KR20200059249A - 신경아세포종의 치료를 위한 항-gd2 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-강글리오시드 GD2 항체 및 상기 항체를 사용한 GD2 양성 종양, 바람직하게는 신경아세포종을 가진 대상체의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 항체 가변 도메인 및 항체 불변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은 적어도 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역의 CDR3 및 적어도 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역의 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 IgA 힌지 및 C_H2 도메인을 포함한다.

Description

신경아세포종의 치료를 위한 항-GD2 항체

본 발명은 항체 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 강글리오시드 GD2에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 의료 및 검출 방법에서의 GD2 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 항체의 생성을 위한 세포, 핵산 분자 및 방법에 관한 것이다.

모든 소아과 암 환자의 대략 12%가 소아의 가장 흔한 두개외 고형 종양인 신경아세포종에 굴복한다. 대부분의 환자는 사망률이 50%인 고위험 신경아세포종으로 진단된다. 신경아세포종 요법은 심각한 독성을 갖는 집중적인 다학제적 치료(intensive multimodality treatment)로 이루어진다. 고위험 신경아세포종 요법은 심각한 단기간 및 장기간 독성을 갖는 집약적인 다학제적 치료로 이루어진다. 제한된 추가의 치료 선택지에 대해 재발률이 높다. 잔존 질병은 집약적 화학요법, 방사선 요법, 고용량 화학요법으로 치료된 후, 이어서 자가 조혈 줄기 세포 구조(rescue) 및 아이소트레티노인으로 치료된다. 종양의 완전한 근절은 종종 달성되지 않는다(문헌[Matthay et al., 1999; New Engl. J. of Med Vol 341: pp 1165-73]). 통상적인 요법의 강화는 성과를 개선하지 못하였으며, 심지어 증가된 독성과 관련된다.

2015년에, 신경아세포종 및 신경 조직 상에 균일하게 발현되는 탄수화물 항원인 강글리오시드 GD2에 대해 유도된 항체 디누툭시맙(상표명 Unituxin)은 신경아세포종 치료를 위해 FDA-승인되었다. 사이토카인 및 분화 인자와 병용된 이러한 항체의 적용은 환자 예후를 개선하였으며, 신경아세포종이 면역요법에 취약하다는 것을 입증하였다(문헌[Yu et al., 2010; New Engl. J. Med, Vol 363: pp 1324-34]; 및 문헌[Suzuki and Cheung., 2015; Expert Opin Ther Targets Vol 19: p. 349-62]). 디누툭시맙은 표준 치료에 비해 무사건 생존을 상당히 개선하였다.

디누툭시맙은 뮤린 항-GD2 항체 14.18의 가변 중쇄 및 경쇄 영역과 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역으로 구성된 키메라 단일클론 항체이다(문헌[Gillies et al., 1989; J Immunol Methods, 125: p. 191-202]). 디누툭시맙은 중추 신경계 및 말초 신경의 조직 상에 뿐만 아니라, 신경아세포종을 포함한 신경외배엽 기원의 많은 종양 상에 세포외 발현되는 다이시알로강글리오시드인 GD2의 말단-종결 펜타-올리고당에 대해 유도된다(문헌[Suzuki and Cheung, 2015; Expert Opin Ther Targets Vol 19: p. 349-62]). SP2/0 마우스 골수종 세포에서 생성되는 항체는 천연 인간 항체에 대하여 비정상 글리코실화를 야기할 수 있다. 유럽에서, 이 항체는 이제 CHO 세포에서 생성된다. 다른 조직 상에서의 낮은 발현과 함께 신경아세포종 상에서의 GD2의 균일한 발현은 이러한 종양 관련 항원이 항체 요법을 위한 유망한 표적이 되게 한다. 디누툭시맙은 유도 요법 후 반응이 나타난 환자에서 고위험 신경아세포종에 대한 1차 치료를 위하여 아이소트레티노인과 병용하여 그리고 IL-2 및 GM-CSF의 교대 투여로 사용된다(문헌[Suzuki and Cheung, 2015; Expert Opin Ther Targets Vol 19: p. 349-62]).

전임상 연구는 디누툭시맙이 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 매개 세포독성(CDC)을 통해 그의 항-종양 효과를 매개한다는 것을 보여주었다(문헌[Barker et al., 1991; Cancer Res, Vol 51: p. 144-9]). ADCC 활성의 경우, 대부분의 치료적 항체는 그들의 작용을 위하여 NK 세포, 그리고 가능하게는 대식세포에 의존한다. 주목할 만한 점은, 신경아세포종에 대한 디누툭시맙의 ADCC 활성은 어떠한 이유로 과립구 활성화에도 또한 의존적이라는 것이다. 이는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서, 환자 결과가 과립구 활성화에 부분적으로 의존한다는 것을 보여줌으로써 밝혀져 있다(문헌[Barker et al., 1991; Cancer Res, Vol 51: p. 144-9]; 문헌[Cheung et al., 2012; J Clin Oncol, Vol 30: p. 426-32]; 및 문헌[Batova et al., 1999; Clin Cancer Res Vol 5: p. 4259-63]). 이들 관찰은 신경아세포종에 대한 항-종양 반응을 향상시키기 위해 과립구를 추가로 자극하기 위해 현재의 치료 계획에 GM-CSF 또는 G-CSF를 포함시키는 것에 대한 기초를 형성해 왔다(문헌[Cheung et al., 2012; J Clin Oncol, Vol 30: p. 426-32]; 및 문헌[Batova et al., 1999; Clin Cancer Res Vol 5: p. 4259-63]).

디누툭시맙의 우수한 임상 효과에도 불구하고, 이것은 다수의 독성과 관련되어 있다. 가장 일반적인 독성은 빈맥, 고혈압, 저혈압, 통증 치료의 어려움, 열 및 두드러기를 포함한다. 이들 독성 중 다수는 용량-의존적이며, 낮은 투여량에서는 거의 언급되어 있지 않다. 다른 독성은 저나트륨혈증, 저칼륨혈증, 구역, 구토 및 설사를 포함한다(문헌[Mora J, 2016, Expert review of clinical pharmacology, pp1-7]; http:/ /dx.doi.org/ 10.1586/17512433.2016.1160775).

본 발명의 항-GD2 항체 및 치료 방법은 개선된 효능을 나타낸다. 게다가, 디누툭시맙 치료와 관련된 독성이 감소되는데, 특히 전임상 모델에 나타난 바와 같이 통증 관련 독성이 제거된다.

본 발명은 항-강글리오시드 GD2 항체를 제공하며, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 항체 가변 도메인 및 항체 불변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은 적어도 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역의 CDR3 및 적어도 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역의 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고; 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 IgA 힌지 및 C_H2 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 바람직하게는 적어도 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 적어도 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 가변 도메인은 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명은 GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체의 치료량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 바람직하게는 상기 대상체에서 상기 GD2 양성 종양, 바람직하게는 신경아세포종 내의 강글리오시드 GD2를 상향조절하는 데 유효한 양으로 레틴산을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 이들의 조합을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. GM-CSF, G-CSF 또는 이들의 조합은 대상체 내의 과립구의 수를 증가시킬 수 있지만, 유도된 세포 사멸을 개선하기 위해 또한 투여된다.

본 발명은 GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 추가로 제공한다. 본 발명은 GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 레틴산과 병용되는 본 발명의 항체를 추가로 제공한다. 본 발명은 GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한, GM-CSF, G-CSF 또는 이들의 조합과 병용되는 본 발명의 항체를 추가로 제공한다. 본 발명은 GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한, GM-CSF, G-CSF 또는 이들의 조합 및 레틴산과 병용되는 본 발명의 항체를 추가로 제공한다.

GD2 양성 종양은 바람직하게는 GD2 양성 신경아세포종, 예컨대 신경외배엽-유래 종양 또는 육종이다. 바람직한 실시 형태에서, GD2 양성 종양은 GD2 양성 신경아세포종, 망막아세포종, 흑색종, 소세포 폐암, 뇌 종양, 예컨대 교아세포종, 골육종, 횡문근육종, 소아 및 청소년에서의 유잉 육종, 또는 지질육종, 섬유육종, 평활근육종 또는 성인에서의 다른 연조직 육종이다. 바람직한 실시 형태에서, GD2 양성 종양은 신경아세포종이다. 본 발명의 방법 또는 사용으로 치료되는 신경아세포종은 바람직하게는 고위험 신경아세포종이다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역:

EVQLLQSGPE LEKPGASVMI SCKASGSSFT GYNMNWVRQN IGKSLEWIGA IDPYYGGTSY NQKFKGRATL TVDKSSSTAY MHLKSLTSED SAVYYCVSGM EYWGQGTSVT VSS;

및 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역:

EIVMTQSPAT LSVSPGERAT LSCRSSQSLV HRNGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIHKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP PLTFGAGTKL ELK; 및

IgA 힌지 및 C_H2 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다.

환자 순응도의 개선 및/또는 면역글로불린 G(IgG) 항체 요법과 관련된 부작용의 감소에 사용하기 위한 조작된 항체 또는 이의 단편이 본 명세서에 제공되며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은 (a) 면역글로불린 G(IgG)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및 (b) 면역글로불린 A(IgA)의 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은 비견되는 양의 상응하는 IgG 항체의 투여와 대비하여 상기 대상체에 투여 시에 적어도 하나의 부작용의 감소를 가져온다.

일 태양에서, 조작된 항체 또는 이의 단편은 IgG의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 일 태양에서, IgA의 불변 영역 또는 이의 일부분은 힌지, C_H2 불변 영역, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 태양에서, 불변 영역 또는 이의 일부분은 IgA의 힌지 및 C_H2 불변 영역을 포함한다. 일 태양에서, 불변 영역은 IgA의 불변 중쇄 및 불변 경쇄를 포함한다. 일 태양에서, IgA의 불변 영역 또는 이의 일부분은 힌지 및 불변 중쇄 도메인을 포함한다. 일 태양에서, 항체 또는 이의 단편은 키메라화된 것이거나, 인간화된 것이거나, 인간의 것이거나, 또는 비인간의 것이다. 일 태양에서, 불변 영역 또는 이의 일부분은 인간의 것이다.

일 태양에서, 부작용은 선천성 면역 반응을 포함한다. 일부 경우에, 선천성 면역 반응은 보체 반응을 포함한다. 일부 경우에, 보체 반응은 FcγR 또는 C1q에 대한 IgG 결합을 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 부작용은 통증, 내장 과민증, 이질통, 통각과민, 알레르기 반응 및 독감-유사 증상(flu-like symptom) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 통증은 급성 통증, 편두통 또는 강한 내장성 통증이다.

일부 경우에, 부작용의 감소를 결정하는 것은 유세포측정, 시험관내 검정(in vitro assay), 또는 이들의 조합을 수행함으로써 측정된다. 일부 경우에, 유세포측정은 세포 용해, 결합, 세포 사멸, 수용체 발현, 또는 이들의 조합을 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 유세포측정은 세포의 생/사 염색을 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 시험관내 검정은 ELISA, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포독성(CDC), 용혈 검정, 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 경우에, 조작된 항체 또는 이의 단편은, 투여될 때, 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 상응하는 IgG 항체와 대비하여 증가된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 감소된 보체-의존성 세포독성(CDC)을 가져온다. 일 태양에서, 감소는, 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 비견되는 IgG 항체를 투여하는 것과 대비하여, 부작용의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 내지 100%를 포함한다.

일부 경우에, 항체 또는 이의 단편은 비암성 세포 상에, 암 세포 상에, 또는 이들의 조합으로 존재하는 표적에 결합한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 단편은 뇌-전이성 암 유래 표적에 결합한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 단편은 GD2, ALK, hNET, GD3, 및 CD20 중 하나 이상에 결합한다. 일부 경우에, GD2 양성 종양은 신경아세포종, 망막아세포종, 흑색종, 소세포 폐암, 교아세포종, 골육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 지질육종, 섬유육종, 평활근육종, 및 이들의 임의의 조합이다. 일 태양에서, 항체 또는 이의 단편은 신경아세포종 세포에 결합한다. 일부 경우에, ALK(역형성 림프종 키나아제) 양성 종양은 역형성 대세포 림프종, 폐의 선암종, 신경아세포종, 염증성 근섬유아세포 종양, 신장 세포 암종, 식도 편평 세포 암종, 유방암, 결장 선암종, 다형성 교아세포종 또는 역형성 갑상선암이다. 일부 경우에, hNET(인간 노르에피네프린 수송체) 양성 종양은 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 암종, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신경아세포종, 난소 종양, 췌장 종양 또는 망막아세포종이다. 일부 경우에, GD3 양성 종양은 중추 신경계의 신경외배엽 종양, 신경교종, 신경아세포종, 망막아세포종, 뇌실막종, 육종, 흑색종, 유방암, 난소암, 교아세포종, 유잉 육종, 또는 소세포 폐암종이다. 일부 경우에, CD20 양성 종양은 백혈병, 림프종 또는 신경아세포종이다.

조작된 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.

조작된 항체 또는 이의 단편 및 이의 사용 설명서를 포함하는 키트가 본 명세서에 제공된다.

항체 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 항체 또는 이의 단편은 (a) 면역글로불린 G(IgG)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및 (b) 면역글로불린 A(IgA)의 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하며, 상기 투여하는 단계는 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 비견되는 IgG 항체를 투여하는 것과 대비하여 상기 대상체에서 부작용의 감소를 가져온다.

조작된 면역글로불린 G(IgG) 항체 단편이 본 명세서에 제공되며, 상기 조작된 IgG 항체 단편은 적어도 인간 IgA 항체의 힌지 도메인 및 C_H2 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 조작된 IgG 항체 단편은, 대상체에게 투여될 때, 인간 IgA 항체의 힌지 도메인 및 C_H2 도메인이 부재하는 비견되는 항체 단편과 대비하여 증가된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 감소된 보체-의존성 세포독성(CDC)을 가져온다.

IgG 투여와 관련된 통증 또는 이질통을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 IgA 항체의 불변 영역을 포함하는 조작된 IgG 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. IgG 투여로부터 발생되는 보체 활성화를 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 IgA 항체의 불변 영역을 포함하는 조작된 IgG 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

강글리오시드는 신호 전달뿐만 아니라 세포 부착 및 인식에서 중요한 역할을 하는 시알산-함유 글리코스핑고지질이다. 강글리오시드 GD2는 시알산 단위를 이의 전구체 G_M2 상에 부가하는 데 효소 GD3 신타제 및 GD2 신타제를 필요로 하는 b-계열 강글리오시드이다. 정상 조직은 일반적으로 a-계열 강글리오시드를 발현하는 반면, b-계열 강글리오시드는 태아 발달 동안 발현되고, 건강한 성인에서는 신경계에 주로 제한되고 말초 신경 및 피부 멜라닌세포에서는 낮은 수준으로 제한된다. 강글리오시드 GD2의 구조가 도 10에 나타나 있다.

강글리오시드 GD2는 신경외배엽-유래 종양 및 육종(신경아세포종을 포함함), 망막아세포종, 흑색종, 소세포 폐암, 뇌 종양, 골육종, 횡문근육종, 소아 및 청소년에서의 유잉 육종뿐만 아니라, 지질육종, 섬유육종, 평활근육종 및 성인에서의 다른 연조직 육종 상에서 고도로 발현된다. 정상 개체에서의 GD2 발현은 뇌 및 소정의 말초 신경 및 멜라닌세포로 제한되는 것으로 나타난다. 뇌는 전형적으로 정상 순환 항체가 접근가능하지 않기 때문에, GD2는 종양-특이적 요법을 위한 매력적인 표적으로 여겨진다(검토를 위해 문헌[Mahiuddin et al., 2014; FEBS letters 588: 288-297] 참조). Mahiuddin et al.은 다양한 GD2 표적화된 접근법을 기술하는데, 이 중에는 GD2 특이적 항체가 있다. 다수의 표적화된 요법이 임상에 들어가 있으며, I상, II상 및 III상 시험에서 가능성을 보여준다.

