KR20200061573A - 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20200061573A
KR20200061573A KR1020180147036A KR20180147036A KR20200061573A KR 20200061573 A KR20200061573 A KR 20200061573A KR 1020180147036 A KR1020180147036 A KR 1020180147036A KR 20180147036 A KR20180147036 A KR 20180147036A KR 20200061573 A KR20200061573 A KR 20200061573A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
water
aggregates
amino acids
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020180147036A
Other languages
English (en)
Inventor
박봉환
김혜주
김영수
백승엽
Original Assignee
아밀로이드솔루션 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아밀로이드솔루션 주식회사 filed Critical 아밀로이드솔루션 주식회사
Priority to KR1020180147036A priority Critical patent/KR20200061573A/ko
Publication of KR20200061573A publication Critical patent/KR20200061573A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

아밀로이드성 질병의 치료용 또는 예방용 약학적 조성물과 이를 구성하는 펩타이드가 제공된다. 아밀로이드성 질병의 치료용 약학적 조성물은 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로, 상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 기능적 펩타이드 단편인 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함한다.

Description

신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물{NEW PEPTIDE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME}
본 기재는 신규 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아밀로이드 베타(amyloid beta)의 응집을 분해하거나 응집을 억제하는 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
인간 아밀로이드 베타(이하 Aβ)는 뇌 내에서 작용하여 아밀로이드성 질병의 원인이 된다. Aβ는 아밀로이드 단백질 전구체(APP)에서 유래된 39~43개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드이다. 아밀로이드 단백질 전구체(APP, Amyloid Pre Protein)는 β-, γ-분해효소(β-, γ-secretase) 에 의하여 순차적으로 Aβ40 또는 Aβ42 모노머(monomer)로 분해된다. 이후 Aβ40 또는 Aβ42 모노머는 집적하여 Aβ올리고머(oligomer)를 형성하고, 이들 올리고머가 집적하여 Aβ피브릴(fibril)을 형성하고, 이들 피브릴이 집적하여 Aβ플라크(plaque)를 형성한다. Aβ는 올리고머가 되는 상태부터 뇌에 강한 신경 독성을 나타내어 뇌세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다.
그러나 현재까지 개발된 아밀로드이성 질병 치료제의 대다수는 환자에게 면역 반응을 일으키는 Aβ 단편(fragment) 또는 Aβ 내의 특정 에피토프(epitope)에 대한 항체를 사용하거나 케미컬 의약품을 적용하는 방식을 채용하고 있다. 그러나 면역 반응을 일으키는 Aβ 단편 또는 항체를 사용하는 방식의 경우에는 뇌혈관 장벽 투과율이 낮고 면역원성에 의한 ARIAs(Amyloid-Related Imaging Abnormalities) 등의 부작용 문제로 임상개발에 어려움이 있다. 또한, 케미컬 의약품의 경우에는 현재까지 아밀로이드성 질병에 대한 근복적인 치료제는 부재한 상태이다.
본 개시는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 수용성 Aβ응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 분해(disaggregate)할 수 있는 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 개시는 Aβ 모노머, 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 Aβ 모노머, 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 집적을 억제(inhibit aggregation)할 수 있는 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 개시는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 이들을 분해할 수 있는 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하여 아밀로이드성 질병을 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 개시는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 이들의 집적을 억제할 수 있는 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하여 아밀로이드성 질병을 예방할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
실시예들에 따른 아밀로이드성 질병의 치료용 약학적 조성물은 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로, 상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 기능적 펩타이드 단편인 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함한다.
실시예들에 따른 아밀로이드성 질병의 예방용 약학적 조성물은 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로, 상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편인 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함한다.
실시예들에 따른 펩타이드는 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로, 상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편이다.
실시예들에 따른 펩타이드를 사용하여 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 응집을 분해할 수 있다.
실시예들에 따른 펩타이드를 사용하여 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 응집을 억제할 수 있다.
기타 본 발명의 측면들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
실시예들에 따른 펩타이드는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 이들을 효과적으로 분해하거나 집적을 억제할 수 있다.
실시예들에 따른 펩타이드는 천연의 Aβ40 또는 Aβ42와 유사한 아미노산을 포함하기 때문에 Aβ에 대한 특이성이 강하고, 작용기작이 명확하고, 뇌혈관장벽(BBB)을 통과하기가 쉽고, 계면활성제 등 화학물질 또는 자외선 등 광 자극에 일부 또는 전부 구조 변성률이 낮아 안정성이 뛰어나며, 종래의 케미컬 의약품과 같은 예상치 못한 부작용이 발생할 가능성이 매우 낮다.
실시예들에 따른 약학적 조성물은 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 이들을 분해하거나 집적을 억제할 수 있는 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하여 Aβ로 유도된 세포 독성을 경감시키고, 신경세포 사멸을 억제할 수 있으므로 아밀로이드성 질병의 예방 또는 치료가 가능하다.
도 1 내지 도 6은 실시예들에 따른 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 분해(disaggregate)하거나 집적을 억제(inhibit aggregation)하는 펩타이드의 구성을 설명하기 위한 모식도들이다.
도 7 내지 도 9는 실험예들에 따른 펩타이드와 비교 제조예에 의해 제조된 펩타이드의 Aβ응집분해 효과를 측정한 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 10 내지 도 12는 실험예들에 따른 펩타이드와 비교 제조예에 의해 제조된 펩타이드의 Aβ응집억제 효과를 측정한 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 13은 P101(0117)가 Aβ에 직접 결합하는 결과를 나타내는 실험결과이다.
도 14a 내지 도 14d는 P101(0117)의 투여가 Aβ플라크를 분해하는 결과를 나타내는 실험결과이다.
도 15a 내지 도 15d는 P101(0117)가 Aβ로 유발된 신경 세포 사멸을 억제하는 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16a 내지 도 16e는 P101(0117) 처리가 Aβ투여 마우스 모델의 공간 작업성 기억과 인지 기억 손상을 개선하는 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 실시예들에 대하여 상세히 설명한다. 실시예는 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구체적인 실시예로만 한정되지 않는다.
신규 펩타이드 (New Peptide)
도 1 내지 도 6에 예시되어 있는 바와 같이 신규 펩타이드는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 분해(disaggregate)하거나 집적을 억제(inhibit aggregation)하는데 효과적인 구조로 구조화된다.
