KR20200058542A - Cd47 및 pd-l1에 특이적인 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물공학 분야, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 항체 제조 방법 및 암 치료에 있어 상기한 항체 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

CD47 및 PD-L1에 특이적인 항체
본 발명은 생물공학 분야, 특히 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 항체 수득 방법 및 암 테라피에서 상기한 항체 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
T-세포에 2종의 개별 신호를 제공하는 것은 남아있는 T-림프구를 항원-제시 세포 (APC)로 림프구 활성화하는 광범위한 모델이다. 이 모델은 자신이 아닌 것으로부터 자신의 구분 및 면역 관용성을 충분히 제공한다. 일차 신호 또는 항원-특이 신호는 주 조직접합성-복합체 (MHC)에 의해 제시된 외래 항원 펩타이드에 의해 인지된 후 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 전달된다. 2차 또는 공동-자극 신호는 항원-제시 세포 (APC) 상에 발현된 공동-자극 분자에 의해 T 세포로 전달되어, T 세포가 클론 증폭, 사이토카인 방출 및 작동자 기능을 자극하도록 유도한다. 공동-자극이 없으면, T 세포는 항원 자극에 대해 면역을 구축할 수 있어, 효과적인 면역 반응을 유발할 수 있으며, 외래 항원에 대한 고갈 또는 내성을 추가적으로 유도할 수 있다.
2-신호 모델에서, T 세포는 2가지 신호를 수신한다: 파지티브 및 네거티브 2차 공동-자극 신호들. 이러한 파지티브 및 네거티브 신호의 조절이 숙주의 방어적 면역 반응은 최대화하면서도 면역 관용성은 유지하고 자가면역을 방지하는데 중요하다. 네거티브 2차 신호는 T 세포 관용성을 유도하는데 필수적인 것으로 보이는데 반해, 파지티브 신호는 T 세포 활성화를 자극한다. 간단한 2-신호 모델이 네이티브 림프구에 대한 타당한 설명을 여전히 제공하지만, 면역 반응은 다이나믹 프로세스이고, 항원-노출 T 세포에 대한 공동-자극 신호도 제공될 수 있다. 공동-자극 신호의 조작이 면역 반응을 강화하거나 또는 종결시키는 수단을 제공하는 것으로 밝혀져 있어, 공동-자극 기전은 치료학적 관점에서 흥미롭다. 최근, T-세포 기능장애 또는 아네르기 (anergy)가 저해성 수용체, 폴리펩타이드 1 프로그래밍된 세포 사멸 (polypeptide 1 programmed cell death, PD-1)의 유도된 지속적인 발현과 동시적으로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 그 결과, PD-1에 대한 치료학적 타겟팅 및 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (programmed death-ligand　1, PD-L1) 또는 프로그래밍된 사멸-리간드 2 (PD-L2)와 같이 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 기타 분자에 대한 치료학적 타겟팅은 매우 관심이 집중되는 분야이다.
PD-L1은 복수의 악성 종양들에서 과다 발현되며, 종종 불량한 예후와 연관되어 있다. 흥미롭게도, 종양 침윤성 T 림프구들 대부분이, 정상 조직 및 말초혈 T 림프구에서의 T-림프구와는 대조적으로, PD-1을 주로 발현하는데, 이는 종양-반응성 T 세포 상의 PD-1의 파지티브 조절이 손상된 면역 반응에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 이는, T-세포 활성화의 완전한 약화 및 면역 감시의 회피와 더불어, 종양 세포 발현성 PD-L1에 의해 매개되는 PD-L1 신호전달 경로의 이용 및 T-세포 발현성 PD-1과의 상호작용이 원인일 수 있다. 따라서, PD-L1/PD-1 상호작용의 저해가 CD8+ T 세포-매개에 의한 종양의 사멸을 강화할 수 있다.
PD-1, 및 PD-L1 및 PD-L2와 같이 PD-1과의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 기타 분자에 대한 치료학적 타겟팅은 매우 흥미로운 영역이다. PD-L1의 신호 저해는 급성 및 만성 감염 등의 감염 및 암을 치료하기 위해 T 세포 면역성 (예, 항-종양 면역성)을 높이기 위한 수단으로서 제안된 바 있다. PD-L1/PD-1 상호작용을 차단하는 저해제들이, 특히 W02001014557, W02002086083, W02007005874, W02010036959, W02010077634 및 WO2011066389에 공지되어 있다. 그러나, 이들 경로를 타겟팅하는 최적의 치료학적 물질은 아직까지 상업화되지 않았으며, 충족되지 못한 상당한 의학적 요구가 존재하고 있다.
CD47은 해당 세포 상에서 SIRPα (가칭 SHPS-1) 및 SIRPγ에 결합하는 세포 표면 당단백질이다. 이들 상호작용은 면역 세포 기능의 네거티브 조절을 야기하거나, 또는 세포 부착 및 이동을 매개할 수 있다. 자가면역성 장애 치료에서 생물 제제로서 CD47의 용도가 제안된 바 있다 (WO 1999/040940). 반면, 유사한 치료학적 목적으로 SIRPα와 같은 CD47 리간드의 사용 가능성에 대한 데이터는 거의 없다. 그 이유는 잠재적인 약물로서 CD47 결합성 폴리펩타이드의 사용의 걸림돌이 될 수 있는, CD47의 편재성 발현이다. Yu et all (J Invest Dermatol, 126:797-807 (2006))에 공개된 데이터에 따르면, 면역글로불린 Fc 도메인과 융합된 SIRPα의 세포외 도메인으로 구성된 융합 단백질이 마우스에서 피부 유래 수지상 세포 (DC)에서 배액성 림프절 (draining lymph node)로의 이동을 방지하여, 마우스에서 (적어도 부분적으로) 접촉 과민성 반응을 약화시킬 수 있는 것으로 시사되었다. DC의 이동과 기능은 면역 또는 염증 반응에 중요하다. 통증성 병태에서, 이들 DC 반응 악화는 질환이 유지되게 할 수 있다. 조직으로부터 림프 기관으로의 병원성 DC의 이동을 방해하는 것이 자가면역 또는 염증성 질환을 구동시키는 악순환을 중단하기 위한 매력적인 기회가 될 것이다.
CD47은, 또한 인테그린-관련 단백질 (IAP), 난소암 항원 OA3, Rh-관련 항원 및 MER6로도 알려져 있으며, 막을 7회 관통하는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 막관통 수용체이다. CD47 발현 및/또는 활성은 다수의 질환 및 장애들에서 관찰된 바 있다. 이에, CD47을 타겟팅하는 테라피가 요구되고 있다. 또한, 혈소판에서의 CD47의 발현으로 인해, 개체에 투여시, 상당한 수준의 혈소판 고갈, 적혈구 응집 반응 (hemagglutination), 적혈구 고갈 및/또는 빈혈을 유발하지 않는, CD47-타겟팅 테라피 (예, 항체)가 요구되고 있다.
CD47과 SIRPα 리간드 간의 상호작용을 저해하는 공지된 항체들은 다음과 같은 문헌에 기술되어 있다: 출원 WO2014123580, WO2013119714, WO2015191861, WO2011143624, WO/2014/093678, WO2017053423.
또한, 다중 특이성 항체를 기술한 다양한 문헌들도 공지되어 있으며, 예를 들어, WO/2014/087248에는 CD47 및 CD19에 특이적인 2중 특이 항체가, WO2016023001에는 CD47 및 PD1에 특이적인 2중 특이 항체가 기술되어 있다. 그러나, CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하는 다중 특이 항체의 제조 및 효과적인 사용 가능성에 대해서는 개시된 바 없다.
전술한 내용과 관련하여, CD47 및 PD-L1에 효과적으로 결합하는 새로운 항체를 구축하는 것이 적절하다.
본 발명은 결합성 분자, 예를 들어 CD47 및 PD-L1에 결합하도록 지시된 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 CD47 및 PD-L1에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는데 이용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하며 CD47에 대한 하나의 결합부 및 PD-L1에 대한 하나 이상의 결합부를 포함하는, 단일클론 항체에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 PD-L1에 대해 하나 또는 2개의 결합부를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 CD47 수용체와 SIRPα 리간드 간의 상호작용을 저해하거나, 및/또는 PD-L1 결합부는 PD-L1과 PD-1 수용체의 상호작용을 저해한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이며, 즉 CDR1은 서열번호 1-4를 포함하는 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 1-4를 포함하는 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열이고, CDR2는 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이며, 즉 CDR2는 서열번호 6-15를 포함하는 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 6-15를 포함하는 군으로부터 선택되되 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환이 존재하는 서열이고, CDR3는 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이며, 즉 CDR3는 서열번호 17-20을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 17-20을 포함하는 군으로부터 선택되되 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, CDR2는 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, CDR3은 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 청구항 4항의 중쇄 가변성 도메인, 및 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 경쇄 가변성 도메인에서 CDR1은 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이고, 즉 CDR1은 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열이고, CDR2는 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이고, 즉 CDR2는 서열번호 36-48을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이거나 또는 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되되 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열이고, CDR3은 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 이상 상동적인 서열이고, 즉 CDR3은 서열번호 50-64의 서열이거나 또는 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 청구항 4항의 중쇄 가변성 도메인, 및 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 경쇄 가변성 도메인에서 CDR1은 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, CDR2는 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, CDR3는 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 서열번호 66-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및 서열번호 89-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47 결합부는 서열번호 66-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및 서열번호 89-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 PD-L1 결합부는 서열번호 5, 서열번호 16 및 서열번호 21의 서열과 80% 이상 상동적인 서열을 포함하는, 즉 서열번호 5, 16 및 21의 아미노산 서열 또는 치환 1개가 존재하는 서열번호 5, 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열번호 16, 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열번호 21의 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및 서열번호 35, 서열번호 49 및 서열번호 65의 서열과 80% 이상 상동적인 서열을 포함하는, 즉 서열번호 35, 49 및 65의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열번호 35, 1개의 치환이 존재하는 서열번호 49, 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열번호 65의 아미노산을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 PD-L1에 대한 결합부는 서열번호 5, 서열번호 16 및 서열번호 21의 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및 서열번호 35, 서열번호 49 및 서열번호 65의 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CD47에 대한 결합부는 Fab, scFv, scFab 또는 단리된 (isolated) VH 또는 VHH 모노-도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 PD-L1에 대한 결합부는 Fab, scFv, scFab 또는 단리된 VH 또는 VHH 모노-도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 표면 상에 CD47 및/또는 PD-L1 항원을 가진 소정의 비율의 세포에 항체-의존적인 세포성 세포독성, 대식세포-매개 식세포 작용 및/또는 T 세포-매개 세포독성을 자극하는 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는, 돌연변이 또는 변형이 없는 동일 항체와 비교해, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 높이는 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 것을, 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 암을 치료하기 위한 약제로서 사용되는 것으로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산은 DNA이다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 전술한 임의 항체를 제조하기 위한 숙주 세포의 수득 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 핵산을 포함하는 전술한 임의 항체를 수득하기 위한 숙주에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 필요에 따라 특정 항체를 수득하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 숙주 세포를 배양한 다음 필요에 따라 수득한 항체를 분리 및 정제하는 것으로 구성되는, 전술한 임의 항체를 수득하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 임의 항체를 하나 또는 수개의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는 PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암 (colorectal cancer with microsatellite instability)), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 육종, 간세포암, 호지킨 림프종, T- 및 B-세포성 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 불응성 비-호지킨 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 췌장암 및 고-위험성 골수이형성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는, PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 것으로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명은, 상기한 임의의 항체 또는 본 발명의 약학적 조성물을 치료가 필요한 개체에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 치료 방법에 대한 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중-음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T- 및 B-세포성 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 불응성 비-호지킨 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 췌장암, 난소암 및 고-위험성 골수이형성 증후군으로 된 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 전술한 임의의 항체를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 저해가 필요한 개체에서 PD-L1 및/또는 CD47의 생물학적 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 개체를 치료하기 위한 전술한 임의 항체 또는 전술한 임의 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체의 용도에 대한 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중-음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T- 및 B-세포성 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 불응성 비-호지킨 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 췌장암, 난소암 및 고-위험성 골수이형성 증후군으로 된 군으로부터 선택된다.
도 1. 포유류 세포의 CHO-K1 배양에서 인간 CD47-Fc를 일시적으로 생산하기 위한 플라스미드의 맵.
도 2. 인간 CD47-Fc 제조물의 비-환원성 조건에서의 SDS-겔 전기영동.
도 3. 대조군 항-CD47 항체 B6H12 산물의 환원성 조건에서의 SDS-겔 전기영동.
도 4. 대조군 항-CD47 항체 B6H12 산물의 비-환원성 조건에서의 SDS-겔 전기영동.
도 5. 인간 CD47 항원과 특이적으로 상호작용하는 VHH 항체 단편이 탑재된 다클론 파지에 대한 ELISA 다이아그램.
도 6. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체의 도메인 구조를 나타낸 개략도로서, A는 항-CD47 scFv 단편에 기반한 것이고, B는 항-CD47 VHH 단편에 기반한 것이다. 동시에, PD-L1 결합 파트는 Fab 단편으로 표시된다.
도 7. 항-CD47 scFv 단편에 기반한 2중 특이성 항체의 항-PD-L1 / 항-CD47 조제물의 비-환원성 조건에서의 SDS-겔 전기영동.
도 8. 항-CD47 VHH 단편에 기반한 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체 조제물의 환원성 조건에서의 SDS-겔 전기영동.
도 9. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 검사 항체의 농도에 대한 세포독성 효과 의존성.
도 10. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 검사 항체의 농도에 대한 세포독성 효과 의존성.
도 11. 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체 존재시 인간 대식세포에 의한 MDA-MB-231 세포주의 식세포작용 효과.
도 12. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체의 농도에 대한 형광 수준 의존성.
도 13. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체의 농도에 대한 형광 수준 의존성.
도 14. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체의 농도에 대한 형광 수준 의존성.
도 15. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체의 농도에 대한 형광 수준 의존성.
도 16. 항-PD-L1/CD47 2중 특이성 항체의 항-PD-L1 활성. 세로 축은 항체 무첨가 웰의 발광성 대비 검사한 aHTH-CD47 / PD-L1 항체 첨가 웰의 발광율을 나타낸다.
도 17. 항-PD-L1 / 항-CD47 2중 특이성 항체의 응집체 동질성 (aggregation homogeneity)에 대한 겔 여과 프로파일.
정의 및 일반적인 방법
본원에서 달리 정의되지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다.
나아가, 문맥상 달리 요구되지 않은 한, 단수형 용어들은 복수를 포함할 것이며, 복수형 용어들은 단수를 포함할 것이다. 전형적으로, 세포 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석화학, 유기 합성 화학, 의학 및 제약 화학의 분류 및 방법뿐 아니라 본원에 기술된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학은 잘 알려져 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 광범위하게 사용된다. 효소 반응 및 정제 방법들은 당해 기술 분야에 통상적이거나 또는 본원에 기술된 바와 같이, 제조사의 지침에 따라 수행된다.
항체와 관련된 정의
PD-L1 (프로그래밍된 사멸-리간드 1)은 또한 분화 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1) 클러스터라고도 알려져 있는, 40kDa의 타입 1 막관통 단백질이다. PD-L1은 Ig V- 및 C-타입 도메인으로 표시되는 세포외 도메인 (220), 막관통 도메인 (21) 및 세포내 도메인 (31)과 같은 3개의 도메인으로 이루어져 있다. 이는 임신 중, 외래 조직의 이식시, 그리고 간염과 같은 특정 질환에서 면역계를 억제하는데 중요한 역할을 수행한다. 정상적인 조건에서는, 자가면역 프로세스를 방지하기 위해, 자기-항원에 반응하여, 항원-특이적인 CD8+ T 작동자 세포가 일정량 림프절과 비장에 축적되어, PD-1/PD-L1 또는 B7-1/PD-L1 복합체가 형성되며, 이로써 림프절에서 이들 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 저해성 신호가 전달된다. 즉, PD-1/PD-L 상호작용은 면역 관용을 구축하는 주요 인자들 중 하나이다.
CD47은, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 멀티-스패닝 막관통 수용체로서, 대식세포 상의 SIRPα (신호 조절 단백질 α)와 상호작용하여, 식세포작용을 억제한다. 이 경로가 활성 상태인 암 세포는 식세포작용을 회피한다. 이에, CD47에 대한 치료학적 효과는 다양한 암들에서 널리 적용된다. CD47 항체는 CD47과 SIRPα 간의 상호작용을 차단하는 능력을 가질 수 있지만, 이러한 능력을 가지지 않을 수도 있다.
용어 "결합성 분자"는 항체 및 면역글로불린을 포함한다.
본원에서, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" 또는 "단일클론 항체" 또는 "2중 특이성 항체" 또는 "다중 특이성 항체" (Ig)는 전체/전장 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역")을 포함한다. 아울러, 예를 들어, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" 또는 "단일클론 항체"는, 하나 이상의 결합가 (valency) 및 하나 이상의 특이성을 가진 항원 결합 단편과 면역글로불린의 불변부로 된 임의 조합을 포함하며, 용어 "2중 특이성 항체" 또는 "다중 특이성 항체""와 비슷한 의미를 가질 수 있다. 아울러, 예를 들어, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" 또는 "단일클론 항체"는 임의 특성의 임의 폴리펩타이드에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된, 면역글로불린의 불변부와 항원 결합 단편으로 된 임의 조합을 포함한다. 또한, 용어 "항체"는, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질 또는 항원-결합 영역을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부를 포함한다. 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 타입의 포유류 Ig 중쇄가 공지되어 있다. 존재하는 중쇄의 타입이 항체 클래스를 정의하며; 이들 쇄들은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 각각에서 발견된다. 서로 다른 중쇄들은 크기 및 구성 측면에서 다양하다; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하지만, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 각각의 중쇄는 2가지 영역, 즉 불변부 및 가변부를 포함한다. 불변부는 동일한 이소형의 항체들 모두에서 동일하지만, 서로 다른 이소형 항체에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 (일렬로)로 구성된 불변부와, 유연성 (flexibility) 부가를 위한 힌지부를 포함하며 (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); 중쇄 μ 및 ε는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 불변부를 가진다. 포유류에서는, 람다 (λ) 및 카파 (κ)로 언급되는 오직 2가지 타입의 경쇄만 공지되어 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄의 대략적인 길이는 아미노산 211개 내지 217개이다. 바람직하게는, 경쇄는 카파 (κ) 경쇄이고, 불변 도메인 CL은 바람직하게는 C 카파 (κ)이다.
본 발명에서 "항체"는 임의 클래스 (예, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 바람직하게는 IgG) 또는 서브클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1)에 속하는 것일 수 있다.
VL 영역 및 VH 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보존성이 높은 영역과 이들 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과-가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등의, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서, 항체의 "항원-결합 영역" 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단하게 "항체 영역" 또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 2개의 Fab 단편들이 연결된 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd-단편; (iv) 항체의 싱글 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv-단편, (v) VH/VHH 도메인으로 구성된 dAb-단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부 (CDR) 등이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL와 VH는 개별 유전자들에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역들이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 싱글 단백질 쇄를 만들 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법으로 연결될 수 있다 (단쇄 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예로, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단일-가닥 분자는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 추정된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 이들 단편은 무손상 항체 (intact antibody)와 동일한 방식으로 스크리닝된다.
바람직하게는, 본 발명의 항원-결합 영역의 CDR 또는 전체 항원 항원 결합 영역은 마우스, 라마 또는 인간 도너 라이브러리로부터 유래되거나, 또는 기본적으로 일부 아미노산 잔기가 변형된, 예를 들어 특정 항체 특성, 예를 들어, KD, koff, IC50, EC50, ED50을 최적화하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된, 인간 기원의 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 프래임워크 영역은 인간 기원의 것이거나 또는 실질적으로 인간 기원의 것이다 (인간 기원의 비율이 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%임).
다른 구현예들에서, 본 발명의 항원 결합 영역은, 비-제한적인 예로, 마우스, 라마, 토끼, 랫 또는 햄스터 등의, 인간을 제외한 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 예로, 항원-결합 영역은 인간 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 "가변성 도메인"은 가변성 도메인의 특정 영역이 항체들에서 서열상 광범위하게 상이하다는 것을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하며, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성이 가변성 도메인의 110개의 아미노산 전체에 균등하게 분산되어 있진 않다. 대신, V 영역은 "과가변부" 또는 CDR로 지칭되는 극도의 가변성을 가진 더 짧은 가닥에 의해 이격된 아미노산 15-30개로 된 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 비교적 불변성 단편들로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 각 가변성 도메인은 FR 4개를 포함하며, 연결성 루프, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 과가변부 3개에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 취한다. 각 체인에서 과가변부들은 FR에 의해 서로 인접하게 유지되며, 다른 체인으로부터 유래된 과가변부와 함께 항체의 항원-결합부를 형성하는데 기여한다. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 참여하진 않지만, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체 참여 등의 여러가지 작동자 기능을 발휘한다.
본원에서, 용어 "과가변부"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 통상적으로, 과가변부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기 및/또는 "과가변성 루프"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 높이기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어, 항체의 인간화로 결합 특이성 또는 친화성의 저하가 발생하고 역 돌연변이 (inverse mutation) 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선하는 것은 가능하지 않을 경우, 인간화와 더불어 수행될 수 있다. 다양한 친화성 돌연변이 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)에 제시된 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
"프래임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다. 각각의 가변성 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 FR 4개를 가지고 있다. CDR이 Kabat에 따라 정의되는 경우, FR 경쇄 잔기들은 대략적으로 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) 및 98-107 (LCFR4)번 위치에 위치하고, 중쇄 FR 잔기들은 대략적으로 중쇄에서 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)번 위치에 위치한다. CDR이 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략적으로 경쇄에서 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) 및 97-107 (LCFR4)번 위치에 존재하며, 중쇄 FR 잔기는 대략적으로 중쇄 잔기에서 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)번 위치에 존재한다. CDR이 Kabat에 의해 정의되는 양쪽 CDR 및 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산을 포함하는 일부 경우에, FR 잔기들은 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 경우, 중쇄의 FR1 잔기는 1-25번 위치에 존재하고, FR2 잔기는 36-49번 위치에 존재한다.
타겟 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는 단백질 또는 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 타겟팅하는 경우 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하며, 다른 단백질과는 약간 교차 반응하는 항체이다. 분석 방법에 따라: 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 방사성면역분석 (RIA) 또는 ELISA, 이러한 구현예에서, 비-타겟 단백질에 항체가 결합하는 수준은 특이적인 타겟 단백질에 결합하는 항체의 10% 미만이다. 항체가 타겟 분자에 결합하는 것과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이라는 용어는, 비-특이적인 상호작용과는 검출가능하게 (측정가능하게) 상이한 결합을 의미한다 (예, bH1-44 또는 bH1-81의 경우, 비-특이적인 상호작용은 소 혈청 알부민, 카세인, 소 태아 혈청 또는 뉴트라비딘에의 결합이다).
