KR20200057701A - 수의과용 igg fc 변이체 - Google Patents

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Abstract

정제의 용이성을 위한 증가된 단백질 A 결합, 감소된 상보체-매개된 면역 반응을 위한 감소된 C1q 결합, 저하된 CD16 결합(예컨대, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 유도를 위함), 증가된 안전성, 및/또는 이종이량체성 단백질을 형성하는 능력)을 갖는 반려 동물의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드와 관련한 다양한 구현예가 제공된다. 또한, 항체 및 이러한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질과 관련된 다양한 구현예가 제공되어 있다. 또한 증진된 혈청 반감기를 갖는 하나 이상의 변이체 GLP1 폴리펩타이드(들)을 포함하는 연속된 폴리펩타이드에 관한 다양한 구현예가 제공된다. 또한 연속된 폴리펩타이드 또는 이중 GLP1 수용체 및 글루카곤 수용체 효능제로서 GLP1 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 폴리펩타이드에 관한 다양한 구현예가 제공된다. 다양한 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 개, 고양이, 및 말과 같은 반려 동물에서 예를 들면, 당뇨병, 비만, 또는 관련된 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

수의과용 IGG FC 변이체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 15일자로 출원된 미국 가특허원 제62/545,858호의 우선권의 이익을 청구하며, 이는 임의의 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 개시내용은 향상된 특징, 예컨대, 증가된 단백질 A 결합(예컨대, 정제의 용이성을 위함), 감소된 C1q 결합(예컨대, 감소된 상보체-매개된 면역 반응을 위함), 감소된 CD16 결합(예컨대, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 유도를 위함), 증가된 안전성, 및/또는 이종이량체성 단백질(heterodimeric protein)을 형성하는 능력을 지닌 반려 동물의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 개시내용의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 반려 동물 치료법에서 광범위한 적용능(applicability)을 가질 수 있다. 예를 들면, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 반려 동물, 예컨대, 개(canine), 고양이(feline), 및 말(equine)에서 예를 들면, 당뇨병, 비만, 또는 관련된 증상을 치료하기 위한 장기-작용하는 GLP1 폴리펩타이드의 설계 및 생산에 사용될 수 있다. 또한, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 반려 동물에서 다양한 장애를 치료하기 위한 항체 또는 융합 단백질의 설계 및 생산에 사용될 수 있다.
배경
IgG Fc는 FcRn, Fc 수용체, 및 C1q와의 상호작용을 통해 Fc-매개된 작용에서 중요한 역활을 담당한다. 반려 동물에서, 다양한 IgG 아형(subtype)은 이의 작용에 있어서 차이를 지니며, 이는 치료학적 또는 진단학적 적용을 위해 특별한 IgG 항체 또는 IgG Fc 융합 단백질을 선택하는 경우 흔히 고려된다. 예를 들면, C1q 또는 CD16에 대해 약하거나 측정할 수 없는 결합 친화성을 갖는 IgG 아형의 능력이 유리할 수 있다. 또한, 단백질 A에 결합하는 IgG Fc의 능력은 단백질 A 친화성 정제 플랫폼(platform)을 사용한 정제를 위해 유용할 수 있다.
그러나, 개, 고양이, 및 말의 대부분의 IgG Fc 아형은 단백질 A 결합 특성, CD16에 대해 약하거나 측정불가능한 결합 친화성, 및 C1q에 대해 약하거나 측정불가능한 결합 친화성을 지니지 않는다. 예를 들면, 4개의 개 IgG Fc 아형(IgG-A, IgG-B, IgG-C, 및 IgG-D) 중에서, 개 IgG-B Fc 만이 단백질 A에 대해 주목할만한 친화성을 갖는다. 한편, 개 IgG-A Fc 및 IgG-D Fc 만이 약한 C1q 결합 또는 CD16 결합을 가지거나 가지지 않는다. C1q 및/또는 CD16에 대해 감소된 결합을 가지고/가지거나 단백질 A에 결합할 수 있는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 항체 및 Fc 융합 단백질이 바람직하다.
글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1)은 강력한 항고혈당성 호르몬이며, 이는 혈당 수준을 조절하는데 있어서 중요한 역활을 한다. 천연의 GLP1은 대략 2분의 생체내(in vivo) 반감기를 갖는다. 장기-작용하는 GLP1 폴리펩타이드는 당뇨병 및 비만을 치료하고/하거나, 당뇨병을 예방하고/하거나, 고혈당성 상태를 제어하거나, 지질을 낮추거나, 저하된 혈당 수준으로부터 유리할 수 있는 상태를 치료하고/하거나, 위 또는 장 운동을 억제하고/하거나, 공복을 늦추고/늦추거나 사료 섭취를 감소시키는데 사용될 수 있다. 반려 동물, 예컨대, 개, 고양이, 및 말에서 고 혈당 또는 제어할 수 없는 혈당-유도된 상태를 치료하기 위한 장기-작용하는 GLP1 폴리펩타이드에 대한 요구가 남아있다.
발명의 요약
구현예 1. 반려 동물 종의 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여(relative to) 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
구현예 2. 반려 동물 종의 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q 및/또는 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다.
구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 생물층 간섭법(biolayer interferometry)으로 측정하여, C1q 및/또는 CD16에 5 x 10-6 M 초과, 1 x 10-5 M 초과, 5 x 10-5 M 초과, 1 x 10-4 M 초과, 5 x 10-4 M 초과, 또는 1 x 10-3 M 초과의 해리 상수(dissociation constant)(Kd)로 결합한다.
구현예 4. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
구현예 5. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 단백질 A에 생물층 간섭법으로 측정하여, 5 x 10-6 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 5 x 10-7 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 5 x 10-8 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만, 5 x 10-11 M 미만, 1 x 10-11 M 미만, 5 x 10-12 M 미만, 또는 1 x 10-12 M 미만의 해리 상수(Kd)로 결합한다.
구현예 6. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 반려 동물 종은 개, 고양이, 또는 말이다.
구현예 7. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드는
a) 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 또는 IgG-D Fc;
b) 말 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, IgG5 Fc, IgG6 Fc, 또는 IgG7 Fc; 또는
c) 고양이 IgG1a Fc, IgG1b Fc, 또는 IgG2 Fc이다.
구현예 8. 야생형 고양이 또는 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 힌지 영역(hinge region)에 대해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 환원 및/또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석으로 측정하여, 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 증가된 재조합 생산 및/또는 증가된 힌지 이황화물 형성(disulfide formation)을 갖는다.
구현예 9. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다);
b) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다); 및/또는
c) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 20번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다).
구현예 10. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다);
b) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다); 및/또는
c) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 20번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다).
구현예 11. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에 상응하는 위치에서 또는 16번 위치에서 프롤린을 포함한다);
b) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에 상응하는 위치 또는 3번 위치에서 세린을 포함한다); 및/또는
c) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 20번 위치에 상응하는 위치 또는 20번 위치에서 프롤린을 포함한다)을 포함한다.
구현예 12. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 상이한 동형의 IgG Fc 폴리펩타이드로부터의 힌지 영역 또는 힌지 영역의 부위를 포함한다.
구현예 13. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG-1a Fc 폴리펩타이드, 야생형 고양이 IgG-1b Fc 폴리펩타이드, 또는 야생형 말 IgG1 Fc 폴리펩타이드로부터의 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부를 포함한다.
구현예 14. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 19, 서열 번호: 125 또는 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135를 포함한다.
구현예 15. 서열 번호: 19, 서열 번호: 125 또는 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 16. 야생형 고양이 IgG2 Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 IgG2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 시스테인이고, 여기서 변이체 IgG2 Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG2 Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 쇄-간 이황화물 결합을 형성할 수 있다.
구현예 17. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 시스테인이고, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 쇄-간 이황화물 결합을 형성할 수 있다.
구현예 18. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 15의 8번 위치, 9번 위치, 10번 위치, 11번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치, 15번 위치, 또는 16번 위치에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
구현예 19. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16의 14번 위치에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다.
구현예 20. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16의 14번 위치에서 시스테인을 포함한다.
구현예 21. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 100, 서열 번호: 107, 서열 번호: 108, 서열 번호: 109, 서열 번호: 110, 서열 번호: 111, 서열 번호: 112, 서열 번호: 113, 서열 번호: 114, 서열 번호: 115, 서열 번호: 116, 서열 번호: 117, 서열 번호: 118, 서열 번호: 119, 서열 번호: 120, 서열 번호: 121, 서열 번호:122, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124, 서열 번호: 125, 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135, 서열 번호: 136, 서열 번호: 137, 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 서열 번호: 147, 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 153, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일하고 적어도 95% 동일하고 적어도 97% 동일하고 또는 적어도 99% 동일하다.
구현예 22. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 17을 포함한다.
구현예 23. 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 24. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
d) 서열 번호: 64의 15번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
e) 서열 번호: 67의 199번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 및/또는
f) 서열 번호: 68의 199번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 200번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 201번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환.
구현예 25. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 아미노산 치환;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 아미노산 치환;
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 아미노산 치환;
d) 서열 번호: 64의 15번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에서 아미노산 치환;
e) 서열 번호: 67의 199번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에서 아미노산 치환; 및/또는
f) 서열 번호: 68의 199번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 200번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 201번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에서 아미노산 치환.
구현예 26. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치의 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신;
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘;
d) 서열 번호: 64의 15번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 발린;
e) 서열 번호: 67의 199번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘; 및/또는
f) 서열 번호: 68의 199번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 68의 200번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘, 서열 번호: 68의 201번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘.
구현예 27. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 히스티딘;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 이소루이신;
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 히스티딘;
d) 서열 번호: 64의 15번 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에서 발린;
e) 서열 번호: 67의 199번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에서 히스티딘; 및/또는
f) 서열 번호: 68의 199번 위치에서 루이신, 서열 번호: 68의 200번 위치에서 히스티딘, 서열 번호: 68의 201번 위치에서 아스파라긴, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에서 히스티딘.
구현예 28. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 또는 서열 번호: 84; 또는
b) 서열 번호: 19, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 75, 또는 서열 번호: 76.
구현예 29. 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 84, 서열 번호: 19, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 75, 또는 서열 번호: 76의 아미노 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 30. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
b) 서열 번호: 63의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 65의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 66의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
c) 서열 번호: 80의 198번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환.
구현예 31. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아미노산 치환;
b) 서열 번호: 63의 87번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 65의 87번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 66의 87번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에서 아미노산 치환; 또는
c) 서열 번호: 80의 198번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에서 아미노산 치환.
구현예 32. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌;
b) 서열 번호: 63의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 65의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린 치환, 서열 번호: 66의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린; 또는
c) 서열 번호: 80의 198번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌.
구현예 33. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아르기닌;
b) 서열 번호: 63의 87번 위치에서 세린, 서열 번호: 65의 87번 위치에서 세린, 서열 번호: 66의 87번 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에서 세린; 또는
c) 서열 번호: 80의 198번 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에서 알라닌.
구현예 34. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 또는 서열 번호: 84; 또는
b) 서열 번호: 70, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 또는 서열 번호: 77; 또는
c) 서열 번호: 82 또는 서열 번호: 83.
구현예 35. 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 84, 서열 번호: 70, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 77, 서열 번호: 82, 또는 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 36. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환.
구현예 37. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 아미노산 치환; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 아미노산 치환.
구현예 38. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신.
구현예 39: 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 글리신; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 글리신.
구현예 40. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 또는 서열 번호: 147; 또는
b) 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157.
구현예 41. 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 서열 번호: 147, 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 42. 다음을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드:
a) 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 2의 137번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판; 또는
b) 서열 번호: 16의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판.
구현예 43. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 138번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 2의 137번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 3의 137번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에서 타이로신 또는 트립토판; 또는
b) 서열 번호: 16의 154번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 154번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 서열 번호:118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판.
구현예 44. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 서열 번호: 115, 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 45. 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 서열 번호: 115, 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 46. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
구현예 47. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
구현예 48. 다음을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드:
a) 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 2의 의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 16의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린;
b) 서열 번호: 1의 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 2의 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 3의 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 16의 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌; 및/또는
c) 서열 번호: 1의 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 2의 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 16의 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌.
구현예 49. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 138번 위치에서 세린, 서열 번호: 2의 137번 위치에서 세린, 서열 번호: 3의 137번 위치에서 세린, 서열 번호: 4의 138번 위치에서 세린, 서열 번호: 16의 154번 위치에서 세린, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 154번 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에서 세린;
b) 서열 번호: 1의 140번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 2의 139번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 3의 139번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 140번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 16의 156번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 156번 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 156번 위치에서 알라닌; 및/또는;
c) 서열 번호: 1의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 2의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 16의 197번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 197번 위치에서 트레오닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 197번 위치에서 트레오닌.
구현예 50. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 서열 번호: 116, 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 51: 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 서열 번호: 116, 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 124의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 52. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 폴리펩타이드는 글리코실화되어 있다.
구현예 53. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나의 폴리펩타이드로서, 여기서 폴리펩타이드는 아글리코실화(aglycosylating)되어 있다.
구현예 54. 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
구현예 55. 구현예 48 내지 53 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
구현예 56. 구현예 46의 연속된 폴리펩타이드 및 구현예 54의 연속된 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질.
구현예 57. 구현예 47의 연속된 폴리펩타이드 및 구현예 55의 연속된 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질.
구현예 58. 구현예 46, 47, 또는 54 내지 57 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 GLP1 폴리펩타이드는 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 임의로 포함하는, 야생형 GLP1 폴리펩타이드이다.
구현예 59. 구현예 46, 47, 또는 54 내지 58 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 GLP1 폴리펩타이드는 변이체 GLP1 폴리펩타이드이다.
구현예 60. 구현예 46, 47, 또는 54 내지 59 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체 단백질로서, 여기서 GLP1 폴리펩타이드는 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 98, 또는 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 61. 구현예 46, 47, 또는 54 내지 60 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 글루카곤 폴리펩타이드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 임의로 포함하는, 야생형 글루카곤 폴리펩타이드이다.
구현예 62. 구현예 46, 47, 또는 54 내지 61 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 글루카곤 폴리펩타이드는 변이체 글루카곤 폴리펩타이드이다.
구현예 63. i) 제1의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드; 또는
ii) 제1의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질로서, 여기서:
a) 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치, 서열 번호: 2의 137번 위치, 서열 번호: 3의 137번 위치, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에서 아미노산 치환을 포함하고/하거나;
b) 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치, 140번 위치, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치, 서열 번호: 2의 137번 위치, 139번 위치, 및/또는 180번 위치, 서열 번호: 3의 137번 위치, 139번 위치, 및/또는 180번 위치, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치, 140번 위치, 및/또는 181번 위치에서 아미노산 치환을 포함하고/하거나;
c) 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고/하거나;
d) 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치, 156번 위치, 및/또는 197번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
구현예 64. 구현예 63의 이종이량체성 단백질로서, 여기서 제1의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 동일한 IgG 아형이고/이거나 제1의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 동일한 IgG 아형으로부터 유래된다.
구현예 65. 구현예 63의 이종이량체성 단백질로서, 여기서 제1의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 상이한 IgG 아형으로부터 유래되고/되거나 제1의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 동일한 IgG 아형으로부터 유래된다.
구현예 66. 구현예 63 내지 65 중 어느 하나의 이종이량체성 단백질로서, 여기서:
a) 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치, 서열 번호: 2의 137번 위치, 서열 번호: 3의 137번 위치, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함하고/하거나;
b) 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 트립토판을 포함한다.
구현예 67. 구현예 63 내지 66 중 어느 하나의 이종이량체성 단백질로서, 여기서:
a) 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 2의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 및/또는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하고/하거나;
b) 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다.
구현예 68. 구현예 63 내지 67 중 어느 하나의 이종이량체성 단백질로서, 여기서:
a) 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 또는 서열 번호: 115의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
b) 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 69: 구현예 63 내지 68 중 어느 하나의 이종이량체성 단백질로서, 여기서:
a) 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 또는 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
b) 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 70. 구현예 42 내지 69 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형을 포함하고 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다.
구현예 71. 구현예 42 내지 70 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환.
구현예 72. 구현예 42 내지 71 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 207번 위치에서 아미노산 치환;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 아미노산 치환; 또는
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 아미노산 치환.
구현예 73. 구현예 42 내지 72 중 임의의 하나의 구현예의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신; 또는
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘.
구현예 74. 구현예 42 내지 73 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 히스티딘;
b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 이소루이신; 또는
c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 히스티딘.
구현예 75. 구현예 42 내지 74 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형을 포함하고 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다.
구현예 76. 구현예 42 내지 75 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환.
구현예 77. 구현예 42 내지 76 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 아미노산 치환; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 아미노산 치환.
구현예 78. 구현예 42 내지 77 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신.
구현예 79. 구현예 42 내지 78 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 글리신; 또는
b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 글리신.
구현예 80. 구현예 42 내지 79 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형을 포함하고 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다.
구현예 81. 구현예 42 내지 80 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
구현예 82. 구현예 42 내지 81 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
구현예 83. 구현예 42 내지 82 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다.
구현예 84. 구현예 42 내지 83 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아르기닌을 포함한다.
구현예 85. 구현예 1 내지 84 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질로서, 여기서 폴리펩타이드는 항체, 항체 융합체, 또는 융합 폴리펩타이드이다.
구현예 86.
a) 제1의 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드(GLP1A);
b) 제1의 링커(linker) (L1);
c) 반려 동물 종의 Fc 폴리펩타이드(Fc);
d) 임의로, 제2의 링커(L2); 및
e) 임의로, 제2의 GLP1 폴리펩타이드(GLP1B)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
구현예 87. 화학식 (I): GLP1A-L1-Fc; 또는
화학식 (II): Fc-L1-GLP1A를 포함하는 구현예 65의 연속된 폴리펩타이드.
구현예 88. 화학식 (III): GLP1A-L1-Fc-L2-GLP1B를 포함하는 구현예 65의 연속된 폴리펩타이드.
구현예 89. 구현에 86 내지 88 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 GLP1B는, 존재하는 경우, GLP1A와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 90.
a) 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드;
b) 제1의 링커(L1);
c) Fc 폴리펩타이드(Fc);
d) 제2의 링커(L2); 및
e) 글루카곤 폴리펩타이드(Gluc)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
구현예 91.
화학식 (IV): GLP1-L1-Fc-L2-Gluc; 또는
화학식 (V): Gluc-L1-Fc-L2-GLP1을 포함하는 구현예 90의 연속된 폴리펩타이드.
구현예 92. 구현예 86 내지 91 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 GLP1A, GLP1, 및/또는 GLP1B는, 존재하는 경우, 야생형 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다.
구현예 93. 구현예 86 내지 92 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 GLP1A, GLP1, 및/또는 GLP1B는, 존재하는 경우, 변이체 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다.
구현예 94. 구현예 86 내지 93 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 GLP1A, GLP1, 및/또는 GLP1B는, 존재하는 경우, 서열 번호: 85, 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 98, 또는 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 95. 구현예 86 내지 94 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 글루카곤 폴리펩타이드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 임의로 포함하는 야생형 글루카곤 폴리펩타이드를 포함한다.
구현예 96. 구현예 86 내지 95 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 글루카곤 폴리펩타이드는 변이체 글루카곤 폴리펩타이드이다.
구현예 97. 구현예 86 내지 96 중 어느 하나의 구현예의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는 사람 IgG Fc이다.
구현예 98. 구현예 86 내지 97 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는 사람 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, 또는 IgG4 Fc이다.
구현예 99. 구현예 86 내지 98 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는 반려 동물 종의 Fc이다.
구현예 100. 구현예 86 내지 97 또는 99 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는:
a) 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 또는 IgG-D Fc;
b) 말 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, IgG5 Fc, IgG6 Fc, 또는 IgG7 Fc; 또는
c) 고양이 IgG1a Fc, IgG1b Fc, 또는 IgG2 Fc를 포함한다.
구현예 101. 구현예 86 내지 100 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드이다.
구현예 102. 구현예 86 내지 100 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드이다.
구현예 103. 구현예 86 내지 102 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 Fc 폴리펩타이드는 구현예 1 내지 84 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질을 포함한다.
구현예 104. 구현예 85 내지 102 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 연속된 폴리펩타이드는 야생형 GLP1 폴리펩타이드보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는다.
구현예 105. 구현예 86 내지 104 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 L1 및 L2는, 존재하는 경우, 각각 독립적으로 가요성 링커(flexible linker)이다.
구현예 106. 구현예 86 내지 105 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 L1 및 L2의 아미노산 서열은, 존재하는 경우, 각각 독립적으로 100%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%의 세린 및/또는 글리신 아미노산 잔기를 포함한다.
구현예 107. 구현예 86 내지 106 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 연속된 폴리펩타이드는 이의 C-말단에서 연장을 포함한다.
구현예 108. 구현예 86 내지 107 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 연속된 폴리펩타이드는 이의 C-말단에서 글리신 잔기, 2개의 글리신 잔기, 3개의 글리신 잔기, 4개의 글리신 잔기, 5개의 글리신 잔기, 6개의 글리신 잔기, 7개의 글리신 잔기, 8개의 글리신 잔기, 또는 8개 이상의 글리신 잔기를 포함한다.
구현예 109. 구현예 86 내지 108 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 연속된 폴리펩타이드는 이의 C-말단에서 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 94, 또는 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 110. 구현예 86 내지 109 중 어느 하나의 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 연속된 폴리펩타이드는:
a) 서열 번호: 23; 서열 번호: 24; 서열 번호: 25; 서열 번호: 26; 서열 번호: 27; 서열 번호: 28; 서열 번호: 29; 서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42; 서열 번호: 43; 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97, 서열 번호: 103, 서열 번호: 104, 서열 번호: 105, 또는 서열 번호: 106의 아미노산 서열; 또는
b) 서열 번호: 52; 서열 번호: 53; 서열 번호: 54; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 또는 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예 111. 서열 번호: 23; 서열 번호: 24; 서열 번호: 25; 서열 번호: 26; 서열 번호: 27; 서열 번호: 28; 서열 번호: 29; 서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42; 서열 번호: 43; 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97, 서열 번호: 52; 서열 번호: 53; 서열 번호: 54; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 103; 서열 번호: 104, 서열 번호: 105, 또는 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
구현예 112. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드로서, 여기서 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 치환은 아미노산 유도체를 지닌 아미노산 치환을 포함한다.