다양한 GD2 항체가 현재 개발 중이다. 이들 항체는 ADCC 및 CDC를 유도하는 것으로 여겨지는데, 이에 대해 특히 신경아세포종이 비교적 민감한 것으로 나타난다. 효능을 개선하고 표적화된 접근법의 독성을 감소시키기 위하여 다양한 방법이 추구되고 있다. 가장 빈번하게 사용되는 항체들은 모두 뮤린 IgG3 항체로부터 기원한다. 뮤린 항체는 최근에 인간화되어 왔다. 다수의 변이체가 만들어져 왔다. 뮤린 항체 14.18은 ch14.18로 키메라화되고 hu14.18로 인간화되어 왔으며, 이들 둘 모두는 인간 IgG1 백그라운드를 갖는다(문헌[Mahiuddin et al., 2014; FEBS letters 588: 288-297]). 뮤린 IgG3 항체 3F8은 인간에서 사용되어 왔다. 독성을 감소시키면서, 인간 항-마우스 반응을 감소시키고 항체의 효능을 개선하기 위하여, 3F8은 키메라화 (ch3F8) 및 인간화 3F8(hu3F8-IgG1 및 hu3F8-IgG4)이었다. SPR에 의한 GD2 결합 연구에서, ch3F8 및 hu3F8은 m3F8에 비견되는 KD를 유지하였다. 다른 항-GD2 항체와 달리, m3F8, ch3F8 및 hu3F8은 실질적으로 더 느린 k_off를 가졌다. m3F8과 유사하게, ch3F8 및 hu3F8 둘 모두는 시험관내에서 종양 세포 성장을 억제하였으며, 한편 다른 강글리오시드와의 교차-반응성은 m3F8의 것에 비견되었다. ch3F8 및 hu3F8-IgG1의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)-ADCC 및 다형핵 백혈구(PMN)-ADCC 둘 모두는 m3F8보다 더 강력하였다. hu3F8-IgG4는 PBMC-ADCC 및 CDC가 거의 부재하였다. hu3F8 및 m3F8은 생체내분포 연구에서 유사한 종양-대-비종양 비를 가졌다. 신경아세포종 이종이식편에 대한 항-종양 효과는 m3F8보다 hu3F8-IgG1의 경우에 더 우수하였다(문헌[Cheung et al., 2012; Oncoimmunology 1.4: 477-486] 참조).

면역글로불린(Ig)으로도 알려진 항체(Ab)는 큰 단백질이다. 항체는 면역 시스템의 다양한 성분들과 상호작용한다. 이러한 상호작용들 중 일부는 그의 Fc 영역(기부(base)에 위치됨)에 의해 매개되며, 이 영역은 이들 상호작용에 관여하는 부위(들)를 함유한다.

항체는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 단백질이다. 이들은 전형적으로 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는다. 항원-결합 단편에 부착될 수 있는 5가지 상이한 유형의 결정화가능한 단편(Fc)을 규정하는 몇몇 상이한 유형의 항체 중쇄가 있다. 이러한 5가지 상이한 유형의 Fc 영역은 항체들을 5가지 동종형으로 그룹화될 수 있게 한다. 특정 항체 동종형의 Fc 영역은 그의 특이적 Fc 수용체(FcR)에 결합할 수 있으며, 이에 따라 항원-항체 복합체가 어느 FcR에 결합하는지에 따라 항원-항체 복합체가 상이한 역할을 매개할 수 있게 한다. IgG 항체가 그의 상응하는 FcR에 결합하는 능력은 상호작용 부위의 존재/부재 및 (존재하는 경우) 그의 Fc 영역 내의 부위에 존재하는 글리칸(들)의 구조에 의해 조절된다. FcR에 결합하는 항체의 능력은 이들이 접하게 되는 각각의 상이한 유형의 외래 물체에 대해 적절한 면역 반응을 유도하는 데 도움을 준다.

모든 항체의 일반적인 구조는 유사하지만, 단백질의 선단부에 있는 영역이 매우 가변적이어서, 약간 상이한 선단부 구조 또는 항원-결합 부위를 갖는 수백만 개의 항체가 존재할 수 있게 한다. 이 영역은 초가변 영역으로 알려져 있다. 항체에 의한 항원 결합의 엄청난 다양성은 초가변 영역, 및 초가변 영역을 함유하는 가변 도메인에 의해 대체로 규정된다.

본 발명의 항체는 전형적으로 전장(full-length) 항체이다. 용어 '전장 항체'는 본질적으로 완전한 면역글로불린 분자를 포함하는 것으로 정의되지만, 이것은 반드시 온전한 면역글로불린의 모든 기능을 갖는 것은 아니다. 오해를 피하기 위하여, 전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는다. 각각의 사슬은 불변(C) 영역 및 가변(V) 영역을 함유한다. 전장 항체의 중쇄는 전형적으로 C_H1, C_H2, C_H3, VH 영역 및 힌지 영역을 포함한다. 전장 항체의 경쇄는 전형적으로 CL 영역 및 VL 영역을 포함한다.

항체는 Fab 부분 내에 함유된 가변 영역 도메인을 통해 항원에 결합한다. 항체 가변 도메인은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명에 따른 전장 항체는 원하는 특성을 제공하는 돌연변이가 존재할 수 있는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 전장 항체는 임의의 이들 영역의 실질적인 부분의 결실을 가져서는 안 된다. 그러나, 생성되는 항체의 항원 결합 특성을 본질적으로 변경시키지 않고서, 한 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 치환되거나, 삽입되거나, 결실되거나 또는 이들이 조합된 IgG 분자는 용어 "전장" 항체 내에 포함된다. 예를 들어, "전장" 항체는, 바람직하게는 비-CDR 영역 내에 1 내지 10개(종점 포함)의 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 가질 수 있으며, 이때 결실된 아미노산은 항체의 결합 특이성에 필수적이지 않다.

4가지의 인간 IgG 동종형은 상이한 친화도로 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제성 FcγRIIb 수용체, 및 제1 보체 성분(C1q)과 결합하여, 매우 상이한 이펙터 기능을 생성한다. FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 C_H2 도메인 내에 위치된 잔기에 좌우된다. C_H2 도메인의 2개의 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하며, IgG2 및 IgG4에서 특유의 서열을 갖는다. 위치 233-236에서의 IgG2 잔기의 인간 IgG1로의 치환이 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, Idusogie et al.은 K322A를 비롯한 상이한 위치에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 유의하게 감소시켰음을 입증하였다. 유사하게, 뮤린 IgG2A의 CH2 도메인에서의 돌연변이가 FcγRI 및 C1q에 대한 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 수많은 돌연변이가 인간 IgG1의 C_H2 도메인에서 만들어져 왔으며, ADCC 및 CDC에 대한 그들의 효과가 시험관내에서 시험되어 왔다. 특히, 위치 333에서의 알라닌 치환은 ADCC 및 CDC 둘 모두를 증가시키는 것으로 보고되었다. Fc-수용체 기능은, 특히 문헌[Bruhns et al., 2009. Blood. 113(16):3716-25]; 문헌[Armour et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24]; 문헌[Shields et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604]; 문헌[Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84]; 문헌[Steurer et al., 1995. J Immunol. 155(3):1165- 74]; 및 문헌[Idusogie. et al., 2001. J Immunol. 166(4):2571-5]에 검토되어 있다. IgG1 항체는 C1q 결합 부위를 가지며, 이를 통해 고전적인 경로를 통한 보체 활성화가 달성된다. IgA 항체는 또한 보체를 활성화시킬 수 있다. 이는, 대체 경로, 보체 렉틴 경로 및 고전적인 경로를 통해 이루어질 수 있다(문헌[Jarvis et al., J Immunol. 1989;143(5):1703-9]; 문헌[Hiemstra et al., European journal of immunology. 1987;17(3):321-6]; 문헌[Pfaffenbach et al., The Journal of experimental medicine. 1982;155(1):231-47]; 문헌[Roos et al., J Immunol. 2001;167(5):2861-8]; 문헌[Pascal et al., Haematologica DOI: 10.3324/haematol.2011.061408]; 및 문헌[Lohse et al., Britisch Journal of Haematology. 2011 doi: 10.1111/bjh.14624]).

본 발명자들은, 비변형된 불변 영역을 갖는 뮤린, 뮤린 키메라화 또는 인간화 IgG 또는 인간 IgM GD2 항체의 ADCC 활성이, 적어도 이의 힌지 도메인 및 C_H2 도메인을 인간 IgA 항체, 바람직하게는 인간 IgA1 항체의 힌지 도메인 및 C_H2 도메인으로 대체함으로써 증가될 수 있다는 것을 알아내었다. 바람직한 실시 형태에서는, C_H3 도메인이 또한 인간 IgA 항체의 것이다. 바람직한 실시 형태에서, 항체는 본질적으로 완전한 IgA 불변 영역을 포함한다. 따라서, 본 발명은, GD2에 결합할 수 있고, ADCC 활성을 포함하고, 인간 IgA 항체의 힌지 도메인 및 C_H2 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 본 발명의 GD2 항체는 감소된 CDC 유도능을 갖는다. 본 발명의 GD2 항체는 뮤린, 뮤린 키메라화 또는 인간화 IgG 또는 인간 IgM 기원 GD2 항체와 대비하여 감소된 통증 유도능을 갖는다.

IgA 불변 도메인 또는 힌지 영역은 배선(germ line) IgA 도메인 또는 힌지 영역에 대하여 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. IgA 도메인 또는 힌지 영역은 바람직하게는 최대 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합, 바람직하게는 최대 3개; 2개; 또는 바람직하게는 최대 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다. 그러한 단백질은 여전히 IgA 불변 도메인 또는 힌지 영역이다. IgA 불변 도메인 또는 힌지 영역은 배선 IgA에 대하여 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. IgA 불변 부분(3개의 도메인 및 힌지 영역을 포함함)은 0개; 1개; 2개; 3개; 4개; 5개; 6개; 7개; 8개; 9개; 10개; 11개; 12개; 13개; 14개; 또는 15개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 항-강글리오시드 GD2 항체를 제공하며, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 항체 가변 도메인 및 항체 불변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은 적어도 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 IgA 힌지 및 C_H2 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 바람직하게는 적어도 도 1에 나타낸 바와 같은 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 가변 도메인은 바람직하게는 도 1에 나타낸 바와 같은 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.

항-강글리오시드 GD2 항체 중쇄 가변 영역은 바람직하게는 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역이다. 하나 이상의 위치는 바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아니다. 따라서, CDR의 서열은 도 1의 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역에 대해 나타낸 바와 같다. 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 3개, 더 바람직하게는 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0 또는 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 내의 중쇄 가변 영역은 도 1에서의 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

항-강글리오시드 GD2 항체 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역이다. 하나 이상의 위치는 바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아니다. 따라서, CDR의 서열은 도 1의 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역에 대해 나타낸 바와 같다. 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 3개, 더 바람직하게는 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0 또는 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 내의 경쇄 가변 영역은 도 1에서의 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

다른 실시 형태에서, 본 발명은 항-강글리오시드 GD2 항체를 제공하며, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 항체 가변 도메인 및 항체 불변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은 적어도 항체 3F8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 IgA 힌지 및 C_H2 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 바람직하게는 적어도 (도 1에 나타낸 바와 같은) 항체 3F8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 가변 도메인은 바람직하게는 도 1에 나타낸 바와 같은 항체 3F8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 항-강글리오시드 GD2 항체 중쇄 가변 영역은 바람직하게는 도 1에 나타낸 항체 3F8의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 항체 3F8의 중쇄 가변 영역이다. 하나 이상의 위치는 바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아니다. 따라서, CDR의 서열은 도 1의 항체 3F8의 중쇄 가변 영역에 대해 나타낸 바와 같다. 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 3F8의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 3F8의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 3개, 더 바람직하게는 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0 또는 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 내의 중쇄 가변 영역은 도 1에서의 항체 3F8의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

항-강글리오시드 GD2 항체 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 도 1에 나타낸 항체 3F8의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 항체 3F8의 경쇄 가변 영역이다. 하나 이상의 위치는 바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아니다. 따라서, CDR의 서열은 도 1의 항체 3F8의 경쇄 가변 영역에 대해 나타낸 바와 같다. 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 3F8의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 3F8의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 3개, 더 바람직하게는 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0 또는 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 내의 경쇄 가변 영역은 도 1에서의 항체 3F8의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다.

IgA는 2개의 하위부류(IgA1 및 IgA2)를 가지며, 단량체 형태뿐만 아니라 이량체 형태로 생성될 수 있다. 본 발명에서의 항체는 바람직하게는 단량체 항체이다. 본 발명의 항체 내의 IgA 요소는 바람직하게는 인간 IgA 요소이다. IgA 요소는 IgA1 요소 또는 IgA2 요소일 수 있다. 본 발명의 항체 내의 IgA 요소는 전부 IgA1 요소이거나 전부 IgA2 요소이거나 또는 IgA1 및 IgA2 요소의 조합일 수 있다. IgA 요소는 바람직하게는 인간 IgA 요소이다. 바람직하게는, 항체 내의 모든 IgA 요소는 인간 IgA 요소이다. IgA 요소는 IgA1 요소, 바람직하게는 인간 IgA1 요소일 수 있다. IgA 요소는 또한 IgA2, 바람직하게는 IgA2m(1) 요소, 바람직하게는 인간 IgA1 요소일 수 있다. 항체의 C_H1 도메인 및/또는 C_H3 도메인은 IgG C_H1 도메인, IgG C_H3 도메인 또는 이들의 조합일 수 있다. C_H1 도메인, C_H3 도메인 또는 이들의 조합은 IgA C_H1 도메인, IgA C_H3 도메인 또는 이들의 조합인 것이 바람직하다. IgA C_H1 도메인 및/또는 힌지 영역은 인간 IgA C_H1 도메인 및/또는 인간 IgA 힌지 영역인 것이 바람직하다. 상기 인간 IgA C_H1 도메인 및/또는 인간 IgA 힌지 영역은 바람직하게는 인간 IgA1 C_H1 도메인 또는 인간 IgA1 힌지 영역이다. 상기 인간 IgA C_H1 도메인 및/또는 인간 IgA 힌지 영역은 바람직하게는 인간 IgA2m(1) C_H1 도메인 또는 인간 IgA2m(1) 힌지 영역이다. 바람직하게는, 항체의 불변 도메인 및 힌지 영역은 인간 불변 영역 및 힌지 영역이며, 바람직하게는 인간 IgA 항체의 인간 불변 영역 및 힌지 영역이다. 항체의 불변 도메인 및 힌지 영역은 바람직하게는 인간 IgA1 또는 인간 IgA2m(1) 불변 도메인 및 힌지 영역이다.

인간 불변 영역은 자연에서 발견되는 바와 같은 인간 대립유전자에 대해 0 내지 15개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 아미노산 변화는 다양한 이유로 도입될 수 있다. 비제한적인 예에는 항체의 생성 또는 균일성의 개선, 순환 내에서의 반감기의 적응, HC/LC 조합의 안정성, 글리코실화의 최적화, 이량체화 또는 복합체 형성의 조정, ADCC 활성의 조정을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 인간 불변 영역은 자연에서 발견되는 바와 같은 인간 대립유전자에 대해 0개; 1개; 2개; 3개; 4개; 5개; 6개; 7개; 8개; 9개; 10개; 11개; 12개; 13개; 14개; 및 15개의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 변화된 아미노산은 바람직하게는 상이한 동종형의 상응하는 위치에 있는 아미노산으로부터 선택된 것이다.

일 실시 형태에서, 중쇄의 불변 영역은 IgA2 불변 영역, 바람직하게는 인간 IgA2 불변 영역, 바람직하게는 인간 IgA2m(1)이다. 일 태양에서, 인간 불변 영역은 돌연변이된 IgA2m(1) 서열이다.