수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체는 Aβ 올리고머, Aβ 프로토피브릴(protofibril), Aβ 피브릴(fibril), Aβ 플라크(plaque) 등을 포함한다.
신규 펩타이드는 링크 코어(LC)에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편(functional peptide fragment, FPF)이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드이다. 즉 링크 코어(LC)를 기준으로 다수의 기능적 펩타이드 단편(FPF)이 각각의 자유 말단을 가지고 자유롭게 유동하여 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 직접 결합할 수 있기 때문에 모노머로 이루어진 펩타이드 단편 대비 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 매우 효과적으로 분해하거나 효과적으로 집적을 억제할 수 있다.
링크 코어(LC)와 기능적 펩타이드 단편(FPF)의 결합은 직접적인 결합 또는 간접적인 결합 모두 가능하다. 도 1 및 도 2에 예시되어 있는 바와 같이 링크 코어(LC)에 기능적 펩타이드 단편이 직접적으로 결합될 수도 있고, 도 3 내지 도 6에 예시되어 있는 바와 같이 기능적 펩타이드 단편(FPF)과 링크 코어(LC)가 펩타이드 아암(Peptide Arm, PA)를 통해 간접적으로 결합될 수도 있다.
링크 코어(LC)는 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편(FPF)과 직접적 또는 간접적으로 결합하기 위해서 두 개 이상의 아미노기를 가지는 아미노산 또는 두 개 이상의 카르복실기를 가지는 아미노산으로 이루어질 수 있다. 두 개 이상의 아미노기를 가지는 아미노산은 Lys(K) 또는 Arg(R) 일 수 있다. 특히 Lys(K)일 수 있다. 두 개 이상의 카르복실기를 가지는 아미노산은 Asp(D) 또는 Glu(E) 일 수 있다.
펩타이드 아암(PA)은 기능적 펩타이드 단편(FPF)이 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 분해하거나 집적을 억제하는 기능을 보다 원할하게 수행하거나 이들 기능을 방해지 않기 위해서 알짜 전하(net charge)가 0인 펩타이드 및/또는 플렉서블한 펩타이드일 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 아암(PA)을 구성하는 Z는 글라이신(Gly, G) 또는 세린(Ser, S) 일 수 있다. 나아가 펩타이드 아암(PA)은 GGGS 서열을 반복단위로 포함하는 4 내지 16개의 아미노산을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 아암(PA)은 플렉서블한 정도를 고려할 때 GGGSGGGS 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다. 물론 펩타이드 아암(PA) 없이도 기능적 펩타이드 단편(FPF)의 기능성이 충분히 담보된다면 펩타이드 아암(PA)은 생략될 수도 있다.
기능적 펩타이드 단편(FPF)은 최대 17개의 아미노산으로 이루어진다. 도 1 내지 도 6에서는 천연 Aβ1~17과 동일 서열(SEQ ID NO : 1)을 예시하고 있으나 기능적 단편은 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 서열이면 가능하다. 도 1 내지 도 6 에 예시되어 있는 바와 같이 적어도 10개 이상의 아미노산은 인접한(contiguous) 서열을 구성할 수 있다.
적어도 10개 이상의 아미노산은 비인접한(non-contiguous) 서열을 구성할 수 있다.
적어도 10개 이상의 아미노산이 인접한 서열을 구성할 경우에는 기능적 펩타이드 단편(FPF)은 SEQ ID NO : 1~36의 서열 중 어느 하나의 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다.
적어도 12개 이상의 아미노산이 비인접한 서열을 구성할 경우에는 SEQ ID NO : 37 내지 9310의 서열 중 어느 하나의 서열을 가지는 펩타이드일 수 있다.
적어도 10개 내지 11개의 아미노산이 비인접한 서열을 구성하는 서열은 아래 표 1에 구체적인 서열로 기재하지는 않았으나 Xaa 사이에 연속된 아미노산이 2개 이상이거나 N말단이나 C말단으로 연속된 아미노산이 2개 이상 존재하는 조합이 적합할 수 있다.
나아가 Xaa의 위치가 N 말단으로부터 1,3,7,11 위치인 경우에는 극 산성인 아미노산이 적합할 수 있다.
SEQ ID
천연
Aβ1~17과
유사한
아미노산수		 SEQUENCE
NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1 17 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
2 16 Xaa Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
3 16 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa
4 15 Xaa Xaa Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
5 15 Xaa Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa
6 15 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Xaa Xaa
7 14 Xaa Xaa Xaa Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
8 14 Xaa Xaa Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Xaa
9 14 Xaa Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Xaa Xaa
10 14 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Xaa Xaa Xaa
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
Figure pat00024
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
Figure pat00036
Figure pat00037
Figure pat00038
Figure pat00039
Figure pat00040
Figure pat00041
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
Figure pat00046
Figure pat00047
Figure pat00048
Figure pat00049
Figure pat00050
Figure pat00051
Figure pat00052
Figure pat00053
Figure pat00054
Figure pat00055
Figure pat00056
Figure pat00057
Figure pat00058
Figure pat00059
Figure pat00060
Figure pat00061
Figure pat00062
Figure pat00063
Figure pat00064
Figure pat00065
Figure pat00066
Figure pat00067
Figure pat00068
Figure pat00069
Figure pat00070
Figure pat00071
Figure pat00072
Figure pat00073
Figure pat00074
Figure pat00075
Figure pat00076
Figure pat00077
Figure pat00078
Figure pat00079
Figure pat00080
Figure pat00081
Figure pat00082
Figure pat00083
Figure pat00084
Figure pat00085
Figure pat00086
Figure pat00087
Figure pat00088
Figure pat00089
Figure pat00090
Figure pat00091
Figure pat00092
Figure pat00093
Figure pat00094
Figure pat00095
Figure pat00096
Figure pat00097
Figure pat00098
Figure pat00099
Figure pat00100
Figure pat00101
Figure pat00102
Figure pat00103
Figure pat00104
Figure pat00105
Figure pat00106
Figure pat00107
Figure pat00108
Figure pat00109
Figure pat00110
Figure pat00111
Figure pat00112
Figure pat00113
Figure pat00114
Figure pat00115
Figure pat00116
Figure pat00117
Figure pat00118
Figure pat00119
Figure pat00120
Figure pat00121
Figure pat00122
Figure pat00123
Figure pat00124
Figure pat00125
Figure pat00126
Figure pat00127
Figure pat00128
Figure pat00129
Figure pat00130
Figure pat00131
Figure pat00132
Figure pat00133
Figure pat00134
Figure pat00135
Figure pat00136
Figure pat00137
Figure pat00138
Figure pat00139
Figure pat00140
Figure pat00141
Figure pat00142
Figure pat00143
Figure pat00144
Figure pat00145
Figure pat00146
Figure pat00147
Figure pat00148
Figure pat00149
Figure pat00150
Figure pat00151
Figure pat00152
Figure pat00153
Figure pat00154
Figure pat00155
Figure pat00156
Figure pat00157
Figure pat00158
Figure pat00159
Figure pat00160
Figure pat00161
Figure pat00162
Figure pat00163
Figure pat00164
Figure pat00165
Figure pat00166
Figure pat00167
Figure pat00168
Figure pat00169
Figure pat00170
Figure pat00171
Figure pat00172
Figure pat00173
표 1의 SEQ ID NO : 1 ~ 9310 에서 Xaa는 20개의 아미노산 중 선택된 어느 하나의 아미노산이거나 해당 위치의 아미노산이 결실된 경우를 나타낸다. 나아가 Xaa의 위치가 N 말단으로부터 1, 3, 7, 11 위치인 경우에는 극 산성인 아미노산(polar acidic amino acid)이 적합할 수 있다. 극 산성인 아미노산으로는 Asp, Glu 등이 적합할 수 있다. N 말단으로부터 5, 6, 13, 14, 16 위치인 경우에는 극 염기성인 아미노산(polar basic amino acid)이 적합할 수 있다. 극 염기성인 아미노산으로는 Asn, Gln, His, Lys, Arg 등이 사용될 수 있다. N 말단으로부터 2, 12, 17 위치인 경우에는 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid)이 적합할 수 있다. 소수성 아미노산으로는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp 등이 사용될 수 있다.