특이적인 결합은 예를 들어 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교해 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 타겟과 비슷한 다른 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 타겟을 이용한 경쟁적인 반응에 의해 결정할 수 있다. 이 경우, 프로브에의 표지된 타겟의 결합이 과량의 비-표지된 타겟에 의해 경쟁적으로 저해된다면, 특이적인 결합을 의미한다. 본원에서, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 타겟 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이다라는 표현은, 타겟에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM 또는 적어도 약 150 nM 또는 적어도 약 100 nM 또는 적어도 약 60 nM 또는 적어도 약 50 nM 또는 적어도 약 40 nM 또는 적어도 약 30 nM 또는 적어도 약 20 nM 또는 적어도 약 10 nM 또는 적어도 약 8 nM 또는 적어도 약 6 nM 또는 적어도 약 4 nM 또는 적어도 약 2 nM 또는 적어도 약 1 nM 또는 그 이상인 분자로 특정될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에만 결합하고 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 상의 에피토프에 실질적으로 결합하지 않는 결합을 의미한다.
본원에서, 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 의미하고, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 의미한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예, 항체)의 단일 결합부와 이의 결합 파트너 (예, 항원) 간의 비-공유성 상호작용들 전체의 세기를 의미한다. 달리 언급되지 않은 한, "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버들 (예, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 나타내는 고유한 (특징적인, 참된) 결합 친화성을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 바람직하게는, Kd 값은 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 또는 그 미만이다. 친화성은 본원에 기술된 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하며, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고, 결합된 채 더 길게 유지되는 경향이 있다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이중 임의의 방법을 본 발명의 목적에 따라 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, "Kd" 또는 "Kd 값"은 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 칩 CM5 항원을 사용해 25℃에서 BIAcore™-2000 or BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용해 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정한다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음, 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 로딩한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 주입하여 비-반응성 기들을 차단한다. 카이네틱스를 측정하기 위해, Fab 2배 연속 희석물 (예, 0.78 nM 내지 500 nM)을 0.05% Tween 20 첨가된 PBS (PBST) 중에 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 결합 및 해리 센소그램을 동시적으로 피팅함으로써, 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 간단한 원 투 원 랭뮤어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용해 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비율로 계산한다. 예를 들어, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881을 참조한다. 상기한 표면 플라스몬 공명 분석에 따라 결합 속도가 106 M-1 s-1을 초과한다면, 이는 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 (조사) = 340 nm, 16 nm 대역 (band))의 증가 또는 감소를 측정하는, 형광 퀀칭에 의해 결정할 수 있다. 항원의 농도 증가 조건에서, 20 nM PBS, pH 7.2의 항체 항원 용액을, 정지 흐름 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 분광기 SLM-Aminco (Thermo Spectronie) Series 8000과 같은 분광기에서 큐벳을 교반하면서 사용해 측정한다.
용어 "koff"는 결합 분자와 항원 간의 특별한 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. koff 해리 속도 상수는 예를 들어 Octet™ 시스템을 사용해 바이오레이어 간섭계법 (biolayer interferometry)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 "결합 속도" ("on-rate") 또는 "kon"은 또한 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)에서 ~10 상대적인 단위 (반응 단위, RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용해 25℃에서, 전술한 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 수 있다. 간략하게는, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 제조사의 지침에 따라 N-에틸-N'-다이메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 사용해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8을 사용해 5 ㎍/ml (~0.2 μM) 농도로 희석한 다음 결합된 단백질 약 10 반응 단위 (RU)가 되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원을 주입한 후, 1M 에탄올아민 용액을 주입하여 미-반응성 기들을 차단한다.
달리 명시되지 않은 한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 "생물학적으로 활성인" 및" 생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 생물학적 분자에 결합하는 능력을 가진 것을 의미한다.
"생물학적 분자"라는 표현은 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합을 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 생물학적 분자는 자연계에 존재한다.
Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편은 전체 항체 (whole antibody)의 펩신 또는 파파인 가수분해와 같은 통상적인 방법을 이용해 전체 항체로부터 수득할 수 있다. 또한, 항체, 항체의 일부 및 면역어드헤신 (mmunoadhesion) 분자는 본원에 기술된 바와 같이 표준적인 재조합 DNA 기법을 이용해 수득할 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주에서 발현된 항체를 지칭하며, 이때 뉴클레오티드 서열(들)은 세포와 천연적으로 연관되어 있지 않다.
본원에서, 용어 "변이체 항체"는, 모 항체의 서열과 비교해, 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가, 결손 및/또는 치환함으로써 이의 "모" 항체의 아미노산 서열과 상이한, 아미노산 서열을 가진 항체를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 변이체 항체는 모 항체와 비교해 적어도 하나 이상의 (예, 1-12, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개, 일부 구현예에서, 변이체 항체는 1 내지 약 10개의) 아미노산의 부가, 결손 및/또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 부가, 결손 및/또는 치환은 변이체 항체의 CDR 내에 이루어진다. 변이체 항체 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 변이체 항체 서열에서 모 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기들의 %로서 본원에서 정의된다. 변이체 항체는, 모 항체에 결합하는, 동일한 항원, 바람직하게는 에피토프에 결합하는 능력을 가지고 있으며, 일부 구현예에서 하나 이상의 특성 또는 생활성은 모 항체보다 우수하다. 예를 들어, 변이체 항체는 모 항체와 비교해 예를 들어 더 높은 결합 친화성을 가질 수 있거나, 반감기가 더 길 수 있거나, IC50이 더 낮거나 또는 항원의 생물학적 활성을 저해하는 능력이 강화될 수 있다. 본원에서는, 모 항체의 생물학적 활성에 대해 적어도 2배보다 높은 (바람직하게는 5배 이상, 10배 이상 또는 20배 이상) 생물학적 활성을 나타내는 변이체 항체에 특히 주목한다.
용어 "2중 특이성 항체"는 2개의 서로 다른 생물학적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 하나의 생물학적 분자의 서로 다른 2개의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(들)을 함유한 항체를 의미한다. 이중 특이성 항체는 또한 "듀얼 특이성"을 가진 것으로 또는 "듀얼 특이성" 항체인 것으로서 본원에서 지칭된다.
넓은 의미에서, 용어 "키메라 항체"는 하나의 항체의 하나 이상의 영역과, 하나 또는 수개의 다른 항체의 하나 이상의 영역, 전형적으로 부분적으로 인간 및 부분적으로 비-인간 항체, 즉 마우스, 랫 또는 유사 야생 동물과 같은 비-인간 동물 또는 라마 및 알파카 등의 낙타과로부터 일부 유래된 항체의 하나 이상의 영역을 포함하는, 항체를 지칭한다. 키메라 항체는 일반적으로 인간 항-항체 면역 반응, 예를 들어 뮤라인 항체의 경우 인간 항-마우스 항체 면역 반응의 위험성을 낮추기 위해, 비-인간 항체보다 선호된다. 전형적인 키메라 항체의 예는 가변성 영역의 서열이 뮤라인 서열이고 불변부 서열이 인간 서열인, 항체이다. 키메라 항체의 경우, 비-인간 영역은 항체를 인간화하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다.
용어 "인간화"는, 항체가 완전히 또는 부분적으로 비-인간 기원, 예를 들어, 대상 항원으로 마우스 또는 라마를 각각 면역화함으로써 수득한 마우스 또는 라마 항체이거나, 또는 이러한 마우스 또는 라마 항체에 기반한 키메라 항체일 경우, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 또는 최소화하기 위해, 일부 아미노산, 특히 중쇄 및 경쇄의 프래임워크 영역 및 불변 도메인의 일부 아미노산을 치환할 수 있다는 것을 의미한다. 항체와 타겟 항원 간의 상호작용의 특이성은 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 CDR 영역들에 위치한 아미노산 잔기에 기인한다. 이러한 이유로, CDR 영역내 아미노산 서열은 CDR 영역 이외의 서열과 비교해 여러가지 항체들에서 훨씬 더 가변적이다. CDR 영역 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 특이적인 천연 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키거나, 또는 보다 일반적으로는, 예를 들어, 특이 항체의 CDR 서열과 다른 항체의 프래임워크 서열을 발현하는 발현 벡터를 구축함으로써, 주어진 아미노산 서열을 가진 임의의 특이 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 그 결과, 비-인간 항체를 "인간화"하고, 초기 항체의 결합 특이성 및 친화성을 상당히 보존하는 것이 가능하다. 면역원성, 즉 특정 항체에 대한 인간 항-항체 반응을 정확하게 예측하긴 불가능하지만, 비-인간 항체는 전형적으로 인간 항체보다 면역원성이 더 높다. 외래 (예, 야생 동물 또는 낙타과) 불변부가 인간 기원의 서열로 치환된 키메라 항체는, 일반적으로, 완전히 외래 기원의 항체 보다 면역원성이 더 낮아, 치료 항체로서 완전한 인간 항체 또는 인간화된 항체를 사용하는 경향이 있다. 키메라 항체 또는 비-인간 기원의 기타 항체는 따라서 인간 항-항체 반응의 위험성을 낮추기 위해 인간화될 수 있다.
키메라 항체의 경우, 인간화는 전형적으로 가변부 서열의 프래임워크 영역의 변형을 수반한다. 상보성 결정부 (CDR 영역)의 일부인 아미노산 잔기는, 대부분 인간화에 의해 변형될 가능성이 거의 없지만, 일부 경우에는, 예를 들어, 당화 부위, 탈아미드화 부위, 아스파르테이트 이성질화 부위 또는 부적절한 시스테인 또는 메티오닌 잔기를 제거하기 위해, CDR의 개별 아미노산 잔기들을 변형하는 것이 바람직할 수 있다. N-연결된 당화는 트리펩타이드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 올리고당 쇄를 부착시켜 이루어지며, 서열에서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-당화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 다른 잔기로 돌연변이함으로써, 바람직하게는 보존적인 치환에 의해 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 인자에 따라 발생할 수 있다. 특히, 아스파라긴 잔기는, 주로 Asn-Gly 서열에 존재하는 경우에는 탈아미드화되기 쉬우며, Asn-Ala과 같은 다른 다이펩타이드 서열에서는 정도가 약하다. 이러한 탈아미드화 영역, 특히 CDR 영역 서열 내 Asn-Gly 존재시, 원칙적으로 관련 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 보존적인 치환에 의해 이 영역을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
항체 서열을 인간화하는 다수의 방법들이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 가장 일반적으로 사용되는 방법들 중 한가지는 CDR 사이트 이식 (CDR site transplantation)이다. CDR 그래프팅 (CDR grafting)은 Kabat CDR 정의를 기초로 할 수 있지만, 최종 편집판 (Magdelaine-Beuzelin et al, Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210-225 (2007))에서는 IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) 정의가 인간화 결과를 개선할 수 있는 것으로 시사되어 있다 (Lefranc et al, Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)). 일부 경우에, CDR 그래프팅은 CDR이 수득되는 모 항체 CDR 영역과 비교해 결합 특이성과 친화성을 낮출 수 있으며, 따라서, CDR 그래프팅된 비-인간 항체의 생물학적 활성을 낮출 수 있다. 리버스 돌연변이 (reverse mutation) (때때로, "프래임워크 영역 수리 (framework region reparation)"라고도 함)를, CDR 그래프팅된 항체의 선택 위치에, 통상적으로 프래임워크 영역에 적용하여, 모 항체의 결합 친화성과 특이성을 회복시킬 수 있다. 잠재적인 리버스 돌연변이를 위한 위치 결정은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 이용가능한 정보를 이용해 수행할 수 있다. 리버스 돌연변이하기 위한 후보 잔기인 아미노산 잔기는 일반적으로 항체 분자의 표면 상에 위치하는데 반해, 표면 노출 정도가 낮거나 또는 묻히는 잔기는 일반적으로 변형되지 않을 것이다. CDR-사이트 이식 및 리버스 돌연변이에 대한 대안으로 인간화 방법은, 비-인간 기원의 비-노출 잔기들은 유지하면서 표면에 노출된 잔기를 인간 잔기로 바꾸는, 표면 변화 (surface change)이다.
완전한 인간 항체를 제조하기 위한 2가지 기법이 있다: 시험관내 구축된 파지 라이브러리 (in vitro collected phage libraries)를 이용한 기법, 또는 인간화된 동물 (마우스, 랫 등)을 면역화함에 의한 생체내 기법.
파지 디스플레이는 최초이자 가장 널리 사용되는 시험관내 항체 검색 기법이다. 1985년에, 스미스는 클로닝한 유전자 서열이 융합 단백질로서 파지 입자의 표면에 발현되는 방식으로 외래 DNA 서열을 필라멘트형의 박테리오파지 M13에 클로닝할 수 있음을 알게 되었다 (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317). 따라서, 다른 단백질에 결합하는 능력을 기반으로 대상 외래 단백질을 선별할 수 있다. 이러한 발견은 PCR 증폭 기법과 결합되었으며, 면역글로불린 유전자의 cDNA 레파토리를 클로닝하여, 타겟-특이적인 단일클론 항체를 신속하게 검색하기 위해 사용될 수 있는, 가변성 도메인을 포함하는 다양한 파지 라이브러리들을 구축할 수 있었다. 파지 라이브러리 레파토리는, 라이브러리 구축에 사용된 혈액의 각 인간 또는 동물의 B-세포 항체의 레파토리를 반영한다. 1995년에, 하이브리도마 기법으로 제조된 것과 일치할 수 있는 완전한 인간 항체 레파토리를 발현하는 유전자 조작 마우스를 구축한 것에 대한 논문 2개가 발표되었다 (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856-859). 이들 동물에서 자신의 내인성 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자를 의도적으로 파괴한 다음, 인간 중쇄 및 κ 경쇄 유전자의 세그먼트인 전이유전자를 도입하였다. 인간 유전자 레파토리를 마우스 면역계에 사용하여, 매우 다양한 항원들에 대해 고 특이성 및 고 친화성의 항체가 생산되는 것으로 밝혀졌다. 형질전환 마우스는 기본적으로 마우스 및 인간 성분의 하이브리드 (인간 면역글로불린, 마우스 Igα, Igβ 및 기타 신호전달 분자들)인 B 세포 수용체를 발현함에도 불구하고, 이의 B 세포는 정상적으로 발생 및 성숙한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 개선하기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이를 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어 항체의 인간화로 결합 특이성 또는 친화성의 감소가 발생하고, 역 돌연변이만으로는 결합 특이성 또는 친화성의 충분한 개선이 가능하지 않은 일부 경우에, 인간화와 함께 수행될 수 있다. 다양한 친화성 성숙화 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)의 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 세포의 분리된 클론 집단에 의해 합성 및 단리된 항체를 지칭한다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 클론 집단에서 불멸화 세포는 전형적으로 면역화 동물 유래 개별 B 림프구를 림프성 종양 유래의 개별 세포와 융합하여 제조되는 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마이다. 하이브리도마는 구축된 세포 타입이며, 자연적으로 존재하진 않는다.
"나이브 항체"는 통상적으로 동일한 2개의 경(L) 쇄와 동일한 2개의 중(H) 쇄로 구성된 약 150,000 달톤 분자량의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 중쇄와 연결되고, 이황화 결합의 개수는 여러가지 면역글로불린 이소형의 중쇄들에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정하게 이격된 체인내 이황화 결합을 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VH)을 가지고 있으며, 그 다음에 복수의 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인 (VL)을, 다른 말단에는 불변 도메인을 가지고 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변성 도메인과 중쇄 가변성 도메인 사이에 계면 (interface)을 형성하는 것으로 생각된다.
본원에서 다양한 항체를 기술하기 위해 사용된 용어 "단리된" ("isolated")은 항체가 발현되는 세포 또는 세포 배양물로부터 동정 및 분리 및/또는 재생된 항체를 지칭한다. 천연 환경으로부터의 불순물 (오염 물질)은 폴리펩타이드의 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는, (1) 스피닝 컵 서열 분석 장치 (spinning cup sequenator) (Edman sequenator)의 사용에 의한 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 코마시 브릴리언트 블루 또는 바람직하게는 은 염료를 이용한 환원성 또는 비-환원성 조건 하 SDS-PAGE에서의 동질성을 나타내는 수준으로 정제된다. 단리된 항체는, 폴리펩타이드의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하진 않으므로, 재조합 세포 내부의 인 시추 항체를 포함한다. 전형적으로, 단리된 폴리펩타이드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 수득된다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 소스에서 일반적으로 결합되어 있는 하나 이상의 핵산 분자-불순물로부터 동정 및 분리된 것이다. 단리된 핵산 분자는, 천연 환경에서 발견되는 형태 또는 세트와 구분된다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 환경에서 세포내 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 환경에서 세포내 위치화가 아닌 염색체 위치에 존재하는 경우에, 항체가 정상적으로 발현되는 세포내 위치된 핵산 분자를 포함한다.
본원에서, 용어 "에피토프"는 결합 분자 (예, 이중 특이성 결합 분자와 같이, 항체 또는 관련 분자)에 특이적으로 결합하는 항원의 영역 (결정부)을 지칭한다. 에피토프 결정부는 통상적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑들로 이루어지며, 통상적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체 구조 (conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프의 경우, 단백질 (예, 항원)과 상호작용 분자 (예, 항체) 간의 상호작용 지점들 모두 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 이루어진다. 입체 에피토프의 경우, 상호작용 지점들은 1차 아미노산 서열상 서로 이격되어 있는 단백질의 아미노산 잔기들을 가로질러 형성된다. 바람직한 항원 에피토프가 동정되면, 이 에피토프에 대한 항체를 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법으로 제작할 수 있다. 또한, 항체 또는 기타 결합 분자의 구축 및 특정화로 바람직한 에피토프에 대한 정보를 해명할 수 있다. 이러한 정보를 기반으로, 예를 들어, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 결합 분자를 탐색하기 위한 경쟁적인 실험들을 수행함으로써, 같은 또는 동일한 (identical) 에피토프에 결합하는 결합 분자를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다.
본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 도메인들을 조합할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 서로 결합하는 도메인에 따라 소정의 길이를 가지며, 임의의 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는 5개 이상의 아미노산 길이를 가지며, G, A, S, P, E, T, D, K로부터 선택되는 임의의 아미노산 세트로 구성된다.
용어 "시험관내"는 인공적인 조건에서 모델링되는 신체 외부에서의 생물학적 대상, 생물학적 공정 또는 생물학적 반응을 지칭한다. 예를 들어, 시험관내 배양된 세포는 신체 외부 환경, 예를 들어 시험관, 배양 바이얼 또는 마이크로타이터 플레이트에서 배양된 세포로서 이해된다.
용어 "IC50" (50% 저해 농도)은 종양 세포와 같은 세포의 측정가능한 활성 또는 반응, 예를 들어, 증식/증폭을 50%까지 저해하는 약물 농도이다. IC50 값은 커브 피팅 (curve fitting)을 위한 특수 통계 소프트웨어를 사용해 적절한 용량-반응 곡선을 적용해 계산할 수 있다.
용어 GI 50 (50% 증식 저해)은 종양 세포와 같은 세포의 증식이 50%까지 저해되는 약물의 농도를 지칭한다.
용어 "ED50" (EC50) (50% 유효 용량/농도)은 50%의 (세포독성을 포함할 수 있는) 생물학적 효과를 발휘하는 약물의 농도를 지칭한다.
용어 항체 "작동자 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 Fc-영역 서열 또는 Fc-영역 아미노산 변이체)에 기인하거나 또는 항체 이소형에 따라 달라지는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 작동자 기능의 예로는 Clq 결합 및 보체 의존적인 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예, B 세포 수용체, BCR)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화 등이 있다.
"항체-의존적인 세포성 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포 (예, 자연 살상 (NK) 세포, 호중구, 세포 및 대식세포)가 타겟 세포 상에 결합된 항체를 인지한 후 타겟 세포의 세포용해를 유도하는, 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 일차 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII만 발현하지만, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)의 464쪽 표 3에 요약 기술되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 사용가능한 작동자 세포는 말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 및 자연 살상 (NK) 세포이다. 다른 예로 또는 부가적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)에 기술된 바와 같이 동물 모델에서 분석할 수 있다.
"인간 작동자 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하며 작동자 기능을 수행하는, 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며, ADCC 작동자 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살상 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있으며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 작동자 세포는 이의 천연 소스로부터, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타내기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 인간 FcR 서열이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (수용체 gamma)이며, FcγRI, FcγRII (FcγRIIa 및 FcγRIIb) 및 FcγRIII (FcγRIIIa 및 FcγRIIIb) 서브클래스를 포함하며, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 얼터너티브 슬라이싱된 형태 (alternatively spliced form) 등을 포함한다. FcγRI은 IgG에 대해 고 친화성을 나타내는데 반해, FcγRII 및 FcγRIII는 저 친화성을 나타낸다. FcγRIIa 및 FcγRIIIa는 단핵세포/대식세포 및 단핵세포/대식세포/자연 살상 세포 각각에서 발현되는 활성화 FcγR이며, 인간 타겟 세포의 세포독성을 촉발할 수 있다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 함유한다. 저해성 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반의 저해 모티프 (ITIM)를 함유하고 있다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR에 대한 리뷰는 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)에 제공된다. 향후 동정될 FcR 등의, 기타 FcR도 본원에서 용어 "FcR" 범위에 포함된다. 이 용어는 또한 모계 IgG를 태아에 전달하는 역할을 하는 신생아 (neonatal) 수용체 FcRn을 포함한다.
"보체-의존적인 세포독성" 또는 "CDC"는 분자가 보체의 존재시 타겟을 세포용해시킬 수 있는 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예, 항체)에 결합함으로써, 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기술된 바와 같이, CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 전체 서열에 대해 최대 동일성%를 달성하기 위해 갭을 도입하며, 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 후, 후보 서열의 아미노산 잔기가 이와 비교되는 대응되는 서열의 잔기와 동일한 %를 의미하는 것으로 해석된다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되진 않을 것이다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정할 수 있다 (예, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). 이 소프트웨어는 다양한 치환, 결손 (소거) 및 기타 변형에 대한 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열들을 매칭시킨다.
항체의 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "상동성"은 항체가 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 이 용어는, 핵산 서열과 관련하여, 뉴클레오티드 서열이 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97%의 서열 동일성을 나타내는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 기술된 항체의 아미노산 서열에 변형(들)이 제안된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형으로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결손, 및/또는 삽입, 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조체가 바람직한 특징을 가지는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 결손, 삽입 및 치환의 임의 조합이 행해진다. 또한, 아미노산 변형은 당화 부위의 개수 또는 위치의 변동 등의, 항체에서 번역 후 프로세스를 변형시킬 수 있다.