일 실시 형태에서, 항체는 IgA2m(1) 서열의 불변 영역을 포함하며, 이러한 불변 영역은 바람직하게는 적어도 1개; 그리고 바람직하게는 적어도 2개; 3개; 4개; 5개; 그리고 바람직하게는 적어도 7개의 하기 돌연변이를 갖는다: N166G; P221R; N337T; I338L; T339S; C331S; 및 인간 IgA2m(1) 항체의 C-말단 아미노산 서열 "…VDGTCY"의 "…VDGT"로의 돌연변이. 도 13은 인간 IgA1; IgA2m(1) 및 바람직한 돌연변이된 IgA2m(1) 서열(hIgA2.0)을 나타내며; 또한 도 13의 E를 참조한다.

일 실시 형태에서, GD2 항체는 도 13의 E에 제공된 서열에 대해 0개; 1개; 2개; 3개; 4개; 5개; 6개; 7개; 8개; 9개; 10개; 11개; 12개; 13개; 14개; 및 15개의 아미노산 변화를 갖는 도 13의 E의 불변 영역을 갖는 중쇄를 포함하되, 단, 위치 166; 221; 337; 338; 339; 및 331에 있는 아미노산은 166G; 221R; 337T; 338L; 339S 및 331S이다. 바람직하게는, 인간 IgA2m(1) 항체에서 "…VDGTCY"인 C-말단 아미노산 서열은 "... VDGT"이다.

어떠한 아형이든 인간 IgA 서열은 항체의 중쇄와 관련된다. 중쇄는 동종형 전환을 거친다.

언급된 IgA 항체는 바람직하게는 ch14.18 가변 도메인 또는 3F8 가변 도메인, 바람직하게는 ch14.18 가변 도메인을 포함한다.

항-강글리오시드 GD2 항체는 하기를 포함한다:

- 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역. 하나 이상의 위치는 바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아니다. 따라서, CDR의 서열은 도 1의 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역에 대해 나타낸 바와 같다. 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 중쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 3개, 더 바람직하게는 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0 또는 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 내의 중쇄 가변 영역은 도 1에서의 항체 ch14.18의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가짐;

- 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역. 하나 이상의 위치는 바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아니다. 따라서, CDR의 서열은 도 1의 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역에 대해 나타낸 바와 같다. 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 경쇄 가변 영역은 도 1에 나타낸 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 0 내지 3개, 더 바람직하게는 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0 또는 1개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가지며, 하나 이상의 위치는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 내의 위치가 아닌 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체 내의 경쇄 가변 영역은 도 1에서의 항체 ch14.18의 경쇄 가변 영역 서열에 대해 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가짐;

- IgA 중쇄로서, 바람직하게는, 도 13의 E에 제공된 서열에 대해 0개; 1개; 2개; 3개; 4개; 5개; 6개; 7개; 8개; 9개; 10개; 11개; 12개; 13개; 14개; 및 15개의 아미노산 변화를 갖는 도 13의 E에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하되, 단, 위치 166; 221; 337; 338; 339; 및 331에 있는 아미노산은 166G; 221R; 337T; 338L; 339S 및 331S인, IgA 중쇄. 바람직하게는, 인간 IgA2m(1) 항체에서 "…VDGTCY"인 C-말단 아미노산 서열은 "... VDGT"임; 및

- 경쇄 불변 도메인으로서, 바람직하게는 항체 ch14.18의 경쇄 불변 도메인.

본 발명의 항-강글리오시드 GD2 항체는 바람직하게는 적합한 시험관내 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 검정에서 측정될 때 항체 디누툭시맙보다 더 많은 ADCC를 나타낸다. 그것은, 바람직하게는, 적합한 시험관내 보체-의존성 세포독성(CDC) 검정에서 측정될 때 항체 디누툭시맙보다 더 적은 CDC를 나타낸다. 다양한 ADCC 및 CDC 검정이 당업자에게 이용가능하다. 본 발명과 관련하여, 실시예에 기재된 바와 같은 ADCC 검정 또는 CDC 검정이 사용되는 것이 바람직하다. 청구된 바와 같은 항체의 ADCC 기능은 바람직하게는 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은) 고전적인 크롬 방출 검정에서 측정된다. 청구된 바와 같은 항체의 CDC 기능은 바람직하게는 유세포측정에서 7-AAD 양성에 기초한 방법으로 측정된다(예를 들어, 실시예 참조). 항체는 바람직하게는 적합한 시험관내 보체-의존성 세포독성(CDC) 검정에서 측정될 때 항체 디누툭시맙의 CDC의 20% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하를 나타낸다. 바람직한 실시 형태에서, 항체는 항체의 중쇄 또는 경쇄에 부착된 알부민-결합 도메인(ABD)을 포함한다. 중쇄 또는 경쇄에 대한 알부민-결합 도메인의 결합에 대한 상세한 내용에 대해서는 문헌[Meyer, et al., 2016; MAbs. Vol. 8. No. 1]을 참조한다. 다른 실시 형태에서, 항체의 반감기를 증가시키기 위해 다른 도메인이 첨가된다. 바람직한 실시 형태에서, 그러한 도메인은 인간 알부민의 DIII 도메인이다. 그러한 도메인은 바람직하게는 항체의 IgA 부분의 불변 영역에 물리적으로 연결된다.

일 태양에서, IgG 항체의 가변 영역 및 IgA 항체의 불변 영역을 포함하는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 조작된 항체 또는 이의 단편은 부작용을 감소시킬 수 있다. 일 태양에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 조작된 항체 또는 이의 단편은 IgG 항체 요법과 관련된 부작용을 감소시킬 수 있다. 일 태양에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 조작된 항체 또는 이의 단편은 선천성 면역 반응과 관련된 부작용을 감소시킬 수 있다. 그러한 선천성 면역 반응과 관련된 부작용은 염증, 보체 시스템 활성화, 백혈구(비만 세포, 식세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호염기구, 호산구, 천연 살해 세포, 및 감마 델타 세포 활성일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 바와 같은 조작된 항체 또는 이의 단편은 보체 시스템 활성화와 관련된 부작용을 감소시킬 수 있다.

보체 시스템 활성화는, 항체 또는 이의 단편이 병원체를 제거하거나 파괴를 위해 이를 마킹하는 능력을 보완하는 면역 시스템의 생화학적 캐스케이드(biochemical cascade)일 수 있다. 보체 캐스케이드는 간에서 합성되는 다양한 혈장 단백질을 포함하며, 이들 단백질은 염증성 세포의 동원을 촉발시키는 기능, 파괴를 위하여 병원체를 태깅하는 기능(옵소닌화(opsonization)), 병원체의 원형질 막을 천공하는 기능, 중화된 항원-항체 복합체를 제거하는 기능, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 다양한 기능을 갖는다. 일부 태양에서, 부작용의 감소는 보체 시스템 활성화의 감소를 포함할 수 있다.

일 태양에서, IgG 항체 또는 이의 일부분은 표적과 반응하여, 항원-결합된 IgG의 Fc 부분에 대한 C1q의 결합을 가져올 수 있으며, 이후에 C1r 및 C1s가 부착되어, 보체 활성화와 관련된 효소인 C1을 형성할 수 있다. C1은 C4를 C4a 및 C4b로 효소적으로 절단하도록 진행할 수 있다. C4b는 표적의 표면 상의 인접한 단백질 및 탄수화물에 결합하고, 이어서 C2에 결합한다. 활성화된 C1은 C2를 C2a 및 C2b로 절단하여, C3 전환효소인 C4b2a를 형성할 수 있다. C3 전환효소는 C3을 C3a 및 C3b로 절단할 수 있다. 보체 활성화 경로의 추가의 단계에서, C3b는 C3 전환효소인 C4b2a에 결합하여 C5 전환효소인 C4b2a3b를 형성할 수 있으며, C5 전환효소는 C5를 C5a 및 C5b로 절단할 수 있다. C5b는 표적에 결합하고, 또한 C6, C7, C8, 및 C9에 결합하여, 막 공격 복합체(MAC)인 C5b6789n을 형성할 수 있다. MAC는 그람-음성 세균뿐만 아니라 외래 항원을 디스플레이하는 세포(예컨대 몇 가지 예를 들자면, 바이러스-감염된 세포, 종양 세포)를, 그들의 용해를 야기함으로써 파괴할 수 있다. 일 태양에서, 보체 반응의 감소는 C1q, C1r, C1s, C1, C4, C4a, C4b, C2, C2a, C2b, C4b2a, C3, C3a, C3b, C4b2a3b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, C5b6789m, MAC, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 부재 또는 감소된 수준에 의해 측정될 수 있다. 일 태양에서, 보체 반응의 감소는, 비견되는 양의 IgG 항체와 대비하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 IgG 가변 영역 및 IgA 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하는 조작된 항체에 대한 C1q, C1r, C1s, C1, C4, C4a, C4b, C2, C2a, C2b, C4b2a, C3, C3a, C3b, C4b2a3b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, C5b6789m, 및 MAC 중 어느 하나로부터 선택되는 보체 인자의 결합의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%의 감소를 지칭할 수 있다.

보체 반응의 감소는 ELISA, 유세포측정, 혈액학적 검사, 또는 시험관내 검정을 수행하여 C1q, C1r, C1s, C1, C4, C4a, C4b, C2, C2a, C2b, C4b2a, C3, C3a, C3b, C4b2a3b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, C5b6789m, MAC, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나로부터 선택되는 보체 인자의 양을 정량화함으로써 결정될 수 있다. 일부 태양에서, 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 단편은 제공된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 비견되는 항체 또는 이의 단편과 대비하여 더 낮은 수준의 보체 인자를 생성할 수 있다. 일부 태양에서, 본 명세서에 제공되는 조작된 IgG-IgA 항체 또는 이의 단편은 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 비견되는 IgG 항체 또는 이의 단편과 대비하여 더 낮은 수준의 보체 인자를 생성할 수 있다. 보체 반응의 감소는 또한 표적 세포의 보체 의존성 용해의 유세포측정 정량화에 의해 측정될 수 있을 뿐만 아니라 실시예에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

IgG의 투여와 대비하여 본 명세서에 기재된 조작된 항체 또는 이의 단편의 투여에 의해 경감되거나 감소될 수 있는 추가의 부작용은 IgG 항체 요법과 관련된 임의의 부작용을 지칭할 수 있다. IgG 항체 요법과 관련된 부작용은 염증, 혈전색전성 사건, 용혈성 사건, 보체-시스템 관련 사건, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, IgG 항체 요법은 하기와 같은 부작용을 초래할 수 있다: 염증, 고혈압, 저혈압, 통증, 발열, 두드러기, 알레르기, 한기, 쇠약, 설사, 구역, 구토, 발진, 가려움, 기침, 변비, 부종, 두통, 열, 숨참, 근육통, 동통, 식욕 감소, 불면증, 현기증, 아나필락시스, 혈전증, 심부전, 출혈, 간염, 전장염, 점막염, 사이토카인 증후군, 갑상선 기능저하증, 저나트륨혈증, 저칼슘혈증, 모세혈관 누출 증후군, 및 이질통.

일 태양에서, 보체 반응, 보체-관련 부작용, 또는 독성을 감소시키는 것은 이를 필요로 하는 대상체의 치료 순응도를 개선할 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 단편, 예컨대 조작된 항체는 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 비견되는 IgG 항체와 대비하여 더 높은 용량, 더 오랜 치료 기간, 또는 더 많은 빈도로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 단편, 예컨대 조작된 항체는 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 비견되는 IgG 항체에 비하여 약 1X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X 더 높은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 단편, 예컨대 조작된 항체는 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 비견되는 IgG 항체에 비하여 약 1시간, 5시간, 10시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 14일, 24일, 30일, 매월, 격월, 격년, 매년, 그리고 매일 더 오랜 기간 동안 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 단편, 예컨대 조작된 항체는 동일한 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역을 포함하는 비견되는 IgG 항체와 대비하여 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년과 같이 더 많은 빈도로 투여될 수 있다.

소정 위치에 있는 아미노산을 변화시키는 이유는 면역원성일 수 있다. 다른 이유로는 항체의 생성 또는 균일성의 개선이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 뮤린 백그라운드로부터 유래되는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 갖는다. 그러한 가변 도메인을 갖는 항체는 인간에서 사용될 수 있다. 현재에는, 그러한 가변 도메인을 탈면역화하는 것이 바람직하다. 탈면역화는 전형적으로 가능한 언제든지 뮤린 서열을 더 많은 인간 서열로 변형시키는 것을 수반한다. 전형적으로, 그러한 변형은 가변 도메인으로부터 하나 이상의 T-세포 에피토프 또는 하나 이상의 B-세포 에피토프를 제거하는 쪽으로 유도된다. 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 (인간) T-세포 에피토프가 그러한 에피토프의 적어도 하나의 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체함으로써 제거되었다. 종종, 그것은 이른바 "앵커(anchor)" 아미노산을 치환하는 것으로 충분하다. 적합한 대체 아미노산은 특정 VH 또는 VL의 체세포 초돌연변이체로부터 얻어질 수 있다. 인간 항체 내의 그 위치에 천연적으로 존재하는 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 또한, 인간 B-세포 에피토프가 그러한 에피토프의 적어도 하나의 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체함으로써 제거될 수 있다. 종종, 그것은 에피토프의 단지 하나의 아미노산만을 치환하는 것으로 충분하다. 적합한 대체 아미노산은 특정 VH 또는 VL의 체세포 초돌연변이체로부터 얻어질 수 있다. 인간 항체 내의 그 위치에 천연적으로 존재하는 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 가변 도메인은 하나 이상의 외부 잔기에 대해 변형된다. 그러한 잔기는 면역 시스템에 의해 용이하게 접하게 되고, 바람직하게는 인간 잔기로 선택적으로 대체되어 하이브리드 분자를 생성하는데, 이러한 하이브리드 분자는 약면역원성이거나 실질적으로 비면역원성인 표면을 포함한다. 적합한 대체 아미노산은 특정 VH 또는 VL의 체세포 초돌연변이체로부터 얻어질 수 있다. 인간 항체 내의 그 위치에 천연적으로 존재하는 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 인간화 중쇄 가변 영역, 인간화 경쇄 가변 영역 또는 이들의 조합을 포함하는 본 발명의 항체를 추가로 제공한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체의 경쇄는 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 바람직하게는 상응하는 항체의 경쇄 불변 영역이다. ch14.18 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄는 바람직하게는 또한 ch14.18 항체의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 3F8 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄는 바람직하게는 또한 3F8 항체의 경쇄 불변 영역을 포함한다.

본 발명은 GD2 양성 종양을 갖거나 상기 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체의 치료량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체가 제공된다. 치료는 바람직하게는 상기 대상체에서 신경아세포종 내의 강글리오시드 GD2를 상향조절하는 데 유효한 양으로 레틴산을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 치료는 바람직하게는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), G-CSF 또는 이들의 조합을 상기 대상체 내의 과립구의 수를 증가시키기에 그리고/또는 ADCC를 증가시키기에 유효한 양으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. GM-CSF, G-CSF 또는 이들의 조합은 바람직하게는 치료하려는 종의 것이다. 그것은 바람직하게는 인간 GM-CSF, 인간 G-CSF 또는 이들의 조합이다.

GD2 양성 종양은 바람직하게는 GD2 양성 신경아세포종, 예컨대 신경외배엽-유래 종양 또는 육종이다. 바람직한 실시 형태에서, GD2 양성 종양은 GD2 양성 신경아세포종, 망막아세포종, 흑색종, 소세포 폐암, 뇌 종양, 골육종, 횡문근육종, 소아 및 청소년에서의 유잉 육종, 또는 지질육종, 섬유육종, 평활근육종 또는 성인에서의 다른 연조직 육종이다. 바람직한 실시 형태에서, GD2 양성 종양은 신경아세포종이다. 본 발명의 방법 또는 사용으로 치료되는 신경아세포종은 바람직하게는 고위험 신경아세포종이다.

레틴산은 바람직하게는 13-시스-레틴산(아이소트레티노인)이다.

