KR20200058433A - 바이러스 백신과 같은 생체분자의 생산 시스템 및 방법 - Google Patents

바이러스 백신과 같은 생체분자의 생산 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기(1); 및 농축기(2)를 포함하는 생체분자 생산 시스템에 관한 것으로, 상기 농축기는, 농축물을 수집하기에 적합하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기의 사이에 배치된 중간 용기(4)의 입력으로 상기 농축물을 재순환시킬 수 있는 농축물 도관(300, 303)을 구비한다. 제 2 및 제 3 양태에서, 본 개시는 생체분자 생산 방법 및 생체분자의 생산을 위한 개시된 시스템의 용도에 관한 것이다.

Description

바이러스 백신과 같은 생체분자의 생산 시스템 및 방법
본 발명은 바이러스 백신 생산의 기술 분야에 관한 것이며, 이에 대한 시스템 및 방법을 기술한다.
병원성 박테리아와 바이러스에 의해 유발되는 수많은 질병으로 인해, 항체와 바이러스와 같은 생체분자를 효율적으로 생산하기 위한 해당 분야의 요구가 여전히 크다.
배양된 세포로부터 생체분자, 특히 바이러스를 정제하는 전통적인 방법은 지루하고 시간 소모적이며, 생체분자 생산 비용이 너무 높다. 임상 투여에 적합한 생성물을 수득하기 위해서는, 배양 세포에서 바이러스 또는 바이러스 단백질과 같은 생체분자를 생산하는 신속하고 효율적인 방법이 필요하다.
본 개시는 상기한 문제점의 적어도 일부를 해결하는 것을 목표로 한다. 본 개시는 제한된 공간에서 최소한의 생체분자 손실 및 고품질의 생체분자 보장과 함께 생체분자의 정제에 적합한 시스템을 제공한다. 둘째, 운영 비용(OPEX)의 상당한 감소와 높은 수준의 봉쇄(containment)와 함께 여전히 높은 수율의 생체분자를 제공하는, 제한된 운영 단계를 갖는 방법론을 제공하는 것을 또한 목표로 한다.
본 개시는 청구항 1에 따른 생체분자 생산 시스템을 제공한다. 더욱 상세하게, 본 개시는 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기(bioreactor); 및 농축기(concentrator)를 포함하는 생체분자 생산 시스템 제공하며, 상기 농축기는, 농축물(retentate)을 수집하기에 적합하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기의 사이에 배치된 중간 용기(intermediate vessel)의 입력으로 농축물을 재순환시킬 수 있는 농축물 도관을 구비한다.
제 2 양태에서, 본 개시는 청구항 18에 따른 방법을 제공한다. 더욱 상세하게, 본 개시는 생체분자 생산 방법을 제공하며, 상기 생체분자는 세포를 함유하는 액체를 포함하는 생물반응기에서 생산되고, 상기 방법은 농축 단계를 포함하고, 상기 생물반응기로부터의 배출물(output)은 농축기에서 농축되며, 상기 농축기로부터의 배출물은 상기 생물반응기로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기 사이에 배치된 중간 용기로 재순환된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 청구항 31에 따른 생체분자의 정제를 위한 시스템의 용도를 제공한다. 더욱 상세하게, 본 개시는 바이러스 및/또는 바이러스 백신의 생산을 위한 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 시스템의 용도를 제공한다.
도 1은 본 개시의 일 실시형태에 따른 생체분자 생산 시스템의 개략적인 개요를 도시한다.
도 2a는 본 개시의 또 다른 실시형태에 따른 생체분자 생산 시스템의 개략적인 개요를 도시한다.
도 2b는 도 2a에 도시된 방식을 실행할 수 있는 시스템의 일 실시형태를 도시한다.
도 3은 본 개시의 또 다른 실시형태에 따른 생체분자 생산 및 정제 시스템의 개략적인 개요를 도시한다.
도 4는 본 개시의 또 다른 실시형태에 따른 생체분자 생산 및 정제 시스템의 개략적인 개요를 도시한다.
도 5 및 도 6은 본 개시의 실시형태에 따른 생체분자 생산 시스템을 도시한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하여 본 발명을 개시하기 위해 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 추가의 안내를 통해, 본 발명의 교시를 보다 잘 이해할 수 있도록 용어의 정의가 포함된다.
본원에서 사용된 다음 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다:
본원에서 사용된 부정관사와 정관사는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수형과 복수형을 모두를 지칭한다. 예로서, "격실(compartment)"은 하나 이상의 격실을 지칭한다.
파라미터, 양, 일시적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하는, 본원에서 사용된 "약"은 명시된 값으로부터 +/-20% 이하, 바람직하게는 +/-10% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-5% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/-1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변동을 포함하기 위한 것으로, 이러한 변동은 개시된 발명에서 실시하기에 적합한 경우에 그렇다. 그러나, "약"이라는 수식어가 지칭하는 값은 그 자체가 또한 구체적으로 개시되어 있음을 알아야 한다.
본원에서 사용된 "~으로 구성되다", "~으로 구성된" 및 "~으로 이루어진"은 "~을 포함하다", "~을 포함하는", 또는 "~을 함유하는"과 동의어이고, 다음에 뒤따르는 것, 예를 들어, 구성요소의 존재를 명시하는 포괄적 또는 개방형 용어이며, 본 기술 분야에 공지되거나 본원에 개시된 추가의, 언급되지 않은 구성요소, 특징, 요소, 부재, 단계의 존재를 제외하거나 배제하지 않는다.
종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 언급은 언급된 종점뿐만 아니라 해당 범위 내에 포함된 모든 수와 분수를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원 및 명세서 전체에서의 "중량%", "중량 퍼센트", %wt" 또는 "wt%"라는 표현은 제제(formulation)의 전체 중량을 기준으로 각각의 성분의 상대 중량을 지칭한다.
"생체분자"는 생물반응기에서 생산되는 임의의 관심 있는 생물학적 물질을 지칭한다. 생체분자는 예를 들어 바이러스, 바이러스-유사 입자, 바이러스 제품, 항체와 같은 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 대사산물 및 펩티드를 포함한다.
"항체"는, 인간화, 인간, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식, 및 시험관내 생산 항체와 같은 천연 또는 유전자 변형 형태를 포함하는, 인간 또는 다른 동물 세포주에서 유래된, 임의의 면역글로불린 분자, 항체-결합 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 융합 단백질, 단일클론 또는 다클론 항체를 지칭한다. 일반적으로 알려진 천연 면역글로불린 항체는 IgA(이량체), IgG, IgE, IgG 및 IgM(오량체)을 포함한다.
"바이러스" 또는 "비리온(virion)"은, RNA 또는 DNA 코어, 단백질 외피, 및 보다 복잡한 형태의 경우 주위 외막(surrounding surrounding)으로 구성된, 살아있는 숙주 세포, 주로 박테리아, 식물 및 동물의 세포에서만 복제하는, 초현미경적(대략 20 내지 300 nm 직경) 감염원을 지칭한다.
"생물반응기"는 예를 들어 생물학적 제품을 생산하기 위한 세포 또는 유기체의 배양을 위한 생물학적 활성 환경을 지원하는 임의의 장치 또는 시스템을 지칭한다. 여기에는 셀 스택(cell stack), 롤러 병(roller bottle), 쉐이크(shake), 플라스크, 교반 탱크 현탁 생물반응기(stirred tank suspension bioreactor), 고밀도 세포 고정층 관류 생물반응기(high cell density fixed-bed perfusion bioreactor) 등이 포함된다.
"정제"는 표적 생체분자의 농도에 대한 하나 이상의 표적 불순물 또는 오염 물질의 농도의 실질적인 감소를 지칭한다.
"접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)"는, 기공(pore)을 통과할 수 있을 정도로 작은 분자가 여과액(filtrate) 또는 "투과액(permeate)"에서 제거되고, 기공에 의해 거부될 수 있을 정도로 큰 분자가 농축물 내에 남게 되는, 하나 이상의 다공성 막에 의해 한정되는 공간을 통해 유체가 강제로 유동하는 막 여과(membrane filtration) 방법을 지칭한다. 접선 유동이라는 명칭은 특히, 유동이 막에 대해 대략 수직인, 소위 전량 여과(dead-end filtration)와는 대조적으로, 유체 유동의 방향이 막과 대략 평행하다는 사실을 의미한다.
본원에서 사용된 "바이러스 감염"은 바이러스의 세포로의 진입 및 세포에서의 바이러스의 후속 복제를 지칭한다.
"세포 배양 수확물(cell culture harvest)", "배양 수확물" 및 "수확물"은 동의어로 사용되며, 생물반응기에서 세포를 배양하여 수득된 정화되지 않은 (unclarified) 세포 배양액을 지칭한다. 배양 세포 또는 성장 세포는 또한 숙주 세포로 지칭된다.
"연속 인-라인(serial in-line)"은, 하나의 유닛 또는 장치의 유출이 중간 저장 없이 후속 유닛 또는 장치로 직접 공급되도록 장치 또는 유닛이 연결되는 것을 의미한다.
"격리실(isolator)" 또는 "캐비닛(cabinet)"은 본원에서 동의어로 사용되며, 생물학적 물질을 안전하게 연구하기 위한 환기형 실험실 작업 공간을 지칭한다. "격리실"은 병원체로 오염된(또는 잠재적으로 오염된) 물질의 봉쇄를 위한 밀폐된 격리실(enclosed isolator), 병원체로 오염된(또는 잠재적으로 오염된) 물질의 봉쇄를 위한 그리고 오염으로부터 생성물(예를 들어, 정제된 표적 생체분자)의 보호를 위한 밀폐된 생물학적 안전 캐비닛(biosafety cabinet) 및 오염으로부터 생성물(예를 들어, 정제된 표적 생체분자)을 보호하기 위한 층류 캐비닛(laminar flow cabinet)을 포함한다.
본 발명은 단백질 또는 바이러스와 같은 생체분자의 정제 시스템 및 방법에 관한 것이다.
제 1 양태에서, 본 개시는 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기, 및 농축기를 포함하는 생체분자 생산 시스템을 제공하며, 상기 농축기는, 농축기 배출물을 수집하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기의 사이에 배치된 중간 용기의 입력으로 배출물을 재순환시킬 수 있는 농축물 라인 배출구(retentate line output)를 구비한다.
추가의 양태에서, 본 개시는 표적 생체분자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기, 농축기, 및 생물반응기 내의 표적 생체분자보다 높은 농도로 표적 생체분자를 함유하는 세포 배양 수확물을 포함하는 중간 용기를 포함하는 생체분자 생산 시스템을 제공한다.
