KR20200057766A - 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 프로모터 및 인핸서 조합을 포함하는 벡터 - Google Patents

페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 프로모터 및 인핸서 조합을 포함하는 벡터 Download PDF

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KR20200057766A
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타일러 라후젠
찰스 데이비드 파우자
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아메리칸 진 테크놀로지스 인터내셔널 인코포레이티드
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Abstract

렌티바이러스 입자를 발현시키기 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시되어 있다. 렌티바이러스 벡터 시스템은 치료적 벡터를 포함한다. 렌티바이러스 벡터 시스템은 페닐케톤뇨증 (PKU) 에 걸린 대상체의 세포에서 PAH 발현을 상향조절하기 위한 렌티바이러스 입자를 생산한다.

Description

페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 프로모터 및 인핸서 조합을 포함하는 벡터
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017 년 10 월 2 일에 출원된, 표제 "페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 프로모터 및 인핸서 조합을 포함하는 벡터" 의, 미국 가 특허 출원 No. 62/566,979 에 대해 우선권을 주장하며, 상기 출원의 공개가 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 공개의 양태는 페닐케톤뇨증 (phenylketonuria) (PKU) 을 치료하기 위한 유전 의약에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 공개의 양태는 발현이 다양한 프로모터 및 인핸서 조합에 의해 제어되는, PAH-함유 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 렌티바이러스 벡터에 관한 것이다.
페닐케톤뇨증 (PKU) 은 치료받지 않은 채로 있다면 지적 장애, 발작, 행동 문제, 및 영향을 받는 어린이에서 손상된 성장 및 발달을 초래할 수 있는 장애의 이종 군을 나타낸다. 고페닐알라닌 혈증이 지적 장애를 초래하는 메커니즘은 고용량 페닐알라닌의 놀라운 독성을 반영하며 신경계 조직의 저수초화 또는 탈수초화를 포함한다. PKU는 북미에서 12,000 건 중 1 건의 평균 보고 발생률을 가지며, 남성과 여성에게 동일하게 영향을 준다. 이 장애는 유럽인 또는 아메리카 원주민 조상에서 가장 흔하며 동부 지중해 지역에서 훨씬 높은 수준에 이른다.
PKU 환자의 신경학적 변화는 생후 1 개월 이내에 입증되었으며, 성인 PKU 환자의 자기 공명 영상 (MRI) 은 뇌에서의 백질 병변을 보여주었다. 이러한 병변의 크기와 수는 혈액 페닐알라닌 농도와 직접적으로 관련된다. 대조군 대상체과 비교하여 PKU 를 갖는 청소년 및 성인의 인지 프로파일은 현저하게 감소된 IQ, 처리 속도, 운동 제어 및 억제 능력, 및 주의력 시험에서의 수행 감소를 포함할 수 있다.
PKU 의 대부분은 간 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) 의 결핍으로 인해 야기된다. PAH 는 분자 산소 및 촉매량의 테트라히드로바이오프테린 (BH4), 그의 비단백질 보조인자의 존재 하에 페닐알라닌 (Phe) 의 티로신 (Tyr) 으로의 히드록실화를 촉매화하는 다량체성 간 효소이다. PAH 의 충분한 발현의 부재 하에, 혈액 내 페닐알라닌 수치가 증가하여 PKU 환자에서 고페닐알라닌혈증 및 유해한 부작용을 일으킨다. PAH 활성의 감소 또는 부재는 티로신, 및 멜라닌, l-티록신 및 카테콜아민 신경전달물질 (도파민을 포함) 을 포함하는 그의 다운스트림 생성물의 결핍을 유발할 수 있다.
PKU 는 PAH 에서의 돌연변이 및/또는 PAH 보조인자 (즉, BH4) 의 합성 또는 재생 결함에 의해 유발될 수 있다. 특히, 몇몇 PAH 돌연변이는 소포체에서의 단백질 폴딩에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 효소 촉매 활성을 약화시키거나 크게 철폐시키는 단백질 구조에서의 미스센스 돌연변이 (63%) 및 작은 결실 (13%) 로 인한 가속화된 분해 및/또는 응집을 초래한다.
일반적으로, 혈장 Phe 수준, Phe 에 대한 식이 내성 및 치료요법에 대한 잠재적 반응성을 기반으로 하여 PKU 를 분류하기 위해 3 개의 주요 표현형 군이 사용된다. 이들 군은 고전적 PKU (Phe > 1200 μM), 비정형 또는 경증 PKU (Phe 가 600 - 1200 μM 임) 및 영구적인 경증 고페닐알라닌혈증 (HPA, Phe 120 - 600 μM) 을 포함한다.
PKU 의 검출은 보편적 신생아 스크리닝 (NBS) 에 의존한다. 힐 스틱 (heel stick) 으로부터 채취한 혈액 1 점적을 미국의 모든 50 개 주에서 필수인 스크린에서 페닐알라닌 수치에 대해 검사한다.
현재, Phe 및 BH4 보충의 평생 식이 제한은 PKU 에 대해 유일하게 이용가능한 두 가지 치료 옵션이며, 영향받은 영아에서 최적의 임상 결과를 보장하기 위해 조기 치료 개입이 중요하다. 그러나, 고가의 약물 치료와 특수 저-단백 식품은, 특히 이들 제품이 민감 의료 보험에 의해 완전히 커버되지 않는 경우, 영양결핍, 심리사회적 또는 신경인지적 합병증으로 이어질 수 있는 환자에 대한 큰 부담을 부과한다. 또한, BH4 치료요법은 BH4 생합성에서의 결함과 관련된 바에 따라 경증 고페닐알라닌혈증의 치료에 주로 효과적인 반면, 경증 또는 고전적 PKU 를 갖는 환자의 오직 20-30% 만이 반응성이다. 따라서, 과도한 Phe-제한 식단에 대한 대안으로서 PKU 를 위한 새로운 치료 방식이 절실히 필요하다. 따라서, 페닐케톤뇨증의 치료를 위한 대안적 방법을 개발하는 것이 바람직할 것이다.
유전 의약은 PKU 를 효과적으로 치료하는 잠재성을 갖는다. 유전 의약은 질환 요법 또는 예방의 목적을 위해 유전적 구축물의 전달 및 발현을 수반할 수 있따. 유전적 구축물의 발현은 다양한 프로모터, 인핸서, 및/또는 그의 조합에 의해 조정될 수 있다.
본 공개의 양태에서, 바이러스 벡터는 치료적 카고 부분을 포함하며, 치료적 카고 부분은 PAH 서열 또는 그의 변이체, 프로모터, 및 간-특이적 인핸서를 포함하며, PAH 서열 또는 그의 변이체는 프로모터 및 간-특이적 인핸서 둘 모두에 의해 작동적으로 제어된다.
실시형태에서, 간-특이적 인핸서는 프로트롬빈 인핸서를 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 간-특이적 프로모터이다. 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 치료적 카고 부분은 베타 글로빈 인트론을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리는 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 배치되어 있다. 실시형태에서, 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리는 프로트롬빈 인핸서의 다운스트림에 배치되어 있다.
실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 절두되어 있다. 실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체의 절두된 부분은 PAH 서열 또는 그의 변이체의 3' 미번역 영역 (UTR) 이다.
실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 하기 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 하기 서열을 포함한다: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 4.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서는 하기 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다:
Figure pct00004
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서의 서열은 SEQ ID NO: 5 를 포함한다.
실시형태에서, hAAT 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 6 을 포함한다. 실시형태에서, 베타 글로빈 인트론의 서열은 SEQ ID NOs: 7 또는 8 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 간세포 핵 인자 결합 자리의 서열은 SEQ ID NOs: 9-12 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태에서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 예정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 전장 UTR 를 함유하는 상보적 mRNA 서열을 표적화한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 예정된 상보적 mRNA 서열은 PAH mRNA 서열이다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 내인성 PAH 의 생산을 저해한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 shRNA 를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 제 1 프로모터의 제어 하에 있고, PAH 서열 또는 그의 변이체는 제 2 프로모터의 제어 하에 있다. 실시형태에서, 제 1 프로모터는 H1 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 제 2 프로모터는 간-특이적 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 하기 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다:
Figure pct00005
실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 SEQ ID NO: 13; 또는 SEQ ID NO: 14 를 포함한다.
실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.
본 공개의 양태에서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시키기 위해 최적화된 외피 단백질, 및 본 공개의 임의의 실시형태에 따른 바이러스 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 표적 세포는 간 세포, 근육 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 신경내분비 세포, 내분비 세포, 림프구, 골수 세포, 고형 기관 내에 존재하는 세포, 또는 조혈 계통의 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 전구체 조혈 줄기 세포이다.
본 공개의 양태에서, 대상체에서 PKU 을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에서 기재되는 렌티바이러스 입자를 투여하는 것을 포함한다. 본 공개의 양태에서, 대상체에서 PKU 을 예방하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에서 기재되는 렌티바이러스 입자를 투여하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 방법은 대상체에서 PKU 표현형과 상관관계가 있는 PKU 유전자형을 진단하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 대상체는 자궁 내에 (in utero) 있다. 실시형태에서, 진단은 대상체의 태아기 스크리닝 동안 이루어진다. 실시형태에서, 진단은 시험관 내에서 (in vitro) 이루어진다. 실시형태에서, 치료 유효량의 렌티바이러스 입자는 복수의 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다. 실시형태에서, 치료 유효량의 렌티바이러스 입자는 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다.
도 1 은 원형화된 형태의 예시적 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 2 는 원형화된 형태의 예시적 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 3 은 프로트롬빈 인핸서의 변이 및 PAH 의 발현을 조절하기 위한 hAAT 프로모터를 함유하는 여덟 가지 예시적 렌티바이러스 벡터의 선형 맵을 도시한다.
도 4A 및 4B 는 (도 4A) Hepa1-6 및 (도 4B) 293T 세포에서 3' UTR 의 존재 또는 부재 하에 상이한 인핸서 요소에 의한 PAH 의 수준을 비교하는 면역블롯 데이타를 도시한다.
도 5A-5C 는 Hepa1-6 세포에서 (도 5A) 토끼 베타 글로빈 인트론, (도 5B) 코돈-최적화된 PAH 서열, 및 (도 5C) 업스트림 또는 다운스트림에 HNF1 또는 HNF1/4 결합 자리가 있는 프로트롬빈 인핸서의 존재 또는 부재 하에 PAH 의 수준을 비교하는 면역블롯 데이타를 도시한다.
도 6 은 프로트롬빈 인핸서에서의 변이를 통해 PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 Hepa1-6 세포에서의 PAH RNA 발현을 도시한다.
도 7 은 Hepa1-6 세포에서 항-알파 1 트립신 (hAAT) 또는 티록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터에 의한 PAH 발현의 수준을 비교하는 면역블롯 데이타를 도시한다.
도 8A 및 8B 는 Hepa1-6 세포 (도 8A) 또는 Hep3B 세포 (도 8B) 에서 토끼 또는 인간 베타 글로빈 인트론의 존재 또는 부재 하에 PAH 의 수준을 비교하는 면역블롯 데이타를 도시한다.
도 9 는 PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터에 의한 인간 일차 간세포에서 PAH 발현의 면역블롯 데이타를 도시한다.
도 10A-10C 는 PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 Hepa1-6 세포의 (도 10A 및 10C) 세포 배지 또는 (도 10B) 용해물의 페닐알라닌 수준의 검출 및 세피아프테린, BH4 보조인자 전구체에 의한 처리에 의한 PAH 활성을 도시한다.
도 11 은 PAH 를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 처리한 후에 Pahenu2 마우스의 혈액에서 Phe 의 감소된 수준을 도시한다.
도 12 는 LV-Pro-hAAT-PAH 에 의한 혈액 페닐알라닌 억제를 도시한다.
도 13A-13D 는 다양한 DJ 또는 AAV/2 혈청형 벡터에 의한 293 세포에서 PAH 의 AAV-전달되는 발현 후에 PAH 단백질 발현 (도 13A) 및 PAH RNA 발현 (도 13D) 을 도시한다; AAV/DJ 벡터 (도 13B) 및 AAV/2 벡터 (도 13C) 의 전달 후에 PAH 단백질 발현의 배수 변화를 또한 분석했다.
도 14 는 PKU 에 관해 LV-Pro-hAAT-PAH 렌티바이러스 벡터 요법으로 치료된 신생아 enu2/enu2 마우스에서 Phe 의 감소된 수준을 도시한다.
도 15 는 프로트롬빈-hAAT-PAH-PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 13) 또는 프로트롬빈-hAAT-PAH-PAH shRNA 서열 #2 (SEQ ID NO: 14) (이들 각각은 내인성 Pah 유전자에 의해 발현되는 mRNA 의 3'UTR 를 표적화하고 PAH 단백질의 발현을 저해한다) 을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 처리한 후에 PAH 발현을 보이는 Hep3B 세포로부터의 데이타를 도시한다.
상세한 설명
본 공개의 개관
이 공개는 치료적 벡터 및 세포로의 치료적 벡터의 전달에 관한 것이다. 실시형태에서, 치료적 벡터는 PAH 서열 또는 그의 변이체, 및 간-특이적 인핸서를 포함한다. 실시형태에서, 치료적 벡터는 숙주 (즉, 내인성) PAH 단백질 발현을 조절하는 작은 RNA 를 또한 포함한다.
정의 및 해석
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 공개와 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기법은 당업계에 잘 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 공개의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 공지된 종래의 방법에 따라, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 다음을 참조한다: Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 임의의 효소 반응 또는 정제 기법은 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조사의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기법은 당업계에 잘 공지되며 통상적으로 사용되는 것들이다.
상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형 형태는 문맥에서 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수형 형태와 상호교환가능하게 사용되며 복수형 형태를 포함하는 것 뿐만 아니라 각각의 의미 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "및/또는" 은 하나 이상의 열거된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라 대안으로 해석될 때의 조합 부족 ("또는") 을 나타내며 포함한다.
모든 숫자 지정, 예를 들어 범위를 포함하는, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 0.1 씩 증가하여 (+) 또는 (-) 로 변동되는 근사치이다. 항상 명확하게 언급되지 않더라도, 모든 수치 지정은 용어 "약" 이 선행된다는 것이 이해된다. 용어 "약" 은 "X + 0.1" 또는 "X - 0.1" 와 같은 "X" 의 작은 증분에 더하여 정확한 값 "X" 를 또한 포함한다. 항상 명확하게 언급되지 않더라도, 본원에서 기재되는 시약은 단지 예시적이며 이들의 등가물이 당업계에 공지되어 있다는 것이 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 은 당업자에 의해 이해될 것이며 사용되는 문맥에 따라서 어느 정도 가변적일 것이다. 사용되는 문맥을 고려했을 때 당업자에게 분명하지 않은 용어가 사용되는 경우, "약" 은 특정한 용어의 10% 까지를 더하거나 뺀 것을 의미할 것이다.
용어 활성제의 "투여" 또는 활성제를 "투여하는" 은 개인의 신체에 치료적으로 유용한 형태 및 치료적 유효량으로 도입될 수 있는 형태로 치료를 필요로 하는 대상체에게 활성제를 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하지만 다른 것은 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우 "~로 본질적으로 이루어지는" 은 조성물 또는 방법에 임의의 필수적인 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. "~로 이루어지는" 은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대한 다른 구성성분의 미량 초과의 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의되는 실시형태는 본 공개의 범주 내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물이 추가의 단계 및 성분을 포함할 수 있거나 (포함하는), 대안적으로, 중요하지 않은 단계 또는 조성물을 포함하거나 (본질적으로 이루어지는), 또는 대안적으로, 오직 언급된 방법 단계 및 조성물을 의도하는 (이루어지는) 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현", "발현된" 또는 "인코딩하는" 은 폴리뉴클레오티드가 mRNA 로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA 가 이후 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA 의 스플라이싱 또는 전사후 변형 또는 번역후 변형의 다른 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아데노-연관 바이러스 벡터" 는 아데노-연관 바이러스의 담체 또는 수송체를 지칭한다. 용어 "아데노-연관 바이러스 벡터" 는 또한 본원에서 "AAV 벡터" 로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아데노-연관 바이러스" 는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있고 병원성이 아닌, 약한 면역 응답을 발생시키는 작은 바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "AAV/DJ" (또한 본원에서 "AAV-DJ" 로서 언급됨) 는 야생형 AAV 혈청형보다 더 높은 형질도입율 및 감염율을 매개하는, 상이한 AAV 혈청형으로부터 조작된 AAV 벡터의 혈청형이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "AAV2" (또한 본원에서 로서 언급됨 "AAV/2" 또는 "AAV-2") 는 자연적으로 존재하는 AAV 혈청형이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "AAV-Pro-hAAT-PAH" 는 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열을 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약어 "ApoE 인핸서" 는 Apolipo단백질 E 인핸서를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전 의약" 또는 "유전 의약들" 은 일반적으로 임상적 질환 또는 징후를 치료하기 위해 유전적 표적에 초점을 두는 치료제 및 치료 전략을 지칭한다. 용어 "유전 의약" 은 유전자 요법 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약어 "hAAT" 는 hAAT 프로모터를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "hAAT-hPAH-3'UTR289" 는 또한 본원에서 U289 로서, 또는 일반적으로 이식유전자-발현되는 절두된 hPAH 3'UTR, 또는 일반적으로 절두된 3' UTR 로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "간세포 핵 인자" 는 간에서 우세하게 발현되는 전사 인자를 지칭한다. 간세포 핵 인자의 유형은 간세포 핵 인자 1, 간세포 핵 인자 2, 간세포 핵 인자 3, 및 간세포 핵 인자 4 를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약어 "HNF" 는 간세포 핵 인자를 지칭한다. 따라서 HNF1 는 간세포 핵 인자 1 을 지칭하고, HNF2 는 간세포 핵 인자 2 를 지칭하고, HNF3 은 간세포 핵 인자 3 을 지칭하고, HNF4 는 간세포 핵 인자 4 를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "HNF 결합 자리" 는 HNF 전사 인자가 결합할 수 있는 DNA 의 영역을 지칭한다. 따라서, HNF1 결합 자리는 HNF1 이 결합할 수 있는 DNA 의 영역이고, HNF4 결합 자리는 HNF4 가 결합할 수 있는 DNA 의 영역이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체", "대상체" 및 "환자" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 임의의 개별 포유동물 대상체, 예를 들어, 쥐, 돼지, 소, 개, 고양이, 말, 비인간 영장류 또는 인간 영장류를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "토끼 베타 글로빈 인트론" 는 RNA 성숙 동안 스플라이싱되지 않고, 단백질에 대해 코딩하지 않는 토끼 베타 글로빈 유전자 내의 핵산 분절을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "인간 베타 글로빈 인트론" 은 RNA 성숙 동안 스플라이싱되지 않고, 단백질에 대해 코딩하지 않는 인간 베타 글로빈 유전자 내의 핵산 분절을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV" 는 일반적으로 "렌티바이러스" 를 지칭한다. 비제한적 예로서, "LV-PAH" 에 대한 언급은 PAH 서열을 함유하고 PAH 를 발현하는 렌티바이러스에 대한 언급이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-Pro-hAAT-PAH" 는 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열을 포함하는 렌티바이러스를 지칭한다. LV-Pro-hAAT-PAH 벡터는 또한 AGT323 벡터로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-HNF-Pro-hAAT-PAH" 는 HNF 결합 자리, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열을 포함하는 렌티바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-Pro-인트론-PAH" 는 프로트롬빈 인핸서, 인트론, 및 PAH 서열을 포함하는 렌티바이러스를 지칭하며, 인트론은 인간 베타 글로빈 인트론이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-Pro-hAAT" 는 프로트롬빈 인핸서 및 hAAT 프로모터를 포함하는 렌티바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-Pro-TBG-PAH" 는 프로트롬빈 인핸서, 티록신 결합 글로불린, 및 PAH 서열을 포함하는 렌티바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-ApoE-hAAT-PAH-UTR" 는 아포지방단백질 E 인핸서, hAAT 프로모터, PAH 서열, 및 유전자의 미번역 영역을 포함하는 렌티바이러스를 지칭하며, 미번역 영역은 PAH 유전자의 3'UTR 이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "LV-Pro-hAAT-PAH-shPAH" 는 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, PAH 서열 및 shPAH 서열을 포함하는 렌티바이러스를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키징 세포주" 는 렌티바이러스 입자를 발현하는데 사용될 수 있는 임의의 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일성 %" 는, 하기 기재된 서열 비교 알고리즘 중 하나 (예를 들어 BLASTP 및 BLASTN 또는 기타 숙련자가 이용가능한 기타 알고리즘) 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같은, 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때 동일한 특정 백분율의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라, "동일성 %" 는 비교되는 서열의 부위에 걸쳐, 예를 들어, 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로, 비교될 2 개 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재한다. 서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열을 그에 대해 비교하는 참조 서열로서 역할한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들) 의 서열 동일성 % 를 계산한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한" 은 타당한 의료적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제점 또는 합병증이 합당한 이익/위험 비에 비례하지 않으면서, 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과 접촉하여 사용하기에 적합한 이러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 생리적으로 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 지칭하며 포함한다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어, 산 부가염 또는 염기 부가염을 포함할 수 있다 (예를 들어, Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66:1-19 참조).