구현예 113. 앞서의 구현예 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산.
구현예 114. 구현예 113의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
구현예 115. 구현예 114의 숙주 세포를 배양하고 폴리펩타이드를 단리함을 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
구현예 116. 구현예 1 내지 112 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
구현예 117. 세포내에서 cAMP의 증가된 생산 방법으로서, 이러한 방법은 세포를 구현예 1 내지 112 또는 116 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물에 GLP1R에 대한 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드의 결합을 허용하는 조건 하에 노출시킴을 포함한다.
구현예 118. 구현예 117의 방법으로서, 여기서 세포가 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물에 생체외에서(ex vivo) 노출되는 방법.
구현예 119. 구현예 117의 방법으로서, 여기서 세포는 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물에 생체내에서(in vivo) 노출되는 방법.
구현예 120. 구현예 118 또는 119의 방법으로서, 여기서 세포는 사람 세포, 개 세포, 고양이 세포, 또는 말 세포이다.
구현예 121. 구현예 1 내지 112 또는 116 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 비경구적으로 투여함을 포함하여, 대상체에게 폴리펩타이드를 전달하는 방법.
구현예 122. 구현예 1 내지 112 또는 116 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 근육내 경로, 복강내 경로, 뇌척수내 경로, 피하 경로, 동맥내 경로, 윤활액내 경로, 척수강내 경로, 또는 흡입 경로에 의해 투여함을 포함하여, 폴리펩타이드를 대상체로 전달하는 방법.
구현예 123. 당뇨병 또는 비반을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 이러한 방법은 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 구현예 1 내지 112 또는 116 중 어느 하나의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
구현예 124. 인슐린, DPP4 억제제, SGLT2 억제제, 비구아니드 설포닐우레아스 메글리티니드 유도체, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온(TZD), 아밀리노모사체(amylinomimetic), 담즙산 격리제(sequestrant), 도파민 효능제를 투여함을 포함하는, 구현예 123의 방법.
구현예 125. 구현예 121 내지 124 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 대상체는 사람 대상체이다.
구현예 126. 구현예 121 내지 124 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 대상체는 반려 동물 종이다.
구현예 127. 구현예 126의 방법으로서, 여기서 대상체는 개, 말, 또는 고양이이다.
도 1은 개 IgG-A, B, C, 및 D Fc 서열의 정렬을 나타낸다. 박스는 단백질 A와 접촉하는 경향이 있는 영역을 나타낸다.
도 2a는 환원제(DTT)의 부재 및 존재하에서 하나의 이황화물 결합을 지닌 야생형 고양이 IgG2 힌지를 갖는 GLP1-G8/GLP-2G_III_WTfeIgG2(서열 번호: 23; 당해 도에서 "GLP1 변이체") 및 GLP1-G8_I_WTfeIgG2(서열 번호: 24; 당해 도에서 "GLP1 B 변이체")의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 2b는 환원제(DTT)의 부재 및 존재하에서 2개의 이황화물 결합을 지닌 변이체 고양이 IgG2 힌지를 갖는 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26; 당해 도에서 "GLP1 MB 변이체")의 GLP1-G8/GLP-2G_III_VARfeIgG2(서열 번호: 25; 당해 도에서 "GLP1 MA 변이체")의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 3은 대조군 (GLP1(7-37) 및 엑텐딘-4)과 비교하여 GLP1-G8/GLP1-2G_III_VARfeIgG2(서열 번호: 25) 및 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)의 활성을 평가하기 위한 cAMP CHO-K1 GLP1R 생물검정을 나타낸다.
도 4는 CHOK1-GLP1R 세포 및 cAMP-glo(n=2)와 함께 1년 저장 후 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)(당해 도에서 "GLP1-B")의 활성을 평가하기 위한 세포-기반 생물검정을 나타낸다.
도 5는 37℃에서 24시간 동안 혈청 속에서(레인 1), 37℃에서 24시간 동안 PBS 속에서(레인 2), 4℃에서 24시간 동안 PBS 속에서(레인 9) 항온처리 후 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)(이러한 도에서 "GLP1B")의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 나타낸다. 마우스 항-GLP1 항체를 사용하였다.
도 6은 정량적 ELISA로 측정하여, 5마리의 고양이에게 피하 투여 후 시간에 걸쳐 혈청 속의 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26) 농도의 플롯이다.
도 7은 세포-기반 활성 검정으로 측정하여, 5마리의 고양이에게 피하 투여 후 시간에 걸쳐 혈청 속의 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호:26) 농도의 플롯을 나타낸다. 0 내지 168 시간의 평균 AUC는 약 840 μg(h)/mL이었고 평균 t1/2은 36 시간이었다.
서열의 설명
도 1은 본원에 언급된 예시적인 서열의 목록을 제공한다.
[표 1]
Figure pct00001

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구현예의 설명
반려동물, 예컨대, 개, 말, 및 고양이로부터의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 변이체 igG Fc 폴리펩타이드는 단백질 A에 대해 증가된 결합, C1q에 대해 감소된 결합, CD16에 대해 감소된 결합, 증가된 안전성, 증가된 재조합체 생산, 증가된 힌지 이황화물 형성을 가지고/가지거나 이종이량체성 폴리펩타이드를 형성한다. 일부 구현예에서, 항체, 항체 단편, 또는 융합 단백질은 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 생산하거나 정제하는 방법 및 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 반려 동물에게 투여하는 방법이 또한 제공된다.
또한 증진된 혈청 반감기를 갖는 하나 이상의 변이체 GLP1 폴리펩타이드(들)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드 및 이종이량체성 폴리펩타이드에 관한 다양한 구현예가 제공된다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 폴리펩타이드는 이중 GLP1 수용체 및 글루카곤 수용체 효능제로서 GLP1 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리펩타이드는 반려 동물, 예컨대 개, 고양이, 및 말에서 예를 들면, 당뇨병, 비만, 또는 관련 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
구독자의 편의를 위하여, 본원에 사용된 용어의 다음 정의가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, 수치 용어, 예컨대, KD는 과학적 측정을 기반으로 계산되므로, 적절한 측정 오류에 속한다. 일부 예에서, 수치 용어는 가장 근접한 유의적인 숫자 주변의 수치 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수형("a" 또는 "an")은 달리 규정하지 않는 한, "적어도 하나의" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "또는"은 달리 규정하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 다수의 종속항의 맥락에서, 다른 청구항을 다시 인용하는 경우 "또는"의 사용은 대안적으로만 이러한 청구항을 지칭한다.
예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
신규한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 예를 들면, 단백질 A에 대한 증가된 결합을 위한, C1q에 대한 감소된 결합을 위한, CD16에 대한 감소된 결합을 위한, 증가된 안전성을 위한, 증가된 재조합 생산을 위한, 힌지 이황화물 형성을 위한, 및/또는 이종이량체성 단백질 검정을 형성하기 위한, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 제공된다.
"아미노산 서열"은 펩타이드 또는 단백질내 아미노산 잔기의 서열을 의미한다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 함유하며, 아미노산 잔기의 펩타이드, 올리고펩타이드, 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전체-길이의 단백질 및 이의 단편 둘 다는 이러한 정의에 포함된다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 개시내용의 목적을 위해, "폴리펩타이드"는 단백질이 목적한 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대해 변형, 예컨대, 결실, 첨가, 및 치환(일반적으로 천연적으로 보존성인)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 고려될 수 있거나, 우발적으로, 예컨대, 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통한 또는 PCR 증폭으로 인한 오류일 수 있다.
"단편 결정화가능한 폴리펩타이드" 또는 "Fc 폴리펩타이드"는 효과기(effector) 분자 및 세포와 상호작용하는 항체 분자의 부위이다. 이는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, Fc 폴리펩타이드는 전체 Fc 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 Fc 도메인의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 FcRn에 결합하는 능력이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 C1q에 결합하는 능력이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 CD16에 결합하는 능력이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 단백질 A에 결합하는 능력이다. Fc 폴리펩타이드의 "효과기 기능"은 자극에 대한 반응시 임의의 항체에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 수행된 작용 또는 활성이며 상보체 고정 및/또는 ADCC(항체-의존성 세포 세포독성) 유도를 포함할 수 있다.
"IgX Fc"는 특수한 항체 동형(예컨대, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 등)으로부터 유래된 Fc 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 "X"는 항체 동형을 나타낸다. 따라서, "IgG Fc"는 Fc 폴리펩타이드가 γ 쇄로부터 유래됨을 나타낸다. "IgA Fc"는 Fc 폴리펩타이드가 α 쇄로부터 유래됨을 나타내고, "IgD Fc"는 Fc 폴리펩타이드가 δ 쇄로부터 유래됨을 나타내고, "IgE Fc"는 Fc 폴리펩타이드가 ε 쇄로부터 유래됨을 나타내고, "IgM Fc"는 Fc 폴리펩타이드가 μ 쇄로부터 유래됨을 나타낸다. 일부 구현예에서, IgG Fc 폴리펩타이드는 힌지, CH2, 및 CH3를 포함하지만, CH1 또는 CL을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, IgG Fc 폴리펩타이드는 CH2 및 CH3을 포함하지만, CH1, 힌지, 또는 CL은 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, IgG Fc 폴리펩타이드는 CL의 존재 또는 부재하에 CH1, 힌지, CH2, CH3를 포함한다. "IgX-N Fc" 또는 "IgGXN Fc"는 Fc 폴리펩타이드가 항체 동형의 특수한 아강(subclass)(예컨대, 개 IgG 아강 IgG-A, IgG-B, IgG-C, 또는 IgG-D; 고양이 IgG 아강 IgG1a, IgG1b, 또는 IgG2; 또는 말 IgG 아강 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, 또는 IgG7 등)으로부터 유래됨을 나타내며, 여기서 "N"은 아강을 나타낸다.
"힌지"는 프롤린이 풍부한 Fc 폴리펩타이드 또는 변이체 Fc 폴리펩타이드의 일부 부위를 지칭하며 완전한 길이의 중쇄 불변 영역의 CH1와 CH2 사이에 위치하는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 힌지는 동일한 힌지 영역내, 동일한 Fc 폴리펩타이드내에서 별도의 Fc 폴리펩타이드의 힌지 영역과 함께, 또는 별도의 Fc 폴리펩타이드와 함께 이황화물 결합을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지는 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 프롤린 잔기를 포함한다.
용어 "반려 동물 종(companion animal species)"은 사람과 동행하기에 적합한 동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 반려 동물 종은 개(canine 또는 dog), 고양이(feline 또는 cat), 또는 말(equine 또는 horse)이다. 일부 구현예에서, 반려 동물 종은 작은 포유동물, 예컨대, 개(canine), 고양이(feline), 개(dog), 고양이(cat), 토끼, 흰담비, 기니아 피그(guinea pig), 설치류 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 반려 동물 종은 농장 동물, 예컨대, 말, 소, 돼지 등이다.
일부 구현예에서, IgX Fc 폴리펩타이드 또는 IgX-N Fc 폴리펩타이드는 반려 동물, 예컨대, 개(dog), 고양이(cat) 또는 말(horse)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IgG Fc 폴리펩타이드는 개 γ 중쇄, 예컨대, IgG-A, IgG-B, IgG-C, 또는 IgG-D로부터 단리된다. 일부 예에서, IgG Fc 폴리펩타이드는 고양이 γ 중쇄, 예컨대 IgG1a, IgG1b, 또는 IgG2로부터 단리된다. 다른 예에서, IgG Fc 폴리펩타이드는 말 γ 중쇄, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, 또는 IgG7로부터 단리된다.
용어 "IgX Fc" 및 "IgX Fc 폴리펩타이드"는 달리 나타내지 않는 한 야생형 IgX Fc 폴리펩타이드 및 변이체 IgX Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
"야생형"은 천연에 존재하는 폴리펩타이드의 돌연변이되지 않은 버젼, 또는 이의 단편을 지칭한다. 야생형 폴리펩타이드는 재조합적으로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 16, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 100, 서열 번호: 107, 서열 번호: 108, 서열 번호: 117, 서열 번호: 118의 아미노산 서열을 포함한다.
"변이체"는 단일 또는 다수의 비-천연 아미노산 치환, 결실, 및/또는 첨가에 의해 참고 폴리펩타이드와는 상이한 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 변이체는 참고 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 변이체(예컨대, 변이체 개 IgG-A Fc, 변이체 개 IgG-C Fc, 변이체 개 IgG-D Fc, 변이체 말 IgG2 Fc, 변이체 말 IgG5 Fc, 또는 변이체 말 IgG6 Fc)는 참고 폴리펩타이드를 실질적으로 결여한 활성을 갖는다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 변이체 개 IgG-A Fc, 변이체 개 IgG-C Fc, 변이체 개 IgG-D Fc, 변이체 말 IgG2 Fc, 변이체 말 IgG5 Fc, 또는 변이체 말 IgG6 Fc는 단백질 A에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)" 및 "상동성"은 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입하여 필요한 경우, 최대의 서열 동일성 퍼센트를 달성하고, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 구체적인 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 서열내 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기와 동일한 참고 서열내 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 서열 동일성 퍼센트를 측정할 목적의 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 MEGALINE™(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기에 적절한 매개변수를 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체는 서열을 정렬시키고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대의 서열 동일성 퍼센트를 달성하고, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후 참고 핵산 분자 도는 폴리펩타이드와 적어도 약 50% 서열 동일성을 갖는다. 이러한 변이체는 예를 들면, 폴리펩타이드를 포함하며 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에서 첨가되거나 결실된다. 일부 구현예에서, 변이체는 참고 핵산 또는 폴리펩타이드의 서열과 적어도 약 50% 서열 동일성, 적어도 약 60% 서열 동일성, 적어도 약 65% 서열 동일성, 적어도 약 70% 서열 동일성, 적어도 약 75% 서열 동일성, 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 적어도 약 97% 서열 동일성, 적어도 약 98% 서열 동일성, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다.
"점(point) 돌연변이"는 단일 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이이다. 돌연변이는 아미노산의 손실, 다른 아미노산 잔기에 대한 하나의 아미노산 잔기의 치환, 또는 추가의 아미노산 잔기의 삽입일 수 있다.
"아미노산 치환"은 폴리펩타이드내 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 비제한적인 예시적인 보존적 아미노산 치환은 표 2에 나타낸다. 아미노산 치환은 목적한 분자 및 목적한 활성, 예를 들면, 보유된/증진된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 증진된 ADCC 또는 CDC 또는 향상된 약동학에 대해 스크리닝된(screened) 생성물내로 도입시킬 수 있다.
[표 2]
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아미노산은 일반적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류와 교환시킴을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "변이체 IgG Fc"는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 첨가에 의해 참고 IgG Fc 폴리펩타이드와는 상이한 IgG Fc 폴리펩타이드이며 참고 IgG Fc 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다.
본원에 사용된 바와 같은, "아미노산 유도체"는 임의의 아미노산, 변형된 아미노산, 및/또는 아미노산 유사체를 지칭하며, 이는 사람에서 발견된 20개의 일반적인 천연 아미노산 중 하나가 아니다. 예시적인 아미노산 유도체는 사람에서 발견되지 않은 아미노산(예컨대, 셀레노 시스테인 및 피롤라이신, 이는 일부 미생물에서 발견될 수 있다) 및 비천연 아미노산을 포함한다. 예시적인 아미노산 유도체는 화학적 생성물 제조업자를 통해 상업적으로 이용가능한 아미노산 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예컨대, 2017년 5월 6일자로 접속된 sigmaaldrich.com/chemistry/chemistry-products.html?TablePage=16274965, 이는 본원에 참고로 포함된다). 하나 이상의 아미노산 유도체는 숙주 세포, 진정세균 신테타제(eubacterial synthetase), 직교(orthogonal) tRNA, 및 아미노산 유도체를 활용하는 해독 시스템을 사용하여 구체적인 위치에서 폴리펩타이드 내로 혼입될 수 있다. 추가의 설명에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제9,624,485호를 참고한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 아미노산 유도체를 지닌 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 유도체는 알라닌 유도체, 시스테인 유도체, 아스파르트산 유도체, 글루탐산 유도체, 페닐알라닌 유도체, 글리신 유도체, 히스티딘 유도체, 이소루이신 유도체, 라이신 유도체, 루이신 유도체, 메티오닌 유도체, 아스파라긴 유도체, 프롤린 유도체, 글루타민 유도체, 아르기닌 유도체, 세린 유도체, 트레오닌 유도체, 발린 유도체, 트립토판 유도체, 또는 타이로신 유도체이다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 반려 동물 종의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드, 변이체 말 IgG Fc 폴리펩타이드, 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
변형된 단백질 A 결합을 지닌 예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 변형된 단백질 A 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 21번 위치, 23번 위치, 25번 위치, 80번 위치, 205번 위치, 및/또는 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 21번 위치, 23번 위치, 및/또는 24번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 21번 위치, 23번 위치, 25번 위치, 80번 위치, 및/또는 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 64의 15번 위치 및/또는 203번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 67의 199번 위치 및/또는 200번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 68의 199번, 200번, 201번, 및/또는 202번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 21번 위치, 23번 위치, 25번 위치, 80번 위치, 205번 위치, 및/또는 207번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 21번 위치, 23번 위치, 및/또는 24번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 21번 위치, 23번 위치, 25번 위치, 80번 위치, 및/또는 207번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 64의 15번 위치 및/또는 203번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 67의 199번 위치 및/또는 200번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 68의 199번 위치, 200번 위치, 201번 위치, 및/또는 202번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 3의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 64의 15번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 서열 번호: 64의 203번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 발린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 67의 199번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호:68의 199번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 서열 번호: 68의 200번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘, 서열 번호: 68의 201번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 이소루이신을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 히스티딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 64의 15번 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에서 발린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 67의 199번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에서 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 68의 199번 위치에서 이소루이신, 서열 번호: 68의 200번 위치에서 히스티딘, 서열 번호: 68의 201번 위치에서 아스파라긴, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에서 히스티딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 또는 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 19, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 75, 또는 서열 번호: 76을 포함한다.
변형된 CD16 결합을 지닌 예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 변형된 CD16 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc는 감소된 ADCC 면역 반응을 갖는다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 5번 위치, 38번 위치, 39번 위치, 97번 위치, 및/또는 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 5번 위치, 38번 위치, 39번 위치, 97번 위치, 및/또는 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 5번 위치, 38번 위치, 39번 위치, 97번 위치, 및/또는 98번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 5번 위치, 38번 위치, 39번 위치, 97번 위치, 및/또는 98번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 5번 위치에서 프롤린, 38번 위치에서 글리신, 39번 위치에서 아르기닌, 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 98번 위치에서 글리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 5번 위치에서 프롤린, 38번 위치에서 글리신, 39번 위치에서 아르기닌, 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 98번 위치에서 글리신을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 서열 번호: 147, 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157의 아미노산 서열을 포함한다.
변형된 C1q 결합을 지닌 예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 변형된 C1q 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 C1q에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 감소된 상보체 고정을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc는 감소된 상보체-매개된 면역 반응을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 63의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 65의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 66의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 80의 198번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 81의 198번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 63의 87번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 65의 87번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 66의 87번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 80의 198번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 81의 198번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 63의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 65의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 66의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 80의 198번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 81의 198번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아르기닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 63의 87번 위치에서 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 65의 87번 위치에서 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 66의 87번 위치에서 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 80의 198번 위치에서 알라닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 81의 198번 위치에서 알라닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 또는 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 70, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 또는 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 82 또는 서열 번호: 83이 아미노산 서열을 포함한다.
변형된 쇄-간 (inter-chain)이황화물 결합을 지닌 예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
일부 구현예에서, 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 쇄-간 이황화물 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 힌지 영역 내에서 적어도 하나의 추가의 쇄-간 이황화물 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 쇄-간 이황화물 결합을 지닌 변이체 고양이 IgG2 Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 증가된 쇄-간 안전성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 힌지 영역에 대해 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 또는 말 IgG Fc 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 상이한 동형의 IgG Fc 폴리펩타이드로부터 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG-1a Fc 폴리펩타이드로부터, 야생형 고양이 IgG-1b Fc 폴리펩타이드로부터, 또는 야생형 말 IgG1 Fc 폴리펩타이드로부터 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG2 Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 대해 증가된 재조합체 생산 및/또는 증가된 힌지 이황화물 형성을 갖는다. 일부 구현예에서, 증가된 재조합 생산 및/또는 증가된 힌지 이황화물 형성은 환원 및/또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16의 8번 위치에 상응하는 위치, 9번 위치, 10번 위치, 11번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치, 15번 위치, 또는 16번 위치에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16의 8번 위치, 9번 위치, 10번 위치, 11번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치, 15번 위치, 또는 16번 위치에서 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 17을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에 상응하는 위치에서 및/또는 20번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에서 및/또는 20번 위치에 상응하는 위치에서 16번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에 상응하는 위치에서 세린 및/또는 20번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에서 프롤린을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에서 세린 및/또는 20번 위치에서 프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 19, 서열 번호: 125 또는 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135를 포함한다.
이종이량체성 폴리펩타이드에 대한 예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 이종이량체성 폴리펩타이드는 이특이적인 항체이다. 이특이적인 항체는 2개의 상이한 에피토프(epitope) 또는 표적 분자에 대해 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 이특이적인 항체는 동일한 표적 분자의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 이특이적인 항체는 전체 길이(full length)의 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩타이드는 "놉(knob)" 돌연변이를 포함하는 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 및 "홀(hole)" 돌연변이를 포함하는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 비제한적인 예시적인 놉 및 홀 돌연변이는, 예를 들면, 문헌: Merchant, A. M. et al. An efficient route to human bispecific IgG. Nat Biotechnol, 16(7):677-81 (1998)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 변이체 개 또는 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 놉 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 137번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 트립토판을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 137번 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 137번 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 138번 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에서 트립토판을 포함한다.
일부 구현예에서, 놉 돌연변이를 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 서열 번호: 115, 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 개 또는 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 홀 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치에서 세린, 서열 번호: 1의 140번 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 181번 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 137번 위치에서 세린, 139번 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 3의 137번 위치에서 세린, 139번 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 138번 위치에서 세린, 140번 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에서 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에서 세린, 156번 위치에서 알라닌, 및/또는 197번 위치에서 트레오닌을 포함한다.