도 1 내지 도 4에 예시된 바와 같이 신규 펩타이드가 기능적 펩타이드 단편(FPF)을 2개 포함하는 경우에는 신규 펩타이드는 하기 일반식 1로 표시되는 펩타이드 다이머일 수 있다.
[일반식 1]
FPF-PAx-LC-PAx-FPF
상기 식 중 FPF는 천연 Aβ1~17 과 적어도 10개 이상의 아미노산 서열이 동일한 서열을 가지는 펩타이드이고,
상기 PA는 4 내지 16개의 아미노산을 갖는 펩타이드이고,
상기 x는 0 또는 1이고,
상기 LC는 적어도 2개 이상의 아미노기를 가지는 아미노산이다.
신규 펩타이드가 화학적으로 합성된 경우에는 링크 코어(LC)가 C 말단을 기능적 펩타이드 단편(FPF)의 자유 말단이 각각 N 말단을 구성한다.
신규 펩타이드가 바이오 합성된 경우에는 링크 코어(LC)가 펩타이드의 중간에 위치하고, 기능적 펩타이드 단편(FPF)의 자유 말단 중 하나는 N 말단이고, 다른 하나는 C 말단일 수 있다.
도 5에 예시된 바와 같이 신규 펩타이드가 기능적 펩타이드 단편(FPF)을 3개 포함하는 경우에는 신규 펩타이드는 하기 일반식 2로 표시되는 펩타이드 트라이머(trimer)일 수 있다.
[일반식 2]
Figure pat00174
상기 식 중, FPF는 천연 Aβ1~17 과 적어도 10개 이상의 아미노산 서열이 동일한 서열을 가지는 펩타이드이고,
상기 PA는 4 내지 16개의 아미노산을 갖는 펩타이드이고,
상기 x는 0 또는 1이고,
상기 LC는 적어도 2개 이상의 아미노기를 가지는 아미노산이다.
도 6에 예시된 바와 같이 신규 펩타이드가 기능적 펩타이드 단편(FPF)을 4개 포함하는 경우에는 신규 펩타이드는 화학식 3으로 표시되는 펩타이드 테트라머(tetramer)일 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00175
상기 식 중, FPF는 천연 Aβ1~17 과 적어도 10개 이상의 아미노산 서열이 동일한 서열을 가지는 펩타이드이고,
상기 PA는 4 내지 16개의 아미노산을 갖는 펩타이드이고,
상기 x는 0 또는 1이고,
상기 LC는 적어도 2개 이상의 아미노기를 가지는 아미노산이다.
SEQ ID NO : 1 ~ 41038로 표시된 기능적 펩타이드 단편(FPF)은 다이머, 트라이머, 테트라머를 구성하는 펩타이드를 설명하였으나, 기능적 펩타이드 단편(FPF)이 모노머 상태로도 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 분해(disaggregate)하거나 집적을 억제(inhibit aggregation)할 수 있다.
상기 펩타이드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하며, 실시예들에 따른 펩타이드를 구성하는 아미노산은 이들을 모두 포함할 수 있다. 펩타이드는 변이체를 포함하는 것으로, 자연적 변이 또는 인공적 변이에 의하여 주요 활성에 변화를 주지 않으면서 펩타이드 구조의 일부가 변이된 것을 포함할 수 있다.
펩타이드 제조
실시예들에 따른 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 합성할 수 있다. 상세하게는 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 제조되거나, 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 무세포 단백질 합성법 등과 같은 바이오 합성을 통하여 제조될 수 있다.