아미노산 치환을 이용한 항체의 아미노산 서열의 변형 변이체. 이러한 변이체는 항체 분자의 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 치환한 것이다. 치환 돌연변이를 유발하기 위한 가장 주목되는 부위로는 과가변부 또는 CDR 등이 있지만, FR 또는 Fc 변형 역시 고려된다. 보존적인 치환은 표 A의 "바람직한 치환"에 나타낸다. 이러한 치환으로 생물학적 활성에 변화가 생긴다면, 표 A에서 "치환 예"로 언급된 부가적인 유의한 변화가 도입될 수 있거나, 또는 아미노산의 클래스를 기술함에 있어 아래에 추가적으로 기술된 변화가 도입될 수 있으며, 산물을 스크리닝할 수 있다.
표 A
오리지날 잔기 치환 예 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn(N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly(G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르루신 Leu
Leu (L) 노르루신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르루신 Leu
용어 "핵산", "뉴클레익 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 핵산의 단편 또는 영역을 결정하고, 비-천연 뉴클레오티드를 함유하거나 또는 비-함유하고, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 또는 이들 DNA의 전사 산물인, 변형된 또는 비-변형된 정확한 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명은 천연 염색체 환경, 즉 천연 상태의 뉴클레오티드 서열과 무관한 것으로 본원에 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 단리 및/또는 정제된 것이며, 즉, 예를 들어, 복사 (copy)에 의해 직접 또는 간접적으로 수집된 것이며, 이의 환경은 적어도 부분적으로 변형된다. 이에, 예를 들어, 숙주 세포의 재조합 유전학에 의해 수득되거나 또는 화학 합성에 의해 수득된 단리된 핵산 역시 본 발명에 언급되어야 한다.
뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 즉, 특정 서열을 가진 핵산은 이의 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해되어야 한다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체에서 기능적으로 관련된 코딩 서열을 발현시키는데 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합부 등이 있다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치되었을 때, "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프리-서열 (pre-sequence) 또는 분비형 리더 서열의 DNA는, 폴리펩타이드 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서가 서열 전사에 영향을 미친다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합부가 번역을 용이하도록 배치된다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 DNA 서열들이 인접해 있으며, 분비형 리더의 경우에는 인접해 있으며 리딩 페이스 (in reading phase)인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 인접하게 위치되어야 하는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이며, 즉 부가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 조각이다. 일부 구현예에서, 벡터는 부가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율적인 복제 (autonomous replication)를 수행할 수 있다 (예, 박테리아의 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 추가적인 구현예들에서, 벡터 (예, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포 게놈에 병합될 수 있으며, 그래서 숙주 유전자와 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로서 언급된다.
본원에서, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 본 발명의 결합 분자의 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의, 중쇄 또는 이의 항원-결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 경쇄-코딩 뉴클레오티드 서열 또는 이의 항원-결합 영역, 또는 이 둘다를 포함하는, 숙주 세포에 관한 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐 아니라 물론 이 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다. 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속 세대들에서 발생할 수 있으므로, 이들 자손은 실제 모 세포와 동일하지 않을 순 있지만, 이들 세포는 여전히 본 발명의 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 포함된다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 다른 임의의 성분을 나타내기 위해 사용된다.
"약학적 조성물"은 본 발명의 항체와, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 혼용가능한 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배 및 감지 물질 (dispensing and sensing agent), 전달제, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 충전제, 붕해제 (disintegrator), 보습제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 감미제, 향제 (flavouring agent), 방향제 (aromatizing agent), 항세균제, 살진균제, 윤활제 및 장기 전달 조절제 (prolonged delivery regulator)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들의 선택과 적절한 비율은 투여 타입과 방식 및 용량에 따라 결정된다. 적합한 현탁화제의 예로는 에톡시화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에텐, 소르비톨 및 소르비톨 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물이 있다. 미생물 작용을 방지하는 보호는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 소르브산 및 유사 화합물에 의해 제공될 수 있다. 또한, 조성물은 등장성 물질, 예를 들어, 당 (sugar), 폴리올, 염화나트륨 등을 포함할 수 있다. 조성물의 연장된 작용은 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성될 수 있다. 적절한 담체, 용매, 희석제 및 전달제의 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 천연 오일 (예, 올리브 오일) 및 주사용 유기 에스테르 (예, 에틸 올리에이트) 등이 있다. 충전제의 예로는 락토스, 유당 (milk sugar), 소듐 사이트레이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 등이 있다. 붕해제 및 분배제의 예는 전분, 알긴산 및 이의 염, 실리케이트이다. 적절한 윤활제의 예는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 탈크 및 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜이다. 활성 성분을 단독으로 또는 다른 화합물과 조합하여, 경구, 설하, 경피, 안내, 근육내, 정맥내, 피하, 국소 또는 직장 투여하기 위한 약학적 조성물은, 동물 및 인간에게 전통적인 약제학적 담체와의 혼합물로서 표준적인 투여 형태로 투여될 수 있다. 적절한 표준적인 투여 형태로는 경구 형태, 예를 들어, 정제, 젤라틴 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 츄잉 검 및 경구 용액 (peroral solution) 또는 현탁액; 설하 및 볼을 통한 (transbuccal) 투여 형태; 에어로졸; 임플란트; 국소, 경피, 피하, 근육내, 정맥내, 비강내 또는 안내 투여 형태 및 직장 투여 형태 등이 있다.
"약제"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 용액, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 화합물 (또는 약학적 조성물로서 화합물들의 혼합물)이다.
용어 " CD47 및 PD-L1 에 의해 매개되는 질환 또는 장애"는, 질환 또는 장애의 병인, 발병, 진행, 지속 또는 병리를 포함하여, CD47 및 PD-L1 과 직접 또는 간접적으로 연관된, 모든 질환 또는 장애를 의미한다. "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 하나 이상의 이와 관련된 증상을 완화 또는 제거하는 방법을 의미한다. 본원에서, 질환, 장애 또는 병태를 "완화한다"는 것은 질환, 장애 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발병 빈도의 감소를 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"는 것은 근치적 (curative), 고식적 (palliative) 및 예방적 치료를 포괄한다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류이며, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
용어 "장애"는 본 발명의 화합물을 이용한 치료가 유익한 임의 병태를 의미한다. 이 용어에 대한 정의는 포유류가 이러한 장애 (violation) 발병에 취약하게 만드는 병리학적 병태를 비롯해, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본 발명에 따라 치료할 바람직한 장애는 암이다.
용어 "암" 및 "암성 (cancerous)"은 포유류에서 전형적으로 규제를 벗어난 세포 성장/증식을 특징으로 하는 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 이를 나타낸다. 이 정의에는, 양성 및 악성의 암성 질환이 포함된다. 암성 질환의 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 이러한 암성 질환에 대한 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소-세포 폐암, 비-소 세포성 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 상피암 (squamous carcinoma), 복막암, 간세포성 암, 위장암 등의 위암 (stomach cancer), 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 침샘암, 신장암 (kidney or renal cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암, 항문암, 고환암, 흑색종 및 다양한 타입의 두경부암 등이 있다.
용어 "면역 반응", "자가면역 반응" 및 "자가면역 염증"은, 예를 들어, 림프구, 항원-제시 세포, 식세포, 과립구 및 이들 세포나 간세포에 의해 생산되는 용해성 거대분자 (soluble macromolecule) (침습성 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포 또는 자가면역 또는 병원성 염증의 경우에는 인체로부터 유래된 정상 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴 또는 소거의 결과로 생기는, 항체, 사이토카인 및 보체)의 작용을 지칭한다.
"치료학적 유효량"은 치료 중인 장애의 한가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 투여 중인 치료학적 물질의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "만성적인 (chronic)" 투여는, 장기간 동안 초기 치료학적 효과 (활성)를 유지하기 위해, 급성 (단기간) 투여 방식과 반대되는, 물질(들)의 연속적인 (지속적인) 사용을 의미한다.
"간헐적" 투여는 중단없이 계속적으로 수행되는 것이 아니라 사실상 주기적인 치료를 의미한다.
본원에서, 용어 "들을 포함한다", "들을 가진다, "들을 함유한다" 또는 "을 포함한다", "포함하는", "을 가진다", "가지는", "을 함유한다" 또는 "포함하여"와 같은 변형어, 그리고 이의 모든 문법상 변형어들은, 언급된 정수 (integer) 또는 정수군을 포함하는 의미로 이해될 뿐 아니라, 임의의 다른 정수 또는 정수군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 상세한 설명
항체
본 발명은 CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 PD-L1에 대해 하나 또는 2개의 결합부를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, CD47에 대한 결합부는 CD47 수용체와 SIRPα 리간드의 상호작용을 저해하거나, 및/또는 PD-L1에 대한 결합부는 PD-L1과 PD-1 수용체 간의 상호작용을 저해한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 중쇄 가변부를 포함하는 CD47 결합부를 포함하고, 중쇄 가변부가 하기를 포함하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(a) 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 또는 90% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열임;
(b) 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 80%, 84%, 86%, 88%, 92% 또는 96% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열번호 6-15의 서열이거나, 또는 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되되 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환이 존재하는 서열임;
(c) 서열번호 7-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 90%, 93% 또는 95% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 7-20으로 이루어진 군으로부터 선택되되 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열임.
일 구현예에서, 본 발명은 CD47 결합부를 포함하며, CD47 결합부가 하기를 포함하는 중쇄 가변부를 포함하는 CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(d) 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(e) 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
(f) 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 구현예에서, 본 발명은 CD47 결합부를 포함하며, CD47 결합부가 하기 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부를 포함하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변부:
(i) 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 또는 90% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열임,
(ii) 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 80%, 84%, 86%, 88%, 92% 또는 96% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열번호 6-15의 서열이거나, 또는 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되되 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환이 존재하는 서열임,
(iii) 서열번호 7-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 90%, 93% 또는 95% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 7-20으로 이루어진 군으로부터 선택되되 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열임, 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변부:
(i) 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 또는 90% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열임,
(ii) 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 80%, 87% 또는 94% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되되 1, 2 또는 3개의 치환이 존재하는 서열임,
(iii) 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 80% 또는 90% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이거나, 또는 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되되 1 또는 2개의 치환이 존재하는 서열임.
일 구현예에서, 본 발명은, CD47 결합부를 포함하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체로서, CD47 결합부가 하기 중쇄 결합부 및 경쇄 가변부를 포함하는 항체에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변부:
(i) 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
(ii) 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
(iii) 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변부:
(i) 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
(ii) 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
(iii) 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 구현예에서, 본 발명은, CD47 결합부를 포함하며, CD47 결합부가 하기 중쇄 결합부 및 경쇄 가변부를 포함하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(a) 서열번호 66-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부, 및
(b) 서열번호 89-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부.
일 구현예에서, 본 발명은, CD47 결합부를 포함하며, CD47 결합부가 하기 중쇄 결합부 및 경쇄 가변부를 포함하는 CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(a) 서열번호 66-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변부, 및
(b) 서열번호 89-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변부.
일 구현예에서, 본 발명은, PD-L1 결합부를 포함하며, PD-L1 결합부가 하기 중쇄 결합부 및 경쇄 가변부를 포함하는 CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변부:
(i) 서열번호 5의 서열에 대해 80% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열번호 5의 서열이거나 또는 하나의 치환을 가진 서열번호 5의 서열임;
(ii) 서열번호 16의 서열에 대해 적어도 80%, 86% 또는 92% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열번호 16의 서열이거나, 또는 1, 2 또는 3개의 치환을 가진 서열번호 16의 서열임;
(iii) 서열번호 21의 서열에 대해 적어도 80% 또는 90% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열번호 21의 서열이거나 또는 1 또는 2개의 치환을 가진 서열번호 21의 서열임, 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변부:
(i) 서열번호 35의 서열에 대해 적어도 80%, 86% 또는 83% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 즉 CDR1은 서열번호 35의 서열이거나 또는 1, 2 또는 3개의 치환을 가진 서열번호 35의 서열임;
(ii) 서열번호 49의 서열에 대해 적어도 80% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 즉 CDR2는 서열번호 49의 서열이거나, 또는 1개의 치환을 가진 서열번호 49의 서열임;
(iii) 서열번호 65의 서열에 대해 적어도 80% 또는 90% 이상 상동적이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 즉 CDR3는 서열번호 65의 서열이거나 또는 1 또는 2개의 치환을 가진 서열번호 65의 서열임.
일 구현예에서, 본 발명은, PD-L1 결합부를 포함하며, PD-L1 결합부가 하기 중쇄 결합부 및 경쇄 가변부를 포함하는 CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다:
(a) 하기를 포함하는 중쇄 가변부:
(i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
(ii) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
(iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및
(b) 하기를 포함하는 경쇄 가변부:
(i) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
(ii) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2,
(iii) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
일 구현예에서, 본 발명은, CD47 결합부가 Fab, scFv, scFab, 또는 단리된 VH 또는 VHH 모노-도메인인 것을 특징으로 하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, PD-L1 결합부가 Fab, scFv, scFab, 또는 단리된 VH 또는 VHH 모노-도메인인 것을 특징으로 하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, CD47 및/또는 PD-L1 항원으로 덮인 세포에 대해 항체-의존적인 세포성 세포독성, 대식세포-매개 식세포작용, 보체-의존적인 세포독성 및/또는 T 세포-매개 세포독성을 자극하는 것을 특징으로 하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 돌연변이 또는 변형이 없는 동일한 항체와 비교해 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 가진 Fc 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, CD47 및 PD-L1에 결합하는 항체에 관한 것이다.
핵산 분자
본 발명은 또한 본원에 기술된 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체 를 코딩하는 핵산 분자 및 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 다양한 핵산 분자들이 항-CD47/PD-L1 항체 의 아미노산 서열의 제1 도메인 및 제2 도메인을 코딩한다. 제1 도메인 및/또는 제2 도메인이 중쇄 및 경쇄를 포함하는 일부 구현예에서, 서로 다른핵산들이 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열들을 코딩한다. 다른 구현예들에서, 동일한 핵산 분자가 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 코딩한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 제1 도메인의 아미노산 서열과 제2 도메인의 아미노산 서열 (예, 중쇄 및 경쇄 서열)의 임의 조합을 코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는, 선택적으로 서로 연결하는 펩타이드 링커의 임의 서열을 포함하여, 제1 결합 도메인의 아미노산 서열과 제2 결합 도메인의 경쇄 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않은 한 이의 상보체를 포괄한다. 따라서, 특이적인 서열을 가진 핵산은 상보적인 서열을 가진 이의 상보적인 가닥을 포괄하는 것으로서 이해되어야 한다. 본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 염기 10개 이상의 길이의 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 임의 타입의 뉴클레오티드의 변형된 형태로 된 폴리머 형태를 의미한다. 이 용어는 이중 가닥 형태 및 단일 가닥 형태를 포함한다.
전술한 임의 구현예에서, 핵산 분자는 단리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 항-CD47/PD-L1 항체를 생산하는 임의 소스로부터 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 단리되기 보다는 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 임의 소스의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프래임으로 연결된, 본 발명의 항체의 제1 도메인 또는 제2 도메인 유래의 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 핵산 분자는, 임의 소스의 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프래임으로 연결된, 본 발명의 항체의 제1 영역 또는 제2 영역 유래의 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 제1 또는 제2 결합 도메인의 중쇄 (VH) 및/또는 경쇄 (VL)의 가변성 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 항체 유전자의 전체 길이에서 "변환"될 수 있다. 일 구현예에서, VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, VH 세그먼트가 벡터에서 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되거나 및/또는 VL 세그먼트가 벡터에서 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되도록, 이미 중쇄 불변 (CH) 또는 경쇄 불변 (CL) 도메인을 코딩하는 발현 벡터에 각각 삽입함으로써, 전체 길이에 걸쳐 항체 유전자로 변환된다. 다른 구현예에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자는, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 CH 및/또는 CL 도메인을 코딩하는 핵산 분자에 표준 분자 생물학 기법을 이용해 연결, 예를 들어, 라이게이션함으로써, 전체 길이에서 항체 유전자로 변환된다. 전체 길이에서 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 이후 이것이 도입된 세포에서 발현될 수 있다.
핵산 분자를 사용해 재조합 항-CD47/PD-L1 항체 를 다량 발현시킬 수 있다. 또한, 핵산 분자를 사용해, 본원에 기술된 바와 같이, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 2중 특이성 항체, 단쇄 항체, 면역어드헤신, 다이아바디, 돌연변이 항체 및 항체 유도체를 제조할 수 있다.
벡터
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합한 벡터에 관한 것이다.
본 발명은, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CD47/PD-L1 항체 또는 이의 일부의 임의 아미노산 서열 (예, 제1 결합 도메인의 중쇄 서열 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄 서열)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가적으로 제공한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자 및 벡터를 사용해 돌연변이된 항-CD47/PD-L1 항체 를 만들 수 있다. 항체는, 예를 들어, 항체의 결합 특성을 변형시키기 위해, 제1 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변성 도메인 및/또는 제2 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 항체의 KD를 높이거나 또는 낮추기 위해, 또는 koff를 높이거나 또는 낮추기 위해, 또는 항체의 FcRn에 대한 결합 특이성을 변형시키기 위해, 하나 이상의 CDR에 행해질 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는, 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체 의 제1 또는 제2 결합 도메인에 대응되는 항체에서 생식계열 (germinal line)과 비교해 변경되는 것으로 알려진, 아미노산 잔기에 행해진다. 이러한 돌연변이는 가변성 도메인의 CDR 또는 프래임워크 영역에서, 또는 불변 도메인에서 행해질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 가변성 도메인에서 이루어진다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는, 본 발명의 항체의 가변성 도메인의 CDR 또는 프래임워크 영역에서 생식계열과 비교해 변경되는 것으로 알려진 아미노산 잔기에 행해진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체 는, 유전자들이 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열과 같은 필수 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록, 발현 벡터에서, 전술한 바와 같이 수득되는, 제1 또는 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스 (AAV), 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자익 바이러스, 토바코 모자익 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. DNA 분자는 벡터내 전사 및 번역 조절 서열이 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록, 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합하도록 선택될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA 서열이 각 벡터에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 DNA 분자들의 임의 조합은 동일한 발현 벡터에 도입된다. DNA 분자는 표준 방법 (예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한효소 부위의 라이게이션, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는다면 블런트 엔드 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 도입될 수 있다.
적절한 벡터는, 임의의 VH 또는 VL 서열이 전술한 바와 같이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적절한 제한효소 부위 조작을 가진, 기능적으로 완전한 (complete) 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 이러한 벡터에서 HC- 및 LC-코딩 유전자는, 대응되는 mRNA를 안정화함으로써 항체 단백질의 전체 수율을 높이는, 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열 측면에는, RNA 스플라이싱이 발생할 위치를 결정하는 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 어셉터 부위가 배치된다. 인트론 서열의 위치는 항체 쇄의 가변부 또는 불변부 중 어느 하나이거나, 또는 복수의 인트론이 사용된 경우에는 가변부 및 불변부 양쪽일 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류 천연 염색체 부위에서 발생할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩한다. 항체 쇄 유전자는, 신호 펩타이드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 (heterologous) 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린 단백질 유래 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체의 쇄 유전자 외에도, 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 함유 (caryying)할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 조절 서열의 선택 등의 발현 벡터의 설계가 형질전환할 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 포유류에서 발현 숙주 세포에 대해 바람직한 조절 서열로는, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40) (예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스, (예, 주요 후기 프로모터 아데노바이러스 (AdMLP)), 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및 천연 면역글로불린 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터 등의, 포유류 세포에서 단백질의 높은 수준의 발현을 보장하는 바이러스 인자 등이 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명은, 예를 들어 미국 특허 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615를 참조한다. 프로모터 및 벡터뿐 아니라 식물의 형질전환에 대한 설명을 포함하여, 식물에서 항체와 같은 결합 분자를 발현시키는 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,517,529를 참조한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어 효모 세포에서 폴리펩타이드를 발현시키는 방법 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 쇄 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 규제하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자 등의, 부가적인 서열을 함유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별가능하게 만든다 (예, 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제 물질에 대한 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭에 dhfr-숙주 세포를 사용하는 경우), neo 유전자 (G418 선별하는 경우), 및 글루타메이트 신테타제 유전자 등이 있다.
본원에서, 용어 "발현 조절 서열"은 이것이 라이게이션된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 발현 조절 서열로는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 등의 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정시키는 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 적절한 경우, 단백질 분비를 강화하는 서열 등이 있다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하며; 원핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 일반적으로 리보솜 결합부의 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 전형적으로 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 구성 성분들을 적어도 포함하며, 존재할 경우 유익한 부가적인 구성성분, 예를 들어 리딩 서열 및 융합 세포의 서열을 또한 포함할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 CD47 및 PD-L1에 대한 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예는, 항체를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포를 도입/제조하고, 이러한 숙주 세포를 항체의 발현/생산에 적합한 조건에서 배양하고, 수득된 항체를 분리하는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 재조합 숙주 세포에서의 발현에 의해 수득되는 CD47 및 PD-L1에 대한 항체는 본원에서 "재조합 항체"로서 지칭된다. 또한, 본 발명은 이러한 숙주 세포로부터 유래된 세포의 자손 및 이와 유사하게 수득되는 CD47 및 PD-L1에 대한 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체 를 코딩하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적절한 포유류 또는 이의 세포, 식물 또는 이의 세포, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질전환하는데 사용할 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 공지된 기법일 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-핵산 복합체 형질감염, 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵내 직접 미세주입법 등이 있다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류에 도입될 수 있다. 세포의 형질감염 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 식물 세포의 형질전환 방법도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation), 바이올리스틱 형질전환 (biolistic transformation), 직접 주입 (direct injection), 전기천공 (electroporation) 및 바이러스 형질전환 등이 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
형질전환의 숙주로 사용되는 포유류 세포주는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이용가능한 복수의 불멸화 세포주들을 포함한다. 이러한 것으로는, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, FreeStyle 293 세포 (Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예, Hep G2), A549 세포, 및 복수의 기타 세포주 등이 있다. 발현 수준이 높고 생산되는 단백질의 필수 특징을 제공하는 세포주를 확인함으로써, 세포주를 선택한다. 사용될 수 있는 기타 세포주는 Sf9 또는 Sf21 세포 등의 곤충 세포주이다. CD47 및 PD-L1에 대한 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 더 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 배양 배지로의 항체의 방출을 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 제조한다. CD47 및 PD-L1에 대한 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 영양 배지로부터 단리할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들어, 니코티아나 (Nicotiana), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 개구리밥 (duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등이 있다. 박테리아 숙주 세포로는 E. coli 및 스트렙토마이세스 종 등이 있다. 효모 숙주 세포로는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등이 있다.