본 발명은 본 발명의 항체 또는 본 발명의 용도를 위한 방법 또는 항체를 추가로 제공하며, 상기 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역:

EVQLLQSGPE LEKPGASVMI SCKASGSSFT GYNMNWVRQN IGKSLEWIGA IDPYYGGTSY NQKFKGRATL TVDKSSSTAY MHLKSLTSED SAVYYCVSGM EYWGQGTSVT VSS

및 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다:

EIVMTQSPAT LSVSPGERAT LSCRSSQSLV HRNGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIHKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP PLTFGAGTKL ELK.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 중쇄, 경쇄 또는 바람직하게는 둘 모두를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 조합을 제공한다. 핵산 분자 또는 조합은 바람직하게는 기재된 바와 같은 항체의 발현을 위한 하나 이상의 서열을 추가로 포함한다. 그러한 발현 서열의 비제한적인 예는 프로모터, 종결 서열, 인핸서, 인트론 등이다. 그러한 서열은 핵산 분자 상에 반드시 존재하는 것은 아닌데, 그 이유는 그러한 서열은, 예를 들어 세포의 염색체, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 내의 핵산 분자의 통합 부위에 의해 인 시스(in cis)로 제공될 수 있기 때문이다. 세포 염색체 내의 적합한 통합 부위는, 예를 들어 상동성 재조합에 의해, 용이하게 결정되고 표적화될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 조합을 포함하는 세포가 추가로 제공된다.

본 발명의 핵산 분자 또는 조합, 또는 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 조합을 포함하는 세포를 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 생성을 위한 수단 및 방법이 추가로 제공된다.

본 발명에 따른 핵산 분자 또는 조합은, 예를 들어 세포 내에 포함된다. 상기 핵산이 상기 세포 내에서 발현될 때, 핵산 분자의 번역된 생성물은 본 발명의 항체이거나 그 안으로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 조합을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 핵산 분자 또는 조합을 포함하고 본 발명의 항체를 생성할 수 있는 세포를 추가로 제공한다. 본 발명의 항체를 생성하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 발현하는 것을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양 배지, 세포 또는 이들의 조합으로부터 항체를 수집하는 단계를 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 동물 세포, 더 바람직하게는 포유류 세포이다. 상기 세포는 바람직하게는 인간에서 사용하기 위한 항체의 생성에 통상적으로 사용되는 세포이다. 그러한 세포의 비제한적인 예는 CHO, NSO, HEK 세포, 바람직하게는 HEK293F 세포, 및 PER.C6 세포이다. 세포는 소정의 목적에 적합하도록 특별히 설계될 수 있으며, 예를 들어, 항체의 생성에 사용되는 대부분의 세포주는 부유 상태로, 고밀도로 그리고 다른 특성으로 성장에 맞게 구성되어 왔다. 본 발명의 목적상, 적합한 세포는 본 발명에 따른 항체를 포함할 수 있는, 그리고 바람직하게는 생성할 수 있는 임의의 세포이다.

도 1: 항체 ch14.18의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산(각각 패널 A 및 패널 B; CDR 영역은 밑줄 쳐져 있음). 항체 ch14.18의 가변 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열(각각 패널 C 및 패널 D). 3F8에 대하여, 키메라 감마 1 중쇄(서열 번호 1) 및 키메라 카파 경쇄(서열 번호 2)가 나타나 있다. 각각의 CDR은 밑줄 쳐져 있다.
도 2: 몇몇 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 비에 의한 형질감염 후의 IgA ch14.18의 정량화. 5개의 상이한 비를 IgG1 및 IgA1 생성에 사용하였다. 최적비를 더 큰 규모의 생성에 사용하였다.
도 3: A: IgA ch14.18의 κ-경쇄 특이적 친화성 크로마토그래피. B: 단백질 농도를 나타내는 IgA ch14.18 UV 흡수의 크기 배제 크로마토그래피가 궤적으로 표시되어 있다.
도 4: 유세포측정에서 GD2 발현 신경아세포종 세포주 IMR32 및 SK-N-FI에 대한 자체적으로(in-house) 생성되고 정제된 IgG1 및 IgA ch14.18의 결합.
도 5: IMR32 세포주와 함께 1시간 및 4시간 인큐베이션한 후의 IgG1 및 IgA의 CDC 검정. 보체 활성화를 통한 세포 용해는 유세포측정 분석에 의해 분석된다. 15% 풀링된 인간 혈청을 첨가하고, 세포를 37℃에서 60분 및 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해의 양은 7-AAD 염색에 의해 측정된다.
도 6: IMR32(패널 A 및 패널 B) 및 SK-N-FI(패널 C 및 패널 D) 세포주와 함께 4시간 인큐베이션한 후의 IgG1 및 IgA의 백혈구(패널 A 및 패널 C) 및 PMN(패널 B 및 패널 D) ADCC 검정. 적혈구를 용해시키고, 나머지 이펙터 세포를 웰에 첨가하였다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, ⁵¹Cr 방출을 베타-감마 계수기에 의해 분당 카운트(cpm) 단위로 측정하였다. 특이적 용해의 백분율을 Triton의 존재 하에서의 최대 용해와 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에서의 기저 용해를 결정함으로써 계산하였다.
도 7: IMR32 및 SK-N-FI 세포주와 함께 4시간 인큐베이션한 후의 자체적으로 생성되고 정제된 IgG1 및 IgA의 백혈구 ADCC 검정. 적혈구를 용해시키고, 나머지 이펙터 세포를 사이토카인과 함께 웰에 첨가하였다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, ⁵¹Cr 방출을 베타-감마 계수기에 의해 분당 카운트(cpm) 단위로 측정하였다. 특이적 용해의 백분율을 Triton의 존재 하에서의 최대 용해와 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에서의 기저 용해를 결정함으로써 계산하였다.
도 8: IMR32 또는 SK-N-FI 세포주와 함께 4시간 인큐베이션한 후의 IgG1 및 IgA ch14.18의 PMN ADCC 검정. PMN을 Ficoll/Histopaque 분리에 의해 단리하였다. 후속으로, 이펙터 세포, 사이토카인 및 다양한 농도의 항체를 표적 세포가 담긴 미세적정 플레이트에 첨가하였다. E:T 비는 40:1(PMN)이었다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, ⁵¹Cr 방출을 베타-감마 계수기에 의해 분당 카운트(cpm) 단위로 측정하였다. 특이적 용해의 백분율을 Triton의 존재 하에서의 최대 용해와 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에서의 기저 용해를 결정함으로써 계산하였다.
도 9: 연속 4일 동안 상이한 농도의 아이소트레티노인에 노출시킨 후의 IMR32 세포 상에서의 GD2(패널 A) 및 MHC-I(패널 B) 발현. 세포를 IgA ch14.18로 염색하고, 2차 항-IgA PE 또는 항-MHC-I-PE로 검출하였다.
도 10: 강글리오시드 GD2의 개략도.
도 11: 생체내 기계적 역치의 정량화. 암컷(8 내지 12주령) C57BL/6 마우스(Harlan Laboratories)를 사용하여 실험을 수행하였다. 마우스는 100 마이크로그램의 항체의 정맥내 주사를 제공받았다. 기계적 역치는 문헌[Eijkelkamp et al., 2010; J. Neurosci. 30:2138-2149] 및 문헌[Chaplan et al., 1994; J. Neurosci. Methods 53:55-63]에 기재된 바와 같은 업-앤-다운 방법(up-and-down method)과 함께 본 프레이(von Frey) 시험(Stoelting)을 사용하여 결정하였다. 모든 실험은 처리에 대해 맹검 상태인 실험자들에 의해 수행되었다.
도 12: 1차 서열 및 IgA1/IgA2.0 하이브리드 항체의 모델링. A, hIgA1, IgA2m(1), 및 a IgA1/IgA2m(1) 하이브리드(hIgA2.0)의 불변 영역의 1차 서열의 정렬. 잔기는 골수종 IgA1 단백질(Bur) 체계에 따라 넘버링된다. 도메인 경계는 서열 위에 수직선으로 표시되어 있다. 하기 특징들이 강조되어 있다: 밝은 회색의 밑줄 쳐진 잔기는 IgA1에 대해 특유한 것이고, 어두운 회색의 밑줄 쳐진 아스파라긴은 보존된 N-글리코실화 컨센서스 서열이고, 흑색의 밑줄 쳐진 잔기는 IgA2.0에 대해 특유한 것이다. B, 225-IgA2.0의 중쇄를 모델링하였으며, 정측면도로 도시되어 있고, 돌연변이가 마킹되어 있다. C, 야생형 및 돌연변이 IgA2의 중쇄를 모델링하였다. 생성된 정렬은, IgA2.0과 비교하여 IgA2-wt의 중쇄 내의 C241의 상이한 배향을 나타내는데, 이는 아마도 P221R 돌연변이로 인해 그러할 것이다. D, 225-IgA2-wt(녹색, C471; 적색, Y472) 및 IgA2.0(적색)의 꼬리 조각에 초점을 맞춤. 모델의 예측 및 정렬은 I-TASSER을 사용하여 수행하였으며; 모델은 3D-Mol Viewer에서 변형시켰다. E, IgA2.0의 중쇄의 불변 영역의 핵산 서열 및 단백질 서열.
도 13: IgA1 및 IgG1 ch14.18의 HP-SEC 분석. 정제된 항체에 대해 HP-SEC 분석을 수행하였다. IgA1 ch14.18(A) 및 IgG1 ch14.18(B) 둘 모두는 고도로 단량체인 것으로 밝혀졌다. 궤적은 280 nm에서의 UV 흡광도를 나타낸다.
도 14: 신경아세포종 세포주에 대한 IgG1 및 IgA1 ch14.18 항체의 결합. (A) GD2 발현 신경아세포종 세포주 IMR32 및 GD2-음성 세포주 GI-ME-N에 대한 IgA1-FITC 및 IgG1-FITC ch14.18의 항체 결합, (B) IMR32 세포에 대한 신경아세포종 항체의 실시간 세포-기반 친화도 측정. IMR32 세포주를 1시간 동안 10 nM의 항체로 처리하였다. 후속으로, 농도를 1시간 동안 20 nM의 항체로 증가시켰다. 항체 함유 배지를 항체 무함유 배지로 대체함으로써, 130 내지 250분부터 해리가 뒤따랐다. 세포-기반 친화도 측정으로부터의 계산된 친화도가 B에 나타나 있다.
도 15: 신경아세포종 세포주의 패널에 대한 IgA1 및 IgG1 ch14.18에 의한 ADCC의 특성화. (A) 이펙터 세포로서 말초 혈액으로부터의 백혈구를 사용하여 3개의 상이한 신경아세포종 세포주에 대한 IgA1 및 IgG1 ch14.18에 의한 ADCC 검정. (B) 이펙터 세포로서 단리된 PBMC(E:T 비 100:1) 또는 단리된 호중구(E:T 비 40:1)를 사용하여 IMR-32 세포주에 대한 IgG1 ch14.18에 의한 ADCC 검정. (C) 10 ng/ml GM-CSF, 6545 U/ml의 IL-2의 동시처리 및 10 μM의 11-시스 레틴산과의 24시간의 사전-인큐베이션과 함께, 이펙터 세포로서 단리된 PBMC(E:T 비 100:1) 또는 단리된 호중구(E:T 비 40:1)를 사용하여 IMR-32 세포주에 대한 IgG1 ch14.18에 의한 ADCC 검정. (D) 15% 풀링된 인간 보체 활성 혈청과 배합된 이펙터 세포로서의 말초 혈액으로부터의 백혈구에 의한 ADCC 검정.
도 16: IgG1 및 IgA1 ch14.18 항체에 의한 신경아세포종 세포주의 패널에 대한 보체 검정. (A) 4개의 상이한 신경아세포종 세포주에 대한 IgG1 ch14.18 항체에 의한 용해. 세포를 15분 및 4시간 동안 4개의 상이한 농도의 항체 및 15% 혈청과 함께 인큐베이션하였다. (B) 4개의 상이한 신경아세포종 세포주에 대한 IgA1 ch14.18 항체에 의한 용해. 세포를 15분 및 4시간 동안 4개의 상이한 농도의 항체 및 15% 혈청과 함께 인큐베이션하였다. (C) 신경아세포종 세포주 상에서의 보체 조절 단백질 CD46, CD55 및 CD59의 발현.
도 17: IgG1 및 IgA1 ch14.18 항체의 생체내 효능. (A) IgA1 또는 IgG1 ch14.18에 의한 24시간의 처리 후의 신경아세포종 세포의 생물발광 신호의 정량화. (B) 종양 세포의 I.V. 주사 후 처리 3일째에서의 생물발광 신호의 정량화.
도 18: IgA1에 대한 뉴런 노출은 기계적 회피 역치의 감소로 이어지지 않는다. (A) 정맥내 주사 후 3시간째에서의 IgA1 및 IgG1 ch14.18의 혈장 농도. (B) 본 프레이 회피 역치. (C) 형광 표지 IgA1 ch14.18 또는 IgG1 ch14.18의 I.V. 주사 후의 본 프레이 회피 역치. (D) 좌측 열: 좌골 신경에 대한 정맥내 주사된 Alexa-488 표지 항체의 시각화. 우측 열: 뉴런을 Alexa-549 표지 IgG1 ch14.18과 함께 인큐베이션함으로써 GD2의 생체외 염색의 시각화.

명료성 및 간결한 설명을 위해, 특징들은 본 명세서에 동일하거나 개별적인 실시 형태의 일부로서 기재되지만, 본 발명의 범주는 개시된 특징들 중 전부 또는 일부의 조합을 갖는 실시 형태를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.

실시예

실시예 1

항-GD2 항체 생성 벡터의 생성:

ch14.18로부터 유래되는 가변 영역의 아미노산 서열을 디누툭시맙의 FDA 애플리케이션에서 발견하였다(애플리케이션 125516; 도 1에 나타냄). 이들 아미노산 서열을 가장 가능성 있는 비축퇴 코딩 서열을 나타내는 cDNA 서열로 번역하였다. cDNA를 합성하고(Baseclear), IgA1 골격 또는 IgG1 골격 중 어느 하나를 함유하는 pEE14.4 발현 벡터들로 하위클로닝하였다(문헌[Beyer, T., et al. "Serum-free production and purification of chimeric IgA antibodies." Journal of immunological methods 346.1 (2009): 26-37]에 기재됨). 먼저, 형질감염을 위한 중쇄 대 경쇄 DNA의 최적비를 HEK293F 세포에서 소규모 시험 형질감염에 의해 결정하였다. 이어서, 항체 생성을 항-인간 IgG ELISA(도 2a) 또는 항-인간 IgA ELISA(도 2b)에 의해 정량화하였다.

항체 특성화 및 기능 검정이 가능하도록 생성 규모를 확대하였다. 역시, HEK293F 세포를 최적의 중쇄 대 경쇄 형질감염 비로 pEE14.4 IgA ch14.18 중쇄 및 ch14.18 카파 경쇄를 사용하여 형질감염시켰다. 생성된 IgA 항체를 일련의 2개의 액체 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제하였다. 먼저, 인간 κ-경쇄 특이적 친화성 크로마토그래피를 사용하여 IgA ch14.18을 무혈청 상층액으로부터 단리하였다(도 3의 A). 다음으로, 분취용 사전팩킹된(prepacked) Superdex200 26x600 컬럼과 함께 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 경쇄로부터 온전한 IgA를 분리하였다(도 3의 B). 마지막으로, IgG 항체를 단백질 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 후속으로 PBS에 대해 투석시켰다. 이러한 다단계 절차는 재조합 단량체 IgA의 고순수 조제물의 생성을 가져온다.

항-GD2 항체의 특성화

GD2 발현 세포주 IMR32 및 SK-N-FI에 대한 항-GD2 항체의 결합을, 몇몇 농도의 항-GD2 항체로 45분 동안 얼음 상에서 세포를 염색함으로써 분석하였다. 세포를 세척하고, 2차 염소-항 인간 IgA-PE 또는 IgG-PE를 암실에서 얼음 상에서 45분 동안 세포에 첨가하였다. 이후에, 항체 결합을 유세포측정 분석에 의해 정량화하였다.

