KR20200053501A - 알레르기성 기도 질환 (aad)/ 천식을 치료하는 방법 - Google Patents

알레르기성 기도 질환 (aad)/ 천식을 치료하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200053501A
KR20200053501A KR1020207007796A KR20207007796A KR20200053501A KR 20200053501 A KR20200053501 A KR 20200053501A KR 1020207007796 A KR1020207007796 A KR 1020207007796A KR 20207007796 A KR20207007796 A KR 20207007796A KR 20200053501 A KR20200053501 A KR 20200053501A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
msc
mca
cells
asthma
mir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020207007796A
Other languages
English (en)
Inventor
크리샨 사무엘
시몬 로이스
Original Assignee
시나타 세라퓨틱스 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2017903758A external-priority patent/AU2017903758A0/en
Application filed by 시나타 세라퓨틱스 엘티디 filed Critical 시나타 세라퓨틱스 엘티디
Publication of KR20200053501A publication Critical patent/KR20200053501A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 대상체에서 알레르기성 기도 질환 (AAD)/ 천식을 치료하기 위한 중간엽 혈관 모세포-유래된 중간엽 줄기세포 (MCA-MSC)의 용도에 관한 것이다.

Description

알레르기성 기도 질환 (AAD)/ 천식을 치료하는 방법
본 발명은 대상체에서 알레르기성 기도 질환 (allergic airways disease: AAD)/ 천식 (asthma)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
천식은 전 세계적으로 약 3 억 명의 사람들에게 영향을 미치는 만성 호흡기 질환으로, 연간 250,000 명의 사망을 초래하는 질환이다. 그의 병인에는 세 가지 주요 구성 요소가 있다: 기도 염증 (airway inflammation: AI); 기도 개형 (airway remodelling (AWR); 기도/ 폐의 구조적 변화를 나타내며, 이로 인해 최종적으로 기도 섬유증 (fibrosis) 및 폐쇄로 이어짐); 및 기도 과민성 (airway hyperresponsiveness (AHR); 천식의 임상적 특징). AWR은 지속적이거나 만성적인 AI로 인해 발생할 수 있을 뿐만 아니라, AI와는 독립적으로 AHR을 발생시키고 그 원인으로 작용할 수도 있다.
코르티코스테로이드 (corticosteroid) 또는 β-작용제 (β-agonist)를 포함한 현재의 천식 치료는 질환 퇴행보다는 증상 관리에 중점을 두기 때문에 완전히 효과적이지 않다. β-작용제-기반 요법으로 치료된 대상체는 천식 증상이 완화될 수 있지만, 근본적인 AI는 지속된다. 따라서, β-작용제를 만성적으로 사용해야 하는 대상체는 천식이 심각하게 악화되어 입원 및 사망으로 이어질 위험이 더 크다.
코르티코스테로이드의 금-표준 요법 (gold-standard therapy)은 또한 천식 대상체 중 중증 및 중증-난치성 하위 집단을 치료하는데 효과적이지 않다. 중증 천식 대상체는 종종 고용량의 코르티코스테로이드 치료를 필요로 하지만, 이는 전신 부작용과 관련될 수 있고, 폐 기능이나 삶의 질을 반드시 향상시키는 것은 아니다. 또한, 천식 대상체 중 중증 난치성 하위-집단은 고정된 기도 제한 (airway restriction)을 나타내어, 이 집단은 천식 증상의 일부인 AWR에 있어서 중요한 역할을 나타내는 바, AWR을 표적으로 하고 감소시킬 수 있는 치료 전략에 대한 긴급한 필요성이 강조된다.
중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell: MSC)는 다수의 세포 계통으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 다능성 기질 세포 (multipotent stromal cell)이다. 이들 세포는 주 조직 적합성 복합체의 클래스 I (MHC-I)을 발현하지만, MHC-II 및 보조-자극 분자인 CD80, CD86 및 CD40은 결여되어 면역학적 특권 (immunoprivileged)을 보유한다. 이와 같이, MSC는 정맥 내 (IV) 주입을 통해 전신으로 투여되어 광범위한 분포를 허용할 수 있다. IV 투여시, MSC는 폐에 축적된다. MSC는 또한 케모킨 수용체 타입 4 (chemokine receptor type 4)의 발현을 통해 손상된 조직을 복구하며, 이러한 발현은 천식에서와 같이 염증-유발 (pro-inflammatory) 환경에서 증가되어 이들의 복구 능력을 향상시킨다.
인간의 천식의 여러 특징을 모방한, 알레르기성 기도 질환 (AAD)의 뮤린 모델 (Murine model)은 MSC가 직접 세포간 (cell-cell) 접촉과 파라크린 (paracrine) 인자의 분비 모두를 통해 면역 조절 및 항-염증 (anti-inflammatory) 특성을 나타낸다는 것을 보여주기 위해 사용되었다. 외인성 MSC의 투여는 Th2 증식을 감소시키고 AAD의 원인이 되는 Th2 편향을 감소시키는 것으로 나타났다. 수지상 세포의 활성화, 이동 및 항원 제시의 억제가 관찰되었다. 호산구 (eosinophil)-관련된 염증-유발 사이토킨의 감소는 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid)에서 관찰되었다. AI를 억제하는 코르티코스테로이드와 비교하여, MSC는 이들 모델에서 염증을 담당하는 세포의 존재 및 활성을 능동적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
또한, MSC 치료는 기도에서 상피 두께, 평활근 증식 및 술잔 세포의 화생화 (goblet cell metaplasia)를 감소시키고 콜라겐-분해 젤라티나제 (collagen-degrading gelatinase) 수준을 촉진하는 능력을 통해 상피하 및 총 콜라겐의 침착 (섬유증)을 적당히 감소시키는 것으로 나타났고, 이는 MSC에도 개형-방지 작용 (anti-remodelling action)이 있음을 시사했다.
그러나, MSC는 만성 질환 설정과 관련된 유해 증상의 완화를 일관되게 입증하지 못했으며, MSC 치료의 결과는 그들의 조직 기원/ 소스, 배양 증식 정도, 공여체-의존성 생존력 및 효능, 및 그들의 투여 시기에 따라 달라질 수 있다.
또한, MSC는 제 2 치료제와 병용하여 투여될 때에만 유리한 효과를 나타내었다.
게다가, 각각의 공여체 기관 (donor organ)으로부터 비교적 적은 수의 MSC만이 단리될 수 있기 때문에, 실험 및 상업적 사용을 위해 충분한 수의 MSC의 단리를 촉진하기 위해 공여체의 지속적인 공급을 필요로 할 것이다.
임의의 선행 기술 간행물이 본 명세서에서 언급되는 경우, 그러한 참조 문헌은 간행물이 호주 또는 다른 국가에서 해당 기술 분야의 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것으로 인정되는 것은 아님을 이해하여야 한다.
제1 양상은 대상체에서 AAD/ 천식을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에 중간엽 혈관 모세포의 중간엽 줄기세포 (mesenchymoangioblast mesenchymal stem cell: MCA-MSC)를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 MCA-MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는다.
상기 제1 양상의 대안적 또는 추가적인 일 구체예는 대상체에서 AAD/ 천식 치료용 의약의 제조에 있어서 중간엽 혈관 모세포의 중간엽 줄기세포 (MCA-MSC)의 용도를 제공하며, 상기 MCA-MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는다.
상기 제1 양상의 추가적인 대체예 또는 추가적 구체예는 대상체에서 AAD/ 천식을 치료하는 방법에 사용하기 위한 중간엽 혈관 모세포의 중간엽 줄기세포 (MCA-MSC)를 제공하며, 상기 MCA-MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는다.
일 구체예에서, 상기 MCA-MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 갖는다.
일 구체예에서, 상기 MCA-MSC는 하기를 포함하는 방법에 의해 제조된다:
(a) LiCl 및 FGF2를 포함하지만, PDGF는 제외된 중간엽-콜로니 형성 배지 (M-CFM)에서 중간엽 콜로니가 형성되기에 충분한 시간 동안 정상산소 조건 하에서 원시 중배엽 세포 (primitive mesoderm cell)를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a)의 중간엽 콜로니를 부착 배양하여 MCA-MSC를 생성하는 단계.
일 구체예에서, 상기 MCA-MSC는 정맥 내 또는 비강 내로 투여된다. 일 구체예에서, 상기 MCA-MSC는 비강 내로 투여된다.
일 구체예에서, 치료는 약 1x106 내지 약 1x109 의 MCA-MSC를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 대상체는 포유류이다. 일 구체예에서, 상기 대상체는 인간이다.
일 구체예에서, 상기 대상체는 천식 치료를 위해 코르티코스테로이드 또는 β-작용제를 미리 투여받았다. 다른 일 구체예에서, 상기 대상체는 천식 치료를 위해 코르티코스테로이드 또는 β-작용제를 미리 투여받지 않았다.
일 구체예에서, 상기 대상체는 코르티코스테로이드 또는 β-작용제를 투여받지 않는다.
일 구체예에서, 상기 대상체는 중증 천식 또는 중증-난치성 천식을 갖는다.
일 구체예에서, AAD/ 천식 또는 이의 특징적 특성의 치료는 하기를 포함한다:
(a) AI, AWR, 기도 섬유증, 폐 섬유증, 술잔 세포의 화생화, 상피 비후, 기도 전환 성장 인자 (TGF)-β1의 수준, 상피하의 근섬유모세포 (myofibroblast)의 밀도, 상피하의 콜라겐 농도 또는 폐의 총 콜라겐 농도의 감소; 또는
(b) 폐 MMP (matrix metalloproteinase)의 활성 증가; 또는
(c) 상기 (a)의 임의의 하나 이상의 특징들의 조합 또는 상기 (a) 및 (b)의 임의의 하나 이상의 특징들의 조합.
AAD/ 천식 또는 이의 특징적 특성을 치료하기 위해 MCA-MSC를 사용하면 하기 비-제한적인 장점 중 하나 이상을 제공할 수 있다.
Figure pct00001
비정상적인 기도의 TGF-β1 수준, 기도/폐 섬유증 및 AHR의 완전한 역전이 일어나지 않더라도, 상당한 수준의 효과
Figure pct00002
콜라겐-분해 MMP 수준 증가
Figure pct00003
AAD/ 천식의 안전하고 효과적인 치료를 나타내는, 측정된 매개 변수의 기초 발현에 영향을 미치지 않음.
본 발명에 의해 제공된 해결 수단은 예상치 못한 것으로, 이전 연구에 따르면 줄기세포-기반 치료제를 항-섬유화 약물과 병용하여 투여할 때에만, 상피하 및 총 콜라겐 침착의 오브알부민 (ovalbumin, OVA)-유도된 촉진이 완전히 역전될 수 있다고 밝혀졌었기 때문이다. 따라서, 본 발명은 AAD/ 천식 치료에 있어서 상당한 개선을 제공한다.
도 1은 실시예 4에 따른 기관지 주변의 염증 점수 (peribronchial inflammation score)에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. A) 기도 상피층 내부 및 주위에 존재하는 기관지 벽 염증 세포의 침윤의 정도를 보여주는, 연구된 각 그룹으로부터 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin and eosin: H & E)-염색된 폐 단면의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 (Scale bar) = 50 μm. B) 또한, 5 개의 기도/마우스, n = 8 마리 마우스/그룹으로부터 염증 점수의 평균 ± 표준오차 값을 나타내며, 여기서 0 (뚜렷한 염증 없음) 내지 4 (중증의 염증)의 규모로 염증 응집체의 수 및 분포에 대해 상기 단면을 평가하였다. * p < 0.05, 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; OVA 그룹의 ### p < 0.001.
도 2는 실시예 4에 따른 술잔 세포의 화생화에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. A) 기도 상피층 내의 술잔 세포의 정도 (OVA-손상된 마우스에서만 화살표로 표시됨)를 보여주는, 연구된 각 그룹으로부터 알시안 블루 과요오드산 쉬프 (Alcian blue periodic acid Schiff: ABPAS)-염색된 폐 단면의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 25 μm. B) 또한 5 개의 기도/마우스, n = 8 마우스/그룹으로부터 술잔 세포의 수의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; ## p < 0.01, OVA 그룹의 ### p < 0.001.
도 3은 실시예 4에 따른 기도 상피 두께 및 상피하의 콜라겐 침착 (섬유증)에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. A) 기도 상피 두께 및 상피하의 콜라겐 두께의 정도 (청색 염색)를 보여주는, 연구된 각 그룹으로부터 마손 트리크롬 (masson trichrome)-염색된 폐 단면의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 50 μm. 또한, 5 개의 기도/마우스, n = 8 마우스/그룹으로부터의 기저막 (basement membrane: BM) 길이에 대한 B) 상피 두께 (μm2)의 평균 ± 표준오차 값 및 C) 상피하의 콜라겐 두께 (μm)의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; # p < 0.05, OVA 그룹의 ### p < 0.001; OVA MCA-MSC IV 그룹의 p < 0.05.
도 4는 실시예 4에 따른 총 폐 콜라겐 농도 (섬유증의 또 다른 측정)에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. 연구된 각 그룹으로부터 총 폐 콜라겐 농도 (폐 콜라겐 함량 %/건조 중량 조직)의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다; n = 8 마우스/그룹으로부터 마우스 당 두 번째로 큰 폐 엽 (lung lobe)에서 측정되었다. ** p < 0.01, 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; # p < 0.05, OVA 그룹의 ### p < 0.001; OVA MCA-MSC IV 그룹의 ¶¶ p < 0.05.
도 5는 실시예 4에 따른 기도 TGF-β1 (섬유화-유발 사이토킨: pro-fibrotic cytokine) 발현에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. A) 기도 상피층 내부 및 주위의 TGF-β1 염색/발현 정도를 보여주는, 연구된 각 그룹으로부터 면역조직화학 (IHC)-염색된 폐 단면의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 50 μm. B) 또한 5 개의 기도/마우스, n = 7-8 마우스/그룹으로부터 TGF-β1 염색 (%/필드로 표시됨)의 상대적인 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; OVA 그룹의 ### p < 0.001.