용어 "페닐알라닌 히드록실라아제" 는 또한 본원에서 PAH 로서 지칭될 수 있다. 용어 페닐알라닌 히드록실라아제는 뉴클레오티드 및 펩티드 서열 둘 모두를 포함하는 모든 야생형 및 변이체 PAH 서열을 포함한다. 제한 없이, 용어 페닐알라닌 히드록실라아제는 SEQ ID NOs: 1-4 에 대한 언급을 포함하고, 그와 적어도 약 80% 동일성을 갖는 변이체를 추가로 포함한다. 인간 PAH 는 또한 본원에서 hPAH 로서 지칭될 수 있다. 인간 PAH 는 또한 본원에서 hPAH 로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형 hPAH" 는 또한 본원에서 내인성 PAH 또는 "전장 PAH" 로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 "PKU" 로도 나타내는 용어 "페닐케톤뇨증" 은 페닐알라닌 히드록실라아제의 만성적 결핍 뿐만 아니라 경증 및 고전적 형태의 질환을 포함하여 이와 관련된 모든 증상을 지칭한다. 따라서, "페닐케톤뇨증" 의 치료는 PKU 와 관련된 모든 또는 일부 증상의 치료에 관한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로트롬빈 인핸서" 는 프로트롬빈 유전자의 전사를 초래하는, 단백질에 의해 결합될 수 있는 프로트롬빈 유전자 상의 영역이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약어 "Pro" 는 프로트롬빈 인핸서를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작은 RNA" 는 일반적으로 약 200 개 이하의 뉴클레오티드 길이이며 침묵 또는 간섭 기능을 갖는 비-코딩 RNA 를 지칭한다. 다른 실시형태에서, 작은 RNA 는 약 175 개 이하의 뉴클레오티드, 약 150 개 이하의 뉴클레오티드, 약 125 개 이하의 뉴클레오티드, 약 100 개 이하의 뉴클레오티드, 또는 약 75 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 RNA 는 microRNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 이중가닥 RNA (dsRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 를 포함한다. 공개의 "작은 RNA" 는 일반적으로 표적 유전자 mRNA 의 파괴를 초래하는 경로를 통해 표적 유전자의 유전자 발현을 억제 또는 녹다운시킬 수 있어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "shPAH" 는 PAH 를 표적화하는 작은 헤어핀 RNA 를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 약어 "lncRNA" 는 긴 비-코딩 RNA 를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SEQ ID NO" 는 용어 "서열 ID No" 와 동의어이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "티록신 결합 글로불린" 은 혈류에서 티로이드 호르몬을 운반하는 책임을 지는 수송 단백질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약어 "TBG" 는 티록신 결합 글로불린을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량" 은 특정한 질병, 상해, 질환 또는 병상을 앓고 있는 환자에서 보이는 합병증의 증상, 진행 또는 개시를 치료하거나 예방하기 위한, 적합한 조성물, 및 적합한 투약 형태 중 본 공개의 활성제의 충분한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 환자의 병상의 상태 또는 이의 중증도, 및 치료하려는 대상체의 연령, 체중 등에 따라 가변적일 것이다. 치료적 유효량은 예를 들어 투여 경로, 대상체의 병상 뿐만 아니라 당업자에 의해 이해되는 기타 인자를 포함하는, 임의의 수많은 인자에 따라 가변적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 벡터" 는 비제한적으로, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 언급을 포함한다. 추가로, 렌티바이러스 벡터 시스템과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터" 는 용어 "플라스미드" 와 동의어이다. 예를 들어, 2-벡터 및 3-벡터 패키징 시스템을 포함하는 3-벡터 및 4-벡터 시스템은 또한, 3-플라스미드 및 4-플라스미드 시스템으로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는" 은 일반적으로 치료하는 대상체의 자연적 과정을 변경시키려고 시도하는 중재술을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 저해, 감소 또는 억제, 질환 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도의 야기 또는 개선된 예후를 포함한다.
"치료" 는 질환 상태를 대상으로 삼아서 그것과 싸우는 것, 즉, 질환 상태를 완화 또는 예방하는 것이 의도된다. 특정 치료는 따라서 대상이 되는 질환 상태 및 약물 요법 및 치료적 접근법의 현재 또는 미래의 상태에 따라 좌우된다. 치료는 연관 독성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "절두된" 은 또한 본원에서 "단축된" 또는 "없이" 로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "UTR" 는 유전자의 코딩 영역의 5' 또는 3' 에 있는 유전자의 영역에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "3' UTR" 는 유전자의 코딩 영역의 3' 에 있는 "UTR" 이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체" 는 또한 본원에서 유사체 또는 변이로서 지칭될 수 있다. 변이체는 뉴클레오티드 서열에 대한 임의의 치환, 결실, 또는 부가를 지칭한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬을 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) 의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis. 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 에 의해, 또는 육안 검사에 의해 (일반적으로, 상기 Ausubel et al. 참조) 실시할 수 있다.
서열 동일성 % 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 알고리즘이며 이는 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) 에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information) 웹사이트로부터 공개적으로 입수가능하다.
본 공개의 핵산 및 단백질 서열은 또한, 예를 들어, 관련된 서열을 확인하기 위해 공개적 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열 (query sequence)" 로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (version 2.0) 을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 공개에서 제공된 핵산 분자와 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12 로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 공개의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3 으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭화된 정렬 (gapped alignment) 을 수득하기 위해, Gapped BLAST 를 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 에서 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어 XBLAST 및 NBLAST) 의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 를 참조한다.
본 공개의 양태 및 실시형태의 설명
본 공개의 양태에서, 바이러스 벡터는 치료적 카고 부분을 포함하며, 치료적 카고 부분은 PAH 서열 또는 그의 변이체, 프로모터, 및 간-특이적 인핸서를 포함하며, PAH 서열 또는 그의 변이체는 프로모터 및 간-특이적 인핸서 둘 모두에 의해 작동적으로 제어된다.
실시형태에서, 간-특이적 인핸서는 프로트롬빈 인핸서를 포함한다. 실시형태에서, 프로모터는 간-특이적 프로모터이다. 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 치료적 카고 부분은 베타 글로빈 인트론을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리를 추가로 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리는 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 배치되어 있다. 실시형태에서, 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리는 프로트롬빈 인핸서의 다운스트림에 배치되어 있다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열 (LV-Pro-hAAT-PAH) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, HNF 결합 자리, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열 (LV-HNF-Pro-hAAT-PAH) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, HNF 결합 자리는 HNF1 또는 HNF1/4 결합 자리이다. 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 인트론, 및 PAH 서열 (LV-Pro-인트론-PAH) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, 인트론은 토끼 글로빈 인트론이다. 실시형태에서, 인트론은 인간 글로빈 인트론이다. 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서 및 hAAT 프로모터 (LV-Pro-hAAT) 를 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, 티록신 결합 글로불린, 및 PAH 서열 (LV-Pro-TBG-PAH) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, ApoE 인핸서, hAAT 프로모터, PAH 서열, 및 PAH 의 3'UTR (LV-ApoE-hAAT-PAH-UTR) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다.
실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 절두되어 있다. 실시형태에서, 절두되어 있는 PAH 서열 또는 그의 변이체의 부분은 PAH 서열 또는 그의 변이체의 3' 미번역 영역 (UTR) 이다.
실시형태에서, 3'UTR 에서의 PAH 절두는 3'UTR 에 대한 특정 조절 RNA 의 결합을 방지한다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 lncRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 microRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 piRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 shRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 19 내지 25 뉴클레오티드 길이의 siRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 SEQ ID NOs: 13 또는 14 와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그보다 높은 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 작은 RNA 서열이다.
실시형태에서, PAH 서열은 SEQ ID NO: 1 을 포함한다. 실시형태에서, PAH 서열은 코돈 최적화된 PAH 서열 (SEQ ID NO: 2) 을 포함한다. 실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 절두된 3' UTR (289 개 뉴클레오티드) (SEQ ID NO: 4) 를 포함한다. 실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 5' UTR (897 개 뉴클레오티드) (SEQ ID NO: 3) 를 포함한다.
실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 4 와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그보다 높은 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 변이체는 임의의 위에서 기재된 서열로 만들어질 수 있다. 실시형태에서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 4 를 포함한다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서는 SEQ ID NO: 5 와 적어도 80%, 또는 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그보다 높은 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 변이체는 위에서 기재된 서열로 만들어질 수 있다. 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서의 서열은 SEQ ID NO: 5 를 포함한다.
실시형태에서, hAAT 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 6 을 포함한다. 실시형태에서, 베타 글로빈 인트론의 서열은 SEQ ID NOs: 7 또는 8 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 간세포 핵 인자 결합 자리의 서열은 SEQ ID NOs: 9-12 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태에서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 예정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 전장 UTR 를 함유하는 상보적 mRNA 서열을 표적화한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 예정된 상보적 mRNA 서열은 PAH mRNA 서열이다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 shRNA 를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 제 1 프로모터의 제어 하에 있고, PAH 서열 또는 그의 변이체는 제 2 프로모터의 제어 하에 있다. 실시형태에서, 제 1 프로모터는 H1 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 제 2 프로모터는 간-특이적 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 SEQ ID NO: 13; 또는 SEQ ID NO: 14 와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그보다 높은 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 변이체는 임의의 위에서 기재된 서열로 만들어질 수 있다. 실시형태에서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 SEQ ID NO: 13; 또는 SEQ ID NO: 14 를 포함한다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, PAH 서열, 및 내인성 PAH 를 표적화하는 shRNA (LV-Pro-hAAT-PAH-shPAH) 를 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, shRNA 는 내인성 PAH 의 3'UTR 를 표적화한다. 실시형태에서, shPAH 를 SEQ ID NO: 13 을 포함한다. 실시형태에서, shPAH 는 SEQ ID NO: 14 를 포함한다.
본 공개의 양태에서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시키기 위해 최적화된 외피 단백질, 및 본원에서 개시되는 임의의 바이러스 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 표적 세포는 간 세포, 근육 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 신경내분비 세포, 내분비 세포, 림프구, 골수 세포, 고형 기관 내에 존재하는 세포, 또는 조혈 계통의 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 전구체 조혈 줄기 세포이다.
본 공개의 양태에서, 대상체에서 PKU 을 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에서 개시되는 임의의 렌티바이러스 입자를 투여하는 것을 포함한다. 본 공개의 양태에서, 대상체에서 PKU 을 예방하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에서 개시되는 임의의 렌티바이러스 입자를 투여하는 것을 포함한다. 본 공개의 또다른 양태에서, 대상체에서 PKU 을 치료하기 위한 치료 유효량의 본원에서 개시되는 임의의 렌티바이러스 입자의 용도가 개시되어 있다. 실시형태에서, 방법은 대상체에서 PKU 표현형과 상관관계가 있는 PKU 유전자형을 진단하는 것을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 대상체는 자궁 내에 있다. 실시형태에서, 진단은 대상체의 태아기 스크리닝 동안 또는 부모의 유전적 스크리닝 후에 이루어진다. 실시형태에서, 진단은 시험관 내에서 이루어진다. 실시형태에서, 치료 유효량의 렌티바이러스 입자는 복수의 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다. 실시형태에서, 치료 유효량의 렌티바이러스 입자는 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함한다.
본 공개의 양태에서, PAH 의 돌연변이체 형태를 갖는 대상체를 외인성 PAH 를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 치료 유효량으로 처리하는 것을 포함하는 대상체에서 PKU 을 치료하는 방법이 제공된다. 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 실시형태에서, 포유동물은 설치류이다. 실시형태에서, 설치류는 마우스 또는 랫트이다. 실시형태에서, 포유동물은 돼지이다.
실시형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터로 처리된다. 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 PAH 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 실시형태에서, PAH 서열은 본원에서 기재되는 임의의 PAH 서열 또는 변이체이다.
실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 본원에서 기재되는 PAH 또는 변이체를 포함하는 임의의 렌티바이러스 벡터이다. 실시형태에서, PAH 를 포함하는 렌티바이러스 벡터는 도 1 및 2 에 도시된 바와 같은 PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터이다. 실시형태에서, PAH 를 포함하는 렌티바이러스 벡터는 도 3 에 도시된 바와 같은 PAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터이다.
실시형태에서, 바이러스 벡터는 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열 (또한 본원에서 LV-Pro-hAAT-PAH 또는 AGT323 로서 언급됨) 을 포함한다. 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서 서열은 본원에서 기재되는 임의의 프로트롬빈 서열 또는 변이체이다. 실시형태에서, hAAT 프로모터는 본원에서 기재되는 임의의 hAAT 프로모터 서열 또는 변이체이다. 실시형태에서, PAH 서열은 본원에서 기재되는 임의의 PAH 서열 또는 변이체이다.
실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 통합된 렌티바이러스 벡터로 구성된다. 실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 시스템에서 유래한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터 시스템은 rev 유전자 및 env 유전자를 인코딩하는 별개의 플라스미드를 포함한다. 실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터는 3-벡터 렌티바이러스 시스템에서 유래한다. 실시형태에서, 3-벡터 렌티바이러스 시스템은 도 1 에 예시되어 있다. 실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터는 4-벡터 렌티바이러스 시스템에서 유래한다. 실시형태에서, 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 도 2 에 예시되어 있다.
실시형태에서, 대상체는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터로 처리된다. 실시형태에서, AAV 벡터는 본원에서 개시되는 임의의 AAV 벡터를 포함한다. 실시형태에서, AAV 벡터는 PAH 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 실시형태에서, PAH 서열은 본원에서 기재되는 임의의 PAH 서열 또는 변이체이다.
실시형태에서, 주입은 피내 주입이다. 실시형태에서, 주입은 근육내 주입이다. 실시형태에서, 주입은 피하 주입이다. 실시형태에서, 주입은 정맥내 주입이다.
실시형태에서, 본원에서 기재되는 방법은 대상체를 렌티바이러스 입자로 처리하기에 앞서 통합된 렌티바이러스 벡터의 비역가 (specific titer) 를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 비역가는 시험관 내에서 세포 표적 및 렌티바이러스 벡터 형질도입, 그에 뒤이어 형질도입된 세포의 빈도 및 세포 당 통합된 벡터 카피의 수를 측정하기 위한 형질도입된 세포로부터의 염색체 DNA 의 정량적 PCR 분석을 이용하는 시험 시스템에서 확인된다. 역가는 적당한 칼럼의 렌티바이러스 벡터를 적당한 수의 세포 내로 형질도입하여 초래될 통합된 카피의 수로서 표현된다. 실시형태에서, 역가는 1 x 105 내지 1 x 1015 개 통합된 벡터 카피, 예를 들어, 1 x 107 내지 1 x 1013 개 통합된 벡터 카피, 또는 1 x 109 내지 1 x 1011 개 통합된 벡터 카피이다. 실시형태에서, 역가는 1 x 1010 개 통합된 벡터 카피이다.
실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터의 비역가의 생성은 벡터 시스템을 하나 이상의 세포에 첨가하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 하나 이상의 세포는 세포주이다. 실시형태에서, 세포주는 293T 세포주이다. 실시형태에서, 세포주는 HeLa 세포주이다. 실시형태에서, 세포주는 CHO 세포주이다. 실시형태에서, 세포주는 Hep3B 세포주이다. 당업자는 또한 다른 실시형태에서, 세포주가 당업계에 알려진 임의의 적합한 세포주일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시형태에서, 방법은 PAH 를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 주입 후에 혈액에서 Phe 의 수준을 측정하는 것을 추가로 포함한다.
본 공개의 양태에서, 인간 PAH 는 AAV-전달되는 발현 시스템을 사용하여 세포에서 발현된다. 실시형태에서 AAV-2 혈청형이 사용된다. 실시형태에서, AAV-DJ 혈청형이 사용된다. 실시형태에서, AAV 벡터는 GFP 를 함유한다. 실시형태에서, AAV 벡터는 임의의 혈청형을 나타낼 수 있거나 또는 재조합 DNA 또는 인간 간세포의 형질도입을 개선하기 위해 디자인된 다른 합성 접근법에 의해 생성될 수 있다.
실시형태에서, 인간 PAH 가 AAV 벡터 내로 도입된다. 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서가 AAV 벡터 내로 도입된다. 실시형태에서, hAAT 프로모터가 AAV 벡터 내로 도입된다. 실시형태에서, 토끼 글로빈 인트론이 AAV 벡터 내로 도입된다. 실시형태에서, 인간 PAH, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 토끼 글로빈 인트론 중 어느 하나 또는 그 이상이 AAV 벡터 내로 도입된다. 실시형태에서 바이러스 벡터는 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 PAH 서열 (AAV-Pro-hAAT-PAH; AGT323) 을 포함한다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서 서열은 본원에서 개시되는 임의의 프로트롬빈 서열 또는 변이체이다. 실시형태에서, PAH 서열은 본원에서 기재되는 임의의 PAH 서열 또는 변이체이다. 실시형태에서, hAAT 서열은 본원에서 개시되는 임의의 hAAT 서열 또는 변이체이다. 실시형태에서, 인트론 서열은 본원에서 개시되는 임의의 인트론 서열 또는 변이체이다.
본 공개의 양태에서, 렌티바이러스 벡터 요법은 돌연변이체 PAH 유전자를 갖는 대상체의 치료에서 사용된다. 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 다른 실시형태에서, 본원에서 실험적으로 보여지는 바와 같이, 대상체는 Pah 돌연변이체 마우스 라인에서 유래하는 신생아 마우스이다. 실시형태에서, 돌연변이체 마우스 라인은 Pahenu1 이다. 실시형태에서, 돌연변이체 마우스 라인은 Pahenu2 이다. 실시형태에서, 돌연변이체 마우스 라인은 Pahenu3 이다.
실시형태에서, 렌티바이러스 벡터 내의 PAH 서열은 본원에서 기재되고 www.biopku.org 에서 발견되는 PAHvdb, BIODEF, BIOPKU, JAKE 또는 PNDdb 데이타베이스에서 열거된 것들을 포함하는 임의의 PAH 서열 또는 변이체이다.
실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 통합된 렌티바이러스 벡터로 구성된다. 실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 시스템에서 유래한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터 시스템은 rev 유전자 및 외피 유전자를 인코딩하는 별개의 플라스미드를 포함한다. 실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터는 3-벡터 렌티바이러스 시스템에서 유래한다. 실시형태에서, 3-벡터 렌티바이러스 시스템은 도 1 에 예시되어 있다. 실시형태에서, 통합된 렌티바이러스 벡터는 4-벡터 렌티바이러스 시스템에서 유래한다. 실시형태에서, 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 도 2 에 예시되어 있다.
본 공개의 양태에서, shRNA 및 PAH 를 함유하는 세포에서 렌티바이러스의 발현은 내인성 PAH 의 발현을 억제하지만, 렌티바이러스 벡터로부터 발현되는 외인성 PAH 의 발현은 억제하지 않는다.