일부 구현예에서, 홀 돌연변이를 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 서열 번호: 116, 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 GLP1 폴리펩타이드 및 놉 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 글루카곤 폴리펩타이드 및 놉 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 GLP1 폴리펩타이드 및 홀 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 글루카곤 폴리펩타이드 및 홀 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩타이드는 GLP1 폴리펩타이드 및 놉 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 연속된 폴리펩타이드, 및 글루카곤 폴리펩타이드 및 홀 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제2의 연속된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체성 폴리펩타이드는 글루카곤 폴리펩타이드 및 놉 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 연속된 폴리펩타이드, 및 GLP1 폴리펩타이드 및 홀 돌연변이를 포함하는 변이체 개 또는 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제2의 연속된 폴리펩타이드를 포함한다.
예시적인 GLP1 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드
본원에 사용된 바와 같은, "GLP1" 또는 "GLP1 폴리펩타이드"는 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체(GLP1R)에 결합하는 글루카곤-유사 펩타이드-1의 전체 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드이다.
예를 들면, "GLP1"은 달리 나타내지 않는 한 임의의 척추동물 공급원, 예컨대 포유동물, 예컨대, 영장류(예컨대, 사람 및 시노몰구스 원숭이), 설치류(예컨대, 마우스 및 랫트), 및 반려 동물(예컨대, 개, 고양이, 및 말)로부터의 GLP1 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, GLP1 폴리펩타이드는 야생형 GLP1 폴리펩타이드, 예컨대, GLP1(7-37)(서열 번호: 85)이다. 일부 구현예에서, GLP1 폴리펩타이드는 변이체 GLP1 폴리펩타이드, 예컨대, GLP1(7-36)(서열 번호: 98), GLP1 (7-35)(서열 번호: 99), GLP1-S8(7-35)(서열 번호: 86), 또는 GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87)이다. 일부 구현예에서, GLP1은 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "GLP1R"은 야생형 GLP1에 결합할 수 있는 글루카곤-유사 펩타이드 1 수용체의 전체 또는 이의 일부를 포함하는 폴리펩타이드이다.
예를 들면, "GLP1R"은 달리 나타내지 않는 한, 임의의 척추동물 공급원, 예컨대, 포유동물, 예컨대, 영장류(예컨대, 사람 및 시노몰구스 원숭이), 설치류(예컨대, 마우스 및 랫트), 및 반려 동물(예컨대, 개, 고양이, 및 말)로부터의 GLP1R 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, GLP1R은 야생형 GLP1 폴리펩타이드에 결합하는 세포외 도메인 단편이다. 일부 구현예에서, 고양이 GLP1R은 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고양이 GLP1R은 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다.
"세포외 도메인"("ECD")은 세포외 공간으로 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 넘어서 연장하는 폴리펩타이드의 부위이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포외 도메인"은 완전한 세포외 도메인을 포함할 수 있거나 이의 리간드에 결합하는, 하나 이상의 아미노산을 결여하고 있는 절단된(truncated) 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 세포외 도메인의 조성은 어느 아미노산이 막내에 있는지를 측정하는데 사용된 알고리즘에 의존할 수 있다. 상이한 알고리즘은 예측할 수 있으며, 상이한 시스템은 주어진 단백질에 대해 상이한 세포외 도메인을 발현할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "글루카곤" 또는 "글루카곤 폴리펩타이드"는 글루카곤 수용체에 결합하는 글루카곤의 전체 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드이다.
예를 들면, "글루카곤"은 달리 나타내지 않은 한, 임의의 척추동물 공급원, 예컨대, 포유동물, 예컨대, 영장류(예: 사람 및 시노몰구스 원숭이), 설치류(예: 마우스 및 랫트), 및 반려 동물(예: 개(dog), 고양이(cat), 및 말)로부터의 글루카곤 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 글루카곤 폴리펩타이드는 야생형 글루카곤 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 번호: 21이다.
예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 및 융합 분자
폴리펩타이드 및 다른 분자는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 분자는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 예컨대, 본원에 기술된 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 예컨대, 본원에 기술된 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은,"융합 분자"는, 하나 이상의 "융합 파트너(fusion partner)"를 포함하는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 융합 파트너는 공유결합으로 연결된다("융합된다"). 2개의 융합 파트너가 폴리펩타이드 둘 다인 경우, 융합 파트너 폴리펩타이드는 연속된 아미노산 서열(즉, 연속된 폴리펩타이드)의 부분일 수 있다. 제1의 융합 파트너 폴리펩타이드는 제2의 융합 파트너의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 파트너는 융합 파트너 둘 다를 암호화하는 암호화 서열로부터의 단일 폴리펩타이드로서 해독된다. 융합 파트너는 다른 수단, 예를 들면, 펩타이드 결합 이외의 다른 화학 결합을 통해 결합될 수 있다. 폴리펩타이드를 다른 분자(예를 들면, 융합 파트너)에 공유결합으로 결합시키는 많은 공지된 방법이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 융합 파트너는 "링커"를 통해 융합되며, 이는 적어도 하나의 아미노산 또는 화학적 모이어티로 구성된다. 일부 구현예에서, 융합 파트너는 비공유결합으로 결합된다. 일부의 이러한 구현예에서, 이들은 예를 들면, 결합 쌍을 사용하여 결합시킬 수 있다. 예시적인 결합 쌍은 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, 항체 및 이의 항원 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 융합 파트너는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 파트너는 IgG Fc 폴리펩타이드, GLP1 폴리펩타이드, 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, GLP1 폴리펩타이드는 IgG Fc 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 글루카곤 폴리펩타이드는 IgG Fc 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다.
본원에서 용어 "연속된 폴리펩타이드"는 아미노산의 차단되지 않은 서열을 의미하기 위해 사용된다. 연속된 폴리펩타이드는 전형적으로 단일의 연속된 DNA 서열로부터 해독된다. 이는 유전 가공(genetic engineering), 예를 들면, 제1의 단백질의 DNA 서열로부터의 정지 코돈을 제거한 후, 제2의 단백질의 DNA 서열을 프레임내(in frame)에서 첨부함으로써, DNA 서열을 단일 단백질로서 발현시켜서 제조할 수 있다. 전형적으로, 이는 cDNA를 발현 벡터내로 프레임내에서 존재하는 유전자와 함께 클로닝(cloning)함으로써 달성된다.
"링커"는 제1의 폴리펩타이드를 제2의 폴리펩타이드와 연결시키는 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다.
일부 구현예에서, 링커는 가요성(flexible), 비-구조적 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신이 풍부하거나, 세린이 풍부하거나 글리신- 및 세린이 풍부하다. 일부 구현예에서, 링커는 100%, 적어도 95%, 적어도 90%, 또는 적어도 85%의 세린 및/또는 글리신 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "연장"은 이의 C-말단 또는 이의 N-말단에서 폴리펩타이드에 연결된 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다.
일부 구현예에서, 연장은 가요성이다. 일부 구현예에서, 연장은 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 방해하지 않고 폴리펩타이드에 가요성을 가한다. 일부 구현예에서, 연장은 폴리펩타이드의 용해도를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 연장은 하나 이상의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 연장은 글리신 잔기(서열 번호: 88), 2개의 글리신 잔기(서열 번호: 89), 3개의 글리신 잔기(서열 번호: 90), 4개의 글리신 잔기(서열 번호: 91), 5개의 글리신 잔기(서열 번호: 92), 6개의 글리신 잔기(서열 번호: 93), 7개의 글리신 잔기(서열 번호: 94), 8개의 글리신 잔기(서열 번호: 95), 또는 그 이상의 글리신 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 167, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 또는 199 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 167, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 또는 199 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 서열 번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 167, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 또는 199 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 서열 번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 167, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 또는 199 중 어느 하나의 아미노산을 포함하는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 167, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 또는 199 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 100, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 167, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 또는 199 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 글루카곤 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 반려 동물 종의 제1의 GLP1 폴리펩타이드(GLP1A), 제1의 링커(L1), Fc 폴리펩타이드, 임의로 제2의 링커(L2), 및 임의로 제2의 GLP1 폴리펩타이드(GLP1B)를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는:
화학식 (I): GLP1A-L1-Fc;
화학식 (II): Fc-L1-GLP1A; 또는
화학식 (III): GLP1A-L1-Fc-L2-GLP1B를 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 GLP1 폴리펩타이드, 제1의 링커 (L1), Fc 폴리펩타이드, 제2의 링커(L2), 및 글루카곤 폴리펩타이드(Gluc)를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는:
화학식 (IV): GLP1-L1-Fc-L2-Gluc; 또는
화학식 (V): Gluc-L1-Fc-L2-GLP1을 포함한다.
일부 구현예에서, GLP1 융합 분자는 야생형 GLP1 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 혈청 반감기를 갖는다. 본원에 기술된 GLP1 융합 분자의 증가된 반감기는 야생형 GLP1 폴리펩타이드보다 저 낮은 용량 및 훨씬 적은 빈도의 투여 요법을 필요로 할 수 있다.
일부 구현예에서, GLP1B는, 존재하는 경우, GLP1A와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, GLP1, GLP1A, 또는 GLP1B는, 존재하는 경우, 야생형 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, GLP1, GLP1A, 또는 GLP1B는, 존재하는 경우, 변이체 GLP1 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, GLP1, GLP1A, 또는 GLP1B는, 존재하는 경우, 서열 번호: 85, 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 98, 또는 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 글루카곤 폴리펩타이드는 야생형 글루카곤 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 글루카곤 폴리펩타이드는 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 글루카곤 폴리펩타이드는 변이체 글루카곤 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 사람 IgG Fc이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 사람 IgG1 Fc, 사람 IgG2 Fc, 사람 IgG3 Fc, 또는 사람 IgG4 Fc이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 변이체 사람 IgG Fc이다.
일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 반려 동물로부터의 IgG Fc이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 개 IgG-A Fc, 개 IgG-B Fc, 개 IgG-C Fc, 개 IgG-D Fc이다. 일부 구현예에서, Fc는 말 IgG1 Fc, 말 IgG2 Fc, 말 IgG3 Fc, 말 IgG4 Fc, 말 IgG5 Fc, 말 IgG6 Fc, 또는 말 IgG7 Fc이다. 일부 구현예에서, Fc는 고양이 IgG1a Fc, 고양이 IgG1b Fc, 또는 고양이 IgG2 Fc이다.
일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 변이체 IgG Fc이다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 변이체 개 IgG-A Fc, 변이체 개 IgG-B Fc, 변이체 개 IgG-C Fc, 변이체 개 IgG-D Fc이다. 일부 구현예에서, Fc는 변이체 말 IgG1 Fc, 변이체 말 IgG2 Fc, 변이체 말 IgG3 Fc, 변이체 말 IgG4 Fc, 변이체 말 IgG5 Fc, 변이체 말 IgG6 Fc, 또는 변이체 말 IgG7 Fc이다. 일부 구현예에서, Fc는 변이체 고양이 IgG1a Fc, 변이체 고양이 IgG1b Fc, 또는 변이체 고양이 IgG2 Fc이다.
일부 구현예에서, L1 및 L2는, 존재하는 경우, 각각 독립적으로 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2의 아미노산 서열은, 존재하는 경우, 각각 독립적으로 100%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%의 세린 및/또는 글리신 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 이의 C-말단에서의 연장을 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 이의 C-말단에서 글리신 잔기, 2개의 글리신 잔기, 3개의 글리신 잔기, 4개의 글리신 잔기, 5개의 글리신 잔기, 6개의 글리신 잔기, 7개의 글리신 잔기, 8개의 글리신 잔기, 또는 8개 이상의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 이의 C-말단에 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 94, 또는 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 연속된 폴리펩타이드는 서열 번호: 23; 서열 번호: 24; 서열 번호: 25; 서열 번호: 26; 서열 번호: 27; 서열 번호: 28; 서열 번호: 29; 서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42; 서열 번호: 43; 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97, 서열 번호: 52; 서열 번호: 53; 서열 번호: 54; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 103; 서열 번호: 104; 서열 번호: 105; 또는 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함한다.
목적한 폴리펩타이드, 예컨대, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 세포내에서 발현에 적합한 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질감염시킨 숙주 세포를 배양함으로써 발현될 수 있다.
"벡터"는 하나의 유기체로부터 다른 유기체로 DNA 서열을 전달시키거나 목적한 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있는 플라스미드이다. 벡터는 전형적으로 복제 오리진(origin of replication) 및 목적한 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 포함하며, 선택성 마커 유전자, 예컨대, 항생제 내성 유전자를 수반하거나 수반하지 않을 수 있다. 벡터는 이것이 발현되어야 하는 숙주 세포에 적합하다. 벡터는 목적한 유전자가 벡터내에 존재하는 경우 "재조합 벡터"로 명명될 수 있다.
"숙주 세포"는 벡터 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드의 수용체일 수 있거나 이러한 수용체인 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대, 영장류 또는 비-영장류 동물 세포; 진균 세포, 예컨대, 효모; 식물 세포; 및 곤충 세포를 포함한다. 비제한적인 예시적인 포유동물 세포는 NS0 세포, PER.C6® 세포(Crucell), 293 세포, 및 CHO 세포, 및 이들의 유도체, 예컨대, 293-6E, DG44, CHO-S, 및 CHO-K 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 후대세포를 포함하며, 후대세포는 천연적인, 우연한, 또는 고의의 돌연변이에 기인한 원래의 모 세포에 대해 필수적으로 완전히 동일하지 않을 수 있다(형태학적으로 또는 게놈 DNA 상보체에서). 숙주 세포는 본원에 제공된 아미노산 서열(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된"은 이를 사용하여 전형적으로 천연적으로 발견되거나 생산되는 성분 중 적어도 일부로부터 분리된 분자를 지칭한다. 폴리펩타이드가 발현 후 세포에 의해 분비되는 경우, 이를 생산한 세포로부터의 폴리펩타이드를 함유하는 상층액을 물리적으로 분리하는 것은 폴리펩타이드를 "단리하는" 것으로 고려된다. 유사하게, 폴리뉴클레오타이드는 보다 큰 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, DNA 폴리뉴클레오타이드의 경우에, 게놈성 DNA 또는 미토콘드리아 DNA) 중 부분이 아닌 경우 "단리된" 것으로 지칭되며 여기서 이는 전형적으로 천연적으로 발견되거나 예를 들면, RNA 폴리뉴클레오타이드의 경우에 이것이 생산된 세포의 구성성분 중 적어도 일부로부터 분리된다. 따라서, 숙주세포에서 벡터내에 함유된 DNA 폴리뉴클레오타이드는 "단리된"으로 지칭될 수 있다.
"신호 서열(signal sequence)"은 아미노산 잔기 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 지칭하며, 이는 목적한 폴리펩타이드의 분비를 촉진시키며 폴리펩타이드를 세포 표면 막의 외부로 배출시 전형적으로 절단된다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 변이체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드는 크로마토그래피, 예컨대, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 CHT 크로마토그래피를 이용하여 단리시킨다.
표지는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 변이체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드에 부착될 수 있다. "표지"는 이것이 검출될 수 있도록 하는 분자에 부착된 모이어티를 의미한다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 변이체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드는 방사선동위원소, 형광성 표지, 및 당해 분야에 공지된 다양한 효소-기질을 포함하나 이에 한정되지 않은 검출가능한 모이어티로 표지된다. 일부 구현예에서, 표지는 가시적인 또는 장치 수단, 예를 들면, 방사표지된 아미노산의 혼입 또는 표지된 아비딘(예를 들면, 광학적 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에 대한 부착에 의해 검출될 수 있는 신호를 생산할 수 있는 검출가능한 마커이다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 방사선동위원소 또는 방사핵종(예를 들면, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm); 크로모겐, 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 란타니드 포스포르), 효소 표지(예를 들면, p-갈락토시다제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제); 화학발광성 마커; 바이오티닐 그룹; 재2의 리포터(예를 들면, 루이신 지퍼 쌍 서열, 제2의 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식된 예정된 폴리펩타이드 에피토프; 및 자기제(magnetic agent), 예컨대, 가돌리늄 킬레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역검정에 일반적으로 사용된 표지의 대표적인 예는 광을 생산하는 모이어티, 예를 들면, 아크리디늄 화합물, 및 형광성을 생산하는 모이어티, 예를 들면, 플루오레세인을 포함한다. 이에 관하여, 모이어티 자체는 검출가능하게 표지되지 않을 수 있지만 여전히 다른 모이어티와 반응시 검출가능하게 될 수 있다. 상기 나타낸 다양한 면역검정을 수행하는데 사용될 일반적인 기술은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
단백질 A 및/또는 C1q 및/또는 CD16에 대한 예시적인 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 친화성
본원에 기술된 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 단백질 A 및/또는 C1q 및/또는 CD16에 대해 변경된 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는다. 이러한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 단백질 A 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 이러한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 감소된 상보체-매개된 면역 반응을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 가졌다. 이러한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 감소된 ADCC 면역 반응을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 가지고/가지거나 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q에 대해 감소된 결합 친화성을 가지고/가지거나 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "단백질 A"는 야생형 개 IgG-B Fc, 야생형 말 IgG1 Fc, 야생형 말 IgG3 Fc, 야생형 말 IgG4 Fc, 야생형 말 IgG7 Fc, 야생형 고양이 IgG1a Fc, 야생형 고양이 IgG1b Fc, 또는 야생형 고양이 IgG2 Fc에 결합할 수 있는 단백질 A의 전체 또는 이의 부분을 포함하는 폴리펩타이드이다.
"C1q" 또는 "C1q 복합체"는 야생형 개 IgG-B Fc, 야생형 개 IgG-C Fc, 야생형 말 IgG1 Fc, 야생형 말 IgG3 Fc, 야생형 말 IgG4 Fc, 야생형 말 IgG7 Fc, 야생형 고양이 IgG1a Fc, 또는 야생형 고양이 IgG1b Fc에 결합할 수 있는 상보체 시스템, 또는 이의 부분에 포함된 단백질 복합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, "CD16"은 야생형 개 IgG-A Fc 또는 야생형 개 IgG-D Fc에 결합할 수 있는 CD16의 전체 또는 이의 일부를 포함하는 폴리펩타이드이다. 용어 물질에 "결합하다"는 당해 분야에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 결합을 측정하는 방법은 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 분자는 특수한 세포 또는 물질과 반응하거나, 이와 회합되거나, 이에 대해 친화성을 갖는 경우 "결합하는 것"을 나타내기 위해 일컬어지며 반응, 회합, 또는 친화성은 당해 분야에 공지된 하나 이상의 방법, 예를 들면, 면역블롯(immunoblot), ELISA, KinEx A, 생물층 간섭법(BLI), 표면 플라스몬 공명 장치 등에 의해 검출가능하다.
본원에 사용된 바와 같은, "단백질 A +"는 Fc 폴리펩타이드가 단백질 A 결합 친화성을 가짐을 의미한다. 일부 구현예에서, 단백질 A+ Fc 폴리펩타이드는 단백질 A 결합 친화성을 증가시키는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은" 단백질 A-"는, Fc 폴리펩타이드가 낮은 단백질 A 결합 친화성을 갖거나 이러한 친화성을 가지지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "C1q +"는 Fc 폴리펩타이드가 C1q 결합 친화성을 가짐을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "C1q-"는, Fc 폴리펩타이드가 낮은 C1q 결합 친화성을 갖거나 이러한 친화성을 가지지 않음을 의미한다. 일부 구현예에서, C1q- Fc 폴리펩타이드는 C1q 결합 친화성을 감소시키는적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "CD16 +"는, Fc 폴리펩타이드가 CD16 결합 친화성을 가짐을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "CD16-"는 Fc 폴리펩타이드가 낮은 CD16 결합 친화성을 갖거나 이러한 친화성을 가지지 않음을 의미한다. 일부 구현예에서, CD16-Fc 폴리펩타이드는 CD16 결합 친화성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다.
용어 "친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 수용체)와 이의 결합 파트너(예를 들면, 리간드) 사이의 비공유결합성 상호작용의 총 합의 강도를 의미한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화성은 당해 분야에 공지된 일반적인 방법, 예를 들면, 면역블롯, ELISA, KinEx A, 생물층 간섭법(BLI), 또는 표면 플라스몬 공명 장치에 의해 측정될 수 있다.
"표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)"은 바이오센서 매트릭스, 예를 들면 BIAcore™ 시스템(BIAcore International AB, GE Healthcare company, 스웨덴 업살라(Uppsala) 및 뉴저지주 피스타카웨이(Piscataway) 소재) 내에서 단백질 농도에 있어서의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적인 상호작용의 분석을 허용하는 광학적 현상을 나타낸다. 추가의 설명을 위해서는 Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26을 참고한다.
"생물층 간섭법(biolayer interferometry)"은 바이오센서 팁 및 내부 참고 층 위에 고정화된 단백질의 층으로부터 반사된 광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기술을 지칭한다. 바이오센스 팁에 결합된 분자의 수에 있어서의 변화는 실시간으로 측정될 수 있는 간섭 패턴내 이동을 유발한다. 생물층 간섭법에 대한 비제한적인 예시적인 장치는 Octet® 시스템(Pall ForteBio LLC)이다. 예컨대, Abdiche et al., 2008, Anal. Biochem. 377: 209-277을 참고한다.
용어 "KD", "Kd", "Kd" 또는 "Kd 값"은 수용체-리간드 상호작용 또는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 생물층 간섭법으로 측정하여, 단백질 A에 대해 5 x 10-6 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 5 x 10-7 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 5 x 10-8 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만, 5 x 10-11 M 미만, 1 x 10-11 M 미만, 5 x 10-12 M 미만, 또는 1 x 10-12 M 미만의 해리 상수(KD)로 결합한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 생물층 간섭법으로 측정하여 C1q 또는 CD16에 대해 5 x 10-6 M 이상, 1 x 10-5 M 이상, 5 x 10-5 M 이상, 1 x 10-4 M 이상, 5 x 10-4 M 이상, 또는 1 x 10-3 M 이상의 해리 상수(KD)로 결합한다.