도 6은 실시예 4에 따른 상피하의 근섬유모세포 (핵심 섬유증-생성 세포)의 밀도에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. A) 기도 상피하 층 내에서 알파-SMA-염색된 근섬유모세포의 밀도의 정도 (화살표로 나타냄)를 보여주는, 연구된 각 그룹으로부터 IHC-염색된 폐 단면의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 25 μm. B) 또한 5 개의 기도/마우스, n = 7-8 마우스/그룹으로부터 근섬유모세포 (100μm BM 길이 당)의 수의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; # p < 0.05, OVA 그룹의 ### p < 0.001; OVA MCA-MSC IV 그룹의 p < 0.05.
도 7은 실시예 4에 따른 MMP-9 (콜라겐-분해 효소) 수준에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. A) 연구된 각 그룹에서 폐 MMP-9 (젤라티나제 B; 92 kDa) 및 MMP-13 (콜라게나제-3; ~55kDa)의 상대적 발현 수준을 보여주는 대표적인 젤라틴 자이모그래프 (zymograph). 각 경우에, 샘플 당 10 ㎍의 총 단백질을 분석을 위해 자이모그래프에 로딩하고; 그룹 당 5-6 개의 추가 샘플을 분석하는 별도의 자이모그래프는 유사한 결과를 나타내었다. B) 또한, n = 7-8 마우스/그룹으로부터 MMP-9 (암컷 Balb/c 마우스의 폐에서 가장 풍부하게 발현된 젤라티나제 임)의 광학 밀도 (optical density: OD)의 상대적인 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. * p < 0.05, ** p < 0.01, 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; OVA 그룹의 ### p < 0.001; OVA MCA-MSC IV 그룹의 p < 0.05.
도 8은 실시예 4에 따른 AHR에 대한 MCA-MSC의 효과를 보여준다. 기도 저항 (AHR의 변화를 반영함)은 분무된 메타콜린 (기관지 수축제; 또한 기저선으로부터의 저항 변화로서 표시됨)의 용량이 증가함에 따라 침습성 혈량측정법 (invasive plethysmography)을 통해 평가되었다. n = 7-8 마우스/그룹으로부터 시험된 메타콜린의 각 용량에 대한 기도 저항의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. * p < 0.05, 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; ## p < 0.01, OVA 그룹의 ### p < 0.001; OVA MCA-MSC IV 그룹의 ¶¶ p < 0.01.
도 9는 실시예 5 및 6의 만성 알레르기성 기도 질환 모델에 대한 도식화된 타임라인이다. 치료제를 64-78 일부터 투여한다 (폐 병리가 확립되어 진행 중인 경우).
도 10은 실시예 5에 따라 덱사메타손 (dexamethasone: DEX)이 보충된 MCA-MSC의 AHR에 대한 효과를 보여준다. 기도 저항 (AHR의 변화를 반영함)은 실시예 4에 따라 분무된 메타콜린 (기관지 수축제; 또한 기저선으로부터의 저항 변화로서 표시됨)의 용량이 증가함에 따라 침습성 혈량측정법을 통해 평가되었다. n = 6-8 마우스/그룹으로부터 시험된 각각의 메타콜린 용량에 대한 기도 저항의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. * p < 0.05, 식염수 (SAL) 그룹의 *** p < 0.001; # p < 0.05, OVA 그룹의 ### p < 0.001; OVA + DEX 그룹의 ¶¶ p < 0.01.
도 11은 실시예 6에 따라 비강 내 (IN) 대 정맥 내 (IV) 대 기관 내 (ET)로 투여된 MCA-MSC의 AHR에 대한 효과를 보여준다. 기도 저항 (AHR의 변화를 반영함)은 실시예 4에 따라 분무된 메타콜린 (기관지 수축제; 또한 기저선으로부터의 저항 변화로서 표시됨)의 용량이 증가함에 따라 침습성 혈량측정법을 통해 평가되었다. n = 6-8 마우스/그룹으로부터 시험된 각각의 메타콜린 용량에 대한 기도 저항의 평균 ± 표준오차 값을 나타낸다. ** p<0.01, 식염수-처리된 그룹의 *** p<0.001; OVA 그룹의 ## p<0.01.
기도 개형 (AWR)으로 알려진 구조적 변화는 만성/중증의 천식의 특징이 되고 폐 기능 장애의 원인이 된다. 일반적으로 천식은 코르티코스테로이드 및/또는 β-작용제로 관리된다.
본 발명은 MCA-MSC를 사용하여 대상체에서 천식을 치료하는 방법에 관한 것이며, 코르티코스테로이드 및/또는 β-작용제에 의한 천식 치료에 비해 개선되고, 다른 작용제와 병용한 MSC에 의한 제안된 치료에 비해 새로 개선된 것이다.
실시예 1 및 2는 인간의 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cells: iPSC)를 초기 클론 중내배엽성 전구 세포 (early clonal mesoendodermal precursor cell)의 한 부류인 중간엽 혈관 모세포 (mesenchymoangioblasts: MCA)로 알려진 전구 세포로, 이어서 중간엽 줄기세포 (MCA-MSC)로의 분화를 나타내었다. iPSC가 무한정으로 증식할 수 있고, MCA 자체는 매우 많은 양의 MSC로 증식될 수 있기 때문에, 충분한 MCA-MSC가 단일의 건강한 혈액 공여체로부터 유래된 iPSC의 단일 마스터 세포 은행 (single Master Cell Bank)로부터 획득될 수 있어, 일단 MSC가 형성되면 과도한 배양 증식의 필요 없이, 공여체-의존성 및 증식-의존적 변동성 및 비-표적 세포로부터의 오염이 제한된다.
본 개시 내용의 MCA-MSC는 본질적으로 무제한 공급의 이점 및 종래 기술의 MSC와 비교하여 개선된 면역 조절 효과의 추가 이점을 제공한다.
본 개시 내용에서, 특히 실시예 4 및 5에서, 이러한 MCA-MSC가 만성 AAD의 잘 확립된 뮤린 모델로 전달되었을 때 이의 치료 가능성을 조사하였다. 상기 AAD의 뮤린 모델은 인간 천식, AI, AWR 및 AHR의 3가지 중심 특징을 제시하며, 당 업계에서는 천식의 전-임상 모델 (pre-clinical model)로서 받아들여진다. 특히, MCA-MSC가 정맥 내로 (IV)-투여된 경우와 비강 내로 (IN)-투여된 경우에, 이의 개형-방지 (anti-remodelling) 효과를 비교하였다.
중요하게도, 일부 MSC가 천식 또는 그의 증상을 치료하는데 어느 정도의 효능을 나타내었을 수 있지만, 이러한 효과는 상기 MSC가 다른 치료제와 병용되어 사용될 때에만 수득되었다. 유리하게는, 본 발명은 병용 요법의 필요성을 회피한다.
천식
천식 및/또는 AAD는 임의의 조합으로 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: AI, AWR, AHR, 기도/ 폐 섬유증, 술잔 세포의 화생화, 상피 비후, 증가된 기도 전환 성장 인자 (TGF)-β1의 수준, 없거나 낮은 폐 MMP-9의 수준, 증가된 상피하의 근섬유모세포의 밀도, 상피하의 콜라겐의 축적 및 총 폐 콜라겐 축적.
따라서, 본 개시 내용의 MCA-MSC로 천식 및/또는 AAD를 치료하는 것은 임의의 조합으로 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 치료하는 것을 특징으로 할 수 있다: AI 감소, AWR 감소, 기도/ 폐 섬유증 감소, 술잔 세포의 화생화의 감소, 상피 비후 감소, 기도 전환 성장 인자 (TGF)-β1의 수준의 감소, 상피하의 근섬유모세포 및 콜라겐 감소 및 총 폐 콜라겐 농도 감소.
본 개시 내용의 MCA-MSC에 의한 AAD/ 천식의 치료는 MMP, 예를 들어 젤라티나제 및/또는 콜라게나제 (collagenase)의 발현/ 활성을 증가시킬 수 있다. 일 구체예에서, 상기 MMP는 MMP-9이다. 다른 구체예에서, 상기 MMP는 MMP13이다. 다른 구체예에서, 상기 MMP는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8 또는 MMP12이다.
중간엽 혈관 모세포-중간엽 줄기세포 (MCA-MSC)
따라서, 본 발명은 MCA-MSC를 투여함으로써 AAD/ 천식 또는 이의 특징적 특성 중 하나 이상에 대한 개선된 요법을 제공한다. MCA-MSC는 면역조절 특성을 통해 효과를 발휘하며 AAD/ 천식의 특징적 특성을 생성하는 부위에서 직접 작용할 수 있다.
MCA-MSC는 사이토킨, 케모킨 및 성장 인자와 같은 생물활성 분자를 분비하고 면역계를 조절하는 능력을 갖는다. MCA-MSC는 생착 (engraftment)에 의존하지 않고 면역계에 대한 재생 및 효과를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 다시 말해서, 상기 MCA-MSC 자체가 반드시 숙주인 대상체에 포함되는 것은 아니며, 그보다는 이들이 그 효과를 발휘한 후 짧은 시간 내에 제거된다. 그러나, MCA-MSC는 생착될 수 있다.
본 원에 사용된 "중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)" 또는 "MSC"는 골수 (bone marrow), 지방 조직 (fat), 태반 (placenta) 및 제대혈 (umbilical cord blood)을 포함하는 광범위한 조직으로부터 단리될 수 있는 특정 유형의 줄기세포를 지칭한다. 대안적으로, MSC는 만능성 줄기세포 (PSC)로부터 생산될 수 있다. MSC는 "중간엽 기질 세포 (mesenchymal stromal cell)" 로도 알려져 있다.
본 원에 사용된 "MCA-MSC"는 중간엽 혈관 모세포 표현형을 통해 iPSC로부터 생성된 특정 유형의 MSC를 지칭한다. PSC로부터 MCA-MSC의 생산은 2017 년 3 월 14 일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/AU2017/050228 에 기재되어 있으며, 이는 상호-참조에 의해 완전히 포함되어 있으며, 실시예 1 및 2에 기재되어 있다. MCA-MSC는 예를 들어 실시예 3에 나타낸 바와 같이 종래 기술의 MSC와는 구별된다.
MSC는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식 세포 및 자연 살해 세포에 대하여 면역 조절 활성을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 이론에 구속되지 않고, 기본 기전은 면역 조절 매개체, 예를 들어 산화질소, 인돌아민 2,3, 디옥시게나제 (dioxygenase), 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2), 종양 괴사 인자-유도성 유전자 6 단백질 (tumour necrosis factor-inducible gene 6 protein), CCL-2 및 프로그램된 사멸 리간드 1 (programmed death ligand 1)을 포함할 수 있다. 이들 매개체는 예를 들어 IFNγ, TNFα 및 IL-17과 같은 염증성 사이토킨에 의해 자극될 때까지 낮은 수준으로 발현된다.
본 원에 사용된, "만능성 줄기세포" 또는 "PSC"는 자신을 무한정으로 재생산하고 임의의 다른 세포 유형으로 분화하는 능력을 가진 세포를 지칭한다. PSC에는 2 가지 주요 유형이 있다: 배아 줄기세포 (embryonic stem cell: ESC); 및 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC).
본 원에 사용된 "배아 줄기세포 (embryonic stem cell)" 또는 "ESC"는 체외 수정 요법을 완료하고 여분의 배아를 보유한 대상체의 동의하에 기증된 5 내지 7 일 된 배아 (embryo)로부터 단리된 세포를 지칭한다. 인간 배아에서 세포를 추출하는 것에 대한 윤리적 우려로 인해 ESC의 사용은 어느 정도 제약이 있었다.
적합한 인간 PSC는 H1 및 H9 인간 배아 줄기세포 (human embryonic stem cell)를 포함한다.
본 원에 사용된, "유도 만능성 줄기세포" 또는 "iPSC"는 성체 세포로부터 유래된 ESC-유사 세포를 지칭한다. iPSC는 ESC와 매우 유사한 특성을 갖지만, iPSC는 배아로부터 유래되지 않기 때문에 ESC와 관련된 윤리적 문제를 피할 수 있다. 대신에, iPSC는 전형적으로 만능성 상태로 "재 프로그래밍된 (reprogrammed)" 완전히 분화된 성체 세포로부터 유래된다.
적합한 인간 iPSC는 섬유모세포로부터 유래된 iPSC 19-9-7T, MIRJT6i-mND1-4 및 MIRJT7i-mND2-0 및 골수 단핵 세포 (bone marrow mononuclear cell)로부터 유래된 iPSC BM119-9를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 iPSC는 미국 위스콘신주 매디슨의 CDI (Cellular Dynamics International)로부터 입수할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용되는 MCA-MSC는 원시 중배엽 세포로부터 형성된다. 상기 원시 중배엽 세포는 중간엽 혈관 모세포 (MCA)의 전위를 가질 수 있다. 상기 원시 중배엽 세포는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 표현형을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 MCA-MSC는 MCA 전위를 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+의 원시 중배엽 세포로부터 형성된다.
본 원에 사용된, “MCA 전위를 갖는 EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 원시 중배엽 세포"는 전형적인 원시선 (primitive streak) 및 측판 (lateral plate)/ 배외의 중배엽 유전자 (extraembryonic mesoderm gene)를 발현하는 세포를 지칭한다. 이들 세포는 섬유모세포 성장 인자 2 (fibroblast growth factor 2: FGF2)에 반응하여 무-혈청 배지 (serum-free medium)에서 MCA 및 혈관 모세포 (hemangioblast) 콜로니를 형성할 가능성을 갖는다. 실시예 2에 따라 배양될 때, 이들 세포는 MCA-MSC가 된다.
용어 EMHlin-은 CD31, VE-카드헤린 내피 마커, CD73 및 CD105 중간엽/ 내피 마커 및 CD43 및 CD45 조혈 마커의 발현의 결핍을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 MCA-MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 MCA-MSC는 각각의 마이크로 RNA인 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는다.
본 원에서 입증된 AAD/ 천식 치료에 대한 이들의 효과 외에, MCA-MSC는 인비트로에서 T 헬퍼 (CD4+) 림프구의 증식을 억제하는 MCA-MSC의 능력으로서 평가될 수 있는 "면역 조절 활성"을 보유한다. 면역 조절 활성은 예를 들어 면역 역가 분석법 (ImmunoPotency Assay)을 사용하여 결정된 바와 같이 인비트로에서 기준과 비교하여 정량화될 수 있다.