화학적 합성을 사용할 경우에는 펩타이드를 Schroder and Lubke 저, 「The Peptides」제1 권, Acadmeic Press, New York (1965) 등에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있고, 용액상 합성 또는 고체상 합성 등의 방법에 의해 제조할 수 있다. 펩타이드 결합을 형성하기 위한 방법의 예는 아실아지드법 아실하라이드법, 아실이미다졸법, 카르보디이미드법, 포스포니움법, 무수물법, 혼합무수물법, 산화-환원법, 및 Woodward 시약 K 를 사용하는 방법 등이 있다. 축합 반응을 수행하기 전에, 반응에 관여하지 않은 카르복실기, 아미노기 등을 보호시킬 수 있고, 축합 반응에 관여하는 카르복실기 등을 당 분야에 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있다. 카르복실기를 보호하는 기의 예는 메틸, 티-부틸, 아릴, 펜타플루오로페닐, 벤질, 파라-메톡시벤질, 또는 메톡시에톡시메틸 같은 에스테르-형성기를 들 수 있다. 아미노기를 보호하는 기의 예는 트리틸카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐, 트리클로로에틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 티-부톡시카르보닐, 및/또는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 등을 들 수 있다. 카르복실기의 활성 형태의 예는 혼합무수물, 아지드, 아실클로라이드 또는 활성 에스테르[알코올 (예를 들어, 펜타클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알코올, p-니트로페놀, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드로옥시프탈아미드, 또는 1-히드록시벤조트리아졸)과의 에스테르] 등을 들 수 있다. 펩타이드 결합을 형성하기 위한 축합 반응에 사용할 수 있는 용매는 벤젠, 톨루엔, 헥산, 아세톤, 니트로 메탄, 시클로 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸슬폭시드, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란, 물, 메탄올, 또는 에탄올 등의 단일 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 반응 온도는 반응에 일반적으로 사용되는 약 -70℃ 내지 100℃의 범위일 수 있고, 보다 바람직하게는 -30℃ 내지 30℃의 범위일 수 있다. 펩타이드 보호기를 제거하는 반응은 보호기의 종류에 따라 다르지만, 펩타이드 결합에 아무런 영향을 주지 않고 보호기를 이탈시킬 수 있는 산화합물, 염기화합물, 또는 전이금속 등을 이용하여 제거할 수 있다. 보호기를 산처리 예를 들어, 염화 수소, 브롬화수소, 플루오르화수소, 아세트산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산, 트리메틸클로로실란, 또는 이들의 혼합물로 처리함으로써 제거시킬 수 있다. 산처리로 보호기를 제거하는 반응을 수행할 때, 아니솔, 페놀 및 티오아니솔 등을 보조제로 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 보호기를 염기처리 예를 들어, 암모니아, 디에틸아민, 히드라진, 몰포린, 엔-메틸피롤리딘, 피페리딘, 탄산나트륨, 또는 이들 염기의 혼합물을 이용하여 제거할 수 있다. 보호기를 전이금속처리 예를 들어, 아연, 수은, 팔라듐/수소 등을 이용하여 제거할 수 있다. 반응 완결 후, 통상적인 펩타이드 정제 방법 예를 들어, 추출, 층 분리, 고체침전, 재결정 또는 컬럼 크로마트그래피에 의해 펩타이드를 정제할 수 있다.
약제학적 제제, 제형, 조성물
실시예들에 따른 펩타이드는 염기의 형태(base form) 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태(pharmaceutically acceptable salt)로 존재할 수도 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 해당 화합물과 유기산 또는 무기산의 조합에 의해 얻어진 염을 지칭한다. 염의 예로는 염산염, 황산염, 인산염, 초산염, 구연산염, 주석산염, 숙신산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 또는 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있다.
실시예들에 따른 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열 등을 추가로 포함할 수 있다. 실시예들에 따른 펩타이드는 당 사슬 화합물, 지질 화합물, 핵산 화합물, 다른 종류의 펩타이드 또는 단백질 등을 포함할 수 있다. 실시예들에 따른 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭(prodrug), 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다. 실시예들에 따른 펩타이드는 나노파티클이나 리포좀 등의 다양한 제형(formulation)에 탑재될 수 있고, 상기 제형의 내외부 표면에 연결되어 다양한 형태를 가질 수 있다
실시예들에 따른 약제학적 조성물은 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염으로 이루어진 활성 약제학적 유효성분과 함께 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제와 함께 제제화할 수 있다. 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다. 또한, 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다.
약학제 조성물 제제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 첨가제와 함께 주사제, 좌제, 분말, 경피투여용 패치제 등의 다양한 제형으로 만들어질 수 있다.
약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 첨가제는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 적용될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용가능한 첨가제에는 D5W(물 중에서 5% 포도당), 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액 등을 포함하며, 병소 내 국소주사의 경우 치료 효과를 증진시키고 지속시간을 증가시키기 위하여 여러 가지 주사가능한 하이드로겔(hydrogel)을 사용할 수 있다. 또한 약학적으로 이용가능한 첨가제는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염, 억제제, 또는 조성물은 해당분야의 적절한 방법으로 제형화할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA(최근판) 등에 개시되어 있는 방법을 참조하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.
실시예들에 따른 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 생리 식염수 용액으로 보관할 수 있고, 약제학적 첨가제 또는 부형제 등을 첨가 후 앰플(ample)에 동결 건조시킬 수 있으며, 이것을 투여하기 위해 사용할 때는 생리 식염수 등에 용해시켜 주사제로 사용할 수 있다.
아밀로이드성 질병 예방, 개선 또는 치료제로서의 용도
실시예들에 따른 펩타이드는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체를 매우 효과적으로 분해하거나 효과적으로 집적을 억제할 수 있다. 따라서, 실시예들에 따른 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 그의 염을 약제학적 성분으로 포함하는 조성물은 Aβ의 집적(aggregation)에 기인한 아밀로이드성 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 예방이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 치료란 조성물의 투여로 질병이 호전(개선)되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
아밀로이드성 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병 등을 예시로 들 수 있으나 Aβ의 집적(aggregation)에 기인한 질병이라면 어느 질병이라도 대상이 될 수 있다.
특히, 실시예들에 따른 펩타이드가 시험관 내(in vitro)에서 Aβ의 분해 및 응집 억제를 일으켜서(도7 내지 도 12 참조) Aβ로 인해 유도된 독성을 감소시킨다는 것을 확인하였을 뿐만 아니라(도 15a 내지 15d 참조), 실시예들에 따른 펩타이드의 정맥 투여가 APP/PS1 형질 전환 마우스 모델의 뇌에서 Aβ플라크를 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 14a 내지 14d 참조). 또한 Aβ투여를 통해 유도된 AD 마우스 모델에 실시예들에 따른 펩타이드들 투여했을 때 세포사멸 신호전달(apoptotic signaling) 조절을 통해 Aβ유도된 세포 독성을 경감시킬 수 있음을 확인할 수 있었고(도 15a 내지 15d 참조), 인지기능 저하를 개선하는 효과를 보임을 확인하였다(도 16a 내지 16e 참조). 이러한 결과들은 실시예들에 따른 펩타이드가 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 질환 치료를 위한 약제학적 조성물의 활성 약제학적 성분(Active Pharmaceutical Ingredient)이 될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 기재는 실시예들에 따른 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 투여하여 아밀로이드성 질병을 치료할 수 있다. 포유류는 실시예들에 따른 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 투여하여 아밀로이드성 질병이 억제 또는 감소될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 또는 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다. 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 특별히 제한되지 않지만, 장 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
실시예들에 따른 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 주로 비경구적인 방법으로, 예를 들면 국소주사, 정맥 또는 피하주사, 대뇌실내 또는 척수강내 투여, 경피투여, 혹은 경비투여 또는 직장내 투여로 투여한다. 투여량은 성인(체중 60kg) 기준일 수 있으나, 체중, 신체 상태 등에 달라질 수 있음은 당연하다
기타 용도
실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염은 퇴행성 신경질환을 진단하는데도 동일하게 이용할 수 있다. 진단 방법의 경우 실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 조성물을 샘플과 반응시키는 단계, 및 펩타이드 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 조성물과의 반응 전과 후의 샘플 내 베타아밀로이드 농도를 비교하는 단계를 통해서 퇴행성 신경질환의 존재 여부를 진단할 수 있다.
