색, 1.005의 비중, 맑은 액 특징을 나타내었다.

실험군 A 및 B 의 조성 및 이들의 물리 화학적 특징을 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 셀라멕틴 투여에 따른 생동성 분석

2.1 셀라멕틴 투여

시판 중인 셀라멕틴 제제와 동일한 조성을 가진 셀라멕틴 대조군과 실험군 A 및 실험군 B 를 동일한 용법, 용량으로 적용한 후 개 혈청 중 셀라멕틴의 농도 변화를 비교하여 생동성을 확인하였다. 셀라멕틴 대조군, 실험군 A 및 실험군 B는 양쪽 견갑골 사이의 목 부위 털을 헤쳐서 피부에 체중 kg 당 0.05mL 비율 (셀라멕틴으로 6mg) 으로 도포하였다.

투여 당시 대조군 시험군의 평균 체중은 12.45±3.07kg 이었으며, 대조 제품은 평균 0.62±0.15ml 용량으로 1회 도포하였다. 실험군 A 의 시험군의 평균 체중은 12.38±2.78kg 이었으며, 대조 제품은 평균 0.62±0.14ml 용량으로 1회 도포하였다. 실험군 B 의 시험군의 평균 체중은 11.23±1.37kg 이었으며, 대조 제품은 평균 0.56±0.07ml 용량으로 1회 도포하였다. 약물 투여 28일째까지 시험 기간 동안 모든 약물 처치군에서 구토, 피부 이상, 이상 행동 등 특이적인 임상 소견은 관찰되지 않았다.

구체적인 각 실험군에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

2.2 개 혈청 시료 채취

개의 혈청 내에 존재하는 셀라멕틴을 정량하기 위하여 전처리를 거친 후 LC-MS/MS 를 이용하여 분석하였다. 시료를 채취하기 위하여, 대조군, 실험군 A 및 실험군 B 를 개의 견갑골 사이 등 피부에 1회 도포한 각 실험군의 개 요골쪽 피부 정맥에서 도포 전, 도포 완료 후 2, 4, 8 시간 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 및 28일째에 혈액을 5mL 채취하여 항응고제가 처리되어 있지 않은 원심 분리관에 담고 3,000RPM 에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.

2.3 분석방법 검증

각 성분별 분석법의 정확성, 정밀성, 검량선의 상관계수, 검출 한계(LOD), 정량 한계(LOQ) 는 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

이동상 조제

본 분석에 사용한 이동상 조제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

셀라멕틴 (0.1% 포름산:아세토니트릴=40:60 v/v) 을 이용하였다. 이동상 A 는 1L 부피 플라스크에 증류수 900mL 을 채우고 1mL 포름산을 가한 후 눈금까지 증류수를 부어 제조하였다. 이동상 B 는 100% 아세토니트릴을 사용하였으며, 이동상 A 와 이동상 B 를 40:60 으로 사용하였다.

추출 용매 조제

추출용매는 다음과 같이 조제하였다.

1) 아세토니트릴

아세토니트릴 100% 를 사용하하였다.

2) 트리스 완충액

1L 부피 플라스크에 증류수를 900mL 채우고, 트리스 (염) 2.79g 과 Trizma HCl 4.44g 을 가한 후 눈금까지 증류수를 부어 조제하였다.

3) 아세토니트릴: 트리스 완충액 pH8 (30:70 v/v)

1L 부피 플라스크에 아세토니트릴 300mL 및 트리스 완충액 pH 8 용액 700mL 를 넣어 조제하였다.

4) 아세토니트릴: 증류수 (50:50 v/v)

1L 부피 플라스크에 아세토니트릴 500mL 및 증류수 500mL 를 넣어 조제하였다.

5) 아세토니트릴: 트리에틸아민 (99.9:0.1 v/v)

1L 부피 플라스크에서 아세토니트릴 900mL에 트리에틸아민 1mL 를 가한 후 눈금까지 아세토니트릴을 부어 조제하였다.