적합한 면역 역가 분석법은 본 원에 개시된 방법에 따라 생성되어 조사된 MCA-MSC 및 조사된 기준 샘플 MSC를 사용하며, 이는 건강한 공여체의 말초 혈액 (peripheral blood)으로부터 정제된 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르-표지된 백혈구와 함께 다양한 농도로 개별적으로 플레이팅된다. 기준 샘플의 서브 세트를 나타내는 T 헬퍼 (CD4+) 림프구는 CD3 및 CD28 항체를 첨가함으로써 자극된다. CD4로 표지된 T 세포는 T 세포 증식을 평가하기 위해 유세포 분석법 (flow cytometry)을 사용하여 나열된다. IC50 값은 기준 샘플의 함수 (function)로 기록된다. IC50 값이 커지면 T 헬퍼 (CD4+) 림프구의 증식 억제 크기가 더 커지는 것을 나타내며, 따라서 우수한 T-세포 면역 조절 특성을 나타낸다. 증식 가능성의 혼란 요인을 제거하기 위하여 이 분석법을 사용하기 전에 MSC 샘플은 조사된다.
MCA-MSC를 이용한 AAD/ 천식의 치료
대상체에서 AAD/ 천식을 치료하기 위한 치료적 유효량의 MCA-MSC를 상기 대상체에게 투여하는 정확한 방식은 의료인의 재량에 달려있다는 것은 당업자들에 의해 인정되어진다. 투여량, 다른 활성제와의 병용, 투여 시기 및 빈도 등을 포함하는 투여 방식은 대상체의 병태 및 병력에 의해 영향을 받을 수 있다.
상기 MCA-MSC가 AAD/ 천식 또는 그의 특징적 특성을 치료하기 위해 단독으로 사용될 수 있다는 것이 본 발명의 이점이지만, MCA-MSC는 다른 천식 요법과 조합될 수 있다는 것이 인정되어진다. 예를 들어, 의료인은 천식 대상자가 코르티코스테로이드 또는 β-작용제 요법을 포함하는 기존의 천식 치료 요법을 갖는 경우 다른 천식 요법으로 천식 대상자를 치료할 수 있고, 그에 이어서 MCA-MSC에 의한 치료를 수행할 수 있다.
상기 MCA-MSC는 치료용 조성물로서 투여될 수 있다. 본 원에 사용된 용어 "치료용 조성물 (therapeutic composition)"은 대상체에게 투여하기 위해 제제화된, 본 원에 기재된 바와 같은 MCA-MSC 또는 MCA-MSC 집단을 포함하는 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 치료용 조성물은 멸균의 상태이다. 일 구체예에서, 상기 치료용 조성물은 발열원이 없다 (pyrogen-free).
일 구체예에서, 상기 MCA-MSC 또는 치료용 조성물은 용기, 바람직하게는 멸균 용기, 바람직하게는 무-발열원 용기에 제공된다. 일 구체예에서, 상기 용기는, 예를 들어 볼루스 투여 (bolus administration)에 적합한 주사기이다. 다른 구체예에서, 상기 용기는 주입에 적합한 주입 백이다. 다른 구체예에서, 상기 용기는 IN 투여에 적합하다.
상기 MCA-MSC는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요인에는 치료될 특정 유형의 장애 및 예상되는 부작용 또는 증상, 치료할 특정 대상, 대상의 임상 상태, 투여 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료인에게 알려진 다른 요인들을 포함한다. 투여될 MCA-MSC의 치료적 유효량은 이러한 고려 사항에 의해 결정될 것이다.
MCA-MSC의 용량은 약 103 세포/m2 내지 약 1011　세포/m2의 범위, 예를 들어 약 106 세포/m2 내지 약 2x108 세포/m2의 범위, 또는 약 103 세포/m2, 약 5x103 세포/m2, 약 104 세포/m2, 약 5x104 세포/m2, 약 105 세포/m2, 약 5x105 세포/m2, 약 106　세포/m2, 약 5x106 세포/m2, 약 107 세포/m2, 약 5x107　세포/m2, 약 108 세포/m2 약 5x108 세포/m2, 약 109　세포/m2, 약 5x109 세포/m2, 약 1010 세포/m2, 약 5x1010　세포/m2, 또는 약 1011　세포/m2일 수 있다.
MCA-MSC의 용량은 약 103 세포/kg 내지 1011 세포/kg의 범위, 예를 들어 약 106 세포/kg 내지 약 2x108 세포/kg의 범위, 또는 약 103 세포/kg, 약 5x103 세포/kg, 약 104 세포/kg, 약 5x104 세포/kg, 약 105 세포/kg, 약 5x105 세포/kg, 약 106 세포/kg, 약 5x106 세포/kg, 약 107 세포/kg, 약 5x107 세포/kg, 약 108 세포/kg, 약 5x108 세포/kg, 약 109 세포/kg, 약 5x109 세포/kg, 약 1010 세포/kg, 약 5x1010 세포/kg, 또는 약 1011 세포/kg일 수 있다.
MCA-MSC의 용량은 약 103 세포 내지 약 1011 세포의 범위, 예를 들어 약 106 세포 내지 약 2x108 세포의 범위, 또는 약 103 세포, 약 5x103 세포, 약 104 세포, 약 5x104 세포, 약 105 세포, 약 5x105 세포, 약 106 세포, 약 5x106 세포, 약 107 세포, 약 5x107 세포, 약 108 세포, 약 5x108 세포, 약 109 세포, 약 5x109 세포, 약 1010 세포, 약 5x1010 세포, 또는 약 1011 세포일 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 치료하기에 효과적인 MCA-MSC의 양을 지칭한다.
상기 MCA-MSC는 단일 용량, 분할 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 분할 용량은 대상체의 콧구멍 사이에서, 구체적으로 콧구멍 당 용량의 약 절반으로 투여될 수 있다.
대상체에게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 회 용량의 MCA-MSC를 투여할 수 있다.
대상체에게 1 주일, 2 주일, 1 개월 또는 2 개월 간격으로 2 회 이상의 용량의 MCA-MSC를 투여할 수 있다. 예를 들어, AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성이 MCA-MSC로 이미 치료된 대상체에서 재발하는 경우에는 재발 시점 또는 이후에 분기별, 반기별, 매년, 2 년마다 또는 더 큰 간격으로, 2 회 이상의 용량의 MCA-MSC를 대상체에게 투여할 수 있다.
MCA-MSC는 임의의 적절한 경로, 예를 들어 정맥 내 (IV), 비강 내 (IN), 기관 내, 폐 내 및 동맥 내를 포함하는 경로에 의해 전신으로 또는 말초로 투여 될 수 있다. 일 구체예에서, MCA-MSC는 IV, IN, 기관 내 또는 폐 내 경로로 투여된다. 일 구체예에서, MCA-MSC는 IN으로 투여된다.
일 구체예에서, MCA-MSC는 투여 전에 전-처리 된다. 전-처리는 성장 인자를 사용하거나 유전자 편집 (gene editing)을 통해 이루어질 수 있으며, 예를 들어 성장 인자는 MCA-MSC를 프라이밍 (prime)할 수 있고 유전자 편집은 MCA-MSC에 새로운 치료 특성을 부여할 수 있다.
상기 MCA-MSC는 대상체에 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성이 발병하기 전, 진행 중 또는 발병 후에 상기 대상체에게 투여될 수 있다.
따라서, "치료하다”, “치료하는” 또는 “치료”라는 용어는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 모두를 지칭하며, 여기서 목표는 대상체에서 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 예방, 감소 또는 개선하거나, 또는 대상체에서 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성의 진행을 지연 (약화)시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 갖는 대상체뿐만 아니라 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성이 예방 또는 개선되어야 하는 대상체를 포함한다.
"예방하는", "예방", "방지적" 또는 "예방적"이라는 용어는 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성의 발생을 막거나, 발생을 방해하거나, AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성의 발생으로부터 방어 또는 보호하는 것을 지칭한다. AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성의 예방을 필요로 하는 대상체는, 예를 들어 가족력 때문에 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성이 발생하기 쉬울 수 있다.
용어 "개선하다" 또는 "개선"은 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성의 감소, 저하 또는 제거를 지칭한다.
MCA-MSC를 투여하여 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 치료하면 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성이 약 1 % 감소, 약 2 %, 약 3 %, 약 4 %, 약 5 %, 약 6 %, 약 7 %, 약 8 %, 약 9 %, 약 10 %, 약 15 %, 약 20 %, 약 25 %, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 %, 약 55 %, 약 60 %, 약 65 %, 약 70 %, 약 75 %, 약 80 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 99 %, 또는 약 100 % 감소될 수 있다.
일 구체예에서, MCA-MSC를 투여함으로써 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 치료하여 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성이 없는 대상체와 동등한 수준으로 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 감소시킬 수 있다.
당업자는 본 실시예에 제시된 방법을 사용하여 어려움 또는 과도한 부담 없이 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 평가 및 정량화하는 방법 및 이를 수행하는 방법을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들어, 하기와 같이 정량화될 수 있다: i) AI의 척도로서 염증 점수; ii) AI-유도된 AWR의 척도로서 술잔 세포의 화생화; iii) AWR의 척도로서 상피 두께; iv) AWR/ 섬유증의 척도로서 상피하의 콜라겐 두께; v) AWR/ 섬유증의 척도로서 총 폐 콜라겐 농도; vi) AWR의 척도로서 상피 TGF-β1 염색; vii) AWR의 척도로서 상피하의 근섬유모세포의 밀도; viii) AWR의 척도로서 젤라티나제 (예: MMP-2 및/또는 MMP-9) 및/또는 콜라게나제 (예: MMP-1 및/또는 MMP-13) 발현/ 활성; 및/또는 ix) 폐 기능 및 AHR의 척도로서 기도 과민성/ 반응성.
AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성의 임의의 정량화는 대조군, 예를 들어 AAD/ 천식이나 그의 특징적인 특성이 없는 건강한 대조군 대상체 또는 건강한 대조군 대상체의 집단과 비교될 수 있다. 대안적으로, 상기 대조군은 AAD/ 천식 또는 이의 특징적인 특성을 갖고 MCA-MSC로 치료 및 이에 반응하는 대조군 대상체 또는 대조군 대상체의 집단일 수 있다.
본 원에 사용된 용어 "대상체"는 포유류를 지칭할 수 있다. 상기 포유류는 영장류, 특히 인간일 수 있거나, 또한 가축, 동물원 동물 또는 반려동물일 수 있다. 본 원에 개시된 방법이 인간의 의학적 치료에 적합하다는 것이 특히 고려되지만, 말, 소 및 양과 같은 가축, 개 및 고양이와 같은 반려동물 또는 고양잇과, 갯과, 솟과 및 유제류 동물과 같은 동물원 동물의 치료를 포함하는 수의학적 치료에도 적용 가능하다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 원에 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며 공개된 문헌을 참조한다.
용어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 그 이상을 지칭하며, 예를 들어 "a MCA-MSC"는 하나 또는 그 이상의 MCA-MSC를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a" 또는 "an", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 설명 및 하기의 청구범위에서, 언어의 표현 또는 필요한 함축적 의미로 인해 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, "포함하다" 또는 "포함한" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로 사용되며, 즉 언급된 특징의 존재를 명시하지만 본 발명의 다양한 구체예에서 추가적인 특징의 존재 또는 부가를 배제하지는 않는다.
본 원에 사용된 용어 "약"은 주어진 수에 대한 값의 범위를 그 수의 크기의 ± 25 % 로 고려한다. 다른 구체예에서, 용어 "약"은 주어진 수에 대한 값의 범위를 그 수의 크기의 ± 20 %, ± 15 %, ± 10 % 또는 ± 5 % 로 고려한다. 예를 들어, 일 구체예에서, "약 3 그램"은 2.7 그램 내지 3.3 그램 (즉, 3 그램 ± 10 %)의 값을 나타낸다.
유사하게, 이벤트의 시기 또는 기간은 적어도 25 % 만큼 가변될 수 있다. 예를 들어, 특정 이벤트가 일 구체예에서 하루 동안 지속되는 것으로 개시될 수 있지만, 상기 이벤트는 하루보다 길거나 또는 짧게 지속될 수 있다. 예를 들어, "1 일"은 약 18 시간 내지 약 30 시간의 기간을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 기간은 그 기간의 ± 20 %, ± 15 %, ± 10 % 또는 ± 5 % 만큼 가변될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하는데 도움이 되며, 이러한 실시예에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1. MCA-MSC 생성용 시약
시약
설명 제조사 / 제품번호 (Cat #) 또는
참조 번호 (Ref #)
DMEM/F12 기본 배지 인비트로젠 (Invitrogen) / A1516901
E8 보충제 인비트로젠 / A1517101
비트로넥틴 라이프 테크놀로지 (Life Technologies) / A14700
콜라겐 IV 시그마 (Sigma) / C5533
H-1152 ROCK 억제제 EMD 밀리포아 (EMD Millipore) / 555550
Y27632 디히드로클로라이드 ROCK 억제제 토크리스 (Tocris) / 1254
FGF2 와이즈만 바이오매뉴팩처링 (Waisman Biomanufacturing) / WC-FGF2-FP
인간 내피-SFM 라이프 테크놀로지 / 11111-044
stemline II 조혈 줄기세포 증식 배지 시그마 / S0192
글루타맥스 인비트로젠 / 35050-061
인슐린 시그마 / I9278
리튬 클로라이드 (LiCl) 시그마 / L4408
콜라겐 I 용액 시그마 / C2249
피브로넥틴 라이프 테크놀로지 / 33016-015
DMEM/F12 인비트로젠 / 11330032
재조합 인간 BMP4 페프로텍 (Peprotech) / 120-05ET
액티빈 A 페프로텍 / 120-14E
이스코브의 개질된 둘베코의 배지 (IMDM) 인비트로젠 / 12200036
Ham의 F12 영양소 혼합물 인비트로젠 / 21700075
중탄산나트륨 (sodium bicarbonate) 시그마 / S5761
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2+ 시그마 / A8960
1-티오글리세롤 시그마 / M6145
아셀렌산나트륨 (sodium selenite) 시그마 / S5261
비-필수 아미노산 하이클론 (HyClone) / SH30853.01
화학적으로 정의된 지질 농축액 인비트로젠 / 11905031
배아 이식 등급수 (embryo transfer grade water) 시그마 / W1503
폴리비닐 알코올 (PVA) MP 바이오 (MP Bio) / 151-941-83