생성된 항체의 보체 활성화를, 37℃에서 1시간 및 4시간 동안 15% 풀링된 인간 혈청 및 항체(10 내지 0.01 ㎍/ml)와 함께 IMR32 및 SK-N-FI 세포를 인큐베이션함으로써 평가하였다. 이후에, 세포의 생/사 염색(7-AAD)을 수행하였으며, 세포 용해를 유세포측정 분석을 통해 정량화하였다.

ADCC 검정을 수행하여, IgA 및 IgG1 ch14.18이 신경아세포종 세포에 대해 이펙터 세포를 동원하는 효능을 평가하였다. 먼저, 백혈구 ADCC를 수행하였다. 여기에, 건강한 공여자로부터의 말초 혈액을 RBC 용해 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 잔존 백혈구를 세척하고, IL-2 및 GM-CSF(둘 모두 10 ng/ml)가 있거나 없는 상태에서 방사성 표지 신경아세포종 세포에 첨가하였다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, 액체 신틸레이션에 의해 측정된 ⁵¹Cr 방출에 의해 세포 사멸을 정량화하였다. 특이적 용해의 백분율을 2.5% Triton X-100의 존재 하에서의 최대 용해와 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에서의 기저 세포 용해를 결정함으로써 계산하였다.

PMN이 IgA 매개 사멸을 위한 중요한 이펙터 세포 집단인지의 여부를 평가하기 위하여, PMN을 Ficoll-Histopaque에 의해 건강한 공여자로부터의 말초 혈액으로부터 단리하고, IL-2 및 GM-CSF(둘 모두 10 ng/ml)가 있거나 없는 상태에서 방사성 표지 신경아세포종 세포에 40:1 E:T 비로 첨가하였다.

결과 및 논의

GD2에 대한 결합능, 보체 활성화 및 이펙터 세포 동원을 결정함으로써 항체의 기능적 특성화를 수행하였다. GD2-양성 세포주 IMR32 및 SK-N-FI에 대한 결합의 유세포측정 분석은 IgG1 및 IgA 둘 모두에 대해 유사한 결합 패턴을 보여주었다(도 4). 15% 풀링된 인간 혈청 및 몇몇 농도의 항체와 함께 인큐베이션한 후 생/사 염색(7-AAD)에 의해, 생성된 항체의 보체 활성화를 평가하였다. 1시간의 인큐베이션 후, IgA 항-GD2 항체는 보체의 활성화를 나타내지 않은 반면, 동일한 가변 영역을 갖는 IgG1 변이체는 보체 시스템을 활성화하였다(도 5의 A). 인큐베이션 시간이 4시간으로 증가되었을 때 IgG의 경우 용해가 더 증가한 반면, IgA의 경우에는 보체 활성화가 관찰되지 않았다(도 5의 B).

ADCC 검정을 수행하여, IgA 및 IgG1 ch14.18이 신경아세포종 세포에 대해 이펙터 세포를 동원하는 효능을 평가하였다. 먼저, 백혈구 ADCC를 수행하였다. 여기서, IgA 항-GD2 항체는 IMR32 및 SK-N-FI 세포주 둘 모두에 대해 월등한 것으로 나타났다(도 6). PMN이 IgA 매개 사멸을 위한 중요한 이펙터 세포 집단인지의 여부를 평가하기 위하여, PMN을 건강한 공여자로부터의 말초 혈액으로부터 단리하였다. IgA 항-GD2 항체는 IMR32 및 SK-N-FI 세포를 사멸시키는 데 있어서 IgG1보다 더 우수하게 PMN을 자극하는 것으로 나타났다(도 6).

세포를 임상적으로 사용된 사이토카인 GM-CSF와 함께 인큐베이션하였을 때, IgA 항-GD2 항체에 의해 유도된 최대 용해는 강하게 증가한 반면, IgG1 변이체에 대해서는 최소한의 효과만이 관찰되었다(도 7). 더욱이, IL-2의 첨가는 관찰된 용해를 증가시키지 않았다(도 7). 유사한 효과가 PMN 매개 ADCC에 대해서도 관찰되었다(도 8).

본 발명자들은 또한 아이소트레티노인에 의한 신경아세포종 세포주의 처리가 GD2 발현에 영향을 줄 수 있음을 보여준다. 아이소트레티노인과 함께 4일간 인큐베이션한 후, IgA ch14.18의 결합은 증가되는 반면, MHC-I 발현은 안정하게 남아 있는 것으로 나타났다(도 9).

이들 실시예는 디누툭시맙의 IgA 동종형 변이체가 신경아세포종의 사멸에 대해 더 높은 ADCC 능력을 가지며, 보체 활성화는 갖지 않음을 보여준다. IgA 항-GD2 항체는 신경아세포종 세포의 파괴를 향상시키는 반면, 신경병증성 통증과 같은 부작용은 감소시킨다.

본 발명에서는, IgA로의 디누툭시맙의 동종형 전환이 디누툭시맙 항체의 독성 문제들 중 하나 이상에 대한 해결책을 제공한다는 것이 밝혀져 있다. 본 발명의 항체는 강력한 ADCC 활성을 제공하면서 동시에, 적어도 디누툭시맙 투여와 관련된 통증 문제를 감소시킨다. 본 발명의 항체는, 추측컨대 FcαR(CD89)을 통해, 호중구를 효율적으로 활성화시킨다. 이는 강력한 항-종양 반응을 발생시킨다. 본 발명의 항체에 대한 신경아세포종 세포의 감수성은, IgA 항-GD2가 동일한 가변 도메인을 갖는 IgG 동종형 변이체와 대비하여 신경아세포종에 대해 개선된 효능을 나타내고, 이와 동시에 치료 독성을 감소시킨다는 것을 보여준다. 이는 항-신경아세포종 면역요법을 상당히 개선한다.

항체 기능은 다수의 인자에 의해 지배된다. 인식되는 표적 및 에피토프는 중요한 역할을 하며, 이는, 표적이 존재하는 세포도 마찬가지이다. 항체의 이펙터 기능은 종종 항체의 동종형과 상관된다. 이것은 일반적인 규칙으로서 유용하지만, 많은 예외가 실제로 존재한다. 이는, 예를 들어, ADCC 활성에 대해서는 문헌[Rajasekaran et al (Rajasekaran et al., 2015; ImmunoTargets and Therapy Vol 4: 91)]에 의해, 그리고 CDC 활성에 대해서는 문헌[Lohse et al., 2017; Br J Haematol. doi:10.1111/bjh.14624dgf]; 및 문헌[Pascal, et al., (2012) Haematologica 97.11: 1686-1694]에 의해 예시되어 있다.

IgA로의 IgG의 전환은 항체와 상호작용하는 수용체를 변경시킬 수 있다. IgG의 경우, ITAM 모티프를 보유하는 활성화 Fc 감마 수용체(FcγR)가 백혈구의 항체 매개 활성화의 주요 매개체이다. 억제성 FcγR 및 FcγR에서의 다형성은 이들 효과를 방해한다. 이는 IgG 치료가 환자의 하위군에 대해 덜 적합해지게 할 수 있다. 본 발명자들 및 다른 사람들은 IgA가 또한 호중구, 단핵구 및 대식세포 상에서 발현되는 Fc 수용체인 FcαR을 통해 항-종양 효과를 발휘한다는 것을 보여주었다. 억제성 수용체 및 다형성은 FcαRI에 대해서는 보고되어 있지 않다. 그러나, FcαRI은 마우스에서 발현되지 않으며, 이는, 오랜 시간 동안 IgA 치료적 항체에 대해 필요한 전임상 생체내 연구를 불가능하게 하였다. 그러나, 본 발명자들의 실험실에서 인간 FcαRI 유전자도입 마우스를 생성하였다. 이 마우스는 인간에서와 같이 인간 FcαRI의 유사한 발현 패턴을 갖는다. 이들 마우스를 인간 종양의 성장을 위하여 관련 백그라운드, 즉, balb/c, C57B/L6, 및 SCID에서 역교배시켰다.

치료적 항체로서의 IgA.

IgA는 점막 항체로 알려져 있지만, 그의 단량체 형태에서, 그것은 인간 혈청에 존재하는 제2 부류의 항체이다. 이전 연구에서, 본 발명자들은 항-종양 항체 IgA가 시험관내에서 효과적일 수 있음을 보여주었다. 항-종양 기전은 상이하고, 가장 풍부한 유형의 백혈구인 호중구의 동원을 통해 주로 이루어진다. 또한, 생체내 IgA는 치료적 항체로서 효능이 있을 수 있다. IgA 분자의 결점은, 상이한 글리코실화 및 신생아 Fc 수용체, FcRn에 대한 결합의 결여로 인한, 그의 평균적으로 비교적 짧은 반감기이다. 본 발명은 GD2 특이적 IgA 항체에 대한 이러한 문제를, 이들에게 조정된 글리코실화 및 FcRn에 대한 IgA의 간접 표적화를 제공함으로써 해결한다(문헌[Meyer et al., 2016 MAbs Vol 8: pp 87-98]).

본 발명에서, 본 발명자들은 항-GD2 IgA 동종형 항체가 시험관내, 생체내 그리고 환자-유래 모델에서 신경아세포종을 표적화하고 있음을 보여준다.

실시예 2

ADCC를 유도하는 항-GD2 항체의 효능은, 표적으로서 생체외 신경아세포종 세포 및, ATCC로부터의, GD2 발현 신경아세포종 세포주(예를 들어, IMR-32, SH-SY5Y, SK-N-FI, LAN-5)의 추가의 패널에 대한 검정일 것이다. 게다가, 상기 패널은 종양-개시 세포를 포함할 것인데, 종양-개시 세포는 원발성 신경아세포종 샘플로부터 생성되었고, (문헌[Bate-Eya, et al., 2014; European journal of cancer 50.3: 628-637]에 기재된 바와 같은) 통상적인 화학요법에 대한 저항성의 원인이 되는 화학요법-저항성 세포 집단을 나타낼 수 있는 줄기 세포-유사 세포를 함유한다. 건강한 지원자 및 환자로부터의 전혈 및 단리된 이펙터 집단 둘 모두가 이펙터 세포로 사용될 것이다. 실제로는, 표적 세포를 2시간 동안 ⁵¹Cr로 표지할 것이다. PMN 및 PBMC를 Ficoll/Histopaque 분리에 의해 단리할 것이다. 후속으로, 이펙터 세포, 다양한 농도의 항체, 및 배지를 표적 세포가 담긴 미세적정 플레이트에 첨가할 것이다. E:T 비는 40:1(PMN) 및 50:1(PBMC)일 것이다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후에, ⁵¹Cr 방출을 분당 카운트(cpm) 단위로 측정할 것이다. 특이적 용해의 백분율을 Triton의 존재 하에서의 최대 용해와 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에서의 기저 용해를 결정함으로써 계산할 것이다.

신경아세포종 환자로부터 유래된 오가노이드에 대한 시험

본 발명자들은 원발성 신경아세포종 샘플로부터 종양-유래 오가노이드를 생성하였다. 종양-유래 오가노이드는 종양 이종성을 반영하고, 원발성 종양 조직을 나타내는 조직에 대해 이들 기능적 시험을 수행하는 것을 가능하게 한다. 본 발명자들은 이들 오가노이드에 IgA 디누툭시맙을 사용할 것이다. 본 발명자들은 C1q 및 iC3b 검출 항체를 사용하여 사멸 마커 및 보체 침착에 의해 ADCC 현미경적으로 결합을 평가할 것이다.

FcαR 유전자도입 마우스에서의 생체내 실험

생체내 실험을 위하여, 동계 모델, 이종이식편 모델 및 환자 유래 이종이식편(PDX) 모델을 사용할 것이다.

동계 모델의 경우, 본 발명자들은 동소적으로(orthotopically) 또는 피하에서 성장된 TH-MYCN 9464D-기반 동계 신경아세포종 마우스 모델을 사용할 것이다.

이종이식편 모델의 경우, 본 발명자들은 문헌[Bogenmann 1996 Int. J. Cancer Vol 67: 379]; 및 문헌[Raffaghello et al., 2003 Cancer Lett, Vol 197(1-2): p. 205-9]에 기재된 바와 같은, SCID 마우스 내에 이식된 HTLA-230 NB 세포를 사용할 것이다. 이전에, 항-GD2 항체 14G2a를 이 모델에서 시험하였으며, 그것은 매우 효율적으로 작용하였지만, 여전히 NK 세포 및 대식세포의 부재 하에서 이루어진 것으로 밝혀졌다(상기 문헌[Raffaghello et al., 2003]). 이는 호중구가 디누툭시맙을 위한 중요한 이펙터 세포라는 개념과 일치한다. 본 발명자들이 이들 마우스에서 IgA를 시험할 때, 본 발명자들은 본 발명자들의 실험실에서 이용가능한 SCID/FcαR 유전자도입 마우스를 사용할 것인데, 그 이유는, 마우스가 FcaR이 결여되어 있기 때문이다. 본 발명자들은 이들 유전자도입 SCID 마우스에서 IgG와 IgA의 효능을 비교할 것이다.

PDX 모델의 경우, 본 발명자들은 NSG 마우스(NOD/SCID/감마^널 마우스)를 사용할 것이다. 이들 모델은 환자 종양의 동소 위치결정, 증생 및 후속 처리를 가능하게 한다(문헌[Braekeveldt et al., 2016 Cancer Lett. Vol 1;375(2):384-9], doi: 10.1016/j.canlet.2016.02.046).

실시예 3

신경아세포종 환자 생존의 개선은 2015년에 확대되었는데, 이때에는 신경아세포종 세포 상에서 발현된, 그러나 또한 말초 및 중추 신경 조직 상에서도 발현된, 강글리오시드 GD2에 대해 유도된 IgG1 동종형의 키메라 항체인 ch14.18의 FDA 승인이 있었다. ch14.18은 조혈 줄기 세포 이식 후 고위험 신경아세포종의 치료를 위하여 IL-2, GM-CSF 및 11-시스 레틴산과 병용하여 2차 치료로서 제공된다. 대규모 III상 임상 시험(n = 226)에서, ch14.18 병용 요법은 치료 후 2년째에 표준 요법보다 20% 더 높은 무사건 생존, 및 10% 더 높은 전체 생존을 가져온 것으로 밝혀졌다(문헌[Yu et al. 2010, N Engl J Med 363(14): 1324-1334]). 면역요법의 포함이 신경아세포종 환자의 생존을 개선하였지만, ch14.18의 투여에 의해 야기되는 중요한 부작용이 있다. 이들 중, 심각한 신경병증성 통증이 가장 빈번하다(문헌[Yu et al. 2010, N Engl J Med 363(14): 1324-1334]). 이는 Aδ 및 C 통증 섬유 상의 GD2에 대한 ch14.18 결합에 의해 야기되는 것으로 여겨지며, 보체 시스템을 국부적으로 활성화시키는데, 이것이 관찰된 통증의 원인이 된다(문헌[Xiao et al 1997, Pain 69(1-2): 145-151]). 이러한 통증은 진통제에 잘 반응하지 않으며, 용량 제한적일 수 있다(문헌[Gilman et al 2009, J Clin Oncol 27(1): 85-91]).

ch14.18-항체-옵소닌화된 종양 세포는 백혈구 상의 Fc 수용체에 대한 항체 결합에 따라, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 통해 백혈구에 의해 사멸될 수 있다. ch14.18은 또한 종양 세포 표면 상의 보체 시스템을 활성화시켜, 보체-의존성 세포독성(CDC)을 통한 세포의 용해를 야기할 수 있다. IgG1 항체 요법에 의해 매개되는 ADCC의 경우에는, 자연 살해(NK) 세포가 ADCC를 매개하는 데 있어서 중요한 세포로 간주된다. 신경아세포종의 경우, 항-GD2 IgG1 항체로 치료될 때, 과립구가 또한 ADCC를 매개하는 데 역할을 한다는 증거가 있다(문헌[Bruchelt et al 1989, Immunol Lett 22(3): 217-220]; 문헌[Gilman et al 2009, J Clin Oncol 27(1): 85-91]; 문헌[Cheung et al 2012, J Clin Oncol 30(4): 426-432]).