실시형태에서, shRNA 및 PAH 를 함유하는 렌티바이러스는 본원에서 기재되는 바와 같이 대상체에서 생체 내에서 (in vivo) 발현된다. 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
실시형태에서, shRNA 및 PAH 를 함유하는 렌티바이러스는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 발현된다. 실시형태에서, 렌티바이러스는 시험관 내에서, 예를 들어 세포주에서 발현된다. 실시형태에서, 세포주는 본원에서 기재되는 임의의 세포주 또는 당업자에게 공지된 세포주이다. 실시형태에서, 세포주는 Hep3B 세포주이다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, PAH 서열, 및 내인성 PAH 를 표적화하는 shRNA (임의로 본원에서 LV-Pro-hAAT-PAH-shPAH 로서 언급됨) 을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 실시형태에서, shRNA 는 내인성 PAH 의 3'UTR 를 표적화한다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서 서열은 본원에서 개시되는 임의의 프로트롬빈 서열 또는 변이체를 포함한다. 실시형태에서, hAAT 프로모터는 본원에서 개시되는 임의의 hAAT 프로모터 서열 또는 변이체를 포함한다. 실시형태에서, PAH 서열은 본원에서 기재되는 임의의 PAH 서열 또는 변이체를 포함한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터의 shRNA 서열은 SEQ ID NO: 13 을 포함한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터의 shRNA 서열은 SEQ ID NO: 14 를 포함한다.
본원에서 기재되는 본 발명의 다른 양태 및 이점은, 본 발명의 양태를 예로서 설명하는, 첨부된 도면과 함께 고려하여 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
페닐케톤뇨증
PKU 는 PAH 의 돌연변이 및/또는 PAH 보조인자 (즉, BH4) 의 합성 또는 재생 결함에 의해 유발된다고 여겨진다. 특히, 몇몇 PAH 돌연변이는 소포체에서의 단백질 폴딩에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 효소 촉매 활성을 약화시키거나 크게 철폐시키는 단백질 구조에서의 미스센스 돌연변이 (63%) 및 작은 결실 (13%) 로 인한 가속화된 분해 및/또는 응집을 초래한다. PAH 의 기능성에 영향을 줄 수 있는 수많은 돌연변이가 존재하므로, PKU 를 치료하기 위한 효과적인 치료적 접근방식은 비정상 PAH 및/또는 대체 PAH 가 투여될 수 있는 방식을 다루는 것이 필요할 수 있다.
일반적으로, 3 가지 주요 표현형 군은 진단시 측정된 Phe 수준, Phe 에 대한 식이 내성 및 치료요법에 대한 잠재적 반응성을 기반으로 하여 PKU 에서 분류된다. 이들 군은 고전적 PKU (Phe > 1200 μM), 비정형 또는 경증 PKU (Phe 가 600 - 1200 μM 임) 및 영구적인 경증 고페닐알라닌혈증 (HPA, Phe 120 - 600 μM) 을 포함한다.
PKU 의 검출은 보편적 신생아 스크리닝 (NBS) 에 의존한다. 힐 스틱으로부터 수집한 1 점적의 혈액을 USA 의 모든 50 개 주에서 의무적이고 대부분의 개발도상국에서 통상적으로 사용되는 스크린에서 페닐알라닌 수준에 대해 검사한다.
유전 의약
유전 의약은 질환 치료 또는 예방의 목적으로 숙주 세포에 유전적 구축물을 전달하는데 사용되는 바이러스 벡터에 대한 언급을 포함한다.
유전적 구축물은 비제한적으로, 존재하는 결함을 교정하거나 보완하기 위한 기능적 유전자 또는 유전자의 일부, 조절 단백질을 인코딩하는 DNA 서열, 안티센스, 짧은 헤어핀 RNA, 짧은 상동성 RNA, 긴 비-코딩 RNA, 작은 간섭 RNA 또는 기타의 것들을 포함하는 조절 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열, 및 질환 상태를 변경하기 위해 중요한 세포 인자에 대해 경쟁하도록 디자인된 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 디코이 서열 (decoy sequence) 을 포함할 수 있다. 유전 의약은 특징 질환의 치료 또는 완화를 제공하기 위해 이러한 치료적 유전적 구축물을 표적 세포에 전달하는 것을 포함한다.
기능적 PAH 유전자를 간에 생체내 전달함으로써, PAH 활성이 재구성될 수 있어, 혈액 내 Phe 의 정상적인 청소를 초래하여 따라서 식이 제한 또는 빈번한 효소 대체 치료요법에 대한 필요성을 제거한다. 이러한 치료적 접근방식의 효과는 내인성 PAH 에 대한 shRNA 의 표적화에 의해 개선될 수 있다. 본 공개의 하나의 양태에서, 기능적 PAH 유전자 또는 이의 변이체는, 태아가 PKU 유전자형에 대한 위험성이 있는 것으로 확인된 경우 자궁 내에 전달될 수 있다. 실시형태에서, 진단 단계는 태아가 PKU 표현형에 대한 위험성이 있는지 여부를 결정하기 위해 실행될 수 있다. 진단 단계에서 태아가 PKU 표현형에 대한 위험성이 있는 것으로 결정되는 경우, 태아는 본원에 상세히 나타낸 유전 의약로 치료될 수 있다. 치료는 자궁 내에서 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다.
치료적 벡터
본원의 다양한 양태 및 실시형태에 따른 렌티바이러스 비리온 (입자) 은 비리온 (바이러스 입자) 를 생성하기 위해 필요한 바이러스 단백질을 인코딩하는 벡터 시스템에 의해 발현된다. 다양한 실시형태에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 렌티바이러스 pol 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 하나의 벡터가 역전사 및 통합을 위해 제공된다. 또 다른 실시형태에서, pol 단백질은 다수의 벡터에 의해 발현된다. 다른 실시형태에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 바이러스 캡시드를 형성하기 위한 렌티바이러스 Gag 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터가 제공된다. 실시형태에서, 이러한 gag 핵산 서열은 적어도 일부의 pol 핵산 서열 외에 별개의 벡터 상에 존재한다.
야생형 복귀 돌연변이체 (revertant) 를 수득하는 가능성을 더 최소화하기 위해, 입자 생성에 사용되는 본원의 벡터에 수많은 변형이 이루어질 수 있다. 이들은 비제한적으로, LTR 의 U3 부위의 결실, tat 결실 및 매트릭스 (MA) 결실을 포함한다. 실시형태에서, gag, pol 및 env 벡터(들)는 렌티바이러스 패키징 서열로 지칭되는, 렌티바이러스 RNA 를 패키징하는 렌티바이러스 게놈으로부터의 뉴클레오티드를 함유하지 않는다.
입자를 형성하는 벡터(들)는 바람직하게는 외피 단백질을 발현하는 렌티바이러스 게놈으로부터의 핵산 서열을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 프로모터에 작동가능하게 연결된 외피 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 별개의 벡터가 사용된다. 이러한 env 벡터는 또한 렌티바이러스 패키징 서열을 함유하지 않는다. 한 실시형태에서 env 핵산 서열은 렌티바이러스 외피 단백질을 인코딩한다.
또다른 실시형태에서 외피 단백질은 렌티바이러스로부터가 아니라 상이한 바이러스로부터 유래된다. 생성된 입자는 위형 입자 (pseudotyped particle) 로 지칭된다. 외피 단백질을 적절히 선택함으로써 사실상 임의의 세포를 "감염" 시킬 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, VSV-G 또는 인간 및 비-인간 랩도바이러스 단리물로부터의 유사한 외피 단백질, 알파 바이러스 (셈리키 삼림열바이러스, 신드비스 바이러스), 아레나바이러스 (림프구성 맥락수막염 바이러스), 플라비바이러스 (진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, C 형 간염 바이러스, GB 바이러스), 랍도바이러스 (수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스), 파라믹소바이러스 (볼거리 또는 홍역) 및 오르토믹소바이러스 (인플루엔자 바이러스) 의 것과 같은 세포내이입성 구획을 표적으로 하는 외피 단백질을 인코딩하는 env 유전자를 사용할 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 다른 외피 단백질은 고양이 백혈병 바이러스 및 고양이 내인성 레트로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스 예컨대 MLV-E, MLV-A, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 GALV, 및 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스로부터의 것들을 포함한다. 이들 후자의 외피 단백질은 숙주 세포가 일차 세포인 경우에 특히 바람직하다. 원하는 숙주 세포에 따라 다른 외피 단백질이 선택될 수 있다.
본원에서 제공된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 gag, pol 또는 rev 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함한다. 각각의 gag, pol 및 rev 유전자는 개별 플라스미드 상에 제공될 수 있거나, 하나 이상의 유전자가 동일한 플라스미드 상에 함께 제공될 수 있다. 한 실시형태에서, gag, pol 및 rev 유전자는 동일한 플라스미드 상에 제공된다 (예를 들어, 도 1). 또다른 실시형태에서, gag 및 pol 유전자는 제 1 플라스미드 상에 제공되며 rev 유전자는 제 2 플라스미드 상에 제공된다 (예를 들어, 도 2). 따라서, 3-벡터 및 4-벡터 시스템 둘 모두가 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스를 생성하는데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 치료적 벡터, 적어도 하나의 외피 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포, 예를 들어, 패키징 세포주에 트랜스펙션된다. 패키징 세포주의 비제한적인 예는 293T/17 HEK 세포주이다. 치료적 벡터, 외피 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주에 트랜스펙션되는 경우, 렌티바이러스 입자가 궁극적으로 생성된다.
또다른 양태에서, 렌티바이러스 입자를 발현시키기 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시되어 있다. 시스템은 본원에서 기재되는 렌티바이러스 벡터; 세포를 감염시키기 위해 최적화된 외피 단백질을 발현시키기 위한 외피 플라스미드; 및 gag, pol, 및 rev 유전자를 발현시키기 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하며, 렌티바이러스 벡터, 외피 플라스미드, 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주 내로 트랜스펙션될 때, 패키징 세포주에 의해 렌티바이러스 입자가 생산되며, 렌티바이러스 입자는 PAH 의 생산을 저해할 수 있고/있거나 내인성 PAH 의 발현을 저해할 수 있다.
또다른 양태에서, 또한 본원에서 치료적 벡터로서 언급되는, 렌티바이러스 벡터는 하기 요소를 포함한다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/5' LTR) (SEQ ID NOs: 15-16), Psi 서열 (RNA 패키징 자리) (SEQ ID NO: 17), RRE (Rev-응답 요소) (SEQ ID NO: 18), cPPT (폴리퓨린 구역 (tract)) (SEQ ID NO: 19), 항 알파 트립신 프로모터 (hAAT) (SEQ ID NO: 6), 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) (SEQ ID NOs: 1-4, 우드척 전사후 조절 요소 (Woodchuck Post-Transcriptional Regulatory Element) (WPRE) (SEQ ID NOs: 20), 및 ΔU3 3' LTR (SEQ ID NO: 21). 실시형태에서, 또한 본원에서 치료적 벡터로서 언급되는, 렌티바이러스 벡터는 하기 요소를 포함한다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/5' LTR) (SEQ ID NOs: 15-16), Psi 서열 (RNA 패키징 자리) (SEQ ID NO: 17), RRE (Rev-응답 요소) (SEQ ID NO: 18), cPPT (폴리퓨린 구역) (SEQ ID NO: 19), H1 프로모터 (SEQ ID NO: 22), PAH shRNA (SEQ ID NOs: 1-4), 항 알파 트립신 프로모터 (hAAT) (SEQ ID NO: 6), PAH shRNA (SEQ ID NOs: 1-4), 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE) (SEQ ID NO: 20), 및 ΔU3 3' LTR (SEQ ID NO: 21). 실시형태에서, 치환, 결실, 부가, 또는 돌연변이에 의한 서열 변이는 본원에서 서열 레퍼런스를 변형시키는데 사용될 수 있다.
또다른 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 하기 요소를 포함한다: CMV 인핸서/닭 베타 액틴 인핸서 (SEQ ID NO: 23); HIV 성분 gag (SEQ ID NO: 24); HIV 성분 pol (SEQ ID NO: 25); HIV Int (SEQ ID NO: 26); HIV RRE (SEQ ID NO: 27); 및 HIV Rev (SEQ ID NO: 28). 또다른 양태에서, 헬퍼 플라스미드는 gag 및 pol 유전자를 발현하기 위한 제 1 헬퍼 플라스미드, 및 rev 유전자를 발현하기 위한 제 2 및 별개의 플라스미드를 포함하도록 변형될 수 있다. 실시형태에서, 치환, 결실, 부가, 또는 돌연변이에 의한 서열 변이는 본원에서 서열 레퍼런스를 변형시키는데 사용될 수 있다.
또다른 양태에서, 외피 플라스미드는 하기 요소를 포함한다: RNA 폴리머라아제 II 프로모터 (CMV) (SEQ ID NO: 29) 및 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질 (VSV-G) (SEQ ID NO: 30). 실시형태에서, 치환, 결실, 부가, 또는 돌연변이에 의한 서열 변이는 본원에서 서열 레퍼런스를 변형시키는데 사용될 수 있다.
다양한 양태에서, 렌티바이러스 패키징에 사용된 플라스미드는 벡터 기능의 상실 없이 다양한 요소의 치환, 부가, 결실 또는 돌연변이에 의해 변형된다. 예를 들어, 비제한적으로, 하기 요소는 패키징 시스템을 포함하는 플라스미드 내의 유사한 요소를 대체할 수 있다: 신장 인자-1 (EF-1), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 및 유비퀴틴 C (UbC) 프로모터는 CMV 또는 CAG 프로모터를 대체할 수 있다. SV40 poly A 및 bGH poly A 는 토끼 베타 글로빈 poly A 를 대체할 수 있다. 헬퍼 플라스미드 내 HIV 서열은 상이한 HIV 균주 또는 클레이드로부터 구축될 수 있다. VSV-G 당단백질은 HERV-W 를 포함하는 인간 내인성 레트로바이러스, 개코 원숭이 내인성 레트로바이러스 BaEV, 고양이 내인성 바이러스 (RD114), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 광견병 바이러스 (FUG), 림프구성 맥락 뇌막염 바이러스 (LCMV), 인플루엔자 A 조류 흑사병 바이러스 (FPV), 로스 리버 알파바이러스 (RRV), 쥐 백혈병 바이러스 10A1 (MLV) 또는 에볼라 바이러스 (EboV) 로부터의 멤브레인 당단백질로 치환될 수 있다.
다양한 렌티바이러스 패키징 시스템은 상업적으로 구입할 수 있으며 (예를 들어 OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD 로부터의 Lenti-vpak 패키징 키트), 또한 본원에 기재된 바와 같이 디자인될 수 있다. 더욱이, 렌티바이러스 입자의 생성 효율을 포함하여 임의의 수의 관련 인자를 개선하기 위해 렌티바이러스 패키징 시스템의 양태를 치환하거나 변형시키는 것은 당업자의 기술 내에 있다.
또다른 양태에서, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터가 또한 사용될 수 있다. 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV-DJ 혈청형이다. 실시형태에서, AAV 벡터는 혈청형 1-11 중 임의의 혈청형이다. 실시형태에서, AAV 혈청형은 AAV-2 이다. 실시형태에서, AAV 벡터는 인간 간세포의 최적 형질도입을 위해 조작된 비-천연 유형이다.
AAV 벡터 구축. 본 공개의 양태에서, PAH 코딩 서열 (SEQ ID NOs: 1-4) 및 프로트롬빈 인핸서 (SEQ ID NO: 5) 와 hAAT 프로모터 (SEQ ID NO: 6) 를 pAAV 플라스미드 (Cell Biolabs, San Diego, CA) 내로 삽입한다. PAH 코딩 서열과 측면 EcoRI 및 SalI 제한 자리는 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성된다. pAAV 플라스미드 및 PAH 서열을 EcoRI 및 SalI 효소로 소화시키고 함께 결찰시킨다. PAH 서열의 삽입을 서열분석에 의해 확인한다. 다음으로, 프로트롬빈 인핸서 및 hAAT 프로모터와 측면 MluI 및 EcoRI 제한 자리는 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성된다. PAH 코딩 서열 및 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 서열을 함유하는 pAAV 플라스미드를 MluI 및 EcoRI 효소로 소화시키고 함께 결찰시킨다. 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터의 삽입을 서열분석에 의해 확인한다.
나아가, PAH 를 발현시키기 위한 대표적인 AAV 플라스미드 시스템은 AAV 헬퍼 플라스미드, AAV 플라스미드, 및 AAV Rev/Cap 플라스미드를 포함할 수 있다. AAV 헬퍼 플라스미드는 좌측 ITR (SEQ ID NO: 31), 프로트롬빈 인핸서 (SEQ ID NO: 5), 인간 항 알파 트립신 프로모터 (SEQ ID NO: 6), PAH 요소 (SEQ ID NOs: 1-4), PolyA 요소 (SEQ ID NO: 32), 및 우측 ITR (SEQ ID NO: 33) 를 함유할 수 있다. AAV 플라스미드는 적합한 프로모터 요소 (SEQ ID NO: 23 또는 SEQ ID NO: 29), E2A 요소 (SEQ ID NO: 34), E4 요소 (SEQ ID NO: 35), VA RNA 요소 (SEQ ID NO: 36), 및 PolyA 요소 (SEQ ID NO: 32) 를 함유할 수 있다. AAV Rep/Cap 플라스미드는 적합한 프로모터 요소, Rep 요소 (SEQ ID NO: 37), Cap 요소 (SEQ ID NO: 38), 및 PolyA 요소 (SEQ ID NO: 32) 를 함유할 수 있다.
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서 및 PAH 서열을 포함하는 AAV/DJ 플라스미드가 제공된다 (AAV/DJ-Pro-PAH). 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, 인트론, 및 PAH 서열을 포함하는 AAV/DJ 플라스미드가 제공된다 (AAV/DJ-Pro-인트론-PAH). 실시형태에서, 인트론은 인간 베타 글로빈 인트론이다. 실시형태에서, 인트론은 토끼 베타 글로빈 인트론이다. 실시형태에서, GFP 를 포함하는 AAV/DJ 플라스미드가 제공된다 (AAV/DJ-GFP).
실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서 및 PAH 서열을 포함하는 AAV2 플라스미드가 제공된다 (AAV2-Pro-PAH). 실시형태에서, 프로트롬빈 인핸서, 인트론, 및 PAH 서열을 포함하는 AAV2 플라스미드가 제공된다 (AAV2-Pro-인트론-PAH). 실시형태에서, 인트론은 인간 베타 글로빈 인트론이다. 실시형태에서, 인트론은 토끼 베타 글로빈 인트론이다. 실시형태에서, GFP 를 포함하는 AAV2 가 제공된다 (AAV2-GFP).
실시형태에서, 본원에서 개시되는 임의의 AAV 벡터는 조절 RNA 를 발현하는 서열을 함유할 수 있다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 lncRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 microRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 piRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 shRNA 이다. 실시형태에서, 조절 RNA 는 SEQ ID NOs: 13 또는 14 와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 또는 그보다 높은 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 작은 RNA 서열이다.
AAV 입자의 생산. AAV-PAH 플라스미드는 플라스미드 pAAV-RC2 (Cell Biolabs) 및 pHelper (Cell Biolabs) 와 조합된다. pAAV-RC2 플라스미드는 Rep 및 AAV-2 캡시드 유전자를 함유하고, pHelper 는 아데노바이러스 E2A, E4, 및 VA 유전자를 함유한다. AAV 캡시드는 또한 AAV-8 (SEQ ID NO: 39) 또는 AAV-DJ (SEQ ID NO: 40) 서열로 이루어질 수 있다. AAV 입자를 생산하기 위해서, 이들 플라스미드는 1:1:1 (pAAV-PAH: pAAV-RC2: pHelper) 비로 293T 세포 내로 트랜스펙션된다. 150 ㎜ 디쉬 (BD Falcon) 에서 세포의 트랜스펙션을 위해, 10 ㎍ 의 각각의 플라스미드를 1 ㎖ 의 DMEM 중에 함께 첨가한다. 또다른 튜브에서, 60 ㎕ 의 트랜스펙션 시약 PEI (1 ㎍/㎖) (Polysciences) 를 1 ㎖ 의 DMEM 에 첨가한다. 2 개의 튜브를 함께 혼합하여 15 분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, 트랜스펙션 혼합물을 세포에 첨가하고, 세포를 3 일 후 수집한다. 세포를 드라이 아이스/이소프로판올 중 동결/해동 용해 (lysis) 에 의해 용해한다. 벤조나아제 뉴클레아제 (Sigma) 를 37℃ 에서 30 분 동안 세포 용해물에 첨가한다. 그런 다음, 세포 용해물을 4℃ 에서 15 분 동안 12,000 rpm 에서 원심분리에 의해 펠렛한다. 상청액을 수집한 다음, 표적 세포에 첨가한다.