이 시스템은 강화(intensification) 기술을 통합함으로써, 각각의 격실의 크기를 획기적으로 줄이고, 따라서 작은 공간의 생산 및 정제 시스템을 생성한다. 생체분자의 생산 및 정제는, 세포 배양에서부터 최종 제품 정제까지 인간의 개입을 최소화하면서, 이 시스템을 기반으로 연속적이고 자동화된 공정으로 수행될 수 있다. 공정 강화 및 통합은 모든 격실을 격리실 내로 봉쇄하여 공정 조작자와 환경의 안전을 보장한다. 시스템은 차지하는 공간이 작다. 일부 실시형태에서, 시스템의 공간은 약 50 m2, 40 m2, 30 m2, 20 m2, 10 m2, 5 m2 이하이다. 일부 실시형태에서, 시스템의 공간은 약 5 m2 내지 10 m2, 5 m2 내지 20 m2, 5 내지 30 m2, 5 내지 40 m2, 5 내지 50 m2이다. 예를 들어, 공간은 10 m2 미만이다. 예를 들어, 7 m2 시스템은 배치(batch)당 적어도 5십만 투여량의 바이러스 백신, 또는 연간 약 107 투여량을 생산할 수 있다. 결과적으로, 이러한 자율적인 공정은 제품 비용뿐만 아니라 자본 지출을 크게 줄임으로써 생체분자 생산의 경제성에 극적인 영향을 미친다.
본 개시의 생체분자 생산 시스템은 산업 차원에서 생체분자 생산에 필요한 기반시설의 축소를 가능하게 하고, 따라서 소모품의 양을 또한 줄일 수 있다. 시스템은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 사용되는 소모품의 양을 줄인다. 시스템은 약 10% 내지 20%, 10% 내지 30%, 10% 내지 40%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90% 정도 사용되는 소모품의 양을 줄인다. 시스템은 또한 안전하고 효율적이며 비용 효과적인 방식으로 생체분자를 정제할 수 있다.
본 개시의 시스템은 선행 기술의 시스템에 비해 상당히 작은 장비를 사용하여 재조합 단백질, 바이러스 또는 바이러스 생성물과 같은 생체분자의 신속한 생산 및 정제를 가능하게 한다. 또한, 시스템을 사용하여 높은 수율의 생체분자가 수득되므로, 최종 생성물의 비용이 감소된다. 표적 생체분자의 회수는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상일 수 있다. 결과적으로, 투자 및 생산 비용이 절감되며 이는 상당한 이점이다.
시스템은 세포 성장 및/또는 세포 생성물 생산을 위한 적어도 하나의 생물반응기를 포함한다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 일회용 생물반응기이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 오토클레이브 가능하다. 시스템은 비-부착 세포뿐만 아니라 부착 세포의 성장에 사용될 수 있도록 설계되었다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 배치 생물반응기(batch bioreactor)이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 관류 생물반응기(perfusion bioreactor)이다. 관류 생물반응기에서, 동등한 부피의 배지가 생물반응기에 동시에 첨가되고 제거되는 반면, 세포는 생물반응기에 유지된다. 이는 신선한 영양소의 안정적인 공급 및 세포(폐기물) 생성물의 지속적인 제거를 제공한다. 관류는 종래의 생물반응기보다 훨씬 더 높은 세포 밀도를 달성하고, 따라서 부피당 생산성이 더 높다.
또한, 관류 생물반응기는 배지를 제거하는 과정 동안 분비된 생성물이 지속적으로 수확될 수 있도록 한다. 바람직하게, 생물반응기는 고정층 관류 생물반응기이다. 고정층 구성은 시스템에서 더 높은 밀도의 세포 성장이 달성될 수 있도록 하며, 이는 종래의 생물반응기보다 작은 생물반응기의 사용을 가능하게 한다. 상기 생물반응기는 적어도 5천만 세포/ml의 세포 밀도가 용이하게 달성될 수 있도록 한다. 따라서, 시스템은 생물반응기의 고밀도 세포 배양 능력을 손상시키지 않으면서, 종래의 생물반응기보다 작은 생물반응기를 이용한다. 따라서, 기술되는 바와 같은 생물반응기의 통합은 시스템에 필요한 공간의 축소를 가능하게 한다. 이러한 유형의 생물반응기를 사용하는 세포 배양의 강화로 인해, 시스템은 격리실 내에 배치될 수 있을 정도로 작은 고밀도 세포 생물반응기를 구비한다. 또 다른 실시형태에서, 시스템은 배치 모드와 관류 모드 둘 모두에서 작동하기에 적합한 생물반응기를 구비한다. 이는 시스템 내의 생물반응기가 생산 및 정제 공정의 특정 단계에 적응될 수 있기 때문에 유리할 수 있다, 예를 들어, 생물반응기는 접종 동안 배치 모드로 작동되고 세포 성장 동안 관류 모드로 작동될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 시스템은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 개 이상의 생물반응기를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 현재 개시된 시스템은 생물반응기 및 농축기를 포함한다. 농축기는 액체 내의 표적 분자의 양을 감소시키지 않으면서 시스템 내의 총 액체 부피의 감소를 가능하게 함으로써 액체 내에 존재하는 표적 생체분자의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 개시의 시스템에서의 농축기의 구현은, 액체의 부피를 감소시킬 수 있기 때문에 시스템에 의해 점유되는 공간의 양을 추가로 감소시킨다. 바람직하게, 농축기는 여과 장치 또는 크기 배제 크로마토그래피 장치(size exclusion chromatography device)를 포함한다.
본 시스템에서, 농축기는, 가장 큰 분율의 표적 생체분자를 함유하는 농축물을 수집하기에 적합하고 생물반응기의 입력으로 또는 농축기와 생물반응기의 사이에 배치된 중간 용기의 입력으로 농축물을 재순환시킬 수 있는 농축물 도관을 구비한다. 본 시스템은 따라서 동일한 농축기를 통해 농축물의 재순환을 가능하게 함으로써 생체분자의 추가 농축을 위해 농축된 농축물의 재순환을 가능하게 한다. 일 실시형태에서, 액체는 적어도 5번, 바람직하게는 적어도 10번, 보다 바람직하게는 적어도 15번, 가장 바람직하게는 세포 배양 수확물의 원하는 감소가 달성될 때까지 농축기를 통해 재순환된다. 이러한 구성으로 인해, 시스템은 농축물의 재순환으로 인해 고농축 생체분자 생성물이 수득될 때 필요한 하류 공정의 양을 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 시스템의 도관은 펌프와 밸브 및 예를 들어 농축기로부터 생물반응기 및/또는 중간 용기로의 액체의 흐름을 제어하고 모니터링하기 위한 유량계 또는 센서를 포함한다. 일 실시형태에서, 농축물 도관과 같은 시스템 도관은 검출기(예를 들어, 광 검출기)를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출기는 도관으로 이송되는 세포, 표적 생체분자 및/또는 오염 물질의 양을 모니터링할 수 있다.
중간 용기의 부피는 바람직하게는 생물반응기의 부피에 맞춰진다. 농축된 표적 생체분자를 함유하는 농축물은 결국 중간 용기에서 수확된다. 예를 들어, 시스템이, 관류 모드에서 300 L의 배양 배지를 사용하는 약 10 L의 용량을 갖는 생물반응기를 구비할 때, 이 시스템은 바람직하게는 약 10 L의 부피를 갖는 중간 용기를 구비할 것이다.
일 실시형태에서, 생물반응기와 농축기는 상기 생물반응기로부터 상기 농축기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 대안적으로, 중간 용기가 시스템에 포함되는 경우, 생물반응기와 중간 용기는 생물반응기로부터 상기 중간 용기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 또한, 중간 용기와 농축기는 또한 중간 용기로부터 농축기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 마지막으로, 농축기로부터 생물반응기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관이 또한 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 중간 용기는 일회용이거나 또는 오토클레이브 가능할 수 있다.
시스템의 농축기는 표적 생체분자가 들어있는 액체의 부피를 감소시키는 데 적합한, 당업자에게 공지된 다수의 장치로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농축기는 한 가지 유형의 농축 장치(예를 들어, 접선 유동 필터(tangential flow filter))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 농축기는 한 가지 이상의 유형의 농축 장치(예를 들어, 접선 유동 필터 및 데드-엔드 필터(dead-end filter))를 포함한다. 대부분의 이들 장치는 여과 및/또는 크기 배제 크로마토그래피를 기반으로 한다. 일 실시형태에서, 농축기는 여과 장치, 보다 바람직하게는 정밀-여과(micro-filtration) 장치, 또는 한외-여과(ultra-filtration) 장치 또는 정밀-여과 장치와 한외-여과 장치의 조합이다. 시스템이 표적 생체분자가 들어있는 액체의 부피를 감소시키기 위한 한외-여과 장치를 구비할 때, 장치의 막은 일반적으로 투과액이라고 지칭되는 저분자량 용질과 물의 유동을 가능하게 하는 반면, 생체분자와 같은 거대 분자는 농축물에서 막에 유지되도록 구성된다. 추가의 실시형태에서, 시스템은 접선 유동 여과(TFF) 장치를 구비한다. 일 실시형태에서, 상기 TFF는, 성장 배지와 용질과 같은 작은 오염 물질은 막의 기공을 통과할 수 있게 하면서, 사실상 모든 표적 생체분자를 보유하기에 충분한 다공성(porosity)을 갖는 기공을 갖는 적어도 하나의 중공 섬유를 구비한다. 액체는 막 또는 층을 통과하고 고체는 필터에 포획되는 데드-엔드 여과와는 대조적으로, 필터 표면을 가로지르는 접선 유동은 필터를 직접 통하지 않고 TFF 장치에서 이루어진다. 따라서, TFF 내의 필터 케이크(filter cake)의 형성이 방지된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 TFF는 접선 유동 여과를 가능하게 하는 카세트를 구비할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 TFF는 단일 통과 접선 유동 여과(single pass tangential flow filtration, SP-TFF)이다. 이 장치는 항체와 같은 단백질을 정제할 때 특히 유리하다.
상기한 바와 같이, 시스템은 생물반응기의 입력 또는 중간 용기의 입력으로 농축물을 재순환시킬 수 있는 농축물 도관을 구비한다. 시스템에서 농축기로서 TFF 장치를 구현할 때의 추가 이점은 TFF 장치가 연속 관류 공정에서 작동하기에 적합하다는 것이다. 이로써 배양 부피의 상당한 농축이 가능하다. 예를 들어, 500 m2 내부 성장 영역(세포 성장이 가능한 표면적을 지칭함)을 갖는 고정층 관류 생물반응기에서 출발할 때, 시스템은 배양 부피를 50 L의 최종 부피로 농축할 수 있다. 이는 전형적인 1000 L 마이크로캐리어(microcarrier) 기반 배양 또는 6000 개의 롤러 병 기반 배양에 해당하며, 따라서 시스템의 공간 축소를 전혀 제공하지 않는 선행 기술에 비해 현저한 개선을 제공한다. 시스템의 크기 축소로 인해 생체분자의 생산이 고도로 봉쇄된 멸균 환경에서 수행될 수 있고, 작업의 멸균성을 보장한다.