일부 구현예에서, 단백질 A 또는 C1q 또는 CD16에 대한 IgG Fc 폴리펩타이드, 예컨대, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드의 KD는 바이오센서, 예컨대, Octet® 시스템(Pall ForteBio LLC, 캘리포니아주 프레몬트(Fremont) 소재)을 사용하여 공급업자의 설명서에 따라 측정한다. 요약하면, 바이오티닐화된 단백질 A 또는 C1q 또는 CD16을 센서 팁에 결합시키고 IgG Fc 폴리펩타이드의 결합을 규정된 시간 동안 또는 정상 상태(steady state)에 도달할 때까지 모니터링한다. 해리는 규정된 시간 동안 또는 정상 상태에 도달할 때까지 모니터링할 수 있다. 완충제만의 블랭크 곡선(blank curve)을 감하여 임의의 이동(drift)에 대해 교정한다. 데이타는 ForteBio 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 2:1 결합 모델에 대해 조정하여 결합 속도 상수(kon), 해리 속도 상수(koff), 및 Kd를 측정한다. 평형 해리 상수(KD)는 koff/kon으로서 계산된다. 용어 "kon"은 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 결합에 대한 속도 상수를 지칭하며 용어 "koff"는 분자 X/파트너 Y 복합체로부터 분자 X 또는 파트너 Y의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.
"증가시키는" 또는 "자극하는" 것은 참고와 비교하여 활성, 기능, 또는 양을 증가시키거나, 증진시키거나 증강시킴을 의미한다. 일부 구현예에서, "증가하다" 또는 "자극하다"는 참고 값(reference value)에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 125% 이상, 약 200% 이상의 전체적인 증가를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "증가하다" 또는 "자극하다"는 참고 값에 비하여 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 20%, 약 50% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 70%의 전체 증가를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "증가하다" 또는 "자극하다"는 50% 이상의 전체적인 증가를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "증가하다" 또는 "자극하다"는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체적인 증가를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 나타낸 양은 동일한 기간에 걸쳐 대조군 용량(예컨대, 위약)에 비하여, 동일한 기간에 걸쳐 자극되거나 증가된다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 참고 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 125% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상의 증가된 친화성으로 단백질 A에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 참고 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 20%, 약 50% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 70%의 증가된 친화성으로 단백질 A에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 참고 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 참고 IgG Fc 폴리펩타이드는 상이한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드이다.
"감소하다" 또는 "억제하다"는 참고와 비교하여 활성, 기능, 또는 양을 저하시키거나, 감소시키거나, 정지시킴을 의미한다. 일부 구현예에서, "감소하다" 또는 "억제하다"는 참고 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상의 전체 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "감소하다" 또는 "억제하다"는 참고 값에 비하여 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 20%, 약 50% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 70%의 전체적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "감소하다" 또는 "억제하다"는 50% 이상의 전체 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "감소하다" 또는 "억제하다"는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 나타낸 양은 일정한 기간에 걸쳐 대조군 용량(예컨대, 위약)에 비하여 동일한 기간에 걸쳐 억제되거나 감소된다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 참고 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q 또는 CD16에 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상의 결합 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 참고 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q 또는 CD16에 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 20%, 약 50% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 70%의 감소된 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 참고 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 참고 IgG Fc 폴리펩타이드는 상이한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드이다.
본원에 사용된 바와 같은, "참고"는 비교 목적을 위해 사용된 임의의 샘플, 표준, 또는 수준을 지칭한다. 참고는 야생형 참고 또는 변이체 참고일 수 있다. 참고는 건강하거나 질환이 없는 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 참고는 반려 동물의 질환이 없거나 치료되지 않은 샘플로부터 수득된다. 일부 예에서, 참고는 특수한 종의 하나 이상의 건강한 동물로부터 수득되며, 이는 시험되거나 치료되는 동물이 아니다.
변이체 GLP1 융합 분자의 예시적인 생물학적 활성
일부 구현예에서, GLP1 융합 분자는 GLP1R에 결합하여 cAMP 생산을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, GLP1 융합 폴리펩타이드는 세포내에서 cAMP의 생산을 GLP1 융합 폴리펩타이드의 부재하에서 신호전달 기능과 비교하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%까지 증가시킨다.
예시적인 약제학적 조성물
용어 "약제학적 제형" 및 "약제학적 조성물"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 수 있는 대상체에 대해 허용불가능하게 독성인 추가의 구성성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 무-독성, 반고체, 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 제형 보조제, 또는 대상체에게 투여하기 위한 "약제학적 조성물"을 함께 포함하는 치료제와 함께 사용하기 위한 당해 분야에 통상적인 담체를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며 제형의 다른 성분과 상용성이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 사용된 제형을 위해 적절하다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 알루미나; 스테아르산알루미늄; 레시틴; 혈청 단백질, 예컨대, 사람 혈청 알부민, 개 또는 다른 동물 알부민; 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 트로메타민 또는 HEPES 완충제; 글리신; 소르브산; 소르브산칼륨; 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물; 물; 염 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 또는 삼규산마그네슘; 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 물질; 폴리에틸렌 글리콜; 슈크로즈; 만니톨; 또는 아르기닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아미노산을 포함한다.
약제학적 조성물은 동결건조된 형태로 저장될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 제제 과정은 개(dog), 고양이(cat), 또는 말에 투여하기 전에, 전형적으로 비경구 투여에 적합한 수성 조성물로서 재제형화될 수 있다. 다른 구현예에서, 특히 본원에 기술된 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 다른 폴리펩타이드는 열 및 산화 변성에 대해 고도로 안정하며, 약제학적 조성물은 액체로서, 즉, 수성 조성물로서 저장될 수 있으며, 이는 직접 또는 적절히 희석하여 개(dog), 고양이(cat), 또는 말(horse)에게 투여될 수 있다. 동결건조된 조성물은 주사용 멸균수(WFI)를 사용하여 재구성시킬 수 있다. 정균 시약(bacteriostatic reagent), 예컨대, 벤질 알코올이 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 고체 또는 액체형으로 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물의 pH는 투여된 경우 약 pH 5 내지 약 pH 8의 범위내일 수 있다. 본 발명의 조성물은 치료학적 목적으로 사용되는 경우 멸균성이다. 멸균성은 당해 분야에 공지된 임의의 수개의 수단, 예컨대, 멸균 여과 막(예컨대, 0.2 마이크론 막)을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 멸균성은 항-세균제의 존재 또는 부재하에서 유지될 수 있다.
Fc 폴리펩타이드 및 약제학적 조성물의 특정 용도.
본 발명의 변이체 Fc 폴리펩타이드, 예컨대 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 본 발명의 변이체 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 반려 동물, 예컨대, 이에 한정되지 않는 개, 고양이, 또는 말에서 생성문 반감기를 연장시키는데 유용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 유리하거나 목적한 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본원에 사용된 바와 같은, "치료"는 반려 동물을 포함하는, 포유동물에서 질환에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 유리하거나 목적한 임상 결과는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 정도의 약화, 질환의 확산의 방지 또는 지연, 질환의 재발의 방지 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 지체, 질환 상태의 완화, 질환 또는 질환의 진행의 억제, 질환 또는 이의 진행의 억제 또는 지체, 이의 발달의 정지, 및 차도(부분적이거나 전체적으로). "치료"에는 또한 증식성 질환의 병리학적 결과의 감소가 포함된다. 본원에 제공된 방법은 치료의 이러한 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다. 상기와 비슷하게, 용어 치료는 장애의 모든 양태의 100 퍼센트 제거를 필요로 하지 않는다.
물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료학적 유효량"은 치료될 질환의 유형, 질환 상태, 질환의 중증도 및 과정, 치료학적 목적의 유형, 임의의 선행 치료요법, 임상 병력, 선행 치료에 대한 반응, 주치 수의사의 판단, 동물의 연령, 성별, 및 체중, 및 동물내에서 목적한 반응을 유발하는 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 물질/분자, 효능제, 또는 길항제의 임의의 독성 또는 유해한 효과는 치료학적으로 유리한 효과보다 더 크다. 치료학적 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 치료학적 유효량은 목적한 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해, 투여량에서 효과적인 양 및 이에 필요한 기간을 지칭한다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 비경구적으로, 피하 투여, 정맥내 주입, 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 거환 주사(bolus injection)로서 또는 연속적인 주입에 의해 일정한 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 동맥내, 활액막내, 척추강내, 또는 흡입 경로에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, GLP1 융합 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 본원의 방법에 따라 고 혈당-관련 상태를 치료하는데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, GLP1 융합 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물은 반려 동물, 예컨대, 개, 고양이, 또는 말에게 고 혈당 관련된 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 용량당 0.0001 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위의 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, GLP1 유사체는 용량당 0.005 mg/kg의 체중 내지 20 mg/kg의 체중의 범위의 양으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, GLP1 유사체는 용량당 1 mg/kg의 체중 내지 10 mg/kg의 체중의 범위의 양으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, GLP1 유사체는 0.5 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위, 1 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위, 5 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위, 10 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위, 20 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위, 50 mg/kg의 체중 내지 100 mg/kg의 체중의 범위, 1 mg/kg의 체중 내지 10 mg/kg의 체중의 범위, 5 mg/kg의 체중 내지 10 mg/kg의 체중의 범위, 0.5 mg/kg의 체중 내지 10 mg/kg의 체중의 범위, 또는 5 mg/kg의 체중 내지 50 mg/kg의 체중의 범위의 양으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드 또는 본원에 기술된 다른 폴리펩타이드, 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 반려 동물에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 주당 1회로 적어도 2 또는 3주 연속 동안 투여되며, 일부 구현예에서, 이러한 치료 주기는 2회 이상의 횟수로 반복되며, 하나 이상의 주(week)의 비 치료(no treatment)가 중간에 임의로 배치된다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효 용량은 2 내지 5 연속일 동안 1일 1회 투여되며, 일부 구현예에서, 이러한 치료 주기는 2회 이상 반복되며, 하나 이상의 일 또는 주의 비 치료가 중간에 임의로 배치된다.
하나 이상의 추가의 치료제"와 함께" 투여는 임의의 순서의 동시(공존) 및 연속 또는 순차적인 투여를 포함한다. 용어 "동시에"는 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하는데 사용되며, 여기서 투여의 적어도 일부는 시간내에서 중첩되거나 여기서 하나의 치료제의 투여는 다른 치료제의 투여에 비하여 짧은 기간내에 속한다. 예를 들면, 2개 이상의 치료제는 거의 규정된 수의 분 이하의 시간으로 분리하여 투여된다. 용어 "순차적으로"는 본원에서 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위해 사용되며 여기서 하나 이상의 제제(들)의 투여는 하나 이상의 다른 제제(들)의 투여를 중지한 후 지속되거나, 여기서 하나 이상의 제제(들)의 투여는 하나 이상의 다른 제제(들)의 투여 전에 개시한다. 예를 들면, 2개 이상의 치료제의 투여는 거의 규정된 수의 분 이상의 시간 분리로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, "와 함께"는 다른 치료 양상 외에 하나의 치료 양상의 투여를 지칭한다. 따라서, "와 함께"는 동물에 대한 다른 치료 양상의 투여 전, 동안 또는 후의 하나의 치료 양상의 투여를 지칭한다.
일부 구현예에서, 용량은 적어도 2 또는 3 연속 주 동안 주당 1회 투여되며, 일부 구현예에서, 이러한 치료 주기는 2회 이상 반복되고, 1주 이상의 비 치료가 중간에 임의로 배치된다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효 용량은 2 내지 5 연속 일 동안 일당 1회 투여되며, 일부 구현예에서, 이러한 치료 주기는 2회 이상 반복되고, 1일 이상 또는 1주 이상의 비 치료가 중간에 임의로 배치된다.
하나 이상의 추가의 치료제 "와 함께" 투여는 임의의 순서의 동시(공존) 및 연속 또는 순차적인 투여를 포함한다. 용어 "동시에"는 본원에서 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하며, 여기서 투여의 적어도 일부는 시간내에 중첩되거나 여기서 하나의 치료제의 투여는 다른 치료제의 투여외 비하여 짧은 기간내에 속한다. 예를 들면, 2개 이상의 치료제는 거의 규정된 수의 분 이하의 시간 분리와 함께 투여된다. 용어 "순차적으로"는 본원에서 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위해 사용되며 여기서 하나 이상의 제제(들)의 투여는 하나 이상의 다른 제제(들)의 투여를 중지한 후 지속하거나, 여기서 하나 이상의 제제(들)의 투여는 하나 이상의 다른 제제(들)의 투여 전에 개시한다. 예를 들면, 2개 이상의 치료제의 투여는 거의 규정된 수의 분 이상의 시간 분리와 함께 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, "와 함꼐"는 다른 치료 양상 외에 하나의 치료 양상의 투여를 지칭한다. 따라서, "와 함께"는 동물에게 다른 치료 양상의 투여 전, 동안 또는 후에 하나의 치료 양상의 투여를 지칭한다.
일부 구현예에서, 방법은 GLP1 융합 폴리펩타이드 인슐린, DPP4 억제제, SGLT2 억제제, 비구아니드 설포닐우레아, 메글리티니드 유도체, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온(TZD), 아밀리노모사체, 담즙산 격리제(bile acid sequestrant), 도파민 효능제와 함께 투여함을 포함한다.
다음의 실시예는 본 개시내용의 특수한 양태를 나타내나 본 개시내용을 어떠한 방식으로도 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
증가된 단백질 A 결합 및/또는 감소된 상보체 결합 및/또는 감소된 CD16 결합을 위한 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드
단백질 A 친화성을 사용한 항체의 정제는 잘-개발된 과정이다. 그러나, 개 IgG의 4개의 아형 중에서, IgG-B Fc(예컨대, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 107) 만이 단백질 A 결합 친화성을 갖는다. 개 IgG-A Fc(예컨대, 서열 번호: 1), IgG-C Fc(예컨대, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 108), 및 IgG-D Fc(예컨대, 서열 번호: 4)는 약하거나 측정불가능한 단백질 A 결합 친화성을 갖는다. 변이체 개 IgG-A Fc, IgG-C Fc, 및 IgG-D Fc 폴리펩타이드가 변경된 단백질 A 결합을 위해 설계되었다.
또한, 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc는 상보체 활성을 가지며 C1q에 결합하는 반면, 개 IgG-A Fc 및 IgG-D Fc는 C1q에 대해 약하거나 측정불가능한 결합 친화성을 갖는다. C1q 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 상보체-매개된 면역 반응을 잠재적으로 감소시키기 위해, 변이체 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc 폴리펩타이드를 설계하였다.
또한, 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc는 CD16 결합 활성을 갖는다. IgG-B Fc 및 IgG-C Fc에 대한 CD16의 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 ADCC를 잠재적으로 감소시키기 위해, 변이체 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc 폴리펩타이드를 설계하였다.
하기 표 3은 개 IgG Fc 아형의 단백질 A 및 C1q 결합 특성을 요약한다. 특히, 야생형 개 IgG Fc 아형 중 어느 것도 C1q 결합을 결여하고 있지 않으며 단백질 A에 결합하지 않는다.
[표 3]
Figure pct00032
(-)는 낮거나 측정불가능한 결합 활성을 나타낸다.
3차원 단백질 모델링 및 단백질 서열 분석을 사용하여, 단백질 A와 접촉하는 경향이 있는 개 IgG-B Fc의 서열을 확인하였다. 도 1은 개 IgG-A, B, C, 및 D Fc 서열의 정렬을 나타낸다. 박스는 단백질 A와 접촉가능성이 있는 영역을 나타낸다.
2개의 접근법을 사용하여 증가된 단백질 A 결합에 대한 변이체 개 IgG-A, IgG-C, 및 IgG-D Fc 폴리펩타이드를 설계하였다. 제1의 접근법을 위해, 변이체 개 IgG-A, IgG-C, 및 IgG-D Fc 폴리펩타이드를 개 IgG-B Fc(예컨대, 각각 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 및 서열 번호: 7)와 동일한 단백질 A 결합 모티프(motif) 서열을 가지도록 설계하였다.제2의 접근법을 위해, 변이체 개 IgG-A Fc I(21)T/Q(207)H(서열 번호: 60), 변이체 개 IgG-C Fc I(21)T(서열 번호: 61), 및 변이체 개 IgG-D Fc I(21)T/Q(207)H(서열 번호: 62)를 개 IgG-B Fc 서열에 상응하는 단백질 A 결합 영역 내에서 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 지니도록 설계하였다.
또한, 표 4에 나타낸 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 증가된 단백질 A 결합을 지닌 변이체 개 IgG-A Fc, IgG-C Fc, 및 IgG-D Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
[표 4]
Figure pct00033
*나열된 아미노산 위치는 나타낸 서열 번호에 대한 것이다.
개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc에 대한 C1q의 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 상보체-매개된 면역 반응을 잠재적으로 감소시키기 위하여, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 3 각각의 93번 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 Lys를 제외하고는 Lys를 임의의 아미노산으로 아미노산 치환된 변이체 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 이러한 아미노산 치환을 개 IgG-A Fc 및 IgG-D Fc와 비교하여 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc의 단백질 서열 및 3-D 구조 모델링의 분석 후 확인하였으며, 이는 상보체 활성을 억제하지 않는 것으로 이해된다. 예를 들면, 변이체 개 IgG-B Fc K(93)R(서열 번호: 78) 및 변이체 개 IgG-C Fc K(93)R(서열 번호: 79)을 제조하였다. 사람 C1q와 변이체 개 IgG-B Fc K(93)R을 포함하는 융합 단백질 사이의 감소된 결합은 야생형 개 IgG-B Fc를 포함하는 융합 단백질과 비교하는 경우 관찰되었다.
IgG-B Fc 및 IgG-C Fc에 대한 CD16의 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 ADCC를 잠재적으로 감소시키기 위하여, 도 5에 나타낸 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변이체 개 IgG-B Fc 및 IgG-C Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 아미노산 치환(들)은 IgG-A 및 IgG-D와 비교하여 개 IgG-B 및 IgG-C의 단백질 서열 및 3-D 구조 모델링의 분석 후 확인되었으며, 이는 ADCC 활성을 나타내지 않는 것으로 이해된다.
[표 5]
Figure pct00034
*나타낸 아미노산 위치는 나타낸 서열 번호에 대한 것이다.
야생형 개 IgG-C Fc는 단백질 A 결합을 결여하고 감소된 C1q 결합을 가지므로, 단백질 A에 결합하고 C1q에 대해 감소된 결합을 갖는 이중 변이체 개 IgG-C Fc를 표 4에 나타낸 하나 이상의 아미노산 치환을 K(93)R 치환 또는 K(93)X 치환과 결합시켜 제조할 수 있으며, 여기서 X는 Lys를 제외한 임의의 아미노산이다. C1q에 대해 감소된 결합 및 CD16에 대해 감소된 결합을 지닌 이중 변이체 개 IgG-B Fc 또는 이중 변이체 개 IgG-C Fc는 표 5에 나타낸 하나 이상의 아미노산 치환을 K(93)R 치환 또는 K(93)X 치환과 조합시켜 제조할 수 있으며, 여기서 X는 Lys를 제외한 임의의 아미노산이다. 단백질 A에 결합하고 C1q에 대해 감소된 결합을 갖는 삼중 변이체 개-IgG-C Fc는 표 4에 나타낸 하나 이상의 아미노산 치환을 K(93)R 치환 또는 K(93)X 치환을 지닌 하나 이상의 아미노산 치환과 조합시킴으로써 제조할 수 있으며, 여기서 X는 Lys를 제외한 임의의 아미노산이다.
단백질 A, CD16, 및/또는 C1q에 대한 임의의 변이체 개 IgG Fc의 결합을 측정하고 단백질 A, CD16, 및/또는 C1q(예컨대, 상응하는 야생형 개 IgG Fc, 다른 야생형 또는 변이체 개 IgG Fc, 또는 다른 반려 동물의 야생형 또는 변이체 IgG Fc 등)에 대한 다른 IgG Fc의 결합과 비교하였다.
결합 분석은 Octet 바이오센서를 사용하여 수행할 수 있다. 요약하면, 표적 분자(예컨대, 단백질 A, C1q, CD16 등)을 바이오티닐화하고 유리된 반응하지 않은 바이오틴을 제거할 수 있다(예컨대, 투석에 의해). 바이오티닐화된 표적 분자를 스트렙타비딘 센서 팁에서 포획한다. 표적 분자와 다양한 농도(예컨대, 10 μg/mL)의 IgG Fc 폴리펩타이드의 회합은 규정된 시점에 대해 또는 정상 상태에 도달할 때까지 모니터링한다. 해리는 규정된 시간 동안 또는 정상 상태에 도달할 때까지 모니터링한다. 완충제만의 블랭크 곡선을 감하여 임의의 이동에 대해 교정할 수 있다. 데이타는 ForteBioTM 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로 조정하여 kon, koff, 및 Kd를 측정한다.
실시예 2
증가된 단백질 A 결합 및/또는 감소된 상보체 결합을 위한 변이체 말 IgG Fc 폴리펩타이드
말 IgG의 7개의 아형 중, IgG1 Fc(예컨대, 서열 번호: 63), IgG3 Fc(예컨대, 서열 번호: 65), IgG4 Fc(예컨대, 서열 번호: 66), IgG7 Fc(예컨대, 서열 번호: 69)는 단백질 A 결합 친화성을 갖는다. 말 IgG2 Fc(예컨대, 서열 번호: 18, 서열 번호: 64), IgG5 Fc(예컨대, 서열 번호: 67), 및 IgG6 Fc(예컨대, 서열 번호: 68)는 약하거나 측정불가능한 단백질 A 결합 친화성을 갖는다. 변이체 말 IgG2 Fc, IgG5 Fc, 및 IgG6 Fc 폴리펩타이드를 변경된 단백질 A 결합에 대해 설계하였다.
또한, 말 IgG2 Fc, IgG5 Fc, 및 IgG6 Fc는 C1q에 대해 약하거나 측정불가능한 결합 친화성을 갖는 반면, 말 IgG1 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 및 IgG7 Fc는 C1q에 결합한다. C1q 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 상보체-매개된 면역 반응을 잠재적으로 감소시키기 위해, 변이체 말 IgG1 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 및 IgG7 Fc 폴리펩타이드를 설계하였다.