6) 아세토니트릴: 증류수: 3mM 암모늄포르메이트를 갖는 1% 포름산 (75:15:10 v/v/v)

1L 부피 플라스크에 증류수 900mL 를 채우고 포름산 10mL 및 암모늄포르메이트 189mg 을 가한 후 눈금까지 증류수를 부어 3mM 암모늄 포르메이트가 포함된 1% 포름산 용액을 제조하였다. 1L 부피 플라스크에 아세토니트릴 750mL, 증류수 150mL 및 3mM 암모늄포르메이트가 포함된 1% 포름산 용액 100mL 를 부어 조제하였다.

표준 용액 조제

1) 스톡 (stock) 용액 조제

셀라멕틴 표준 물질을 10.0mg 칭량하고 각각 아세토니트릴: 증류수: 3mM 암모늄포르메이트(75:15:10, v/v/v) 를 갖는 1% 포름산 용액 10mL 를 가하여 1000 ug/mL (1000ppm) 을 만든 후 냉장 보관하였다.

2) intermediate working solution 의 조제 (Pm-[I]-01 및 Pt-[I]-01)

스톡 용액 1mL 를 각각 아세토니트릴: 증류수: 3mM 암모늄포르메이트 (75:15:10, v/v/v) 용액 9mL 로 희석하여 최종 농도 100 ug/mL 로 조제하였다.

3) Working solution 의 조제

검량선 작성용 표준 용액과 Qc 시료의 농도는 스톡 용액 조제시 사용한 용매와 동일한 용매를 사용하여 표 2와 같은 농도로 조제하였다.

[표 2]

4) 검량선 시료 준비

표 3과 같은 농도가 되도록 무처치 개 혈청에 working 용액을 첨가하여 검량선 시료 및 QC 시료를 준비하였다.

[표 3]

시료의 전처리

냉동보관 중인 혈청을 해동 시킨 후 500uL 을 15mL 튜브에 담고, 3.5mL 아세토니트릴을 첨가한 후, 40℃ 에서 5분간 진탕한 뒤, 2,500RPM 으로 10분간 강하게 흔들어 주었다. 이후 3,500rpm 으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 15mL 튜브에 옮기고, 트리스 완충액 pH8 용액 5mL 을 첨가하고 정치하였다. Agilent Bond Elut C18 Cartridge에 아세토니트릴 5mL 과 아세토니트릴: 트리스 완충액 pH 8 (30:70, v/v) 용액 10mL 을 차례로 가하여 활성화 시킨 후 정치하고 있던 추출용액을 카트리지에 음압에서 통과시켰다. 이 후 아세토니트릴: 증류수 (50:50, v/v) 용액 10mL 로 세척하였으며, 아세토니트릴: 트리에틸아민 (99.9:0.1, v/v) 용액 10mL 로 용출시켰다. 용출액은 60℃에서 완전히 건고시킨 후, 아세토니트릴:트리에틸아민 (99.9:0.1, v/v) 용액 1mL 를 가하여 재분산시키고, 이 용액을 1.5mL 튜브에 다시 옮겨 담고 60℃에서 완전히 건고시킨 후 아세토니트릴:증류수:1% 포름산 (75:15:10, v/v/v) 용액 50uL 을 첨가한 후 2,500rpm 으로 강하게 흔들어 주었다. 제조된 용액을 바이알에 옮겼으며, 이 후 LC-MS/MS 로 분석하였다.

검출 한계(Limit of Detection, LOD ) 및 정량 한계 분석 (Limit of Quantitation, LOQ )

정확도(회수율)와 정밀도 (변이계수, CV) 를 산출하기 위하여 QC 시료를 이용하여 각 농도에 대하여 최소 3번의 시험을 실시하였다. 무처치 개 혈청 시료에 표준 물질을 첨가하고 전처리 과정을 거친 시료로 검량선을 작성하여 개 혈청에서 셀라멕틴을 정량하였고, 검출한계 (LOD) 는 측정값의 표준 편차로 S/N (Signal to Noise) 비율의 3배로, 정량한계 (LOQ) 는 S/N 비율의 10 배 이상의 농도로 계산하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2 에 나타낸 바와 같이, 셀라멕틴의 검출 한계는 0.2ng/ml, 정량한계는 1.0ng/ml 인 것을 확인하였다.