예를 들어, 분석대상이 되는 샘플과 실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 조성물을 반응시키기 전과 후의 농도를 비교하여, 퇴행성 신경질환을 진단할 수 있다. 구체적으로, (a) 실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 조성물을 샘플(혈액 또는 혈장 등)에 투여하기 전의 Aβ의 제1 농도를 측정하고, (b) 실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 조성물을을 샘플에 투여한 후의 Aβ의 제2 농도를 측정하고, (c) 측정한 제1 농도와 제2 농도를 비교하여, 제2 농도가 높으면 퇴행성 신경질환으로 진단할 수 있다. 이 때 사용될 수 있는 샘플은 혈액, 혈장, 혈청뿐만 아니라, 뇌척수액, 타액, 소변, 눈물, 콧물 등과 같은 모든 형태의 바이오 유체(bio-fluid)를 포함할 수 있다.
이와 같은 진단용 조성물 및 진단방법은 체외진단(in vitro) 뿐만 아니라 체내진단(in vivo)에도 적용 가능하다. 예를 들어, 실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 조성물을 체내에 투여하기 전과 후의 Aβ의 농도를 비교하여, 진단하는 것이 가능하다. Aβ의 농도는 이미징 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 진단 방법은 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 알려진 다양한 모든 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 제2014-0128265호, 대한민국 공개특허 제2014-0128266호 등에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
실시예들에 따른 펩타이드 또는 그의 염은 인지장애 예방을 위한 건강기능식품 등과 같은 식품 조성물로 사용될 수도 있다. 식품 조성물로 적용될 경우에는 통상의 식품 조성물과 같이 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예들을 제시하나, 하기 실험예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
펩타이드 제조
제조예 1: P101(0117) (NH 2 - SEQ ID NO:1 - GGGSGGGS - εK ( COOH )- GGGSGGGS - SEQ ID NO:1(parallel) -NH 2 ) 제조
아민부분이 보호기로 보호된 라이신(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)(1.1 mmol)을 2 ㎖의 DMF:DCM (Dimethylformamide:dichloromethane=1:1 부피비) 혼합용액에 용해시킨 후 156 ㎕의 DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 첨가한 다음 2분 동안 초음파 수조에서 활성화시켰다. 그 후 진탕된 혼합물에 0.051 g의 DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 용해시키고 상기 혼합물을 카트리지에서 부풀어 오른 레진(TentaGel R PHB 0.125 mmol, 기질)에 1시간 동안 진탕함으로써 무수 커플링 반응을 수행하여 레진과 라이신을 결합하였다. 반응이 완료된 레진은 DMF, DCM 및 DMF 순으로 각 20초 동안 세척하였다.
레진에 결합된 라이신의 Fmoc을 제거하기 위해 20% 피페리딘 (1:4 피페리딘/DMF, v/v) 6 ㎖ 으로 15분씩 2회 진탕하여 제거하였다.
한편, Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 H2N-GGGSGGGS-COOH 아미노산 서열을 가진 펩타이드 아암(2.2 mmol) 및 SEQ ID 1 (Aβ 1~17)의 기능적 펩타이드 단편(2.2mmol)을 서열의 순서에 따라, 0.2 M 아미노산 5 ㎖, 1.0 M oxyma 1 ㎖ 및 0.5 M DIC 2 ㎖을 순서대로 넣어 반응시킨 후 50분 동안 보호기가 제거된 상기 라이신과 반응시켰다
각각 반응 과정 동안 기질이 결합된 펩타이드-기반 레진을 DMF, DCM 및DMF 순으로 각각 20초 동안 세척하고, 상기 Fmoc-보호기를 20% 피페리딘 (1:4 피페리딘/DMF, v/v) 6 ㎖ 으로 15분씩 2회 진탕하여 제거하였다.
상기 과정을 모두 거친 후 Fmoc-보호기가 제거되어 완성된 기질이 결합된 단백질 다이머는 DCM으로 세척하고, 감압하에 보관한 후 TFA/anisole/TIS(95:2.5:2.5, v/v/v)로 4시간 진탕하여 레진과 단백질 다이머를 분리한 다음 TFA를 감압농축기를 이용하여 완전히 제거하였다. 그 후 단백질 다이머를 30 ㎖의 디에틸에테르로 처리한 후 15분 동안 3000 rpm 으로 원심분리 하였다. 디에틸에테르의 상층액을 제거 후 다시 30 ml의 디에틸에테르를 넣고 3000 rpm으로 15분 원심분리 한 다음 침전된 백색의 단백질 다이머를 25% 아세토나이트릴 수용액에 녹이고 동결건조하여 백색 고체분말의 평행 입체구조의 단백질 다이머를 얻었다. 동결건조 후에 HPLC를 이용하여 정제하였다.
제조예 2: P101(0317) (NH 2 - SEQ ID NO:4 - GGGSGGGS - εK ( COOH )- GGGSGGGS - SEQ ID NO:4 (parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 SEQ ID NO:4 (Aβ03~17)의 기능적 펩타이드 단편 서열이 되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 P101(0317)을 제조하였다. 제조예 2에서 사용한 SEQ ID NO:4 에서 1, 2 번 위치의 아미노산이 결실된 것(X=0)을 사용하였다.
제조예 3: P101(0517) (NH 2 - SEQ ID NO:11 - GGGSGGGS - εK ( COOH )- GGGSGGGS - SEQ ID NO:11 (parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 SEQ ID NO:11(Aβ05~17)의 기능적 펩타이드 단편 서열이 되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 P101(0517)을 제조하였다. 제조예 3에서 사용한 SEQ ID NO:11의 경우 1, 2, 3, 4 번 위치의 아미노산이 결실된 것(X=0)을 사용하였다.