아울러, 생산 세포주로부터 본 발명의 CD47 및 PD-L1에 대한 항체의 생산 수준은 다수의 공지된 기법을 이용해 강화할 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 강화하기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 EP 0216846, 0256055, 0323997 및 0338841과 연계하여 전체 또는 일부 논의되어 있다.
여러가지 세포주에 의해 또는 형질전환 동물에서 발현된 CD47 및 PD-L1에 대한 항체가 서로 상이한 당화 프로파일을 가질 것임은 틀림없다. 그러나, 본원에 기술된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 CD47 및 PD-L1에 대한 항체들 모두, 결합 분자의 당화와 무관하게, 일반적으로 번역 후 수정 여부와 무관하게, 본 발명의 일부이다.
항체 제조
본 발명은 또한 CD47 및 PD-L1에 대한 항체 및 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 및 공정에 관한 것이다.
단일클론 항체
단일클론 항체는 Kohler, et al. Nature 256,1975, p. 495에 최초로 언급된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나, 또는 재조합 DNA 방법 (US 4816567)을 이용해 제조할 수 있다.
하이브리도마-기반의 방법을 이용하는 경우, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를, 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구의 형성을 유발하기 위해, 전술한 방법에 따라 면역화한다. 다른 구현예에서, 림프구는 시험관내 면역화에 의해 제조할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 골수종 세포주와 적절한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용해 융합시켜, 하이브리도마 세포를 제조한다.
이렇게 수득되는 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 비-융합된 모 골수종 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는, 적절한 배양 배지에 접종하여 배양한다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소를 포함하지 않는다면, 하이브리도마의 배양 배지는 통상적으로 하이토크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지), 즉 HGPRT가 결핍된 세포의 증식을 저해하는 물질을 함유하여야 한다.
바람직한 골수종 세포주는 미국 캘리포니아 pc. 샌디에고 Salk Institite Cell Disrtibution Center에서 입수할 수 있는 뮤라인 종양 세포주 MORS-21 및 MPC-11, 그리고 미국 메릴랜드 ea. 록빌 American Type Culture Collection에서 입수할 수 있는 세포주 SP-2 또는 X63-Ag8-653에 기반한 세포주와 같은 마우스 골수종 세포주이다. 단일클론 항체를 제조하기 위한 인간 마우스 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주의 사용 역시 개시된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, p. 3001).
바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 수득되는 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 분석에 의해, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정한다.
단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)에 기술된 스캐차드 분석 (Scatchard analysis)에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정한 후, 제한 희석 방법을 이용해 클론을 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 배양할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어 마우스에 세포의 복막내 (i.p.) 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체내 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 방출되는 단일클론 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통례적인 항체 정제 기법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예, 단백질 A- 또는 단백질 G-세파로스 이용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 분리할 수 있다.
단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통례적인 공정 (예, 뮤라인 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)을 이용해 쉽게 단리 및 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 소스로서 사용된다. DNA는, 단리 후, 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 이후 E. coli 세포, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 형질감염되지 않은 항체 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 달성한다. 박테리아에서 항체를 코딩하는 DNA의 재조합 발현에 대한 논문들을 참조한다.
추가적인 구현예에서, 단일클론 항체 또는 항체 단편은 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에 기술된 기법을 이용해 구축된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에는 파지 라이브러리를 이용해 뮤라인 및 인간 항체를 각각 단리하는 방법이 기술되어 있다. 후속 간행물들은 매우 거대한 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 체인 셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐 아니라 조합 감염 및 생체내 재조합 (combinatorial infection and in vivo recombination)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조 방법을 개시한다 (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). 즉, 이러한 기법들은 단일클론 항체를 단리하기 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기법에 대한 실행가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들어, 키메라 또는 융합 항체 폴리펩타이드를 제조하기 위해, 예를 들어, 중쇄 및 경쇄 (CH 및 CL) 불변부의 서열을 상동적인 뮤라인 서열로 치환함으로써 (US 4,816,567 및 Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81: 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드 (이종의 폴리펩타이드)의 코딩 서열 전체 또는 일부에 공유적으로 연결함으로써, 변형할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩타이드 서열이 항체의 불변부를 치환하거나, 또는 항체의 항원-결합 센터의 가변성 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성을 가진 항원-결합부와 다른 항원에 대한 특이성을 가진 다른 항원-결합부를 포함하는 키메라 2가 항체를 구축할 수 있다.
인간화 항체 (humanized antibody)
비-인간 동물에서 "인간화 항체"를 생산하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 소스로부터 내부에 통합된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는, 전형적으로 "유입 (import)" 가변부로부터 입수되므로, 흔히 "유입" 잔기로 지칭된다. 인간화는 기본적으로 과가변성 영역의 서열을 인간 항체의 대응되는 서열로 치환함으로써, 윈터 및 동료 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986))의 방법에 따라 수행할 수 있다. 이에, "인간화" 항체는, 온전한 인간 가변부 보다 실질적으로 작은 영역이 비-인간 종 유래의 대응되는 서열로 치환된, 키메라 항체 (US 4,816,567)이다. 실제, 인간화 항체는 전형적으로 일부 과가변부 잔기 및 잠재적으로는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사 영역의 잔기로 치환된, 인간 항체 (human antibody)이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될, 인간 가변부, 경쇄 및 중쇄 둘다의 선택은, 항체가 인간 치료용으로 의도된 경우, 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 줄이는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변부 서열은 공지된 인간 가변성 도메인 서열의 전체 라이브러리에서 스크리닝한다. 설치류와 가장 가까운 인간 V 도메인 서열을 동정하고, 인간화 항체에 사용하기 적합한 그 내부 인간 프래임워크 영역 (FR)을 선택한다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)). 다른 방법의 경우, 모든 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 컨센서스 서열로부터 수득되는, 특정 프래임워크 영역을 사용한다. 동일한 프래임워크를 수종의 여러가지 인간화 항체들에 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89:4285 (1992)).
또한, 항체는 인간화되고 높은 항원 결합 친화성과 그외 유의한 생물학적 특성을 가지는 것이 중요하다. 이를 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화된 서열의 개념적인 3차원 모델을 이용한 모 서열 및 다양한 인간화 산물의 분석에 의해, 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙하다. 선택한 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시 및 제시하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 이미지를 조사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능성에 있어 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉 후보 면역글로불린이 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있다. 이런 방식으로, 타겟 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은 바람직한 항체 특징을 달성할 수 있도록, FR 잔기들을 선택하고 수용 (recipient) 서열 및 유입 (import) 서열과 조합하여, 타겟 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은 원하는 항체 특징을 달성할 수 있다. 일반적으로, 과가변부 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체는, 선택적으로 면역접합체를 형성하기 위해 하나 이상의 세포독성 물질(들)이 접합된, Fab와 같은 항체 단편일 수 있다. 다른 예로, 인간화 항체는 전장 항체(full-length antibody), 예를 들어, 전장 IgG1 항체일 수 있다.
인간 항체 및 파지 디스플레이 라이브러리에 기반한 기법
인간화의 대안으로서, 인간 항체를 구축할 수 있다. 예를 들어, 현재, 면역화 후, 내인성 면역글로불린 생산 없이 전 범위 (full spectrum)의 인간 항체를 생산할 수 있는, 형질전환 동물 (예, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결손 (homozygous deletion)시, 내인성 항체 생산이 완전히 저해되는 것으로 개시된 바 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 전이하면, 항원 챌린지시 인간 항체가 만들어진다 (US 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852).
다른 예로, 면역화된 공여체 유래 면역글로불린 가변 (V) 영역 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 제조하기 위해, 파지 디스플레이 기법을 이용할 수 있다 (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)). 이 기법에 따라, 항체 V-영역 유전자를 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 외막 단백질 유전자와 인-프래임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 제시한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 1 카피를 포함하므로, 항체의 기능적 특성에 기반한 선택으로 상기한 특성을 가진 항체를 코딩하는 유전자를 선별한다. 즉, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 파지 디스플레이를 위해 여러가지 소스의 V-유전자 세그먼트를 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)에서는, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V-유전자의 소규모 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 세트를 단리하였다. 다양한 항원 세트 (자기-항원 포함)에 대해 비-면역화된 인간 공여체 유래의 V 유전자 레퍼토리는 기본적으로 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기술된 기법에 따라 단리할 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 구축할 수 있다 (US 5,567,610 및 US 5,229,275).
항체 단편
특정 경우에, 전체 항체 보다는 항체 단편을 사용하는 것이 권고된다. 더 작은 크기의 단편이 이를 신속하게 제거하고, 밀집 종양 (dense tumor)에 더 잘 침투하게 할 수 있다.
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기법들이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해 (proteolytic digestion)를 통해 유래된다. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 수득할 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 E. coli로부터 발현 및 분비시켜, 이들 단편의 다량 생산을 용이하게 할 수 있다. 항체 단편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 다른 구현예에서, Fab'-SH-단편을 E. coli에서 직접 단리하고, 화학적으로 커플링하여 F(ab')2-단편을 제조할 수 있다 (Carter et al, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2-단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 에피토프-결합 수용체 잔기를 보유한 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2가 US 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편을 수득하기 위한 또 다른 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 다른 구현예들에서, 선택 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185, US 5,571,894 및 US 5,587,458 참조). Fv 및 sFcv는 불변부가 결핍된 온전한 결합 부위를 가진 유일한 종이며; 그래서, 생체내 사용시 비-특이적인 결합을 줄이는데 적합하다. scFv가 탑재된 (carrying) 융합 단백질은 scFv의 N- 또는 C-말단에 작동자 단백질이 융합되게 설계될 수 있다. 또한, 항체 단편은, 예를 들어, US 5,641,870에 기술된 바와 같이 "선형 항체 (linear antibody)"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일 특이성 또는 2중 특이성일 수 있다.
다중 특이성 항체
다중 특이성 항체는 2 이상의 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 단백질의 서로 다른 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 다중 특이성 항체는, CD47 및 PD-L1에 대한 결합부를 다른 단백질에 대한 결합부와 조합하여 겸비할 수 있다. 2중 특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예, 2중 특이성 항체의 F(ab')2 단편)으로서 수득할 수 있다.
다중 특이성 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 2중 특이성 전장 항체의 전통적인 제조 방법은 양쪽 쇄가 서로 다른 특이성을 가진 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기반으로 한다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배분 (random assortment)으로, 이들 하이브리도마 (쿼드로마스 (quadromas))는 단 하나만 올바른 2중 특이성 구조를 가진 10종의 항체 분자들로 된 잠재적인 혼합을 생산한다. 여러 단계들에서 친화성 크로마토그래피에 의해 통상적으로 수행되는 올바른 분자 정제 공정은 다소 번거럽고, 생산 수율이 낮다. 비슷한 방법들은 WO 93/08829에 기술되어 있다.
다른 접근법에 따라, 바람직한 결합 특이성 (항체의 항원-결합부)을 가진 항체 가변성 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합한다. 융합은 바람직하게는 힌지 CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig-중쇄 불변부를 이용해 이루어진다. 바람직하게는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 가진 제1 중쇄 불변부 (CH1)가 하나 이상의 융합체에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 적절할 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 다양한 발현 벡터에 삽입하여, 적합한 숙주 세포에 공동-형질감염시킨다. 이는, 최적의 수율을 제공하기 위해 구조체에 3개의 폴리펩타이드 체인을 비-균등한 비율로 사용하는 구현예에서, 이들 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율 (mutual proportion)을 선정하는데 상당한 유연성이 제공된다. 그러나, 폴리펩타이드 체인 2 이상을 균등한 비율로 고 수율로 발현시키거나 또는 이들 비율이 특별히 중요하지 않을 경우, 하나의 발현 벡터에 폴리펩타이드 체인 2개 또는 3개 모두를 코딩 서열을 삽입하는 것도 가능하다.
이러한 접근법에 대한 바람직한 구현예에서, 2중 특이성 항체는 제1 암에 제1 결합 특이성을 제공하는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 제2 암에 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍이다. 이러한 비-대칭적인 구조는, 2중 특이성 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 분리하기 용이하게 하므로, 원치않은 면역글로불린 체인 조합들로부터 바람직한 2중 특이성 분자를 쉽게 분리시키는 것으로, 확인되었다. 이러한 방식은 WO 94/04690에 기술되어 있다. 2중 특이성 항체의 제조와 관련한 보다 상세한 내용은, 예를 들어, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)을 참조한다.
US 5731168에 기술된 다른 방식에 따르면, 재조합 세포 배양물로부터 수득되는 헤테로다이머의 %를 최대화하도록 항체 분자 쌍 사이의 계면 (interface)을 구축할 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 측쇄를 가진 하나 이상의 소형 아미노산을 더 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 치환한다. 큰 측쇄를 가진 아미노산을 더 작은 측쇄를 가진 아미노산 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환함으로써, 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)와 동일한 또는 비슷한 크기의 보상적인 "캐비티" (compensatory cavity)를 형성시킨다. 이는 원치않은 기타 최종 산물과 비교해 헤테로다이머의 수율을 높이는 기전을 제공한다.
2중 특이성 항체는 가교된 또는 "헤테로접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체에서 항체 하나는 아비딘과 커플링되고, 다른 항체는 바이오틴과 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역 시스템 세포를 원치않은 세포로 타겟팅하기 위해 (US 4,676,980), 그리고 HIV 감염을 치료하기 위해 사용할 수 있다 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089). 헤테로접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용해 만들 수도 있다. 적절한 가교제들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 가교 기법들과 더불어 US 4,676,980에 기술되어 있다.
항체 단편들로부터 2중 특이성 항체를 수득하는 방법들 역시 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 화학적 결합에 의해 수득할 수 있다. Brennan et al., Science 229:81 (1985)에는 온전한 항체를 단백질 분해에 의해 절단하여 F(ab')2를 제조하는 공정이 기술되어 있다. 이들 단편은 다이티올 착화제 (dithiol complexing agent), 예를 들어, 아비산나트륨의 존재하에 환원 처리하여, 인접한 다이티올을 안정화하고, 분자간 이황화 결합 형성을 방지한다. 그런 후, 제조된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 변환한다. 이후, Fab'-TNB 유도체들 중 하나를 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 다시 변환하고, 이를 동일 몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 2중 특이성 항체를 수득한다. 제조된 2중 특이성 항체는 선택적인 효소 고정화 (selective immobilization)를 위한 물질로 사용할 수 있다.
최근 진전으로, 화학적으로 커플링하여 2중 특이성 항체를 제조할 수 있는, Fab'-SH 단편을 E. coli로부터 직접 회수하는 것이 용이해졌다. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)에는 완전히 인간화된 2중 특이성 항체 분자의 F(ab')2의 제조 방법이 기술되어 있다. 각각의 Fab'을 E. coli로부터 각각 분리하고, 시험관내 직접 화학적 커플링을 수행하여, 2중 특이성 항체를 제조한다. 이렇게 수득된 2중 특이성 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐 아니라 인간 유방 종양 타겟에 대한 인간 세포독성 림프구의 세포용해 활성을 자극할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 2중 특이성 항체 단편들을 수득 및 단리하는 다양한 기법들 역시 개시되어 있다. 예를 들어, 2중 특이성 항체는 루신 지퍼를 이용해 제조된 바 있다 (Kostelny et al, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터 유래된 루신 지퍼 펩타이드는 2개의 서로 다른 항체의 Fab'에 유전자 융합에 의해 연결된다. 항체 호모다이머는 힌지부에서 환원하여 모노머를 제조한 다음, 이를 재-산화시켜 항체 헤테로다이머를 제조한다. 또한, 이 방법을 이용해 호모다이머 항체를 수득할 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)에 의해 기술된 "더블 항체" 기법은 2중 특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전이다. 단편은, 매우 짧아 동일한 체인 상에서 2개의 도메인 간에 쌍을 형성시킬 수 없는 링커에 의해 연결된 VL 영역과 VH 영역을 포함한다. 즉, 하나의 단편의 VH 영역과 VL 영역은 다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 영역과 쌍을 형성하도록 하여야 하며, 따라서 2개의 항원-결합부가 형성된다. 단쇄 Fv-(sFv) 다이머를 이용하여 2중 특이성 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 또한 개시되어 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조).
또한, 본 발명은 2가 보다 높은 다가 항체를 제공한다. 예를 들어, 3중 특이성 항체를 제조할 수 있다.
다가 항체 (polyvalent antibody)
다가 항체는 2가 항체 보다 더 빠르게 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화 (및/또는 이화 (catabolize))될 수 있다. 본 발명의 항체는 항체의 폴리펩타이드 체인을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 수득할 수 있는 항원 결합부를 3개 이상 가진 (예, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 (dimerization domain)과 3개 이상의 항원 결합부를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 단편 또는 힌지부를 포함한다 (또는 이들로 구성된다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 단편과, Fc 단편에 대해 N-말단 위치에 3개 이상의 항원 결합부를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 항원 결합부를 3 내지 약 8개 포함하며 (또는 이로 구성되며), 바람직하게는 항원 결합부를 4개 포함한다 (또는 이로 구성된다). 다가 항체는, 2 이상의 가변부를 포함하는, 하나 이상의 폴리펩타이드 체인 (바람직하게는, 2개의 폴리펩타이드 체인)을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 체인(들)은, VD1이 제1 가변부이고; VD2가 제2 가변부이고; Fc가 Fc 단편의 하나의 폴리펩타이드 체인이고; X1 및 X2가 아미노산 또는 폴리펩타이드이고; 및 n이 0 또는 1인, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 체인(들)은 다음과 같은 체인을 포함할 수 있다: VH-CH1-플렉시블 링커-VH-CH1-Fc 단편; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 단편. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 경쇄 가변부 폴리펩타이드를 2개 이상 (바람직하게는 4개) 더 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 경쇄 가변부 폴리펩타이드를 약 2 내지 약 8개 포함할 수 있다. 본원의 맥락에서, 경쇄 가변부 폴리펩타이드는 경쇄 가변부를 포함하며, 선택적으로 CL 영역을 더 포함한다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 (또는 유일한 활성 성분으로서) CD47/PD-L1-특이 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은, 본원에 기술된 바와 같이, CD47 및 PD-L1에 특이적인 하나 이상의 항체, 및/또는 대응되는 하나 이상의 표면 수용체를 타겟팅하는 하나 이상의 부가적인 결합 분자 (예, 항체)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 IgG에 의해 매개되는 장애를 개선, 예방 또는 치료하기 위한 것이다.
"약학적 조성물"은 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체, 및 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배제, 전달제, 보존제, 안정화제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 장기 전달 조절제와 같은, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 적절한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들 물질의 선정 및 비율은 투여 타입과 경로 및 투여량에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 의심의 여지없이 자명할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP (우수 의약품제조 관리 기준) 요건을 준수하여 제조되어야 한다. 조성물은 완충제 조성물, 긴장성 물질 (tonicity agent), 안정화제 및 용해제를 포함할 수 있다. 조성물의 장기 작용은 약학적 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성할 수 있다. 적합한 담체, 용매, 희석제 및 전달제의 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 오일, 및 주사용 유기 에스테르 등이 있다.
"약제 (약물)"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 산제, 동결건조제, 주사제, 주입제, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 물질 또는 약학적 조성물로서 물질들의 혼합물이다. 당해 기술 분야에서 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의 방법이 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체에 적절하게 채택될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 포유류, 바람직하게는 인간에 투여하기 적합한 하나 이상의 혼용가능한 (compatible) 액체 또는 고체 성분을 지칭한다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 전술한 성분 이외의 임의 성분을 기술하기 위해 사용된다. 이러한 성분은 약물 제품에 필요한 물리화학적 특성을 부여하기 위해 약제 제조에 사용되는 무기 또는 유기 성질의 물질이다.
본원에서, "완충제", "완충제 조성물", "완충화제 (buffering agent)"는 산-염기 공액 구성성분들의 작용에 의해 pH 변화를 견딜 수 있으며, 항-CD47/PD-L1 항체 약물이 pH 변화를 견딜 수 있게 하는, 용액을 지칭한다. 일반적으로, 약학적 조성물은 바람직하게는 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 가진다. 사용되는 완충제의 예로는, 비-제한적으로, 아세테이트, 포스페이트, 사이트레이트, 히스티딘, 숙시네이트 등이 있다. 완충제 용액.
본원에서, 용어 "긴장성 물질", "삼투용질 (osmolyte)" 또는 "삼투압제 (osmotic agent)"는 액체 항체 제형의 삼투압을 높일 수 있는 부형제를 지칭한다. "등장성 (isotonic)" 약물은 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 약물이다. 등장성 약물은 전형적으로 약 250 내지 350 mOsm/kg의 삼투압을 가진다. 사용되는 등장제 (isotonic agent)로는, 비-제한적으로, 폴리올, 사카라이드 및 슈크로스, 아미노산, 금속염, 예를 들어, 소듐 클로라이드 등이 있다.
"안정화제"는 활성 물질의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공하는 부형제 또는 2 이상의 부형제의 혼합물을 의미한다. 안정화제로는, 아미노산, 비-제한적인 예로, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 라이신, 글루타민, 프롤린; 계면활성제, 비-제한적인 예로, 폴리소르베이트 20 (상품명 Tween 20), 폴리소르베이트 80 (상품명 Tween 80), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 및 이의 코폴리머 (상품명 Poloxamer), Pluronic, 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 항산화제, 비-제한적인 예로, 메티오닌, 아세틸시스테인, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 아황산 염 등; 킬레이트제, 비-제한적인 예로, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 소듐 사이트레이트 등이 있다.
약학적 조성물은, 활성 물질이 보관 온도, 예를 들어 2-8℃의 보관 온도에서 지정된 유통 기한 (shelf life) 동안 그 물리적인 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지한다면, "안정적"이다. 바람직하게는, 활성 물질은 물리적 및 화학적 안정성뿐 아니라 생물학적 활성을 유지한다. 보관 기간은 가속 또는 자연 노화 조건에서의 안정성 검사 결과를 토대로 조정된다.
본 발명의 약학적 조성물은 레디 제형 (ready formulation) 형태의 단일 단위 용량 (single unit dose) 또는 복수개의 단일 단위 용량들로 제조, 포장 또는 널리 판매될 수 있다. 본원에서, 용어 "단일 단위 용량"은 활성 물질을 미리 정해진 양으로 포함하는 개별 약학적 조성물의 양을 의미한다. 활성 물질의 양은 일반적으로 환자에게 투여할 활성 물질의 투여량 또는 투여량의 편리한 일부 (convenient part), 예를 들어 투여량의 절반 또는 1/3과 같다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 전형적으로, 주사, 주입 및 이식 (implantation)에 의해 위장관을 우회하여, 피부 또는 점막 장벽에서의 브리치 (breach)를 통해 인체에 투여하기 위한 것으로 의도된 무균성 (sterile) 제형으로서 비경구 투여에 적합하다. 예를 들어, 비경구 투여는, 특히 피하, 복막내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 뇌실내, 요도내, 두개강내, 활액내, 경피 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법 등이 있다. 또한, 국소 관류 (regional perfusion)도 제공된다. 바람직한 구현예는 정맥내 경로 및 피하 경로를 포함한다. 당해 기술 분야에서 허용되는, 펩타이드 또는 단백질의 임의 투여 방법이 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체에 적절히 채택될 수 있다.