LC-MS/MS 분석 조건

질량 분석은 API 4000 MS/MS 시스템 (SCIEX, USA) 을 사용하였고, ESI (Electrospray Ionization)로 fragmentation 이 일어난 양성 이온은 MS/MS 모드로 검출하였다. 질량 분석기는 0.1% 포름산이 혼합된 아세토니트릴을 흘려줌으로써 최적화하였다. 사용한 LC-MS/MS 조건 및 이에 따른 셀라멕틴의 질량 스펙트럼 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이 셀라멕틴의 생성물 이온 (product ion)은 626.9 m/z 으로 확인되었다.

특이성 ( specificity)

무처치 개 혈청 시료에 표준 물질을 첨가하여 전처리한 후, 분석한 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 시험물질에 영향을 주는 간섭물질이 생체 시료 내에 존재하지 않는 것을 확인하였다.

정확도 및 정밀도 분석법 검증

무처치 개 혈청 시료에 각각의 농도가 되도록 표준 물질을 첨가하고 전처리하여 LC-MS/MS 로 분석한 결과를 도 5 및 표 4에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 표준 곡선의 수식은 y= 74.2x + 811 이었으며, 상관계수 (r²) 로 0.9998 매우 양호한 직선성을 확인하였다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 정확성을 나타내는 회수율은 76.96 내지 99.57% 였으며, 정밀성을 나타내는 변이 계수는 3.18% 내지 8.85% 인 것을 확인하였다.

[표 4]

상기와 같은 결과를 통해, 본 실험에서 사용한 분석법의 정확성과 정밀성이 모두 분석법으로 신뢰할 수 있는 수준임을 검증하였다.

2.4 혈중 셀라멕틴 농도 분석

개에게 셀라멕틴 제제 대조군, 실험군 A 및 실험군 B 를 각각의 투여군의 개의 견갑골 사이 목 피부에 체중 kg 당 셀라멕틴 6mg 가 되도록 1회 도포한 후, 2, 4, 8 시간 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 및 28 일째에 채혈한 혈청에서 셀라멕틴을 전처리를 거쳐 LC-MS/MS로 분석한 혈중 셀라멕틴의 함량을 분석하였다. 그 결과를 도 6 및 표 5 내지 표 8 에 나타내었다.

[표 5]

대조군 투여에 따른 혈청 셀라멕틴 농도

[표 6]

실험군 A 투여에 따른 혈청 셀라멕틴 농도

[표 7]

실험군 B 투여에 따른 혈청 셀라멕틴 농도

[표 8]

대조군, 실험군 A, 실험군 B의 혈중 셀라멕틴 농도 종합

도 6 및 표 5 내지 표 8 에 나타낸 바와 같이, 대조군 투여군은 1회 도포 후 2시간 째에 1.41±0.47ng/ml, 4시간 째에 7.28±6.58ng/ml, 8시간 째에 17.14±10.99ng/ml, 1일 째에 67.07±9.13ng/ml, 2일 째에 49.56±12.59ng/ml, 3일 째에 65.55±16.35ng/ml, 4일 째에 53.44±15.30ng/ml, 5일 째에 33.96±7.14ng/ml, 6일 째에 42.98±11.46ng/ml, 7일 째에 33.18±14.01ng/ml, 10일 째에 18.95±9.41ng/ml, 14일 째에 16.34±7.82ng/ml, 21일 째에 7.64±3.02ng/ml 및 28일 째에 4.59±3.96ng/ml 이 검출되었다.

또한 실험군 A 투여군은 1 회 도포 후 2시간 째에 206.91±170.06ng/ml, 4시간 째에 289.89±210.06ng/ml, 8시간 째에 410.58±159.47ng/ml, 1일 째에 320.19±83.54ng/ml, 2일 째에 124.79±26.08ng/ml, 3일 째에 66.94±16.29ng/ml, 4일 째에 32.62±9.17ng/ml, 5일 째에 25.18±7.30ng/ml, 6일 째에 21.46±6.09ng/ml, 7일 째에 23.02±12.52ng/ml, 10일 째에 7.88±1.43ng/ml, 14일 째에 6.62±4.25ng/ml, 21일 째에 2.05±0.36ng/ml 및 28일 째에 1.64±0.21ng/ml 이 검출되었다.