제조예 4: P101(0717) (NH 2 - SEQ ID NO:22 - GGGSGGGS - εK ( COOH )- GGGSGGGS - SEQ ID NO:22 (parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 SEQ ID NO:15(Aβ01~13)의 기능적 펩타이드 단편 서열이 되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 P101(0717)을 제조하였다. 제조예 4에서 사용한 SEQ ID NO:11의 경우 1, 2, 3, 4, 5, 6 번 위치의 아미노산이 결실된 것(X=0)을 사용하였다.
비교제조예 1: C101(0119) (NH 2 - Aβ1 ~19- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ1 ~19(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ1~19의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(0119)를 제조하였다.
비교제조예 2: C101(0121) (NH 2 - Aβ1 ~21- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ1 ~21(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ1~21의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(0121)를 제조하였다.
비교제조예 3: C101(0123) (NH 2 - Aβ1 ~23- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ1 ~23(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ1~21의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(0121)를 제조하였다.
비교제조예 4: C101(0125) (NH 2 - Aβ1 ~25- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ1 ~25(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ1~25의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(0125)를 제조하였다.
비교제조예 5: C101(0917) (NH 2 - Aβ9 ~17- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ9 ~17(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~17)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ9~17의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(0917)를 제조하였다.
비교제조예 6: C101(1117) (NH 2 - Aβ11 ~17- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ11 ~17(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~21)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ11~17의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(1117)를 제조하였다.
비교제조예 7: C101(1317) (NH 2 - Aβ13 ~17- GGGSGGGS - εK ( COOH )- Aβ13 ~17(parallel)-NH 2 ) 제조
SEQ ID NO:1 (Aβ1~21)의 기능적 펩타이드 단편 대신 천연 Aβ13~17의 서열을 가지는 펩타이드가 연결되도록 제조하였다는 점을 제외하고는 제조예 1과 동일하게 진행하여 C101(1317)를 제조하였다.
아밀로이드베타 ( Aβ ) 응집 분해 및/또는 응집 억제 효과 측정
시료의 준비
Aβ1~17 모노머 단편으로 이루어진 펩타이드(MAβ(0117)), 제조예 1 내지 4, 비교제조예 1 내지 7에 따라 제조된 펩타이드 다이머를 각각 2.5M 농도가 1% DMSO를 이용하여 녹였다. 그 후, 상기 물질들은 1% DMSO 용액을 이용하여 희석하여 사용하였다.
아밀로이드베타(Aβ) 용액은 Aβ1~42 모노머를 10mM 농도가 되도록 DMSO에 녹였다. 그 후, DW를 이용하여 100uM 농도가 되도록 희석하고 얼음위에 보관하였다.
한편, Thioflavin-T를 5mM 농도가 되도록 50mM glycine buffer (pH8.5)에 녹였다. 그 후, 50mM glycine buffer (pH8.5)를 사용하여 5uM이 되도록 희석하고 빛을 차단한 상태로 암실에서 보관하였다.
아밀로이드베타 ( Aβ ) 응집 분해 효과 측정
앞에서 준비한 아밀로이드베타(Aβ) 용액을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 50uM이 되도록 각각 넣었 후, 37℃에서 72시간 동안 반응시켰다. 상기 1.5mL 마이크로 원심분리관 별로 Aβ1~17 모노머 단편으로 이루어진 펩타이드(MAβ(0117)), 제조예 1 내지 4, 비교제조예 1 내지 7에 따라 제조된 펩타이드 다이머를 각각 50uM, 250uM의 서로 다른 농도로 각각 처리한 후 37℃에서 48시간 동안 반응시켰다.
반응이 완료된 반응액을 96-웰 형광분석용 플레이트에 25uL씩 각 웰에 넣고, 앞에서 준비한 Thioflavin-T 용액을 각 웰에 75uL씩 넣었다. 상온에서 암실상태로 5분간 반응시킨 후, 다중모드 마이크로플레이트 리더(multi-mode microplate reader)를 이용하여 excitation 450nm, emission 485 nm에서 형광 값을 측정하였다.
측정 결과 아밀로이드베타(Aβ)만을 처리하여 72시간 동안 응집한 군의 형광 값을 %값으로 환산하여 100으로 표시하고 얻어지는 형광 값을 상대적인 값으로 환산하여 도 7 내지 도 9에 도시하였다.
도 7의 결과로부터 모노머(MAβ(0117)) 대비 2개의 기능적 펩타이드 단편을 가지는 P101(0117) 펩타이드가 응집 분해 효과가 거의 3~4배 이상 현저함을 알 수 있다.
도 8의 결과로부터 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지는 것이 응집 분해 효과를 최대화할 수 있음을 알 수 있다.
도 9의 결과로부터 기능적 펩타이드 단편이 천연 Aβ1~17의 아미노산 서열과 적어도 10개 이상의 아미노산 서열이 동일할 경우 응집 분해 효과를 유지할 수 있음을 알 수 있다.
아밀로이드베타 ( Aβ ) 응집 억제 효과 측정
앞에서 준비한 아밀로이드베타(Aβ) 용액을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 50uM이 되도록 각각 넣은 후 1.5mL 마이크로 원심분리관 별로 Aβ1~17 모노머 단편으로 이루어진 펩타이드(MAβ(0117)), 제조예 1 내지 4, 비교제조예 1 내지 7에 따라 제조된 펩타이드 다이머를 각각 50uM, 250uM의 서로 다른 농도로 각각 처리한 후 37℃에서 72시간 동안 반응시켰다.
반응이 완료된 반응액을 96-웰 형광분석용 플레이트에 25uL씩 각 웰에 넣고, 앞에서 준비한 Thioflavin-T 용액을 각 웰에 75uL씩 넣었다. 상온에서 암실상태로 5분간 반응시킨 후, 다중모드 마이크로플레이트 리더(multi-mode microplate reader)를 이용하여 excitation 450nm, emission 485 nm에서 형광 값을 측정하였다.
측정 결과 아밀로이드베타(Aβ)만을 처리하여 72시간동안 응집한 군의 형광 값을 %값으로 환산하여 100으로 표시하고 얻어지는 형광 값을 상대적인 값으로 환산하여 도 10 내지 도 12에 도시하였다.