일 실시형태에서, 방향성 액체 유동을 제공하고 시스템의 다른 부분들 사이의 차압을 제어하거나 유도하기 위해 시스템의 도관에는 하나 이상의 펌프가 장착되어 있다. 추가의 실시형태에서, 펌프는 앞뒤 모두 작동할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 시스템의 도관에는 바람직하게 농축기를 통한 액체의 교차-유동(cross-flow)을 제공하기 위해 하나 이상의 펌프가 장착된다.
본원에 개시된 시스템의 도관은, 액체 유량, 온도, pH, 산소 포화도 및 압력을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 세포 성장 및 정제 공정에 중요한 파라미터를 측정하기 위한 센서를 구비할 수 있다. 또한, 시스템의 도관은 유동 분포를 제어하기 위한 밸브를 구비할 수 있다. 밸브는 또한 특정 시스템 부분 또는 도관과 결합되거나 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 밸브는 계량 밸브 또는 개별 밸브(예를 들어, 온 또는 오프 밸브)이다. 예를 들어, 밸브는 개별 밸브이다. 일부 실시형태에서, 밸브는 예를 들어 품질 관리를 위해 각각의 도관으로부터의 액체의 샘플링을 가능하게 한다.
일 실시형태에서, 시스템은 생물반응기와 농축기 사이에 배치된 프리-필터(pre-filter)를 구비한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 개 이상의 프리-필터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프리-필터는 동일한 다공성을 가질 수 있고, 또는 프리-필터는 상이한 다공성을 가질 수 있다. 일례에서, 시스템은 상이한 다공성의 적어도 두 개의 프리-필터를 갖는다. 프리-필터는 농축기의 막힘을 방지한다. 프리-필터는 바람직하게 적어도 50 μm, 적어도 75 μm, 적어도 100 μm, 적어도 125 μm 및 최대 250 μm, 200 μm, 최대 175 μm, 최대 150 μm의 기공 크기를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 필터는 125 μm의 기공 크기를 갖는다. 50 μm보다 작은 기공 크기는 충분한 액체 유량을 허용하지 않는 반면, 250 μm보다 큰 기공 크기는 시스템을 막을 수 있는 입자를 함유하는 액체 유동의 위험이 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 프리-필터의 기공 크기는 생체분자보다 상당히 크며, 세포 잔해(debris) 및 응집체(aggregate)를 보유하는 크기를 갖는다. 일 실시형태에서, 상기 프리-필터는 TFF일 수 있으며, 여기서 상기 관심 생체분자보다 큰 입자는 보유되는 반면, 생체분자를 함유하는 더 작은 입자는 상기 TFF를 통과할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 프리-필터는 흡착계(adsorption system), 예를 들어, 크로마토그래피를 기반으로 하는 흡착계일 수 있다.
중간 용기가 시스템에 포함되는 경우, 상기한 프리-필터는 바람직하게 생물반응기와 중간 용기 사이에 배치된다. 따라서, 시스템은 중간 용기와 농축기 사이의 도관에 입자가 존재하지 않도록 할 수 있으며, 그렇지 않은 경우 이들 입자의 크기로 인해 농축기가 막힐 수 있다.
시스템에서 생성된 원치 않는 물질 또는 공정의 부산물은 오염 제거 용기(decontamination vessel)에 일시적으로 저장될 수 있다. 시스템은 하나 이상의 오염 제거 용기를 포함할 수 있고, 투과액을 폐기하기 위해 농축기로부터 오염 제거 용기(들)로의 배출물 도관 라인과 같은 적합한 도관으로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 개 이상의 오염 제거 용기를 포함한다. 또 다른 예는 생체분자의 생산이 시작되기 전에(예를 들어, 세포의 바이러스 감염 전에) 액체를 직접 폐기하기 위한, 생물반응기로부터 오염 제거 용기로의 배출물 도관 라인이다.
생체분자의 생산 및 정제(예를 들어, 상류 생산 공정) 이외에, 시스템은 하류 생산 공정을 수행하기에 적합한 장치를 더 포함하도록 구성될 수 있다. 본 개시의 시스템은 정화 격실(clarification compartment)을 포함할 수 있다. 이 정화 격실은 생물반응기 및 농축기와 같은 상기한 장치로부터 물리적으로 분리될 필요는 없고 후자와 유동 연결될 것이다. 정화는 하류 공정의 첫 번째 단계로 간주될 수 있으며 이전에 수확한 농축물에서 세포 잔해 및 기타 오염 물질의 제거를 보장한다. 일부 실시형태에서, 정화 격실은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 개 이상의 필터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정화 격실은 단일 유형의 필터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정화 격실은 다수 유형의 필터를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 정화 격실은 심층 필터(depth filter), 필터 보조제로서 규조토를 포함하는 필터, 마이크로필터, 및 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피를 기반으로 하는 필터와 같은 기능성 필터에서 선택되는 하나 이상의 필터를 포함한다. 일례에서, 정화 격실은 음이온 교환 심층 필터 및 정밀-여과 장치를 포함한다. 정화는 숙주 세포 DNA 및 단백질 잔기와 같은 남아있는 세포 배양 불순물의 제거를 가능하게 한다. 따라서, 이러한 구성으로 인해, 잔류 고체 오염 물질이 생성물 스트림으로부터 제거될 수 있고, 따라서 후속 정제 격실의 올바른 작동을 보장한다. 농축물이 농축기로부터 생물반응기 또는 중간 용기로 재순환되는, 상기한 바와 같은 농축 단계의 사용으로 인해, 정화 격실은 (선행 기술과 비해) 크기가 작을 것이고, 소형 격실의 작동 및 처리 시간의 감소를 가능하게 하고, 따라서 생체분자 생산 및 정제 공정의 전반적인 경제성에 유익하다. 일부 실시형태에서, 정화 격실은 농축기가 없는 시스템 내의 정화 격실보다 적어도 50%, 75%, 80%, 85% 작다. 따라서, 농축기를 포함하는 시스템의 사용으로 인해, 시스템 내에 농축기가 없는 경우 정화 격실의 크기를 필요한 크기의 최대 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%로 줄일 수 있다.
현재 개시된 시스템은, 다른 또는 추가의 실시형태에서, 크로마토그래피 격실을 포함할 수 있으며, 여기서 크로마토그래피 격실과 정화 격실은 정화 격실로부터 크로마토그래피 격실로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 크로마토그래피 격실은 표적 생체분자의 추가 정제를 가능하게 하고 적어도 하나의 크로마토그래피 장치를 포함한다. 일 실시형태에서, 크로마토그래피 격실은, 제한된 수의 사이클에서 많은 입력 부피를 처리할 수 있는 높은 결합 용량을 제공하는 단일 크로마토그래피 장치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 장비는 농축기가 없는 시스템 내의 크로마토그래피 장비보다 적어도 50%, 75%, 80%, 85% 작다. 따라서, 농축기를 포함하는 시스템의 사용으로 인해, 시스템 내에 농축기가 없는 경우 크로마토그래피 장치의 크기를 필요한 크기의 최대 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%로 줄일 수 있다. 일 실시형태에서, 크로마토그래피 격실은 흡수 장치 및/또는 하나 이상의 접선 유동 여과 장치를 직렬로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 격실은 연속 모드 작동에 적합한 혼합 모드 크로마토그래피 막을 포함한다. 개시된 바와 같이 시스템의 제 1 부분에 의해 보장된 부피 감소로 인해, 크로마토그래피 격실 내의 필요한 크로마토그래피 막 부피는 선행 기술의 시스템에서보다 작다. 따라서, 시스템은 고가의 대형 크로마토그래피 장비와 관련된 비용을 줄일 수 있다. 또한, 통상적으로 두 개의 연속 크로마토그래피 장치의 존재를 필요로 하는 선행 기술의 생체분자 생산 및 정제 시스템과는 대조적으로, 본 개시의 시스템은 크로마토그래피 격실에서 단일 단계 크로마토그래피 장치를 구현함으로써 동등한 생체분자 순도 및 수율을 보장한다. 이로 인해 생체분자 생산 공간, 생산 비용 및 생산 시간이 현저히 감소하고, 따라서 낮은 공정 용적을 유지하면서 생산성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 공간이 5000 m2인 종래의 소아마비 백신 생산 시스템은 투여량당 미화 1.2 내지 1.5 달러의 생산 비용과 적어도 5주의 처리 시간으로 연간 6000만 투여량의 생산 능력을 가질 수 있다. 본 개시의 일 실시형태에 따른 소아마비 백신 생산 시스템은 1500 m2의 공간 및 투여량당 미화 0.22 달러의 생산 비용과 약 3 주의 처리 시간으로 연간 4000만 투여량의 생산 능력을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시의 시스템에서 생산 및 정제된 생체분자는 정제 불활성화 바이러스이다. 따라서, 시스템은 바이러스 불활성화 격실을 구현할 수 있고, 바이러스 불활성화 격실과 크로마토그래피 격실은 크로마토그래피 격실로부터 바이러스 불활성화 격실로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 바이러스 불활성화는, 표적 생체분자가 바이러스 입자인 실시형태에서, 포름알데히드에 의한 크로마토그래피 이후 수득된 정제 바이러스를 희석함으로써 달성된다.
일 실시형태에서, 생물반응기로부터 농축기로의 공정 흐름은 공정 제어기 또는 공정 제어 장치에 의해 제어된다. 제어기는 생물반응기 파라미터뿐만 아니라 공정 흐름 파라미터를 제어하고 조작하며 상기한 하나 이상의 센서로부터의 데이터(pH, 온도 및/또는 DO)를 모니터링하고 기록한다. 상기 제어기는 또한 농축기의 기능 및 농축기로부터 중간 용기로의 농축물의 재순환을 제어한다. 이를 위해, 상기 제어기는 시스템의 공정 흐름 및 파라미터를 모니터링하고 제어하며 기록할 수 있는 소프트웨어를 구비한다. 제어기는 시스템의 후속 부분을 통한 액체 유동을 관리할 수 있고, 따라서 표적 생체분자의 생산 및 정제를 제어할 수 있다. 바람직하게, 액체 유동은 펌프 및/또는 그 안에 존재하는 밸브의 기능을 제어함으로써 시스템의 제어기에 의해 관리된다. 일 실시형태에서, 공정 제어 장치는 시스템의 공정 흐름의 자동 제어를 제공한다.