주사가능한 제형은, 비-제한적으로, 예를 들어, 앰플, 바이얼, 플라스틱 용기, 사전 충전된 주사기, 자동주사 기구내 단위 투약 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 특히 현탁제, 용액제, 오일성 또는 수성 베이스 중의 에멀젼, 파스타제 (pastes) 등을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 투여하기 전에 적절한 베이스 (예, 무균성 발열원 제거 수)를 사용해 재구성하기 위한 건조된 형태 (즉, 분말 또는 과립)로 제공되는 약학적 조성물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 이러한 제형은, 예를 들어, 냉동 건조로서 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 산물을 냉동시킨 다음 냉동된 물질로부터 용매를 제거하는 것을 수반하는, 동결건조 공정에 의해 수득할 수 있다.
본 발명의 CD47 및 PD-L1 항체는 또한 적절한 추진제가 사용되거나 또는 사용되지 않는, 가압 에어로졸 용기 (aerosol pressurized container), 펌프, 스프레이, 분무기 (atomizer) 또는 네블라이저와 같은 흡입기로부터 단독으로 또는 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로서 흡입에 의해 또는 비강내로, 또는 점비제로서 또는 스프레이제로서 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 투여 형태는 즉시 방출형으로 및/또는 변형된 방출형으로 제형화될 수 있다. 변형된 방출형 제형은 지연성, 지속성, 펄스형, 조절된, 타겟화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체의 치료학적 용도
일 측면에서, 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체는 CD47 및 PD-L1에 의해 매개되는 장애, 예를 들어, (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중-음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, 호지킨 림프종, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류, 바람직하게는 인간 개체이다. 상기한 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
종양 (예, 암)의 경우, 항체 또는 이의 단편 (예, CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편)의 치료학적 유효량은 암 세포의 수를 줄이거나; 초기 종양의 크기를 줄이거나; 암 세포의 말초 장기로의 침윤을 저해하거나 (즉, 다소 느리게, 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 저해하거나 (즉, 다소 느리게, 바람직하게는 정지시킴); 종양 증식을 다소 저해하거나; 및/또는 장애와 관련된 한가지 이상의 증상을 다소 완화할 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 존재하는 암 세포를 어느 정도까지 증식 방지하거나 및/또는 사멸시킬 수 있으며, 이는 세포증식 억제 및/또는 세포독성을 제공할 수 있다. 암 테라피의 경우, 생체내 효과는 예를 들어 전체 생존율 (OS), 종양 진행 소용 시간 (time to tumor progression, TTP), 치료에 대한 전체 종양 반응율 (ORR), 반응 지속 기간 (DR) 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정할 수 있다.
본원에서, 항-CD47/PD-L1 항체 및 하나 이상의 다른 치료학적 물질과 관련하여 용어 "공동-투여 (co-administration)", "공동-투여된다" 및 "와 조합하여 (in combination with)"는,
1) 환자에게 구성 성분들을 실질적으로 동시에 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 제형화되는, 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체와 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시 투여하는 방식,
2) 구성 성분들이 서로 다른 투약 형태로 분리하여 제형화되고, 지정된 환자에게 거의 동시에 도입된 후 이들 구성 성분들이 지정된 환자에서 거의 동시에 방출되는, 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 실질적으로 동시에 투여하는 방식,
3) 구성 성분들이 별개의 투약 형태로 서로 분리되어 제형화되고, 투약 형태들이 충분한 투여 간격으로 환자에게 연속적인 횟수로 섭취되어, 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 다른 시기에 방출되는, 본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식; 및
4) 환자에게 동시에, 연속적으로 또는 동일 시점에 및/또는 서로 다른 시점에 합동적으로 (jointly) 방출되는 조절된 방식으로 구성 성분들을 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 함께 제형화되고, 각각의 부분이 동일 경로에 의해 또는 서로 다른 경로에 의해 투여될 수 있는, 본 발명의 CD47 및 PD-L1에 대한 항체 및 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식을 의미, 언급 또는 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체는 추가적인 치료학적 치료없이, 즉 독립적인 테라피 (independent therapy)로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체에 의한 치료는 하나 이상의 부가적인 치료학적 치료를 포함할 수 있다 (병용 요법). 본 발명의 일부 구현예에서, 항-CD7/PD-L1 항체는 다른 암 약제/약물과 조합하여 투여되거나 또는 이와 함께 제형화될 수 있다.
본원에서, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지하거나 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 단편 및/또는 변이체를 비롯한, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 효소학적으로 활성인 독소를 포괄하는 것으로 의도된다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예로 티오테파 (thiotepa) 및 사이클로포스파미드 (CYTOXAN®); 알킬 설포네이트, 예로 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan); 아지리딘 (aziridine), 예로 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa) 및 우레도파 (uredopa); 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (methylamelamin), 예로, 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 (trimethylolomelamine); 아세토게닌 (acetogenin) (예, 불라탁신 (bullatacin) 및 불라탁시논 (bullatacinone)); 베타-라파콘 (beta-lapachone); 라파콜 (lapachol); 콜히친; 베툴린산 (betulinic acid); 캄프토테신 (camptothecin) (합성 유사체, 토포테칸 (topotecan) (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸 (irinotecan), CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신 (camptothecin), 스코포렉틴 (scopolectin) 및 9-아미노캄프토테신 (camptothecin)); 브리오스타틴 (bryostatin); 칼리스타틴 (callystatin); CC-1065 (이의 아도젤레신 (adozelesin), 카르젤레신 (carzelesin) 및 바이젤레신 (bizelesin) 합성 유사체 포함); 포도필로톡신 (podophyllotoxin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 테니포시드 (teniposide); 크립토피신 (cryptoplhycin) (예, 크립토피신 (cryptophycin) 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴 (dolastatin); 두오카르마이신 (duocarmycin) (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘루테로빈 (eleutherobin); 판크라티스타틴 (pancratistatin); 사르코딕틴 (sarcodictyin); 스폰기스타틴 (spongistatin); 니트로겐 머스타드 (nitrogen mustard), 예로, 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 클로로포스파미드, 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 모벰비신 (novembichin), 펜에스테린 (phenesterine), 프레드무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예로 카르무스틴 (carmustine), 클로로조톡신, 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine) 및 라님누스틴 (ranimnustine); 항생제, 예로, 엔다이인 항생제 (예, 칼리케아미신 (calicheamicin), 예를 들어 칼리케아미신 gamma II 및 칼리케아미신 omega II (예, Angew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 디네미신 (dynemicin), 예로, 디네미신 A; 에스페라미신 (esperamicin); 뿐만 아니라 네오카르지노 스타틴 (neocarzino statin) 크로모포어 및 관련 크로모프로테인 엔다이인 (chromoprotein enediyne) 항생제 크로모포어, 아클라시노마이신 (aclacinomysin), 액티노마이신 (actinomycin), 오트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserin), 블레오마이신 (bleomycin), 캑티노마이신 (cactinomycin), 카라비신 (carabicin), 카르미노마이신 (carminomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-다이아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사제 (DOXIL®), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®), 페길화된 리포좀 독소루비신 (CAELYX®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 예로 미토마이신 (mitomycin) C, 미코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), ?라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토족신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사산물제, 예를 들어, 메토트렉세이트 (methotrexate), 겜시타빈 (gemcitabine) (GEMZAR®), 테가푸르 (tegafur) (UFTORAL®), 카페시타빈 (capecitabine) (XELODA®), 에포틸론 (epothilone) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈 (fludarabine), 6-머캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘, 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 (enocitabine), 플록스우리딘; 항-아드레날린제, 예를 들어 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트릴로스탄 (trilostane); 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산 (frolinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 에닐우라실 (eniluracil); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비스안트렌 (비스antrene); 에다트렉세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 다이아지쿠온 (diaziquone); 엘포르니틴 (elfornithine); 엘립티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다이닌 (lonidainine); 메이탄시노이드 (maytansinoid), 예를 들어 메이탄신 및 안사미톡신 (ansamitocin); 미토구아존 (mitoguazone); 미톡산트론 (mitoxantrone); 모피단몰 (mopidanmol); 니트라에린 (nitraerine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 로속산트론 (losoxantrone); 2-에틸하이드라지드; 프로카바진 (procarbazine); PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산 (razoxane); 리족신 (rhizoxin); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마륨 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (trichothecene) (예, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘 (anguidine)); 우레탄; 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파 (thiotepa); 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (ABRAXANE) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®); 클로란부실 (chloranbucil); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트 (metotrexate); 플라티늄 제제, 예를 들어, 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin); 미세소관을 형성하지 않도록 투불린 중합을 억제하는, 빈카 (vinca), 예를 들어, 빈블라스틴 (vinblastine) (VELBAN®), 빈크리스틴 (vincristine) (ONCOVIN®), 빈데신 (vindesine) (ELDISINE®), FILDESIN®) 및 비노렐빈 (vinorelbine) (NAVELBINE®)); 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미톡산트론 (mitoxantrone); 루코보빈 (leucovovin); 노반트론 (novantrone); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 이반드로네이트 (ibandronate); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노익산, 예로 벡사로텐 (bexarotene) (TARGRETIN®); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (clodronate) (예, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (etidronate) (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (zoledronate) (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (alendronate) (FOSAMAJX®), 파미드로네이트 (pamidronate) (AREDIA®), 틸루드로네이트 (tiludronate) (SKELID®) 또는 리세드로네이트 (risedronate) (ACTONEL®); 트록사시타빈 (1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 구체적으로 비정상적인 세포 증식과 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-alpha, Raf, H-Ras 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어, THERATOPE® 백신 및 유전자 테라피 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제 (예, LURTOTECAN®); rmRH (예, ABARELIX®); BAY439006 (소라페닙 (sorafenib); Bayer); SU-11248 (Pfizer); 페리포신 (perifosine), COX-2 저해제 (예, 셀레콕십 (celecoxib) 또는 에토리콕십 (etoricoxib)), 프로테오좀 저해제 (예, PS341); 보르테조밉 (bortezomib) (VELCADE®); CCI-779; 티피파르닙 (tipifarnib) (R1 1577); 오라페닙 (orafenib), ABT510; Bcl-2 저해제, 예로 오블리머센 소듐 (oblimersen sodium) (GENASENSE®); 픽산트론 (pixantrone); EGFR 저해제 (아래 정의 참조); 티로신 키나제 저해제 (아래 정의 참조); 및 전술한 임의 물질의 약제학적으로 허용가능한 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 전술한 2종 이상의 조합물, 예로, CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법의 약어임) 및 FOLFOX (옥살리플라틴 (ELOXATIN)과 5FU 및 루코보빈 (leucovovin)이 조합된 치료 용법을 의미하는 약어임) 등이 있다.
또한, 이 정의에는 종양에 대한 호르몬의 작용을 규제 또는 저해하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들어, 혼합된 작용제/길항제 프로파일을 가진 항-에스트로겐이 포함되며, 그 예로는 타목시펜 (tamoxifen) (NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene) (FARESTON®), 이독시펜 (idoxifene), 드롤록시펜 (droloxifene), 랄록시펜 (raloxifene) (EVISTA®), 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene) 및 선택적인 에스트로겐 수용체 모듈레이터 (SERM), 예로 SERM3; 작용제 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예로 풀베스트란트 (fulvestrant) (FASLODEX®) 및 EM800 (이러한 물질은 에스트로겐 수용체 (ER) 이량화를 차단할 수 있거나, DNA 결합을 저해할 수 있거나, ER 턴오버를 증가시킬 수 있거나, 및/또는 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 저해제, 예로 스테로이드계 아로마타제 저해제, 예를 들어 포르메스탄 (formestane) 및 엑세메스탄 (exemestane) (AROMASIN®), 및 비스테로이드계 아로마타제 저해제, 예를 들어 아나스트라졸 (anastrazole) (ARIMIDEX®), 레트로졸 (letrozole) (FEMARA®) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 저해제, 예를 들어 보로졸 (vorozole) (RIVISOR®), 메게스트롤 (megestrol) 아세테이트 (MEGASE®), 파드로졸 (fadrozole), 이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 작용제, 예를 들어 루프롤라이드 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 (goserelin), 부세렐린 및 트리프테렐린 (tripterelin); 성 스테로이드, 예를 들어 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트와 같은 프로게스틴 (progestine), 다이에틸스틸베스트롤 및 프레마린 (premarin)과 같은 에스트로겐, 및 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 모든 트랜스레티노익 산 (transretionic acid) 및 펜레티니드 (fenretinide)와 같은 안드로겐/레티노이드; 오나프리스톤 (onapristone); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드 (flutamide), 닐루타미드 (nilutamide) 및 바이칼루타미드 (bicalutamide); 테스토락톤 (testolactone); 및 전술한 임의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐 아니라 상기한 물질 2종 이상의 조합 등을 포함한다.
본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체와 조합하여 사용될 수 있는 그외 치료학적 물질은 성장인자 기능의 저해제일 수 있으며, 예를 들어, 이러한 저해제로는 성장인자 항체 및 성장인자 수용체 항체 (예, 항-erbB2 항체 트라스투주맵 (trastuzumab) [헤르셉틴 (herceptin)], 항-EGFR 항체 파니투무맵 (panitumumab), 항-erbB1 항체 세투시맵 (cetuximab) [Erbitux, C225] 및 Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29에 기술된 임의의 성장인자 또는 성장인자 수용체 항체); 항-혈관신생제, 예로 혈관내피 성장인자의 작용을 저해하는 물질 [예, 항-혈관 내피 세포 성장인자 항체 베박시주맵 (bevacizumab) (아바스틴 (avastin))], 항-혈관 내피 성장인자 수용체 항체, 예를 들어 항-KDR 항체 및 항-flt1 항체; 안티센스 뉴클레오티드, 예를 들어 상기 열거된 타겟에 대한 안티센스 뉴클레오티드, 예를 들어 ISIS 2503, 항-ras 안티센스 물질 또는 G3139 (Genasense), 항-bcl2 안티센스; 유전자 테라피 방식, 예를 들어, 비정상적인 p53 또는 비정상적인 BRCA1 또는 BRCA2와 같은 비정상적인 유전자를 치환하는 방식, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아 니트로리덕타제 효소를 이용하는 등의 GDEPT (유전자-특이적인 효소 프로드럭 테라피) 방식, 및 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자 허용성을 높이기 위한 방식, 예를 들어, 다약제 내성 유전자 테라피; 면역치료 방식 (immunotherapeutic approach), 예를 들어, CD52에 대한 단일클론 항체인 알렘투주맵 (Alemtuzumab) (campath-1H)을 이용한 치료, 또는 CD22에 대한 항체를 이용한 치료, 환자의 종양 세포의 면역원성을 높이기 위한 생체외 및 생체내 방식, 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 사이토카인을 이용한 형질감염, T 세포 아네르기를 줄이기 위한 방식, 예를 들어, CTLA-4 기능을 저해하는 단일클론 항체를 이용한 치료, 사이토카인-형질감염된 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 이용한 방식, 사이토카인-형질감염된 종양 세포주를 이용한 방식 및 항-이디오타입 항체를 이용한 방식, 비-특이적으로 활성화되었거나 또는 대상 특정 항원을 생체외에서 타겟팅하는 T 세포를 이용한 후천적인 T 세포 전달; 벨카드 (Velcade) (보르테조미드 (bortezomide))와 같은 프로테아좀 저해제 등의 단백질 변성 저해제; 예를 들어 수용체 리간드를 격리시키거나, 수용체에 대한 리간드 결합을 차단하거나 또는 (예, 수용체 분해 강화 또는 발현 수준 감소로 인해) 수용체 신호전달을 약화시키는 펩타이드 또는 단백질 (예, 항체 또는 용해성 외부 수용체 도메인 구조)를 이용하는 방식과 같은, 바이오테라퓨틱 치료학적 방식 (biotherapeutic therapeutic approach) 등이 있다.
투여 용량 및 경로
본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체는 대상 병태를 치료하는데 효과적인 양으로, 즉 바람직한 결과를 달성하는데 필요한 용량 및 시간 동안 투여되어야 한다. 치료학적 유효량은 치료 중인 구체적인 병태, 환자의 나이, 성별 및 체중뿐 아니라 항-CD47/PD-L1 항체가 독립 치료 (stand-alone treatment)인지 또는 하나 이상의 부가적인 치료와 조합하여 수행되는 지의 여부와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다.
투약 용법은 최적의 바람직한 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여하거나, 분할된 수개의 용량을 일정 기간 동안 투여하거나, 또는 용량을 치료학적 상황의 긴급성에 의해 지정되는 바와 같이 비례적으로 줄이거나 높일 수 있다. 투여 용이성 및 투여 단일성 (dosing uniformity)을 위해 표준 투약 형태로 비경구 조성물을 제조하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 단위 투약 형태는 치료할 환자/개체에게 단일한 용량 (unitary dosages)으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는 것으로 의도되며; 각 단위는 바람직한 약제학적 담체와 조합하여 바람직한 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 기-결정된 함량으로 활성 화합물을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 표준 투약 형태에 대한 사양 (specification)은, (a) 화학요법제의 고유한 특징 및 달성할 구체적인 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 치료에 있어 이러한 활성 화합물의 컴파운딩 기법의 고유한 한계에 의해 기술되며, 이에 의해 직접 결정된다.
따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본원에 기술된 내용으로부터, 용량 및 투여 용법이 치료 분야에서 잘 공지된 방법에 따라 조정됨을 알 것이다. 즉, 최대 허용량은 쉽게 확립할 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료학적 이점을 제공하는 유효량 역시 환자에게 검출가능한 치료학적 효과를 제공하기 위해 각 물질을 투여하는 시간적 요건처럼 결정할 수 있다. 따라서, 일부 용량 및 투여 용법이 본원에 예로 제공되지만, 이들 예는 본 발명을 실시할 때 환자에게 필수적일 수 있는 용량 및 투여 용법을 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
용량 값은 완화할 병태의 유형과 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 1회 투여 또는 다중 투여를 포함할 수 있음에 유념하여야 한다. 또한, 임의 특정 환자의 경우, 구체적인 투여 용법은 개체 필요성에 따라, 그리고 조성물의 투여를 수행 또는 감독하는 의료 전문가의 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 기술된 용량 범위는 단순 예이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 투여 용법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적인 상태, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용되는 구체적인 항-CD47/PD-L1 항체 등의, 여러가지 인자들에 기초할 수 있다. 즉, 투여 용법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 표준 방법을 이용해 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 또는 실험 값과 같은 임상적인 효과를 포함할 수 있는 약동학 및 약력학 파라미터를 기반으로 조정될 수 있다. 이에, 본 발명은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되는 환자별 용량-증가 (dose-escalation)를 포함한다. 적정 용량 및 용법을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 아이디어가 제공된다면 당해 기술 분야의 당업자라면 이해할 것이다.
적합한 투여 방법의 예는 상기에 제공된다.
본 발명에 따른 CD47 및 PD-L1에 대한 항체의 적정 용량은 0.1-200 mg/kg, 바람직하게는 0.1-100 mg/kg, 예로, 약 0.5-50 mg/kg, 예를 들어, 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 간주된다. CD47 및 PD-L1에 대한 항체는, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예로, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예로, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어 적어도 5 mg/kg; 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예로, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 20 mg/kg, 예로, 최대 15 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 적절한 시간 간격으로, 예를 들어 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회 또는 4주당 1회로, 그리고 주치의가 적절하다고 생각하는 동안 반복될 것이며, 일부 경우에 필요에 따라 용량을 늘리거나 또는 줄일 수 있다.
제조 물품 (제품) 및 키트
본 발명의 추가적인 구현예는 암, 특히 HNSCC, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC, CRC, 간세포암, 흑색종, NSCLC, 신장암, 난소암, 호지킨 림프종, MSI CRC, 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군을 치료하기 위해 사용되는 제품을 포함하는 제품이다. 본 제품은 용기와, 용기 위에 배치하거나 또는 용기 안에 동봉되는 라벨 또는 리플릿 인서트 (leaflet insert)이다. 적합한 용기는, 예를 들어, 캔, 바이얼, 시린지 등이다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 용기는 특정 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 수용하며, 무균성 유입 채널 (sterile inlet channel)을 구비할 수 있다 (예, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사용 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 구비된 바이얼일 수 있음). 조성물 내 한가지 이상의 활성 물질이 본 발명에 따른 항-PD-L1 항체이다. 패키지의 라벨 또는 리플릿은, 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용됨을, 표시한다. 패키지의 라벨 또는 패키지 리플릿은 부가적으로 항체 조성물을 환자에게 투여하기 위한 설명을 포함하여야 한다.
패키지 리플릿은, 치료 제품의 적응증, 빈도, 용량, 투여 경로, 금기 및/또는 예방 조치에 대한 일부 정보를 포함하여, 시판 중인 치료 제품의 패키지에 포함되는 전형적인 설명서를 포함한다. 일 구현예에서, 패키지 인서트는, 조성물이 암, 예를 들어, HNSCC, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC, CRC, 간세포암, 흑색종, NSCLC, 신장암, 난소암, 호지킨 림프종, MSI CRC, 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군을 치료하기 위해 사용됨을, 표시한다.
또한, 물품 (article)은 주사용 정균수 (bacteriostatic water for injection, BSVI)), 포스페이트 완충화된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충제가 든 제2 용기를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 물품은 상업적인 관점에서 그리고 소비자의 관점에서 필요한 기타 제품, 특히, 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다양한 목적으로, 예를 들어, 포유류의 조직, 세포 또는 체액에서 PD-L1을 검출하기 위해 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 PD-L1 질환과 관련된 스크리닝에 적합할 것이다. 키트는 본 발명의 특이적인 결합제 또는 항체와, 이러한 특이적인 결합제 또는 항체가 존재하는 경우 이의 반응을 표시하는 수단을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일 구현예에서, PD-L1에 결합하는 항체는 표지된다. 다른 구현예에서, 항체는 비-표지된 1차 항체이고, 키트는 1차 항체를 검출하기 위한 수단을 더 포함한다. 일 구현예에서, 검출 수단은 항-면역글로불린인 표지된 2차 항체를 포함한다. 항체는 형광단, 효소, 방사성 핵종 및 방사선 비투과성 물질 (radiopaque material)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커로 표지될 수 있다. 키트는 시험관내에서, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 PD-L1을 검출 및 정량하기 위해 항체를 포함하는 키트일 수 있다. 또한, 물품의 경우에서와 같이, 키트는 용기와, 용기 위에 또는 내부에 배치되는 라벨 또는 패키지 인서트를 포함한다. 용기는 본 발명에 따른 하나 이상의 항-PD-L1 항체를 포함하는 조성물을 보유한다. 부가적인 용기는, 예를 들어, 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 포함할 수 있다. 패키지의 라벨 또는 패키지 리플릿은 조성물에 대한 설명뿐 아니라 이의 시험관내 사용 또는 진단 목적을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
진단학적 용도 및 조성물
본 발명의 항-CD47/PD-L1 항체는 또한 진단 프로세스 (예, 시험관내, 생체외)에서 사용된다. 예를 들어, 항-CD47/PD-L1 항체는 환자로부터 수득한 샘플 (예, 염증성 삼출액, 혈액, 혈청, 장액, 타액 또는 뇨와 같은 조직 샘플 또는 체액 샘플)에서 CD47 및/또는 PD-L1의 농도를 검출 또는 측정하기 위해 사용할 수 있다. 적합한 검출 및 측정 방법으로는 유세포 측정, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 화학발광 분석, 방사성 면역분석 및 면역조직학과 같은 면역분석 등이 있다. 본 발명은 본원에 기술된 항-CD47/PD-L1 항체를 포함하는 키트, 예를 들어 진단 키트를 더 포함한다.