도 10의 결과로부터 모노머(MAβ(0117)) 대비 2개의 기능적 펩타이드 단편을 가지는 P101(0117) 펩타이드가 응집 억제 효과가 거의 3~4배 이상 현저함을 알 수 있다.
도 11의 결과로부터 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지는 것이 응집 억제 효과를 최대화할 수 있음을 알 수 있다.
도 12의 결과로부터 기능적 펩타이드 단편이 천연 Aβ1~17의 아미노산 서열과 적어도 10개 이상의 아미노산 서열이 동일할 경우 응집 억제 효과를 유지할 수 있음을 알 수 있다.
P101(0117)과 Aβ올리고머와의 직접적 상호작용 확인
P101(0117)이 2xTg-AD 마우스에서 아밀로이드 플라크 및 신경 세포 사멸을 감소시키는 방법을 이해하기 위해, 본 발명자들은 in vitro(시험관내) 물리생물학적 검정 및 구조 검색에 의해 P101(0117)과 Aβ42 응집체 사이에 직접적인 상호 작용이 존재하는지를 조사하였다. 본 발명자들은 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용하여 결합 동역학을 평가하고 Biacore T200 시스템을 사용하여 친화성을 평가하였다. 그 결과가 도 13에 도시되어 있다.
표면 플라즈몬 공명 분석은 Biacore T200 기기 및 Series S carboxymethylated (CM5) 덱스트란 매트릭스 센서칩 (GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. HBS-EP+ (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05 % 계면활성제 P20)를 25℃에서 런닝 완충액(running buffer)으로 사용하였다. 먼저 본 발명자들은 DMSO (20 mg/ml, w/v)에 Aβ42 펩타이드를 용해시키고 증류수에 100배 희석하여 200 μg/ml로 만들었다. 상기 제조된 Aβ42 펩타이드를 37℃에서 7 일 동안 배양하였다. 마지막으로 배양된 Aβ42 펩타이드 (200 ㎍/㎖)를 10 mM 아세트산나트륨용액 (pH 4.0)으로 희석하여 Aβ42 응집체 40 ㎍/㎖를 제조하였다. 그리고나서, 상기 응집체들은 아민 결합 화학에 의해 상기 칩 표면에 공유 결합으로 고정화되었다. 상기 표면 상에 남아있는 활성화된 카르복시메틸기는 1 M 에탄올아민(pH 8.0)의 투여에 의해 차단되었다. 상기 Aβ42 응집체의 고정화 값(immobilization value)은 6000 RU이고 Aβ42 응집체의 이론적인 Rmax는 7017 RU이었다. P101(0117)은 연속 희석된 샘플로서 1% DMSO를 함유하는 PBS-T 런닝 완충액 (10mM 포스페이트, 135 mM NaCl, 27 mM KCl 및 0.005 % 계면활성제 P20)으로 제조하였다. 상기 결합 및 동역학 분석을 위해, P101(0117)을 30 ㎕/분의 유속으로 120 초 동안 투여하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 아민 커플링을 통해 CM5 센서칩 상의 리간드로서 Aβ42 응집체를 고정시킨 후, 상이한 농도(62.5 ~ 5000 nM)의 P101(0117) 단백질을 채널을 통해 흘렸다. 다양한 형태로 응집된 Aβ로 인해 정확한 결합 상수의 계산이 어려움에도 불구하고, 실질적인 곡선 일치 효과(substantial curve fitting efficacy)의 결과 (계산된 χ의 0.0843 RU2)는 P101(0117)가 Aβ42 응집체와 직접적으로 결합하며 이는 용량에 의존적 상호 작용임을 발견하였다.
2xTg -AD 마우스에서 뇌 아밀로이드 플라크 감소 효과 확인
Aβ40 또는 Aβ42 모노머는 집적하여 Aβ올리고머(oligomer)를 형성하고, 이들 올리고머가 집적하여 Aβ피브릴(fibril)을 형성하고, 이들 피브릴이 집적하여 Aβ 플라크(plaque)를 형성하고 이렇게 축적된 Aβ 플라크가 AD 환자의 기억력 결핍을 일으키는 것으로 알려져 있으므로 실시예에 따른 펩타이드(P101(0117)) 투여시 뇌 아밀로이드 플라크 감소가 일어나는지를 조사하였다.
(1)2xTg-AD 마우스 모델 준비
2가지 유전자가 돌연변이된 형질 전환 마우스(Doubly mutated transgenic mice) (2xTg-AD, 계통명; B6.Cg-Tg (APPswe, PS1dE9) 85Dbo/J) 및 야생형 (C57BL/6J) 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA)로부터 유래하였다. 이러한 2xTg-AD 마우스는 야생형 마우스와 교차하여 이중 반접합체(double hemizygotes)로 유지되었다. 모든 APP와 PS1 유전자의 유전자형은 Jackson Laboratory의 표준 PCR 조건에 따라 꼬리 DNA(tail DNA)를 이용한 PCR 분석을 통해 확인되었다. 마우스는 동물 사육실에서 플라스틱 케이지 당 4 ~ 6 마리씩 수용되어, 12 시간의 명암 사이클을 번갈아가면서 21±1℃로 유지되었고, 음식과 물을 자유롭게 섭취하였다. 실험 초기에, 2xTg-AD (n = 13, 남성) 및 야생형 (n = 14, 남성) 4개월령으로 27 마리의 마우스를 평가했다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 보살핌과 사용을 위한 국립보건원 가이드(the National Institutes of Health guide for the care and use of laboratory animals)에 따라 수행되었다 (NIH Publications No. 8023, 1978 년 개정).
(2)마우스 모델에 P101(0117) 처리
정맥(intravenous) 투여 모델 : 응집되지 않은 P101(0117) 100 μmol 를 12 개월령의 2xTg-AD 마우스의 꼬리 정맥 내로 4 주 동안 일주일에 두번씩 정맥 내(i.v.)로 투여하였다. 대조군은 동량의 매체(vehicle) (PBS 중 2.5% DMSO)를 투여받았다. 상기 투여는 1 mL Kovacs-주사기로 수행하였다.