홀로-트랜스페린 (holo-transferrin) 시그마 / T0665
ES-컬트 (ES-CULT) M3120 스템 셀 테크놀로지 (Stem Cell Technologies) / 03120
StemSpan 무-혈청 증식 배지 (SFEM) 스템 셀 테크놀로지 / 09650
L-아스코르브산 시그마 / A4544
혈소판-유래된 성장 인자 서브유니트 (subunit) B 형이합체 (homodimer)(PDGF-BB) 페프로텍 / 110-14B
상기 표 1에 열거된 시약은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 IMDM 및 Ham의 F12 (Ham 's F12)와 같은 조성물을 수용하고 있다. 글루타맥스 (GLUTAMAX)는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 포함하며, 보통 0.85 % NaCl에서 200 mM로 공급된다. 글루타맥스는 배양되는 세포에 의해서 디펩티드 (dipeptide) 결합의 절단시 L-글루타민을 방출한다. 화학적으로 정의된 지질 농축물은 아라키돈산 2 mg/L, 콜레스테롤 220 mg/L, DL-알파-토코페롤 아세테이트 70 mg/L, 리놀레산 10 mg/L, 리놀렌산 10 mg/L, 미리스트산 10 mg/L, 올레산 10 mg/L, 팔미트산 10 mg/L, 팔미톨레산 10 mg/L, 플루로닉 (pluronic) F-68 90 g/L, 스테아르산 10 mg/L, 트윈 80® (TWEEN 80®) 2.2 g/L 및 에틸 알코올을 포함한다. H-1152 및 Y27632는 매우 강력한 세포-투과성 선택적 ROCK (단백질 세린/트레오닌 키나아제를 형성하는 Rho-관련 이중 나선) 억제제이다.
IF6S 배지 (10 X 농도)
10 X IF6S 양 (Quantity) 최종 농도 (Final Concentration)
IMDM 1 패키지, 1 L 용 분말 5 X
Ham의 F12 영양소 혼합물 1 패키지, 1 L 용 분말 5 X
중탄산나트륨 4.2 g 21 mg/mL
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2+ 128 mg 640 μg/mL
1-티오글리세롤 80 μL 4.6　mM
아셀렌산나트륨 (0.7 mg/mL 용액) 24 μL 84 ng/mL
글루타맥스 20 mL 10 X
비-필수 아미노산 20 mL 10 X
화학적으로 정의된 지질 농축액 4 mL 10 X
배아 이식 등급수 200 mL 까지 해당 사항 없음
IF9S 배지 (1 X 농도; IF6S 기준)
IF9S 양 최종 농도
IF6S 5 mL 1 X
폴리비닐 알코올 (PVA; 20 mg/mL 용액) 25 mL 10 mg/mL
홀로-트랜스페린 (10.6 mg/mL 용액) 50 μL 10.6 μg/mL
인슐린 100　μL 20 μg/mL
배아 이식 등급수 50 mL 까지 해당 사항 없음
분화 배지 (1 X 농도; IF9S 기준)
분화 배지 양 최종 농도
IF9S 36 mL 1 X
FGF2 1.8 μg 50 ng/mL
LiCl (2 M 용액) 36 μL 2 mM
BMP4 (100 μg/mL 용액) 18 μL 50 ng/mL
액티빈 A (10 mg/mL 용액) 5.4 μL 1.5 ng/mL
중간엽 콜로니 형성 배지 (1 X 농도)
중간엽 콜로니 형성 배지 (M-CFM) 양 최종 농도
ES-컬트 M3120 40 mL 40 %
STEMSPAN SFEM 30 mL 30 %
인간 내피-SFM 30 mL 30 %
글루타맥스 1 mL 1 X
L-아스코르브산 (250 mM 용액) 100 μL 250　μM
LiCl (2 M 용액) 50 μL 1　mM
1-티오글리세롤 (100 mM 용액) 100 μL 100 μM
FGF2 600 ng 20 ng/mL
중간엽 무-혈청 증식 배지 (1 X 농도)
중간엽 무-혈청 증식 배지 (M-SFEM) 양 최종 농도
인간 내피-SFM 5 L 50 %
STEMLINE II HSFM 5 L 50 %
글루타맥스 100 mL 1 X
1-티오글리세롤 87 μL 100 μM
FGF2 100 μg 10 ng/mL
실시예 2. 인간 iPSC의 MCA- MSC로의 분화
1. 비트로넥틴 (Vitronectin)으로 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 실험기구 (plastic ware)에 E8 완전 배지 (DMEM/F12 기본 배지 + E8 보충제) + 1 μM H1152 에서 iPSC를 해동함. 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 플레이팅된 iPSC를 인큐베이션함.
2. 비트로넥틴으로 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 실험기구에서 E8 완전 배지 (ROCK 억제제는 불포함)에서 iPSC를 3 계대 (passages)로 증식하고, 분화 과정을 시작하기 전에 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 인큐베이션함.
3. iPSC를 수확하고, E8 완전 배지 + 10 μM Y27632 중에 콜라겐 IV로 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 실험기구 상에 iPSC를 단일 세포/작은 콜로니로서 5x103 세포/cm2의 농도로 시딩하고, 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 24 시간 동안 인큐베이션함.
4. E8 완전 배지 + 10 μM Y27632를 분화 배지로 교체하고, 37 ℃, 5 % CO2, 5 % O2 (저산소 조건)에서 48 시간 동안 인큐베이션하여 원시 중배엽 세포를 생성함.
5. 분화 배지 부착 배양물로부터 단일 세포 현탁액으로서 원시 중배엽 세포를 형성하는 콜로니를 수확하고, M-CFM 현탁 배양물로 옮긴 후, 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 12 일 동안 중간엽 콜로니가 형성될 때까지 인큐베이션함.
6. 중간엽 콜로니를 수확하고, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 I 코팅된 (0.67 μg/cm2 피브로넥틴, 1.2 μg/cm2 콜라겐 I) 플라스틱 실험기구 상에 상기 중간엽 콜로니를 시딩하고, 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 3 일 동안 인큐베이션하여 MSC를 생성함 (계대 0).
7. 콜로니를 수확한 후, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 실험기구 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포로서 시딩하고 (계대 1), 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 3 일 동안 인큐베이션함.
8. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 실험기구 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포로서 시딩하고 (계대 2), 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 3일 동안 인큐베이션함.
9. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 실험기구 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포로서 시딩하고 (계대 3), 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 3 일 동안 인큐베이션함.
10. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 실험기구 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포로서 시딩하고 (계대 4), 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 3 일 동안 인큐베이션함.
11. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 실험기구 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포로서 시딩하고 (계대 5), 37 ℃, 5 % CO2, 20 % O2 (정상산소 조건)에서 3 일 동안 인큐베이션함.
12. 단일 세포로 수확하고 최종 산물을 동결시킴.
PDGF-BB (10 ng/mL) 및/또는 LiCl (1 mM)을 M-CFM에 보충하는 것이 iPSC-유래된 MCA-MSC의 T 세포 억제에 대하여 미치는 영향을 조사하기 위해 2 개의 실험 (TC-A-96 및 DAD-V-90)을 수행하였다. T 세포 억제는 와이즈만 바이오매뉴팩처링의 면역 역가 분석법 (IPA)을 사용하여 평가하였다.
하기 표 7에 요약된 바와 같이, 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF) 및 LiCl의 하기 조합을 평가하였다: PDGF+/LiCl+, PDGF-/LiCl-, PDGF+/LiCl- 및 PDGF-/LiCl+. 분화 배지 (1 X AA = 15 ng/mL 및 0.1 X AA = 1.5 ng/mL) 중에 2 가지의 상이한 Dneg1의 시드 밀도 (5x103 세포/cm2 및 1x104 세포/cm2)와 2 가지의 상이한 농도의 액티빈 A (activin A: AA)를 TC-A-96 실험에서 비교하였음을 유의해야 한다. 단일 Dneg1의 시드 밀도 (5x10e3 세포/cm2) 및 액티빈 A의 농도 (1.5 ng/mL)를 DAD-V-90 실험에 사용하였다. 또한 단일 류코팩 (leukopak)(LPK7)을 제 1 IPA (IPA 1)에 사용하고 2 개의 류코팩 (LPK7 및 LPK8)을 제 2 IPA (IPA 2)에 사용하였음을 유의해야 한다.
상기 분석법은 각 MSC 세포주가 T 헬퍼 (CD4+) 림프구의 증식을 억제할 수 있는 정도를 평가하도록 디자인되었다. 동결 보존된 MSC는 건강한 개인의 말초 혈액으로부터 정제된 동결 보존된 백혈구 (류코팩 (LPK)로부터 유래된 말초혈 단핵세포 (PBMC))를 사용하여 시험하였다. 따라서, 공여체 간의 LPK 세포 집단 변이가 예상된다. 각 MCA-MSC 시험 샘플은 임상 등급 물질 (clinical grade material)로 상이한 두 개인으로부터의 PMBC에 대해 시험하였고, 이는 연구 등급 물질 (research grade material)에 대해 단일 PMBC 샘플을 시험하는 것을 제한하는 옵션을 갖는다. 각 MCA-MSC 시험 샘플에 대한 분석법은 참조가 되는 표준 MSC 세포주와 함께 수행하여 분석의 완전성/ 재현성을 보장하고 시험 샘플을 표준화 (normalize)하였다. 상기 분석법은 Bloom et al. Cytotherapy, 2015, 17 (2):140-51에 기재되어 있다.
요약하면, 시험용 MCA-MSC를 21 Gy의 감마선 조사에 노출시켰다. 48-웰 조직 배양 플레이트에서 4x10e5, 2x10e5, 4x10e4 및 2x10e4 조사된 MCA-MSC를 개별 웰에 플레이팅하였다. PMBC는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르로 별도로 표지 되었다. 표지 된 PMBC 세포를 상기 MCA-MSC를 함유하는 웰 당 4x105 세포의 농도로 플레이팅하였다. 그 결과 적정한 PBMC:MCA-MSC 비율은 1:1, 1:0.5, 1:0.1 및 1:0.05 로 나타났다. 추가의 웰에는 자극된 PBMC를 단독으로, 다른 하나에는 MCA-MSC를 단독으로, 다른 하나에는 자극 없이 1:0.05 의 비율로 플레이팅하였고, 이 모두는 대조군으로 제공하였다. 이어서, T 세포-자극 단일클론 항체 (T cell-stimulatory monoclonal antibody), 항-인간 CD3-엡실론 및 항-인간 CD28 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)을 각 웰에 첨가하였다.
배양 4 일째에, 세포를 개별 웰로부터 수확하였다. 각 웰로부터 세포를 알로피코시아닌-표지된 항-인간 CD4와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 CD4+ 세포의 증식에 대해 유세포 분석기를 사용하여 카르복시플루오레세인의 강도 (intensity)를 통해 분석하였다. MCA-MSC 단독 대조군은 공동-배양 웰로부터 MCA-MSC를 차단하는 역할을 하였다. PBMC 단독 대조군은 MCA-MSC 매개의 억제 정도가 측정되는 것에 대하여 최대 T 세포 증식에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다. 증식이 측정되는 것에 대하여 음성 대조군 게이트를 생성하는데 자극되지 않은 1:0.05 비율의 웰을 사용하였다.
시험 샘플 비율로부터 IC50 값을 생성하는데 가장 적합한 곡선을 사용하였다. 상기 IC50 값은 참조 표준 (IC50 Ref Std/IC50 시험 시료)으로 표준화되었다. 상기 표준화된 IC50은 더 강력한 (더 억제하는) 샘플에 대해서는 보다 큰 값을, 덜 강력한 샘플에 대해서는 보다 작은 값을 산출한다.
결과
하기 표 7에 제시된 IC50 데이터로부터 LiCl이 보충되었지만 PDGF는 제외된 (즉, PDGF-/LiCl+) M-CFM가 면역 조절의 특성을 갖는 iPSC-MSC를 생성하기 위해 iPSC를 분화하는데 최적임을 보여준다. 또한, 더 낮은 농도의 액티빈 A 또한 iPSC-유래된 MCA-MSC의 면역 억제를 향상시켰다.
면역 역가 분석법
IC50 (LPK7) IC50 (LPK8) 샘플 PDGF LiCl 액티빈 A 시드 밀도 (D2)
해당 사항 없음 억제되지 않음 TC-A-96-B3 + + 0.1 X (1.5 ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 사항 없음 0.17 TC-A-96-B1 + + 1 X (15 ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 사항 없음 0.17 DAD-V-90-4 + + 0.1 X (1.5 ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 사항 없음 0.19 TC-A-96-D3 + + 0.1 X (1.5 ng/mL) 1x104 세포/cm2
해당 사항 없음 0.36 DAD-V-90-2 + - 0.1 X (1.5 ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 사항 없음 0.57 DAD-V-90-1 - - 0.1 X (1.5 ng/mL) 5x103 세포/cm2
0.39 0.54 TC-A-96-B2 - + 1 X (15 ng/mL) 5x103 세포/cm2
0.37 0.58 TC-A-96-D2 - + 1 X (15 ng/mL) 1x104 세포/cm2
0.69 0.93 DAD-V-90-3 - + 0.1 X (1.5 ng/mL) 5x103 세포/cm2
상기 실시예에 따라 생성된 MCA-MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 나타낸다.
실시예 3. MCA-MSC의 마이크로RNA 분석
실시예 2에 따라 생성된 MCA-MSC는 71 개의 MSC 샘플 및 94 개의 MSC-불포함 (non-MSC) 샘플에 대해 검증된, miR-127-3p, miR-145-5p, miR-181b-5p, miR-214-3p, miR-299-5p로 구성된 독점적 miRNA 패널 및 1194 개의 miRNA를 포함하는 마이크로RNA (miRNA) 마이크로어레이에 대하여 분석을 수행하였다.
실시예 2에 따라 생성된 MCA-MSC는 각각의 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않았다.
시험된 모든 샘플에 대해 생성된 표준화된 데이터 (적어도 하나의 시험된 샘플에서 존재함)에서 신뢰성 있게 검출된 마이크로어레이의 233 개의 miRNA의 주요 성분 분석은 실시예 2에 따라 생성된 MCA-MSC가 다른 71 개의 MSC 샘플 각각으로부터 구별된다는 것을 입증했다.
실시예 4. AAD/ 천식의 인 비보 치료
방법 및 재료
동물