실시예
본 발명을 가장 잘 이해하기 위해, 하기 실시예들이 제공된다. 실시예들은 단지 예시적인 목적일 뿐이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 발명이 예시에 의해 그리고 이해를 명확하기 위한 목적으로 예를 들어 일부 상세히 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본원에 기술된 아이디어를 토대로 본 발명의 첨부된 변형 구현의 본질 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 일부 변동 및 수정이 행해질 수 있음이 매우 자명할 것이다.
실시예 1. 포유류 세포 배양으로 재조합 항원 및 항체 생산
인간 CD47 (Leu19-Val134) 및 PD-L1 (Phe19-Arg238) (서열번호 107-108)의 세포외 도메인 서열을 포유류 세포에서 Fc-태깅된 단백질을 생산하기 위한 플라스미드 (도 1)에 SalI/NotI 제한효소 부위에 클로닝하였다. E. Coli에서 필요한 양의 플라스미드를 생산하여, Qiagen 키트를 사용해 정제하였다.
항-CD47 항체의 가변성 도메인 서열 (B6H12, Stanford University, US20130142786)을 포유류 세포에서 IgG1 단백질을 생산하기 위한 플라스미드에 클로닝하였다. E. Coli에서 필요한 양의 플라스미드를 생산하여, Qiagen 키트를 사용해 정제하였다.
항체 및 항원을 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)로부터 수득한 확립된 세포주에서 생산하였다. 오르비탈 셰이커 상에서 무혈청 배지 (Life Technologies Corporation)를 사용해 제조사의 가이드라인에 따라 플라스크에서 현탁 배양을 수행하였다. 일시적인 발현을 위해, 선형 폴리에틸렌이민 (예, PEI MAX, Polysciences)을 사용해 세포를 2*106/ml 농도로 형질감염시켰다. DNA/PEI 비율은 1:3/1:10이었다. 형질감염 후 5-7일에, 세포 배양물을 2000 g에서 20분간 원심분리하고, 0.22 μm 필터로 여과하였다. 배양액으로부터 (affine) HPLC에 의해 타겟 단백질을 단리하였다.
어핀 HPLC를 위한 단백질 A 컬럼에서 세포 배양물로부터 재조합 Fc 단백질을 단리 및 정제하였다. 포스페이트 완충화된 염수 (PBS, pH 7.4)로 평형화된 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF 컬럼 (GE Healthcare)에 맑은 배양액을 통과시켰다. 그런 후, 컬럼은 5배 부피의 PBS로 세척하여 비-특이적인 결합 물질을 제거하였다. 0.1 M 글리신 완충제 (pH 8)로 결합된 항원을 용출시켰다. 주 단백질 용출 피크를 수집하였으며, 1 M Tris 완충제 (pH 8)로 중성 pH로 적정하였다. 모든 단계는 유속 110 cm/h로 수행하였다. 이후, 단백질을 SnakeSkin Dialysis Tubing 기법을 이용해 PBS (pH 7.4)로 투석하고, 여과 (0.22 ㎛)한 다음 시험관으로 옮겨 -70℃에서 보관하였다.
수득한 단백질 용액 순도를 비-환원성 SDS-PAGE (12% 겔)에 의해 분석하였다 (도 2).
실시예 2. 전장 항체의 제조.
클로닝을 표준 기법에 의해 수행하였다. 제한효소 부위가 함유된 프라이머를 사용해, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인 유전자를 포함하는 PCR 산물을 수득하였다. 중쇄의 가변성 도메인을 벡터 pEE-Hc IgG1의 Sal1/Nhe1 제한효소 부위에 클로닝하였다. 경쇄의 가변성 도메인은 벡터 pEE-CK의 Sal1/BsiW1 제한효소 부위에 클로닝하였다. 수득한 유전자 구조체는 CHO-T 세포주에서 일시적으로 단백질을 생산하기 위해 사용하였다. 단백질을 실시예 1에 기술된 바와 같이 박테리아 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 표준 방법에 따라 단리 및 정제하였다. 머캅토에탄올이 첨가된 12% 변성 PAGE에서 (도 3), 머캅토에탄올이 첨가되지 않은 8% 변성 PAGE (도 4)에서 전기영동을 수행하였다.
실시예 3. 나이브 인간 Fab 파지 라이브러리 MeganLibTM의 조작
인간 공여자 1000명 이상으로부터 채집한 혈액 샘플로부터 수득한 총 B-림프구 RNA를 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 사용해 제안된 프로토콜에 따라 단리하였다. RNA 농도 분석은 Nanovue 키트 (GE Healthcare)를 사용해 수행하였으며, 단리된 RNA의 품질은 1.5% 아가로스 겔 전기영동에 의해 검사하였다.
MMuLV 역전사효소와 프라이머로서 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오티드를 사용해, MMLV RT 키트 (Evrogen)로, 권고된 프로토콜에 따라, 역 전사 반응을 수행하였다.
역 전사 산물을 2-단계 중합효소 연쇄 반응의 매트릭스로서 사용해 제한효소 부위들이 측면에 위치된 가변성 도메인 유전자를 수득하였으며, 반응은 문헌 [J Biol Chem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218-30]의 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드 키트를 사용해 수행하였다.
수득된 DNA 산물 (VL-CK-VH)에 엔도뉴클레아제 제한효소 NheI/Eco91I을 처리하고, 이를 오리지날 파지미드 pH5에 라이게이션하였다. 프로토콜 [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]에 따라 준비한 일렉트로컴피턴트 SS320 E. coli 세포에 라이게이션 산물을 형질전환하였다. 조합 Fab 파지 디스플레이 라이브러리 MeganLibTM의 레퍼토리는 형질전환체 1011종이었다. Fab 파지 라이브러리 산물은 기존 공정 [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]에 따라 제조하였다.
실시예 4. 라마에 인간 CD47 항원의 면역화 및 라마 항체 단편의 파지 디스플레이 라이브러리 구축.
동물 라마 글라마 (Lama Glama)에 완전 (1차 주사) 또는 불완전 (그외 주사) 프로인드 보강제와 동일 부피로 혼합한 항원 물질을 피하 투여하여, 5회 연속 면역 주입하였다. 실시예 1의 재조합 인간 CD47 단백질 (1 mg/주사)을 항원으로 사용하였다. 항원 주사는 0, 2, 4, 5 및 8주 간격으로 수행하였다. 3차 주사 후부터 각 주사 후 혈액 샘플 (5 ml)을 5회 수집하였다. 3.8% 소듐 사이트레이트를 항-응고제로 사용하였다 (1:9). 혈액을 멸균 식염수로 2배수 희석하였다. 혈액 희석액 30 ml을 Lymphoprep™ (Axis-Shield, Norway) 매질 (밀도 1.077 g/ml) 15 ml 위에 적층하고, 20분간 800g로 원심분리하였다. 혈장/림포프렙 (Lymphoprep) 매질 인터페이스 구역으로부터 단핵 세포 (림프구 및 단핵구)를 취하여, 멸균 PBS로 헹구었다.
CD47에 대해 수득한 혈청 면역글로불린의 역가를 표준 프로토콜에 따라 분석한 바, 적어도 1/100000인 것으로 판단되었으며, 이는 항체 라이브러리를 제조하기에 충분하였다.
라마 단핵 세포로부터 총 RNA를 RNeasy Mini Kit를 프로토콜 (QIAGEN)에 따라 사용하여 단리하였다. RNA 농도 분석을 Nanovue (GE Healthcare)을 사용해 분석하였으며; 단리된 RNA의 품질을 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 이용해 검사하였다.
MMuLV 역전사효소와 헥사머 프라이머를 사용해, MMLV RT 키트 (Evrogen)에서, 권고된 프로토콜에 따라, 역 전사 반응을 수행하였다.
역전사 산물을 2-단계 중합효소 연쇄 반응의 매트릭스로서 사용해 제한효소 부위가 측면에 위치한 모노도메인 VHH, scFv 또는 Fab 유전자를 수득하였으며; 반응은 [FASEB J. 2007 Nov;21(13):3490-8]에 따른 프로토콜에 따라 올리고뉴클레오티드 키트를 사용해 수행하였다. 수득한 VHH 유전자 DNA 산물에 NcoI/NotI 제한효소를 처리한 다음, [FASEB J. 2007 Nov; 21 (13): 3490-8]에서 사용된 pHEN2와 구성이 비슷한 오리지날 파지미드 pscFv에 라이게이션하였다. 라이게이션 산물은 프로토콜 [Methods Enzymol. 2000;328: 333-63]에 따라 준비한 SS320 일렉트로컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 구축된 VHH-기반의 라이브러리의 레파토리는 독립된 형질전환체 0,5-2*10E+8개였다. 구축된 scFv/Fab-기반의 라이브러리의 레파토리는 각각 0,5-2*10E+9/1,2-2,5*10E+9이었다. 파지 라이브러리 산물을 기존에 공지된 공정 [J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3): 581-97]에 따라 제조하였다.
실시예 5. 항체 단편의 파지 디스플레이 라이브러리 선별
문헌 [EMBO J. 1994 Jul 15;13(14):3245-60, Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581-97]에 기술된 통례적인 선별 공정에 의해 파지 Fab, VHH 또는 scFv 디스플레이 라이브러리 (실시예 3, 4)로부터 특이적인 항-CD47 파지 항체를 선별하였으며, 단 최대 96가지의 스킴 (scheme) 및 변이체를 동시에 수행할 수 있어 자기 비드 및 KingFisher Flex 장치를 사용하였다.
인간 바이오틴화된 PD-L1/CD47 항원 (Fc, EPEA)을 1차 라운드에서 농도 10 ㎍/ml로, 2차 라운드에서 2 ㎍/ml, 3차 라운드 및 4차 라운드에서 각각 0.4 및 0.2 ㎍/ml으로 스트렙타비딘 자기 비드 (NEB) 상에 의도적으로 고정시켰다. 항원을 비드와 함께 회전기 (rotator) 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 그런 후, 비드를 PBS (pH 7.4)로 헹구고, 비드 표면을 2% 탈지 밀크 또는 1% BSA/PBS (pH 7.4) 용액으로 1시간 블록킹하였다. 인간 파지 라이브러리 MeganLibTM을, 2% 탈지 밀크 및 타겟 항원 태그를 포함하는 비-타겟 항원이 첨가된 PBS (pH 7.4) 중의 파지 입자 2*1013개/ml의 농도로 희석한 다음 표면 상에 항원이 없는 자기 비드를 사용해 예비 선별하여 비-특이적인 결합 파지를 제거하였다. IL-5Rα-코팅된 자기 비드를 MeganLibTM과 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다.
결합되지 않은 파지는, 자기 비드를 0.1% Tween-20 함유 PBS (pH 7.4) 용액으로 세척하는 수회 사이클을 수행하여, 제거하였다. 세척 사이클의 횟수는 라운드에 따라 증가시켰다 (1차 라운드에서는 세척 사이클 3회, 2차 라운드에서는 세척 사이클 9회 및 4차 라운드에서는 세척 사이클 15회). 자기 비드 표면 상의 항원에 결합된 파지를, 15분간 교반하면서, 100 mM Gly-HCl 용액 (pH 2.2)을 사용해 비드로부터 용출시킨 다음 1M Tris-HCl (pH 7.6)로 중화하였다. E. coli TG1 박테리아에 파지를 감염시키고, 배양 배지에서 배양 후 다음 선별 사이클에 사용하였다. 3회 또는 4회 라운드 후, E. coli TG1 배양물로부터 제조사 (Qiagen)의 프로토콜에 따라 파지미드 DNA를 단리하였다. 타겟 항원에 대한 라이브러리 농화 및 비-특이적으로 결합하는 파지 입자의 존재 분석을 위해 다클론 파지 효소 면역분석 (ELISA)을 이용하였다.
실시예 6. 특이 및 비특이 항원에 대한 다클론 파지의 ELISA
ELISA를 수행하기 위해 고 흡착 플레이트 (Greiner-Bio) 상에 타겟 항원 (CD47/PD-L1) 및 비-타겟 항원 (Fc-융합 단백질)을 고정시켰다. 단백질을 0.1 M NaHCO3 (pH 9.0) 중의 각각 1 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml 농도로 첨가하고 2에서 7회 희석으로 증가시켜 타이트레이션하였으며, 이후 밀봉된 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후의 모든 단계들은 표준 ELISA 프로토콜에 따라 고-성능 자동 Tecan Freedom EVO 200-기반의 로보트 플랫폼 (Tecan)을 사용해 수행하였다. 비-특이적인 결합을 차단하기 위해, PBS (pH 7.4) 중에 2% 탈지 밀크 또는 1% BSA를 포함하는 차단 완충제를 플레이트 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. Tween 20 (PBST)이 첨가된 포스페이트-염수 완충제로 수회 세척 사이클을 수행한 후, 시험 다클론 파지를 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 세척 후, 각각의 웰을 PBST (1:7500) 중의 항-M13 HRP-접합된 2차 항체 (Pierce-ThermoScientific)로 (50 ㎕/웰) 코팅하였다. 실온에서 50분 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. 10분간 기질 용액 (H2O2-0.02% 및 TMB / CH3COONa pH 5.5)을 첨가하여 비색 신호 (colorimetric signal)를 입수하였으며; 이후 1% 황산 (20 ㎕)을 첨가하여 발색을 차단하였다. 색 신호는 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다.
다클론 파지 생성물에 대한 ELISA에서 타겟 항원의 3차 및 4차 선별 라운드 후 현저하게 농화되었음을 확인하였다. 신호가 파지 라이브러리의 최소 희석시 비-상동적인 대조군 항원에 비해 5배 초과하는 것으로 관찰된 라이브러리를 재 클로닝 및 추가적인 스크리닝을 위해 선택하였다.
실시예 7. 발현 플라스미드에 항체 단편 클로닝
연속적인 선별 라운드 후, 제한효소 라이게이션 기법을 이용한 표준 프로토콜에 따라, 항체 가변성 도메인 유전자를 파지미드 벡터에서 발현 플로스미드로 다시 클로닝하였다.
VHH 모노도메인 또는 scFv로 농화되고 CD47에 특이적인, 수득한 클론 풀을 T7 프로모터의 통제 하에 발현 플라스미드 pET-22 (Novagen)에 클로닝하였으며, 이 플라스미드는 VHH의 C-말단에 mys- 및 His6-태그 서열을 포함한다. CD47 항원에 대해 농화된 서열을 포함하는 라이브러리의 Fab 유전자를, 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 myc- 및 His6-태그 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터 pLL4에, lac 프로모터의 통제 하에 클로닝하였다.
그런 후, 배양 배지로의 방출에 의한 항체 단편 생성 및 Mabnext 플로우 차트 플랫폼을 이용한 ELISA에 의한 디스플레이 라이브러리 유래 가변성 항체 단편의 항원에 대한 친화성 비교 분석을 수행하기 위해, 항체 단편을 포함하는 발현 벡터를 E. coli Bl21(DE3) Gold (Stratagene)에 형질전환하였다.
실시예 8. scFv 또는 VHH 모노도메인의 인간 CD47- Fc에 대한 특이적인 결합 분석.
ELISA를 이용해, 실시예 4의 특이적인 시험 항체 단편의 인간 CD47-Fc에 대한 결합을 측정하였다. ELISA 웰 플레이트 (Nunc ImmunoMaxisorp)를 인간 CD47-Fc (Biocad) (1X 코팅 카보네이트 완충제 중의 0.5 ㎍/ml) 50 ㎕/웰로 코팅하고, 밀봉한 다음 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 추가적인 단계들은 모두 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 차단 완충제 BB (200 ㎕ 0.5% 탈지 밀크/PBS)를 첨가하여, 비-특이적인 결합을 차단하였다. 그런 후, 플레이트를 셰이커 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이를 PBS-Tween으로 헹군 후, 각 셀을 시험 항체 단편이 함유된 세포 상층액 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 셰이커 상에서 인큐베이션하였으며; 추가적으로, 각 플레이트 웰을 PBS-Tween 완충제로 5회 세척하였다. 세척 후, 마우스 항-MYC IgG 클론 9E10 (ThermoFisher Scientific) (50 ㎕/웰)을 PBS-Tween에 첨가하였다 (1:5000). 플레이트를 회전 셰이커에서 교반 (실온에서 50분)한 다음, 전술한 바와 같이 PBS-Tween 완충제로 5회 헹구었다. 세척 후, 항-마우스 IgG HRP 접합체 (ThermoFisher Scientific)(50 ㎕/웰)를 PBS-Tween에 첨가하였다 (1:10000). 플레이트를 회전 셰이커에서 교반 (실온에서 50분)한 다음, 전술한 바와 같이 PBS-Tween 완충제로 5회 헹구었다. TMB (50 ㎕/웰)를 포화될 때까지 (평균 10-12분) 첨가하여 비색 신호를 수득하였으며; 정지 용액 (25 ㎕/웰, 1% 황산)을 첨가하여 발색을 차단하였다. 색 신호는 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다. 항체 결합은 발생된 신호에 비례하였다. 색 신호가 백그라운드 신호 보다 5배 이상인 클론들을 경쟁적인 ELISA 분석으로 검사하여, [WO2016048188 A8]에 언급된 조건과 비슷한 조건 및 검사 항체 단편을 포함하지 않는 대조군 대비 4배 신호 감소 조건 하에 SIRP-Fc 리간드 (BIOCAD)와 인간 CD47-Fc 수용체 간의 상호작용을 차단하는 길항성의 특이 항체 단편을 동정하였다.
클론 2400개를 스크리닝한 결과, 백그라운드 신호에 비해 5배 높은 신호를 나타내는 scFv 및 VHH 클론 265개가 확보되었다. 이들 양성 클론들은 SIRP-Fc 리간드 (BIOCAD)와 인간 CD47-Fc 수용체 간의 상호작용을 차단할 수 있는 길항성 클론 27종을 생산하였다. 양성 클론 유전자의 뉴클레오티드 서열을 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems)에서의 생거 서열분석에 의해 결정하였다. 예시적인 VHH 모노도메인 클론 6종이 수득되었는데, 이는 서열상 아미노산 1개 이상의 차이가 존재하며, 서로 90% 이상 상동적인 CDR 영역들을 가지므로, 이는 면역화된 라마에서 생체내 성숙화에 의해 하나의 모 클론으로부터 기원하였음을 의미한다 (표 1).
표 1. 인간 CD47에 대한 CD47-특이 결합성 VHH 모노도메인의 서열.
클론 명 아미노산 서열 OD 단위, CD47-Fc에 대한 초기 스크리닝 OD 단위, CD47 상에서의 결합 OD 단위, SIRP-Fc에 대한 경쟁적인 스크리닝
BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_H10_78 QVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSISSINAMNWYRQAPGKRREWVAQITGEGITNYRDSVKGRFTITSDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVIHTTSEVYWGQGTLVTVSS 0.4 0.448 0.095
BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_G5_37 AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQAPGNRREWVAQITDEGITNYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGQGTTVTVSS 0.166 0.426 0.143
BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_G7_53 QVKLEESGGGLVQPGGSLTLSCAASGIISSINAMNWYRQAPGKRREWVAQITGEGITNCRDSWKGRFSITSDSANNTMYLQMNNLKPDDTDVYYCNAFVIHTTSEIYWGLGTTVTVSS 0.319 0.498 0.088
BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_F10_76 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNIFSINAMNWYRQAPGKRREWVAQITSEGITNYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITASSEVYWGQGTTVTVSS 0.213 0.312 0.114
BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_C7_49 AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQAPGNRREWVAQITDEGITNYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGQGTTVTVSS 0.127 0.379 0.14
BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_B9_64 DVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCAASRNIFRINAMNWYRQAPGKRREWVAPITSEGITNYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNACLITASSEVYWGQGTLVTVSS 0.129 0.24 0.188
음성 대조군 항원 + 접합체 - 0.021 0.024 0.481
실시예 9. Fab의 인간 CD47- Fc에 대한 특이 결합 분석.
Fab 산물을 표준 기법에 따라 제조하였다: 박테리아 세포를 Fab 유전자를 함유한 발현 벡터로 형질전환시킨 다음 제조된 형질전환체를 배양하는 동안 lac 오페론의 전사를 촉발시키는 유도제를 배지에 첨가하여, Fab의 발현을 유도하였다.
그런 후, ELISA를 수행하여 Fab에 결합하는 인간 CD47을 검색하였다.
공개된 서열 (실시예 1 참조)을 가진 B6H12 Fab를 양성 대조군으로 사용하였다. 특이적인 결합을 검사하기 위해, ELISA 웰 플레이트 (배지 결합, Greiner bio one)를 CD47 Fc lama (1X 카보네이트 완충제 중의 0.2 ㎍/ml) 50 ㎕/웰로 코팅하고, 밀봉한 다음 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 추가적인 단계들은 모두 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 차단 완충제 BB (200 ㎕ 0.5% 탈지 밀크/PBS)를 첨가하여, 비-특이적인 결합을 차단하였다. 그런 후, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 이를 PBS-Tween으로 헹군 후, 각 웰을 시험 Fab가 함유된 세포 상층액 60 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였으며; 이후, 각 플레이트 웰을 PBS-Tween 완충제로 3회 세척하였다. 세척 후, 각 웰을 PBS-Tween 중의 (1:7500) 항-인간 Fab HRP-접합된 2차 항체 (Pierce-ThermoScientific)로 코팅 (50 ㎕/웰)하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음 전술한 바와 같이 PBS-Tween 완충제로 3회 헹구었다. TMB (50 ㎕/웰)를 포화될 때까지 (15분) 첨가하여 비색 신호를 수득하였으며; 정지 용액 (25 ㎕/웰, 1% 황산)을 첨가하여 발색을 차단하였다. 색 신호는 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다. 항체 결합은 발생된 신호에 비례하였다. 색 신호가 대조군 신호에 5배를 초과하는 클론들을 비-특이적인 결합에 대한 ELISA에 의해 검사하였다.