투약량 및 투약 형태
개시된 벡터 시스템은 개시된 벡터의 에피솜 유지 및 관심 유전자 또는 서열의 단기간, 중간 기간 또는 장기간 발현을 가능하게 한다. 따라서, 용량 용법은 치료되는 병상 및 투여 방법을 기반으로 가변적일 수 있다.
실시형태에서, 벡터 조성물은 가변적 용량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특히, 대상체는 약 ≥ 106 감염 용량 (여기서 1 용량이 1 표적 세포를 형질도입시키는데 평균적으로 필요함) 이 투여될 수 있다. 보다 특히, 대상체는 약 ≥ 107, 약 ≥ 108, 약 ≥ 109, 약 ≥ 1010, 약 ≥ 1011, 또는 약 ≥ 1012 감염 용량/체중 ㎏, 또는 이들 값 사이의 임의 수의 용량을 투여받을 수 있다. 용량의 상한치는 각각의 질환 징후에 대해 결정될 것이며, 각각의 개별 제품 또는 제품 로트에 대한 독성/안전성 프로파일에 따라 좌우될 것이다.
부가적으로, 본 공개의 벡터 조성물은 1 일 1 회 또는 2 회와 같이 주기적으로, 또는 임의의 다른 적합한 시간으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 벡터 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 1 주에 1 회, 2 주에 1 회, 3 주에 1 회, 1 개월에 1 회, 2 개월마다, 3 개월마다, 6 개월마다, 9 개월마다, 1 년에 1 회, 18 개월마다, 2 년마다, 30 개월마다, 또는 3 년마다 투여될 수 있다.
실시형태에서, 개시된 벡터 조성물은 약학적 조성물로서 투여된다. 실시형태에서, 약학적 조성물은 임상 적용을 위한 코, 폐, 경구, 국소 또는 비경구 투약 형태를 비제한적으로 포함하는 광범위한 투약 형태로 제형화될 수 있다. 각각의 투약 형태는 다양한 가용화제, 붕해제, 계면활성제, 충전제, 증점제, 결합제, 희석제 예컨대 습윤제 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 또한 주입, 흡입, 주입 또는 피내 노출을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 주입가능 제형은 적합한 pH 및 등장성에서 수성 또는 비-수성 용액 중에 개시된 벡터를 포함할 수 있다.
개시된 벡터 조성물은 대상체에게 유도 주입으로 간 내로 직접 주입을 통해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 동맥 또는 정맥 순환을 통해 전신 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터 조성물은 유도 삽관을 통해 비장 또는 췌장을 포함하는 간을 바로 둘러싼 조직에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터 조성물은 문맥 또는 문맥동 내로 주입에 의해 전달될 수 있고, 탯줄 정맥 내로 주입에 의해 전달될 수 있다.
개시된 벡터 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 방법, 예컨대 비내, 구강, 설하, 경구, 직장, 안구, 비경구 (정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내), 폐, 질내, 국부 투여, 국소 투여, 난절 이후 국소 투여, 점막 투여를 사용하여, 에어로졸을 통해, 반고체 매질 예컨대 아가로오스 또는 젤라틴에서, 또는 구강 또는 코 스프레이 제형을 통해 투여될 수 있다.
또한, 개시된 벡터 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 투약 형태, 예컨대 고체 투약 형태, 정제, 알약, 로젠지, 캡슐, 액체 분산액, 겔, 에어로졸, 폐 에어로졸, 코 에어로졸, 연고, 크림, 반고체 투약 형태, 용액, 에멀젼 및 현탁액으로 제형화될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 제어 방출 제형, 지속 방출 제형, 즉시 방출 제형 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 경피 전달 시스템일 수 있다.
실시형태에서, 약학적 조성물은 경구 투여용 고체 투약 형태로 제형화될 수 있고, 고체 투약 형태는 분말, 과립, 캡슐, 정제 또는 알약일 수 있다. 실시형태에서, 고체 투약 형태는 하나 이상의 부형제 예컨대 칼슘 카르보네이트, 전분, 수크로오스, 락토오스, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴을 포함할 수 있다. 또한, 고체 투약 형태는 부형제에 추가로, 윤활제 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 경구 투약 형태는 즉시 방출 또는 변형 방출 형태일 수 있다. 변형 방출 투약 형태는 제어 또는 연장 방출, 장 방출 등을 포함한다. 변형 방출 투약 형태에서 사용되는 부형제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
실시형태에서, 약학적 조성물은 설하 또는 구강 투약 형태로서 제형화될 수 있다. 이러한 투약 형태는 혀 아래에 투여되는 설하 정제 또는 용액 조성물 및 뺨과 잇몸 사이에 놓여지는 구강 정제를 포함한다.
실시형태에서, 약학적 조성물은 코 투약 형태로서 제형화될 수 있다. 본 공개의 이러한 투약 형태는 코 전달을 위한 용액, 현탁액 및 겔 조성물을 포함한다.
실시형태에서, 약학적 조성물은 경구 투여용 액체 투약 형태, 예컨대 현탁액, 에멀젼 또는 시럽으로 제형화될 수 있다. 실시형태에서, 액체 투약 형태는 통용되는 단순한 희석제 예컨대 물 및 액체 파라핀에 추가로, 다양한 부형제 예컨대 보습제, 감미제, 방향제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 조성물은 소아과 환자에게 투여하기 적합하도록 제형화될 수 있다.
실시형태에서, 약학적 조성물은 비경구 투여용 투약 형태, 예컨대 멸균 수용액, 현탁액, 에멀젼, 비-수용액 또는 좌제로 제형화될 수 있다. 실시형태에서, 용액 또는 현탁액은 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일 또는 주입가능 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함할 수 있다.
약학적 조성물의 투약량은 환자의 체중, 연령, 성별, 투여 시기 및 방식, 배설률, 및 질환의 중증도에 따라 가변적일 수 있다.
실시형태에서, PKU 의 치료는 바늘, 또는 혈관내 삽관을 사용하여 간 내로 개시된 벡터 구축물의 유도 직접 주입에 의해 달성된다. 실시형태에서, 벡터 조성물은 정맥 또는 동맥 삽관 또는 주입, 피내 전달, 근육내 전달 또는 간 근처의 배수 기관 내로의 주입에 의해 뇌척수액, 혈액 또는 림프 순환에 투여된다.
하기 실시예는 본 발명의 양태를 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에서 기재되는 특정 조건또는 세부사항에 제한되지 않는다고 이해될 것이다. 본원에서 참조하는 모든 인쇄된 공개물은 명확하게 참조로 통합된다.
실시예
실시예 1. 렌티바이러스 벡터 시스템의 개발
렌티바이러스 벡터 시스템을 도 1 (원형화된 형태) 에서 요약한 바와 같이 개발했다. 렌티바이러스 입자를 293T/17 HEK 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 로부터 구입) 에서 생성시킨 후, 치료적 벡터, 외피 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드로 트랜스펙션했다. 기능적 바이러스 입자를 생성한 293T/17 HEK 세포의 트랜스펙션에는 시약 폴리(에틸렌이민) (PEI) 을 이용하여 플라스미드 DNA 흡수 효율을 증가시켰다. 플라스미드 및 DNA 를 초기에 3:1 의 비 (PEI 대 DNA 의 질량비) 로, 혈청 없는 배양 배지에서 별도로 첨가했다. 2-3 일 후, 세포 배지를 수집하고 렌티바이러스 입자를 고속 원심분리 및/또는 여과에 의해 정제한 후, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. 렌티바이러스 입자의 농도는 형질도입 단위/㎖ (TU/㎖) 로 표현될 수 있다. TU 의 결정은 배양액 (p24 단백질이 렌티바이러스 입자에 통합됨) 중 HIV p24 수준을 측정함으로써, 정량 PCR 에 의해 형질도입된 세포 당 바이러스 DNA 카피수를 측정함으로써, 또는 세포를 감염시키고 광을 사용하여 (벡터가 루시퍼라아제 또는 형광 단백질 마커를 인코딩하는 경우) 달성되었다.
상기 언급한 바와 같이, 3-벡터 시스템 (즉, 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함함) 은 렌티바이러스 입자의 생성을 위해 디자인되었다. 3-벡터 시스템의 개략도를 도 1 에 나타낸다. 간략하게, 도 1 을 참조하면, 최상부 벡터는 헬퍼 플라스미드이며, 이러한 경우, 이는 Rev 를 포함한다. 도 1 의 중앙에 나타나는 벡터는 외피 플라스미드이다. 최하부 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 치료용 벡터이다.
도 1 을 참조하면, 헬퍼 + Rev 플라스미드는 CMV 인핸서와 닭 베타 액틴 프로모터 (SEQ ID NO: 23); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 41); HIV Gag (SEQ ID NO: 24); HIV Pol (SEQ ID NO: 25); HIV 인테그라아제 (SEQ ID NO: 26); HIV RRE (SEQ ID NO: 27); HIV Rev (SEQ ID NO: 28); 및 토끼 베타 글로빈 poly A (SEQ ID NO: 42) 를 포함한다.
외피 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 29); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 7 또는 8); VSV-G 외피 당단백질 (SEQ ID NO: 30); 및 토끼 베타 글로빈 poly A (SEQ ID NO: 42) 를 포함한다.
헬퍼 (+ Rev) 및 외피 플라스미드로 이루어지는 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함하는 3-벡터 시스템의 합성이 개시되어 있다.
물질 및 방법:
헬퍼 플라스미드의 구축: Gag, Pol, 및 인테그라아제 유전자를 함유하는 pNL4-3 HIV 플라스미드 (NIH Aids Reagent Program) 로부터 DNA 단편의 초기 PCR 증폭에 의해 헬퍼 플라스미드를 구축했다. 프라이머는, pCDNA3 플라스미드 (Invitrogen) 에서의 동일한 자리에 삽입하는데 사용될 수 있는 EcoRI 및 NotI 제한 자리가 있는 단편을 증폭하도록 디자인되었다. 정방향 프라이머는 (5'-TAAGCAGAATTCATGAATTTGCCAGGAAGAT-3') (SEQ ID NO: 43) 이었고, 역방향 프라이머는 (5'-CCATACAATGAATGGACACTAGGCGGCCGCACGAAT-3') (SEQ ID NO: 44) 이었다.
Gag, Pol, 인테그라아제 단편에 대한 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
다음으로, RRE, Rev, 및 토끼 베타 글로빈 poly A 서열과 XbaI 및 XmaI 측면 (flanking) 제한 자리를 함유하는 DNA 단편은 Eurofins Genomics 에 의해 합성되었다. DNA 단편을 그 후 플라스미드 내로 XbaI 및 XmaI 제한 자리에서 삽입했다. DNA 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00009
Figure pct00010
마지막으로, pCDNA3.1 의 CMV 프로모터를 CAG 프로모터 (CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터 + 닭 베타 액틴 인트론 서열) 로 대체했다. CAG 인핸서/프로모터/인트론 서열과 MluI 및 EcoRI 측면 제한 자리를 함유하는 DNA 단편은 Eurofins Genomics 에 의해 합성되었다. DNA 단편을 그 후 플라스미드 내로 MluI 및 EcoRI 제한 자리에서 삽입했다. DNA 서열 다음과 같았다:
Figure pct00011
Figure pct00012
VSV-G 외피 플라스미드의 구축:
수포성 구내염 인디아나 바이러스 당단백질 (VSV-G) 서열과 측면 EcoRI 제한 자리는 Eurofins Genomics 에 의해 합성되었다. DNA 단편을 그 후 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen) 내로 EcoRI 제한 자리에서 삽입하고, CMV 특이적 프라이머를 사용하여 서열분석에 의해 올바른 배향을 확인했다.
DNA 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00013
Figure pct00014
3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함하는 4-벡터 시스템을 또한 본원에서 기재되는 방법 및 물질을 사용하여 디자인 및 생산했다. 4-벡터 시스템의 도해가 도 2 에서 보여진다. 간략히, 도 2 를 참조하면, 최상부 벡터는 헬퍼 플라스미드이며, 이는, 이 경우에, Rev 를 포함하지 않는다. 제 2 벡터는 별개의 Rev 플라스미드이다. 제 3 벡터는 외피 플라스미드이다. 최하부 벡터는 본원에서 기재되는 치료적 벡터이다.
도 2 를 참조하면, 헬퍼 플라스미드는 CMV 인핸서 및 닭 베타 액틴 프로모터 (SEQ ID NO: 23); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 41); HIV Gag (SEQ ID NO: 24); HIV Pol (SEQ ID NO: 25); HIV 인테그라아제 (SEQ ID NO: 26); HIV RRE (SEQ ID NO: 27); 및 토끼 베타 글로빈 poly A (SEQ ID NO: 42) 를 포함한다.
Rev 플라스미드는 RSV 프로모터 및 HIV Rev (SEQ ID NO: 48); 및 토끼 베타 글로빈 poly A (SEQ ID NO: 42) 를 포함한다.
외피 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 29); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 7 또는 8); VSV-G 외피 당단백질 (SEQ ID NO: 30); 및 토끼 베타 글로빈 poly A (SEQ ID NO: 42) 를 포함한다.
하나의 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 A 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 B 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 C 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 D 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 E 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 F 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 G 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다. 또다른 양태에서, PAH 를 발현하는 치료적 렌티바이러스 벡터는 도 3 의 벡터 H 에서 보여지는 요소 전부를 포함한다.
헬퍼, Rev, 및 외피 플라스미드로 이루어지는 3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템을 포함하는 4-벡터 시스템의 합성이 개시되어 있다.
물질 및 방법:
Rev 가 없는 헬퍼 플라스미드의 구축:
RRE 및 토끼 베타 글로빈 poly A 서열을 함유하는 DNA 단편을 삽입하여, Rev 가 없는 헬퍼 플라스미드를 구축했다. 이 서열과 측면 XbaI 및 XmaI 제한 자리는 Eurofins Genomics 에 의해 합성되었다. RRE/토끼 poly A 베타 글로빈 서열을 그 후 헬퍼 플라스미드 내로 XbaI 및 XmaI 제한 자리에서 삽입했다.
DNA 서열은 다음과 같다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Rev 플라스미드의 구축:
RSV 프로모터 및 HIV Rev 서열은 단일 DNA 단편으로서 측면 MfeI 및 XbaI 제한 자리와 Eurofins Genomics 에 의해 합성되었다. DNA 단편을 그 후 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen) 내로 MfeI 및 XbaI 제한 자리에서 삽입했으며, CMV 프로모터는 RSV 프로모터로 대체되어 있다. DNA 서열 다음과 같았다:
Figure pct00017
Figure pct00018
패키징 시스템에서 사용되는 플라스미드는 유사한 요소로 변형될 수 있고, 인트론 서열은 벡터 기능의 상실 없이 잠재적으로 제거될 수 있다. 예를 들어, 하기 요소는 패키징 시스템에서 유사한 요소를 대체할 수 있다:
프로모터: 신장 인자-1 (EF-1) (SEQ ID NO: 49), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) (SEQ ID NO: 50), 및 유비퀴틴 C (UbC) (SEQ ID NO: 51) 는 CMV (SEQ ID NO: 29) 또는 CMV 인핸서/닭 베타 액틴 프로모터 (SEQ ID NO: 23) 를 대체할 수 있다. 이들 서열은 또한 부가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 추가로 달라질 수 있다.
Poly A 서열: SV40 poly A (SEQ ID NO: 52) 및 bGH poly A (SEQ ID NO: 53) 는 토끼 베타 글로빈 poly A (SEQ ID NO: 42) 를 대체할 수 있다. 이들 서열은 또한 부가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 추가로 달라질 수 있다.
HIV Gag, Pol, 및 인테그라아제 서열: 헬퍼 플라스미드에서의 HIV 서열은 상이한 HIV 균주 또는 클레이드로부터 구축될 수 있다. 예를 들어, Bal 균주으로부터의 HIV Gag (SEQ ID NO: 24); HIV Pol (SEQ ID NO: 25); 및 HIV Int (SEQ ID NO: 26) 는 본원에서 개요서술되는 헬퍼/헬퍼 + Rev 플라스미드에 함유된 gag, pol, 및 int 서열과 상호교환될 수 있다. 이들 서열은 또한 부가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 추가로 달라질 수 있다.
외피: VSV-G 당단백질은 고양이 내인성 바이러스 (RD114) (SEQ ID NO: 54), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) (SEQ ID NO: 55), 광견병 바이러스 (FUG) (SEQ ID NO: 56), 림프구성 맥락 뇌막염 바이러스 (LCMV) (SEQ ID NO: 57), 인플루엔자 A 조류 흑사병 바이러스 (FPV) (SEQ ID NO: 58), 로스 리버 알파바이러스 (RRV) (SEQ ID NO: 59), 쥐 백혈병 바이러스 10A1 (MLV) (SEQ ID NO: 60), 또는 에볼라 바이러스 (EboV) (SEQ ID NO: 61) 로부터의 막 당단백질로 치환될 수 있다. 이들 외피에 관한 서열은 본원에서 서열 부분에서 식별된다. 추가로, 이들 서열은 또한 부가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 추가로 달라질 수 있다.
요약하면, 3-벡터 vs. 4-벡터 시스템이 비교될 수 있고, 다음과 같이 대비될 수 있다. 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 다음을 포함한다: 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 인테그라아제, RRE, 및 Rev; 2. 외피 플라스미드: VSV-G 외피; 및 3. 치료적 벡터: RSV, 5'LTR, Psi 패키징 신호, RRE, cPPT, 프로트롬빈 인핸서, 알파 1 항-트립신 프로모터, 페닐알라닌 히드록실라아제, WPRE, 및 3'델타 LTR. 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 다음을 포함한다: 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 인테그라아제, 및 RRE; 2. Rev 플라스미드: Rev; 3. 외피 플라스미드: VSV-G 외피; 및 4. 치료적 벡터: RSV, 5'LTR, Psi 패키징 신호, RRE, cPPT, 프로트롬빈 인핸서, 알파 1 항-트립신 프로모터, 페닐알라닌 히드록실라아제, WPRE, 및 3'델타 LTR. 상기 요소에 상응하는 서열은 본원에서 서열 목록 부분에서 식별된다.
실시예 2. 치료적 벡터
예시적 치료적 벡터를, 예를 들어, 도 3 에서 보여지는 바와 같이 디자인 및 개발했다.
첫째로 도 3 의 벡터 A 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
다음으로 도 3 의 벡터 B 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1 (간세포 핵 인자) 결합 자리, hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
다음으로 도 3 의 벡터 C 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1/4 (간세포 핵 인자) 결합 자리, hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
다음으로 도 3 의 벡터 D 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서, HNF1 (간세포 핵 인자), hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
다음으로 도 3 의 벡터 E 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서, HNF1/4 (간세포 핵 인자), hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
다음으로 도 3 의 벡터 F 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 다섯 개의 HNF1 (간세포 핵 인자) 결합 자리, hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
다음으로 도 3 의 벡터 G 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 세 개의 HNF1/HNF4 (간세포 핵 인자) 결합 자리, hAAT 프로모터, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
첫째로 도 3 의 벡터 H 를 참조하면, 좌측에서 우측으로, 핵심 유전적 요소는 다음과 같다: 하이브리드 5' 장 말단 반복부 (RSV/LTR), Psi 서열 (RNA 패키징 자리), RRE (Rev-응답 요소), cPPT (폴리퓨린 구역), 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 토끼 베타 글로빈 인트론, 본원에서 상세히 기재되는, PAH 서열 및 그의 변이체를 포함하는 PAH 서열, 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE), 및 U3 영역에 결실이 있는 LTR.