제어기에 연결할 수 있는 컴퓨터를 통해 제어기로의 액세스가 사용자에게 제공될 수 있다. 제어기는, 와이파이 또는 블루투스 연결과 같은 무선이거나 상기 제어기 상에 존재하는 USB 연결과 같은 유선일 수 있는 하나 이상의 데이터 전송 장치를 통한 데이터를 전송할 수 있다. 제어기 상의 데이터 연결은, 다른 또는 추가의 실시형태에서, IT 네트워크로의 접근을 가능하게 할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 시스템의 사용자 또는 조작자가 공정 흐름 및 측정된 파라미터를 따를 수 있게 하고, 예를 들어 특정 하위 공정을 시작하거나 중지시킴으로써 시스템을 수동으로 작동시킬 수 있게 하는 스크린이 제어기에 연결된다.
추가의 또는 다른 실시형태에서, 제어기는 상기한 생물반응기(1)와 농축기(2) 및 중간 용기(4)를 수용하는 도킹 스테이션(docking station)에 통합될 수 있다. 도킹 스테이션에 제어기를 통합하면 시스템에 포함되어 있을 때 시스템의 소형화를 유지할 수 있다.
본 개시의 시스템 내의 각각의 격실의 최적화로 인해, 각각의 격실의 컴팩트한 구조는 시스템에 속하는 모든 격실이 단일 캐비닛, 격리실 또는 봉쇄 구역(containment enclosure) 내에 통합될 수 있게 한다. 이는 필요한 공간을 줄이는 데 기여할 뿐만 아니라 이 시스템을 사용할 때 안전성을 높이는 데에도 기여한다. 또한, 격실 간의 연결로 인해 봉쇄 구역을 나가지 않고도 생산 및 정제 단계를 수행할 수 있고, 따라서 안전 위험을 최소화한다.
시스템의 컴팩트한 구조는 또한, 다른 또는 추가의 실시형태에서, 예를 들어 컨테이너 또는 트레일러 내에 생체분자 생산 및 정제 시스템을 위한 휴대용 시스템으로서 시스템을 제공할 수 있다. 따라서, 본 시스템은 이동식 시스템일 수 있다. 다른 또는 추가의 실시형태에서, 플랫폼의 격실은 또한 예를 들어 각각의 격실 또는 격리실을 이동식 스키드(mobile skid) 상에 배치함으로써 동원될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 시스템은 모듈 방식으로 조립될 수 있다.
다른 또는 추가의 실시형태에서, 시스템은 봉쇄 구역을 더 포함하며, 본원에 개시된 하나 이상의 격실, 격리실 및/또는 시스템은 봉쇄 구역에 수용된다. 일부 실시형태에서, 이 봉쇄 구역은 사용자 및/또는 재료가 봉쇄 구역으로 들어가는 적어도 하나의 입구 및 사용자 및/또는 재료가 봉쇄 구역에서 나가는 적어도 하나의 출구를 구비한다. 봉쇄 구역의 진입 수단 및 출구 수단은 상기 시스템의 격실에 의해 수행되는 행위에 대한 데이터를 수집, 모니터링 및/또는 기록하는 공정 제어 장치 또는 공정 제어기에 의해 자동으로 개폐된다. 공정 제어기는, 특정 작업(예를 들어 바이러스 비활성화)의 종료와 같이, 공정에 의해 생성된 입력 신호에 따라 입구 또는 출구를 잠그거나 잠금 해제한다. 봉쇄 구역으로의 출입에 대한 자동 제어는 안전한 조건에서만 봉쇄 구역의 개방을 보장한다. 일 실시형태에서, 시스템은 다수의 제어 장치를 포함한다. 다른 또는 추가의 실시형태에서, 시스템의 격실은 봉쇄 구역 내의 격리실 내에 배치된다. 격리된 격실은 이들 격리실 사이에 존재하는 칸막이에 의해 서로 연결되거나 분리될 수 있으며, 이들 칸막이는 존재하는 경우 개방형 구성 또는 폐쇄형 구성일 수 있다. 개방형 구성에서, 하나의 격리실로부터 다른 격리실로의 접근이 허용된다. 격리실로의 및/또는 격리실 간의 접근은 따라서 상기 칸막이의 개폐를 통해 조절된다. 또 다른 실시형태에서, 격실은 단일 격리실 내에 배치되고, 개방형 및 폐쇄형 구성일 수 있는 칸막이에 의해 서로 분리됨으로써, 하나의 격리실로부터 다른 격리실로의 재료 또는 유체의 접근 및 이송을 허용하거나 차단할 수 있다. 상기 칸막이의 개폐는 또한, 시스템의 안전한 사용을 더 보장하기 위해, 특정 작업(예를 들어 바이러스 비활성화)의 종료와 같이, 공정에 의해 생성된 입력 신호에 따라 공정 제어 장치 또는 공정 제어기에 의해 자동으로 제어될 수 있다. 상기 칸막이는 배관과 같은 도관을 통과시키기 위한 개구부를 구비할 수 있다.
칸막이 및/또는 입구 및/또는 출구 수단은 강한 재료, 예를 들어 알루미늄, 스테인레스 스틸, 섬유 유리 또는 임의의 다른 적합한 재료로 제조될 수 있다. 칸막이 및/또는 입구 및/또는 출구 수단은 리프트 게이트(lift gate) 유형의 도어, 스윙 도어(swing door), 셔터(shutter) 또는 슬라이딩 도어(sliding door)를 포함할 수 있고, 유리 또는 플렉시글라스(Plexiglas) 패널을 포함할 수 있다. 격리실 및 봉쇄 시스템은 유럽 및 미국 표준에 따라 생산 및 조립되며 내부 환경을 외부 환경과 격리시킨다.
적절한 접근 메커니즘, 예를 들어, 자물쇠 및 열쇠 메커니즘, 패스 코드 펀치 패드(pass code punch pad), 카드 판독기(card swipe), 트랜스폰더 리더(transponder reader), 지문 스캐너(finger print scanner), 망막 스캐너(retina scanner), 센서, 무선 주파수 식별(RFID)과 같은 자동 식별 및 데이터 수집 방법, 생체인식(biometrics, 예를 들어, 홍채 및 얼굴 인식 시스템), 자기 띠(magnetic stripe), 광학 문자 인식(Optical character recognition, OCR), 스마트 카드 및 음성 인식 또는 기타 접근 메커니즘이 제공되어 칸막이 및/또는 입구 및/또는 출구를 잠금 해제할 수 있다.
바람직하게, 시스템으로 들어가는 사용자는 격리된 격실 외부에 남는다. 품질 관리 절차를 위한 샘플 채취를 허용하기 위해, 격리된 격실은 일 실시형태에서 사용자에게 격실에 대한 제한된 간접 접근을 허용하는 유연한 슬리브(flexible sleeve)를 구비하며, 격실의 내용은 사용자로부터 격리된 상태로 유지된다. 이러한 추가의 봉쇄 및 격리 조치로 인해, 시스템은 사용자에게 큰 위험이 되는 생체분자의 생산 및 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 정제 불활성화 바이러스로 구성된 백신의 제조에 필요한 다량의 생 바이러스의 정제에 적합하다. 후자의 경우, 높은 수준의 BSL-3 봉쇄가 필요하다.
시스템의 일부인 격리실과 봉쇄 구역을 통합하면, 생물학적 안전 규칙을 보다 간단하고 저렴하게 준수할 수 있고, 환경과 조작자에 대한 오염 위험이 줄어든다.
일 실시형태에서, 상기 생체분자 생산 시스템은:
- 세포를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 고정층 관류 생물반응기; 및 농축기, 바람직하게는, TFF를 포함하는 상류 공정 격실로서, 상기 농축기는, 상기 농축기로부터의 농축물과 같은 액체 배출물을 수집하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기 사이에 배치된 중간 용기의 입력으로 상기 액체 배출물을 재순환시키기에 적합한 농축물 도관을 구비하는, 상류 공정 격실과;
- 정화 격실과;
- 크로마토그래피 격실; 및
- 선택적으로 바이러스 불활성화 격실을 포함하고,
상기 격실은 하나 이상의 격리실 내에 배치된다. 일부 실시형태에서, 격실은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 개의 격리실 내에 배치된다. 일부 실시형태에서, 격리실은 하나의 격실 또는 하나 이상의 격실을 포함할 수 있다.
일례에서, 시스템은 적어도 상류 공정을 포함하는 제 1 격리실; 및 하류 공정을 포함하는 제 2 격리실을 포함하고, 제 2 격리실은 정화 격실 및 크로마토그래피 격실을 포함한다.
우선, 상기 시스템은 적어도 세 개의 격리실을 포함하는데, 제 1 격리실은 상기 상류 공정을 포함하고, 제 2 격리실은 상기 정화 격실 및 크로마토그래피 격실을 포함하며, 제 3 격리실은 상기 불활성 격실을 포함한다. 상기 제 1 격리실은 바람직하게 상기 제 2 격리실과 유동 연통하고, 상기 제 2 격리실은 바람직하게 상기 제 3 격리실과 유동 연통할 것이다.
상기 격리실은 또한 칸막이에 의해 서로 연결되거나 분리될 수 있으며, 상기 칸막이는 개방형 구성 또는 폐쇄형 구성일 수 있다. 이는 위에서 광범위하게 논의되었다.
최종 실시형태에서, 격리실은 상기한 바와 같이 봉쇄 구역에 포함될 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시는 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 고정층 관류 생물반응기; 및 중공 섬유 접선 유동 여과(TFF) 장치를 포함하는 바이러스 생산 시스템을 제공하며, 상기 TFF는, 상기 농축물을 수집하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 TFF와 상기 생물반응기 사이에 배치된 중간 용기의 입력으로 상기 농축물을 재순환시키기에 적합한 농축물 도관을 구비한다.