실시예 10. Fab의 다양한 인간 항원에 대한 비-특이적인 결합 분석.
2차 스크리닝은 전장 CD47 항원과 상호작용하지만 비-특이적인 항원과는 상호작용하지 않으며 또한 SIRPa에의 결합에 대해 리간드 (CD47)와 경쟁하는 Fab-생산 클론을 선별하는 것을 목표로 한다.
ELISA를 이용해, 시험 Fab가 다른 항원에 비-특이적으로 결합하는 지를 분석하였다. 분석은 상기와 같이 수행하였으나, 3DHer3-H6E, INFα2b, PD-L1-Fc-lama (1x 카보네이트 완충제 중의 2.5 ㎍/ml)를 고정 항원으로 사용하였다. CD47 FE 및 CD47 Fc lama (1x 카보네이트 완충제 중의 0.2 ㎍/ml)를 특이적인 결합 대조군으로 사용하였다. 추가적인 모든 단계들은 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다.
경쟁적인 ELISA를 이용해, 예비-선별된 항-인간-CD47 특이 Fab의 SIRPa 수용체와의 상호작용을 차단하는 능력에 대해 검사하였다. 공개된 서열 (실시예 1 참조)을 가진 Fab를 길항제에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
ELISA 웰 플레이트 (고 결합성, Greiner bio one)를 SIRPa (1X 카보네이트 완충제 중의 0.5 ㎍/ml)로 코팅 (50 ㎕/웰)하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 추가적인 모든 단계들은 Genetix Qpix2xt (Molecular Devices) 및 Tecan Freedom EVO 200 (Tecan)과 같은 로보트 시스템에 기반한 고-성능 자동 플랫폼을 사용해 표준 ELISA 프로토콜에 따라 수행하였다. 차단 완충제 BB (0.5% 탈지 밀크/PBS, 200 ㎕)를 첨가하여 비-특이적인 결합을 차단하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션하였다.
병행하여, 시험 Fab 및 CD47 Fc lama (PBS-Tween 중의 최종 농도 1 ㎍/ml)를 함유한 세포 상층액을 비-흡착 플레이트에서 1:1 비율로 혼합하여, 실온에서 45분간 인큐베이션하였다.
BB를 제거하기 위해 SIRPa 수용체-함유 플레이트를 헹군 후, Fab 및 CD47 Fc lama 혼합물을 플레이트로 옮겨, 실온에서 45분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 각 플레이트 웰을 PBS-Tween 완충제로 3회 헹구었으며, 항-인간 Fab HRP-접합된 2차 항체 (Pierce-ThermoScientific)를 PBS-Tween (1:7500)에 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 45분간 인큐베이션한 다음 상기와 같이 PBS-Tween으로 3회 세척하였다. TMB (50 ㎕/웰)를 포화될 때까지 (평균 15분) 첨가하여 비색 신호를 수득하였으며; 정지 용액 (25 ㎕/웰, 1% 황산)을 첨가하여 발색을 차단하였다. 색 신호는 적절한 Tecan-Sunrise 플레이트 리더 (Tecan)를 사용해 450 nm에서 측정하였다. Fab 결합은 발생되는 색 신호와 반비례하였다. 대조군 Fab의 수준에서 차단되는 것으로 확인되는 클론을 양성으로 지정하였으며, 추가적인 분석에 사용하였다. 양성 클론의 가변성 도메인 유전자를 Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)에서 표준 프로토콜에 따라 서열분석하였으며, 분석하였다.
실시예 11. 카이네틱 해리 상수 koff ( kdis )에 의한 항-CD47 항체 단편의 비교 스크리닝.
CD47 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 단편의 상호작용에 대한 카이네틱 파라미터 분석예를 제공하기 위해, VHH 항체 단편을 측정하였다. 해리 상수 (kdis)-기반한 VHH 단편의 비교 스크리닝을 Octet Red 96 및 ARG2 아미노-반응성 바이오센서 (Pall-ForteBio)를 사용해 수행하였다. 시험 용액내 실제 단백질의 농도를 기초로 친화성 상수를 계산할 수 있으며, 세포 배양 배지를 단백질 용액으로서 사용하고 단백질 농도를 측정하지 않았으므로, 후보 물질들은 이의 해리 상수를 이용해 서로 비교하였다. 바이오센서를 수중에서 한시간 동안 예비-수화시켰다. 바이오센서를 활성화한 후, 아세테이트 완충제 pH4 중의 10 ㎍/ml 농도의 CD47-Fc를 바이오센서 상에 비-특이적으로 (NH2 기에 의해) 고정시켰다. 그런 후, 센서를 특이적인 VHH가 첨가된 세포 배양 배지 (배지 1 ml 중 VHH 1 ㎍)가 든 웰에 침지하였으며, 이때 복합체가 형성되었다. 이후, 센서를 완충액에 침지하였으며, 이때 복합체의 해리 단계가 이루어진다. 항-CD47 VHH 단편이 함유된 E. Coli 배양 배지 중의 검사 시료 (test specimen)에, 10x 워킹 완충제를 1/10 부피로 첨가하였다. 그래프 (curve)를 작성하여, 1:1 상호작용 모델을 이용한 표준 공정에 따라 OctetDataAnalysis (version 7.0)으로 분석하였다.
항-CD47 VHH 후보 물질에 대한 Koff 스크리닝 결과를 표 2에 나타낸다. 전체 VHH 단편의 인간 CD47에 대한 특이 결합을 확인하였으며; 2중 특이성 항체를 수득하기 위한 추가적인 실험 및 클로닝을 위해 지배적인 kdis에 기반하여 후보 물질 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_C7_49를 선별하였다.
표 2. CD47-Fc와의 VHH의 카이네틱 해리 상수
번호 클론 명 kdis(1/s)
1 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_B9_64 8.00E-03
2 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_C7_49 5.00E-03
3 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_F10_76 1.00E-02
4 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_G5_37 6.00E-03
5 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_G7_53 8.00E-03
6 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_H10_78 6.00E-03
7 BCD106-02_L.Alecto.VHHSel2_MP1_B9_64 8.00E-03
실시예 12. 구조체 수득 및 비-대칭적인 2중 특이성 항-CD47/PD-L1 항체 생산.
최적화된 scFv 단편의 모든 가변성 도메인들의 서열, 및 후보 물질 BCD106-02-VHH_C7_49 (표 3)의 가변성 도메인 VHH의 야생형 및 돌연변이 변이체를 합성하기 위한 유전자 서열 및 항-PD-L1 항체 (BCD135, BIOCAD 사의 오리지날 인간 항체)의 경쇄 및 중쇄의 가변성 도메인의 유전자 서열을, 전용 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 계산하고 표준 프로토콜 [http://www.openwetware.org/wiki/DNA_Synthesis_from_Oligos]에 따라 ASM-2000 (Novosibirsk) 합성기에서 수득된 올리고뉴클레오티드로부터 PCR 합성함으로써, 데노보 수득하였다. 긴 scFv 유전자는 단일 가닥 DNA 분자로부터의 2단계 PCR 합성에 의해 VH 및 VL 유전자로부터 유래되었다. PCR 합성 후, 아가로스 겔 상에서 분리된 DNA 단편들을 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 컬럼에서 정제하였다. scFv 및 VHH 유전자들을 각각 플라스미드 pEE-Fc(knob)에 라이게이션하였으며, aPD-L1-특이 항체의 가변성 중쇄 도메인은 플라스미드 pEE-Fc(hole)에 각각 라이게이션하였다. pEE-Fc(knob)는 돌연변이 S354C+T366W가 존재하는 인간 IgG1 Fc를 포함하고 pEE-Fc(hole)는 돌연변이 Y349C+T366S+L368A가 존재하는 인간 IgG1 Fc를 포함하여, 이들 Fc 영역은 동형이량화가 최소화되는 수준에서 서로 이형이량화를 형성하며 [Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81], pEE-Clambda에 유사한 방식으로 클로닝하여 CHO-EBNA 세포에서 aPD-L1 경쇄 가변성 도메인을 일시적으로 공동-발현시켰다. 변형된 LIC 방법 [Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 1990;18:6069-6074]에 의해 라이게이션-비의존적인 클로닝을 수행한 후, DNA를 E. coli에 형질전환하였다. 정확한 서열 EE-Fc(knob)-scFv 또는 pEE-Fc(knob)-VHH를 가진 구조체를, pEE-BCD135-VH-299P-HC-hole 및 pEE-BCD135-01 4LG VL hzau CL와 함께 공동-형질전환하여, 소위 비-대칭적인 2중 특이성 항체를 수득하였다 (도 6 참조). 도는 A - 항-CD47 scFv 및 항-PD-L1 Fab 결합 단편에 기반한, B - 항-CD47 VHH 및 항-PD-L1 Fab 결합 단편에 기반한, 비-대칭적인 2중 특이성 항체에 대한 대략적인 모델을 도시한다. 제조된 유전자 구조체는 실시예 2에 따라 CHO-T 세포주에서 단백질을 생산하는데 사용하였다. 정제 후, 항체는 구성상 높은 수준의 동질성을 나타내었으며, 2중 특이성 항체의 생산 수율은 배양 배지의 60 내지 260 mg/ml의 범위였다. 도 7은 항-CD47 scFv 단편에 기반한 정제된 2중 특이성 항체의 예들을 보여준다. 도 8은 항-CD47 VHH 단편에 기반한 정제된 2중 특이성 항체의 예들을 보여준다. 표 3에 표시된 서열 VHH47Opt3를 가진 항체 변이체는 매우 낮은 항체 수율을 나타내었으며, 향후 실험에서 제외시켰다.
표 3. BCD106-02-VHH_C7_49 클론으로부터 유래된 항-CD47 VHH의 야생형/돌연변이 변이체 및 항-PD-L1 BCD135의 가변성 도메인의 아미노산 서열. 회색 표시된 부분은 야생형 이외의 다른 돌연변이를 가진 항-CD47 VHH 위치를 나타낸다.
명칭 항-CD47-VHH 가변성 도메인의 아미노산 서열
야생형 VHH47 AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQPPGNRREWVAQITDEGITNYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGQGTTVTVSS
VHH47Opt1 AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQAPGKGTEWVAQITDEGITNYVDSVKGRFTITRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGQGTTVTVSS
VHH47Opt2 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIFSINAMNWYRQAPGKGTEWVAQITDEGITNYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNAFVITTTSEIYWGQGTTVTVSS
VHH47Opt3 QVQLVESDGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSINAMNWVRQAPGKGLEWVSQITDEGITNYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAFVITTTSEIYWGQGTLVTVSS
항-PD-L1 가변성 도메인의 아미노산 서열
VH(BCD135) EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISWSGSNTNYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARAPLLLAMTFGVGSWGQGTLVTVSS
VL(BCD135) QTVVTQEPSLSVSPGGTVTLTCGLSSGTVTAINYPGWYQQTPGQAPRTLIYNTNTRHSGVPDRFSGSISGNKAALTITGAQAEDEADYYCALYMGNGGHMFGGGTKLTVL
실시예 13. OctetRED96에서 항-PD-L1/항-CD47 PD-L1- 2중 특이성 항체와 인간 PD-L1/CD47 항원 간의 상호작용 분석.
PD-L1-2중 특이성 항체와 인간 PD-L1/CD47 항원 간의 상호작용을 OctetRed 96 (Pall-ForteBio)에서 분석하였다. AR2G 바이오센서를 1시간 동안 mQ에서 예비 수화하였다. 바이오센서를 활성화한 후, 아세테이트 완충제 pH4 중의 25 ㎍/ml 농도의 PD-L1-Fc 또는 CD47-Fc를 바이오센서 상에 비-특이적으로 (NH2 기에 의해) 고정하였다. 그런 후, 센서를 항-PD-L1/항-CD47 항체 용액 (10 ㎍/ml)이 든 웰에 침지하였으며, 이때 항체-항원 복합체가 형성되었다. 이후, 센서를 이후 해리 단계에서 완충액에 침지하였다. 결합 그래프를, 기준 신호를 제한 후, Octet Data Analysis software (Version 8.2)를 표준 공정에 따라 1:1 상호작용 모델을 사용해 분석하였다.
분석 결과는 표 4에 나타낸다. 즉, 항체는 고 친화성이며, 이러한 포맷의 항체에서 PD-L1 항원에 대한 친화성은 nM 수준이고 CD47 항원에 대한 친화성은 subnM 수준이다. 이러한 결합은, 시험관내 및 생체내 치료 활성에 대한 향후 실험에서, 항체가 타겟 세포 상의 수용체와 상호작용하기에 충분한 것으로 간주된다.
표 4. 항-CD47/항-PD-L1 2중 특이성 항체의 카이네틱 해리 상수.
후보 물질의 명칭 반응 (CD47 FcL) kD (M) (CD47 FcL) kon(1/Ms)(CD47 FcL) kdis(1/s)(CD47 FcL) 반응 (PD-L1-Fc 인간) kD (M) (PD-L1-Fc 인간) kon(1/Ms)(PD-L1-Fc 인간) kdis(1/s)(PD-L1-Fc 인간)
BCD106-02-001 0.7313 1,45E-08 9,88E+04 1,43E-03 3.1828 1,35E-09 3,24E+05 4,38E-04
BCD106-02-002 0.412 4,59E-08 1,4100E+05 6,44E-03 3.0283 1,24E-09 3,65E+05 4,52E-04
BCD106-02-003 0.4481 2,90E-08 1,65E+05 4,77E-03 3.1756 1,21E-09 3,71E+05 4,50E-04
BCD106-02-004 0.4398 3,09E-08 1,60E+05 4,93E-03 3.0586 1,30E-09 3,55E+05 4,61E-04
BCD106-02-005 0.413 1,77E-08 1,53E+05 2,70E-03 3.0494 1,31E-09 3,35E+05 4,40E-04
BCD106-02-006 1.2762 5,81E-10 2,73E+05 1,58E-04 2.9262 1,04E-09 3,98E+05 4,14E-04
BCD106-02-013 0.7682 5,88E-10 1,13E+06 6,62E-04 2.6744 .75E-09 2.38E+05 4.16E-04
PD-L1-VHH- VHH47Opt1 0.0882 4.65E-09 6.66E+04 3.10E-04 0.1621 6.90E-10 1.17E+06 8.09E-04
PD-L1-VHH- VHH47Opt2 0.2332 3.65E-09 8.02E+04 2.93E-04 0.175 7.64E-10 1.09E+06 8.36E-04
실시예 14. Forte Bio Octet RED 384에서 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체와 시노몰구스 원숭이 CD47 및 PD-L1 수용체 간의 상호작용 분석.
동물 CD47/PD-L1 항원에 대한 항체 친화성에 대한 실험적인 연구를 Forte Bio Octert RED 384에서 수행하였다. AR2G 센서 (Forte Bio)에 표준 프로토콜 및 제조사의 지침에 따라 항체를 20 ㎍/ml 농도로 고정하였다. 분석은 워킹 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 사용해 30℃에서 수행하였다. 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항원 용액 (동물 CD47, 및 PD-L1)이 든 웰에 300초간 침지하였으며, 이때 복합체가 형성되었다. 그런 후, 완충액 내에서의 복합체의 해리를 600초간 검출하였다.
결합 그래프 (binding)를, 기준 신호 (reference signal)를 제한 후, Octet Data Analysis (Version 9.0) 소프트웨어를 표준 공정에 따라 1:1 글로벌 상호작용 모델을 사용해 분석하였다. 항-CD47 항체는 시노몰구스 원숭이 항원 CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하였다. 표 5 및 표 6.
표 5. 시노몰구스 원숭이 항원 (CD-47)에 대한 항체의 상호작용 카이네틱 값.
명칭 KD (M) KD 오차 kon (1/Ms) kon 오차 kdis (1/s) kdis 오차
BCD106 -02-001 6.32E-09 3.69E-11 1.88E+05 9.64E+02 1.18E-03 3.28E-06
BCD106 -02-006 6.99E-10 3.99E-12 8.64E+05 3.61E+03 6.04E-04 2.34E-06
BCD106 -02-013 3.06E-10 3.56E-11 5.31E+04 1.60E+02 1.63E-05 1.89E-06
표 6. 시노몰구스 원숭이 항원 (PD-L1)에 대한 항체의 상호작용 카이네틱 값.
명칭 KD (M) KD 오차 kon (1/Ms) kon 오차 kdis (1/s) kdis 오차
BCD106 -02-001 8.75E-10 6.01E-12 1.67E+06 1.07E+04 1.46E-03 3.55E-06
BCD106 -02-006 7.27E-10 6.40E-12 1.73E+06 1.34E+04 1.26E-03 5.25E-06
BCD106 -02-013 1.34E-09 1.02E-11 1.65E+06 1.19E+04 2.21E-03 5.66E-06
실시예 15. Forte Bio Octet RED 384에서 항원 패널에 대한 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체의 비-특이적인 결합성 분석.
비-특이적인 결합에 대한 실험 연구를 비-특이적인 his-태깅된 항원 패널에 대해 수행하였다. 워킹 완충제로서 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA가 함유된 PBS에서 10분간 예비-수화한 항-hIgG Fc Capture (AHC) 바이오센서를 측정에 사용하였다.
Anti-hIgG Fc Capture (AHC) 센서 (Forte Bio)에 항체를 30 ㎍/ml 농도로 고정하였다. 분석은 워킹 완충제로서 0.1% Tween 20 및 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 사용해 30℃에서 수행하였다. 이 완충액에서 베이스라인을 정한 후, 센서를 비-특이 항원 용액이 든 웰에 300초간 침지하였으며, 이때 복합체가 형성되었다. 그런 후, 완충액에서의 복합체의 해리를 600초간 검출하였다.
결합 그래프를 (기준 신호를 제한 후) Octet Data Analysis (version 9.0)을 표준 공정에 따라 1:1 글로벌 상호작용 모델을 사용해 분석하였다. 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체는 항원 패널에 비-특이적으로 결합하지 않았다.
실시예 16. Forte Bio Octet RED 384에서 FcγRIIIa에 대한 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체의 상호작용 분석.
Fc-결합 단백질 패널에 대한 항체 친화성 실험 연구를 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA가 함유된 PBS에서 30분간 예비-수화한 스트렙타비딘 (SAX) 바이오센서를 사용해 Forte Bio Octert RED 384에서 수행하였다.
0.1% Tween-20 및 0.1% BSA pH 7.4를 포함하는 FSB 카이네틱 완충제 중의 5 ㎍/ml 농도의 바이오틴화된 Fc-결합성 Avi-태깅된 단백질 FcγRIIIa-F158 및 FcγRIIIa-V158을 스트렙타비딘 (SAX) 센서에 고정하였으며, t RecLoad (0.4 nm 신호 수준을 달성하는데 필요한 시간)를 고정하였다. 베이스라인을 기록한 후, 센서를 항체 용액이 든 웰에 60초간 침지하였으며, 이때 복합체가 형성되었다. 그런 후, 완충액에서 복합체의 해리를 150초간 검출하였다.
결합 그래프를 (기준 신호를 제한 후) Octet Data Analysis (version 9.0)을 표준 공정에 따라 2:1 글로벌 상호작용 모델을 사용해 분석하였다. 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체는 Fc-결합 단백질 FcγRIIIa-F158 및 FcγRIIIa-V158에 특이적으로 결합하였다. 표 7 및 표 8.
표 7. 항체 BCD-106 (02-001, 03-006, 02-013)와 FcγRIIIa-F158의 상호작용에 대한 카이네틱 값.
명칭 KD (M) KD 오차 kdis (1/s) kdis 오차 kon (1/Ms) kon 오차
BCD106 -02-001 1.61E-06 9.86E-07 6.27E-08 1.04E-07 1.73E+05 1.19E+04
BCD106 -02-006 1.47E-06 1.73E-07 6.03E-08 8.40E-08 1.35E+05 1.67E+04
BCD106 -02-013 1.30E-06 2.00E-06 3.79E-08 1.88E-07 2.22E+05 1.55E+04
표 8: 항체 BCD-106 (02-001, 03-006, 02-013)와 FcγRIIIa-V158의 상호작용에 대한 카이네틱 값.
명칭 KD (M) KD 오차 kdis (1/s) kdis 오차 kon (1/Ms) kon 오차
BCD106 -02-001 9.32E-07 1.62E-07 2.86E-08 1.86E-08 2.33E+05 5.72E+04
BCD106 -02-006 4.63E-06 <1.0E-12 1.07E-06 5.25E-07 4.75E+04 8.58E+03
BCD106 -02-013 3.73E-07 1.45E-07 1.83E-09 1.07E-08 6.10E+05 5.77E+04
실시예 17. Forte Bio Octet RED 384에서 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체와 FcRn의 상호작용 분석.
Fc-결합 단백질 패널에 대한 항체 친화성 실험 연구를 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA가 함유된 PBS에서 30분간 예비-수화한 스트렙타비딘 (SAX) 바이오센서를 사용해 Forte Bio Octert RED 384에서 수행하였다.
0.1% Tween-20 pH 6이 함유된 PBS 카이네틱 완충제 중의 5 ㎍/ml 농도의 바이오틴화된 Avi-태깅된 FcRn을 스트렙타비딘 (SAX) 센서에 고정하였으며, t RecLoad (0.4 nm 신호 수준을 달성하는데 필요한 시간)를 고정하였다. 완충액에서 베이스라인을 기록한 후, 센서를 0.1% Tween-20 pH 6이 함유된 PBS 카이네틱 완충제 중의 항체 용액이 든 웰에 60초간 침지하였으며, 이때 복합체가 형성되었다. 그런 후, 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA pH 7.4가 함유된 PBS 카이네틱 완충액에서의 복합체의 해리를 150초간 검출하였다.
결합 그래프를 (기준 신호를 제한 후) Octet Data Analysis (version 9.0)을 표준 공정에 따라 2:1 글로벌 상호작용 모델을 사용해 분석하였다. 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체는 FcRn에 특이적으로 결합하였다. 표 9.
표 9. 항체 BCD-106 (02-001, 03-006, 02-013)과 FcRn의 상호작용에 대한 카이네틱 값.
명칭 KD (M) KD 오차 kdis (1/s) kdis 오차 kon (1/Ms) kon 오차
BCD106 -02-001 1.61E-06 9.86E-07 6.27E-08 1.04E-07 1.73E+05 1.19E+04
BCD106 -02-006 1.47E-06 1.73E-07 6.03E-08 8.40E-08 1.35E+05 1.67E+04
BCD106 -02-013 1.30E-06 2.00E-06 3.79E-08 1.88E-07 2.22E+05 1.55E+04
실시예 18. 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체 PD-L1이 PD-L1/CD47 양성 세포에 대해 항체-의존적인 세포성 세포독성을 유발하는 능력 분석.