도 3 에 일반적으로 나타낸 벡터를 생산하기 위해서, 본원에서 기재되는 바와 같고 그 외에는 당업자에게 이해되는 바와 같은 방법 및 물질을 이용했다.
저해성 RNA 디자인: 호모 사피엔스 (Homo sapiens) 페닐알라닌 히드록실라아제 (PAH) (NM_000277.1) mRNA 의 서열을 사용하여 인간 세포에서 PAH 수준을 녹다운시키는 잠재적 shRNA 후보에 대해 검색했다. 잠재적 RNA shRNA 서열을 siRNA 또는 shRNA 디자인 프로그램에 의해 선별된 후보로부터 예컨대 Broad Institute (portals.broadinstitute.org/gpp/public/) 에 의해 관리되는 GPP 웹 포털 또는 Thermo Scientific (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) 의 BLOCK-iT RNAi Designer 로부터 선택했다. 개별 선별된 shRNA 서열을 렌티바이러스 벡터 내로 shRNA 발현을 조절하기 위한 RNA 폴리머라아제 III 프로모터 H1 (SEQ ID NO: 22) 의 바로 3 프라임에 삽입했다. 이들 렌티바이러스 shRNA 구축물을 사용하여 세포를 형질도입하고 특이적 mRNA 수준의 변화를 측정했다.
벡터 구축: PAH shRNA 에 관해, BamHI 및 EcoRI 제한 자리를 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열을 Eurofins MWG Operon 에 의해 합성했다. 중첩하는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 혼합하고 70 ℃ 로부터 실온으로의 냉각 동안 어닐링했다. 렌티바이러스 벡터를 제한 효소 BamHI 및 EcoRI 로 1 시간 동안 37 ℃ 에서 소화시켰다. 소화된 렌티바이러스 벡터를 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, ThermoFisher 로부터의 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 추출했다. DNA 농도를 확인하고, 벡터 대 올리고 (3:1 비) 를 혼합하고, 어닐링되게 두고, 결찰시켰다. 결찰 반응을 T4 DNA 리가아제로 30 분 동안 실온에서 수행했다. 2.5 ㎕ 의 결찰 믹스를 25 ㎕ 의 STBL3 적격 박테리아 세포에 첨가했다. 형질전환을 42 ℃ 에서 열충격 후에 수행했다. 박테리아 세포를 암피실린을 함유하는 아가 플레이트 상에 스프레딩하고, 약물-내성 콜로니 (암피실린-내성 플라스미드의 존재를 시사함) 를 회수하고, LB 브로쓰에서 증식시켰다. 올리고 서열의 삽입을 체크하기 위해서, 수확된 박테리아 배양물로부터 Thermo Scientific DNA 미니 프렙 키트로 플라스미드 DNA 를 추출했다. shRNA 발현을 조절하기 위해 사용되는 프로모터에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 렌티바이러스 벡터 내의 shRNA 서열의 삽입을 확인했다. 하기 표적 서열을 사용하여, 예시적 shRNA 서열이 PAH 를 녹다운시키는지를 확인했다.
PAH shRNA 서열 #1:
Figure pct00019
PAH shRNA 서열 #2:
Figure pct00020
실시예 3. 간- 특이적 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터
Hepa1-6 마우스 간종양 세포를 간-특이적 프로트롬빈 인핸서 (SEQ ID NO: 5), 및 인간 알파-1 항-트립신 프로모터 (SEQ ID NO: 6) 를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입했다. 결과로서 얻어지는 DNA 서열은 다음과 같다:
Figure pct00021
Figure pct00022
이들 감염에 관한 결과는 본원에서 추가의 실시예에서 상세히 기재된다.
실시예 4. hAAT 프로모터와 프로트롬빈 인핸서 및 간세포 핵 인자 (HNF) 결합 자리
Hepa1-6 마우스 간종양 세포를 간-특이적 프로트롬빈 인핸서 (SEQ ID NO: 5), 인간 알파-1 항-트립신 프로모터 (SEQ ID NO: 6), 및 하나 이상의 간세포 핵 인자 (HNF) 결합 자리를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입했다. 다섯 개의 HNF1 결합 자리 (밑줄진 서체로 표시됨) 를 포함하는 결과적인 DNA 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00023
세 개의 HNF1/HNF4 결합 자리 (HNF1 밑줄진 서체로 표시됨; HNF4 굵은 서체로 표시됨) 를 포함하는 결과적인 DNA 서열은 다음과 같다:
Figure pct00024
이들 벡터로부터의 PAH 의 발현은 본원의 추가의 실시예에서 상세히 기술된다.
실시예 5. PAH 에 관한 물질 및 방법
호모 사피엔스 (Homo sapiens) 페닐알라닌 히드록실라아제 (hPAH) mRNA (Gen Bank: NM_000277.1) 의 서열을 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 유전자의 원위 및 근위 말단에 위치하는 EcoRI 및 SalI 제한 효소 자리로 화학적으로 합성했다. EcoRI 및 SalI 제한 효소로 처리된 hPAH 를 ApoE (NM_000001.11, U35114.1) 또는 프로트롬빈 (AF478696.1) 및 hAAT (HG98385.1) 좌위 제어 영역의 부분을 포함하는 하이브리드 프로모터의 제어 하에 pCDH 렌티바이러스 플라스미드 (System Biosciences, Palo Alto, CA) 내로 결찰시켰다. 부가적으로, 3' 미번역 영역 (UTR) 의 289 개 뉴클레오티드를 포함하는 인간 PAH 를 합성했다.
렌티바이러스 벡터 및 hPAH 서열을 제한 효소 BamHI 및 EcoRI (NEB, Ipswich, MA) 로 두 시간 동안 37 ℃ 에서 소화시켰다. 소화된 렌티바이러스 벡터를 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, ThermoFisher (Waltham, MA) 로부터의 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 추출했다. DNA 농도를 확인하고, 그 후 3:1 의 인서트 대 벡터 비를 사용하여 PAH 서열 (hPAH) 와 혼합했다. 혼합물을 T4 DNA 리가아제 (NEB) 로 30 분 동안 실온에서 결찰시켰다. 2.5 ㎕ 의 결찰 믹스를 25 ㎕ 의 STBL3 적격 박테리아 세포 (ThermoFisher) 에 첨가했다. 형질전환을 열충격에 의해 42 ℃ 에서 수행했다. 박테리아 세포를 암피실린을 함유하는 아가 플레이트 상에 스트리킹하고, 그 후 콜로니를 LB 브로쓰에서 증식시켰다. PAH 서열의 삽입을 체크하기 위해서, 수확된 박테리아 배양물로부터 ThermoFisher DNA 미니 프렙 키트로 플라스미드 DNA 를 추출했다. 렌티바이러스 벡터 (LV) 내의 PAH 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 다음으로, ClaI 및 EcoRI 제한 자리가 있는 ApoE 인핸서/hAAT 프로모터 또는 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 서열은 Eurofins Genomics 에 의해 합성되었다. PAH 코딩 서열 및 하이브리드 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 ClaI 및 EcoRI 효소로 소화시키고, 함께 결찰시켰다. 하이브리드 프로모터를 함유하는 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인했다. hPAH 및 하이브리드 프로모터 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 그 후 사용하여, 형질도입된 세포에서 PAH 를 발현하는 능력에 관해 시험하기 위해서 렌티바이러스 입자를 포장했다. 포유동물 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입했다. 3 일 후에 세포를 수집하고, 단백질을 면역블롯에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다.
hPAH 서열의 변형:
ApoE 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 조절되는 세포 발현 수준을 개선하기 위해 hPAH 서열의 여러 변형을 통합시켰다. 첫째로, hPAH 3' 미번역 영역 (UTR) 의 289 개 뉴클레오티드를 PAH 코딩 영역 후에 및 mRNA 말단 전에 삽입했다. 이는 LV-ApoE/hAAT-hPAH-UTR 를 생성했다.
다음으로, 간-특이적 ApoE 인핸서를 간-특이적 프로트롬빈 인핸서로 교환했다. PAH 의 발현을 ApoE 또는 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 조합과 hPAH 코딩 서열 및 UTR 의 289 개 뉴클레오티드로 분석했다. 다음으로, PAH 의 발현을 UTR 영역의 부재 하에 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 hPAH 코딩 서열로 평가했다. 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터의 조합은 ApoE 인핸서/hAAT 프로모터 조합에서는 요구되었던 UTR 영역의 필요를 제거했다. 그러므로, 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 조합은 UTR 영역의 요구 없이 간-특이적 방식으로 높은 수준의 PAH 발현을 조절할 수 있다. 이러한 hPAH 유전자를 조절하는 간-특이적 조절 요소에 대한 이해의 중요한 진전은 간 조직에서의 특이적 발현을 위한 구축물의 생성을 허용하는 한편 여전히 hPAH 의 높은 수준 생산을 달성한다. 이식유전자 발현을 간 세포로 제한하는 것은 페닐케톤뇨증을 위한 유전 의약에서 벡터 안전성 및 표적 특이성을 위한 중요한 고려이다.
실시예 6. Hepa1-6 세포 및 293T 세포에서 프로트롬빈 인핸서의 변이의 존재 하에 및 3' UTR 영역의 존재 또는 부재 하에 hPAH 의 렌티바이러스-전달되는 발현
이 실시예는 ApoE 인핸서와 비교하여 프로트롬빈 인핸서와의 조합으로 hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 Hepa1-6 암종 세포 및 293T 인간 배아 신장 세포에서 인간 PAH 의 발현이 증가된다는 것을 보여주며, 이는 도 4A 및 4B 각각에서 보여지는 바와 같다. 프로트롬빈 인핸서가 hAAT 프로모터와 조합될 때 3' UTR 은 hPAH 발현에 요구되지 않는다. 3' UTR 은 프로트롬빈 함유 벡터에서 PAH 발현을 실제로 감소시키며, 이는 도 4A 및 4B 각각에서 보여지는 바와 같다. 이 실시예는 또한 프로트롬빈 인핸서와의 조합으로 간세포 핵 인자 1 및 4 (HNF1/4) 결합 자리를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 Hepa1-6 세포 및 293T 세포에서 PAH 단백질의 수준을 증가시킨다는 것을 보여주며, 이는 도 4A 및 4B 각각에서 보여지는 바와 같다.
인간 PAH, 프로트롬빈 및 ApoE 인핸서, 및 hAAT 프로모터를 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 또는 293T 인간 배아 신장 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 유전자를 그것의 3' UTR 의 존재 또는 부재 하에 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 간 특이적 프로트롬빈 또는 ApoE 인핸서를 함유하는 hAAT 프로모터에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 3 일 후에 단백질을 면역블롯에 의해 hPAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 의 상대 발현을 항-PAH 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 를 사용하여 면역블롯에 의해 검출하고, 항-베타 액틴 항체 (SigmaMillipore, Billerica, MA) 를 로딩 대조군에 사용했다.
도 4A 및 4B 에서 보여지는 바와 같이, 여섯 개의 군이 비교된다: Hepa 1-6 세포 또는 293T 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 있는 5X HNF1 결합 자리를 함유하는 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3), 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 3X HNF1 및 3X HNF4 결합 자리를 함유하는 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 3' UTR 의 존재 하에 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 5), 및 ApoE 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 3' UTR 의 존재 하에 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 6). 도 4A 및 4B 는 ApoE 인핸서와 비교하여 프로트롬빈 인핸서가 hAAT 프로모터와 조합될 때 Hepa1-6 암종 세포 및 293T 세포 둘 모두에서 PAH 의 발현이 증가된다는 것을 입증한다. 부가적으로, 프로트롬빈 인핸서가 벡터에 포함될 때 PAH 3' UTR 가 hPAH 발현에 요구되지 않는다.
실시예 7. Hepa1-6 세포에서 인트론 서열, 코돈 최적화된 PAH 서열, 및 HNF-1 또는 HNF1/4 결합 자리를 함유하는 프로트롬빈 인핸서에 의한 hPAH 의 렌티바이러스-전달되는 발현
이 실시예는 프로트롬빈 인핸서 및 토끼 베타 글로빈 인트론 서열과의 조합으로 hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 의해 Hepa1-6 암종 세포에서 인간 PAH 의 발현이 증가된다는 것을 보여주며, 이는 도 5A 에서 보여지는 바와 같다. 인트론 서열이 역방향으로 삽입되어 있을 때 hPAH 는 발현되지 않는다. 도 5B 에서, 이는 코돈-최적화된 버전의 hPAH 코딩 서열이 비-최적화된 hPAH 코딩 영역 서열보다 더 적게 발현된다는 것을 보여준다. 이 실시예는 또한 프로트롬빈 인핸서와의 조합으로 간세포 핵 인자-1 및 -4 (HNF1 및 HNF1/4) 결합 자리를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 Hepa1-6 세포에서 hPAH 단백질의 수준을 증가시킨다는 것을 보여주며, 이는 도 5C 에서 보여지는 바와 같다.
인간 PAH (최적화된 및 비-최적화된), 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 토끼 베타 글로빈 서열을 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 유전자를 토끼 베타 글로빈 인트론의 존재 또는 부재 하에 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 프로트롬빈 인핸서의 업스트림 또는 다운스트림에 HNF1 또는 HNF1/4 결합 자리의 존재 하에 간-특이적 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 hAAT 프로모터에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 3 일 후에 단백질을 면역블롯에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 의 상대 발현을 항-PAH 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 를 사용하여 면역블롯에 의해 검출하고, 항-베타 액틴 항체 (SigmaMillipore, Billerica, MA) 를 로딩 대조군에 사용했다.
도 5A 에서 보여지는 바와 같이, 네 개의 군이 비교된다: Hepa 1-6 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하고 정방향으로 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3), 및 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하고 역방향으로 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4). 도 5B 에서 보여지는 바와 같이, 세 개의 군이 비교된다: Hepa 1-6 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 오직 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2 및 3), 및 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코돈-최적화된 서열을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4). 도 5C 에서 보여지는 바와 같이, 여섯 개의 군이 비교된다: Hepa 1-6 세포 단독을 포함하는 대조군 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 오직 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2 및 3), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하고 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 5), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 다운스트림에 HNF1 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 6), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1/4 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 7), 및 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 다운스트림에 HNF1/4 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 8). 도 5A-5C 는 토끼 베타 글로빈 인트론 서열이 hPAH 코딩 서열의 업스트림에 첨가되었을 때 Hepa1-6 암종 세포에서 hPAH 의 발현이 증가된다는 것을 입증한다. 부가적으로, 코돈-최적화된 hPAH 코딩 서열은 비-최적화된 서열보다 더 적게 발현된다. 마지막으로, 오직 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터와 비교하여, 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1 또는 HNF1/4 결합 자리의 부가는 hPAH 의 발현을 증가시키지만 프로트롬빈 인핸서의 다운스트림에 HNF1 또는 HNF1/4 결합 자리의 부가는 hPAH 의 발현을 증가시키지 않는다.
실시예 8. Hepa1-6 세포에서 hAAT 프로모터 및 HNF-1 및 HNF-1/4 결합 자리를 함유하는 프로트롬빈 인핸서에 의한 hPAH 의 렌티바이러스-전달되는 발현 RNA
도 6 에서 보여지는 바와 같이, 이 실시예는 프로트롬빈 인핸서 및 HNF1 및 HNF1/4 에 대한 결합 자리와의 조합으로 hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 감염 다중도 (MOI) 1 및 5 로 형질도입된 Hepa1-6 암종 세포에서 인간 PAH RNA 의 발현이 증가된다는 것을 보여준다.
인간 PAH, 프로트롬빈 인핸서, 및 hAAT 프로모터를 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 유전자를 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 HNF1 또는 HNF1/4 결합 자리의 업스트림에 간-특이적 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 hAAT 프로모터에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 3 일 후에 RNA 를 RNeasy 키트 (Qiagen, Germantown, MD) 로 추출하고, TaqMan 프로브 (5'-TCGTGAAAGCTCATGGACAGTGGC-3') (SEQ ID NO: 66) 및 프라이머 세트 Fwd: 5'- AGATCTTGAGGCATGACATTGG-3' (SEQ ID NO: 67) 및 Rev: 5'-GTCCAGCTCTTGAATGGTTCTT-3' (SEQ ID NO: 68) 를 이용하여 qPCR 분석에 의해 hPAH 에 관해 분석했다. 총 RNA (100 ng) 를 액틴 프로브 (5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3') (SEQ ID NO: 69) 및 프라이머 세트 (Fwd: 5'-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3' (SEQ ID NO: 70) 및 Rev: 5'- CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3') (SEQ ID NO: 71) 로 정규화시켰다.
도 6 에서 보여지는 바와 같이, 네 개의 군이 비교된다: Hepa 1-6 세포 단독을 포함하는 대조군 (막대 1), 1 MOI (막대 2) 및 5 MOI (막대 5) 에서 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터, MOI (막대 3) 및 5 MOI (막대 6) 에서 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터, 및 1 MOI (막대 4) 및 5 MOI (막대 7) 에서 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 HNF1/4 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터. 도 6 은 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 벡터로 PAH RNA 의 발현이 1 내지 4.7 pg (1-5 MOI) 로 증가된다는 것을 입증한다. HNF1 결합 자리가 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 포함되어 있을 때 2.3 으로부터 10.7 pg (1-5 MOI) 로의 증가 및 HNF1/4 결합 자리가 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 삽입되어 있을 때 3 으로부터 17.8 pg (1-5 MOI) 로의 증가가 존재한다.
실시예 9. Hepa1-6 세포에서 프로트롬빈 인핸서 및 hAAT 또는 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터에 의한 hPAH 의 렌티바이러스-전달되는 발현
이 실시예는 TBG 프로모터 (SEQ ID NO: 62) 와 비교하여 hAAT 프로모터와의 조합으로 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 의해 Hepa1-6 암종 세포에서 인간 PAH 의 발현이 증가된다는 것을 보여주며, 이는 도 7 에서 보여지는 바와 같다.
인간 PAH, 프로트롬빈 인핸서, 및 hAAT 및 TBG 프로모터를 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 유전자를 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 간-특이적 hAAT 또는 TBG 프로모터에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 3 일 후에 단백질을 면역블롯에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 의 상대 발현을 항-PAH 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 를 사용하여 면역블롯에 의해 검출하고, 항-베타 액틴 항체 (SigmaMillipore, Billerica, MA) 를 로딩 대조군에 사용했다.
도 7 에서 보여지는 바와 같이, 네 개의 군이 비교된다: 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하고 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), 오직 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 대조군 (레인 3), 및 프로트롬빈 인핸서/TBG 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4). 도 7 은 TBG 프로모터와 비교하여 프로트롬빈 인핸서가 hAAT 프로모터와 조합될 때 Hepa1-6 암종 세포에서 PAH 의 발현이 상당히 증가된다는 것을 입증한다.
실시예 10. Hepa1-6 세포 또는 Hep3B 세포에서 PAH 유전자의 업스트림에 있는 토끼 또는 인간 베타 글로빈 인트론 서열에 의한 hPAH 의 렌티바이러스-전달되는 발현.
이 실시예는 hAAT 프로모터 및 토끼 또는 인간 베타 글로빈 인트론과의 조합으로 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 의해 Hepa1-6 및 Hep3B 암종 세포에서 인간 PAH 의 발현이 인간 베타 글로빈 인트론에 의해 증가되지 않는다는 것을 보여주며, 이는 도 8A 및 8B 에서 보여지는 바와 같다.
인간 PAH, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 토끼 또는 인간 베타 글로빈 인트론을 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 또는 Hep3B 인간 간세포 암종 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 유전자를 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 간-특이적 hAAT 프로모터 및 토끼 또는 인간 베타 글로빈 인트론에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 3 일 후에 단백질을 면역블롯에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 의 상대 발현을 항-PAH 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 를 사용하여 면역블롯에 의해 검출하고, 항-베타 액틴 항체 (SigmaMillipore, Billerica, MA) 를 로딩 대조군에 사용했다.