제 2 양태에서, 본 개시는 생체분자 생산 방법을 제공하며, 상기 생체분자는 세포를 함유하는 액체를 포함하는 생물반응기에서 생산되고, 상기 방법은 농축 단계를 포함하고, 상기 생물반응기로부터의 배출물은 농축기 내에서 농축되며, 상기 농축기로부터의 배출물은 상기 생물반응기로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기 사이에 배치된 중간 용기로 재순환된다. 실시형태 중 하나에서 기술된 시스템이 상기 방법을 실행하기에 적합하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시에 따른 생체분자 생산 방법은 시스템의 도관에 장착된 펌프 및 밸브를 이용하여 시스템을 통한 액체의 방향성 유동을 유도하고 시스템 다양한 부분의 가역적 결합 및 분리를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 개시된 방법은 농축기에서 한외 여과 장치를 이용한다. 농축기에 존재하는 한외 여과 장치의 막힘을 방지하기 위해, 액체는 먼저, 액체로부터 큰 고체 입자를 제거하지만 관심 생체분자에 대해서는 투과성인 프리-필터를 통과한다. 일부 실시형태에서, 프리-필터는 대략 125 μm의 기공 크기 및 대략 100 kDa의 컷오프(cutoff)를 갖는다. 바람직하게, 재순환된 농축물은 방법의 일 실시형태에서 중간 용기에 이를 수집함으로써 수확됨으로써, 농축된 세포 배양 수확물을 수득한다. 일 실시형태에서, 생물반응기 및 중간 용기와 같은 시스템의 일부는 예를 들어 이에 한정되지 않지만 pH, 온도 및 용존 산소를 측정하기 위한 하나 이상의 센서를 구비할 수 있다. 따라서, 생물반응기 및 중간 용기는 농축된 세포 배양 수확물의 pH 및 온도의 제어를 허용할 수 있다.
선택적으로, 농축된 세포 배양 수확물의 pH는 하류 공정을 위해 원하는 값으로 조절된다. 또한, 농축된 세포 배양 수확물에 대해 선택적 엔도뉴클레아제(endonuclease) 처리가 수행되어, 단백질을 그대로 유지하면서, 농축된 세포 배양 수확물에 존재하는 DNA 및 RNA를 분해할 수 있다. 엔도뉴클레아제 처리 단계는 농축된 세포 배양 수확물 내의 응집의 방지에 기여할 수 있고, 따라서 추가의 하류 공정을 위한 최적의 조건을 제공한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 농축된 세포 배양 수확물을 정화함으로써 정화된 세포 배양 수확물을 수득하는 단계 및/또는 이후 정화된 세포 배양 수확물에 대해 크로마토그래피 단계를 수행함으로써 원하는 생체분자를 정제하는 단계를 포함할 수 있는 하류 가공 단계를 더 포함한다.
상기한 바와 같이, 현재 개시된 방법은 필요한 장비의 소형화로 인해 제한된 공간에서 수행될 수 있으며, 따라서 격리실 내 및 심지어는 봉쇄 구역 내에서 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시의 방법은 단백질(항체) 및 바이러스와 같은 생체분자를 정제하는데 특히 적합하다. 이 경우, 방법은 바람직하게 불활성화 조성물로 바이러스를 처리하는 단계로 이루어진, 정제된 바이러스 생성물에 대해 수행되는 바이러스 불활성화 단계를 더 포함한다. 불활성화 조성물은 포름알데히드, 적어도 하나의 세제(detergent), 적어도 하나의 산(acid) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 불활성화 조성물은 과황산칼륨 용액(상업적으로 Virkon®로 알려져 있음), 수산화나트륨 또는 표백제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 포름알데히드 또는 포르말린이 바이러스 불활성화에 사용된다. 따라서, 개시된 방법의 추가의 바람직한 실시형태에서, 정제된 생체분자는 예를 들어 불활성화 소아마비 바이러스 백신과 같은 백신의 제제화에 사용되는 정제 불활성화 바이러스이다. 본 개시의 방법은 생체분자가 바이러스 또는 불활성화 바이러스 입자인 생체분자의 생산 및 정제에 특히 적합하다.
현재 기술된 방법 및 시스템은 상기 방법 및 시스템의 사용과 관련된 매우 높은 수준의 안전성 및 매우 낮은 수준의 건강 또는 환경 위험을 보장한다. 따라서, 그리고 추가의 양태에서, 본 개시는 바이러스 및/또는 바이러스 백신의 생산을 위한 상기한 시스템의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 이전에 기술된 임의의 형태의 설계로 제한되지 않으며, 첨부된 청구범위의 재평가 없이, 제시된 예에 일부 변형이 추가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 소아마비 백신을 참조하여 기술되었지만, 본 발명은 로타바이러스(Rotavirus) 백신, 예를 들어 또는 광견병(Rabies) 백신에 적용될 수 있다.
상세한 도면 설명
도 1은 본 개시의 일 실시형태에 따른 생체분자 생산 시스템의 개략적인 개요를 도시하고 있다.
개략적인 개요는, 세포 배양물을 포함하는 생물반응기(1)로서, 세포 배양물은 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 포함하는, 생물반응기(1); 및 농축기(2)를 포함하는 생체분자 생산 시스템을 도시하며, 상기 농축기는, 농축기 배출물을 수집하고 상기 생물반응기(1)의 입력으로 배출물의 재순환시킬 수 있는 농축물 라인 배출구(300)를 구비한다. 생물반응기(1) 및 농축기(2)는 상기 생물반응기(1)로부터 상기 농축기(2)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관(301)에 의해 연결된다. 농축기(2)의 막힘을 방지하기 위해, 액체는 먼저, 액체로부터 큰 고체 입자를 제거하지만 관심 생체분자에 대해서는 투과성인 프리-필터(7)를 통과한다. 방향성 액체 유동을 제공하고, 시스템의 다른 부분들 사이의 차압을 제어하거나 유도하며, 농축기(2)를 통한 액체의 교차-유동을 제공하기 위해 시스템의 도관에는 펌프(5)가 장착된다. 또한, 시스템의 도관은 유량 분포를 제어하기 위한 밸브(6)를 구비한다. 밸브는 또한 특정 시스템 부분 또는 도관과 결합되거나 분리될 수 있다. 최종적으로, 투과액을 폐기하기 위해 농축기(2)로부터 오염 제거 용기(8)로 배출물 도관(302) 라인이 제공된다. 오염 제거 용기(8)는 시스템에서 생성된 원치 않는 물질 또는 공정의 부산물이 일시적으로 저장될 수 있는 적어도 하나의 폐기물 용기(예를 들어, 탱크)를 포함한다.
농축기는 액체 내의 표적 분자의 양을 감소시키지 않으면서 총 액체 부피의 감소를 가능하게 함으로써 액체에 존재하는 표적 생체분자의 양의 증가를 제공한다. 개시된 시스템의 본 실시형태는 따라서 동일한 농축기(2)를 통한 액체의 재순환을 가능하게 함으로써 생체분자의 추가 농축을 위해, 목표 생체분자를 함유하는 농축된 액체 농축물의 재순환을 제공한다. 이러한 구성으로 인해, 전체 시스템이 액체의 재순환으로 인해 고농축 생체분자 생성물이 수득될 때 필요한 적은 수의 하류 공정으로 설계될 수 있다.
도 2a는 본 개시의 또 다른 실시형태에 따른 생체분자 생산 시스템의 개략적인 개요를 도시하고 있다.
개략적인 개요는, 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기(1), 및 농축기(2)를 포함하는 생체분자 생산 시스템 도시하며, 상기 농축기는, 농축기 배출물을 수집하고 상기 농축기(2)와 상기 생물반응기(1) 사이에 위치한 중간 용기(4) 또는 농축기 병(concentrator bottle)의 입력으로 농축기 배출물을 재순환시킬 수 있는 농축물 라인 배출구(303)를 구비한다. 생물반응기(1)와 중간 용기(4)는 생물반응기(1)로부터 상기 중간 용기(4)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 대안적으로, 생물반응기(1)로부터 농축기(2)로 액체를 이송하기 위해 생물반응기(1)로부터 농축기(2)로 직접 연결된 추가 도관이 존재할 수 있다(도면에는 도시되지 않음). 또한, 중간 용기(4)와 농축기(2)는 또한 중간 용기(4)로부터 농축기(2)로의 액체 이송을 가능하게 하는, 펌프(5)를 갖는 도관(306)에 의해 연결된다. 농축기는 액체 내의 표적 분자의 양을 감소시키지 않으면서 총 액체 부피의 감소를 가능하게 함으로써 액체에 존재하는 표적 생체분자의 양을 증가시킨다.
일 실시형태에서, 두 개의 가스 연결부가 존재하는데, 하나의 연결부(304)는 생물반응기(1)로 들어가고 하나의 연결부(305)는 상기 생물반응기(1)를 빠져나간다. 생물반응기(1)는 적합한 성장 배지 내에 세척, 분리 및 중화된 세포 전배양물(preculture)을 포함하는 접종물(inoculum) 용기(10), 및 생물반응기(1) 내부의 pH 조절을 위한 염기(13) 유입구에 더 연결된다.
다수의 유형의 농축기가 시스템에 사용하기에 적합하며, 본 실시형태에 따른 시스템은 농축기로서 작용하는 접선 유동 여과(TFF) 장치를 구비한다. TFF는, 성장 배지와 용질과 같은 작은 오염 물질은 막의 기공을 통과할 수 있게 하면서, 사실상 모든 표적 생체분자를 보유하도록 장착된다. 이를 위해, 그리고 가능한 실시형태에서, 상기 TFF는, 성장 배지와 용질과 같은 작은 오염 물질은 투과액이 되도록 하면서, 특정 다공성, 예를 들어, 사실상 모든 표적 생체분자를 보유하기에 충분한 다공성의 기공을 갖는 적어도 하나의 중공 섬유를 구비할 수 있다. TFF 농축기(2)는 표적 생체분자를 함유하는 농축물을 중간 용기(4)의 입력으로 재순환시킬 수 있다. 투과액을 폐기하기 위해 TFF 농축기(2)로부터 오염 제거 용기(8) 로의 배출물 도관(307) 라인이 제공된다. 오염 제거 용기(8)는 시스템에서 생성된 원치 않는 물질 또는 공정의 부산물이 일시적으로 저장될 수 있는 탱크와 같은 적어도 하나의 폐기물 용기를 포함한다. 방향성 액체 유동을 제공하고, 시스템의 다른 부분들 사이의 차압을 제어하며, TFF 농축기(2)를 통한 액체의 교차-유동을 제공하기 위해 시스템 도관에는 펌프(5, 501)와 밸브(6)가 장착된다.
농축기(2)는 액체 내의 표적 분자의 양을 감소시키지 않으면서 총 액체 부피의 감소를 가능하게 함으로써 액체에 존재하는 표적 생체분자의 양을 증가시킨다. 시스템에 의한 액체 부피의 감소는 산업 차원에서 생체분자 생산에 필요한 기반시설의 축소를 가능하게 하고, 따라서 소모품의 양을 또한 줄일 수 있다. 또한, 이 시스템의 TFF 농축기(2)는 연속 관류 모드에서 자율적으로 작동된다. 이는 사람의 개입을 최소화하고, 따라서 안전 위험을 제한하고 비용을 줄인다.
도 2b는 도 2a에 도시된 방식을 실행할 수 있는 시스템을 도시하고 있다.