결과

IgG1 및 IgA1 ch14.18의 생성 및 정제

ch14.18 가변 영역을 갖는 IgA1 항체와 IgG1 항체를 비교하기 위하여, 두 항체 모두를 자체적으로 생성하고 정제하였다. 모든 항체를 HP-SEC에 의해 분석하여 이들의 순도를 확인하였다. IgA1 ch14.18(도 13의 A) 및 IgG1 ch14.18(도 13의 B) 둘 모두는 단량체인 것으로 밝혀졌으며, 이때 순도는 95% 초과였다.

IgA1 ch14.18과 IgG1 ch14.18은 유사한 친화도로 GD2에 특이적으로 결합한다

다음으로, 신경아세포종 세포주의 패널에 대한 IgA1 및 IgG1 ch14.18의 결합을 결정하였다. 두 항체 모두는 GD2 발현 신경아세포종 세포주 IMR-32를 유사하게 인식한 반면, GD2 발현이 없는 GI-ME-N 세포주는 결합되지 않았다(도 14의 A). 동종형을 IgA1로 변화시킨 후에 이들 항체의 친화도가 변하지 않은 채로 유지되었는지의 여부를 확립하기 위하여, 리간드 트레이서(Ligand Tracer)를 사용하여 IMR-32 세포에 대해 실시간 세포-기반 친화도 측정을 수행하였다. 이들 항체는 2개의 상이한 농도(각각 10 및 20 nM)에서 동일한 회합 패턴을 근접하게 따르고, 또한 해리 단계에서 중첩된다. 이들 검정은 IMR32 세포에 대해 계산된 친화도가 IgA1과 IgG1 사이에 유의하게 상이하지 않았음을 나타낸다(3.8 nM 대 4.8 nM)(도 14의 B).

IgA1 및 IgG1 ch14.18 항체의 작용 기전

후속으로, 이들 항체의 시험관내 작용 기전을 비교하였다. ADCC 및 CDC 둘 모두가 생체내 신경아세포종에 대해 ch14.18에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이펙터 세포들의 혼합물에 대해 사멸을 비교하기 위하여, 이펙터 세포로서 백혈구를 사용하여 IMR-32, SK-N-FI 및 LAN-1 신경아세포종 세포주에 대해 ADCC 검정을 수행하였다. IgA 및 IgG 항체 둘 모두는 유사한 정도로 IMR-32 세포를 용해시킨 반면, SK-N-FI 및 LAN-1 세포는 IgA1 ch14.18의 경우에 더 우수하게 사멸시켰다(도 15의 A). FACS 상에서 검출가능한 GD2 발현을 갖지 않는 GI-ME-N 세포주는 둘 항체 모두에 의해 용해될 수 없었는데, 이는, GD2 발현이 ADCC에 대한 전제조건임을 나타낸다(데이터는 나타나 있지 않음). ADCC를 매개하는 데 있어서 소정의 백혈구 하위세트의 상대적 중요성을 평가하기 위하여, 이들 항체와 함께, 호중구 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이펙터 세포로서 별개로 사용하여 신경아세포종 세포주에 대한 그들 각각의 세포독성 능력을 결정하였다.

이펙터 세포로서 PBMC를 사용하는 경우, IgG1 ch14.18은 IMR32 세포를 효과적으로 용해시킨 반면, IgA 항체에 의한 용해는 그만큼 잘 수행하지 못하였다(도 15의 B). 이는 또한 2개의 다른 신경아세포종 세포주에 대해서도 관찰되었다(데이터는 나타나 있지 않음). 대조적으로, 호중구를 이펙터 세포로서 사용하였을 때, IgA ch14.18은 모든 시험된 세포주에 대해 IgG1과 대비하여 월등한 ADCC를 매개하였다(도 15의 B).

임상에서, ch14.18은 GM-CSF, IL-2 및 레틴산과의 병용 요법으로 투여된다. 다음으로, ADCC에 대한 이들 화합물의 영향을 두 항체 모두에 대해 평가하였다. PBMC를 이펙터 세포로 사용하는 경우, GM-CSF의 첨가는 IgG1에 의해 ADCC를 증가시키지 않았다. GM-CSF와 IL-2의 병용은 항체의 존재 없이도 세포 사멸의 미소한 증가로 이어졌는데, 이는, 항체와 무관하게 PBMC-매개 사멸의 증가를 보여준다. 마지막으로, 앞서의 병용물에 대해 24시간 동안 11-시스 레틴산의 전처리 추가는 IMR32 및 SK-N-FI 세포주에 대한 사멸의 추가의 증가를 보여주었다(도 15의 C). IgA의 경우, 항체 의존성 사멸이 PBMC에 의해 유도될 수 없었지만, IL-2의 존재 하에서 그리고 시스-레틴산과의 병용물의 존재 하에서 세포를 용해시켰는데, 이는, PBMC에 의한 신경아세포종 세포의 항체 비의존성 인식을 나타낸다(데이터는 나타나 있지 않음).

IgG1과 달리, IgA1 ch14.18과 병용된 GM-CSF는 이펙터 세포로서 호중구를 사용하여 ADCC를 증진시켰다(도 15의 C). IL-2의 존재는 호중구 매개 사멸을 추가로 증가시키지 않았지만, 11-시스-레틴산에 대한 사전노출로 최대 용해가 증가하였다. IgG1 항체의 경우, GM-CSF는 호중구에 의한 사멸을 약간 개선한 반면, IL-2 또는 레틴산의 첨가는 사멸을 추가로 향상시키지 않았다(데이터는 나타나 있지 않음).

마지막으로, CDC가 신경아세포종 세포 용해를 향상시킬 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 인간 풀링된 혈청으로 ADCC 검정을 보완하였다. IgG1 및 IgA1 ch14.18 둘 모두에 대하여, 혈청의 첨가 후에 유의한 용해 차이는 관찰되지 않았다(도 15의 D).

IgA1 ch14.18은 보체를 활성화하지 않는다

ch14.18에 의해 매개되는 제2 효과는 보체 시스템의 활성화이다. ch14.18은 시험관내에서 CDC를 통해 신경아세포종 표적 세포를 용해시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 ADCC 검정에서 사용된 것과 동일한 신경아세포종 세포주 패널에 대해 이들 항체에 의한 시험관내 보체 활성화를 평가하였다. IgG1 ch14.18은 15분 후에 CDC를 통해 SK-N-FI를 제외한 모든 시험된 신경아세포종 세포주를 용해시켰다(도 16의 A). 이와 반대로, IgA1 ch14.18의 경우에는 용해가 관찰될 수 없었다(도 16의 B). 1시간 동안의 더 오랜 인큐베이션으로, 용해의 양이 IgG1의 경우에는 추가로 증가하였지만, IgA1의 경우에는 세포가 7-AAD에 대해 음성으로 유지되었다(도 16의 A, 도 16의 B). SK-N-FI 상의 보체 조절 단백질 CD55 및 CD59의 양이 다른 시험된 신경아세포종 세포주 상에서보다 유의하게 더 높기 때문에, 이 세포주는 보체 매개 용해의 경향이 더 적은 것으로 보인다(도 16의 C).

IgA1은 IgG1 ch14.18과 대비하여 생체내에서의 종양 세포 고갈이 탁월하다

마지막으로, 본 발명자들은 2개의 동계 마우스 모델에서 생체내에서 GD2 발현 세포를 사멸시키는 항체의 능력을 분석하였다. 국부화된 종양에 대한 모델로서, 동물에게 GD2를 천연적으로 발현하는 EL4 세포를 복막내로 주사하였다. 24시간의 증생 후, 동물을 IgA1 또는 IgG1로 처리하였다. 종양 세포의 증생을 항체의 주사 후 24시간째에 평가하였다. 두 항체 모두가 평균 종양 부하를 감소시켰지만, 2개의 이펙터 기전 중 단지 하나만을 갖는 IgA에 의한 처리가 더 효과적이었다(도 17의 A).

두 번째 전신 마우스 모델에서는, 더 오랜 기간 동안 종양 세포 사멸을 평가하였다. EL4 세포를 정맥내 주사하였다. 세포의 주사 직후에, 종양 세포는 폐에 국부화되었으며, 이는 생체발광 이미징에 의해 관찰된 바와 같다(데이터는 나타나 있지 않음). 3일간의 처리 후, IgA1 및 IgG1 둘 모두는 종양 세포를 제거한 반면, PBS로 처리된 마우스에서는 세포가 여전히 존재하였다(도 17의 B) 생체발광 이미징에 의해 마우스의 복부에서 증생이 관찰되었다(데이터는 나타나 있지 않음).

항-GD2-IgA1은 통증을 유도하지 않는다

GD2에 대해 유도된 IgG1 항체의 주요 제한은 치료 후에 가벼운 접촉에 대한 증가된 민감성이다. IgA에 의한 보체 활성화의 결여가 이러한 문제를 경감시킬지의 여부를 시험하기 위하여, 마우스에서 생체내 통증 실험을 수행하였다. 본 프레이 모발에 의한 자극 후의 발 움츠림 역치를 이질통에 대한 척도로서 결정하였다.

IgA1과 IgG1의 반감기 사이의 차이를 보정하기 위하여, 24시간째에 저용량의 IgG1(20 ㎍)(100 ㎍의 IgA 용량에 상응함) 또는 고용량의 IgG1(100 ㎍) 중 어느 하나를 마우스에 복막내 주사하였다(도 18의 A). 24시간 후에 혈청 중에서 다시 발견되는 항체 농도는 ch14.18 처리 후 임상 표현형과 일치한다. 20 ㎍의 IgG1 ch14.18에 의한 처리는 회피 역치의 유의한 감소를 나타내었는데, 이는 48시간 후에 기저선으로 되돌아왔다. IgG1의 아-치료적(sub-therapeutic) 용량(4 ㎍)은 회피 역치의 유의한 감소로 이어지지 않았다. IgG1과 달리, IgA1의 모든 시험된 용량은 발 움츠림 역치를 감소시키지 않았는데, 이는, IgA1이 IgG와 비견되는 수준에서 이질통을 유도하지 않음을 나타낸다(도 18의 B). 형광 표지 IgA1 및 IgG1 ch14.18 항체를 정맥내 주사하였을 때에도 유사한 결과를 얻었다. 여기서도 또한, IgG1 ch14.18은 회피 역치를 감소시킨 반면, IgA1 ch14.18은 그렇지 않았다(도 18의 C).후속으로, 이들 항체의 결합을 좌골 신경에 대해 평가하였다. 항체 노출은 20 ㎍의 IgG1 및 100 ㎍의 IgA1 ch14.18에 대해 유사한 정도로 관찰되었으며, 혈청 중에 존재하는 항체의 양에 상응하였다(도 18의 D). 항-CD20 항체 리툭시맙은 좌골 신경 상에서 검출되지 않았다. GD2의 생체외 염색은 직접 표지된 항체로부터의 신호와 중첩되었다.

키트

조작된 항체 또는 이의 단편의 조성물을 포함하는 키트가 본 명세서에 제공된다. 보체 반응의 감소, 예컨대 보체 활성화의 감소를 위한 키트가 또한 본 명세서에 개시될 수 있다, 암, 병원체 감염, 면역 장애 또는 동종이계 이식의 치료를 위한 키트가 또한 본 명세서에 개시될 수 있다. 일 실시 형태에서, 키트는 단위 투여 형태의 조작된 항체의 유효량을 함유하는 치료적 또는 예방적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 조작된 항체 또는 이의 단편의 치료적 조성물이 담길 수 있는 멸균 용기를 포함하며; 그러한 용기는 박스, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩(blister-pack), 또는 당업계에 알려진 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 그러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이팅된 종이, 금속 포일, 또는 약제를 유지하기에 적합한 다른 재료로 제조될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 항체 및 이의 단편은 독성, 보체-관련 독성, 암, 병원체 감염, 면역 장애 또는 동종이계 이식을 갖거나 이것이 발생될 위험이 있는 대상체에게 항체 또는 이의 단편을 투여하기 위한 설명서와 함께 제공될 수 있다. 설명서는 일반적으로 독성, 부작용, 암, 병원체 감염, 면역 장애 또는 동종이계 이식을 치료하기 위해 조성물을 이용하는 투여 방법의 사용에 관한 정보를 포함할 수 있다.

논의

고위험 신경아세포종에 대한 ch14.18의 승인은 신경아세포종 환자의 생존의 개선으로 이어졌다. 그럼에도 불구하고, 신경아세포종에 대한 IgG1 항체 요법은 하기와 같은 주요 제한을 갖게 된다: 신경병증성 통증 및 이질통과 같은 심각한 부작용의 존재. 본 발명자들은 IgG1로부터 IgA1로의 ch14.18의 동종형의 변경이 이러한 항체-유도 이질통을 소실시킬지의 여부를 조사하였다.

본 발명은 IgA1 ch14.18이 놀랍게도 호중구 매개 ADCC를 통해 강한 항-종양 효과를 제공하고, 생체내에서 이질통을 유도하지 않는다는 것을 보여준다. 길항제에 의한 C5a 수용체의 차단은 이질통을 완전히 정지시켰다(문헌[Sorkin et al 2010, Pain 149(1): 135-142]). 지금까지, 몇몇 접근법이 ch14.18에 의해 야기된 부작용을 개선하기 위해 착수되었다. 첫 번째 접근법은 ch14.18의 C1q-결합 부위를 돌연변이시키는 것이었다(K322A). 이러한 돌연변이는 ch14.18의 보체 활성화를 소실시키는 것으로 여겨진다(문헌[Sorkin et al 2010, Pain 149(1): 135-142]). 이러한 접근법은 단지 보체 활성화를 감소시켰을 뿐이며, 그 결과, 잔류 통증은 남아 있었다. 또한, 이러한 항체에 의한 I상 임상 시험에서는, 통증 형태의 등급 3 내지 4 독성이 환자의 68%에서 발생하였다(문헌[Navid et al 2014, J Clin Oncol 32(14): 1445-1452]).

ch14.18 유도 이질통을 피하기 위한 다른 접근법은, 오로지 신경아세포종 세포 상에만 존재하고 말초 신경 조직 상에는 존재하지 않는 GD2(O-아세틸-GD2)의 차등적으로 글리코실화된 변이체를 항체 c.8B6에 의해 표적화함으로써 수행하였다(문헌[Terme et al 2014, PLoS One 9(2): e87210]). 항체 c.8B6은 통증 섬유 주위에서 보체 활성화를 유도하지 않지만, 이 항체는 덜 효과적일 것으로 예상된다.

ch14.18의 유래가 되는 모 마우스-항체인 14.18에 대한 최초의 보고서에는, 과립구가 신경아세포종에 대한 효과를 매개한다는 것에 주목하였다(문헌[Bruchelt et al (1989); Immunol Lett 22(3): 217-220]). 이후에, 그들의 사멸 잠재력은 GM-CSF의 첨가에 의해 향상될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 임상 연구에서, 과립구의 활성화는 신경아세포종에 대한 항체 요법의 우수한 결과에 대한 지표인 것으로 밝혀졌다(문헌[Cheung et al (2012); J Clin Oncol 30(4): 426-432]). GM-CSF와의 동시처리 이외에도, 치료 목적을 위해 이 표적 세포 집단을 추가로 끌어들일 접근법이 결여되어 있다.