도 8A 및 8B 에서 보여지는 바와 같이, 네 개의 군이 비교된다: 렌티바이러스 없음 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 토끼 베타 글로빈 인트론 서열에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3), 및 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 인간 베타 글로빈 인트론에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4). 도 8A 및 8B 는 프로트롬빈 인핸서 및 hAAT 프로모터에 의해 Hepa1-6 및 Hep3B 암종 세포에서 PAH 의 발현이 증가된다는 것을 입증한다. 토끼 베타 글로빈 인트론의 부가는 Hepa1-6 세포에서 발현을 개선하지만 Hep3B 세포에서는 발현을 개선하지 않는다. 인간 베타 글로빈 인트론은 Hepa1-6 또는 Hep3B 세포에서 발현을 개선하지 않는다.
실시예 11. 일차 인간 간세포에서 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의한 hPAH 의 렌티바이러스-전달되는 발현
이 실시예는 hAAT 프로모터와의 조합으로 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 의해 일차 인간 간세포에서 인간 PAH 의 발현이 상당히 증가된다는 것을 보여주며, 이는 도 9 에서 보여지는 바와 같다.
인간 PAH, 프로트롬빈 및 ApoE 인핸서, 및 hAAT 프로모터를 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 일차 인간 간세포 (Triangle Research Labs, North Carolina) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 의 코딩 서열 또는 코딩 서열 및 3' UTR 를 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 간-특이적 프로트롬빈 또는 ApoE 인핸서 및 hAAT 프로모터에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 4 일 후에 단백질을 면역블롯에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 의 상대 발현을 항-PAH 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 를 사용하여 면역블롯에 의해 검출하고, 항-베타 액틴 항체 (SigmaMillipore, Billerica, MA) 를 로딩 대조군에 사용했다.
도 9 에서 보여지는 바와 같이, 다섯 개의 군이 비교된다: 오직 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 대조군 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 2), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 있는 5X HNF1 결합 자리에 의해 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 3), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하고 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하는 렌티바이러스 벡터 (레인 4), 및 ApoE/hAAT 프로모터에 의해 3' UTR 를 함유하는 hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터 (레인 5). 도 9 는 ApoE 인핸서와 비교하여 프로트롬빈 인핸서가 hAAT 프로모터와 조합될 때 일차 인간 간세포에서 PAH 의 발현이 증가된다는 것을 입증한다. 또한, hPAH 코딩 서열의 업스트림에 토끼 베타 글로빈 인트론 서열의 포함은 hPAH 발현을 향상시킨다.
실시예 12. Hepa1-6 세포에서 렌티바이러스-전달되는 hPAH 의 효소적 활성
이 실시예는 Hepa1-6 세포에서 hPAH 가 발현될 때 세포 배지 및 세포 용해물에서 페닐알라닌 (Phe) 수준의 감소에 의해 나타나는 바와 같이 렌티바이러스-전달되는 인간 PAH 가 효소적으로 활성이라는 것을 보여주며, 이는 도 10A 및 10C, 및 10B, 각각에서 보여지는 바와 같다. Hepa1-6 세포에서 PAH 활성에 보조인자 BH4 의 전구체, 세피아프테린이 요구되었다.
인간 PAH, 프로트롬빈 및 ApoE 인핸서, hAAT 프로모터, 및 토끼 베타 글로빈 인트론을 합성하고, 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 그 후 확인된 hPAH 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 Hepa1-6 마우스 간암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. 렌티바이러스 벡터는 인간 PAH 의 코딩 서열을 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 간-특이적 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 포함된 토끼 베타 글로빈 인트론 서열에 의해 추진되었다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 4 일 후에 페닐알라닌 어세이 키트 (SigmaMillipore, Billerica, MA) 를 사용하여 세포 배지 또는 세포 용해물로부터 페닐알라닌 수준을 측정했다.
도 10A 및 10B 에서 보여지는 바와 같이, 도 10A 에서 세포 배지로부터 또는 도 10B 에서 세포 용해물로부터 네 개의 군이 비교된다: 세피아프테린의 부재 하에 (막대 1) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 3) 오직 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 대조군, 세피아프테린의 부재 하에 (막대 2) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 4) 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하고 토끼 베타 글로빈 인트론 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터. 도 10C 에서 보여지는 바와 같이, 세포 배지로부터 열 개의 군이 비교된다: 세피아프테린의 부재 하에 (막대 1) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 6) 오직 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 대조군, 세피아프테린의 부재 하에 (막대 2) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 7) 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터, 세피아프테린의 부재 하에 (막대 3) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 8) 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 있는 5X HNF1 결합 자리에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터, 세피아프테린의 부재 하에 (막대 4) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 9) 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 의 코딩 영역을 발현하고 토끼 베타 글로빈 인트론 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터, 세피아프테린의 부재 하에 (막대 5) 또는 세피아프테린의 존재 하에 (막대 10) ApoE 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 3' UTR 를 포함하는 hPAH 의 코딩 영역을 발현하는 렌티바이러스 벡터. 도 10A 및 10B 는 세피아프테린의 존재 하에 Hepa1-6 세포에서 hPAH 가 효소적으로 활성이라는 것을 보여준다. hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 Hepa1-6 세포에서 세포 배지 페닐알라닌 수준에서 38% 감소가 있었으며, 이는 도 10A 에서 보여지는 바와 같다. 세포 용해물에서, hPAH 를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 Hepa1-6 세포에서 페닐알라닌 수준에서 88% 감소가 있었으며, 이는 도 10B 에서 보여지는 바와 같다. 도 10C 는 상이한 간-특이적 프로모터 요소를 함유하는 벡터에서 hPAH 가 효소적으로 활성이라는 것을 보여준다. 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 hPAH 를 함유하는 벡터에 의해 Phe 수준에서 41% 감소, 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 있는 5X HNF1 결합 자리/hAAT 프로모터 및 hPAH 를 함유하는 벡터에 의해 Phe 수준에서 43% 감소, 토끼 베타 글로빈 인트론 및 hPAH 를 포함하는 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터를 함유하는 벡터에 의해 Phe 수준에서 48% 감소, 및 3' UTR 를 포함하는 ApoE 인핸서/hAAT 프로모터 및 hPAH 를 함유하는 벡터에 의해 Phe 수준에서 36% 감소가 있었다.
실시예 13. PAH 돌연변이체 마우스의 혈액에서 렌티바이러스 전달되는 PAH 는 혈액 페닐알라닌 수준을 감소시킨다
이 실시예는 Pahenu2 돌연변이체 마우스의 혈액에서 렌티바이러스-전달되는 PAH 가 페닐알라닌 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. Pahenu2 돌연변이체 마우스는 전문이 본원에 참조로 포함되는 Shedlovsky et al. (Mouse Models of Human Phenylketonuria, Genetics 134: 1205-1210 (August, 1993)) 에서 기술 및 특성분석되어 있다. Pahenu2 돌연변이체 마우스 (n=4) 에게 꼬리 정맥을 통해 150 ㎕ 부피의 LV-Pro-hAAT-PAH (AGT323) 벡터를 주입했다. 대조군 처리된 동물에게 꼬리 정맥을 통해 렌티바이러스 벡터를 함유하지 않는 식염수를 주입했다. 형질도입된 293T 세포에서 통합된 벡터 카피수의 qPCR 검출에 의해 확인되는 LV-Pro-hAAT-PAH (AGT323) 의 역가는 1x1010 이었다. 주입시에, 마우스는 6-8 주령이었다. 벡터 주입 전에 (T=0) 및 주입 후 제 1 주 및 제 2 주에 혈액을 수집했다.
페닐알라닌 수준의 측정을 위해, 얼굴 정맥을 통해 혈액을 수집했다. 랜싯을 사용하여 뺨에 구멍을 내고, 400 ㎕ 의 전혈을 혈청 튜브에 수집했다. 혈액을 1 시간 동안 정치시키고, 그 후 튜브를 원심분리했다. 혈장/혈청이 상층에서 분리되고, 수집되었다. 혈장을 그 후 임상 아미노산　분석기 장비에서 분석하기 전까지 동결시켰다.
LV-Pro-hAAT-PAH (AGT323) 벡터의 도입은 주입 후 제 1 주 및 제 2 주 둘 모두에서 혈액 페닐알라닌 수준의 감소를 야기했다. 표 1 및 도 11 에서 보여지는 바와 같이, 1-주 및 2-주 시점에 혈액 페닐알라닌의 평균 마이크로-몰 수준은 각각 1674.7 및 1890 이었다. 이는 ~2400 내지 ~2500 의 대조군 처리된 마우스의 평균 마이크로-몰 혈액 페닐알라닌 수준과 비교된다 (표 1 및 도 11).
게다가, LV-Pro-hAAT-PAH (AGT 323) 벡터의 도입은 간 세포의 유전자 변형을 초래했다. 부검 동안 수집된 간에 대한 벡터 카피수 연구는 이들 연구에서 렌티바이러스 벡터 카피수가 세포 당 대략 0.2 였다는 것을 보여줬다. 도 12 에서 보여지는 바와 같이, 간에서의 증가하는 벡터 카피수와 페닐알라닌의 감소하는 수준 사이에 대략 선형 관계가 존재한다 (피어슨 적률 상관계수 = -0.326).
≥ 20% 의 혈액 페닐알라닌 수준의 감소는 페닐케톤뇨증 질환이 있는 인간 환자에게 치료적 유익을 제공할 것이며, 그들의 진단을 고전적 PKU 으로부터 경도 페닐알란혈증으로 잠재적으로 이동시킨다.
표 1
어린 enu2 마우스에서 AGT323 의 꼬리 정맥 주입에 의한 혈액 페닐알라닌 억제
Figure pct00025
실시예 14. HEK293T 세포에서 DJ 또는 AAV2 혈청형에 의한 hPAH 의 AAV-전달되는 발현
이 실시예는 토끼 베타 글로빈 인트론을 포함하거나 포함하지 않고 hAAT 프로모터와의 조합으로 프로트롬빈 인핸서를 함유하는 AAV 벡터에 의해 HEK293T 세포에서 인간 PAH 가 발현된다는 것을 보여준다.
인간 PAH, 프로트롬빈 인핸서, hAAT 프로모터, 및 토끼 베타 글로빈 인트론을 Eurofins Genomics (Louisville, KY) 에 의해 합성하고, AAV 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 확인된 hPAH 서열을 함유하는 AAV 벡터를 그 후 사용하여 HEK293T 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) 를 형질도입했다. AAV 벡터는 본원에서 개시되는 인간 PAH 유전자를 통합시켰다. 게다가, 이들 구축물에서의 hPAH 발현은 간-특이적 hAAT 프로모터 및 토끼 베타 글로빈 인트론에 의해 추진되었다. 세포를 AAV 입자로 형질도입하고, 3 일 후에, 단백질 또는 RNA 를 면역블롯 또는 qPCR 에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 단백질의 발현을 항-PAH 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 를 사용하여 면역블롯에 의해 검출하고, 항-베타 액틴 항체 (MilliporeSigma, Billerica, MA) 를 로딩 대조군에 사용했다. TaqMan Fam-라벨링된 프로브 (SEQ ID NO: 66) 및 PAH 프라이머 (Fwd: SEQ ID NO: 67; Rev: SEQ ID NO: 68) 를 사용하여 qPCR 에 의해 PAH RNA 발현을 검출했다.
도 13A 는 여섯 개의 그룹의 비교를 보여준다: AAV/DJ-GFP 벡터 (레인 1), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 AAV/DJ 벡터 (레인 2), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 토끼 베타 글로빈 인트론 서열에 의해 hPAH 를 발현하는 AAV/DJ 벡터 (레인 3), AAV2-GFP 벡터 (레인 4), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터에 의해 hPAH 를 발현하는 AAV2 벡터 (레인 5), 프로트롬빈 인핸서/hAAT 프로모터 및 토끼 베타 글로빈 인트론 서열에 의해 hPAH 를 발현하는 AAV2 벡터 (레인 6).
도 13B 및 13C 는 도 13A 에서의 PAH 밴드의 증가된 노출 후의 블롯을 보여준다. 밴드 밀도가 정량적 이미지화에 의해 분석될 범위 내로 오도록 노출을 증가시켰다. AAV/DJ 혈청형 벡터에 의한 처리를 보여주는 블롯에 상대적으로 AAV/2 혈청형 벡터에 의한 처리를 보여주는 블롯에서 원래의 밴드 강도는 훨씬 더 낮았다. 그 결과, PAH 단백질의 정량적 측정을 하기 위해서, AAV/DJ 혈청형 블롯에 상대적으로 AAV/2 혈청형 블롯에서 더 긴 노출 시간이 필요했다.
정량적 이미지화의 결과는 토끼 베타 글로빈 인트론을 포함하는 AAV/DJ 벡터 또는 토끼 베타 글로빈 인트론을 결여하는 AAV/DJ 벡터를 사용하여 PAH 단백질 발현이 2-배 만큼 증가되었다는 거을 보여줬다 (도 13B; 밴드 아래의 숫자는 상대 배수 증가를 보여준다). 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하는 AAV/2 벡터의 사용은 PAH 의 발현을 억제했지만, 토끼 베타 글로빈 인트론을 함유하지 않는 AAV2 벡터의 사용은 PAH 의 50-배 증가를 초래했다 (도 13C; 밴드 아래의 숫자는 상대 배수 증가를 보여준다). AAV 혈청형 사이의 PAH 발현의 비교는 AAV2 PAH 벡터를 사용하는 경우에 상대적으로 AAV/DJ PAH 벡터의 사용이 PAH 단백질의 더 높은 발현을 초래한다는 것을 밝혔다.
도 13D 는 AAV2 PAH 벡터와 비교하여 AAV/DJ PAH 벡터에서 PAH RNA 발현이 더 높고, 토끼 베타 글로빈 인트론의 존재 및 부재 하에 유사한 발현이 존재한다는 것을 입증한다.
실시예 15. 신생아 enu2/enu2 마우스에서 PKU 에 관한 렌티바이러스 벡터 요법
신생아 enu2/enu2 마우스 (생후 제 3 일) 를 간 내로 직접 주입을 통해 10 ㎕ 의 벡터 스톡 LV-Pro-hAAT-PAH 으로 처리했다. 미치료 동물은 벡터를 함유하지 않는 식염수를 받았다 (가짜 대조군). 최종 용량 ~5 x 106 형질도입 단위/마우스 (~109 형질도입 단위/kg) 의 경우에, 벡터 스톡은 대략 5 x 108 형질도입 단위 (transducing unit)/mL 멸균 식염수 (HEK293 세포에서 측정됨) 였다.
표 2 및 도 14 에서 보여지는 바와 같이, 미치료 enu2/enu2 마우스 (2063 +/- 185) 에 상대적으로 LV-Pro-hAAT-PAH 처리된 enu2/enu2 마우스 (1390 +/- 127) 에서 혈액 페닐알라닌 수준의 마이크로-몰 농도가 유의하게 감소되었다.
표 2
Figure pct00026
실시예 16. PAH 유전자의 3'UTR 을 표적화하는 shPAH 의 발현은 Hep3B 세포에서 LV-H1-shPAH-프로트롬빈-hAAT-hPAH 에 의한 PAH 발현을 억제하지 않는다
이 실시예는 shPAH 가 Hep3B 세포에서 렌티바이러스 벡터, LV-Pro-hAAT-PAH-shPAH 서열 # 1 (SEQ ID NO: 13) 로부터, 또는 렌티바이러스 벡터, LV-Pro-hAAT-PAH-shPAH 서열 # 2 (SEQ ID NO: 14) 로부터 PAH 발현을 억제하지 않는다는 것을 보여준다.
본원에서 개시되는 인간 PAH 를 합성하고, PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 13) 또는 PAH shRNA 서열 #2 (SEQ ID NO: 14) 을 함유하는 렌티바이러스 벡터 내로 삽입했다. 서열의 삽입을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. PAH 를 단독으로 또는 PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 13) 또는 PAH shRNA 서열 #2 (SEQ ID NO: 14) 과의 조합으로 함유하는 렌티바이러스 벡터를 그 후 사용하여 인간 Hep3B 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA 로부터 구입) 를 형질도입했다. 세포에 렌티바이러스 입자를 형질도입하고, 3 일 후에 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 PAH 발현에 관해 분석했다. 인간 PAH 의 상대 발현을 항-PAH 항체 (Abcam) 및 로딩 대조군 베타-액틴를 사용하여 면역블롯에 의해 검출했다. hPAH 발현은 프로트롬빈 인핸서 및 hAAT 프로모터에 의해 추진되었다. 렌티바이러스 벡터는, 다양한 경우에, 인간 PAH 유전자 및 PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 13) 또는 PAH shRNA 서열 #2 (SEQ ID NO: 14) 를 통합시켰다. shPAH-2 발현을 조절하기 위해 사용되는 프로모터에 상보적인 프라이머를 사용하여 DNA 서열분석에 의해 렌티바이러스 벡터 (LV) 내의 shRNA 서열의 삽입을 확인했다. 이 경우에, H1 프로모터를 사용하여 PAH shRNA 발현을 조절했다. shPAH-(PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 13) 또는 PAH shRNA 서열 # 2 (SEQ ID NO: 14))-에 대한 표적 서열은 LV-PAH 벡터에 존재하지 않는 PAH 3'UTR 에 있다.
도 15 에서 보여지는 바와 같이, 렌티바이러스에서 유래하는 PAH 의 발현은 PAH shRNA 서열 #1 (SEQ ID NO: 13) 또는 PAH shRNA 서열 # 2 (SEQ ID NO: 14) 로 억제되지 않는다.