하기 표 6은 말 IgG Fc 아형의 단백질 A 및 C1q 결합 특성을 요약한다. 특히, 야생형 말 IgG Fc 아형 중 어느 것도 C1q 결합을 결여하고 있지 않으며 단백질 A에 결합하지 않는다.
[표 6]
Figure pct00035
(-)는 낮거나 측정불가능한 결합 활성을 나타낸다.
3차원 단백질 모델링 및 단백질 서열 분석을 사용하여, 단백질 A와 접촉하는 경향이 있는 말 IgG1 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 및 IgG7 Fc의 서열을 확인하였다. 표 7에 나타낸 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 증가된 단백질 A 결합을 지닌 변이체 말 IgG2 Fc, IgG5 Fc, 및 IgG6 Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
[표 7]
Figure pct00036
*나타낸 아미노산 위치는 나타낸 서열 번호에 대한 것이다.
예를 들면, 야생형 말 IgG Fc의 서열에 상응하는 단백질 A 결합 영역내에 하나 또는 다수의 아미노산 치환을 지닌 변이체 말 IgG2 Fc, IgG5 Fc, 및 IgG6 Fc 폴리펩타이드를 설계하였으며, 이는 단백질 A에 결합한다. 증가된 단백질 A 결합을 지닌 변이체 말 IgG2 Fc F(203)Y(서열 번호: 71); 변이체 말 IgG2 Fc A(15)T/F(203)Y(서열 번호: 72); 변이체 말 IgG5 Fc V(199)L/E(200)Y(서열 번호: 75); 및 변이체 말 IgG6 Fc I(199)L/R(200)H/H(201)N/T(202)H(서열 번호: 76)를 제조할 수 있다.
말 IgG1 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 및 IgG7 Fc에 대한 C1q의 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 상보체-매개된 면역 반응을 잠재적으로 감소시키기 위하여, 서열 번호: 63, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 69 각각의 87번 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 Lys를 제외하고는 임의의 아미노산에 의한 Lys의 아미노산 치환을 갖는 변이체 개 IgG1 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 및 IgG7 Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 말 IgG2 Fc, IgG5 Fc, 및 IgG6 Fc와 비교하여 말 IgG1 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, 및 IgG7 Fc의 단백질 서열 및 3-D 구조 모델링의 분석 후 확인하였으며, 이는 상보체 활성을 나타내지 않는 것으로 이해된다. 예를 들면, 변이체 말 IgG1 Fc K(87)S(서열 번호: 70), 변이체 말 IgG 3 Fc K(87)S(서열 번호: 73), 변이체 말 IgG4 Fc K(87)S(서열 번호: 74), 및 변이체 말 IgG7 Fc K(87)S(서열 번호: 77)을 제조할 수 있다.
단백질 A 및/또는 C1q에 대한 임의의 변이체 말 IgG Fc의 결합을 측정하여 단백질 A 및/또는 C1q(예컨대, 다른 반려 동물의 상응하는 야생형 말 IgG Fc, 다른 야생형 또는 변이체 말 IgG Fc, 또는 야생형 또는 변이체 IgG Fc 등)에 대한 다른 IgG Fc의 결합과 비교할 수 있다. 실시예 1에 기술된 결합 검정을 사용할 수 있다.
실시예 3
감소된 상보체 결합을 위한 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드
고양이 IgG, IgG1a Fc(서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117), IgG1b Fc(서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118), 및 IgG2 Fc(서열 번호: 16)의 각각의 3개의 아형은 단백질 A 결합 친화성을 갖는다. 그러나, 고양이 IgG2 Fc 만은 C1q에 대해 약하거나 측정불가능한 결합 친화성을 갖는 반면, 고양이 IgG1a Fc, IgG1b Fc는 C1q에 결합한다. C1q 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 상보체-매개된 면역 반응을 잠재적으로 감소시키기 위하여, 변이체 고양이 IgG1a Fc 및 IgG1b Fc 폴리펩타이드를 설계하였다.
하기 표 8은 고양이 IgG Fc 아형의 단백질 A 및 C1q 결합 특성을 요약한다. 특히, 야생형 말 IgG Fc 아형 중 어느 것도 C1q 결합을 결고 있지 않으며 단백질 A에 결합하지 않는다.
[표 8]
Figure pct00037
(-)는 낮거나 측정불가능한 결합 활성을 나타낸다.
고양이 IgG1a Fc 및 IgG1b Fc에 대한 C1q의 결합을 잠재적으로 감소시키고/시키거나 상보체-매개된 면역 반응을 잠재적으로 감소시키기 위하여, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 81 각각의 198번 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 Pro를 제외하고는 임의의 아미노산으로 Pro의 아미노산 치환을 갖는 변이체 고양이 IgG1a Fc 및 IgG1b Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 고양이 IgG2 Fc와 비교하여 고양이 IgG1a Fc 및 IgG1b Fc의 단백질 서열 및 3-D 구조 모델링의 분석 후 확인하였으며, 이는 상보체 활성을 나타내지 않는 것으로 이해된다. 예를 들면, 변이체 고양이 IgG1a Fc P(198)A(서열 번호: 82) 및 변이체 고양이 IgG1b Fc P(198)A(서열 번호: 83)를 제조할 수 있다.
C1q에 대한 임의의 변이체 고양이 IgG Fc의 결합을 측정하고 C1q에 대한 다른 IgG Fc(예컨대, 상응하는 야생형 고양이 IgG Fc, 다른 야생형 또는 변이체 고양이 IgG Fc, 또는 다른 반려 동물의 야생형 또는 변이체 IgG Fc 등)의 결합과 비교할 수 있다. 실시예 1에 기술된 결합 검정을 사용할 수 있다.
실시예 4
이종이량체성 단백질을 위한 변이체 개 및 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드
놉-인-홀(knob-in-hole) 이종이량체화 접근법을 사용하여 이특이적인 개 또는 고양이 항체 또는 이기능성 개 또는 고양이 Fc 융합 단백질의 제조를 가능하도록 하기 위하여, 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드의 쌍화(pairing)을 시험하였다.
타이로신에 대한 개 IgG-A(서열 번호: 1)의 138번 위치에 상응하는 위치에서, 개 IgG-B Fc(서열 번호: 2)의 137번 위치에 상응하는 위치에서, 개 IgG-C Fc(서열 번호: 3)의 137번 위치에 상응하는 위치에서, 또는 개 IgG-D Fc(서열 번호: 4)의 138번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌의 아미노산 치환(T138Y 또는 T137Y)을 하나의 Fc 쇄(이종이량체 쇄 1)에 도입시킬 수 있다. 변이체 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 및 IgG-D Fc 이종이량체 쇄 1의 아미노산 서열의 예는 각각 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 및 서열 번호: 14이다.
트레오닌에 대한 개 IgG-A(서열 번호: 1)의 181번 위치에 상응하는 위치에서, 개 IgG-B Fc(서열 번호: 2)의 180번 위치에 상응하는 위치에서, 개 IgG-C Fc(서열 번호: 3)의 180번 위치에 상응하는 위치에서, 또는 개 IgG-D Fc(서열 번호: 4)의 181번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신의 아미노산 치환(Y181T 또는 Y180T)을 제2의 Fc 쇄(이종이량체 쇄 2)에 도입시킬 수 있다. 변이체 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 및 IgG-D Fc 이종이량체 쇄 2의 아미노산 서열의 예는 각각 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 및 서열 번호: 15이다.
변이체 개 IgG Fc 이종이량체 쇄 3 및 4의 제2의 쌍화(pairing)를 또한 시험하였다. 개 IgG-A(서열 번호: 1) 또는 개 IgG-D(서열 번호: 4)의 138번 위치에 상응하는 위치에서 트립토판에 대한 트레오닌의 아미노산 치환(T138W), 또는 개 IgG-B Fc(서열 번호: 2) 또는 개 IgG-C Fc(서열 번호: 3)의 137번 위치에 상응하는 위치에서 트립토판에 대한 트레오닌의 아미노산 치환(T137W)을 하나의 Fc 쇄에 도입할 수 있다(이종이량체 쇄 3). 변이체 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 및 IgG-D Fc 이종이량체 쇄 3의 아미노산 서열의 예는 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 및 서열 번호: 115이다.
개 IgG-A(서열 번호: 1) 또는 IgG-D(서열 번호: 4)의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌에 대한 루이신의 아미노산 치환, 및 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌에 대한 타이로신의 아미노산 치환(T138S, L140A, Y181T), 또는 개 IgG-B Fc(서열 번호: 2) 또는 IgG-C(서열 번호: 3)의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산 치환, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌에 대한 루이신의 아미노산 치환, 및 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌에 대한 타이로신의 아미노산 치환(T137S, L139A, Y180T)을 제2의 Fc 쇄(이종이량체 쇄 4) 내로 도입하였다. 변이체 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 및 IgG-D Fc 이종이량체 쇄-4의 아미노산 서열의 예는 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 및 서열 번호: 116이다.
고양이 IgG2(서열 번호: 16), 고양이 IgG1a Fc(서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117), 또는 고양이 IgG1b Fc(서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118)의 154번 위치에 상응하는 위치에서 트립토판에 대한 트레오닌의 아미노산 치환(T154W)을 하나의 Fc 쇄(이종이량체 쇄 1)에 도입할 수 있다. 변이체 고양이 IgG2 Fc, IgG1a Fc, 및 IgG1b Fc 이종이량체 쇄 1의 아미노산 서열의 예는 각각 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 및 서열 번호: 123이다.
고양이 IgG2 Fc(서열 번호: 16), IgG-1a(서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117), 또는 IgG-1b Fc(서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118)의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린에 대한 트레오닌의 아미노산의 치환, 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌에 대한 루이신의 아미노산 치환, 및 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오틴에 대한 타이로신의 아미노산 치환(T154S, L156A, Y197T)을 제2의 Fc 쇄(이종이량체 쇄 4) 내로 도입하였다. 변이체 고양이 IgG2 Fc, IgG1a Fc, 및 IgG1b Fc 이종이량체 쇄 4의 아미노산 서열의 예는 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 및 서열 번호: 124이다.
변이체 개 IgG Fc 이종이량체 쇄 1 및 2의 쌍화, 변이체 개 IgG Fc 이종이량체 쇄 3 및 4의 쌍화, 또는 변이체 고양이 IgG Fc 이종이량체 쇄 1 및 2의 쌍화는 Fc 이종이량체화를 허용할 수 있으며 Fc 동종이량체화를 방지하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 개 IgG 아형의 이종이량체 쇄 1을 동일하거나 상이한 개 IgG 아형의 이종이량체 쇄 2와 조합할 수 있다. 하나의 개 IgG 아형의 이종이량체 쇄 3을 동일하거나 상이한 개 IgG 아형의 이종이량체 쇄 4와 조합할 수 있다. 하나의 고양이 IgG 아형의 이종이량체 쇄 1을 동일하거나 상이한 고양이 IgG 아형의 이종이량체 쇄 2와 조합시킬 수 있다. 이러한 설계는 이특이적인 개 또는 고양이 항체의 이량체화를 가능하게 할 수 있다. 또한, 2개의 상이한 펩타이드 또는 단백질 또는 상이한 단백질의 조합은 이종이량체성 Fc 쇄에 융합시킬 수 있다. 예를 들면, 이중 GLP1 및 글루카곤 분자는 변이체 개 IgG Fc 이종이량체 쇄 또는 변이체 고양이 IgG Fc 이종이량체 쇄, 예컨대, 변이체 개 IgG-D Fc 이종이량체 쇄 1(예컨대, 서열 번호: 14)에 융합된 GLP1 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 서열 번호: 85, 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 또는 서열 번호: 91) 및 변이체 개 IgG-D Fc 이종이량체 쇄 2(예컨대, 서열 번호: 15)에 융합된 글루카곤 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 94, 또는 서열 번호: 95)를 사용하여 생성시킬 수 있다.
실시예 5
GLP1 융합 단백질
GLP1의 아미노산 서열은 사람, 고양이, 개, 및 말 중에서, 다른 종들 중에서 보존된다. GLP1 단백질분해 생성물(예컨대, GLP1(아미노산 7-37)(서열 번호: 85)은 디펩티딜 펩티다제-4(DPP-4)에 의해 신속하에 분해되며 2분의 짧은 혈청 반감기를 갖는 것으로 이해된다.
적어도 하나의 GLP1 폴리펩타이드 및 고양이, 개, 또는 말 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드의 설계를 시험하여 장기-작용하는 GLP1 융합 단백질을 생성시켰다. 다음의 작제물(construct)을 설계하였다:
화학식 (I): GLP1A-L1-Fc;
화학식 (II): Fc-L1-GLP1A; 또는
화학식 (III): GLP1A-L1-Fc-L2-GLP1B.
여기서 GLP1A는 제1의 GLP1 폴리펩타이드이고, GLP1B는 제2의 GLP1 폴리펩타이드이며, L1 및 L2는 링커이고; Fc는 반려 동물 종의 IgG Fc 폴리펩타이드이다.
야생형 GLP1(7-37)(서열 번호: 85)의 8번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌을 글리신 또는 세린으로 대체시킴으로써 DPP-4 내성이 되도록 변형시켰다. 성숙한 고양이 GLP1R(서열 번호: 49)의 N-말단 도메인에 대한 결합에 대해 야생형 GLP1(7-37)(서열 번호:87)의 최소의 서열을 복합체의 3-차원 단백질 모델링에 의해 분석하였다. 이러한 모델링을 기반으로 하여, 2개의 C-말단 아미노산을 DPP-4 내성 GLP1으로부터 제거함으로써 GLP1-S8(7-35)(서열 번호: 86) 및 GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87) 폴리펩타이드를 생성하였다.
GLP1 폴리펩타이드는, 작제물, 예컨대, 화학식 II 및 III의 C-말단에서 위치하는 경우, DPP-4 분해에 대해 민감하지 않다. 따라서, 알라닌 대 글리신 또는 세린 치환은 C-말단에 위치한 GLP1 폴리펩타이드에 대해 필수적이 아니다. 따라서, 야생형 GLP1(7-37)(서열 번호: 85)을 C-말단에서 사용할 수 있다.
링커는 가요성의, 비-구조적 링커, 예컨대, 글리신 및 세린이 풍부한 링커일 수 있다. 가요성 연장물을 연속된 폴리펩타이드의 C-말단에 가할 수 있다. 연장은 글리신 잔기(서열 번호: 88), 2개의 글리신 잔기(서열 번호: 89), 3개의 글리신 잔기(서열 번호: 90), 4개의 글리신 잔기(서열 번호: 91), 5개의 글리신 잔기(서열 번호: 92), 6개의 글리신 잔기(서열 번호: 93), 7개의 글리신 잔기(서열 번호: 94), 8개의 글리신 잔기(서열 번호: 95), 또는 그 이상의 글리신 잔기를 포함할 수 있다.
실시예 6
GLP1 및 고양이 IgG Fc 융합 단백질
(1) 신호 서열, GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87), 가요성 링커, 및 야생형 고양이 IgG2 Fc(ssGLP1-G8_I_WTfeIgG2; 서열 번호: 96)의 연속된 폴리펩타이드; 및 (2) 신호 서열, GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87), GLP1(7-35)(서열 번호: 89), 2개의 가요성 링커, 2G C-말단 연장부, 및 야생형 고양이 IgG2 Fc (ssGLP1-G8/GLP1-2G_III_WTfeIgG2; 서열 번호: 97)를 갖는 화학식 III의 연속된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 합성하고 별도의 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 야생형 고양이 IgG2 Fc(서열 번호: 16)를 용이한 정제를 위해 감소된 상보체 활성 및 단백질 A 결합에 대해 이의 낮거나 없는 C1Q 결합을 기반으로 선택하였다.
수득되는 벡터는 CHO 세포로 별도로 형질감염되었다. 신호 펩타이드(서열 번호: 24 및 23)를 지니지 않은 연속된 폴리펩타이드를 함유하는 상층액을 수집하고 여과하였다. 단백질 둘 다를 단백질 A 컬럼(CaptivA® 단백질 A 친화성 수지, Repligen)을 사용하여 친화성 정제하였다. 단백질은 HPLC 겔 여과에 의해 평가된 바와 같이 단량체성인 것으로 측정되었다. 그러나, SDS-PAGE 분석은 연속된 폴리펩타이드 둘 다의 퍼센트가 환원제(DTT)의 부재 및 존재하에서 겔내 동일한 위치로 이동함을 나타내었다(도 2a). 이러한 결과는 시스테인 잔기의 하나의 쌍 만을 갖는 야생형 고양이 IgG2 Fc의 힌지가 효과적인 이황화물 결합을 형성하기에 충분하지 않을 수 있음을 시사한다.
수개의 동원체 힌지 구조의 3차원 단백질 모델링 분석을 사용하여 고양이 IgG2 힌지를 변형시켜 이황화물 형성을 증가시키기 위해 근접한 위치를 측정하였다. 고양이 IgG2 힌지에서 이황화물 형성을 증가시키기 위하여, 아미노산을 시스테인으로 치환시킴으로써 힌지 서열을 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 변형된 힌지를 갖는 변이체 고양이 IgG2 Fc(서열 번호: 17)는 서열 번호: 16의 14번 위치에 상응하는 아미노산 위치에서 Gly를 Cys로 치환함으로써 제조하였다. 서열 번호: 17의 변이체 고양이 IgG Fc를 포함하는 상응하는 연속된 폴리펩타이드 ssGLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 39) 및 ssGLP1-G8/GLP1-2G _III_WTfeIgG2(서열 번호: 38)를 설계하고 CHO 세포내에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 신호 서열의 절단 후 분비된 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 26 및 25이다. 변이체 고양이 IgG2 작제물의 SDS-PAGE 분석은 야생형 고양이 IgG2 작제물과 비교하여 환원제의 부재하에 보다 낮은 분자량 밴드내 단백질의 양에 있어서 감소를 나타내었다(도 2b를 도 2a와 비교함). 이러한 결과는 Fc 공유결합성 쌍화가 변이체 고양이 IgG2 작제물 둘 다에 대해 개선되었음을 시사한다.
또한, 차등적인 주사 형광정량법(scanning fluorimetry)을 사용하여 평균 융점 온도(n=3)에 의해 반영된 바와 같이, 다양한 pH에서 연속된 폴리펩타이드의 안전성을 평가하였다(하기 표 9). 변이체 고양이 IgG2 힌지의 증가된 안전성은 pH 6에서 가장 명백하다. 예를 들면, 변이체 고양이 IgG2(서열 번호: 25 및 26)를 가진 작제물은 야생형 고양이 IgG2(서열 번호: 23 및 24)를 갖는 상응하는 작제물보다 pH 6(56.9 및 59.7℃)에서 더 높은 Tm을 나타내었으며, 이는 각각 55.2 및 56.9℃의 Tm을 가졌다.
[표 9]
Figure pct00038
NC = 명백한 전이점이 관찰되지 않았으므로 곡선이 없다.
GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87) 대신에 GLP1-S8(7-35)(서열 번호: 86)를 포함하는 화학식 I, II, 및 III의 연속된 폴리펩타이드를 유사하게 설계하고 제조할 수 있다. 예를 들면, ssGLP1-S8_I_WTfeIgG2(서열 번호: 40), GLP1-S8_I_WTfeIgG2(서열 번호: 28), ssGLP1-S8/GLP1-3G_III_WTfeIgG2(서열 번호: 37), 및 GLP1-S8/GLP1-3G_III_WTfeIgG2(서열 번호: 27)를 제조할 수 있다. 야생형 고양이 IgG Fc, 예컨대, GLP1-S8_I_VARfeIgG2, GLP1-S8_I_ VARfeIgG2, GLP1-S8/GLP1-2G_III_VARfeIgG2, 및 GLP1-S8/GLP1-3G_III_ VARfeIgG2 대신에 변이체를 갖는 유사한 작제물을 또한 제조할 수 있다.
고양이 IgG2 Fc를 당해 실시예에서 사용할 수 있지만, IgG2 대신에 고양이 IgG1a Fc 또는 IgG1b Fc를 포함하는 화학식 I, II, 및 III의 연속된 폴리펩타이드를 설계하고 제조할 수 있다. 예를 들면, 야생형 고양이 IgG1a Fc, 야생형 고양이 IgG1b Fc, 변이체 고양이 IgG1a Fc, 또는 변이체 고양이 IgG1b Fc(각각 서열 번호: 80 내지 83)를 갖는 유사한 연속된 폴리펩타이드를 설계하고 제조할 수 있다.
실시예 7
GLP1 및 개 IgG Fc 융합 단백질
변이체 GLP1 및 개 IgG Fc를 포함하는 다양한 화학식 I, II, 및 III의 연속된 폴리펩타이드를 설계하고 제조할 수 있다. 예를 들면, 변이체 개 IgGD Fc(예컨대, 서열 번호: 7 또는 서열 번호: 62)를 감소된 상보체 활성 및 용이한 정제를 위한 단백질 A 결합에 대해 이의 낮거나 없는 C1q 결합을 기반으로 선택할 수 있다. 또한, 가요성의, 비-구조적 링커, 예컨대, 글리신 및/또는 세린이 풍부한 링커를 사용할 수 있다.
GLP1-G8_I_VARcaIgGD(서열 번호: 30) 및 GLP1-S8_I_VARcaIgGD(서열 번호: 32)는 (1) GLP1-G8(7-35) 또는 GLP1-S8 (7-35), (2) 가요성 링커, 및 (3) 변이체 개 IgGD Fc(예컨대, 서열 번호: 7)을 포함하는 화학식 I의 연속된 폴리펩타이드의 예이다. GLP1-G8/GLP1-3G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 29) 및 GLP1-S8/GLP1-3G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 31)은 (1) GLP1-G8(서열 번호: 87) 또는 GLP1-S8(서열 번호: 86), (2) GLP1 (7-35)(서열 번호: 61), (3) 2개의 가요성 링커, (4) 3G C-말단 연장부, 및 (5) 변이체 개 IgGD Fc를 포함하는 화학식 III의 연속된 폴리펩타이드의 예이다.
연속된 폴리펩타이드를 신호 서열, 상이한 GLP1 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 85, 86, 87, 98, 또는 99), 또는 개 IgG Fc에 대한 상이한 변형을 사용하여 설계할 수 있다. 이러한 변화의 예는 ssGLP1-S8/GLP1-2G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 41), ssGLP1-G8/GLP1-2G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 42), ssGLP1-S8/GLP1-3G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 43), GLP1-S8/GLP1-2G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 105), 및 GLP1-G8/GLP1-2G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 106)을 포함한다.