시스템은 생물학적 안전 캐비닛 또는 격리실에서 사용되도록 설계되었고, 생물학적 물질의 공정 개발 작업 및 실험실 규모 생산 모두에 사용될 수 있으며, 이 경우 소량의 상업적 생산뿐만 아니라 임상 시험용 재료를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 시스템은 비-부착 세포뿐만 아니라 부착 세포의 성장에 사용될 수 있도록 설계되었다. 이를 위해, 시스템은 생물반응기(1), 바람직하게는 고정층 생물반응기를 포함한다. 생물반응기의 고정층은 구조적 요소의 표면에서 세포의 성장을 허용하기 위한 상기 구조적 요소를 구비할 수 있다. 이러한 요소의 예는, 세포의 성장을 허용하고 유체 분포 및 난류를 촉진하기 위한 나선형 구조를 기술하고 본원에 참고로 포함되는 PCT/EP2017/078775에 제시되어 있다. 요소는 폴리에틸렌, 바람직하게는 친수화된(hydrophilized) 폴리에틸렌으로 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 생물반응기(1)는 일회용이다. 액체 또는 가스 이송을 위해 시스템에 존재하는 도관은 도면에 도시되어 있지 않다. 생물반응기(1)는 적어도 두 개의 유체 연결부를 갖는데, 하나의 연결부는 유체를 생물반응기 내로 유입시킬 수 있고, 제 2 연결부는 유체의 제거를 가능하게 한다. 이 마지막 연결부는 비워진 생물반응기(1) 내부의 무용 공간을 최소화하도록 설계되었다. 추가의 실시형태에서, 상기 생물반응기(1)는 가스의 유입 및/또는 배출을 허용하기 위한 가스 연결부를 구비한다. 바람직한 실시형태에서, 세 개의 가스 연결부가 존재하는데, 두 개의 연결부는 생물반응기(1)로 들어가고 한 개의 연결부는 상기 생물반응기(1)를 빠져나간다. 유리하게, 생물반응기(1)는 또한 공정-중 제어 및 공정 종료 분석 모두를 위해, 바람직하게는 상기 생물반응기(1)의 상단으로부터 샘플링을 허용하도록 설계된다. 샘플링은 주사기 또는 이와 동등한 조립체를 통해 이루어질 수 있다.
생물반응기(1)에서의 순환은 임펠러, 바람직하게는 자기 구동식 임펠러(magnetically driven impeller)의 사용에 의해 달성된다. 상기 생물반응기(1)의 내용물을 가열하기 위해 또는 상기 생물반응기(1)로 유입되는 배지를 가열하기 위해 가열 요소가 존재할 수 있다. 생물반응기(1)의 뚜껑에는 상기 생물반응기(1) 내의 온도, pH 및/또는 용존 산소를 측정하기 위한 하나 이상의 센서가 구비된다.
생물반응기(1)로부터의 액체 배출물은 도관을 통해 농축기 병으로도 알려진 중간 용기(4)로 이송될 것이다. 이러한 중간 용기(4)는 PET 병일 수 있으며, 약 500 ml 내지 5000 mL의 부피를 수용할 수 있다. 이 중간 용기(4)는 TFF일 수 있는 농축기(2)에 연결된다. 표적 생체분자를 포함하는 중간 용기(4)로부터의 액체는 펌프(501)에 의해 농축기(2)로 이송될 것이다. 상기 펌프(501)는 일 실시형태에서 농축기(2) 내부에서 2000 s-1의 전단 속도를 제공할 수 있다.
농축기(2)의 농축물은 이후 중간 용기(4)로 되돌아가는 반면, 액체 폐기물은 폐기될 것이다(바람직하게는 폐기물 병, 도 2b에는 도시되지 않음). 중간 용기(4)로부터 농축기(2)로의 농축물의 전후 재순환으로 인해, 고도로 농축된 생체분자 생성물이 수득되며, 이는 추가의 하류 공정(예를 들어, 크로마토그래피 정제) 또는 예를 들어 임상 시험과 같은 시험을 위한 공급원으로 이용될 수 있다.
생물반응기(1)로부터 농축기(2)로의 공정 흐름은 공정 제어기에 의해 제어된다. 시스템의 소형화를 유지하기 위해, 특히 생물학적 안전 캐비닛 또는 격리실 내부에서 사용되는 크기를 고려할 때, 제어기는 상기한 생물반응기(1)와 농축기(2) 및 중간 용기(4)를 수용하도록 설계된 도킹 스테이션(30)에 통합된다. 제어기는 생물반응기 파라미터뿐만 아니라 공정 흐름 파라미터를 제어하고 조작하며 상기한 하나 이상의 센서로부터의 데이터(pH, 온도 및/또는 DO)를 모니터링하고 기록한다. 상기 제어기는 또한 바람직하게 중간 용기(4)와 농축기(2) 사이의 펌프(들)(5, 501)의 기능을 제어함으로써(4) 농축기(2)의 기능 및 농축기(2)로부터 중간 용기(4)로의 농축물의 재순환을 제어한다.
이를 위해, 상기 제어기는 시스템의 공정 흐름 및 파라미터를 모니터링하고 제어하며 기록할 수 있는 소프트웨어를 구비한다. 제어기에 접속할 수 있는 컴퓨터를 통해 제어기로의 액세스가 사용자에게 제공될 수 있다. 제어기는 상기 도킹 스테이션 상에 존재하는 하나 이상의 USB 연결을 통해 데이터를 전송하고 IT 네트워크에 접근할 수 있게 한다. 도킹 스테이션 상에 존재하는 터치 스크린과 같은 스크린(29)은 사용자가 공정 흐름 및 측정된 파라미터를 따르고, 예를 들어 특정 하위 공정을 시작하거나 중지시킴으로써 시스템을 수동으로 작동시킬 수 있게 한다.
상기한 바와 같이, 제어기가 통합된 도킹 스테이션(30)은 또한 생물반응기(1)에 염기(13)를 공급하기 위한 병의 도킹을 가능하게 한다. 이러한 병은 부피가 500 ml내지 5000 ml인 PET 병일 수 있다. 상기 도킹 스테이션(30)은 또한 생물반응기(1)에 접종물(10)/첨가제(도시되지 않음)를 공급하기 위한 병의 도킹을 가능하게 할 수 있다. 가능성 있는 액체의 넘침을 받아내기 위한 보유 트레이가 구비될 수 있다.
도킹 스테이션(30)은 바람직하게 NaOH(예를 들어 0.5 M NaOH) 용액, 에탄올과 같은 알코올 또는 Virkon과 같은 바이러스 박멸제(virucide)로 세척할 수 있는 재료로 구성될 것이다. 도킹 스테이션(30)은 마찬가지로 과산화수소 증기(vaporized hydrogen peroxide, VHP)를 사용하는 살균 방식을 견뎌내야 한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 도킹 스테이션(30)의 재료는 내부식성 금속이다. 도킹 스테이션(30)은 표준 110-230 V, 50-60 Hz 전원 공급 장치와 같은 전원 공급 장치로 전원을 공급받을 수 있다.
따라서, 본 개시는 또한 생물반응기 및 TFF와 같은 농축기를 포함하는 휴대용 생체분자 생산 설비에 관한 것으로, 중간 용기는 상기 생물반응기와 농축기 사이에 배치되고, 상기 중간 용기와 농축기는 농축기의 출력으로부터 상기 중간 용기의 입력으로 액체를 재순환시킬 수 있는 농축물 도관에 의해 연결되며, 상기 생물반응기와 농축기 및 중간 용기는 휴대용 도킹 스테이션 내에 존재하고, 상기 도킹 스테이션은 생체분자 생산 공정을 제어할 수 있는 통합 제어기를 포함한다.
도 3 및 도 4는 본 개시의 실시형태에 따른 바이러스 생산 및 정제 시스템의 개략적인 개요를 도시한다.
도시된 시스템에서의 상류 처리 단계는 생물반응기(1)에서의 바이러스 입자의 생산 단계 및 농축기(2)를 사용하는 세포 배양 수확물의 농축 단계를 포함한다. 바람직하게, 상류 처리 단계(USP)를 위한 장비는 생물학적 안전 캐비닛 또는 격리실(14) 내에 포함된다.
원하는 생체분자의 생산에 적합한 세포의 전배양(pre-culture)은 생물반응기(1)에서의 접종을 위해 수득된다. 접종 전에, 생물반응기(1)는 성장 배지 탱크(9)로부터 성장 배지를 공급받고, 배지는 적어도 하나의 펌프(502)를 사용하여 생물반응기(1)로 공급된다. 바람직하게, 배지는 25℃ 내지 37℃의 온도로 예열되고 생물반응기로 이송되기 전에 혼합된다. 이로써 세포는 새로운 배지(세포의 성장에 부정적인 영향을 줄 수 있음)와 접촉할 때 저온 충격을 받지 않을 뿐만 아니라 배지 내의 모든 영양소가 혼합되어 필요한 양으로 존재할 수 있다. 배지는 염, 아미노산, 비타민, 탄수화물, 지질 및 하나 이상의 단백질 성장 인자의 잘 정의된 혼합물을 포함하는 액체일 수 있다. 배양 배지는 세포에 영양분을 전달하고, 반대로 폐기물을 제거하고 대사 폐기물의 독성 축적을 방지하는 역할을 한다. 세포 배양 파라미터는 또한 접종 전에 정의된다. 도 3의 실시형태에서, 생물반응기(1)는 또한 적합한 성장 배지에서 세척, 분리 및 중화된 세포 전배양물을 포함하는 접종물 용기(10) 및 예를 들어 성장 인자와 같은 본 기술 분야의 숙련자에게 알려진 추가의 첨가제를 포함하는 첨가제 용기(11)와 도관을 통해 연결된다. 생물반응기(1)는 가스 유입구(도시되지 않음) 및/또는 배출구(305) 및 생물반응기(1) 내부의 pH를 조절하기 위한 염기(13) 유입구를 더 구비할 수 있다. 접종 후, 생물반응기(1)는 바람직하게 배치 모드에서 2 시간 내지 6 시간, 바람직하게는 3 시간 내지 4 시간 동안 작동된다. 다음 단계에서, 세포는 적절한 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도가 달성될 때까지 성장된다. 바람직하게, 생물반응기(1)는 이 세포 성장 기간 동안 관류 모드로 작동된다. 일 실시형태에서, 생물반응기(1)를 통한 배지의 흐름을 제어하기 위해 생물반응기(1) 직전 및 직후에 펌프(502 및 503)가 시스템 내에 제공된다. 원하는 바이러스로 세포를 감염시키기 전에, 사용된 성장 배지를 바이러스 입자 생산에 적합한 성장 배지로 희석하여 교환한다. 폐기된 성장 배지는 오염 제거 용기(8)에 수집된다. 대안적으로, 성장 배지는, 생물반응기에 존재하는 성장 배지를 폐기하고, 이어서 바이러스 입자 생산에 적합한 성장 배지를 생물반응기의 세포에 공급함으로써 교환된다. 세포의 감염은 생물반응기(1)에 바이러스 종자를 공급함으로써 수행되며, 이후 생물반응기(1)는 바람직하게 배치 모드에서 1-4 시간 동안, 보다 바람직하게는 2 시간 동안 작동된다.