서열 목록
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Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
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Figure pct00042
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Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
SEQUENCE LISTING <110> American Gene Technologies International Inc. <120> VECTORS WITH PROMOTER AND ENHANCER COMBINATIONS FOR TREATING PHENYLKETONURIA <130> 70612.02516 <140> PCT/US18/53919 <141> 2018-10-02 <150> US 62/566,979 <151> 2017-10-02 <160> 71 <170> Notepad <210> 1 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH <400> 1 atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60 gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120 ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180 aacctgaccc acattgaatc tagaccttct cgtttaaaga aagatgagta tgaatttttc 240 acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300 gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cgagataaga agaaagacac agtgccctgg 360 ttcccaagaa ccattcaaga gctggacaga tttgccaatc agattctcag ctatggagcg 420 gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480 tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540 gaggaagaaa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600 catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660 gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720 cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780 cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840 cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900 cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960 ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020 aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080 aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140 gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200 aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260 attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320 attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359 <210> 2 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized PAH (Opt2) <400> 2 atgagtacgg ctgtgctcga gaatccaggt ttgggccgaa agctgtctga ttttggacag 60 gagacatctt atattgaaga caactgcaac cagaatggtg cgatatccct tattttttct 120 ctgaaagaag aagtaggtgc gctggcaaag gtcttgcggc tgtttgaaga gaacgatgtt 180 aatcttactc atattgagtc cagaccatca cggctgaaaa aagacgagta cgaatttttt 240 actcacttgg acaaacgaag cttgccggct cttactaata tcattaagat cctccggcat 300 gacatagggg cgacagtgca tgagctttca agggataaaa agaaagatac cgtcccctgg 360 tttccaagga ccatacaaga actcgaccga ttcgcgaacc agatcctttc atatggtgct 420 gagttggatg ctgaccaccc cggcttcaaa gacccggtct accgagcgcg gcggaaacaa 480 tttgctgaca tcgcatacaa ttacaggcat ggccagccaa ttcctagagt agaatacatg 540 gaagaagaga aaaaaacctg gggtaccgtc ttcaagacgc tgaaatcatt gtataaaact 600 catgcatgtt acgaatataa ccatattttt ccgttgctcg agaaatattg cgggttccac 660 gaagataaca tcccacaact cgaggatgta tctcagttcc tccagacctg tacggggttt 720 cgacttaggc ctgtcgcggg tttgctcagt tctcgagact tcctgggtgg attggcgttt 780 cgggtattcc attgcacgca gtatatccga cacggaagta agccaatgta cacgccagaa 840 cccgatatct gtcacgaatt gcttggacac gttcctctgt tttctgatcg atcattcgct 900 cagttttcac aggaaatcgg cctggcatct ttgggagcgc cggatgaata tattgagaag 960 ctcgctacaa tttactggtt cacggtagaa tttgggttgt gcaagcaggg tgatagtatt 1020 aaagcatacg gtgcgggatt gctgtcctca ttcggggagc ttcagtattg cctgtccgag 1080 aaacccaagc tgttgccgtt ggaattggaa aaaaccgcta tccaaaatta cacagtaacg 1140 gagttccaac ctttgtacta cgtagccgag tcatttaacg atgcaaagga gaaggtcaga 1200 aattttgctg cgacgatacc cagaccgttc tcagtaaggt acgatcctta cactcagagg 1260 attgaagtcc tggataatac gcaacagctc aagatcctgg cagactccat aaattctgaa 1320 atcggcatct tgtgttcagc actgcaaaag ataaaataa 1359 <210> 3 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH 3'UTR sequence (897 nucleotides) <400> 3 agccatggac agaatgtggt ctgtcagctg tgaatctgtt gatggagatc caactatttc 60 tttcatcaga aaaagtccga aaagcaaacc ttaatttgaa ataacagcct taaatccttt 120 acaagatgga gaaacaacaa ataagtcaaa ataatctgaa atgacaggat atgagtacat 180 actcaagagc ataatggtaa atcttttggg gtcatctttg atttagagat gataatccca 240 tactctcaat tgagttaaat cagtaatctg tcgcatttca tcaagattaa ttaaaatttg 300 ggacctgctt cattcaagct tcatatatgc tttgcagaga actcataaag gagcatataa 360 ggctaaatgt aaaacccaag actgtcatta gaattgaatt attgggctta atataaatcg 420 taacctatga agtttatttt ttattttagt taactatgat tccaattact actttgttat 480 tgtacctaag taaattttct ttaagtcaga agcccattaa aatagttaca agcattgaac 540 ttctttagta ttatattaat ataaaaacat ttttgtatgt tttattgtaa tcataaatac 600 tgctgtataa ggtaataaaa ctctgcacct aatccccata acttccagta tcattttcca 660 attaattatc aagtctgttt tgggaaacac tttgaggaca tttatgatgc agcagatgtt 720 gactaaaggc ttggttggta gatattcagg aaatgttcac tgaataaata agtaaataca 780 ttattgaaaa gcaaatctgt ataaatgtga aatttttatt tgtattagta ataaaacatt 840 agtagtttaa acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaactcgact ctagatt 897 <210> 4 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAH 3'UTR sequence (289 nucleotides) <400> 4 agccatggac agaatgtggt ctgtcagctg tgaatctgtt gatggagatc caactatttc 60 tttcatcaga aaaagtccga aaagcaaacc ttaatttgaa ataacagcct taaatccttt 120 acaagatgga gaaacaacaa ataagtcaaa ataatctgaa atgacaggat atgagtacat 180 actcaagagc ataatggtaa atcttttggg gtcatctttg atttagagat gataatccca 240 tactctcaat tgagttaaat cagtaatctg tcgcatttca tcaagatta 289 <210> 5 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prothrombin enhancer (Pro) <400> 5 gcgagaactt gtgcctcccc gtgttcctgc tctttgtccc tctgtcctac ttagactaat 60 atttgccttg ggtactgcaa acaggaaatg ggggagggac aggagtaggg cggagggtag 120 <210> 6 <211> 397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human alpha-1 antitrypsin promoter (hAAT) <400> 6 gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60 agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120 gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180 ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240 tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300 cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360 cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat 397 <210> 7 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit beta globin intron <400> 7 gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60 ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120 ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 180 cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 240 atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 300 tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 360 ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 420 cttattggta gaaacaacta caccctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 480 tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 540 aaccatgttc atgccttctt ctctttccta cag 573 <210> 8 <211> 544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta globin intron <400> 8 ggatcctgag aacttcaggg tgagtctatg ggacgcttga tgttttcttt ccccttcttt 60 tctatggtta agttcatgtc ataggaaggg gataagtaac agggtacaca tattgaccaa 120 atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt 180 tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa 240 tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 300 atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 360 tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 420 taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 480 atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 540 aaag 544 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1X Hepatocyte Nuclear Factor 1 (1XHNF1) <400> 9 gttaatcatt aac 13 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5X Hepatocyte Nuclear Factor 1 (5XHNF1) <400> 10 gttaatcatt aacgttaatc attaacgtta atcattaacg ttaatcatta acgttaatca 60 ttaac 65 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1X Hepatocyte Nuclear Factor 1/4 (1XHNF1/4) <400> 11 gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca 30 <210> 12 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 3X Hepatocyte Nuclear Factor 1/4 (3XHNF1/4) <400> 12 gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca 60 gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca 90 <210> 13 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PAH shRNA sequence #1 <400> 13 tcgcatttca tcaagattaa tctcgagatt aatcttgatg aaatgcgatt ttt 53 <210> 14 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PAH shRNA sequence #2 <400> 14 actcataaag gagcatataa gctcgagctt atatgctcct ttatgagttt ttt 53 <210> 15 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Rous Sarcoma virus (RSV) promoter <400> 15 gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 60 cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 120 tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 180 gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacg 228 <210> 16 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 5' Long terminal repeat (LTR) <400> 16 ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Psi Packaging signal <400> 17 tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga g 41 <210> 18 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Rev response element (RRE) <400> 18 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233 <210> 19 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Central polypurine tract (cPPT) <400> 19 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaatttta 118 <210> 20 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Long WPRE sequence <400> 20 aatcaacctc tgattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct 590 <210> 21 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> delta U3 3'LTR <400> 21 tggaagggct aattcactcc caacgaagat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta 240 gttcatgtca 250 <210> 22 <211> 217 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> H1 Promoter <400> 22 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accactt 217 <210> 23 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CMV enhancer/chicken beta actin promoter <400> 23 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480 ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 540 ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 600 cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cg 642 <210> 24 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HIV Gag <400> 24 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60 ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180 ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300 ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360 gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420 caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480 gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540 ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600 ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660 gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720 agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780 atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840 agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900 tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960 ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020 gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080 agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140 ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200 atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260 caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320 cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380 gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440 aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500 taa 1503 <210> 25 <211> 1872 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HIV Pol <400> 25 atgaatttgc caggaagatg gaaaccaaaa atgatagggg gaattggagg ttttatcaaa 60 gtaggacagt atgatcagat actcatagaa atctgcggac ataaagctat aggtacagta 120 ttagtaggac ctacacctgt caacataatt ggaagaaatc tgttgactca gattggctgc 180 actttaaatt ttcccattag tcctattgag actgtaccag taaaattaaa gccaggaatg 240 gatggcccaa aagttaaaca atggccattg acagaagaaa aaataaaagc attagtagaa 300 atttgtacag aaatggaaaa ggaaggaaaa atttcaaaaa ttgggcctga aaatccatac 360 aatactccag tatttgccat aaagaaaaaa gacagtacta aatggagaaa attagtagat 420 ttcagagaac ttaataagag aactcaagat ttctgggaag ttcaattagg aataccacat 480 cctgcagggt taaaacagaa aaaatcagta acagtactgg atgtgggcga tgcatatttt 540 tcagttccct tagataaaga cttcaggaag tatactgcat ttaccatacc tagtataaac 600 aatgagacac cagggattag atatcagtac aatgtgcttc cacagggatg gaaaggatca 660 ccagcaatat tccagtgtag catgacaaaa atcttagagc cttttagaaa acaaaatcca 720 gacatagtca tctatcaata catggatgat ttgtatgtag gatctgactt agaaataggg 780 cagcatagaa caaaaataga ggaactgaga caacatctgt tgaggtgggg atttaccaca 840 ccagacaaaa aacatcagaa agaacctcca ttcctttgga tgggttatga actccatcct 900 gataaatgga cagtacagcc tatagtgctg ccagaaaagg acagctggac tgtcaatgac 960 atacagaaat tagtgggaaa attgaattgg gcaagtcaga tttatgcagg gattaaagta 1020 aggcaattat gtaaacttct taggggaacc aaagcactaa cagaagtagt accactaaca 1080 gaagaagcag agctagaact ggcagaaaac agggagattc taaaagaacc ggtacatgga 1140 gtgtattatg acccatcaaa agacttaata gcagaaatac agaagcaggg gcaaggccaa 1200 tggacatatc aaatttatca agagccattt aaaaatctga aaacaggaaa atatgcaaga 1260 atgaagggtg cccacactaa tgatgtgaaa caattaacag aggcagtaca aaaaatagcc 1320 acagaaagca tagtaatatg gggaaagact cctaaattta aattacccat acaaaaggaa 1380 acatgggaag catggtggac agagtattgg caagccacct ggattcctga gtgggagttt 1440 gtcaataccc ctcccttagt gaagttatgg taccagttag agaaagaacc cataatagga 1500 gcagaaactt tctatgtaga tggggcagcc aatagggaaa ctaaattagg aaaagcagga 1560 tatgtaactg acagaggaag acaaaaagtt gtccccctaa cggacacaac aaatcagaag 1620 actgagttac aagcaattca tctagctttg caggattcgg gattagaagt aaacatagtg 1680 acagactcac aatatgcatt gggaatcatt caagcacaac cagataagag tgaatcagag 1740 ttagtcagtc aaataataga gcagttaata aaaaaggaaa aagtctacct ggcatgggta 1800 ccagcacaca aaggaattgg aggaaatgaa caagtagatg ggttggtcag tgctggaatc 1860 aggaaagtac ta 1872 <210> 26 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HIV Int <400> 26 tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60 gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120 gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180 tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240 agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300 ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360 ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420 attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480 attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540 ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600 gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660 caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720 ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780 ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840 gtggcaagta gacaggatga ggattaa 867 <210> 27 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HIV RRE <400> 27 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234 <210> 28 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HIV Rev <400> 28 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gaactcctca aggcagtcag actcatcaag 60 tttctctatc aaagcaaccc acctcccaat cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 120 agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatcctt 180 agcacttatc tgggacgatc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccacc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtaacga ggattgtgga acttctggga cgcagggggt gggaagccct 300 caaatattgg tggaatctcc tacaatattg gagtcaggag ctaaagaata g 351 <210> 29 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CMV Promoter <400> 29 acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180 tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240 agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300 gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360 agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420 gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480 gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 540 gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc taactagaga 600 acccactgct tactg 615 <210> 30 <211> 1536 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> VSV-G Envelope Glycoprotein <400> 30 atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60 gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120 ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180 atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240 gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300 ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360 ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420 gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480 gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540 acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600 gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660 ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720 aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780 tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840 acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900 caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960 cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020 tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080 ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140 gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200 tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260 ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320 tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380 tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440 gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500 tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtga 1536 <210> 31 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Left ITR <400> 31 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 32 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PolyA <400> 32 gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 60 cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 120 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 180 ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggc 228 <210> 33 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Right ITR <400> 33 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 34 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> E2A <400> 34 ttaaaagtcg aaggggttct cgcgctcgtc gttgtgcgcc gcgctgggga gggccacgtt 60 gcggaactgg tacttgggct gccacttgaa ctcggggatc accagtttgg gcactggggt 120 ctcggggaag gtctcgctcc acatgcgccg gctcatctgc agggcgccca gcatgtcagg 180 cgcggagatc ttgaaatcgc agttggggcc ggtgctctgc gcgcgcgagt tgcggtacac 240 tgggttgcag cactggaaca ccatcagact ggggtacttc acactagcca gcacgctctt 300 gtcgctgatc tgatccttgt ccaggtcctc ggcgttgctc aggccgaacg gggtcatctt 360 gcacagctgg cggcccagga agggcacgct ctgaggcttg tggttacact cgcagtgcac 420 gggcatcagc atcatccccg cgccgcgctg catattcggg tagagggcct tgacgaaggc 480 cgcgatctgc ttgaaagctt gctgggcctt ggccccctcg ctgaaaaaca ggccgcagct 540 cttcccgctg aactgattat tcccgcaccc ggcatcatgg acgcagcagc gcgcgtcatg 600 gctggtcagt tgcaccacgc tccgtcccca gcggttctgg gtcaccttgg ccttgctggg 660 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Artificial sequence <220> <223> E4 <400> 35 tcatgtatct ttattgattt ttacaccagc acgggtagtc agtctcccac caccagccca 60 tttcacagtg taaacaattc tctcagcacg ggtggcctta aatagggcaa tattctgatt 120 agtgcgggaa ctggacttgg ggtctataat ccacacagtt tcctggcgag ccaaacgggg 180 gtcggtgatt gagatgaagc cgtcctctga aaagtcatcc aagcgagcct cacagtccaa 240 ggtcacagta ttatgataat ctgcatgatc acaatcgggc aacaggggat gttgttcagt 300 cagtgaagcc ctggtttcct catcagatcg tggtaaacgg gccctgcgat atggatgatg 360 gcggagcgag ctggattgaa tctcggtttg cat 393 <210> 36 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> VA RNA <400> 36 agcgggcact cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg 60 gggttcgagc cccgtatccg gccgtccgcc gtgatccatg cggttaccgc ccgcgtgtcg 120 aacccaggtg tgcgacgtca gacaacgggg gagtgctcct tt 162 <210> 37 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAV2 Rep <400> 37 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60 cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120 gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240 cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300 caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360 gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420 ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480 aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca 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cctgggccct gcccacctac aacaaccacc tctacaagca aatctccaac 180 gggacatcgg gaggagccac caacgacaac acctacttcg gctacagcac cccctggggg 240 tattttgact ttaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca gcgactcatc 300 aacaacaact ggggattccg gcccaagaga ctcagcttca agctcttcaa catccaggtc 360 aaggaggtca cgcagaatga aggcaccaag accatcgcca ataacctcac cagcaccatc 420 caggtgttta cggactcgga gtaccagctg ccgtacgttc tcggctctgc ccaccagggc 480 tgcctgcctc cgttcccggc ggacgtgttc atgattcccc agtacggcta cctaacactc 540 aacaacggta gtcaggccgt gggacgctcc tccttctact gcctggaata ctttccttcg 600 cagatgctga gaaccggcaa caacttccag tttacttaca ccttcgagga cgtgcctttc 660 cacagcagct acgcccacag ccagagcttg gaccggctga tgaatcctct gattgaccag 720 tacctgtact acttgtctcg gactcaaaca acaggaggca cggcaaatac gcagactctg 780 ggcttcagcc aaggtgggcc taatacaatg gccaatcagg caaagaactg gctgccagga 840 ccctgttacc gccaacaacg cgtctcaacg acaaccgggc aaaacaacaa tagcaacttt 900 gcctggactg ctgggaccaa ataccatctg aatggaagaa attcattggc taatcctggc 960 atcgctatgg caacacacaa 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gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag 240 gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 300 cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 360 aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 420 tagctgtccc tcttctctta tgaagatc 448 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 43 taagcagaat tcatgaattt gccaggaaga t 31 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 44 ccatacaatg aatggacact aggcggccgc acgaat 36 <210> 45 <211> 2745 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Gag, Pol, Integrase fragment <400> 45 gaattcatga atttgccagg aagatggaaa ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt 60 atcaaagtaa gacagtatga tcagatactc atagaaatct gcggacataa agctataggt 120 acagtattag taggacctac acctgtcaac ataattggaa gaaatctgtt gactcagatt 180 ggctgcactt taaattttcc cattagtcct attgagactg taccagtaaa attaaagcca 240 ggaatggatg gcccaaaagt taaacaatgg ccattgacag aagaaaaaat aaaagcatta 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caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc 60 atcaagcttc tctatcaaag caacccacct cccaatcccg aggggacccg acaggcccga 120 aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 180 atccttggca cttatctggg acgatctgcg gagcctgtgc ctcttcagct accaccgctt 240 gagagactta ctcttgattg taacgaggat tgtggaactt ctgggacgca gggggtggga 300 agccctcaaa tattggtgga atctcctaca atattggagt caggagctaa agaatagagg 360 agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 420 gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 480 gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 540 ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tagatctttt 600 tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta 660 ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg 720 aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt 780 ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg gctataaaga ggtcatcagt 840 atatgaaaca gccccctgct gtccattcct 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catatatgga 60 gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120 cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180 acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240 tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300 ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360 tattaccatg ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 420 ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 480 gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 540 cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 600 aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 660 ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 720 accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 780 cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc 840 cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 900 ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg 960 gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt 1020 gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc 1080 agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta acccccccct gcacccccct ccccgagttg 1140 ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtgcggg gcgtggcgcg gggctcgccg 1200 tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg 1260 gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc 1320 gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc 1380 ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg 1440 cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc 1500 gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc ggggctgccg cagggggacg gctgccttcg 1560 ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggga attc 1614 <210> 48 <211> 884 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> RSV promoter and HIV Rev <400> 48 caattgcgat gtacgggcca gatatacgcg tatctgaggg gactagggtg 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120 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 180 ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatgg 227 <210> 54 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Envelope; RD114 <400> 54 atgaaactcc caacaggaat ggtcatttta tgtagcctaa taatagttcg ggcagggttt 60 gacgaccccc gcaaggctat cgcattagta caaaaacaac atggtaaacc atgcgaatgc 120 agcggagggc aggtatccga ggccccaccg aactccatcc aacaggtaac ttgcccaggc 180 aagacggcct acttaatgac caaccaaaaa tggaaatgca gagtcactcc aaaaaatctc 240 acccctagcg ggggagaact ccagaactgc ccctgtaaca ctttccagga ctcgatgcac 300 agttcttgtt atactgaata ccggcaatgc agggcgaata ataagacata ctacacggcc 360 accttgctta aaatacggtc tgggagcctc aacgaggtac agatattaca aaaccccaat 420 cagctcctac agtccccttg taggggctct ataaatcagc ccgtttgctg gagtgccaca 480 gcccccatcc atatctccga tggtggagga cccctcgata ctaagagagt gtggacagtc 540 caaaaaaggc tagaacaaat tcataaggct atgcatcctg aacttcaata ccacccctta 600 gccctgccca aagtcagaga tgaccttagc cttgatgcac ggacttttga tatcctgaat 660 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ctacaagtca gtccggacct ggaatgagat catcccctca 1080 aaagggtgtt tgaaagttgg aggaaggtgc catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 1140 ggtataatat tagggcctga cgaccatgtc ctaatcccag agatgcaatc atccctcctc 1200 cagcaacata tggagttgtt ggaatcttca gttatccccc tgatgcaccc cctggcagac 1260 ccttctacag ttttcaaaga aggtgatgag gctgaggatt ttgttgaagt tcacctcccc 1320 gatgtgtaca aacagatctc aggggttgac ctgggtctcc cgaactgggg aaagtatgta 1380 ttgatgactg caggggccat gattggcctg gtgttgatat tttccctaat gacatggtgc 1440 agagttggta tccatctttg cattaaatta aagcacacca agaaaagaca gatttataca 1500 gacatagaga tgaaccgact tggaaagtaa 1530 <210> 57 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Envelope; LCMV <400> 57 atgggtcaga ttgtgacaat gtttgaggct ctgcctcaca tcatcgatga ggtgatcaac 60 attgtcatta ttgtgcttat cgtgatcacg ggtatcaagg ctgtctacaa ttttgccacc 120 tgtgggatat tcgcattgat cagtttccta cttctggctg gcaggtcctg tggcatgtac 180 ggtcttaagg gacccgacat ttacaaagga gtttaccaat ttaagtcagt ggagtttgat 240 atgtcacatc tgaacctgac catgcccaac gcatgttcag ccaacaactc ccaccattac 300 atcagtatgg ggacttctgg actagaattg accttcacca atgattccat catcagtcac 360 aacttttgca atctgacctc tgccttcaac aaaaagacct ttgaccacac actcatgagt 420 atagtttcga gcctacacct cagtatcaga gggaactcca actataaggc agtatcctgc 480 gacttcaaca atggcataac catccaatac aacttgacat tctcagatcg acaaagtgct 540 cagagccagt gtagaacctt cagaggtaga gtcctagata tgtttagaac tgccttcggg 600 gggaaataca tgaggagtgg ctggggctgg acaggctcag atggcaagac cacctggtgt 660 agccagacga gttaccaata cctgattata caaaatagaa cctgggaaaa ccactgcaca 720 tatgcaggtc cttttgggat gtccaggatt ctcctttccc aagagaagac taagttcttc 780 actaggagac tagcgggcac attcacctgg actttgtcag actcttcagg ggtggagaat 840 ccaggtggtt attgcctgac caaatggatg attcttgctg cagagcttaa gtgtttcggg 900 aacacagcag ttgcgaaatg caatgtaaat catgatgccg aattctgtga catgctgcga 960 ctaattgact acaacaaggc tgctttgagt aagttcaaag aggacgtaga atctgccttg 1020 cacttattca aaacaacagt gaattctttg atttcagatc aactactgat gaggaaccac 1080 ttgagagatc tgatgggggt gccatattgc aattactcaa agttttggta cctagaacat 1140 gcaaagaccg gcgaaactag tgtccccaag tgctggcttg tcaccaatgg ttcttactta 1200 aatgagaccc acttcagtga tcaaatcgaa caggaagccg ataacatgat tacagagatg 1260 ttgaggaagg attacataaa gaggcagggg agtacccccc tagcattgat ggaccttctg 1320 atgttttcca catctgcata tctagtcagc atcttcctgc accttgtcaa aataccaaca 1380 cacaggcaca taaaaggtgg ctcatgtcca aagccacacc gattaaccaa caaaggaatt 1440 tgtagttgtg gtgcatttaa ggtgcctggt gtaaaaaccg tctggaaaag acgctga 1497 <210> 58 <211> 1692 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Envelope; FPV <400> 58 atgaacactc aaatcctggt tttcgccctt gtggcagtca tccccacaaa tgcagacaaa 60 atttgtcttg gacatcatgc tgtatcaaat ggcaccaaag taaacacact cactgagaga 120 ggagtagaag ttgtcaatgc aacggaaaca gtggagcgga caaacatccc caaaatttgc 180 tcaaaaggga aaagaaccac tgatcttggc caatgcggac tgttagggac cattaccgga 240 ccacctcaat gcgaccaatt tctagaattt tcagctgatc taataatcga gagacgagaa 300 ggaaatgatg tttgttaccc ggggaagttt gttaatgaag aggcattgcg acaaatcctc 360 agaggatcag gtgggattga caaagaaaca atgggattca 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gcgaggagaa agtgcctaac accgtacgcc 1200 ctgacgccag gagcggtggt accgttgaca ctggggctgc tttgctgcgc accgagggcg 1260 aatgca 1266 <210> 60 <211> 1938 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Envelope; MLV 10A1 <400> 60 atggaaggtc cagcgttctc aaaacccctt aaagataaga ttaacccgtg gaagtcctta 60 atggtcatgg gggtctattt aagagtaggg atggcagaga gcccccatca ggtctttaat 120 gtaacctgga gagtcaccaa cctgatgact gggcgtaccg ccaatgccac ctccctttta 180 ggaactgtac aagatgcctt cccaagatta tattttgatc tatgtgatct ggtcggagaa 240 gagtgggacc cttcagacca ggaaccatat gtcgggtatg gctgcaaata ccccggaggg 300 agaaagcgga cccggacttt tgacttttac gtgtgccctg ggcataccgt aaaatcgggg 360 tgtggggggc caagagaggg ctactgtggt gaatggggtt gtgaaaccac cggacaggct 420 tactggaagc ccacatcatc atgggaccta atctccctta agcgcggtaa caccccctgg 480 gacacgggat gctccaaaat ggcttgtggc ccctgctacg acctctccaa agtatccaat 540 tccttccaag gggctactcg agggggcaga tgcaaccctc tagtcctaga attcactgat 600 gcaggaaaaa aggctaattg ggacgggccc aaatcgtggg gactgagact gtaccggaca 660 ggaacagatc ctattaccat gttctccctg acccgccagg tcctcaatat agggccccgc 720 atccccattg ggcctaatcc cgtgatcact ggtcaactac ccccctcccg acccgtgcag 780 atcaggctcc ccaggcctcc tcagcctcct cctacaggcg cagcctctat agtccctgag 840 actgccccac cttctcaaca acctgggacg ggagacaggc tgctaaacct ggtagaagga 900 gcctatcagg cgcttaacct caccaatccc gacaagaccc aagaatgttg gctgtgctta 960 gtgtcgggac ctccttatta cgaaggagta gcggtcgtgg gcacttatac caatcattct 1020 accgccccgg ccagctgtac ggccacttcc caacataagc ttaccctatc tgaagtgaca 1080 ggacagggcc tatgcatggg agcactacct aaaactcacc aggccttatg taacaccacc 1140 caaagtgccg gctcaggatc ctactacctt gcagcacccg ctggaacaat gtgggcttgt 1200 agcactggat tgactccctg cttgtccacc acgatgctca atctaaccac agactattgt 1260 gtattagttg agctctggcc cagaataatt taccactccc ccgattatat gtatggtcag 1320 cttgaacagc gtaccaaata taagagggag ccagtatcgt tgaccctggc ccttctgcta 1380 ggaggattaa ccatgggagg gattgcagct ggaataggga cggggaccac tgccctaatc 1440 aaaacccagc agtttgagca gcttcacgcc gctatccaga cagacctcaa cgaagtcgaa 1500 aaatcaatta ccaacctaga 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cgggagtgag 360 tgtctaccag cagcgccaga cgggattcgg ggcttccccc ggtgccggta tgtgcacaaa 420 gtatcaggaa cgggaccgtg tgccggagac tttgccttcc acaaagaggg tgctttcttc 480 ctgtatgacc gacttgcttc cacagttatc taccgaggaa cgactttcgc tgaaggtgtc 540 gttgcatttc tgatactgcc ccaagctaag aaggacttct tcagctcaca ccccttgaga 600 gagccggtca atgcaacgga ggacccgtct agtggctact attctaccac aattagatat 660 caagctaccg gttttggaac caatgagaca gagtatttgt tcgaggttga caatttgacc 720 tacgtccaac ttgaatcaag attcacacca cagtttctgc tccagctgaa tgagacaata 780 tatacaagtg ggaaaaggag caataccacg ggaaaactaa tttggaaggt caaccccgaa 840 attgatacaa caatcgggga gtgggccttc tgggaaacta aaaaaacctc actagaaaaa 900 ttcgcagtga agagttgtct ttcacagctg tatcaaacag agccaaaaac atcagtggtc 960 agagtccggc gcgaacttct tccgacccag ggaccaacac aacaactgaa gaccacaaaa 1020 tcatggcttc agaaaattcc tctgcaatgg ttcaagtgca cagtcaagga agggaagctg 1080 cagtgtcgca tctgacaacc cttgccacaa tctccacgag tcctcaaccc cccacaacca 1140 aaccaggtcc ggacaacagc acccacaata cacccgtgta taaacttgac atctctgagg 1200 caactcaagt tgaacaacat caccgcagaa cagacaacga cagcacagcc tccgacactc 1260 cccccgccac gaccgcagcc ggacccctaa aagcagagaa caccaacacg agcaagggta 1320 ccgacctcct ggaccccgcc accacaacaa gtccccaaaa ccacagcgag accgctggca 1380 acaacaacac tcatcaccaa gataccggag aagagagtgc cagcagcggg aagctaggct 1440 taattaccaa tactattgct ggagtcgcag gactgatcac aggcgggagg agagctcgaa 1500 gagaagcaat tgtcaatgct caacccaaat gcaaccctaa tttacattac tggactactc 1560 aggatgaagg tgctgcaatc ggactggcct ggataccata tttcgggcca gcagccgagg 1620 gaatttacat agaggggctg atgcacaatc aagatggttt aatctgtggg ttgagacagc 1680 tggccaacga gacgactcaa gctcttcaac tgttcctgag agccacaacc gagctacgca 1740 ccttttcaat cctcaaccgt aaggcaattg atttcttgct gcagcgatgg ggcggcacat 1800 gccacatttt gggaccggac tgctgtatcg aaccacatga ttggaccaag aacataacag 1860 acaaaattga tcagattatt catgattttg ttgataaaac ccttccggac cagggggaca 1920 atgacaattg gtggacagga tggagacaat ggataccggc aggtattgga gttacaggcg 1980 ttataattgc agttatcgct ttattctgta tatgcaaatt tgtcttttag 2030 <210> 62 <211> 218 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Thyroxin binding globulin promoter (TBG) <400> 62 ctttctcttt tgttttacat gaagggtctg gcagccaaag caatcactca aagttcaaac 60 cttatcattt tttgctttgt tcctcttggc cttggttttg tacatcagct ttgaaaatac 120 catcccaggg ttaatgctgg ggttaattta taactaagag tgctctagtt ttgcaataca 180 ggacatgcta taaaaatgga aagatgttgc tttctgag 218 <210> 63 <211> 523 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA fragment containing prothrombin enhancer and human alpha-1 anti-trypsin promoter <400> 63 gcgagaactt gtgcctcccc gtgttcctgc tctttgtccc tctgtcctac ttagactaat 60 atttgccttg ggtactgcaa acaggaaatg ggggagggac aggagtaggg cggagggtag 120 cccggggatc ttgctaccag tggaacagcc actaaggatt ctgcagtgag agcagagggc 180 cagctaagtg gtactctccc agagactgtc tgactcacgc caccccctcc accttggaca 240 caggacgctg tggtttctga gccaggtaca atgactcctt tcggtaagtg cagtggaagc 300 tgtacactgc ccaggcaaag cgtccgggca gcgtaggcgg gcgactcaga tcccagccag 360 tggacttagc ccctgtttgc tcctccgata actggggtga ccttggttaa tattcaccag 420 cagcctcccc cgttgcccct ctggatccac tgcttaaata cggacgagga cagggccctg 480 tctcctcagc ttcaggcacc accactgacc tgggacagtg aat 523 <210> 64 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA fragment containing prothrombin enhancer, human alpha-1 anti-trypsin promoter, and five HNF1 binding sites <400> 64 gttaatcatt aacgttaatc attaacgtta atcattaacg ttaatcatta acgttaatca 60 ttaacatcga tgcgagaact tgtgcctccc cgtgttcctg ctctttgtcc ctctgtccta 120 cttagactaa tatttgcctt gggtactgca aacaggaaat gggggaggga caggagtagg 180 gcggagggta ggattctgca gtgagagcag agggccagct aagtggtact ctcccagaga 240 ctgtctgact cacgccaccc cctccacctt ggacacagga cgctgtggtt tctgagccag 300 gtacaatgac tcctttcggt aagtgcagtg gaagctgtac actgcccagg caaagcgtcc 360 gggcagcgta ggcgggcgac tcagatccca gccagtggac ttagcccctg tttgctcctc 420 cgataactgg ggtgaccttg gttaatattc accagcagcc tcccccgttg cccctctgga 480 tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc tcagcttcag gcaccaccac 540 tgacctggga cagtgaat 558 <210> 65 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DNA fragment containing prothrombin enhancer, human alpha-1, anti-trypsin promoter, and three HNF1/HNF4 binding sites <400> 65 gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca 60 gttaatcatt aacgcttgta ctttggtaca atcgatgcga gaacttgtgc ctccccgtgt 120 tcctgctctt tgtccctctg tcctacttag actaatattt gccttgggta ctgcaaacag 180 gaaatggggg agggacagga gtagggcgga gggtagcccg gggattctgc agtgagagca 240 gagggccagc taagtggtac tctcccagag actgtctgac tcacgccacc ccctccacct 300 tggacacagg acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga ctcctttcgg taagtgcagt 360 ggaagctgta cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc 420 agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt 480 caccagcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg 540 gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaat 589 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Taqman Probe <400> 66 tcgtgaaagc tcatggacag tggc 24 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Taqman Forward Primer <400> 67 agatcttgag gcatgacatt gg 22 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Taqman Reverse Primer <400> 68 gtccagctct tgaatggttc tt 22 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Actin Probe <400> 69 agcgggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Actin Forward Primer <400> 70 ggacctgact gactacctca t 21 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Actin Reverse Primer <400> 71 cgtagcacag cttctcctta at 22

Claims (38)

  1. 치료적 카고 부분을 포함하는 바이러스 벡터로서, 치료적 카고 부분은 하기를 포함하는 바이러스 벡터:
    PAH 서열 또는 그의 변이체;
    프로모터; 및
    간-특이적 인핸서,
    여기에서 PAH 서열 또는 그의 변이체는 프로모터 및 간-특이적 인핸서 둘 모두에 의해 작동적으로 제어됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 간-특이적 인핸서는 프로트롬빈 인핸서를 포함하는 바이러스 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서, 프로모터는 간-특이적 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
  5. 제 1 항에 있어서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 절두된 것인 바이러스 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서, PAH 서열 또는 그의 변이체의 절두된 부분은 PAH 서열 또는 그의 변이체의 3' 미번역 영역 (UTR) 인 바이러스 벡터.
  7. 제 1 항에 있어서, 치료적 카고 부분은 베타 글로빈 인트론을 추가로 포함하는 바이러스 벡터.
  8. 제 1 항에 있어서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리를 추가로 포함하는 바이러스 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리는 프로트롬빈 인핸서의 업스트림에 배치되어 있는 바이러스 벡터.
  10. 제 8 항에 있어서, 적어도 하나의 간세포 핵 인자 결합 자리는 프로트롬빈 인핸서의 다운스트림에 배치되어 있는 바이러스 벡터.
  11. 제 1 항에 있어서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 4 와 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, PAH 서열 또는 그의 변이체는 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; 또는 SEQ ID NO: 4 를 포함하는 바이러스 벡터.
  13. 제 2 항에 있어서, 프로트롬빈 인핸서는 SEQ ID NO: 5 와 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  14. 제 2 항에 있어서, 프로트롬빈 인핸서의 서열은 SEQ ID NO: 5 를 포함하는 바이러스 벡터.
  15. 제 4 항에 있어서, hAAT 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 6 을 포함하는 바이러스 벡터.
  16. 제 5 항에 있어서, 베타 글로빈 인트론의 서열은 SEQ ID NOs: 7 또는 8 을 포함하는 바이러스 벡터.
  17. 제 6 항에 있어서, 간세포 핵 인자 결합 자리의 서열은 SEQ ID NOs: 9-12 중 어느 하나를 포함하는 바이러스 벡터.
  18. 제 1 항에 있어서, 치료적 카고 부분은 적어도 하나의 예정된 상보적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 적어도 하나의 작은 RNA 서열을 추가로 포함하는 바이러스 벡터.
  19. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 전장 UTR 를 함유하는 상보적 mRNA 서열을 표적화하는 바이러스 벡터.
  20. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 예정된 상보적 mRNA 서열은 PAH mRNA 서열인 바이러스 벡터.
  21. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 shRNA 를 포함하는 바이러스 벡터.
  22. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 제 1 프로모터의 제어 하에 있고, PAH 서열 또는 그의 변이체는 제 2 프로모터의 제어 하에 있는 바이러스 벡터.
  23. 제 20 항에 있어서, 제 1 프로모터는 H1 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
  24. 제 20 항에 있어서, 제 2 프로모터는 간-특이적 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
  25. 제 24 항에 있어서, 간-특이적 프로모터는 hAAT 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터.
  26. 제 18 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14 와 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  27. 제 21 항에 있어서, 적어도 하나의 작은 RNA 서열은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14 를 포함하는 바이러스 벡터.
  28. 제 1 항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 바이러스 벡터.
  29. 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자로서, 하기를 포함하는 렌티바이러스 입자:
    표적 세포를 감염시키기 위해 최적화된 외피 단백질; 및
    제 1 항에 따른 바이러스 벡터.
  30. 제 29 항에 있어서, 표적 세포는 간 세포, 근육 세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경 세포, 신경내분비 세포, 내분비 세포, 림프구, 골수 세포, 고형 기관 내에 존재하는 세포, 또는 조혈 계통의 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 전구체 조혈 줄기 세포인 렌티바이러스 입자.
  31. 대상체에서 PKU 을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 제 29 항 또는 제 30 항의 렌티바이러스 입자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  32. 대상체에서 PKU 을 예방하는 방법으로서, 대상체에게 치료 유효량의 제 29 항 또는 제 30 항의 렌티바이러스 입자를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 대상체에서 PKU 표현형과 상관관계가 있는 PKU 유전자형을 진단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 대상체는 자궁 내에 (in utero) 있는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 진단은 대상체의 태아기 스크리닝 동안 이루어지는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 진단은 시험관 내에서 (in vitro) 이루어지는 방법.
  37. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 치료 유효량의 렌티바이러스 입자는 복수의 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함하는 방법.
  38. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 치료 유효량의 렌티바이러스 입자는 단일 용량의 렌티바이러스 입자를 포함하는 방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
EP3319631A4 (en) 2015-07-08 2019-01-09 American Gene Technologies International Inc. HIV PREMUNICATION AND IMMUNOTHERAPY
CN116064678A (zh) 2016-01-15 2023-05-05 美国基因技术国际有限公司 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy
WO2017156311A2 (en) 2016-03-09 2017-09-14 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
EP3468617A4 (en) 2016-06-08 2020-01-22 American Gene Technologies International Inc. SYSTEM FOR THE NON-INTEGRAL VIRAL ISSUE AND PROCEDURE RELATING TO IT
AU2017292582C1 (en) 2016-07-08 2021-11-11 American Gene Technologies International Inc. HIV pre-immunization and immunotherapy
EP3487507A4 (en) 2016-07-21 2020-04-08 American Gene Technologies International, Inc. VIRAL VECTORS FOR THE TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE
US11820999B2 (en) 2017-04-03 2023-11-21 American Gene Technologies International Inc. Compositions and methods for treating phenylketonuria
JP2020524996A (ja) 2017-06-16 2020-08-27 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド ヒトガンマデルタｔ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物
BR112021024124A2 (pt) * 2019-05-31 2022-01-11 American Gene Tech Int Inc Expressão otimizada de fenilalanina hidroxilase
JP2023510392A (ja) * 2020-01-16 2023-03-13 武田薬品工業株式会社 フェニルケトン尿症に対するアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子治療
TW202208632A (zh) * 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
MX2023003805A (es) 2020-10-01 2023-04-12 Genzyme Corp Casete de expresion de pah humana para el tratamiento de la pku mediante terapia de reemplazo genico dirigida al higado.
WO2023225569A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 Umoja Biopharma, Inc. Manufacturing viral particles
CN115772503B (zh) * 2022-08-16 2023-10-17 广东省南山医药创新研究院 一种表达pah的基因修饰细胞药物及其制备方法与应用
TWI893802B (zh) * 2023-05-11 2025-08-11 大陸商四川至善唯新生物科技有限公司 工程化的肝臟特異性增強子、核心啟動子及其應用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2284545T3 (es) 1999-11-16 2007-11-16 Genzyme Corporation Vectores y transgenes con elementos reguladores para la administracion de genes del higado.
US20030198620A1 (en) * 2002-04-16 2003-10-23 Keiya Ozawa Method of treating amino acid metabolic disorders using recombinant adeno-associated virus virions
US20050138677A1 (en) * 2003-09-16 2005-06-23 Pfister Herbert J. Transgenic animal model for the treatment of skin tumors
EP1854455B1 (en) 2006-05-10 2009-10-07 Biocompatibles UK Limited Spherical microcapsules comprising GLP-1 peptides, their production and use
EP2008656A1 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Bergen Teknologioverforing AS Compositions for the treatment of hyperphenylalaninemia
JP6188728B2 (ja) * 2012-02-07 2017-08-30 グローバル・バイオ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＧｌｏｂａｌ Ｂｉｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 核酸送達の区画化方法ならびにその組成物および使用
HK1225258B (en) 2013-08-08 2017-09-08 Global Bio Therapeutics, Inc. Clamping device for minimally invasive surgery
CN114395559A (zh) * 2014-04-25 2022-04-26 吉尼松公司 高胆红素血症的治疗
WO2017100551A1 (en) * 2015-12-09 2017-06-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. HETEROLOGOUS UTR SEQUENCES FOR ENHANCED mRNA EXPRESSION
US11820999B2 (en) * 2017-04-03 2023-11-21 American Gene Technologies International Inc. Compositions and methods for treating phenylketonuria
CA3077651A1 (en) * 2017-10-03 2019-04-11 Joseph Lillegard Vectors and methods of use
TW202016314A (zh) * 2018-05-09 2020-05-01 美商拜奧馬林製藥公司 治療苯丙酮尿症之方法

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