또한, 화학식 I, II, 및 III의 연속된 폴리펩타이드는 변이체 개 IgGD 대신에 야생형 개 IgGD, 또는 야생형 또는 변이체 개 IgGA, IgGB, 또는 IgGC를 포함할 수 있다. 예를 들면, 야생형 개 IgGA Fc, IgGB Fc, IgGC Fc, 또는 IgGD Fc(예컨대, 각각 서열 번호: 1, 2, 3, 또는 4)을 갖는 유사한 연속된 폴리펩타이드를 설계하고 제조할 수 있다. 추가의 예는 변이체 개 IgGA Fc(예컨대, 서열 번호: 5 또는 60), 변이체 개 IgGB Fc(예컨대, 서열 번호: 78), 또는 변이체 개 IgGC Fc(예컨대, 서열 번호: 6, 61, 79, 또는 84)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드를 포함한다.
GLP1-G8/GLP1-3G_III_VARcaIgGD(서열 번호: 29) 및 GLP1-G8_I_ VARcaIgGD(서열 번호: 30)를 CHO 세포내에서 별도로 발현시키고 단백질을 함유하는 상층액을 수집하고 여과하였다. 연속된 폴리펩타이드 둘 다는 단백질 A 크로마토그래피에 의해 친화성 정제되었다. 환원제(DTT)의 부재 및 존재하에서 2개의 연속된 폴리펩타이드의 SDS-PAGE 프로파일을 비교하였으며 결과는 Fc 이황화물 결합이 폴리펩타이드 둘다에 대해 효과적으로 형성되었음을 시사하였다(데이타는 나타나지 않음).
실시예 8
GLP1 및 말 IgG Fc 융합 단백질
변이체 GLP1 및 말 IgG Fc를 포함하는 다양한 화학식 I, II, 및 III의 연속된 폴리펩타이드를 설계하고 제조할 수 있다. 예를 들면, 변이체 개 IgG2 Fc(예컨대, 서열 번호: 19, 71, 또는 72)를 감소된 상보체 활성 및 용이한 정제를 위한 단백질 A 결합에 대해 이의 낮거나 없는 C1q 결합을 기반으로 선택할 수 있다. 또한, 가요성의, 비-구조적 링커, 예컨대, 글리신 및/또는 세린이 풍부한 링커를 사용할 수 있다.
GLP1-G8_I_VAReqIgG2(서열 번호: 34) 및 GLP1-S8_I_VAReqIgG2(서열 번호: 36)는 (1) GLP1-G8 또는 GLP1-S8, (2) 가요성 링커, 및 (3) 변이체 말 IgG2 Fc(예컨대, 서열 번호: 19)을 포함하는 화학식 I의 연속된 폴리펩타이드의 예이다. GLP1-G8/GLP1-3G_III_VAReqIgG2(서열 번호: 33) 및 GLP1-S8/GLP1-3G_III_VAReqIgG2(서열 번호: 35)는 (1) GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87) 또는 GLP1-S8(7-35)(서열 번호: 86), (2) GLP1(7-35)(서열 번호: 61), (3) 2개의 가요성 링커, (4) 3G C-말단 연장부, 및 (5) 변이체 말 IgGD Fc를 포함하는 화학식 III의 연속된 폴리펩타이드의 예이다.
연속된 폴리펩타이드를 신호 서열, 상이한 GLP1 유사체(예컨대, 서열 번호: 86, 87, 98, 또는 99), 글리신 연장부(예컨대, 서열 번호: 88 내지 95) 또는 말 IgG Fc에 대한 추가의 변형을 사용하여 설계할 수 있다. 이러한 변형을 갖는 예는 ssGLP1-G8/GLP1-3G_III_VAReqIgG2(서열 번호: 44), ssGLP1-G8_I_VAReqIgG2(서열 번호: 45), ssGLP1-S8/GLP1-3G_III_VAReqIgG2(서열 번호: 46), 및 ssGLP1-S8_I_VAReqIgG2(서열 번호: 47)를 포함한다.
또한, 화학식 I, II, 및 III의 연속된 폴리펩타이드는 변이체 말 IgG2 대신에 야생형 말 IgG2, 또는 야생형 또는 변이체 말 IgG1, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7을 포함할 수 있다. 예를 들면, 야생형 말 IgG1 Fc(예컨대, 서열 번호: 63), IgG2 Fc(예컨대, 서열 번호: 18 또는 64), IgG3 Fc(예컨대, 서열 번호: 65), IgG4 Fc(예컨대, 서열 번호: 66), IgG5 Fc(예컨대, 서열 번호: 67), IgG6 Fc(예컨대, 서열 번호: 68), 또는 IgG7 Fc(예컨대, 서열 번호: 69)를 가진 유사한 연속된 폴리펩타이드를 설계하고 제조할 수 있다. 추가의 예는 변이체 말 IgG1Fc(예컨대, 서열 번호: 70), 변이체 말 IgG3 Fc(예컨대, 서열 번호: 73), 변이체 말 IgG4 Fc(예컨대, 서열 번호: 74), 변이체 말 IgG5 Fc(예컨대, 서열 번호: 75), 변이체 말 IgG6 Fc(예컨대, 서열 번호: 76), 또는 변이체 말 IgG7 Gc(예컨대, 서열 번호: 77)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드를 포함한다.
ssGLP1-G8/GLP1-3G_III_VAReqIgG2(서열 번호: 44) 및 ssGLP1-G8_I_ VAReqIgG2(서열 번호: 45)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 합성하고 별도의 포유동물 발현 벡터내로 클로닝하였다. 수득되는 벡터는 CHO 세포로 별도로 형질감염시켰다. 신호 펩타이드(서열 번호: 103 및 104)의 절단 후 연속된 폴리펩타이드를 함유하는 상층액을 수집하고 여과하였다. 단백질 둘 다를 단백질 A 컬럼(CaptivA® 단백질 A 친화성 수지, Repligen)을 사용하여 친화성 정제하고, CHO 세포내에서 별도로 발현시키고 단백질을 함유하는 상층액을 수집하고 여과하였다. 연속된 폴리펩타이드 둘 다는 단백질 A 크로마토그래피로 친화성 정제하였다. 환원제(DTT)의 부재 및 존재하에서 2개의 연속된 폴리펩타이드의 SDS-PAGE 프로파일을 비교하였으며 결과는 Fc 이황화물 결합이 폴리펩타이드 둘 다에 대해 효과적으로 형성되었음을 시사하였다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 9
고양이 GLP1R N-말단 가용성 도메인의 발현 및 정제
GLP1R에 대한 GLP1의 결합에 관여하는 성숙한 고양이 GLP1R(서열 번호: 49)의 N-말단 도메인을 전체 길이의 고양이 GLP1R 아미노산 서열(서열 번호: 48)로부터 확인하였다. (1) 신호 서열, 고양이 N-말단 GLP1R, 사람 Fc, 및 폴리-His 태그(ssFeGLP1R-N-huFc_PolyHis; 서열 번호: 50) 및 (2) 신호 서열, 고양이 N-말단 GLP1R, 및 폴리-His 태그(ssFeGLP1R-N_polyHis; 서열 번호: 51)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 합성하고 별도의 포유동물 발현 벡터내로 클로닝하였다. 수득되는 벡터를 CHO 세포로 별도로 형질감염시켜다. 폴리펩타이드를 함유하는 상층액을 수집하고 여과하였다. 단백질은 huFc 작제물에 대해 Ni-세파로즈 컬럼 또는 단백질 A 컬럼(CaptivA®-단백질 A 친화성 수지, Repligen)을 사용하여 친화성 정제하였다. 단백질 둘 다를 GLP1 기능성 결합 및 ELISA를 위해 사용하였다.
실시예 10
GLP1 융합 단백질 결합 역학
FeGLP1R-N-huFc_PolyHis에 대한 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)의 결합 친화성을 생물층 간섭법(Octet)을 사용하여 평가하였다. 요약하면, FeGLP1R-N-huFc_PolyHis를 바이오티닐화하고, 유리된 반응하지 않은 바이오틴을 제거하고, 바이오티닐화된 단백질을 스트렙타비딘 센서 팁에 대해 포획하였다. 상이한 농도의 GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 결합을 90초 동안 모니터링하였다. 해리는 600초 동안 모니터링하였다. 완충제 만의 블랭크 곡선을 감하여 임의의 이동에 대해 교정하였다. 데이타를 ForteBio™ 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 대해 조정함으로써 kon, koff, 및 Kd를 측정하였다. 희석용 완충제 및 모든 결합 단계는 다음과 같았다: 20 mM 인산염, 150 mM NaCl, pH 7.2. 고양이 GLP1R N-말단 도메인과 GLP1-G8_I_VARfeIgG2 사이의 Kd는 8.0x10-9 내지 16x10-9 M 사이이었다.
실시예 11
세포-기반 검정에서 GLP1 융합 단백질 생물활성
세포 표면 위에 Gs-커플링된 사람 글루카곤 리간드 펩타이드-1 수용체(GLP1R)를 과발현하는 햄스터 난소 세포주인 CHOK-1-GL1R 세포주(Discoverx, 제품 번호 95-0062C2)를 사용하여 GLP1 세포 활성을 cAMP 헌터 생물검정 키트(Hunter Bioassay kit)(Discoverx, 제품 번호 95-0062Y2)로 측정하였다. 세포를 96-웰 플레이트(well plate)에 플레이팅하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 세포를 대조군 효능제- GLP1 사람(37 a.a.)(Prospec, 제품 번호 HOR-236) 또는 엔스텐딘-4(Discoverx, 제품 번호 92-1115)- 또는 변이체 GLP1을 포함하는 연속된 폴리펩타이드를 사용하여 일련의 3-배 희석으로 처리한 후 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 시험된 연속된 폴리펩타이드는 GLP1-G8/GLP1-2G_III_VARfeIgG2(서열 번호: 25) 및 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)이었다.
Gs-커플링된 GLP1R 수용체에 대한 GLP1 결합 시, Gs는 아데닐레이트 사이클라제를 자극시켜 cAMP를 생성하였다. 항온처리 말기에, cAMP 항체 시약 및 분해 완충제를 함유하는 cAMP 작업 검출 용액, β-갈락토시다제(β-gal) 소(small) 단편 접합된 cAMP, 및 기질을 세포에 가하였다. 세포를 암실 속에서 1시간 동안 실온에서 항온처리하여 내인성으로 생성된 cAMP와 cAMP 항체 결합을 위해 β-gal 소 단편 접합된 cAMP 사이에 면역경쟁 반응이 일어나도록 하였다.
1시간 항온처리 말기에, 유리된(비-항체 결합) β-gal 소 단편-cAMP으로 보충하여 작용성 효소를 형성할 수 있는 β-gal 거대 단편을 함유하는 cAMP 용액 A를 세포 분해물에 가하였다. 분해물을 3 내지 6시간 동안 암실에서 실온으로 항온처리하여 β-gal이 기질을 가수분해하여 발광성 신호를 생성하도록 하였다.
남아있는 결합되지 않은 유리된 β-gal 소 단편-cAMP이 많을 수록, 작용성인 β-gal 효소가 더 많이 형성된다. 따라서, 생산된 신호의 양은 세포 분해물 속의 cAMP의 양에 직접 비례한다. 항온처리 말기에, 발광성을 Synergy HT 미세플레이트 판독기(Biotek, 버몬트주 위누스키(Winooski) 소재)에서 판독하였다. EC50을 소프트웨어 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc. 미국 라 졸라 소재)으로 계산하였다.
도 3은 시험한 각각의 샘플에 대해 상대적인 광 단위(RLU) 대 농도의 플롯을 나타낸다. EC50은 하기 표 10에 나타낸다. GLP1-G8/GLP1-2G_III_ VARfeIgG2(서열 번호: 25) 및 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)은 GLP1(7-37) 및 엑스텐딘-4보다 더 활성이다. GLP1-G8/GLP1-2G_III_ VARfeIgG2(서열 번호: 25)는 GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)보다 더 강력하며, 이는 C-말단 GLP1이 추가의 활성에 기여할 수 있음을 시사한다.
[표 10]
Figure pct00039
실시예 12
GLP1 융합 단백질 장기간 안전성
GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)를 PBS, pH7.2 속에 1.3 mg/mL의 농도에서 저장하고, 1.5 mL 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 속에 두고, 2 내지 8℃에서 1년 동안 저장하였다(Lot 2-29-2016). GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)를 또한 PBS, pH 7.2 속에서 10 mg/mL의 농도로 저장하고, 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 두고, 2 내지 8℃에서 1일 동안 저장하였다(Lot 2-2-2017). 안전성을 평가하기 위하여, 저장된 샘플을 세포-기반 검정에 의해 실시예 11에 기술된 동일한 CHOK-1-GL1R 세포주(Discoverx, 제품 번호 95-0062C2)를 사용하여 분석하였으나, 세포 활성은 cAMP-Glo™ 막스 검정(Max Assay)(Promega, 제품 번호 PAV1682)를 사용하여 평가하였다.
CHOK-1-GL1R 세포를 96-웰 플레이트(Corning, 제품 번호 3610)에 웰당 20,000개 세포의 밀도로 10% 소태아 혈청이 보충된 F-12K 배지(ATCC, 제품 번호 ATCC® 30-2004) 내에 두고, 열 불활성화시키고(Sigma, 제품 번호 2868) 37℃, 5% CO2 속에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 세포를 대조군 효능제 GLP1 사람(37 a.a.)(Prospec, 제품 번호 HOR-236), Lot 2-20-2016, 또는 Lot 2-2-2017를 사용하여 혈청-유리된 배지와 일련의 3-배 희석으로 자극시킨 다음 MgCl2를 함유하는 완전 유도 완충제를 최종 농도 20 mM로, 이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX )(Sigma-Aldrich 제품 번호 I7018)를 최종 농도 500 μM로 및 Ro 20-1724[4-(3-부톡시-4-메톡시-벤질)이미다졸리돈](Sigma Aldrich, 제품 번호 B8279)를 최종 농도 100 μM로 가하였다.
세포를 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 이러한 과정에서, Gs-커플링된 GLP1R 수용체에 대한 GLP1 결합시, Gs는 아데닐레이트 사이클라제를 자극하여 cAMP를 생성한다. 항온처리 말기에, 불활성 단백질 키나제 A 홀로엔자임, 단백질 키나제 A 기질, 및 분해 완충제를 함유하는 cAMP 검출 용액을 세포에 가하였다. 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 1 내지 2분 동안 둔 다음 실온(23℃)에서 20분 동안 항온처리하였다. 세포 cAMP는 이의 조절성-억제성 소단위를 결합시키고 촉매 소단위를 방출함으로써 단백질 키나제 A를 활성화시킬 것이다. 유리된 촉매 소단위는 단백질 키나제 A 기질에 대한 ATP의 말단 포스페이트의 전달을 촉매함으로써, 공정 중 세포 ATP를 소비한다. 항온처리 말기에, 루시퍼라제-기반 Kinase-Glo® 시약을 세포 분해물에 가하고 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 2분 동안 진탕한 후 암실 속에서 실온으로 10분 동안 항온처리하였다.
루시페린의 모노-산소화(oxygenation)는 세포 분해물 속에 존재하는 Mg2+ 및 ATP의 존재하에서 루시퍼라제에 의해 촉매되어, 세포내 ATP의 양에 비례하는 발광성 신호를 생성하였다. 10분 항온처리 말기에, 플레이트를 Synergy HT 미세플레이트 판독기(Biotek, 버몬트 위누스키 소재) 상에서 판독하였다. 발광성은 ATP 수준에 비례하지만 cAMP 수준에 대해서는 반비례한다. 따라서, cAMP 농도가 증가함에 따라, 발광성은 감소한다.
도 4는 Lot 2-2-2017 및 GLP1 (31 a.a.)와 비교한 Lot 2-29-2016에 대한 발광성 대 농도의 플롯으로서 세포-기반 검정의 결과를 나타낸다. GLP1-G8_I_VARfeIgG2 샘플은 PBS 속에서 2 내지 8℃로 1년 동안 저장 후 세포 활성을 유지하였다.
실시예 13
GLP1 융합 단백질 혈청 안전성
GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)를 PBS, pH7.2 속에서 고양이 혈청과 함께 37℃에서 24시간 동안 저장하여 시험관내 혈청 안전성을 시험하였다. 세포-기반 검정은 실시예 12에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 결과는 활성이 유지되었음을 시사하였다(데이타는 나타내지 않음). 또한, 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰되는 가시적인 분해는 없었다(도 5).
실시예 14
GLP1 융합 단백질 생체 내 약동학
GLP1-G8_I_VARfeIgG2(서열 번호: 26)를 단일 용량(2 mg/kg)으로서 피하 주사에 의해 5마리의 고양이에게 투여하였다. 혈청 샘플을 투여 전(0 시) 및 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 및 168 시간째에 취하였다. 혈청 샘플 속의 GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 농도를 정량적 ELISA로 측정하였다. 검출 한계가 4 ng/mL인 GLP1-G8_I_VARfeIgG2 폴리펩타이드를 참고로서 사용하였다. GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 혈청 농도를 시간에 대해 플롯팅하였다(도 6). GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 평균 혈청 반감기(t½)는 39 시간이었다. 평균 Tmax는 22시간이었으며, 평균 Cmax는 12 μg /mL이었고, 평균 곡선하 면적(AUC)은 약 950 μg(h)/mL이었다.
정량적 ELISA는 항-GLP1 항체(4F3, Novus Biologicals, 제품 번호 NBP1-97413) 및 염소 항-고양이 IgG-Fc, HRP 접합된 항체(Bethyl Laboratories, Inc., 제품 번호 A20-117P)를 생체내 약동학적 연구로부터의 고양이 혈청 샘플 중 GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 정량화를 위해 사용하였다. 96-웰 플레이트를 항-GLP1 항체(코팅 완충액 중 5 μg/mL, 100 μl/웰)로 코팅하였다. 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 1X TBST(10X TBST, Teknova, 제품 번호 T9511)로 3회 세척하고 차단 완충제를 가하였다. 차단 완충제를 제거한 후, 차단 완충제 중 참고 표준 및 샘플의 일련 희석물을 가하고(100 μl/웰) 플레이트를 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 1X TBST로 3회 세척하고 염소 항-고양이 IgG Fc 항체를 가하였다(차단 완충제 중 0.1 μg/mL, 100 μl/웰). 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 1X TBST로 5회 세척하였다. TMB 기질(ScyTek, 제품 번호 TM1999)을 가하고(100 μl/웰) 실온에서 1분 동안 항온처리시켰다. 반응은 2M H2SO4(50 μl/웰)를 가하여 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 측정하고 혈청 샘플 중 GLP1-G8_I_ VARfeIgG2의 농도를 계산하였다.
또한, 동일한 혈청 샘플(DPP-4를 가하지 않음) 중 GLP1-G8_I_VARfeIgG2 농도를 세포-기반 활성 검정을 사용하여 평가하였다. 실시예 12에 기술된 동일한 CHOK-1-GL1R 세포주(Discoverx, 제품 번호 95-0062C2) 및 cAMP-Glo™ 막스 검정(Promega, 제품 번호 PAV1682)을 사용하였다. 그러나, 본 실시예에서, 세포는 대조군 효능제 GLP1 사람(37 a.a.)(Prospec, 제품 번호 HOR-236) 또는 혈청-유리된 배지 속에 희석된(5%, 0.5%, 및 0.05% 희석) 투여 전(0 시), 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 및 168 시간 째에 취한 고양이 혈청의 샘플로 자극시켰다. 각각의 샘플 중 GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 농도는 SoftMax pro 7(Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일(Sunnyvale) 소재)을 사용하여 계산하였다. 5마리의 고양이에 대한 GLP1-G8_I_VARfeIgG2의 평균 농도를 시간에 대해 플롯팅하였다(도 7). 평균 AUC는 약 840 μg(h)/mL이었고 평균 t1/2은 36시간이었다. 세포-기반 활성 검정으로부터 계산된 농도는 ELISA로부터 수득한 농도와 일치하였으며, 이는 ELISA에 의해 검출된 변이체 GLP1이 생물학적으로 활성임을 시사한다.
실시예 15
GLP1, 글루카곤, 및 IgG Fc 융합 단백질
장기 작용하는 GLP1 수용체 및 글루카곤 수용체 이중 효능제를 시험하기 위하여, GLP1 폴리펩타이드, 글루카곤 폴리펩타이드, 및 다음 구조를 갖는 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드를 설계하였다:
화학식 (IV): GLP1-L1-Fc-L2-Gluc; 및
화학식 (V): Gluc-L1-Fc-L20GLP1,
여기서 GLP1은 GLP1 폴리펩타이드이고, Gluc는 글루카곤 폴리펩타이드이며, L1 및 L2는 링커이고, Fc는 Fc 폴리펩타이드이다.
상기 논의된 바와 같이, GLP1은 야생형 GLP1(7-37)(서열 번호: 85)의 8번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌을 글리신 또는 세린으로 대체함으로써 DPP-4 내성이 되도록 변형시켰다. 또한, DPP-4 내성 GLP1은 2개의 C-말단 아미노산을 제거하여 변이체 GLP1-S8(7-35)(서열 번호: 86) 및 변이체 GLP1-G8(7-35)(서열 번호: 87) 폴리펩타이드를 생성함으로써 추가로 변형시켰다.
GLP1 폴리펩타이드는 화학식 (V)에서와 같이, 작제물의 C-말단에 위치하는 경우, DPP-4 분해에 대해 민감하지 않다. 따라서, 알라닌 대 글리신 또는 세린 치환은 C-말단에 위치한 GLP1 폴리펩타이드의 경우 필수적이지 않다. 따라서, 야생형 GLP1(7-37)(서열 번호: 85)을 C-말단에서 사용할 수 있다.