또한 실험군 B 투여군은 1 회 도포 후 2시간 째에 29.34±39.01ng/ml, 4시간 째에 42.48±47.50ng/ml, 8시간 째에 65.78±39.27ng/ml, 1일 째에 173.26±118.06ng/ml, 2일 째에 84.09±22.67ng/ml, 3일 째에 69.60±14.32ng/ml, 4일 째에 40.48±11.62ng/ml, 5일 째에 33.07±13.39ng/ml, 6일 째에 21.84±11.47ng/ml, 7일 째에 20.99±8.65ng/ml, 10일 째에 10.62±1.89ng/ml, 14일 째에 8.07±4.66ng/ml, 21일 째에 3.86±1.80ng/ml 및 28일 째에 2.14±0.81ng/ml 이 검출되었다.

2.5 셀라멕틴 약물 동태 분석

LC-MS/MS 를 이용하여 대조군, 실험군 A 및 실험군 B 셀라멕틴 제제의 약물 동태를 분석한 결과를 표 9 내지 표 12에 나타내었다.

[표 9]

대조군의 약물 동태 분석

[표 10]

실험군 A의 약물 동태 분석

[표 11]

실험군 B의 약물 동태 분석

[표 12]

대조군, 실험군 A, 실험군 B의 약물 동태 분석 종합

대조군에서 셀라멕틴의 혈중 최고 농도 도달시간 (T_max)은 36.00±24.00 시간이였으며, 혈중 최고 농도 (C_max) 는 72.38±12.94ng/ml 인 것을 확인하였다. 혈중 분포 용적 (AUC₍ _inf ₎) 은 15710.52±6617.12ng·h/ml 으로 나타났으며, 반감기 (T_1/2)는 170.49±61.86 시간인 것을 확인하였다.

실험군 A 투여군에서 셀라멕틴의 혈중 최고 농도 도달시간 (T_max) 은 4.50±2.52 시간이였으며, 혈중 최고 농도 (C_max) 는 713.56±485.77ng/ml 인 것을 확인하였다. 혈중 분포 용적 (AUC₍ _inf ₎) 은 22913.67±4323.83ng·h/ml 으로 나타났으며, 반감기 (T_1/ ₂)는 190.75±106.62 시간인 것을 확인하였다.

실험군 B 투여군에서 셀라멕틴의 혈중 최고 농도 도달시간 (T_max) 은 32.00±27.71 시간이였으며, 혈중 최고 농도 (C_max) 는 179.92±110.47ng/ml 인 것을 확인하였다. 혈중 분포 용적 (AUC₍ _inf ₎) 은 14019.08±3474.04ng·h/ml 으로 나타났으며, 반감기 (T_1/2)는 230.04±225.62 시간인 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 특히 실험군 B는 체내 분포율과 최대 농도 도달시간이 대조군과 유사하여 이와 유사한 약리동태 패턴을 나타내며, 초기 피부 흡수율은 높은 것을 확인하였다. 이는 실험군 B 의 조성에 의해 피부 흡수 촉진 효과가 증가되고, 피부 부착력이 증대될 수 있음을 보여주는 결과이다.

Claims

셀라멕틴 (selamectin), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔 (Butylated hydroxytoluene), 포비돈 (povidone), 항료, 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르 (Diethylene Glycol Monoethyl Ether), DMSO 를 포함하는 수의학적 구충제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 셀라멕틴, 포비돈, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔은 100 내지 130: 30 내지 60 : 1 의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 수의학적 구충제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항료는 라벤더, 시나몬, 세이지, 만다린, 티트리, 페퍼민트, 민트 및 레몬으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 향료인, 수의학적 구충제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 수의학적 구충제 조성물은 개과 동물 또는 고양이과 동물을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는, 수의학적 구충제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 구충제는 내부 또는 외부 기생충 방제용인 것을 특징으로 하는, 수의학적 구충제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 구충제는 응애, 벼룩, 참진드기류, 진드기, 개선충, 회충, 위장관내 선충, 이 및 심장사상충으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기생충에 의한 질병을 예방 또는 치료하는 것인, 수의학적 구충제 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계; 를 포함하는 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 투여는 경피 또는 경구 투여인, 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 0.01 내지 0.1mL/kg 으로 투여되는 것인, 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 1개월 당 1회 내지 2회 투여되는 것인, 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 기생충은 참진드기류이며, 상기 조성물은 2주 간격으로 2 내지 4회 투여되는 것인, 동물의 기생충에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법.