6-8 주 령의 암컷 Balb/c 마우스는 Monash Animal Services (호주 Victoria Clayton에 소재한 Monash University)에서 입수하여 12 시간 명/ 12 시간 암의 조명 주기로 통제된 환경에서 물과 lab chow (Barastock Stockfeeds, Pakenham, Victoria, Victoria)에 자유롭게 접근할 수 있는 상태로 수용하였다. 모든 마우스에게 실험 전 4-5 일의 적응 기간을 제공하였고 수행된 모든 절차는 Monash University Animal Ethics Committee (윤리 번호: MARP/2016/078)의 승인을 받았으며, 이는 과학적인 목적을 위한 실험실 동물의 관리와 이용에 대한 호주의 지침을 준수한다.
만성 AAD의 유도
만성 AAD에서 MSC의 효과를 평가하기 위해, 마우스에서 오브알부민 (OVA)-유도된 만성 AAD의 모델을 확립하였다 (n = 24). 0 일 및 14 일에 10 ㎍의 등급 V 닭의 달걀 OVA (Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 400 ㎍의 알루미늄 포타슘 설페이트 아쥬반트 (alum; AJAX Chemicals, NSW, Australia)를 2 회 복강 내 (IP)로 주사하여 마우스를 감작시켰다. 그런 다음 초음파 네뷸라이저 (Omron NE-U07; Omron, Kyoto, Japan)를 사용하여 21 일에서 63 일 사이에 일주일에 3 회, 30 분 동안 에어로졸화된 OVA (0.9 % 일반 식염수 중 2.5 % w/v)로 상기 마우스를 전신 흡입 노출 (분무)시켰다. 그에 반면, 대조군 마우스 (n = 24)의 경우, OVA 대신에 500μL의 0.9 % 식염수를 IP 주사하고, 0.9 % 식염수로 분무하였다.
MCA-MSC 치료
만성 AAD (64 일째)의 확립 후 24 시간에, OVA- 또는 식염수-감작/노출된 마우스의 서브 그룹 (n = 8 마우스/그룹)에게 MCA-MSC를 IV- 또는 IN-투여하였다. 모든 경우에, OVA-유도된 만성 AAD 모델에서, 인간 골수-유래된 (기질) MSC 및 인간 양막 상피 세포와 같은 다른 줄기세포의 IN-전달 효과를 평가하는데 사용된 기간을 복제 (replicate)하기 위하여 14 일의 치료 기간 (64 일 내지 77 일)을 선택하였다.
MCA-MSC를 실시예 1 및 2에 따라 생성하였다. MSC의 정의된 특징은 CD73, CD90 및 CD105의 발현이고, MCA-MSC 세포는 이들 3 개의 마커 (marker) 모두에 대해 > 99 % 의 양성이지만, CD43/45 및 CD31에 대해서는 음성이었고, 이는 조혈 및 내피 계통 세포의 부재를 확인하였다. 모든 치료는 치료 기간 동안 (64 일 및 71 일에) 주당 1 회 투여되었다. 각 계획된 치료일 아침에, 동결된 MCA-MSC를 37 ℃의 수조에서 해동한 후 다음과 같이 재현탁시켰다: MCA-MSC의 IV-투여의 경우, 1x107 세포를 2 mL의 포스페이트-완충 식염수 (PBS)에 재현탁시켰다. 마우스를 퍼스펙스 억제기 (Perspex restrainer)에서 억제시키고, 1x106 세포/200μl의 PBS를 식염수- 또는 OVA-감작/노출된 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. MCA-MSC의 IN-투여의 경우, 1x107 세포를 0.5 mL의 PBS에 재현탁시켰다. 마우스를 이소플루란 (Baxter Health Care, NSW, Australia)으로 가볍게 마취시키고, 비강 내 주입이 일어나는 동안 반-척추 자세 (semi-supine position)로 유지시켰다. 이어서 1x106 세포/50 μl의 PBS를 자동 피펫 (automatic pipette)을 사용하여 마우스의 각 콧구멍에 25 μL씩 IN-투여하였다.
침습성 혈량 측정법
78 일 (MCA-MSC의 마지막 치료 후 7 일)에 마우스를 케타민 (10 mg/kg 체중) 및 크실라진 (2 mg/kg 체중)이 첨가된 0.9 % 식염수로 마취시켰다. 이어서, 18 게이지 기관 절개 튜브를 사용하여 모든 마우스에 대해 기관 절개술을 수행하였다. 이어서, 마우스를 Buxco FinePointe 혈량 측정기 (Buxco, Research Systems, Wilmington, NC, USA)의 챔버에 넣고 환기시켰다. 이어서, 기관지 수축을 유도하고 AHR을 평가하기 위해 PBS에 용해시켜 4 회 용량에 걸쳐 6.25-50 mg/mL로 기관 내로 전달되는 분무형 메타콜린 (methacholine; Sigma-Aldrich, MO, USA)의 용량 증가에 반응하여 각 마우스의 기도 저항을 측정하였다. 상기 기도 저항의 변화 (각 투여 후의 최대 기도 저항에서 PBS 단독 투여에 대한 기저선 저항을 뺀 값)는 상응하는 메타콜린의 용량에 대해서 플로팅하였다.
조직 수집
침습성 혈량 측정 후, 각 동물의 폐 조직을 단리하고 차가운 PBS로 헹구고, 이후 4 개의 개별 엽 (lobe)으로 나눴다. 가장 큰 엽을 10 % 중성 완충 포름알데히드에 밤새 고정시키고 절단하여 파라핀 왁스 (paraffin wax)에 포매하였다 (다양한 엔드-포인트 (end-point)의 조직학적 및 면역 조직 화학적 분석을 위해). 나머지 3 개의 엽은 다양한 다른 분석을 위해 액체 질소에서 급속-냉동시켰다.
폐 조직 병리학
각각의 마우스로부터 가장 큰 엽을 파라핀-포매한 후, 각각의 조직 블록을 연속적으로-단면화하여 (3μm 두께) 대전된 Mikro 유리 슬라이드 (Grale Scientific, Ringwood, Victoria, Australia)에 놓고 다양한 조직학적 염색 또는 면역 조직 화학을 수행하였다. 염증 점수, 상피 두께 및 상피하의 세포 외 매트릭스 (ECM)의 평가를 위해, 각 마우스로부터 하나의 단면 (슬라이드 당)에 대하여 마손 트리크롬 염색을 수행하였다. 술잔 세포의 화생화 평가를 위해, 두 번째 슬라이드 세트는 ABPAS (Alcian blue periodic acid Schiff) 염색을 수행하였다. 마손 트리크롬 및 ABPAS-염색된 단면을 하기에서 상세히 설명된 바와 같이 형태학적으로 분석하였다.
면역 조직 화학 ( IHC )
TGF-β1 (다 클론성 항체 (polyclonal antibody)를 사용함; sc-146; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:1000 으로 희석) 또는 α-평활근 액틴 (알파-SMA; 근섬유모세포 분화의 마커; 단일 클론성 항체 (monoclonal antibody)를 사용함; M0851; DAKO, Glostrup, Denmark; 1:200 으로 희석)을 검출하는데 IHC를 사용하였다. DAKO EnVision 항-토끼 또는 항-마우스 키트 및 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 크로모겐 (chromogen)을 사용하여 1 차 항체 염색을 검출하였고, 반면 임의의 1 차 항체의 부재 하에 EnVision 키트에 노출시킨 음성 대조군도 포함시켰다. 모든 슬라이드를 헤마톡실린으로 카운터-염색하였고, 형태 측정 분석을 위해 ScanScope AT Turbo (Aperio, CA, USA)를 사용하는 Monash Histology Services에 의해 스캔하였다.
형태 측정 분석
마손 트리크롬-, ABPAS- 및 IHC-염색된 슬라이드를 하기와 같이 형태 측정 분석을 수행하였다. 단면 당 5 개의 기도 (직경 150-300 μm)를 무작위로 선택하고, Aperio ImageScope 소프트웨어 (Aperio, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 마손 트리크롬-염색된 슬라이드에 대하여 반-정량적인 기관지 주변에서의 염증 점수의 측정 (semi-quantitative peri-bronchiolar inflammation scoring)을 수행하고, 실험자는 맹검으로 개별적인 기도를 0 (기도 주변에 검출되는 염증이 없음)에서 4 (광범위한 대규모 염증 세포 응집체, 풀링 된 크기 ~0.6 mm2)까지 점수화하였다. 마손 트리크롬-염색된 슬라이드는 또한 상피 두께와 상피하의 ECM 층 (청색으로 염색됨)을 측정하여 상피 두께 및 상피하의 ECM의 침착의 분석을 수행하였다; 이는 기저막 (BM) 길이의 μm 당 μm2으로 표시되었다.
ABPAS-, 알파-SMA-염색된 슬라이드에 대하여 BM 길이의 100 μm 당 양성적으로 염색된 술잔 세포 또는 알파-SMA 양성 세포의 수를 계수하여, 술잔 세포의 화생화 및 상피하의 근섬유모세포 수에 대해 각각 분석하였다. 기도 내에서 강하게 양성적으로-염색된 픽셀 (pixel)을 평가하는 알고리즘을 실행하여 TGF-β1-염색된 슬라이드를 TGF-β1 단백질 발현에 대해 분석하였다. 결과는 기도의 총 면적 (mm2) 당 강한 양성의 픽셀의 수로서 표시되었다; 그때 1로서 표시되는 식염수-처리된 대조군과 비교하였다.
히드록시프롤린 분석법
각 마우스에서 두 번째로 큰 폐 엽을 히드록시프롤린 함량을 측정하기 위해 이전에 기재된 대로 처리하였고 (Royce, S. G. et al., (2013) Clin. Sci. 124, 41-51), 이는 정제된 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 (Sigma-Aldrich)의 표준 곡선으로부터 결정되었다. 히드록시프롤린 값에 6.94 의 계수 (대부분의 포유류 조직에서 콜라겐의 아미노산 조성의 약 14.4 % 를 나타내는 히드록시프롤린을 기준으로 함)를 곱하여 총 콜라겐 함량을 추정하고, 콜라겐 농도 퍼센트를 산출하기 위하여 이를 각각의 상응하는 조직의 건조 중량으로 나누었다.
젤라틴 자이모그래피
1 mg/ml의 젤라틴을 함유하는 7.5 % 아크릴아마이드 겔에서 총 단백질의 동일한 알리코트 (샘플 당 10 μg)를 평가하기 전에, 각 마우스에서 세 번째로 큰 폐 엽을 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase: MMP)를 포함하는 단백질의 추출을 위해 이전에 기재된 대로 처리하였다 (Woessner, J. F., (1995) Methods Enzymol. 248, 510-528). 젤라틴분해 활성 (Gelatinolytic Activity)을 명확한 밴드로 시각화하였다. MMP-9 (암컷 Balb/c 마우스의 폐에서 지배적인 젤라티나제)의 밀도 측정 (Densitometry)은 GS710 밀도 측정기 (Bio-Rad Laboratories, Gladesville, NSW, Australia) 및 Quantity-One 소프트웨어 (Bio-Rad)를 사용하여 수행되었다. 그때 MMP-9의 광학 밀도 (OD)의 상대적인 평균 ± 표준오차 값을 그래프로 나타내었다.
통계 분석
모든 통계 분석은 그래프패드 프리즘 v6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 수행되었고 평균 ± 표준오차 값으로 나타내었다. AHR 결과는 본페로니 포스트-혹 테스트 (Bonferonni post-hoc test)를 사용한 이원 ANOVA로 분석하였다. 나머지 데이터는 그룹 간 다중 비교를 위해 뉴먼-쿨스 포스트-혹 테스트 (Neuman-Keuls post-hoc test)를 사용한 일원 ANOVA로 분석하였다. 각각의 경우에, 데이터는 p <0.05에서 유의한 것으로 고려되었다.
결과
AI에 대한 MCA-MSC의 효과
AI는 염증 점수 측정 시스템 (0-4)을 사용하여 H & E-염색된 폐 단면으로부터 반-정량화되었다. OVA-손상된 마우스의 기관지 주변의 염증 점수 (2.75 ± 0.09)는 식염수 (SAL)-감작/노출된 대조군에 대한 염증 점수보다 유의하게 더 높았다 (0.25 ± 0.09; SAL 그룹의 p <0.001)(도 1). OVA 그룹에서의 증가된 염증 수준은 이들 마우스가 OVA에 성공적으로 감작 및 노출되었음을 확인하였다.
MCA-MSC의 투여는 SAL-대조군 마우스에 투여될 때의 기저 염증 점수에 영향을 미치지 않으면서 OVA-유도된 기관지 주변 염증 세포 침윤을 유의하게 감소시켰다 (1.25 ± 0.23; OVA 그룹의 p <0.001)(도 1의 A, B). 그러나, MCA-MSC를 사용한 치료는 AI를 SAL-대조군 마우스에서 측정한 수준으로 완전히 감소시킬 수 없었다 (MCA-MSC를 OVA-손상된 마우스에 투여하는 치료의 경우 SAL 그룹의 p <0.05).
AWR에 대한 MCA-MSC의 효과
술잔 세포의 화생화
ABPAS-염색된 폐 단면으로부터 술잔 세포의 화생화는 형태 측정으로 평가하고 BM 길이의 100 μm 당 술잔 세포의 수로 표시되었다 (도 2). OVA-처리된 마우스는 그들의 SAL-대조군 대응물과 비교하여 술잔 세포의 수가 유의하게 증가 (6.08 ± 0.52)하였다 (0.001 ± 0.00; SAL 그룹의 p <0.001; 도 2의 A, B). MCA-MSC의 투여는 완전히는 아니지만 술잔 세포의 수의 OVA-유도된 촉진을 유의하게 감소시킬 수 있었다 (3.97 ± 0.64 내지 2.89 ± 0.48, OVA 그룹의 p <0.01; 도 2의 A, B). 그러나, MCA-MSC 전달은 SAL-대조군에서 측정된 것만큼 OVA-유도된 술잔 세포의 화생화를 회복시키지는 않았지만 (SAL 그룹의 양방의 (both) p <0.001), SAL-처리된 마우스에서 술잔 세포의 수에는 영향을 미치지 않았다.
기도 상피 두께
기도 상피 두께는 마손 트리크롬 염색된 폐 단면에서 형태 측정으로 평가하였고 μm2/μm의 BM 길이로 표시하였다 (도 3). OVA 처리된 마우스의 상피 두께 (19.16 ± 0.63)는 SAL-대조군에서 측정된 것보다 유의하게 더 컸다 (14.28 ± 0.45; SAL 그룹의 p < 0.001; 도 3의 A, B). MCA-MSC의 전달은 완전히는 아니지만, OVA 그룹에서 측정된 것으로부터 상피 두께를 상당히 감소 (18.59 ± 0.77 에서 16.67 ± 0.87)시켰다 (OVA 그룹의 p <0.05; SAL 그룹의 p <0.05; 도 3의 A, B). 중요하게도, MCA-MSC 치료는 SAL-대조군 마우스에서 기저 상피 두께에 영향을 미치지 않았다.
상피하의 콜라겐 침착
마손 트리크롬-염색된 폐 단면으로부터 형태 측정으로 상피하의 콜라겐 침착을 평가하고 μm2/μm BM 길이로 표시하였고 (도 3); 상피하의 콜라겐 침착은 OVA-손상된 마우스 (27.63 ± 0.66)에서 SAL-대조군에서의 것과 비교하여 유의하게 증가하였다 (14.31 ± 1.87; SAL 그룹의 p <0.001; 도 3의 A, C). MCA-MSC의 전달은 상피하의 콜라겐 침착의 비정상적인 OVA-유도된 촉진을 감소시켰다 (22.39 ± 1.78 에서 16.98 ± 0.98; OVA 그룹의 p <0.05; 도 3의 A, C).
총 폐 콜라겐 농도 (섬유증)
총 폐 콜라겐 농도 (콜라겐 농도 %/폐 조직 건조 중량)는 각 마우스의 두 번째로 큰 폐 엽 내에 존재하는 히드록시프롤린 수준으로부터 추론되어 섬유증의 척도로 사용되었고 (도 4); 총 폐 콜라겐 농도는 SAL-대조군에서 측정된 것과 비교하여 OVA-손상된 마우스 (3.94 ± 0.09 %)에서 유의하게 증가하였다 (2.89 ± 0.18 %; SAL 그룹의 p <0.001). MCA-MSC의 OVA-손상된 마우스로의 투여는 폐에서 섬유증을 감소시켰다 (3.26 ± 0.17 % 내지 3.62 ± 0.07 %; OVA 그룹의 p <0.05; 도 4).
기도 TGF-β1 발현
MCA-MSC가 OVA-유도된 상피하 및 총 콜라겐 침착 (섬유증)을 역전시킬 수 있는 기전을 결정하기 위해, 기도 TGF-β1 (섬유화 유발 사이토킨) 발현 수준의 상대적인 변화를 IHC-염색된 폐 단면으로부터 형태 측정으로 평가하고, 분석된 기도 당 % 염색으로 표시하였다 (도 5). 기도 TGF-β1 발현은 SAL-대조군에서 측정된 것과 비교하여 OVA-손상된 마우스 (1.85 ± 0.13)에서 유의하게 증가하였다 (1.00 ± 0.08; SAL 그룹의 p <0.001; 도 5의 A, B). MCA-MSC의 OVA-손상된 마우스로의 전달은 SAL-대조군 마우스에 투여될 때 기저 기도 TGF β1 발현 수준에는 영향을 미치지 않고, 비정상적인 기도 TGF-β1 발현 수준을 SAL-대조군 (1.06 ± 0.05 내지 1.22 ± 0.05; OVA 그룹의 p <0.001; SAL 그룹과 다르지 않음)에서 측정된 수준으로 역전시켰다 (도 5의 A, B).