본 개시에 따른 생체분자의 생산 및 정제 방법은 시스템의 도관에 장착된 펌프(5, 501, 502, 503) 및 밸브(6)를 이용하여 시스템을 통한 액체의 방향성 유동을 유도하고 시스템 다양한 부분의 가역적 결합 및 분리를 가능하게 한다.
다음 단계 동안, 바이러스 생산이 이루어진다. 이에 따라 생물반응기(1)는 인-라인 농도로 관류 모드로 작동된다. 시스템에 존재하는 경우, 생물반응기(1)와 농축기(2) 및 중간 용기(4) 사이의 밸브 및 펌프가 개방되거나 작동된다. 농축기(2)에 존재하는 한외 여과 장치의 막힘을 방지하기 위해, 액체는 먼저, 액체로부터 큰 고체 입자를 제거하지만 관심 생체분자에 대해서는 투과성인 프리-필터(7)를 통과한다. 바람직하게, 프리-필터는 대략 125 μm의 기공 크기 및 대략 100 kDa의 컷오프를 갖는다. 액체의 농축은 한외 여과 장치, 바람직하게는 접선 흐름 여과(TFF) 장치, 보다 바람직하게는 중공 섬유 TFF인 농축기(2)로 액체를 통과시킴으로써 본 개시된 방법에 따라 수행된다. 이 TFF는 제한된 시간 동안 연속 모드로 작동하며, 주로 액체 및 작은 용질을 포함하는 투과액은 오염 제거 용기(8)로 폐기하는 반면, 도 3에 도시된 중간 용기(4) 또는 도 4에 도시된 생물반응기(1)로 농축물에 존재하는 대부분의 관심 생체분자를 재순환시킴으로써 해당 생체분자를 농축시킬 수 있다. 이로써 추가의 하류 공정 전에 표적 생체분자를 포함하는 액체의 부피가 크게 감소될 수 있다.
바이러스 생산 단계의 정점 이후, 농축기(2)와 중간 용기(4) 또는 생물반응기(1) 사이에서 재순환된 농축물은 이를 중간 용기(4)에 수집함으로써 수확된다. 이후 시스템은 생물반응기(1)에 새로운 성장 배지를 공급하지 않고 가동된다(1). 일단 생물반응기(1)가 비워지면, 이는 일 실시형태에서 깨끗한 배지로 다시 채워지고 원하는 시간 동안 세척되며, 이후 잔류 액체는 농축기를 통해 다시 농축되고 원하는 부피 감소가 달성될 때까지 중간 용기(4)로 재순환된다. 마지막으로, 농축기(2)의 재순환된 배출물이 상기 중간 용기(4)에서 수확되고, 따라서 농축된 세포 배양 수확물을 수득한다. 대안적으로, 도 4에 도시된 중간 용기(4)가 없는 경우 농축기(2)와 생물반응기(1) 사이에서 재순환된 농축물은 이를 생물반응기(1)에 수집함으로써 수확된다. 도 3에 도시된 시스템의 일부로서 중간 용기(4)의 존재는, 상기한 바와 같이 생물반응기(1)가 잔류 액체를 수확하기 위해 세척될 수 있는 반면, 이 세척 액체의 부피는 여전히 추가 하류 공정 전에 농축기에 의해 감소될 수 있는 장점을 제공한다.
선택적으로, 농축된 세포 배양 수확물의 pH는 도 3에 도시된 중간 용기(4) 또는 pH 조절 용액이 도시되지 않은 도 4에 도시된 생물반응기(1)에 연결된 pH 조절 용액(35)을 사용하여 하류 공정에 대해 원하는 값으로 조절된다. 또한, 농축된 세포 배양 수확물에 대해 선택적 엔도뉴클레아제 처리가 수행되어, 단백질을 그대로 유지하면서, 농축된 세포 배양 수확물에 존재하는 DNA 및 RNA를 분해할 수 있다. 엔도뉴클레아제 처리 단계는 농축된 세포 배양 수확물 내의 응집의 방지에 기여할 수 있고, 따라서 추가의 하류 공정(DSP)을 위한 최적의 조건을 제공한다.
도 3 및 4에 따른 시스템에 도시된 DSP 단계를 위한 장비는 정화 격실(19)과 크로마토그래피 격실(21) 및 바이러스 불활성 격실(24)을 포함한다.
바람직하게, 정화 격실(19)과 크로마토그래피 격실(21)은 단일 생물학적 안전 캐비닛 또는 격리실(141) 내에 포함된다. 정화는 DSP의 첫 번째 단계로 간주될 수 있으며, 이전에 수확한 농축물 또는 세포 배양 수확물에서 세포 잔해 및 기타 오염 물질을 제거한다. 정화 격실(19)은 예를 들어 생성물 스트림에서 잔류 고체 오염 물질을 제거하여 후속 DSP 단계의 정확한 기능을 보장하는 다수의 음이온 교환 심층 필터(15)를 포함할 수 있다. 정화된 세포 배양 수확물 또는 정화된 농축물은, 시스템의 크로마토그래피 격실(21)로 이송되기 전에, 정화된 수확물 용기(20)에서 수집된다. 크로마토그래피 격실(21)과 정화 격실(19)은 정화 격실(19)로부터 크로마토그래피 격실(21)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관(22)에 의해 연결된다.
크로마토그래피 격실(21)은 표적 생체분자의 추가 정제를 제공한다. 크로마토그래피 격실(21)은, 제한된 수의 사이클에서 많은 입력 부피를 처리할 수 있는 높은 결합 용량을 제공하고 연속 모드 작동에 적합한 단일 혼합 모드 크로마토그래피 장치(16)를 포함한다. 크로마토그래피 격실(21)은 크로마토그래피 수확물 용기(23)를 더 포함할 수 있다. 시스템의 제 1 부분에 의해 보장된 부피 감소로 인해, 크로마토그래피 격실(21) 내의 크로마토그래피 장치(16)의 필요한 크기는 선행 기술의 시스템보다 개시된 시스템에서 더 작다. 따라서, 시스템은 고가의 대형 크로마토그래피 장비와 관련된 비용을 줄일 수 있다.
제 3 격리실(142)은 바이러스 불활성화 격실(24)을 포함하고, 바이러스 불활성화 격실(24)과 크로마토그래피 격실(21)은 크로마토그래피 격실(21)로부터 바이러스 불활성화 격실(24)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관(25)에 의해 연결된다. 바이러스 불활성화는 불활성화 용기(26)에서 포름알데히드에 의한 크로마토그래피 이후 수득된 정제 바이러스를 희석함으로써 달성된다. 바이러스 불활성화 후에는 제제 용기(27) 내의 불활성화 바이러스 입자를 포함하는 용액의 특성을 조절하는 단계가 이어질 수 있다. 조절은 예를 들어 용액의 염 농도 또는 pH를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
마지막으로, 다량의 정제 불활성화 바이러스 입자를 포함하는 용액이 벌크 용기(28)에서 격리실 외부로 안전하게 수집되거나 이송될 수 있다.
도 5 및 도 6은 본 개시의 일 실시형태에 따른 백신의 제제화를 위한, 예를 들어, 항체 또는 바이러스 입자와 같은 생체분자 생산 시스템을 도시하고 있다.
도 5는 본 개시의 일 실시형태에 따른 불활성화 소아마비 바이러스를 생산 및 정제하기 위한 통합 시스템을 도시하고 있다. 시스템은 봉쇄 구역(도 6에 도시됨) 내의 세 개의 서로 다른 생물학적 안전 캐비닛 또는 격리실(14, 141 및 142)에 위치하는 여러 개의 격실으로 구성된다.
제 1 격리실(14)은 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기(1), 및 농축기(2)를 포함하는 상류 생산 및 정제 격실을 포함하며, 상기 농축기(2)는 농축기(2) 배출물을 수집하고 상기 농축기(2)와 상기 생물반응기(1) 사이에 배치된 중간 용기(4)의 입력으로 배출물(농축물)을 재순환시킬 수 있는 농축물 라인 배출구(303)를 구비한다.
제 2 격리실(141)은 정화 격실(19) 및 크로마토그래피 격실(20)을 모두 포함한다. 상류 생산 및 정제 격실과 정화 격실(19)은 상류 생산 및 정제 격실로부터 정화 격실(19)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결된다. 정화는 하류 공정의 첫 번째 단계로 간주될 수 있으며, 이전에 수확한 농축물에서 세포 잔해 및 기타 오염 물질을 제거한다. 정화 격실(19)은 생성물 스트림에서 잔류 고체 오염 물질을 제거하여 후속 DSP 단계의 정확한 기능을 보장하는 다수의 음이온 교환 심층 필터(15)를 포함한다. 정화된 세포 배양 수확물 또는 정화된 농축물은, 시스템의 크로마토그래피 격실(21)로 이송되기 전에, 정화된 수확물 용기(20)에 수집된다. 시스템에서 정화 격실(19)의 구현은 소형 격실 운영을 가능하게 하고 처리 시간을 단축시키고, 따라서 생체분자 생산 및 정제 공정의 전반적인 경제성을 향상시킨다.
크로마토그래피 격실(21)은 표적 생체분자의 추가 정제를 가능하게 한다. 크로마토그래피 격실(21)과 정화 격실(19)은 정화 격실(19)로부터 크로마토그래피 격실(21)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관(22)에 의해 연결된다. 크로마토그래피 격실(21)은, 제한된 수의 사이클에서 많은 입력 부피를 처리할 수 있는 높은 결합 용량을 제공하고 연속 모드 작동에 적합한 단일 혼합 모드 크로마토그래피 장치(16)를 포함한다. 크로마토그래피 격실(21)은 하나 이상의 크로마토그래피 수확물 용기(23)를 더 포함할 수 있다. 시스템의 제 1 부분에 의해 보장된 부피 감소로 인해, 크로마토그래피 격실(21) 내의 크로마토그래피 장치(16)의 필요한 크기는 선행 기술의 시스템보다 더 작다. 개시된 시스템에서, 예를 들어, 크로마토그래피 컬럼의 100 배 감소를 달성할 수 있다. 따라서, 시스템은 고가의 대형 크로마토그래피 장비와 관련된 비용을 줄일 수 있다. 또한, 통상적으로 두 개의 연속 크로마토그래피 장치의 존재를 필요로 하는 선행 기술의 생체분자 생산 및 정제 시스템과는 대조적으로, 본 시스템은 크로마토그래피 격실(21)에서 단일 단계 크로마토그래피 장치를 구현함으로써 동등한 생체분자 순도 및 수율을 보장한다. 이로 인해 생체분자 생산 공간, 생산 비용 및 생산 시간이 현저히 감소하고, 따라서 낮은 공정 용적을 유지하면서 생산성을 향상시킬 수 있다.