링커는 가요성, 비-구조적 링커, 예컨대, 글리신 및 세린이 풍부한 링커일 수 있다. 가요성 연장부를 연속된 폴리펩타이드의 C-말단에 가할 수 있다. 연장부는 글리신 잔기(서열 번호: 88), 2개의 글리신 잔기(서열 번호: 89), 3개의 글리신 잔기(서열 번호: 90), 4개의 글리신 잔기(서열 번호: 91), 5개의 글리신 잔기(서열 번호: 92), 6개의 글리신 잔기(서열 번호: 93), 7개의 글리신 잔기(서열 번호: 94), 8개의 글리신 잔기(서열 번호: 95), 또는 그 이상의 글리신 잔기를 포함할 수 있다.
연속된 폴리펩타이드는 야생형 글루카곤 폴리펩타이드(예컨대, 서열 번호: 21) 또는 변이체 글루카곤 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
연속된 폴리펩타이드는 반려 동물 종, 예컨대, 개, 고양이, 또는 말의 사람 IgG Fc 또는 IgG Fc를 포함할 수 있다. 사용된 IgG Fc의 아형은 C1q 결합 활성이 낮거나 없고/없거나 단백질 A 결합능을 가지는 것을 기반으로 할 수 있다. 예를 들면, C1q 결합이 낮거나 없고/없거나 단백질 A 결합능을 가진 야생형 또는 변이체 사람, 개, 말, 또는 고양이 IgG Fc를 사용할 수 있다(예컨대, 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 또는 84).
GLP1 폴리펩타이드, 글루카곤 폴리펩타이드, 및 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 예시적인 연속된 폴리펩타이드는 GLP1-G8/Gluc-3G_IV_WTfeIgG2(서열 번호: 52) 및 Gluc/GLP1-2G_V_WTfeIgG2(서열 번호: 53)를 포함한다.
GLP1 폴리펩타이드, 글루카곤 폴리펩타이드, 및 개 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 예시적인 연속된 폴리펩타이드는 GLP1-G8/Gluc-4G_IV_VARcaIgGD(서열 번호: 54) 및 Gluc/GLP1-3G_V_VARcaIgGD(서열 번호: 55)를 포함한다.
GLP1 폴리펩타이드, 글루카곤 폴리펩타이드, 및 말 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 예시적인 연속된 폴리펩타이드는 GLP1-G8/Gluc-4G_IV_VAReqIgGD(서열 번호: 56) 및 Gluc/GLP1-3G_V_VAReqIgG2(서열 번호: 57)을 포함한다.
GLP1 폴리펩타이드, 글루카곤 폴리펩타이드, 및 사람 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 예시적인 연속된 폴리펩타이드는 GLP1-G8/Gluc-4G_IV_huIgG4(서열 번호: 8) 및 Gluc/GLP1-3G_V_huIgG4(서열 번호: 59)를 포함한다.
실시예 16
향상된 힌지 이황화물 형성을 위한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
수개의 동원체 힌지 구조의 추가의 3-차원 단백질 모델링 분석을 사용하여 고양이 및 말 IgG 힌지를 변형시킴으로써 이황화물 형성을 향상시켰다. 고양이 IgG 힌지에서 이황화물 형성을 향상시키기 위하여, 힌지 서열은 고양이 IgG2(서열 번호: 16), 고양이 IgG1a(서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117), 또는 고양이 IgG1b(서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118)의 16번 위치에 상응하는 위치에서 라이신을 프롤린으로 치환시킴으로써(예컨대, K16P) 변형시킬 수 있다. 변형된 힌지를 가진 변이체 고양이 IgG 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 예는 서열 번호: 125, 서열 번호: 126, 및 서열 번호: 127을 포함한다.
말 IgG 힌지에서 이황화물 형성을 향상시키기 위하여, 힌지 서열은 말 IgG의 3번 위치에 상응하는 위치에서 시스테인을 세린으로 치환(예컨대, IgG2 Fc(서열 번호: 129))시키고/시키거나 말 IgG의 20번 위치에 상응하는 위치에서 글루타민을 프롤린으로 치환(예컨대, IgG2 Fc(서열 번호: 129)(예컨대, C3S, Q20P)시킴으로써 변형시킬 수 있다. 변형된 힌지를 갖는 변이체 말 IgG 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 예는 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 134, 및 서열 번호: 135를 포함한다.
실시예 17
향상된 재조합체 생산 및/또는 향상된 힌지 이황화물 형성을 위한 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드
3-차원 단백질 모델링을 사용하여 향상된 재조합체 생산 및 증진된 힌지 이황화물 형성에 대한 상이한 IgG 동형으로부터의 힌지 영역으로부터의 서열을 포함하는 고양이 및 말 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 설계하였다. 고양이 IgG1a 또는 IgG1b(예컨대, 서열 번호: 125)의 힌지 영역으로부터의 서열을 포함하는 변이체 고양이 IgG2 Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 또한, 말 IgG1(예컨대, 서열 번호: 19)의 힌지 영역으로부터의 서열을 포함하는 변이체 말 IgG2 Fc 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
변이체 IgG Fc 폴리펩타이드의 재조합체 생산의 수준 및/또는 힌지 이황화물 형성의 수준을 측정하고 환원 및 비-환원 조건 하에서 DSS-PAGE 분석에 의해 다른 IgG Fc(예컨대, 동일하거나 상이한 아형의 상응하는 야생형 IgG Fc, 또는 다른 반려 동물의 야생형 또는 변이체 IgG Fc 등)의 것과 비교할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> KINDRED BIOSCIENCES, INC. <120> IGG FC VARIANTS FOR VETERINARY USE <130> 01157-0011-00PCT <150> US 62/545,858 <151> 2017-08-15 <160> 199 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type canine IgG-A Fc , Protein A -, C1q -, CD16 <400> 1 Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 145 150 155 160 Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn 195 200 205 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type canine IgG-B Fc , Protein A +, C1q +, CD16 + <400> 2 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro 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Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 6 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant canine IgG-C Fc , C1q +, Protein A +, I(21)T, V(23)L, T(24)I <400> 6 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp 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Trp Gln Ser Asn Glu His Pro Glu Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Ser Val Glu Thr Ser Arg Trp Lys Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Gly Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Asn Val 195 200 205 Ser His Ser Pro Gly Lys 210 <210> 76 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant equine IgG6 Fc, C1q -, Protein A +, I(199)L , R(200)H, H(201)N, T(202)H <400> 76 Gly Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 20 25 30 Gln Glu Asn Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Ala His Thr Ala Thr Thr Lys Ala Lys Glu Lys Gln Asp Asn Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Arg Thr Ile Thr Lys Ala Lys Gly Glu Leu Gln Asp Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Ile Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Val Thr Lys Asn Thr Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn Val 130 135 140 Glu Trp Gln Ser Asn Glu Glu Pro Glu Pro Glu Val Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asp Arg Trp Glu Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Arg Gln Lys Ser Ile 195 200 205 Thr Asn Phe Pro Gly Lys 210 <210> 77 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant equine IgG7 Fc, Protein A +, C1q - , K(87)S <400> 77 Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly 20 25 30 His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Asn Asn Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Ile Leu Ala Ile Gln His Lys Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Ser Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Gln Lys Thr Ile Ser Lys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Ile 130 135 140 Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys 180 185 190 Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Glu Lys Ser Val 195 200 205 Ser Lys Ser Pro Gly Lys 210 <210> 78 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q - , K(93)R <400> 78 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Arg Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 80 <211> 237 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Alternative wild-type feline IgG1a Fc, Protein A +, C1q + <400> 80 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Thr Gly Glu Gly Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln 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Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 83 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant feline IgG1b Fc, Protein A +, C1q -, P(198)A <400> 83 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Thr Gly Glu Gly Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Asp Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 84 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant canine IgG-C Fc , C1q - , K(93)R , Protein A +, I(21)T, V(23)L, T(24)I <400> 84 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Arg Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 85 <211> 31 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type GLP1 (7-37) <400> 85 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ala Gly 20 25 30 <210> 86 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: GLP1-S8 (7-35) <400> 86 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 20 25 <210> 87 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: GLP1-G8 (7-35) <400> 87 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 20 25 <210> 88 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 1G extension <400> 88 Gly 1 <210> 89 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 2G extension <400> 89 Gly Gly 1 <210> 90 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 3G extension <400> 90 Gly Gly Gly 1 <210> 91 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 4G extension <400> 91 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 5G extension <400> 92 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 6G extension <400> 93 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 7G extension <400> 94 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 8G extension <400> 95 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 96 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ssGLP1-G8_I_WTfeIgG2 <400> 96 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys 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Gly Gly His Ala Glu Gly Thr Phe 305 310 315 320 Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe 325 330 335 Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 340 345 <210> 98 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant GLP1 (7-36) <400> 98 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Ala 20 25 30 <210> 99 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Variant GLP1 (7-35) <400> 99 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 20 25 <210> 100 <211> 229 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type equine Fc IgG2 (including equine IgG2 hinge), Protein A - , C1q - <400> 100 Val Pro Lys Pro Gln Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Ala Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu 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His Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 109 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-A Fc, Heterodimer chain 3, T(138)W <400> 109 Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Trp Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 145 150 155 160 Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr 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Variant canine IgG-C Fc, Heterodimer chain 4, T(137)S, L(139)A, Y(180)T <400> 114 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Ser Cys Ala Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Thr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 115 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-D Fc, Heterodimer chain 3, T(138)W <400> 115 Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Trp Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu 145 150 155 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Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Ala Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu 145 150 155 160 Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Leu Thr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn 195 200 205 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 117 <211> 237 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type feline IgG1a Fc, Protein A +, C1q + <400> 117 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 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Sequence <220> <223> Variant feline IgG2 Fc, Heterodimer chain 1, T(154)W <400> 119 Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ile Glu Ser Lys Thr Gly Glu Gly Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asn Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala Lys Thr Arg Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Trp Cys Leu Ile Lys Gly Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe 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<211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant feline IgG1b Fc, Heterodimer chain 1, T(154)W <400> 123 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Asp Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Trp Cys Leu Ile Glu Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp 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<210> 127 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant feline IgG1a Fc with modified hinge, K(16)P <400> 127 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Pro 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln 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Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 129 <211> 244 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type equine IgG2 Fc with hinge, Protein A , C1q <400> 129 Pro Pro Cys Val Leu Ser Ala Glu Gly Val Ile Pro Ile Pro Ser Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Gln Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly Gly 20 25 30 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile 35 40 45 Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser Asp Gln 50 55 60 Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu Val His 65 70 75 80 Ser Ala Ile Thr 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Pro Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly Gly 20 25 30 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile 35 40 45 Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser Asp Gln 50 55 60 Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu Val His 65 70 75 80 Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 85 90 95 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys 100 105 110 Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro Gln Pro Ile Ser 115 120 125 Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr 130 135 140 Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Lys Val Ser Val 145 150 155 160 Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ser Val Glu Trp 165 170 175 Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser Thr Thr Pro 180 185 190 Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 195 200 205 Leu Glu Thr Ser Arg Trp Gln Gln Val Glu Ser Phe Thr Cys Ala Val 210 215 220 Met His Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Lys Thr Asp Ile Ser Glu 225 230 235 240 Ser Leu Gly Lys <210> 131 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant equine IgG2 Fc with modified hinge, Protein A , C1q , C(3)S <400> 131 Pro Pro Ser Val Leu Ser Ala Glu Gly Val Ile Pro Ile Pro Ser Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Gln Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly Gly 20 25 30 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile 35 40 45 Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser Asp Gln 50 55 60 Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu Val His 65 70 75 80 Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 85 90 95 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys 100 105 110 Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro Gln Pro Ile Ser 115 120 125 Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr 130 135 140 Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Lys Val Ser Val 145 150 155 160 Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ser Val Glu Trp 165 170 175 Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser Thr Thr Pro 180 185 190 Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 195 200 205 Leu Glu Thr Ser Arg Trp Gln Gln Val Glu Ser Phe Thr Cys Ala Val 210 215 220 Met His Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Lys Thr Asp Ile Ser Glu 225 230 235 240 Ser Leu Gly Lys <210> 132 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant equine IgG2 Fc with modified hinge, Protein A , C1q , C(3)S, Q(20)P <400> 132 Pro Pro Ser Val Leu Ser Ala Glu Gly Val Ile Pro Ile Pro Ser Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Pro Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly Gly 20 25 30 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile 35 40 45 Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser Asp Gln 50 55 60 Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu Val His 65 70 75 80 Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 85 90 95 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys 100 105 110 Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro Gln Pro Ile Ser 115 120 125 Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr 130 135 140 Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Lys Val Ser Val 145 150 155 160 Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ser Val Glu Trp 165 170 175 Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser Thr Thr Pro 180 185 190 Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 195 200 205 Leu Glu Thr Ser Arg Trp Gln Gln Val Glu Ser Phe Thr Cys Ala Val 210 215 220 Met His Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Lys Thr Asp Ile Ser Glu 225 230 235 240 Ser Leu Gly Lys <210> 133 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant equine IgG2 Fc with hinge, Protein A +, C1q , A(45)T, F(233)Y <400> 133 Pro Pro Cys Val Leu Ser Ala Glu Gly Val Ile Pro Ile Pro Ser Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Gln Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly Gly 20 25 30 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 35 40 45 Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser Asp Gln 50 55 60 Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu Val His 65 70 75 80 Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 85 90 95 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys 100 105 110 Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro Gln Pro Ile Ser 115 120 125 Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr 130 135 140 Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Lys Val Ser Val 145 150 155 160 Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ser Val Glu Trp 165 170 175 Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser Thr Thr Pro 180 185 190 Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 195 200 205 Leu Glu Thr Ser Arg Trp Gln Gln Val Glu Ser Phe Thr Cys Ala Val 210 215 220 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Lys Thr Asp Ile Ser Glu 225 230 235 240 Ser Leu Gly Lys <210> 134 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant equine IgG2 Fc with modified hinge, Protein A +, C1q , Q(20)P, A(45)T, F(233)Y <400> 134 Pro Pro Cys Val Leu Ser Ala Glu Gly Val Ile Pro Ile Pro Ser Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Pro Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu Gly Gly 20 25 30 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 35 40 45 Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser Asp Gln 50 55 60 Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu Val His 65 70 75 80 Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 85 90 95 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys 100 105 110 Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro Gln Pro Ile Ser 115 120 125 Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln Val Tyr 130 135 140 Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Lys Val Ser Val 145 150 155 160 Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ser Val Glu Trp 165 170 175 Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys 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His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Asp Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Wild-type equine IgG2 hinge <400> 138 Pro Pro Cys Val Leu Ser Ala Glu Gly Val Ile Pro Ile Pro Ser Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro Gln Cys Pro Pro Tyr Thr His Ser Lys Phe Leu 20 25 30 <210> 139 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , M(5)P <400> 139 Pro Ala Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 140 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , P(39)R <400> 140 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 141 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , D(38)G <400> 141 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Gly Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 142 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , K(97)I <400> 142 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Ile Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 143 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , A(98)G <400> 143 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 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Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 145 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q , CD16 , D(38)G, K(93)R, K(97)I, A(98)G <400> 145 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Gly Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Arg Val Asn Asn 85 90 95 Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 146 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-B Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , M(5)P, P(39)R <400> 146 Pro Ala Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln 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1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Arg Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 148 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , L(5)P <400> 148 Pro Gly Cys Gly Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 149 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , P(39)R <400> 149 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Arg Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 150 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , D(38)G <400> 150 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Gly Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 151 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , K(97)I <400> 151 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 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Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 153 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q , CD16 +, K(93)R <400> 153 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Arg Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 154 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q +, CD16 , D(38)G, K(97)I, A(98)G <400> 154 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Gly Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 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90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 157 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant canine IgG-C Fc, Protein A +, C1q . CD16 , M(5)P, P(39)R, K(93)R <400> 157 Pro Gly Cys Gly Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Arg Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Arg Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 158 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG A Fc, N(68)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X = any amino acid except N <400> 158 Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Xaa Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 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Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 145 150 155 160 Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn 195 200 205 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 160 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG A Fc, T(70)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> X = any amino acid except T or S <400> 160 Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Asn Gly Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 145 150 155 160 Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn 195 200 205 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 161 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG B Fc, N(68)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X = any amino acid except N <400> 161 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Xaa Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 162 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG B Fc, G(69)P <400> 162 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Pro Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 163 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG B Fc, T(70)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> X = any amino acid except T or S <400> 163 Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Gly Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 164 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG C Fc, N(68)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X = any amino acid except N <400> 164 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Xaa Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 165 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG C Fc, G(69)P <400> 165 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Pro Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 166 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG C Fc, T(70)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> X = any amino acid except T or S <400> 166 Pro Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Ser Asn Gly Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Met Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 195 200 205 Tyr Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 167 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG D Fc, N(68)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X = any amino acid except N <400> 167 Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu 145 150 155 160 Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp 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Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu 145 150 155 160 Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn 195 200 205 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 169 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant canine IgG D Fc, T(70)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> X = any amino acid except T or S <400> 169 Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys 20 25 30 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Gln Gln Phe Asn Ser Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 85 90 95 Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 100 105 110 Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 115 120 125 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 130 135 140 Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu 145 150 155 160 Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn 195 200 205 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 170 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant feline IgG1a Fc, N(85)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> X = any amino acid except N <400> 170 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 171 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant feline IgG1a Fc, S(86)P <400> 171 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Pro Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 172 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant feline IgG1a Fc, T(87)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> X = any amino acid except T or S <400> 172 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Ser Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 173 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant feline IgG1b Fc, N(85)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> X = any amino acid except N <400> 173 Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile 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Pro Cys Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Pro Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Asp Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Glu Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser Arg Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His 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Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly 180 185 190 Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Ser Val Asp Arg Ser His Trp Gln 195 200 205 Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu His Ser 210 215 220 His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys 225 230 235 <210> 177 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant feline IgG2 Fc, S(86)P <400> 177 Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ile Glu Ser Lys Thr Gly Glu Gly Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp 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Sequence <220> <223> Aglycosyl variant feline IgG2 Fc, T(87)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> X = any amino acid except T or S <400> 178 Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ile Glu Ser Lys Thr Gly Glu Gly Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Val Pro Glu Ile Pro Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 20 25 30 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 35 40 45 Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asn Val Gln Ile Thr 50 55 60 Trp Phe Val Asp Asn Thr Glu Met His Thr Ala Lys Thr Arg Pro Arg 65 70 75 80 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile 85 90 95 Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 100 105 110 Ser Lys Ser Leu Pro Ser Ala Met Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Thr Gln Glu 130 135 140 Glu Leu Ser Glu Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe 145 150 155 160 His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Glu Asn Asn Tyr 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Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Ala Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn Leu Ser 20 25 30 Asp Gln Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn Thr Glu 35 40 45 Val His Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Xaa Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro Gln Pro 85 90 95 Ile Ser Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser Lys Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Ser Val 130 135 140 Glu Trp Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Ser Leu Glu Thr Ser Arg Trp Gln Gln Val Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Lys Thr Asp Ile 195 200 205 Ser Glu Ser Leu Gly 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MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> X = any amino acid except N <400> 188 Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly 20 25 30 His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Phe Xaa Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Lys Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Arg Thr Ile Ser Ala Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Ala Pro His Arg Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Ile 130 135 140 Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys 180 185 190 Ala Val Met His Glu Ala 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Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Gly 20 25 30 His Asp Asp Pro Asp Val Gln Phe Thr Trp Phe Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Xaa 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Ser Lys Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Leu Arg Val Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Asn Thr Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Glu Ile Asp Val 130 135 140 Glu Trp Gln Ser Asn Glu His Pro Glu Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Ser Val Glu Thr Ser Arg Trp Lys Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Gly Val Met His Glu Ala Val Glu Asn His Tyr Thr Gln Lys Asn Val 195 200 205 Ser His Ser Pro Gly Lys 210 <210> 194 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant equine IgG6 Fc, N(62)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> X = any amino acid except N <400> 194 Gly Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 20 25 30 Gln Glu Asn Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Ala His Thr Ala Thr Thr Lys Ala Lys Glu Lys Gln Asp Xaa Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Arg Thr Ile Thr Lys Ala Lys Gly Glu Leu Gln Asp Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Ile Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Val Thr Lys Asn Thr Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn Val 130 135 140 Glu Trp Gln Ser Asn Glu Glu Pro Glu Pro Glu Val Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asp Arg Trp Glu Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Val Val Met His Glu Ala Ile Arg His Thr Tyr Arg Gln Lys Ser Ile 195 200 205 Thr Asn Phe Pro Gly Lys 210 <210> 195 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant equine IgG6 Fc, S(63)P <400> 195 Gly Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 20 25 30 Gln Glu Asn Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Ala His Thr Ala Thr Thr Lys Ala Lys Glu Lys Gln Asp Asn Pro Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Arg Thr Ile Thr Lys Ala Lys Gly Glu Leu Gln Asp Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Ile Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Val Thr Lys Asn Thr Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn Val 130 135 140 Glu Trp Gln Ser Asn Glu Glu Pro Glu Pro Glu Val Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asp Arg Trp Glu Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Val Val Met His Glu Ala Ile Arg His Thr Tyr Arg Gln Lys Ser Ile 195 200 205 Thr Asn Phe Pro Gly Lys 210 <210> 196 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant equine IgG6 Fc, T(64)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> X = any amino acid except T or S <400> 196 Gly Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 20 25 30 Gln Glu Asn Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Ala His Thr Ala Thr Thr Lys Ala Lys Glu Lys Gln Asp Asn Ser Xaa 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Glu Arg Thr Ile Thr Lys Ala Lys Gly Glu Leu Gln Asp Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Ile Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Val Thr Lys Asn Thr Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn Val 130 135 140 Glu Trp Gln Ser Asn Glu Glu Pro Glu Pro Glu Val Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asp Arg Trp Glu Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys 180 185 190 Val Val Met His Glu Ala Ile Arg His Thr Tyr Arg Gln Lys Ser Ile 195 200 205 Thr Asn Phe Pro Gly Lys 210 <210> 197 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant equine IgG7 Fc, N(62)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> X = any amino acid except N <400> 197 Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly 20 25 30 His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Asn Xaa Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Ile Leu Ala Ile Gln His Lys Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Gln Lys Thr Ile Ser Lys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Ile 130 135 140 Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys 180 185 190 Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Glu Lys Ser Val 195 200 205 Ser Lys Ser Pro Gly Lys 210 <210> 198 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant equine IgG7 Fc, S(63)P <400> 198 Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly 20 25 30 His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Asn Asn Pro Thr 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Ile Leu Ala Ile Gln His Lys Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Gln Lys Thr Ile Ser Lys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Ile 130 135 140 Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys 180 185 190 Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Glu Lys Ser Val 195 200 205 Ser Lys Ser Pro Gly Lys 210 <210> 199 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aglycosyl variant equine IgG7 Fc, T(64)X <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> X = any amino acid except T or S <400> 199 Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly 20 25 30 His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 35 40 45 Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Asn Asn Ser Xaa 50 55 60 Tyr Arg Val Val Ser Ile Leu Ala Ile Gln His Lys Asp Trp Leu Ser 65 70 75 80 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Ala Pro 85 90 95 Val Gln Lys Thr Ile Ser Lys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 100 105 110 Val Tyr Val Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val 115 120 125 Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Ile 130 135 140 Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys 180 185 190 Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Glu Lys Ser Val 195 200 205 Ser Lys Ser Pro Gly Lys 210

Claims (127)

  1. 반려 동물 종(companion animal species)의 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드.