상피하의 근섬유모세포의 밀도
알파-SMA-염색된 상피하의 근섬유모세포의 밀도의 변화를 IHC-염색된 폐 단면으로부터 형태 측정으로 평가하였고 BM 길이의 100 μm 당 근섬유모세포의 수로서 표시되었다 (도 6). 미량의 상피하의 알파-SMA-양성 근섬유모세포를 SAL-대조군 마우스에서 검출하였고 (0.14 ± 0.05), 반면 OVA-손상된 마우스는 근섬유모세포의 밀도에 있어서 30 배까지 증가하였다 (4.37 ± 0.37; SAL 그룹의 p <0.001; 도 6의 A, B). MCA-MSC의 투여는 SAL-대조군 마우스에 투여될 때 기저 근섬유모세포 수에 영향을 미치지 않으면서 상피하의 근섬유모세포의 밀도 (2.86 ± 0.27 내지 3.42 ± 0.09; OVA 그룹의 p <0.05)에 있어서 OVA-유도된 증가를 감소시켰다 (도 6의 A, B). 그러나, MCA-MSC 투여는 비정상적인 상피하의 근섬유모세포의 부담을 SAL-대조군 마우스에서 측정된 값까지 완전히 역전시키지 않았다 (SAL 그룹의 양방의 (both) p <0.001; 도 6의 A, B).
폐에서 젤라티나제의 발현
또한 OVA-유도된 기도/폐 섬유증의 MCA-MSC-매개의 역전이 콜라겐-분해 MMP 수준에 영향을 미치는 그들의 능력과 관련이 있는지를 결정하였다. 젤라틴 자이모그래피는 암컷 Balb/c 마우스의 폐가 MMP-9 (젤라티나제 B)를 주로 발현하고, 더 적은 정도로 MMP-13 (콜라게나제-3)을 발현한다는 것을 입증하였다 (도 7). OVA-손상된 마우스에서 상대적인 MMP-9 발현 수준 (1.62 ± 0.22)은 SAL-대조군 동물 (1.00 ± 0.09)에서 측정된 것과 유의하게 다르지 않았다 (도 7의 A, B). 이에 비해, MCA-MSC의 OVA 손상된 마우스로의 투여는 OVA-처리된 마우스를 단독으로 측정한 결과 MMP-9 수준 (3.77 ± 0.18 내지 4.56 ± 0.20; OVA MCA-MSC 그룹의 p <0.05)을 ~1.3 및 ~1.8 배 만큼 현저하게 증가시켰다 (OVA 그룹의 p <0.001; SAL 그룹의 p <0.001; 도 7의 A, B). 흥미롭게도, MCA-MSC의 SAL-처리된 마우스로의 전달은 또한 MMP-9 수준을 유의하게 증가시켰다 (1.95 ± 0.38 에서 2.65 ± 0.30; SAL 그룹의 p <0.05).
AHR에 대한 MCA-MSC의 효과
AHR을 분무된 메타콜린 - 기관지 수축제의 농도가 증가함에 따라 침습성 혈량 측정법에 의해 평가하였다 (도 8). 예상대로, OVA-처리된 마우스는 SAL-대조군에서 측정된 것과 비교하여 AHR이 유의하게 증가하였다 (SAL 그룹의 p <0.001; 도 8). MCA-MSC의 전달은 AHR에서 OVA-유도된 증가를 역전시켰다 (OVA 그룹의 p <0.05; 도 8). 측정된 대부분의 다른 엔드-포인트와 마찬가지로, MCA-MSC 전달은 SAL-대조군 마우스에 투여될 때 기저 AHR 측정에 영향을 미치지 않았다 (도 8).
토의
본 연구는 만성 AAD/ 천식 발병 기전의 3 가지 주요 구성요소인 AI, AWR 및 AHR에 대해 신규 iPSC-유래된 MCA-MSC를 확립된 질환 병리에 치료적으로 제공할 때 그의 치료적 가능성을 평가하는 것을 목표로 하였다.
MCA-MSC의 투여는 확립된 AI, AWR (술잔 세포의 화생화, 비정상적인 기도 TGF-β1 수준, 상피하의 근섬유모세포 및 콜라겐 축적, 총 폐 콜라겐 농도) 및 마우스에 대하여 반복된 OVA 감작 및 노출에 의해 유발된 AHR를 예방하였다 (표 8). 상기는 MCA-MSC의 전달에 의해 2 주 (1 주일에 1 회)의 치료 기간 동안 비정상적인 기도 TGF-β1 수준, 기도/폐 섬유증 및 AHR이 역전되었고, 콜라겐-분해 MMP-9의 수준이 크게 증가하였다 (표 8). 마찬가지로, MCA-MSC 투여는 측정된 매개 변수의 기저 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌으며, 이는 MCA-MSC의 전달이 AAD/ 천식의 중심 구성 성분을 치료하는 안전하고 가장 효과적인 수단을 제공함을 시사한다.
만성 AAD의 병리에 대한 MCA- MSC의 효과 요약
인간 천식의 주요 특징 OVA SAL MCA-MSC IV OVA MCA-MSC IV SAL MCA-MSC IN OVA MCA-MSC IN
AI ↑↑↑ - ↓ - ↓↓
술잔 세포의 화생화 ↑↑↑ - ↓ - ↓↓
상피 두께 ↑↑↑ - - - ↓↓*
상피하의 콜라겐 ↑↑↑ - ↓ - ↓↓↓*
총 폐 콜라겐 ↑↑↑ - ↓ - ↓↓↓*
기도 TGF-β1 수준 ↑↑↑ - ↓↓↓ - ↓↓↓
상피하의 근섬유모세포의 밀도 ↑↑↑ - ↓ - ↓↓*
폐 MMP-9 수준 - ↑ ↑↑↑ ↑↑ ↑↑↑*
AHR ↑↑↑ - ↓↓ - ↓↓↓**
상기 표 8에서, OVA, SAL MCA-MSC IV 및 SAL MCA-MSC IN 컬럼의 화살표는 식염수 (SAL)-처리된 마우스에서 측정된 것에 대한 변화를 반영하는 반면, OVA MCA-MSC IV 및 OVA MCA-MSC IN 그룹의 화살표는 OVA 단독 그룹의 변화를 반영한다. (-)는 SAL 또는 OVA-처리된 마우스와 각각 비교하여 변화가 없음을 의미한다. * p < 0.05, OVA MCA-MSC IV 그룹의 ** p < 0.01.
천식의 염증 성분은 기도 폐쇄의 원인이 된다. Th2-편향된 염증은 인터루킨 (IL)-13을 포함하는 사이토킨의 특정 서브세트의 상승 및 술잔 세포의 화생화의 유도를 초래한다.
이러한 발견과 일관되게, 이전의 연구는 iPSC-유래된 MSC (본 명세서에 개시된 바와 같은 MCA-MSC는 아님)의 IV-주입은 Th2 사이토킨, IL-4, IL-5 및 IL-13의 수준을 억제함으로써 급성 OVA 모델에서 기도 염증 점수를 부분적으로 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다. MCA-MSC의 전신 효과는 직접 세포 간 접촉을 통해 조절 T 세포를 활성화시키는 능력과 관련될 수 있다. 그러나, MCA-MSC가 AI를 ~ 75 % 만큼 현저히 억제하고 술잔 세포의 화생화를 ~ 50 % 만큼 억제한다는 현재의 발견은 MCA-MSC가 인간 골수 또는 지방 조직으로부터 유래된 MSC에 비해 더 큰 면역 조절 특성을 매개한다는 것을 나타낸다.
MCA-MSC의 기도/ 폐로의 직접 투여는 그들이 분비하는 보호 인자를 폐 환경에 남아있게 한다. 또한, 직접 투여된 MCA-MSC는 염증성 폐에 남아있을 가능성이 높으며, 폐포 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 항원 제시 세포의 억제를 통해 매개되는 알레르겐 노출에 대해 더 큰 보호 효과를 갖는다.
술잔 세포의 화생화와 함께, 상피 증식은 천식에서 상피 개형에 주요 원인이 된다. 상피 장벽 기능 및 박리의 감소는 상피 증식으로서 정점에 이른다. 이러한 증식은 상피의 확장이 기도 폐쇄로 이어지는 중증 천식에서 특히 광범위하다. 이러한 재프로그래밍은 천식 발병 초기에 발생하므로, 천식 요법은 상피를 표적으로 해야 한다. AI의 유사한 감소를 제공함에도 불구하고 MCA-MSC의 전달은 상피 두께를 감소시켰다. 이것은 골수-유래된 MSC와 관련된 이전의 발견과는 대조되는데, 여기서 골수-MSC를 단독으로 IN-전달하는 것은 상피 두께에 영향을 미치지 않았다. 상기 연구에서, 상피 두께는 AI의 감소에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, MCA-MSC와 골수-MSC 사이에 관찰된 차이는 AI를 약화시키는 능력에 의해 생성되는 수동 효과보다는 MCA-MSC 자체의 활성 특성으로 인해 나타난다.
또한, 다른 연구에서, 상피 인자 복구 펩티드 (epithelial factor repair peptide)(트레포일 인자-2)의 투여는, 병용 치료에 의해 제공되는 AI의 큰 감소에도 불구하고, 항-섬유화 및 코르티코스테로이드의 병용 치료와 동일한 정도로 상피 두께를 감소시켰다. 따라서, 상피 증식의 감소는 염증의 감소에 의해 매개되지 않았다.
이러한 추가 증거로, 본 발견은 MCA-MSC의 전달이 i) 상피 두께를 감소시키는 측분비인자 (paracrine factor)의 충분한 축적 및/또는 ii) 이들 세포가 손상된 상피와 직접 접촉하고 그 증식의 역전을 매개할 수 있음을 나타낸다. MCA-MSC에 의해 발휘된 상피 두께 및 술잔 세포의 화생화의 감소는 역전된 AWR의 첫 번째 증거이다.
기계적 손상과 알레르겐을 포함하여 여러 가지 요소의 정점은 AI에 더하여, AWR로 이어지는 폐 구조 및 기도 기능의 파괴의 원인이 된다. 알레르겐 또는 유전적 감수성으로 인한 손상은 기도의 구조 및 기능을 자가-회복하기 위한 노력으로서 폐가 개형의 내인성 (endogenous) 과정을 겪게 하며, 이러한 회복 과정은 비정상적인 상처 치유를 초래하여 결국 섬유증으로 이어진다. 섬유증은 OVA-감작된 기도에서 명백하였고, 이는 비정상적인 상피하 및 총 콜라겐 수준의 상승을 보여주었다. MCA-MSC의 전달은 비정상적인 상피하 및 총 콜라겐 침착을 유의하게 감소시켰으며, 어떤 경우에는 이러한 비정상적인 콜라겐 침착을 손상되지 않은-식염수-처리된 그룹에서 보이는 수준으로 완전히 역전시켰다. 줄기세포-기반 치료제를 항-섬유화 약물과 함께 투여할 때 상피하 및 총 콜라겐 침착의 OVA-유도된 촉진이 완전히 역전될 수 있음을 이전 연구에서 알 수 있듯이 이러한 결과는 예상외였다. 이러한 병용 치료 연구에서, 상기 항-섬유화 약물은 줄기세포-기반 요법이 도입될 수 있는 보다 유리한 환경을 만들어서 그들의 보호/ 치료 효과를 유도하기 위하여 줄기세포 생존을 돕고 그들의 증식 및 이동 능력을 증가시키는 것으로 제안되었다. 따라서, MCA-MSC의 전달은 항-섬유화 약물과 유사한 효과를 가지며, 태아의 섬유모세포와 유사한 항-섬유화 특성을 가질 수 있으며, 이는 섬유증이 없을 때 상처 치유를 촉진할 수 있다.
또한 이러한 결과는 MCA-MSC에 의해 유도되어 관찰된 상피 두께의 감소와 일치한다. 섬유질 성장 인자 (Fibrogenic growth factor)는 상피 교란에 대한 반응으로 상피 세포에 의해 일반적으로 방출된다. 천식에서, 상기 반응이 증진되어, 상피하 섬유증은 결함이 있는 상피에서 더 깊은 기도 벽으로 가는 신호의 전달자 (conduit)로부터 발생함을 시사한다. 이와 같이, MCA-MSC는 IV 투여 시, 상피하 및 총 콜라겐의 감소를 제공하는 면역 조절 특성 및 항-섬유증 매개체 (항-섬유화 mediator)의 가능한 분비를 통해 항-섬유화 효과를 발휘할 수 있다.
본 연구의 주요 발견은 MCA-MSC가 섬유증을 역전시키고 손상되지 않은 마우스에서 측정된 수준으로 AHR을 역전시켰다는 것이었다. AHR은 기도 폐쇄에 의해 유발되는데, 이는 술잔 세포의 화생화 및 상피 비후로부터 점액 막힘 (mucus plugging)에 의해 야기될 수 있다. 또한 AI와 기도 벽의 섬유증 사이의 상호작용은 AHR을 증가시키는 환경으로 이어진다. 섬유증은 천식을 가진 대상체의 기도 순응도 (airway compliance)를 감소시킬 뿐만 아니라, ECM에서의 이러한 확장은 용해성 염증 매개체 (soluble inflammatory mediator)의 보유 및 확립된 AHR의 만성 지속성을 초래한다. 이와 같이, AHR은 주로 상피하 섬유증의 감소 및 AI의 쇠약 및/또는 MCA-MSC에 의해 제공되는 감소된 술잔 세포의 수 및 더 낮은 수준의 상피 비후에 의해 매개되는 기도 폐쇄의 감소에 의해 정상적인 손상되지 않은 수준으로 역전될 수 있다. 본 원에 개시된 바와 같이, MCA-MSC는 항-염증 효과 이외에도 다양한 수준에서 AWR을 표적화함으로써 AHR을 교정하였다.
결론적으로, 만성 AAD/ 천식을 치료하기 위해 MCA-MSC를 사용한 최초의 본 연구는 MCA-MSC가 AHR뿐만 아니라 AI 및 AWR의 역 마커 (reverse marker)를 효과적으로 감소시킨다는 것을 발견하였다. 따라서 MCA-MSC는 AAD/ 천식에 대한 독립형 요법 (stand-alone therapy)을 제공한다. MCA-MSC는 또한 AAD/ 천식에 대한 보조 요법으로 사용될 수 있다. MCA-MSC는 현재 요법, 즉 코르티코스테로이드 또는 β-작용제 요법에 반응하지 않는 AAD/ 천식 대상체의 하위-집단에게 특별한 치료적 유익을 제공할 수 있다.
이전에 연구된 다른 줄기세포로부터 MCA-MSC를 구별시키는 놀라운 발견은 다른 MSC/줄기세포가 다른 치료제와 병용으로 투여될 때만 치료적 효과를 발휘한다는 것이다.
실시예 5
AAD/ 천식은 실시예 4에서와 같이 6 주 대신에, 8 주 동안 일주일에 3 회, 30 분 동안 오브알부민의 분무된 에어로졸 용액에 상기 마우스를 노출시켰다는 점을 제외하고는, 실시예 4와 유사한 방식으로 6 내지 8 마리의 마우스의 그룹에서 유도되었다 (21 일에서 77 일까지, 도 9). 마우스를 5 개의 그룹 중 하나로 무작위로 배정하였다: 1　처리되지 않은 대조군 (천식 없음); 2 처리되지 않은 감작된 동물 (천식); 3 MCA-MSC의 IN 주입 처리된, 감작된 동물 (천식); 4 덱사메타손 (DEX)의 IN 주입 처리된, 감작된 동물 (천식); 5 MCA-MSC + DEX의 IN 주입 처리된, 감작된 동물 (천식). 모든 MCA-MSC-처리된 마우스에게 2 회 (9 주 및 10 주에 걸쳐 1 주에 1 회) 106 세포의 용량을 IN으로 주입하였다. DEX (1 mg/kg/일)를 9-11 주부터 매일 1 회 투여하였다. DEX는 AHR을 개선시켰지만 MCA-MSC는 유의하고 더 뚜렷한 효과를 보였으며, DEX는 MCA-MSC 단독의 효과를 넘어서는 추가적인 효과를 보이지 않았다 (도 10).
실시예 6
본 실시예에서 사용된 모델은 실시예 5의 모델과 동일한, 상기 모델에서 가장 반응성이 높은 암컷 Balb/c 마우스를 사용한 9 주 알레르겐-유도된 만성 기도 질환 모델이다.
7-8 주 령의 암컷 Balb/c 마우스의 하기의 그룹들 (n ~ 8 마우스/그룹)을, MCA-MSC를 9-11 주부터 주 1 회 비강 내 (IN), 정맥 내 (IV) 또는/및 기관 내 (ET)로 투여하여 비교하였다:
i) 식염수 감작/노출된 대조군;
ii) OVA 감작/노출된 그룹 (AAD);
iii) OVA 감작 노출되고 마우스 한 마리 당 1x106 의 MCA-MSC가 IN으로 투여된 그룹;
iv) OVA 감작 노출되고 마우스 한 마리 당 1x106 의 MCA-MSC가 IV로 투여된 그룹; 및
vi) OVA 감작 노출되고 마우스 한 마리 당 1x106 의 MCA-MSC가 ET로 투여된 그룹.
20 % SD를 갖는 상기 디자인은 n = 8 마우스/그룹으로 25 % 효과를 검출하기 위해 90 % 파워 (power)를 제공하였다.
기도 과민 반응성 (폐 기능의 측정)을 분석하였고, 도 11에 보고하였다.
OVA-유도된 만성 AAD를 가진 마우스는 식염수-처리된 대응물과 비교하여 기관지 수축제의 용량 증가에 반응하여 AHR을 유의하게 악화시켰다. 상기 OVA-유도된 AHR은 MCA-MSC의 IN 또는 IV 투여에 의해 79-80 % 만큼 유의하게 감소되었다 (진행 중인 OVA-유도된 손상이 존재하는 경우 9-11 주에서 주 1 회 투여). MCA-MSC로 IN- 또는 IV-처리된 마우스 대 식염수-처리된 대조군 사이에 AHR에 대하여 유의한 차이는 없었다.
MCA-MSC의 ET 투여는 AHR을 61 % 만큼 감소시켰으며, 이는 OVA 그룹 단독으로부터 측정된 것보다 여전히 유의하게 낮았지만, 식염수 그룹으로부터 측정된 것보다 유의하게 높았다.
IN- 대 IV- 대 ET-처리된 그룹 간에 AHR에 대하여 유의한 차이가 없었으며, 이는 3 가지 MCA-MSC 전달 방식 모두 만성 AAD/ 천식 치료의 실현 가능한 접근법을 제공함을 나타낸다.
분석될 추가적인 엔드포인트는 하기를 포함한다:
i) 염증 점수;
ii) 술잔 세포의 화생화;
iii) 상피 두께;
iv) 상피 손상;
v) 상피하의 콜라겐 두께;
vi) 총 폐 콜라겐 농도;
vii) 상피 TGF-베타 1 염색;
viii) 상피하의 근섬유모세포의 밀도; 및
ix) 젤라티나제 (MMP-2 및 MMP-9)의 발현/활성.