제 3 격리실(142)은 바이러스 불활성화 격실(24)을 포함하고, 바이러스 불활성화 격실(24)과 크로마토그래피 격실(21)은 크로마토그래피 격실(21)로부터 바이러스 불활성화 격실(24)로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관(25)에 의해 연결된다. 바이러스 불활성화는 불활성화 용기(26)에서 포름알데히드에 의한 크로마토그래피 이후 수득된 정제 바이러스를 희석함으로써 달성된다. 바이러스 불활성화 후에는 제제 용기(27) 내의 불활성화 바이러스 입자를 포함하는 용액의 특성을 조절하는 단계가 이어질 수 있다.
다양한 격리실 또는 안전 캐비닛(14,141,142)은, 이들 격리실 사이에 존재하고 개방형 및 폐쇄형 구성일 수 있는 칸막이(31)에 의해 서로 연결되거나 분리될 수 있다. 도 5에 도시된 칸막이(31)는 투명한 재료로 제조될 수 있다. 상기 칸막이의 개폐는 또한, 시스템의 안전한 사용을 더 보장하기 위해, 특정 작업(예를 들어 바이러스 비활성화)의 종료와 같이, 공정에 의해 생성된 입력 신호에 따라 공정 제어 장치 또는 공정 제어기(도 5에 도시되지 않음)에 의해 자동으로 제어될 수 있다. 상기 칸막이는 도관을 통과시키기 위한 개구부를 구비한다.
시스템 내의 각각의 격실의 최적화로 인해, 각각의 격실의 컴팩트한 구조는 시스템에 속하는 모든 격실이 도 6에 도시된 여러 개의 격리실(14, 141, 142, 143)을 포함하는 단일 봉쇄 구역(32) 내에 통합될 수 있게 한다. 도 6에 도시된 실시형태에 따른 봉쇄 구역(32)은 시스템에서 생성된 원치 않는 물질 또는 공정의 부산물이 일시적으로 저장될 수 있는 적어도 하나의 폐기물 탱크를 포함하는 다수의 오염 제거 용기(도시되지 않음), 오염 제거 격실, 오토클레이브(34) 및 샘플 분취를 위한 격리실 또는 생물학적 안전 캐비닛(143)을 더 포함한다. 시스템 내의 각각의 격실의 최적화는 필요한 공간을 줄이는 데 기여할 뿐만 아니라 이 시스템을 사용할 때 안전성을 높이는 데에도 기여한다. 또한, 격실 간의 연결로 인해, 생성물이 분리기(14, 141, 142)로부터 나가지 않고도 생산 및 정제 단계를 수행할 수 있고, 따라서 안전 위험을 최소화한다.
시스템은 공정 흐름 파라미터뿐만 아니라 생물반응기 파라미터를 제어하고 조작하는 공정 제어 장치 또는 제어기를 포함한다. 제어기는 또한, 시스템 전체에 존재하고 예를 들어 pH, 온도 및/또는 DO를 측정하는 하나 이상의 센서로부터의 데이터를 모니터링하고 기록한다. 또한, 공정 제어 장치 또는 제어기는 봉쇄 구역(32) 입구 및/또는 출구(33)의 개폐 및 다른 격실 또는 격리실(14, 141, 142) 사이의 재밀봉 가능한 분리 또는 칸막이(31)의 잠금 또는 잠금 해제(31)를 제어한다. 이 실시형태에서, 격실은 재밀봉 가능한 유리 도어(31)에 의해 가역적으로 분리된다. 제어기는, 사용자가 공정 흐름 및 측정된 파라미터를 따르고, 예를 들어 특정 하위 공정을 시작하거나 중지시킴으로써 시스템을 수동으로 작동시킬 수 있게 하는 스크린(29)을 구비한다.
시스템의 봉쇄 구역(32)로 들어가는 조작자(17)는 격리된 격실(14, 141, 142, 143) 외부에 남는다. 품질 관리 절차를 위한 샘플 채취를 허용하기 위해, 격리된 격실은 작업자(17)에게 격실에 대한 제한된 간접 접근을 허용하는 유연한 슬리브(18)를 구비하며, 격실의 내용은 조작자(17)로부터 격리된 상태로 유지된다.
시스템의 일부인 격리실(14, 141, 142, 143)과 봉쇄 구역(32)을 통합하면, 생물학적 안전 규칙을 보다 간단하고 저렴하게 준수할 수 있고, 환경과 조작자에 대한 오염 위험이 줄어든다.
이 시스템은 정제 불활성화 바이러스와 같은 생체분자의 자동화되고 모니터링되는 대규모 GMP 생산에 사용하기에 적합하다.

Claims (34)

  1. 생체분자 생산 시스템으로서, 시스템은:
    표적 생체분자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 포함하는 생물반응기; 및
    농축기를 포함하고, 상기 농축기는, 농축물을 수집하기에 적합하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기의 사이에 배치된 중간 용기의 입력으로 농축물을 재순환시킬 수 있는 농축물 도관을 구비하는, 생체분자 생산 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물반응기와 상기 농축기는 상기 생물반응기로부터 상기 농축기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결되는, 생체분자 생산 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물반응기와 중간 용기는 상기 생물반응기로부터 상기 중간 용기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결되고, 상기 중간 용기와 농축기는 상기 중간 용기로부터 상기 농축기로의 액체 이송을 가능하게 하는 도관에 의해 연결되는, 생체분자 생산 시스템.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물반응기는 관류 생물반응기인, 생체분자 생산 시스템.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물반응기는 배치 생물반응기인, 생체분자 생산 시스템.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도관에는 상기 농축기를 통한 상기 액체의 교차-유동을 제공하기 위해 하나 이상의 펌프가 장착되는, 생체분자 생산 시스템.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농축기는 한외-여과 또는 정밀-여과 장치인, 생체분자 생산 시스템.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농축기는 접선 유동 여과 장치인, 생체분자 생산 시스템.
  9. 제 2 항에 있어서,
    상기 생물반응기와 상기 농축기 사이에 필터가 배치되는, 생체분자 생산 시스템.
  10. 제 3 항에 있어서,
    상기 생물반응기와 상기 중간 용기 사이에 필터가 배치되는, 생체분자 생산 시스템.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시스템은 오염 제거 용기를 더 포함하는 생체분자 생산 시스템.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시스템은 정화 격실을 포함하는 생체분자 생산 시스템.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시스템은 크로마토그래피 격실을 포함하는 생체분자 생산 시스템.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시스템은 바이러스 불활성화 격실을 포함하는 생체분자 생산 시스템.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시스템은 봉쇄 구역을 포함하는 생체분자 생산 시스템.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 격실은 칸막이에 의해 서로 연결되거나 분리될 수 있으며, 상기 칸막이의 구성은 개방형 구성 또는 폐쇄형 구성일 수 있는, 생체분자 생산 시스템.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    시스템은 시스템의 자동 제어를 위한 공정 제어 장치를 포함하는 생체분자 생산 시스템.
  18. 바이러스와 같은 생체분자의 생산 시스템으로서, 시스템은:
    - 표적 생체분자를 함유하는 액체를 수용하기에 적합한 챔버를 고정층 관류 생물반응기; 및 농축기, 바람직하게는, TFF를 포함하는 상류 공정 격실로서, 상기 농축기는, 상기 농축기로부터의 농축물과 같은 액체 배출물을 수집하고 상기 생물반응기의 입력으로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기 사이에 배치된 중간 용기의 입력으로 상기 액체 배출물을 재순환시키기에 적합한 농축물 도관을 구비하는, 상류 공정 격실과;
    - 정화 격실과;
    - 크로마토그래피 격실; 및
    - 선택적으로 바이러스 불활성화 격실을 포함하고,
    상기 격실은 하나 이상의 격리실 내에 배치되는, 생체분자의 생산 시스템.
  19. 생체분자 생산 방법으로서, 상기 생체분자는 액체를 포함하는 생물반응기에서 생산되고, 상기 방법은 농축 단계를 포함하고, 상기 생물반응기로부터의 배출물은 농축기에서 농축되며, 상기 농축기로부터의 배출물은 상기 생물반응기로 또는 상기 농축기와 상기 생물반응기 사이에 배치된 중간 용기로 재순환되는, 생체분자 생산 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 생물반응기는 관류 모드 및/또는 배치 모드에서 작동되는, 생체분자 생산 방법.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    상기 액체의 방향성 유동을 유도하기 위해 펌프가 사용되는, 생체분자 생산 방법.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농축기는 한외-여과 또는 정밀-여과 장치인, 생체분자 생산 방법.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농축기는 접선 유동 여과 장치인, 생체분자 생산 방법.
  24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체는 상기 농축기로 이송되기 전에 필터를 통과하는, 생체분자 생산 방법.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체는 상기 중간 용기로 이송되기 전에 필터를 통과하는, 생체분자 생산 방법.
  26. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 농축기의 재순환된 배출물은 상기 중간 용기로부터 수확됨으로써, 농축된 세포 배양 수확물을 수득하는, 생체분자 생산 방법.
  27. 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재순환된 세포 배양 수확물은 정화됨으로써, 정화된 세포 배양 수확물을 수득하는, 생체분자 생산 방법.
  28. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자는 상기 정화된 세포 배양 수확물에 대해 크로마토그래피 단계를 수행함으로써 더 정제되는, 생체분자 생산 방법.
  29. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자는 바이러스인, 생체분자 생산 방법.
  30. 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 포름알데히드를 사용하여 불활성화되는, 생체분자 생산 방법.
  31. 제 19 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자는 정제 불활성화 바이러스인, 생체분자 생산 방법.
  32. 단백질, 바이러스 및/또는 바이러스 백신과 같은 생체분자의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 시스템의 용도.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 생체분자는 바이러스 백신, 바람직하게는 불활성화 소아마비 바이러스 백신의 제제화에 사용되는, 시스템의 용도.
  34. 도킹 스테이션 및 통합 제어기를 포함하는 통합 생물반응기 플랫폼으로서, 도킹 스테이션은 생물반응기 및 중간 용기를 수용하도록 구성되는, 통합 생물반응기 플랫폼.
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