  2. 반려 동물 종의 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q 및/또는 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 C1q 및/또는 CD16에 생물층 간섭법(biolayer interferometry)으로 측정하여, 5 x 10-6 M 초과, 1 x 10-5 M 초과, 5 x 10-5 M 초과, 1 x 10-4 M 초과, 5 x 10-4 M 초과, 또는 1 x 10-3 M 초과의 해리 상수(dissociation constant)(Kd)로 결합하는 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 단백질 A에, 생물층 간섭법으로 측정하여, 5 x 10-6 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 5 x 10-7 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 5 x 10-8 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 1 x 10-10 M 미만, 5 x 10-11 M 미만, 1 x 10-11 M 미만, 5 x 10-12 M 미만, 또는 1 x 10-12 M 미만의 해리 상수(Kd)로 결합하는 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 반려 동물 종이 개(canine), 고양이(feline), 또는 말(equine)인 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드가
    a) 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 또는 IgG-D Fc;
    b) 말 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, IgG5 Fc, IgG6 Fc, 또는 IgG7 Fc; 또는
    c) 고양이 IgG1a Fc, IgG1b Fc, 또는 IgG2 Fc인 폴리펩타이드.
  8. 야생형 고양이 또는 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 힌지 영역(hinge region)에 대해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 환원 및/또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석으로 측정하여, 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 증가된 재조합체 생산 및/또는 증가된 힌지 이황화물 형성(disulfide formation)을 갖는 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다);
    b) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다); 및/또는
    c) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 20번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다)을 포함하는 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다);
    b) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다); 및/또는
    c) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 20번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다)을 포함하는 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 :
    a) 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 16, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 16번 위치에 상응하는 위치에서 또는 16번 위치에서 프롤린을 포함한다);
    b) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 3번 위치에 상응하는 위치 또는 3번 위치에서 세린을 포함한다); 및/또는
    c) 야생형 말 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환(여기서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 129의 20번 위치에 상응하는 위치에서 또는 20번 위치에서 프롤린을 포함한다)을 포함하는 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 상이한 동형의 IgG Fc 폴리펩타이드로부터의 힌지 영역(hinge region) 또는 힌지 영역의 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 고양이 IgG-1a Fc 폴리펩타이드, 야생형 고양이 IgG-1b Fc 폴리펩타이드, 또는 야생형 말 IgG1 Fc 폴리펩타이드로부터의 힌지 영역 또는 힌지 영역의 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 19, 서열 번호: 125 또는 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135를 포함하는 폴리펩타이드.
  15. 서열 번호: 19, 서열 번호: 125 또는 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  16. 야생형 고양이 IgG2 Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 IgG2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환이 시스테인이고, 여기서 변이체 IgG2 Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG2 Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 쇄-간(inter-chain) 이황화물 결합을 형성할 수 있는 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 시스테인이고, 여기서 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드는 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 쇄-간 이황화물 결합을 형성할 수 있는 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 16의 8번 위치, 9번 위치, 10번 위치, 11번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치, 15번 위치, 또는 16번 위치에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 16의 14번 위치에 상응하는 위치에서 시스테인을 포함하는 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 16의 14번 위치에서 시스테인을 포함하는 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 75, 서열 번호: 76, 서열 번호: 77, 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 82, 서열 번호: 83, 서열 번호: 84, 서열 번호: 100, 서열 번호: 107, 서열 번호: 108, 서열 번호: 109, 서열 번호: 110, 서열 번호: 111, 서열 번호: 112, 서열 번호: 113, 서열 번호: 114, 서열 번호: 115, 서열 번호: 116, 서열 번호: 117, 서열 번호: 118, 서열 번호: 119, 서열 번호: 120, 서열 번호: 121, 서열 번호:122, 서열 번호: 123, 서열 번호: 124, 서열 번호: 125, 서열 번호: 126, 서열 번호: 127, 서열 번호: 128, 서열 번호: 129, 서열 번호: 130, 서열 번호: 131, 서열 번호: 132, 서열 번호: 133, 서열 번호: 134, 서열 번호: 135, 서열 번호: 136, 서열 번호: 137, 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 서열 번호: 147, 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 153, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 17을 포함하는 폴리펩타이드.
  23. 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
    d) 서열 번호: 64의 15번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
    e) 서열 번호: 67의 199번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 및/또는
    f) 서열 번호: 68의 199번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 200번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 201번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 아미노산 치환;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 아미노산 치환;
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 아미노산 치환;
    d) 서열 번호: 64의 15번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에서 아미노산 치환;
    e) 서열 번호: 67의 199번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에서 아미노산 치환; 및/또는
    f) 서열 번호: 68의 199번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 200번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 68의 201번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치의 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신;
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘;
    d) 서열 번호: 64의 15번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 발린;
    e) 서열 번호: 67의 199번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘; 및/또는
    f) 서열 번호: 68의 199번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 68의 200번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘, 서열 번호: 68의 201번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함하는 폴리펩타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 히스티딘;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 이소루이신;
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 히스티딘;
    d) 서열 번호: 64의 15번 위치에서 트레오닌 또는 발린, 및/또는 서열 번호: 64의 203번 위치에서 타이로신 또는 발린;
    e) 서열 번호: 67의 199번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 67의 200번 위치에서 히스티딘; 및/또는
    f) 서열 번호: 68의 199번 위치에서 루이신, 서열 번호: 68의 200번 위치에서 히스티딘, 서열 번호: 68의 201번 위치에서 아스파라긴, 및/또는 서열 번호: 68의 202번 위치에서 히스티딘을 포함하는 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 다음의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드:
    a) 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 또는 서열 번호: 84; 또는
    b) 서열 번호: 19, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 75, 또는 서열 번호: 76.
  29. 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 84, 서열 번호: 19, 서열 번호: 71, 서열 번호: 72, 서열 번호: 75, 또는 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
    b) 서열 번호: 63의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 65의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 66의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
    c) 서열 번호: 80의 198번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아미노산 치환;
    b) 서열 번호: 63의 87번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 65의 87번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 66의 87번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에서 아미노산 치환; 또는
    c) 서열 번호: 80의 198번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌;
    b) 서열 번호: 63의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 65의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린 치환, 서열 번호: 66의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에 상응하는 위치에서 세린; 또는
    c) 서열 번호: 80의 198번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함하는 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아르기닌;
    b) 서열 번호: 63의 87번 위치에서 세린, 서열 번호: 65의 87번 위치에서 세린, 서열 번호: 66의 87번 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 69의 87번 위치에서 세린; 또는
    c) 서열 번호: 80의 198번 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81의 198번 위치에서 알라닌을 포함하는 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 또는 서열 번호: 84; 또는
    b) 서열 번호: 70, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 또는 서열 번호: 77; 또는
    c) 서열 번호: 82 또는 서열 번호: 83의 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  35. 서열 번호: 78, 서열 번호: 79, 서열 번호: 84, 서열 번호: 70, 서열 번호: 73, 서열 번호: 74, 서열 번호: 77, 서열 번호: 82, 또는 서열 번호: 83의 아미노 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 아미노산 치환; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 글리신; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 글리신을 포함하는 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 또는 서열 번호: 147; 또는
    b) 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157을 포함하는 폴리펩타이드.
  41. 서열 번호: 139, 서열 번호: 140, 서열 번호: 141, 서열 번호: 142, 서열 번호: 143, 서열 번호: 144, 서열 번호: 145, 서열 번호: 146, 서열 번호: 147, 서열 번호: 148, 서열 번호: 149, 서열 번호: 150, 서열 번호: 151, 서열 번호: 152, 서열 번호: 154, 서열 번호: 155, 서열 번호: 156, 또는 서열 번호: 157의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  42. 다음을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드:
    a) 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 2의 137번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판; 또는
    b) 서열 번호: 16의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 138번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 2의 137번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 3의 137번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에서 타이로신 또는 트립토판; 또는
    b) 서열 번호: 16의 154번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 154번 위치에서 타이로신 또는 트립토판, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함하는 폴리펩타이드.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 서열 번호: 115, 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  45. 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 서열 번호: 115, 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  48. 다음을 포함하는 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드:
    a) 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 2의 의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 16의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린;
    b) 서열 번호: 1의 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 2의 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 3의 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 16의 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌; 및/또는
    c) 서열 번호: 1의 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 2의 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 16의 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 138번 위치에서 세린, 서열 번호: 2의 137번 위치에서 세린, 서열 번호: 3의 137번 위치에서 세린, 서열 번호: 4의 138번 위치에서 세린, 서열 번호: 16의 154번 위치에서 세린, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 154번 위치에서 세린, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에서 세린;
    b) 서열 번호: 1의 140번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 2의 139번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 3의 139번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 140번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 16의 156번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 156번 위치에서 알라닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 156번 위치에서 알라닌; 및/또는;
    c) 서열 번호: 1의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 2의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 181번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 16의 197번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 80 또는 서열 번호: 117의 197번 위치에서 트레오닌, 또는 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 118의 197번 위치에서 트레오닌를 포함하는 폴리펩타이드.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 서열 번호: 116, 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  51. 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 서열 번호: 116, 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 124의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 글리코실화되어 있는 폴리펩타이드.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 폴리펩타이드가 아글리코실화(aglycosylating)되어 있는 폴리펩타이드.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  55. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 글루카곤 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  56. 제46항에 따른 연속된 폴리펩타이드 및 제54항에 따른 연속된 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질(heterodimeric protein).
  57. 제47항에 따른 연속된 폴리펩타이드 및 제55항에 따른 연속된 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질.
  58. 제46항, 제47항, 및 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1 폴리펩타이드가 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 임의로 포함하는, 야생형 GLP1 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질.
  59. 제46항, 제47항, 및 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1 폴리펩타이드가 변이체 GLP1 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질.
  60. 제46항, 제47항, 및 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1 폴리펩타이드가 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 98, 또는 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질.
  61. 제46항, 제47항, 및 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 글루카곤 폴리펩타이드가 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 임의로 포함하는, 야생형 글루카곤 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질.
  62. 제46항, 제47항, 및 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 글루카곤 폴리펩타이드가 변이체 글루카곤 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드 또는 이종이량체성 단백질.
  63. i) 제1의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드; 또는
    ii) 제1의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체성 단백질로서, 여기서:
    a) 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치, 서열 번호: 2의 137번 위치, 서열 번호: 3의 137번 위치, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에서 아미노산 치환을 포함하고/하거나;
    b) 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 1의 138번 위치, 140번 위치, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치, 서열 번호: 2의 137번 위치, 139번 위치, 및/또는 180번 위치, 서열 번호: 3의 137번 위치, 139번 위치, 및/또는 180번 위치, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치, 140번 위치, 및/또는 181번 위치에서 아미노산 치환을 포함하고/하거나;
    c) 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고/하거나;
    d) 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드는 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치, 156번 위치, 및/또는 197번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 이종이량체성 단백질.
  64. 제63항에 있어서, 제1의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드가 동일한 IgG 아형이고/이거나 제1의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드가 동일한 IgG 아형으로부터 유래되는 이종이량체성 단백질.
  65. 제63항에 있어서, 제1의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드가 상이한 IgG 아형으로부터 유래되고/되거나 제1의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드 및 제2의 야생형 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드가 동일한 IgG 아형으로부터 유래되는 이종이량체성 단백질.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 138번 위치, 서열 번호: 2의 137번 위치, 서열 번호: 3의 137번 위치, 또는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 타이로신 또는 트립토판을 포함하고/하거나;
    b) 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 트립토판을 포함하는 이종이량체성 단백질.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 1의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 2의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 137번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 139번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 180번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 및/또는 서열 번호: 4의 138번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 140번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 181번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하고/하거나;
    b) 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 6, 서열 번호: 80, 서열 번호: 81, 서열 번호: 117, 또는 서열 번호: 118의 154번 위치에 상응하는 위치에서 세린, 156번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 197번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌을 포함하는 이종이량체성 단백질.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 8, 서열 번호: 10, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 서열 번호: 109, 서열 번호: 111, 서열 번호: 113, 또는 서열 번호: 115의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    b) 제1의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 119, 서열 번호: 121, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는 이종이량체성 단백질.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제2의 변이체 개 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 9, 서열 번호: 11, 서열 번호: 13, 서열 번호: 15, 서열 번호: 110, 서열 번호: 112, 서열 번호: 114, 또는 서열 번호: 116의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    b) 제2의 변이체 고양이 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 120, 서열 번호: 122, 또는 서열 번호: 123의 아미노산 서열을 포함하는 이종이량체성 단백질.
  70. 제42항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형을 포함하고 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 단백질 A에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  71. 제42항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  72. 제42항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 1의 207번 위치에서 아미노산 치환;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 아미노산 치환; 또는
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  73. 제42항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신; 또는
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에 상응하는 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에 상응하는 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에 상응하는 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  74. 제42항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 1의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 1의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 1의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 1의 80번 위치에서 글리신, 서열 번호: 1의 205번 위치에서 알라닌, 및/또는 서열 번호: 1의 207번 위치에서 히스티딘;
    b) 서열 번호: 3의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 3의 23번 위치에서 루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 24번 위치에서 이소루이신; 또는
    c) 서열 번호: 4의 21번 위치에서 트레오닌, 서열 번호: 4의 23번 위치에서 루이신, 서열 번호: 4의 25번 위치에서 알라닌, 서열 번호: 4의 80번 위치에서 글리신, 및/또는 서열 번호: 4의 207번 위치에서 히스티딘을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  75. 제42항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형을 포함하고 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 CD16에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  76. 제42항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  77. 제42항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 아미노산 치환; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아미노산 치환, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  78. 제42항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에 상응하는 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에 상응하는 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에 상응하는 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에 상응하는 위치에서 글리신을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  79. 제42항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 2의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 2의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 2의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 2의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 2의 98번 위치에서 글리신; 또는
    b) 서열 번호: 3의 5번 위치에서 프롤린, 서열 번호: 3의 38번 위치에서 글리신, 서열 번호: 3의 39번 위치에서 아르기닌, 서열 번호: 3의 97번 위치에서 이소루이신, 및/또는 서열 번호: 3의 98번 위치에서 글리신을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  80. 제42항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 적어도 하나의 추가의 아미노산 변형을 포함하고 야생형 개 IgG Fc 폴리펩타이드에 비하여 C1q에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  81. 제42항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  82. 제42항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아미노산 치환, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  83. 제42항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 2의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  84. 제42항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 제1의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드, 및/또는 제2의 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드가 서열 번호: 2의 93번 위치에서 아르기닌, 또는 서열 번호: 3의 93번 위치에서 아르기닌을 포함하는 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 항체, 항체 융합체, 또는 융합 폴리펩타이드인 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질.
  86. a) 제1의 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드(GLP1A);
    b) 제1의 링커 (L1);
    c) 반려 동물 종의 Fc 폴리펩타이드(Fc);
    d) 임의로, 제2의 링커(L2); 및
    e) 임의로, 제2의 GLP1 폴리펩타이드(GLP1B)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  87. 제65항에 있어서,
    화학식 (I): GLP1A-L1-Fc; 또는
    화학식 (II): Fc-L1-GLP1A를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  88. 제65항에 있어서, 화학식 (III): GLP1A-L1-Fc-L2-GLP1B를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1B가, 존재하는 경우, GLP1A와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  90. a) 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP1) 폴리펩타이드;
    b) 제1의 링커(L1);
    c) Fc 폴리펩타이드(Fc);
    d) 제2의 링커(L2); 및
    e) 글루카곤 폴리펩타이드(Gluc)를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  91. 제90항에 있어서,
    화학식 (IV): GLP1-L1-Fc-L2-Gluc; 또는
    화학식 (V): Gluc-L1-Fc-L2-GLP1을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1A, GLP1, 및/또는 GLP1B가, 존재하는 경우, 야생형 GLP1 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  93. 제86항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1A, GLP1, 및/또는 GLP1B가, 존재하는 경우, 변이체 GLP1 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  94. 제86항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, GLP1A, GLP1, 및/또는 GLP1B가, 존재하는 경우, 서열 번호: 85, 서열 번호: 86, 서열 번호: 87, 서열 번호: 98, 또는 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  95. 제86항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 글루카곤 폴리펩타이드가 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 임의로 포함하는, 야생형 글루카곤 폴리펩타이드를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  96. 제86항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 글루카곤 폴리펩타이드가 변이체 글루카곤 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드.
  97. 제86항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가 사람 IgG Fc인 연속된 폴리펩타이드.
  98. 제86항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가 사람 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, 또는 IgG4 Fc인 연속된 폴리펩타이드.
  99. 제86항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가 반려 동물 종의 Fc인 연속된 폴리펩타이드.
  100. 제86항 내지 제97항 또는 제99항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가:
    a) 개 IgG-A Fc, IgG-B Fc, IgG-C Fc, 또는 IgG-D Fc;
    b) 말 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc, IgG4 Fc, IgG5 Fc, IgG6 Fc, 또는 IgG7 Fc; 또는
    c) 고양이 IgG1a Fc, IgG1b Fc, 또는 IgG2 Fc를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  101. 제86항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가 야생형 IgG Fc 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드.
  102. 제86항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가 변이체 IgG Fc 폴리펩타이드인 연속된 폴리펩타이드.
  103. 제86항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 폴리펩타이드가 제1항 내지 제84항 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 연속된 폴리펩타이드, 또는 이종이량체성 단백질을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  104. 제85항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 연속된 폴리펩타이드가 야생형 GLP1 폴리펩타이드보다 더 긴 혈청 반감기를 갖는 연속된 폴리펩타이드.
  105. 제86항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2가, 존재하는 경우, 각각 독립적으로 가요성 링커(flexible linker)인 연속된 폴리펩타이드.
  106. 제86항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, L1 및 L2의 아미노산 서열이, 존재하는 경우, 각각 독립적으로 100%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%의 세린 및/또는 글리신 아미노산 잔기를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  107. 제86항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 연속된 폴리펩타이드가 이의 C-말단에서 연장을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  108. 제86항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 연속된 폴리펩타이드가 이의 C-말단에서 글리신 잔기, 2개의 글리신 잔기, 3개의 글리신 잔기, 4개의 글리신 잔기, 5개의 글리신 잔기, 6개의 글리신 잔기, 7개의 글리신 잔기, 8개의 글리신 잔기, 또는 8개 이상의 글리신 잔기를 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  109. 제86항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 연속된 폴리펩타이드가 이의 C-말단에서 서열 번호: 88, 서열 번호: 89, 서열 번호: 90, 서열 번호: 91, 서열 번호: 92, 서열 번호: 93, 서열 번호: 94, 또는 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  110. 제86항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 연속된 폴리펩타이드가:
    a) 서열 번호: 23; 서열 번호: 24; 서열 번호: 25; 서열 번호: 26; 서열 번호: 27; 서열 번호: 28; 서열 번호: 29; 서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42; 서열 번호: 43; 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97, 서열 번호: 103, 서열 번호: 104, 서열 번호: 105, 또는 서열 번호: 106의 아미노산 서열; 또는
    b) 서열 번호: 52; 서열 번호: 53; 서열 번호: 54; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 또는 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 연속된 폴리펩타이드.
  111. 서열 번호: 23; 서열 번호: 24; 서열 번호: 25; 서열 번호: 26; 서열 번호: 27; 서열 번호: 28; 서열 번호: 29; 서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42; 서열 번호: 43; 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47, 서열 번호: 96, 서열 번호: 97, 서열 번호: 52; 서열 번호: 53; 서열 번호: 54; 서열 번호: 55; 서열 번호: 56; 서열 번호: 57; 서열 번호: 58; 서열 번호: 59; 서열 번호: 103; 서열 번호: 104, 서열 번호: 105, 또는 서열 번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 치환이 아미노산 유도체를 지닌 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산.
  114. 제113항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  115. 제114항에 따른 숙주 세포를 배양하고 폴리펩타이드를 단리함을 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  116. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  117. 세포내에서 cAMP의 생산을 증가시키는 방법으로서, 이러한 방법이 세포를 제1항 내지 제112항 또는 제116항 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물에 GLP1R에 대한 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 또는 연속된 폴리펩타이드의 결합을 허용하는 조건 하에 노출시킴을 포함하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 세포가 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물에 생체외에서(ex vivo) 노출되는 방법.
  119. 제117항에 있어서, 세포가 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물에 생체내에서(in vivo) 노출되는 방법.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 세포가 사람 세포, 개 세포, 고양이 세포, 또는 말 세포인 방법.
  121. 제1항 내지 제112항 또는 116항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 비경구적으로 투여함을 포함하여, 대상체에게 폴리펩타이드를 전달하는 방법.
  122. 제1항 내지 제112항 또는 제116항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 근육내 경로, 복강내 경로, 뇌척수내 경로, 피하 경로, 동맥내 경로, 윤활액내 경로, 척수강내 경로, 또는 흡입 경로에 의해 투여함을 포함하여, 폴리펩타이드를 대상체로 전달하는 방법.
  123. 당뇨병 또는 비만을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 이러한 방법이 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제112항 또는 제116항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 이종이량체성 단백질, 연속된 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는 방법.
  124. 제123항 항에 있어서, 인슐린, DPP4 억제제, SGLT2 억제제, 비구아니드 설포닐우레아스 메글리티니드 유도체, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온(TZD), 아밀리노모사체(amilinomimetic), 담즙산 격리제(sequestrant), 도파민 효능제를 투여함을 포함하는 방법.
  125. 제121항 내지 제124항 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 사람 대상체인 방법.
  126. 제121항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 반려 동물 종인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 반려 동물이 개, 말, 또는 고양이인 방법.
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