Claims (14)

  1. 중간엽 혈관 모세포의 중간엽 줄기세포 (mesenchymoangioblast mesenchymal stem cell: MCA-MSC)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 알레르기성 기도 질환 (allergic airways disease: AAD)/ 천식을 치료하는 방법으로서, 상기 MCA-MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p, 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는 것인 방법.
  2. 대상체에서 알레르기성 기도 질환 (AAD)/ 천식 치료용 의약의 제조에서 중간엽 혈관 모세포의 중간엽 줄기세포 (MCA-MSC)의 용도로서, 상기 MCA-MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p, 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는 것인 용도.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 MCA-MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+ CD31-CD45- 표현형을 갖는 것인 방법 또는 용도.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCA-MSC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 방법 또는 용도:
    (a) LiCl 및 FGF2를 포함하지만, PDGF는 제외된 중간엽-콜로니 형성 배지 (M-CFM)에서 중간엽 콜로니가 형성되기에 충분한 시간 동안 정상산소 조건 하에서 원시 중배엽 세포 (primitive mesoderm cell)를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)의 중간엽 콜로니를 부착 배양하여 MCA-MSC를 생성하는 단계.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCA-MSC는 정맥 내 또는 비강 내로 투여되는 것인 방법 또는 용도.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MCA-MSC는 비강 내로 투여되는 것인 방법 또는 용도.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 약 1x106 내지 약 1x109 의 MCA-MSC를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유류인 것인 방법 또는 용도.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것인 방법 또는 용도.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 천식 치료를 위해 코르티코스테로이드 (corticosteroid) 또는 β-작용제 (β-agonist)를 미리 투여한 것인 방법 또는 용도.
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 천식 치료를 위해 코르티코스테로이드 또는 β-작용제를 미리 투여하지 않은 것인 방법 또는 용도.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 중증 천식 또는 중증-난치성 천식을 가진 것인 방법 또는 용도.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAD/ 천식의 치료는 하기를 포함하는 것인 방법 또는 용도:
    (a) AI, AWR, 기도 섬유증, 폐 섬유증, 술잔 세포의 화생화 (goblet cell metaplasia), 상피 비후, 기도 전환 성장 인자 (TGF)-β1의 수준, 상피하의 근섬유모세포 (myofibroblast)의 밀도, 상피하의 콜라겐 농도, 또는 폐의 총 콜라겐 농도의 감소; 또는
    (b) 폐 MMP (matrix metalloproteinase)의 활성 증가; 또는
    (c) 상기 (a)의 임의의 하나 이상의 특징들의 조합 또는 상기 (a) 및 (b)의 임의의 하나 이상의 특징들의 조합.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 코르티코스테로이드 또는 β-작용제를 투여하지 않는 것인 방법 또는 용도.
KR1020207007796A 2017-09-15 2018-08-31 알레르기성 기도 질환 (aad)/ 천식을 치료하는 방법 Ceased KR20200053501A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2017903758A AU2017903758A0 (en) 2017-09-15 Method
AU2017903758 2017-09-15
PCT/AU2018/050937 WO2019051536A1 (en) 2017-09-15 2018-08-31 METHOD OF TREATING ALLERGIC RESPIRATORY TRACT DISEASE (DAA) / ASTHMA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200053501A true KR20200053501A (ko) 2020-05-18