호중구 매개 사멸에 대한 신경아세포종 세포의 고유의 취약성 다음으로, 현재의 치료 프로토콜의 시기는 또한 호중구가 이펙터 세포로서 사용되는 접근법에 유리하다. 이제는, 환자에게 골수제거 계획이 처방되고, 이후에 자가 줄기 세포 이식이 뒤따른다(문헌[Yu et al. (2010). N Engl J Med 363(14): 1324-1334]). 그 직후에, 면역요법 프로토콜이 시작된다. 호중구는 종종 생리학적 수준으로 회복되는 제1 백혈구 집단이며, 이에 따라 그러한 면역-손상된 상태에서 활성화하기에 매력적인 백혈구 하위세트이다. 25% 미만의 환자가 면역요법의 순간에 NK 세포에 적절한 면역 재구성에 도달하였다(문헌[Nassin et al 2018, Biol Blood Marrow Transplant 24(3): 452-459]). NK 세포 대신에 호중구가 처리되는 접근법의 경우, 치료적 변동성이 감소될 것이다.

본 발명에서는, IgA 매개 사멸이 GM-CSF의 첨가에 의해 개선된다는 것을 알아내었다.

IL-2는 IgA 또는 IgG 매개 사멸을 개선하는 것으로 여겨지지 않는다. ch14.18로 치료된 GD2-발현 흑색종 및 육종 환자에서 효과가 관찰된 후에, IL-2를 임상 계획에 추가하였다. 그러나, 신경아세포종 요법에 대한 IL-2의 효과는 불명확한 상태로 남아 있다. 이는, IL-2를 동반한 면역요법과 IL-2를 동반하지 않은 면역요법을 비교한 임상 시험에 의해 추가로 강조된다(문헌[Ladenstein et al 2013 MAbs 5(5): 801-809]). 상기 저자들은 IL-2의 첨가가 EFS 또는 OS에 유의한 효과를 미치지 않았고, 독성으로 인한 조기 종료가 IL-2 시험군에서 유의하게 더 높았음을 보여준다.

IgA1은 C1q 결합 부위가 결여되어 있지만, IgA의 보체 활성화가 기록되어 있다. MBL 경로는 중합체 IgA에 의해 활성화되는 것으로 밝혀진 반면, 고전적인 보체 경로는 CD20에 대해 유도된 단량체 IgA에 대해 촉발되었다(문헌[Roos et al; 2001; J Immunol 167(5): 2861-2868] 및 문헌[Lohse, Loew et al; 2018; Br J Haematol 181(3): 413-417]). 그럼에도 불구하고, IgA1 ch14.18은 신경아세포종 세포주의 CDC를 유도하지 않았으며, 마우스에서 보체-의존성 이질통을 유도하지 않았다.

이질통은 IgA로 해결될 수 있지만, 이펙터 기전으로서의 보체가 또한 손실된다. 본 발명에서는, 놀랍게도, 치료적 효과의 예상된 손실이 발생하지 않았음을 보여주었다. 생체내 종양 모델에서, 실제로 IgA가 종양 세포를 사멸시키는데 있어서 적어도 IgG만큼 효율적이라는 것을 알 수 있다. 항-GD2 항체에 의한 생체내 보체 소비가 입증되어 있는데, 이는 보체 활성화가 일어난다는 것을 나타낸다(문헌[Cheung at al 2014, Int J Cancer 135(9): 2199-2205]).

본 발명자들의 연구에서는, IgG1과 대비하여 5배의 양의 IgA를 마우스에 투여하여, 마우스에서의 이들 2개의 항체간의 반감기의 차이를 조정하였다. 유사한 뉴런 노출 및 혈청 농도가 이들 2개의 항체에 의해 달성될 수 있었다. 더 장기간의 모델의 경우, IgA1의 다회 용량을 주사하여 이를 고려하였다. IgA의 생체내 반감기가 인간에서 대략 1주이지만, 향후의 비교를 개선하기 위해 마우스에서 IgA의 반감기를 개선하기 위한 몇몇 접근법이 착수될 수 있다(문헌[Morell et al, 1973, Clin Exp Immunol 13(4): 521-528]). 아시알로당단백질 수용체에 결합함으로써 IgA의 글리코실화를 감소시켜 제거율을 저하시킬 수 있다. 다수의 IgA 글리코실화 부위의 침묵은 이미 이전에 달성되었으며, 이는 개선된 약동학적 특성으로 이어졌다(문헌[Lohse et al, 2016, Cancer Res 76(2): 403-417]). IgG와는 대조적으로, IgA는 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 상호작용하지 않는다. 따라서, 내피 세포에 의해 음세포작용된 항체는 리소좀 경로를 통해 분해된다. 알부민 및 IgG1 항체 둘 모두는 이 수용체에 결합함으로써 분해로부터 구조된다. IgA는 이전에 C-말단 알부민-결합 부위의 도입에 의해 FcRn 결합을 용이하게 하도록 변형되었으며, 이는 그의 약동학적 프로파일 및 항-종양 효과를 개선하였다(문헌[Meyer et al, 2016 MAbs 8(1): 87-98]).

본 발명은 ch14.18 IgA가 단일 분자에서 개선된 호중구 활성화 및 이질통 극복의 효과 둘 모두를 제공함을 보여준다. 본 발명자들의 전임상 데이터는 IgA가 부작용 없이 IgG보다 더 높은 용량으로 투여될 수 있음을 보여준다.

재료 및 방법

항체 생성, 단리 및 품질 제어

ch14.18의 가변 중쇄 및 경쇄 서열은 BLA(Biologic License Application) 125516으로부터 유래되었다. 가변 중쇄 서열은 IgA1 또는 IgG1 중쇄를 코딩하는 Lonza 발현 벡터(pEE14.4) 내로 클로닝하였으며, 한편 가변 경쇄 서열은 카파 경쇄를 코딩하는 Lonza 발현 벡터(pEE14.4) 내로 클로닝하였다. 제조자의 설명서에 따라 293Fectin 형질감염 시약을 사용하여, 중쇄, 경쇄 및 pAdvantage(수탁 번호 U47294; Promega)를 코딩하는 벡터로 HEK293F 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 단량체 항체를 생성하였다.

플러스 크로마토그래피 시스템(GE Lifesciences)에 커플링된 단백질 A 컬럼(Hi-trap 단백질 A)을 사용하여 IgG1 항체를 정제하였다. 결합된 항체를 0.1 M 소듐 아세테이트(pH 2.5)로 용리시키고, 1 M TRIS-HCl(pH 8.8)로 중화시켰다. 용리액을 PBS에 대해 투석시켰다. IgA1 항체를 카파 경쇄 친화성 크로마토그래피 컬럼(Hi-trap kappaSelect)을 사용하여 정제하고, 0.1 M 글리신 완충액(pH 2.5)으로 용리시켰다. 이동상으로서 PBS를 사용하여 실시되는 SEC 컬럼 상에 용리액을 적용하였다. 단량체 IgA를 함유하는 분획을 수집하고, 100 KDa 스핀 컬럼을 사용하여 농축시켰다. 모든 항체를 0.22 μm 필터로 여과하였다. 280 nm에서의 검출과 함께, 이동상으로서 100 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl(pH 6.8)을 사용하여 HP-SEC(Yarra 3u SEC-2000 컬럼)에 의해 이들 항체의 순도 및 안정성을 분석하였다.

항체의 형광 표지

정제된 항체를 교반하면서 N-하이드록시-석신이미딜-FITC와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션함으로써 플루오레세인으로 표지하였다. 결합되지 않은 NHS-플루오레세인을 제조자의 설명서에 따라 Sephadex 컬럼(NAP-5, GE-Healthcare)을 사용함으로써 제거하였다. 항체를 제조자의 설명서에 따라 Alexa Fluor-488 항체 표지화 키트(ThermoFisher)로 표지하였다.

세포주

모든 신경아세포종 세포주를 5% CO₂를 함유하는 가습된 인큐베이터 내에서 37℃에서 HEPES, Glutamax, 10% 태아 송아지 혈청, 1x 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지 중에서 배양하였다. HEK293F 세포를 8% CO₂를 함유하는 회전식 진탕기 플랫폼을 갖는 가습된 인큐베이터 내에서 37℃에서 FreeStyle 293 발현 배지 중에서 배양하였다.

결합 검정

100.000개의 신경아세포종 세포를 96웰 플레이트 내에서 플레이팅하고, 1500 RPM으로 2분 동안 원심분리하였다. 세포를 세척하고, 몇몇 농도의 플루오레세인-표지 항체와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세포를 1500 RPM으로 2분 동안 원심분리하고, 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다. 세포에 결합된 항체의 양을 유세포측정(BD FacsCanto II, BD)에 의해 정량화하였다.

세포 기반 친화도 측정

1x10⁶개의 IMR32 신경아세포종 세포를 타원 형상의 10 cm 배양 접시의 측면 상에 플레이팅하고, 플레이트에 부착시키기 위하여 하룻밤 인큐베이션하였다. 후속으로, 플레이트를 배양 배지로 세척하고, LigandTracer 장치(Ridgeview Instruments)에 옮겼다. 10 nM의 플루오레세인-표지 항체를 세포에 첨가하고, 1시간 동안 회합을 측정하였다. 이후에, 항체 농도를 20 nM로 증가시켜, 1시간 동안 더 높은 항체 농도에서 회합을 평가하였다. 마지막으로, 항체 함유 용액을 항체가 없는 배지로 대체함으로써 해리를 측정하였으며, 해리를 2시간 동안 측정하였다. 항체의 친화도를 TraceDrawer 소프트웨어(Ridgeview Instruments)를 통해 계산하였다.

ADCC 검정

ADCC를 이전에 기재된 바와 같이 정량화하였다(문헌[Brandsmaet al; 2015; Cancer Immunol Res 3(12): 1316-1324]). 간단히 말하면, 24시간 동안 10 μM 11-시스-레틴산으로 전처리되거나 전처리되지 않은 표적 세포를 2시간 동안 3.7 MBq ⁵¹Cr로 표지하였다. 이후에, 세포를 3회 세척하여 과량의 크롬을 제거하였다. ADCC를 위한 혈액을 UMC 위트레흐트(Utrecht)에서 건강한 공여자로부터 입수하였다. 백혈구 단리를 위하여, 혈액을 30초 동안 데미워터(demiwater)와 함께 인큐베이션하여 적혈구를 용해시켰다. 이후에, 10x PBS를 첨가하여 생리학적 오스몰랄 농도를 회복시켰다. 세포를 배지 중에 세척하고, 원래의 혈액 부피에 상응하는 배지 중에 재현탁시켰다. 웰당 사용되는 백혈구의 수는 용해 전에 50 μl의 혈액 중에 존재하는 백혈구의 수에 상응한다. PMN 및 PBMC 단리의 경우, Ficoll/Histopaque 1119 층의 상부에 혈액을 첨가하고, 제동 없이 1500 RPM으로 25분 동안 원심분리하였다. 이후에, PBMC 및 PMN을 혈청과 Ficoll 사이의 중간상으로부터 또는 Histopaque 층 내에서 각각 수집하였다. 이펙터-대-표적(E:T) 비는 PBMC의 경우 80:1이고, PMN의 경우 40:1이었다. 이펙터 세포, 다양한 농도의 항체, GM-CSF와 IL-2, 및 방사성 표지 종양 세포를 둥근바닥 미세적정 플레이트(Corning Incorporated)에 첨가하고, 5% CO₂를 함유하는 가습된 인큐베이터 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 1500 RPM으로 2분 동안 원심분리하고, 50 μl의 상층액을 LumaPlate에 옮겼다. 베타-감마 계수기 내에서 방사성 신호(cpm 단위)를 정량화하였다. 특이적 용해를 식 ((실험 cpm - 기저 cpm)/(최대 cpm - 기저 cpm)) × 100을 사용하여 계산하였으며, 이때 최대 용해는 표지 세포를 2.5% Triton과 함께 인큐베이션함으로써 결정하였고, 기저 방출은 항체 및 이펙터 세포의 부재 하에서 결정하였다.

CDC 검정

10⁵개의 신경아세포종 세포를 미세적정 플레이트에 첨가하고, 실온에서 다양한 농도의 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 풀링된 인간 혈청(8명의 상이한 건강한 공여자로부터의 것)을 15%의 농도로 첨가하고, 1시간 또는 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 세포를 세척하고, 15분 동안 7-AAD로 염색하였다. 세포 용해를 나타내는 7-AAD 흡수를 유세포측정에 의해 정량화하였다.

마우스 혈청 중의 항체 농도 결정

MaxiSorp 96웰 ELISA 플레이트를 PBS 중에 희석된 0.5 ㎍/ml 염소 IgG 항-인간 카파로 하룻밤 코팅하였다. 다음으로, 플레이트를 PBS 중 0.05% TWEEN 20(PBST)으로 3회 세척하고 PBST 중 1% BSA와 함께 인큐베이션함으로써 1시간 동안 블로킹하였다. 혈청 샘플을 PBST 중 1% BSA 중에 1:2000으로 희석시켜 웰에 첨가하고, 실온에서 1.5 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 PBST로 3회 세척하였다. HRP-표지 항-인간 IgA 또는 HRP-표지 항-인간 IgG를 사용하여, 인간 IgA 또는 인간 IgG를 각각 결합시켰다. 플레이트를 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS)으로 10분 동안 현상시키고, 415 nm에서 분광광도계 상에서 판독하였다.

동물 및 동물 실험

마우스를 위트레흐트 대학(University of Utrecht)의 동물 시설에서 유지하였다. 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스(Janvier) 둘 모두를 사용하여 실험을 수행하였다. 마우스를 12:12 명암 주기 하에서 그룹에 수용하였으며, 이때 먹이와 물은 자유롭게 이용가능하였다. 실험 시작 전 적어도 1주 동안 마우스를 순응화하였다. 샘플 크기를 실험 설계 시점에서 전력 해석(power analysis)을 사용하여 계산하였다.

IgG1 ch14.18, IgA1 ch14.18 또는 이들의 형광 표지 변이체의 정맥내 주사 후 마우스에서, 이전에 앞서 기재된 바와 같은 업-앤-다운 방법(문헌[Eijkelkamp et al; 2016; J Neurosci 36(28): 7353-7363])과 함께 본 프레이 시험을 사용하여 기계적 역치를 결정하였다(미국 일리노이주 우드 데일 소재의 Stoelting). 간략하게 말하면, 보정된 본 프레이 모발 모노필라멘트(Stoelting)를 사용하여 기계적 통각을 시험하였다. 먼저, 마우스를 금속 메시 바닥을 갖는 투명 박스 내에서 15 내지 20분 동안 순응시켰다. 본 프레이 모발 모노필라멘트를 메시 바닥을 통해 뒷발의 발바닥 피부에 적용하였다. 미처리 동물에서 반응을 유발하지 않는 0.02 mg 본 프레이 모발의 일련의 6회 적용에 대한 반응으로 발 회피의 총 횟수로서 기계적 통각을 측정하였다(문헌[Alessandri-Haber et al., 2006; J Neurosci. 2006 Apr 5;26(14):3864-74]). 실험에서는, 좌측 및 우측 발의 평균을 독립적인 측정치로서 간주하였다. 바이어스를 최소화하기 위하여, 동물들을 실험 시작 전에 상이한 그룹에 무작위로 배정하였으며, 모든 실험은 처리에 대해 맹검 상태인 실험자들에 의해 수행되었다. 실험의 종료 시점에서, 마우스를 경추 탈구에 의해 안락사시켰다. 기계적 역치를 48시간 동안 평가하였다.

항체의 생체내 효능을 평가하기 위하여, 마우스에 5x10⁶개의 GD2 발현 EL4 세포를 복막내 주사하여 (ATCC)를 발현시켰다. 1일 후에, 마우스에 100 ㎍의 IgG1 ch14.18, 또는 100 ㎍의 IgA1 ch14.18을 복막내 주사하였다. 2일 후에, 혈액을 채취하고, 마우스에 루시페린을 주사하고, 생물발광 분석을 거쳤다. 이후에, 마우스를 경추 탈구에 의해 안락사시켰다.