ADCC (항체-의존적인 세포성 세포독성)를 수행하기 위해, 표면에 PD-L1/CD47 수용체를 발현하는 MDA-MB-231 세포주와 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 사용하였다.
말초혈 단핵 세포 수득
건강한 공여체로부터 수득한 정맥혈 세포를 밀도 구배에 의해 분리하여 PBMC를 수득하였다. 세포를 단리한 후, 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지에서 2-5x106 세포/ml의 농도로 37℃ 및 5% CO2에서 18-24시간 배양하였다.
타겟 세포 준비
MDA-MB-231 세포를 10% FBS (소 태아 혈청)가 함유된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 플라스틱 표면으로부터 트립신을 사용해 세포를 회수하여, 10% FBS가 첨가된 DMEM에 재현탁하였다. 칼세인 AM을 5 μM 농도로 첨가하였다. 30분 후, 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 과량의 Calcein AM으로부터 세포를 2회 세척하였다. 105 세포/ml 농도의 타겟 세포 현탁액을 10% FBS가 첨가된 DMEM 중에 준비하였다.
검사 항체의 희석물 제조
모든 검사 항체에 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 첨가하여 10 ㎍/ml 농도로 희석하였다. 5배수의 연속 희석물을 준비하였다. 검사 항체의 농도는 (ng/ml)이다: 10000; 2000; 400; 80; 16; 3,2; 0,64; 0,128; 0,0256; 0.
PBMC 준비
단핵 림프구를 바이얼로부터 취하여, 200xg에서 5분간 원심분리하였다. 5x106 세포/ml 농도의 세포 현탁액을 10% FBS 함유 DMEM 배지 중에 준비하였다.
ADCC 분석 수행
검사 항체를 96웰 플레이트의 웰에 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 항체가 든 웰에 타겟 세포 현탁물을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 15-20분간 인큐베이션하였다. 항체 및 타겟 세포가 든 웰에 PBMC 현탁액을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 50 ㎕/웰, 타겟 세포 현탁액 100 ㎕ 및 PBMC 현탁액 50 ㎕를 웰 3개 (최대 세포용해 대조군, "KL")에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 3.5-4시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 종료 30분 전에, 세포용해 완충제를 KL 세포에 첨가하였다.
인큐베이션 후, 플레이트를 10분간 200xg에서 원심분리하였다. 상층액을 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트 형광계를 사용해 여기/방출 파장 485/538 nm에서 상대적인 형광 단위로 형광성을 측정하였다.
ADCC 효율은 하기 식으로 계산하였다:
Figure pct00001
식에서,
K - 작동자 세포의 존재 하 타겟 세포의 자발적인 세포용해 대조군 (10% FBS가 함유된 DMEM 배지 50 ㎕/웰 + 타겟 세포 100 ㎕/웰 + PBMC 50 ㎕/웰)
KL - 타겟 세포의 최대 세포용해 대조군 (10% FBS가 함유된 DMEM 배지 50 ㎕/웰 + 타겟 세포 100 ㎕/웰 + PBMC 50 ㎕/웰 + 세포용해 완충제).
그 결과는 도 9 및 10에 나타낸다.
수득한 데이터에 따르면, 항-CD47/PD-L1 항체들 모두 대조군 단일 특이성 항-CD47 항체 (클론 B6H12)와 비슷하거나 또는 높은 EC50 값을 나타내었다.
실시예 19. 인간 대식세포에 의한 식세포작용 자극 검사에서 CD47/PD-L1에 대한 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체의 활성 비교
ADCP (항체-의존적인 세포성 식세포작용)를 수행하기 위해, 표면에 PD-L1/CD47 수용체를 가진 MDA-MB-231 세포주와 인간 대식세포를 사용하였다.
인간 대식세포 확보
건강한 공여체로부터 수득한 정맥혈 세포를 밀도 구배에 의해 분리하여 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 단리하였다. 인간 CD14-양성 인간 세포 분획을 분리하기 위한 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용해 인간 혈액 단핵구를 단리하였다. 24웰 플레이트의 웰을 사용해, 10% FBS 및 100 ng/ml GM-CSF (Peprotech)가 함유된 RPMI-1640 700 ㎕ 중에 350,000 단핵구/웰로 3일간 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 4일차에, 각 웰 당 10% FBS, 100 ng/ml GM-CSF (Peprotech), 50 ng/ml IFNγ (Peprotech) 및 10 ng/ml LPS (Sigma)가 함유된 RPMI-1640 700 ㎕로 배지를 교체하고, 세포를 다시 3일간 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
타겟 세포 준비
MDA-MB-231 세포를 10% FBS (소 태아 혈청)가 함유된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건하에 배양하였다. 플라스틱 표면으로부터 트립신을 사용해 세포를 회수하여, 10% FBS가 첨가된 DMEM에 재현탁하였다. 칼세인 AM을 5 μM 농도로 첨가하였다. 30분 후, 10% FBS가 첨가된 DMEM으로 과량의 Calcein AM으로부터 세포를 2회 세척하였다. 105 세포/ml 농도의 타겟 세포 현탁액을 10% FBS가 첨가된 DMEM 중에 준비하였다.
ADCP 분석 수행
대식세포가 든 플레이트 웰로부터 배지를 취하고, 10% FBS 및 20 ㎍/ml 검사 항체가 함유된 RPMI-1640 배지 500 ㎕을 웰에 첨가하였다. 타겟 세포 현탁물을 웰에 500 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 3시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그런 후, 배지를 선택하고, TrypLE Express 시약을 사용해 플라스틱 표면으로부터 세포를 회수하고, 형광-표지된 항-CD14 항체로 염색하였다. 염색된 세포 현탁액을 유세포 측정기에서 분석하였다.
ADCP 효율을 하기 식으로 계산한다:
Figure pct00002
상기 식에서,
칼세인+CD14+는 칼세인 염료를 함유한 CD14-양성 세포의 개수이다.
CD14+는 CD14-양성 세포의 개수이다.
그 결과는 도 11에 나타낸다.
수득한 데이터에 따르면, 다수의 항-CD47/PD-L1 항체들이 인간 대식세포에 의한 MDA-MB-231 세포주의 식세포작용을 자극하는데 효과적이며, 이는 대조군 단일 특이성 항-CD47 항체 (클론 B6H12)와 비슷한 수준이었다.
실시예 20. 인간 적혈구 응집반응 ( hemagglutination )에 대한 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체 후보 물질의 효과 비교
인간 적혈구를 사용해 적혈구 응집반응을 유발하는 항체 능력을 분석하였다.
적혈구 현탁액 준비
혈액 샘플을 건강한 공여자의 정맥으로부터 취하여 진공 헤파린 시험관에 넣었다. 혈액 9 ml을 50 ml 원심분리관에 넣었다. 혈액을 Ca2+ 및 Mg2+가 첨가되지 않은 DPBS 30 ml로 실온에서 희석하였다. 상층액을 10분간 800g에서 원심분리하고, 상층액은 버렸다. 세포 세척 공정을 Ca2+ 및 Mg2+ 무첨가된 DPBS를 사용해 2회 반복한 다음 원심분리하였다. 세포 펠렛 300 ㎕를 DPBS 30 ml에 재현탁하여, 1% 적혈구 현탁액을 제조하였다.
적혈구 응집반응 분석 수행
검사 항체를 DPBS에 20 ㎍/ml 농도로 희석하였다. 항체 희석액 100 ㎕과 적혈구 현탁물을 바닥이 평평한 96웰 플레이트에서 혼합하였다. 플레이트를 16시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 결과는 임의의 4 + 척도 (cross scale)를 사용해 가시적으로 나타내었다. 유의한 양성 결과는 2+ 이상이다. 그 결과는 표 10에 나타낸다.
표 10. 항-CD47/PD-L1 항체의 존재하에 적혈구 응집반응. "-"는 응집반응이 없다는 것을 의미한다.
Figure pct00003
수득된 데이터에 따르면, 항-CD47/PD-L1 항체는 적혈구 응집반응을 유발하지 않았지만, 참조물질 항-CD47 단일클론 항체 (클론 B6H12)는 항체의 2가 특성, 즉 여러가지 적혈구 상에 위치한 2종의 CD47 분자와 상호작용하는 능력으로 인해 유의한 적혈구 응집반응을 유발하였다.
실시예 21. 2중 특이성 항-CD47/PD-L1 항체의 보체 -의존적인 세포독성 ( CDC ) 분석.
CDC (보체-의존적인 세포독성) 분석을 수행하기 위해, 표면에 PD-L1 및 CD47 수용체를 가진 MDA-MB-231 세포주를 타겟 세포로 이용하였다.
타겟 세포 준비
MDA-MB-231 배양물을 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 DMEM 배양 배지에서 배양하였다.
트립신을 처리하여 플라스틱 표면으로부터 세포를 회수하여, 0.1% BSA가 포함된 DMEM 배지에 1x106 세포/ml 농도로 현탁하였다.
검사 항체 희석액 제조
모든 검사 항-CD47/PD-L1 항체에 0.1% BSA가 첨가된 DMEM 배지를 첨가하여 100 ㎍/ml 농도로 희석하였다. 8배수의 연속 희석물을 준비하였다. 검사 항체의 농도는 (ng/ml)이다: 100000; 12500; 1562,5; 195,3; 24,4; 3,05; 0,38; 0,04; 0,005.
CDC 검사 수행
인간 보체를 해동하고, 0.1% BSA가 첨가된 DMEM 배지에 1:4의 비율로 희석하였다.
검사 항체의 각 희석액을 96웰 플레이트의 웰에 50 ㎕/웰로 첨가하였으며, 각 항체 시료에 대해 0.1% BSA가 첨가된 배지 (세포 대조군)는 50 ㎕/웰로, 0.1% BSA가 첨가된 DMEM 배지 (배지 대조군)는 150 ㎕/웰로 첨가하였다.
검사 항체 및 세포 대조군이 든 각각의 웰에 MDA-MB-231 세포 현탁액을 50 ㎕/웰로 첨가하였다.
검사 항체 및 세포 대조군이 든 모든 웰에 보체 희석액을 50 ㎕/웰로 넣었다. 플레이트를 오르비탈 셰이커에 장착하여 실온에서 2-4분간 교반한 다음 CO2 인큐베이터에 넣어 2-3시간 동안 37℃에 두었다.
알라마르 블루 시약 15 ㎕를 검사 플레이트 웰에 첨가하였다. 플레이트를 오르비탈 셰이커에 장착하여 실온에서 10-20분간 교반하였다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 넣어 18-24시간 동안 추가적으로 인큐베이션하였다.
플레이트를 오르비탈 셰이커에 장착하여 실온에서 10-20분간 교반하였다.
플레이트 형광계를 사용해 여기/방출 파장 544/590 nm에서 상대적인 형광 단위로 형광성을 측정하였다. 수득한 형광 신호는 생존 세포 수에 비례한다. 결과를 도 12-15에 나타낸다.
수득한 결과에 따르면, 검사 항체는 MDA-MB-231 세포주의 보체-의존적인 세포독성 (CDC)을 유발하지 않는다.
실시예 22. PD-L1 멤브레인 수용체를 가진 세포 배양물에 대한 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체의 길항 활성 분석.
PD-L1 수용체에 대한 항-PD-L1/CD47 항체의 길항 활성을 분석하기 위해, PD-L1-생산 세포와의 공동-배양시 Jurkat-PD1-NFAT-Luc 리포터 세포에서 루시퍼라제 신호를 활성화하는 항체의 능력을 평가하였다.
PD-L1 생산 세포 제조
MDA-MB-231 배양물을 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 DMEM 배양 배지에서 배양하였다.
트립신을 처리하여 플라스틱 표면으로부터 세포를 회수하여 10% FBS 및 20 ng/ml 인터페론 gamma가 첨가된 DMEM 배지에 1*105 세포/ml의 농도로 현탁하였다. 그런 후, 세포 현탁물을 백색 96웰 플레이트의 웰에 200 ㎕/웰로 첨가한 다음 CO2 인큐베이터에 넣어 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건에서 인큐베이션하였다.
검사 항체의 희석액 제조
모든 검사 항-CD47/PD-L1 항체에 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지를 첨가하여 5 ㎍/ml 농도로 희석하였다. 3배수의 연속 희석물을 준비하였다. 검사 항체의 농도는 (ng/ml)이다: 2500; 833,3; 277,7; 92,5; 30,8; 10,2; 3,4; 1,1.
ㆍ Jurkat -PD1- NFAT -Luc 세포 준비
ㆍ 실험 당일에, 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에 Jurkat-PD1-NFAT-Luc 세포를 2.5*106 세포/ml 농도로 현탁하여 현탁물을 준비하였다.
ㆍ 활성화 항체 용액 준비
ㆍ 실험 당일에, 10x 활성화 항체 혼합물을 준비하였다 (10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지 중의, 4 ㎍/ml 항-CD3; 4 ㎍/ml -CD28; 16 ㎍/ml 항-마우스).
ㆍ 검사 수행
ㆍ MDA-MB-231 세포가 수용된 플레이트로부터 배양 배지를 제거하였다. 항체 희석액을 세포가 수용된 웰에 40 ㎕/웰로 첨가하였다. 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 대조군 웰 (검사 항체 무첨가 셀, 검사 및 활성화 항체 무첨가 셀)에 40 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다.
ㆍ 그런 후, Jurkat-PD1-NFAT-Luc 세포 현탁액을 모든 웰에 40 ㎕/웰로 첨가하였다. 그 후, 10x 활성화 항체 용액을 모든 웰에 10 ㎕/웰로 첨가하였으며, 단 "검사 및 활성화 항체 무첨가 웰"인 대조군 웰에는 첨가하지 않았다. 웰은 CO2 인큐베이터에 넣어 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건에서 인큐베이션하였다.
ㆍ 루시퍼라제 기질 One-Glo 루시퍼라제 분석 시스템 "Promega"를 모든 웰에 1:1 (90 ㎕/웰) 비율로 첨가하였다. 5-10분 후, 발광 수준을 플레이트 리더를 사용해 측정하였다.
ㆍ 수득한 데이터에 따르면, 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 검사 항체뿐 아니라 대조군 항-PD-L1 단일 특이성 항체는 PD-L1-의존적인 신호전달 경로의 길항제이며, 따라서 PD-L1 수용체가 탑재된 세포에 대해 T-세포 의존적인 세포독성을 자극할 수 있다.
실시예 25. 항-PD-L1/항-CD47 2중 특이성 항체 산물의 동질성 (homogeneity) 분석.
2중 특이성 항체의 동질성을 크기-배제 HPLC (SEC HPLC) 및 검출기를 사용해 분석하였다. HPLC 시스템 (Agilent)에서 컬럼 Tosoh TSK-Gel G3000SWXL (7.8 mm x 30 cm, order no. 08541)과 프리컬럼 Tosoh TSKgel Guard SWXL (6.0 mm x 4.0 cm, 입자 직경 7 ㎛, order no. 08543)을 사용해 크로마토그래피를 수행하였다. 220 및 280 nm 파장에서 검출하였다. 도 17은 VHH47Opt2에 기반한 산물 BCD106-02-013의 예시적인 HPLC 프로파일을 나타낸다 (실시예 12 참조). 검사 결과에 따르면, 분자 BCD106-02-013이 모노머 응집 조성물에서 93% 동질적인 산물을 형성하였으며, 이후 시험관내 및 생체내 검사에 적용가능한 것으로 결론내릴 수 있었다.
<110> JOINT STOCK COMPANY "BIOCAD" <120> ANTIBODIES SPECIFIC TO CD47 AND PD-L1 <140> EA201791961 <141> 2017-10-03 <160> 108 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid Sequence <400> 1 Arg Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid Sequence <400> 2 Ile Asn Ala Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 3 Lys Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 4 Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 5 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 6 Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr Thr Tyr 1 5 10 15 Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly 20 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 7 Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr Thr 1 5 10 15 Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 8 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Ser Glu Lys 1 5 10 15 Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 20 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 9 Ser Ile Glu Asp Ser Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 10 Gln Ile Thr Asp Glu Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 11 Ser Ile Glu Asp Ser Ser Thr Glu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 12 Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Thr Glu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 13 Ser Ile Asn Asp Gly Gly Gly Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 14 Gly Ile Arg Thr Ser Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 15 Gln Ile Thr Asp Glu Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 16 Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 17 Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 18 Val Ile Thr Thr Thr Ser Glu Ile Tyr 1 5 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 19 Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr His Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 20 Asn Ala Phe Val Ile Thr Thr Thr Ser Glu Ile Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 21 Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 22 Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 23 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 24 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 25 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 26 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 27 Arg Ala Ser Gln His Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser His Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 29 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 30 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 31 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 32 Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 33 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 34 Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 35 Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr Pro Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 36 Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 37 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 38 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Arg 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25 30 Ala Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Thr Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Asp Glu Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Phe Val Ile Thr Thr Thr Ser Glu Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 84 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Asp Ser Ser Thr Glu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 85 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Thr Glu Thr Thr Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 86 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 86 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Asp Gly Gly Gly Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Val Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr His Tyr Glu Cys Gln His 100 105 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 87 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Arg Thr Ser Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 88 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 88 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Thr Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Thr Asp Glu Gly Ile Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Phe Val Ile Thr Thr Thr Ser Glu Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 89 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ala Ser Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 90 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 90 Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 91 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 91 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 92 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 92 Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser His Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Gly Gly Asn Gln 100 105 <210> 93 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 93 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ile Tyr His Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 94 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 94 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Thr Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 95 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 95 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser His Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Trp Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 96 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 96 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 97 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 97 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Thr Ser Pro 85 90 95 Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 98 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 98 Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ser Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu Ser Ile Pro Gln 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 99 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 99 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Ala Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Glu Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Tyr Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 100 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 100 Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Val 1 5 10 15 Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr Ser Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 50 55 60 Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu 65 70 75 80 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 <210> 101 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 101 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr 20 25 30 Ser Trp Phe Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Asn Ala Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Val Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln 100 105 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 102 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr 20 25 30 Ser Trp Phe Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Asn Ala Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Val Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln 100 105 <210> 103 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 103 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr 20 25 30 Ser Trp Phe Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Asn Ala Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Val Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln 100 105 <210> 104 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 104 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Phe Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Glu Ile Ser Gly 85 90 95 Tyr Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln 100 105 110 <210> 105 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 105 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asp Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 106 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 107 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 107 Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn 1 5 10 15 Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn 20 25 30 Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr 35 40 45 Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu 65 70 75 80 Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys 85 90 95 Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys 100 105 110 Tyr Arg Val Val 115 <210> 108 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 108 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg 210 215 220

Claims (30)

  1. CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하며,
    하나의 CD47 결합부 및 하나 이상의 PD-L1 결합부를 포함하는,
    단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 전장 항체 (full-length antibody) 또는 이의 항원 결합 단편인, 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 PD-L1 결합부를 1 또는 2개 포함하는, 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가 CD47 수용체와 SIRPα 리간드 간의 상호작용을 저해하거나, 및/또는 상기 PD-L1 결합부가 PD-L1과 PD-L1 수용체 간의 상호작용을 저해하는, 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하고,
    상기 CDR1이 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상 상동적인 서열이고, 상기 CDR2가 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상 상동적인 서열이고, 상기 CDR3가 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상 상동적인 서열인, 항체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함하고,
    상기 CDR1이 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, 상기 CDR2가 서열번호 6-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, 상기 CDR3가 서열번호 17-20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인, 항체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가 제4항에 따른 중쇄 가변성 도메인과 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하고,
    상기 CDR1이 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상 상동적인 서열이고, 상기 CDR2가 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상 상동적인 서열이고, 상기 CDR3가 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상 상동적인 서열인, 항체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가 제4항에 따른 중쇄 가변성 도메인과 CDR1, CDR2, CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하고,
    상기 CDR1이 서열번호 22-34로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, 상기 CDR2가 서열번호 36-48로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이고, 상기 CDR3가 서열번호 50-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인, 항체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가, 서열번호 66-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 89-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 상동적인 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 항체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가, 서열번호 66-88로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 89-106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 항체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 PD-L1 결합부가 서열번호 5, 서열번호 16 및 서열번호 21과 같이 80% 이상 상동적인 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 35, 서열번호 49 및 서열번호 65와 같이 80% 이상 상동적인 서열들을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 항체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 PD-L1 결합부가 서열번호 5, 서열번호 16 및 서열번호 21의 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, 서열번호 35, 서열번호 49 및 서열번호 65의 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 항체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 CD47 결합부가 Fab, scFv, scFab, 또는 단리된 VH 또는 VHH 모노-도메인인, 항체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 PD-L1 결합부가 Fab, scFv, scFab, 또는 단리된 VH 또는 VHH 모노-도메인인, 항체.
  15. 제1항에 있어서,
    표면 상에 CD47 및/또는 PD-L1 항원을 가진 소정의 비율의 세포에 항체-의존적인 세포성 세포독성, 대식세포-매개 식세포작용 및/또는 T 세포-매개 세포독성을 유발하는, 항체.
  16. 제1항에 있어서,
    돌연변이 또는 변형이 없는 동일 항체와 비교해, 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존적인 세포독성 (CDC)을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함하는 Fc 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 치료용 약제로서 사용하기 위한 것인, 항체.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA인, 핵산.
  20. 제18항 또는 제19항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  21. 세포를 제20항에 따른 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하기 위한 숙주 세포를 수득하는 방법.
  22. 제18항 또는 제19항에 따른 핵산을 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 수득하기 위한 숙주 세포.
  23. 제22항에 따른 숙주 세포를, 지정된 항체를 수득하기에 충분한 조건에서 배양 배지에서 배양하고, 필요에 따라 수득되는 항체를 분리 및 정제하는 것으로 이루어지는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 수득하는 방법.
  24. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 하나 또는 수종의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중-음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 육종, 간세포암, 호지킨 림프종, T- 및 B-세포성 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 불응성 비-호지킨 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 췌장암 및 고-위험성 골수이형성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
  26. 치료가 필요한 개체에 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중-음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T- 및 B-세포성 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 불응성 비-호지킨 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험성 골수이형성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  28. 개체에게 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, PD-L1 및/또는 CD47의 생물학적 활성의 저해가 필요한 개체에서 PD-L1 및/또는 CD47의 생물학적 활성을 저해하는 방법.
  29. PD-L1 및 CD47에 의해 매개되는 질환 또는 장애에 대해 치료가 필요한 개체에서 이를 치료하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제24항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애가 (HNSCC) 두경부 편평 세포암, 자궁경부암, 불명의 원발성 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중-음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정성을 동반한 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T- 및 B-세포성 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 불응성 비-호지킨 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험성 골수이형성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
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