Family

ID=65722228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207007796A Ceased KR20200053501A (ko) 2017-09-15 2018-08-31 알레르기성 기도 질환 (aad)/ 천식을 치료하는 방법

Country Status (14)

Country Link
US (1) US11471493B2 (ko)
EP (1) EP3681519B1 (ko)
JP (1) JP2020533373A (ko)
KR (1) KR20200053501A (ko)
CN (1) CN111093680A (ko)
AR (1) AR112802A1 (ko)
AU (1) AU2018333272B2 (ko)
BR (1) BR112020004856A2 (ko)
CA (1) CA3074470C (ko)
ES (1) ES2996339T3 (ko)
MX (1) MX2020002760A (ko)
SG (1) SG11202001909TA (ko)
TW (1) TWI806896B (ko)
WO (1) WO2019051536A1 (ko)

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100785969B1 (ko) * 2004-05-12 2007-12-14 동아제약주식회사 Ｆｇｆ2를 유효성분으로 포함하는 천식 및 만성폐쇄성폐질환 예방 또는 치료제
KR20130128438A (ko) * 2010-12-17 2013-11-26 안트로제네시스 코포레이션 양막 유래 부착성 세포를 사용한, 면역-관련 질환 및 장애의 치료
CA2866590A1 (en) * 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
US20150064141A1 (en) * 2012-04-05 2015-03-05 The Regents Of The University Of California Regenerative sera cells and mesenchymal stem cells
CN104704122A (zh) * 2012-04-20 2015-06-10 艾珀特玛治疗公司 产热的miRNA调节剂
HK1208054A1 (en) * 2012-07-12 2016-02-19 爱姆斯坦生物技术公司 Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof
DK2880151T3 (da) * 2012-08-06 2020-08-17 Brainstorm Cell Therapeutics Ltd Fremgangsmåder til frembringelse af mesenkymale stemceller, som udskiller neurotrofiske faktorer
CA2893951C (en) * 2012-12-12 2022-05-03 Mesoblast, Inc. Methods of treating or preventing respiratory conditions
HUE043785T2 (hu) 2013-03-13 2019-09-30 Wisconsin Alumni Res Found Módszerek és anyagok humán pluripotens õssejtek hematoendothelialis differenciálására meghatározott körülmények között
WO2016094932A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Cell Ideas Pty Ltd Improved cell therapies
US11174461B2 (en) 2016-03-16 2021-11-16 Cynata Therapeutics Limited Colony forming medium and use thereof
WO2018023170A1 (en) * 2016-08-04 2018-02-08 Hudson Institute of Medical Research A method of treatment
JP2020523400A (ja) 2017-06-16 2020-08-06 サイナータ セラピューティクス リミテッド 免疫療法の副作用を治療するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020111190A (ru) 2021-10-15
JP2020533373A (ja) 2020-11-19
EP3681519A4 (en) 2021-04-28
EP3681519C0 (en) 2024-10-30
CA3074470A1 (en) 2019-03-21
WO2019051536A1 (en) 2019-03-21
US11471493B2 (en) 2022-10-18
TWI806896B (zh) 2023-07-01
BR112020004856A2 (pt) 2020-09-15
MX2020002760A (es) 2020-07-20
ES2996339T3 (en) 2025-02-12
AU2018333272B2 (en) 2022-12-08
EP3681519A1 (en) 2020-07-22
RU2020111190A3 (ko) 2022-03-30
SG11202001909TA (en) 2020-04-29
US20200276243A1 (en) 2020-09-03
CA3074470C (en) 2024-01-16
EP3681519B1 (en) 2024-10-30
CN111093680A (zh) 2020-05-01
AR112802A1 (es) 2019-12-11
AU2018333272A1 (en) 2020-03-05
TW201919666A (zh) 2019-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12545889B2 (en) Colony forming medium and use thereof
KR101921787B1 (ko) 자간전증의 예방 및 치료 방법
Ikhapoh et al. Sry-type HMG box 18 contributes to the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to endothelial cells
JPWO2017110425A1 (ja) 肝疾患治療剤及び肝疾患を治療する方法
KR20200053501A (ko) 알레르기성 기도 질환 (aad)/ 천식을 치료하는 방법
RU2790031C2 (ru) Способ лечения аллергического заболевания дыхательных путей (AAD)/астмы
EP3873503B1 (en) Treatment of cachexia using fibroblast cells and products thereof
HK40024451B (en) Method for treating allergic airways disease (aad)/ asthma
HK40024451A (en) Method for treating allergic airways disease (aad)/ asthma
US20220119773A1 (en) Method for improving angiogenic potential of a mesenchymal stem cell
WO2022241090A9 (en) Methods and compositions for treating liver disease
HK40116423A (en) Treatment of cachexia using fibroblast cells and products thereof
HK40000643B (en) Colony forming medium and use thereof
HK40000643A (en) Colony forming medium and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20200317

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210810

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20240411

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20240613

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20240411

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I