뉴런에 결합하는 GD2 항체를 20 ㎍ 또는 100 ㎍의 Alexa-488 표지 IgG1 ch14.18 또는 20 ㎍의 IgA1 ch14.18의 i.v. 주사에 의해 시각화하였다. 좌골 신경을 단리하고, 크라이오스탯 동결박편기(cryostat cryotome)를 사용하여 10 μm 두께의 슬라이스를 제조하고, 슬라이드 상에 놓았다. 슬라이드를 4% PFA 중에 10분 동안 고정시키고 세척하였다. 마지막으로, 슬라이드를 DAPI로 대비염색하고, 세척하고, FluorSave로 처리하였다. 슬라이드를 4℃에서 하룻밤 건조시키고, 형광 현미경법으로 이미지를 촬영하였다.

SEQUENCE LISTING <110> UMC Utrecht Holding B.V. <120> Anti-GD2 antibody for the treatment of neuroblastoma <130> P115607PC00 <140> PCT/NL2018/050629 <141> 2018-09-21 <150> EP 17192476.4 <151> 2017-09-21 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3f8 heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F8 light chain <400> 2 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 100 105 110 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 115 120 125 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 130 135 140 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 145 150 155 160 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 165 170 175 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Val Tyr Ala Cys Glu Val 180 185 190 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 195 200 205 Glu Cys 210 <210> 3 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-GD2 antibody ch14.18 heavy chain <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-GD2 antibody ch14.18 light chain <400> 4 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody C-terminus <400> 5 Val Asp Gly Thr Cys Tyr 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated antibody C-terminus <400> 6 Val Asp Gly Thr 1 <210> 7 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of antibody ch14.18 heavy chain <400> 7 gaagtgcagc tgctgcagag cggcccggaa ctggaaaaac cgggcgcgag cgtgatgatt 60 agctgcaaag cgagcggcag cagctttacc ggctataaca tgaactgggt gcgccagaac 120 attggcaaaa gcctggaatg gattggcgcg attgatccgt attatggcgg caccagctat 180 aaccagaaat ttaaaggccg cgcgaccctg accgtggata aaagcagcag caccgcgtat 240 atgcatctga aaagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt attattgcgt gagcggcatg 300 gaatattggg gccagggcac cagcgtgacc gtgagcagc 339 <210> 8 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of antibody ch14.18 light chain <400> 8 gaaattgtga tgacccagag cccggcgacc ctgagcgtga gcccgggcga acgcgcgacc 60 ctgagctgcc gcagcagcca gagcctggtg catcgcaacg gcaacaccta tctgcattgg 120 tatctgcaga aaccgggcca gagcccgaaa ctgctgattc ataaagtgag caaccgcttt 180 agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggca ccgattttac cctgaaaatt 240 agccgcgtgg aagcggaaga tctgggcgtg tatttttgca gccagagcac ccatgtgccg 300 ccgctgacct ttggcgcggg caccaaactg gaactgaaa 339 <210> 9 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA2.0 heavy chain <220> <221> CDS <222> (1)..(1017) <400> 9 gca tcc ccg acc agc ccc aag gtc ttc ccg ctg agc ctc gac agc acc 48 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr 1 5 10 15 ccc caa gat ggg aac gtg gtc gtc gca tgc ctg gtc cag ggc ttc ttc 96 Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 ccc cag gag cca ctc agt gtg acc tgg agc gaa agc gga cag ggc gtg 144 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 acc gcc aga aac ttc cca cct agc cag gat gcc tcc ggg gac ctg tac 192 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 acc acg agc agc cag ctg acc ctg ccg gcc aca cag tgc cca gac ggc 240 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 65 70 75 80 aag tcc gtg aca tgc cac gtg aag cac tac acg aat ccc agc cag gat 288 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 gtg act gtg ccc tgc cga gtt ccc cca cct ccc cca tgc tgc cac ccc 336 Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 100 105 110 cga ctg tcg ctg cac cga ccg gcc ctc gag gac ctg ctc tta ggt tca 384 Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser 115 120 125 gaa gcg aac ctc acg tgc aca ctg acc ggc ctg aga gat gcc tct ggt 432 Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly 130 135 140 gcc acc ttc acc tgg acg ccc tca agt ggg aag agc gct gtt caa gga 480 Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly 145 150 155 160 cca cct gag cgt gac ctc tgt ggc tgc tac agc gtg tcc agt gtc ctg 528 Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu 165 170 175 cct ggc tct gcc cag cca tgg aac cat ggg gag acc ttc acc tgc act 576 Pro Gly Ser Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr 180 185 190 gct gcc cac ccc gag ttg aag acc cca cta acc gcc acc ctg tca aaa 624 Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys 195 200 205 tcc gga aac aca ttc cgg ccc gag gtc cac ctg ctg ccg ccg ccg tcg 672 Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 210 215 220 gag gag ctg gcc ctg aac gag ctg gtg acg ctg acg tgc ctg gca cgt 720 Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg 225 230 235 240 ggc ttc agc ccc aag gat gtg ctg gtt cgc tgg ctg cag ggg tca cag 768 Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln 245 250 255 gag ctg ccc cgc gag aag tac ctg act tgg gca tcc cgg cag gag ccc 816 Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro 260 265 270 agc cag ggc acc acc acc ttc gct gtg acc agc ata ctg cgc gtg gca 864 Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala 275 280 285 gcc gag gac tgg aag aag ggg gac acc ttc tcc tgc atg gtg ggc cac 912 Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His 290 295 300 gag gcc ctg ccg ctg gcc ttc aca cag aag acc atc gac cgc ttg gcg 960 Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala 305 310 315 320 ggt aaa ccc acc cat gtc aat gtg tct gtt gtc atg gcg gag gtg gac 1008 Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp 325 330 335 ggc acc tga 1017 Gly Thr <210> 10 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr 1 5 10 15 Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro 100 105 110 Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser 115 120 125 Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly 130 135 140 Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu 165 170 175 Pro Gly Ser Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr 180 185 190 Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 210 215 220 Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg 225 230 235 240 Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro 260 265 270 Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala 275 280 285 Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His 290 295 300 Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala 305 310 315 320 Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp 325 330 335 Gly Thr <210> 11 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgA2m(1) <400> 11 Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp 1 5 10 15 Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly 20 25 30 Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln 35 40 45 Asn Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp 50 55 60 Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro 65 70 75 80 Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser 85 90 95 Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys 100 105 110 His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu 115 120 125 Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala 130 135 140 Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val 145 150 155 160 Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser 165 170 175 Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr 180 185 190 Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile 195 200 205 Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro 210 215 220 Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu 225 230 235 240 Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly 245 250 255 Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln 260 265 270 Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg 275 280 285 Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val 290 295 300 Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg 305 310 315 320 Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu 325 330 335 Val Asp Gly Thr Cys Tyr 340 <210> 12 <211> 356 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIgA1 <400> 12 Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ser Thr Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly 20 25 30 Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln 35 40 45 Gly Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp 50 55 60 Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu 65 70 75 80 Ala Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser 85 90 95 Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro 100 105 110 Ser Pro Ser Thr Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro 115 120 125 Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser 130 135 140 Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly 145 150 155 160 Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly 165 170 175 Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu 180 185 190 Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr 195 200 205 Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys 210 215 220 Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser 225 230 235 240 Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg 245 250 255 Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln 260 265 270 Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro 275 280 285 Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala 290 295 300 Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His 305 310 315 320 Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala 325 330 335 Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp 340 345 350 Gly Thr Cys Tyr 355 <210> 13 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> higA2.0 <400> 13 Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp 1 5 10 15 Ser Thr Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly 20 25 30 Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln 35 40 45 Gly Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp 50 55 60 Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro 65 70 75 80 Asp Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser 85 90 95 Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys 100 105 110 His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu 115 120 125 Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala 130 135 140 Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val 145 150 155 160 Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser 165 170 175 Val Leu Pro Gly Ser Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr 180 185 190 Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu 195 200 205 Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro 210 215 220 Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu 225 230 235 240 Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly 245 250 255 Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln 260 265 270 Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg 275 280 285 Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val 290 295 300 Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg 305 310 315 320 Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu 325 330 335 Val Asp Gly Thr 340

Claims (53)

1. 항-강글리오시드 GD2 항체로서,
   상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 항체 가변 도메인 및 항체 불변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은 적어도 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항-강글리오시드 GD2 항체는 IgA 힌지 및 C_H2 도메인을 포함하는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 가변 도메인은 적어도 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가변 도메인은 항체 ch14.18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IgA C_H1 도메인, IgA C_H3 도메인 또는 이들의 조합을 포함하는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgA 도메인 또는 힌지 영역은 인간 IgA 도메인 또는 인간 IgA 힌지 영역인, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 인간 IgA 도메인 또는 인간 IgA 힌지 영역은 인간 IgA1 도메인 또는 인간 IgA1 힌지 영역인, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 적절한 시험관내(in vitro) 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 검정에서 측정될 때 항체 디누툭시맙보다 더 많은 ADCC를 나타내는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 시험관내 보체-의존성 세포독성(CDC) 검정에서 측정될 때 항체 디누툭시맙보다 더 적은 CDC를 나타내는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 시험관내 보체-의존성 세포독성(CDC) 검정에서 측정될 때 항체 디누툭시맙의 CDC의 20% 이하를 나타내는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
   
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄에 부착된 알부민-결합 도메인(ABD) 또는 ZFcRN 펩티드를 포함하는, 항-강글리오시드 GD2 항체.
    
11. GD2 양성 종양을 갖거나 GD2 양성 종양을 가질 위험이 있는 대상체의 치료 방법으로서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체의 치료량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 대상체에서 상기 GD2 양성 종양 세포 내의 강글리오시드 GD2를 상향조절하는 데 유효한 양으로 레틴산을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
    
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 이들의 조합을 상기 대상체 내의 과립구의 수를 증가시키기에 유효한 양으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
    
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역:
    EVQLLQSGPE LEKPGASVMI SCKASGSSFT GYNMNWVRQN IGKSLEWIGA IDPYYGGTSY NQKFKGRATL TVDKSSSTAY MHLKSLTSED SAVYYCVSGM EYWGQGTSVT VSS;
    및 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법:
    EIVMTQSPAT LSVSPGERAT LSCRSSQSLV HRNGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIHKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP PLTFGAGTKL ELK.
    
15. 대상체에서 면역글로불린 G(IgG) 관련 부작용의 감소에 사용하기 위한 조작된 항체 또는 이의 단편으로서,
    a) 면역글로불린 G(IgG)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및
    b) 면역글로불린 A(IgA)의 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은 비견되는 양의 상응하는 IgG 항체의 투여와 대비하여 상기 대상체에 투여 시에 적어도 하나의 부작용의 감소를 가져오는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
16. 제15항에 있어서, IgG의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
17. 제15항에 있어서, 상기 IgA의 불변 영역의 일부분을 포함하며, 상기 일부분은 힌지 영역 또는 불변 영역을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
18. 제17항에 있어서, 상기 IgA의 힌지 및 불변 영역을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 불변 영역은 상기 IgA의 불변 중쇄 및 불변 경쇄를 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
20. 제17항에 있어서, 상기 IgA의 불변 영역 또는 이의 일부분은 힌지 및 불변 중쇄 도메인을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 키메라화된 것이거나, 인간화된 것이거나, 인간의 것이거나, 또는 비인간의 것인, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 영역 또는 이의 일부분은 인간의 것인, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부작용은 선천성 면역 반응을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
24. 제23항에 있어서, 상기 선천성 면역 반응은 보체 반응을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
25. 제24항에 있어서, 상기 보체 반응은 FcγR 또는 C1q에 대한 항체 결합을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 부작용의 감소는 유세포측정, 시험관내 검정(in vitro assay), 또는 이들의 조합을 수행함으로써 결정되는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
27. 제26항에 있어서, 상기 유세포측정은 세포 용해, 결합, 세포 사멸, 수용체 발현, 또는 이들의 조합을 결정하는 것을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 유세포측정은 세포의 생/사 염색(live/dead staining)을 결정하는 것을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험관내 검정은 ELISA, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포독성(CDC), 용혈 검정, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 투여 시에 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 상응하는 IgG 항체와 대비하여 증가된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 감소된 보체-의존성 세포독성(CDC)을 가져오는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
31. 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 부작용의 감소는, 비견되는 양의 상응하는 IgG 항체의 투여와 대비하여 상기 적어도 하나의 부작용의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 감소를 포함하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
32. 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 항원 세포 또는 암 세포 상에 존재하는 표적에 결합하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
33. 제15항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 뇌-전이성 암 유래 표적에 결합하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
34. 제15항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 GD2 양성 암 또는 CD20 양성 암에 결합하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
35. 제34항에 있어서, 상기 GD2 양성 암은 신경아세포종, 망막아세포종, 흑색종, 소세포 폐암, 교아세포종, 골육종, 횡문근육종, 유잉 육종, 지질육종, 섬유육종, 또는 평활근육종인, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
36. 제15항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 신경아세포종 세포에 결합하는, 조작된 항체 또는 이의 단편.
    
37. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조작된 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
    
38. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조작된 항체 또는 이의 단편 및 이의 사용 설명서를 포함하는, 키트.
    
39. 조작된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 조작된 항체 또는 이의 단편은
    a) 면역글로불린 G(IgG)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및
    b) 면역글로불린 A(IgA)의 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하며, 상기 투여하는 단계는 비견되는 양의 상응하는 IgG 항체의 투여와 대비하여 상기 대상체에서 부작용의 감소를 가져오는, 방법.
    
40. 제39항에 있어서, IgG의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는, 방법.
    
41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 IgA의 불변 영역 또는 이의 일부분은 상기 IgA의 힌지 또는 불변 영역을 포함하는, 방법.
    
42. 제41항에 있어서, 상기 불변 영역 또는 이의 일부분은 상기 IgA의 힌지 및 불변 영역을 포함하는, 방법.
    
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 불변 영역은 상기 IgA의 불변 중쇄 및 불변 경쇄를 포함하는, 방법.
    
44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgA의 불변 영역 또는 이의 일부분은 상기 IgA의 힌지 및 불변 중쇄 도메인을 포함하는, 방법.
    
45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 키메라화된 것이거나, 인간화된 것이거나, 인간의 것이거나, 또는 비인간의 것인, 방법.
    
46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 영역 또는 이의 일부분은 인간의 것인, 방법.
    
47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부작용은 선천성 면역 반응을 포함하는, 방법.
    
48. 제47항에 있어서, 상기 선천성 면역 반응은 보체 반응을 포함하는, 방법.
    
49. 제47항에 있어서, 상기 보체 반응은 상기 대상체에서 통증, 이질통, 통각과민 또는 증강된 민감성을 가져오는, 방법.
    
50. 제48항에 있어서, 상기 보체 반응은 FcγR 또는 C1q에 대한 항체 결합을 포함하는, 방법.
    
51. 제39항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계는 비견되는 양의 상기 상응하는 IgG 항체를 투여하는 것과 대비하여 감소된 보체-의존성 세포독성(CDC)을 포함하는, 방법.
    
52. 대상체에서 면역글로불린 G(IgG) 투여와 관련된 통증 또는 이질통을 감소시키는 방법으로서,
    대상체에서 IgG 관련 부작용의 감소에 사용하기 위한 조작된 항체 또는 이의 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은
    면역글로불린 G(IgG)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및
    면역글로불린 A(IgA)의 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은 비견되는 양의 상응하는 IgG 항체의 투여와 대비하여 상기 대상체에 투여 시에 통증 또는 이질통의 감소를 가져오는, 방법.
    
53. 대상체에서 면역글로불린 G(IgG) 투여로부터 발생되는 보체 활성화를 감소시키는 방법으로서,
    대상체에서 IgG 관련 부작용의 감소에 사용하기 위한 조작된 항체 또는 이의 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은
    면역글로불린 G(IgG)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 및
    면역글로불린 A(IgA)의 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함하며, 상기 조작된 항체 또는 이의 단편은 비견되는 양의 상응하는 IgG 항체의 투여와 대비하여 상기 대상체에 투여 시에 보체 활성화의 감소를 가져오는, 방법.
    

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