뇌실내 (Intracerebroventricular ; ICV) 투여 모델 : 합성 Aβ42와 P101(0117)은 무균 생리 식염수 250과 25 pmole (5 μL 50 μM, 5 μL 5 μM)에 각각 용해시켰다. 마우스를 ICV 투여 전에 2% 아베르틴(20 μg/g, IP)으로 마취시켰다. 용해된 Aβ42와 P101(0117)은 이전에 보고된 프로토콜에 따라 마우스 뇌의 ICV 영역에 투여하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 26-게이지의 스테인레스-스틸 바늘을 갖는 해밀턴 주사기를 사용하여 bregma의 1.0 mm 후방, 시상면의 1.8 mm 외측, 3.6 mm 복부 및 2.4 mm 깊이로 ICV 영역에 Aβ42를 투여했다.
(3)뇌 및 혈장 준비
마우스를 2% 아베르틴(20 mg/g, i.p.)을 사용하여 마취했다. 대정맥으로부터 혈액을 채취하여 프로테아제 저해제 칵테일(Roche Diagnostics, cat# 11836170001)을 이용하여 EDTA 튜브로 옮기고 상기 튜브를 부드럽게 흔들었다. 상기 EDTA 처리된 혈액으로부터 혈장을 얻고 즉시 드라이아이스로 냉동시켜 -80℃냉동고에 저장하였다. 상기 혈액을 수집한 후, 상기 마우스를 0.9% NaCl로 관류시키고 뇌를 절제하였다. 상기 hemibrains은 4℃에서 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)에서 밤새 고정시켰다. 동결 보존을 위해, 뇌를 30% 수크로오스에 48 시간 동안 담갔다. 상기 다른 hemibrains을 피질 및 해마 영역으로 해부하고 1X 프로테아제 저해제 칵테일을 포함하는 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, 320 mM 수크로오스에서 5 mM EDTA, pH 7.4)에서 30 분 동안 얼음 상에서 균질화하였다. 상기 샘플은 4℃에서 13500rpm으로 30 분 동안 원심분리하였다. BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher, cat #23225)로 제조업체의 지시에 따라 lysate 농도를 측정하였다. 상기 흡광도는 560 nm에서 판독하였다.
(4)면역 조직 화학 염색 및 ThS 염색
저온 유지 장치 (Leica CM1800)를 사용하여 35 μm 두께로 뇌를 절단하고 GFAP (Milipore AB5541)로 염색하였다. Alexa Fluor 568-conjugated 2차 항체(Life technologies)를 형광 검출에 사용하였다. ThS 염색은 에탄올(50%)에서 500 μM의 농도로 7 분 동안 수행하였다. 그리고 상기 절편을 100, 90 및 70% 에탄올에서 순차적으로 10 초 동안 헹구고 PBS에 넣었다. Leica DM2500 형광 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.
(5) 결과
본 발명자들은 APP/PS1 (2xTg-AD) 마우스 모델을 사용하였다. 상기 모델은 인간 Aβ를 과잉 생산하여 6 개월령된 실험쥐의 피질과 해마에서 확실한 아밀로이드 플라크를 보였다. 본 발명자들은 4 주 동안 10 개월령 2xTg-AD 마우스에 P101(0117)을 정맥 내로 8 회 투여했다(도 14a). 마지막 투여 후 3 일째에 2% 아베르틴(avertin)(20 μg/g, i.p.)으로 마취한 후 마우스를 희생시켰다. 본 발명자들은 1mL 주사기로 하대 정맥에서 혈액을 채취했다. 채취된 혈액을 EDTA 튜브로 직접 옮기고 혈장(plasma)을 분리하였다. 수득된 뇌를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 동결 보존을 위해 30% 수크로오스 용액을 사용하였다.
냉동 뇌를 티오플라빈 S(thioflavin S; ThS)를 이용하여 염색하기위해 30 μm로 잘라 조직절편을 만든 뒤 β시트가 풍부한 Aβ플라크(β sheet rich Aβ plaques)를 염색하고, 신경 아교 섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein ; GFAP) 항체를 이용하여 신경교 세포(glial cell)를 염색했다(도 13B). 도 14b에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스(vehicle(10% DMSO in PBS)이 투여된 마우스)와 비교를 해 보면, 상기 플라크 수 및 총 플라크 면적이 P101(0117) 투여된 2xTg-마우스에서 유의하게 감소하였다(도 14c 및 14d). Aβ40 과 Aβ42 의 총 농도 또는 상대적 농도는 가족성(familial) 및 산발성(sporadic) 알츠하이머 병의 발병과 관련이 있다고 보고되었다.
종합적으로, 이러한 결과들은 P101(0117)의 투여가 2xTg-AD 모델 마우스 뇌에 존재하는 Aβ42 플라크를 분해하여 이를 Aβ42 펩타이드로 유도함을 말한다.
P101(0117)의 Aβ의해 유도된 세포독성 개선 효과 확인
아밀로이드 단백질에 의해 유도된 신경 세포의 손실은 AD의 핵심적인 특징이다. P101(0117)이 신경 세포 사멸에 영향을 주는지 조사하기 위해 두 가지 세포(BV2 및 HT22 세포)를 이용하여 세포 생존능 분석(MTT 분석)을 수행하였다. 또한, 세포 독성에서 P101(0117)의 신호 메커니즘을 발견하기 위해, 본 발명자들은 상기의 배양(cultures)을 이용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 세포에서 방출된 세포사멸 시그널링(released apoptotic signaling molecules)를 분석하였다.
(1) 세포 배양(BV2세포, HT22세포)
BV2 및 HT22 세포는 한국 세포주 은행 (서울대학교, 대한민국)으로부터 획득하였다. 세포를 10% (v/v) 소태아혈청(FBS, Gibco), 100 units/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 Dulbecco's 65 modified Eagle's 배지(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 주요 성상교세포는 이전에 기술된 바와 같이 신생 C57BL/6 마우스(P0-3)로부터 준비하였다. 상기 대뇌 피질과 해마를 절개하고 분쇄에 의해 단일 세포 현탁액으로 분쇄하고 0.1 ㎎/ml 폴리-D-라이신 (PDL) 사전-코팅된 10 ㎝ 접시로 도금하였다. 이들 세포를 25 mM 글루코오스, 10% (vol/vol) 열-활성화된 말 혈청, 10% (v/v) 열-불활성화된 소태아혈청, 2 mM 글루타민 및 1000 units/ml 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM 배지에서 유지시켰다. 배양 3 일째, 세포를 PBS로 세척한 후 배지를 교체하였다. 다음날, 새로운 배지에서 실험을 하기에 적합한 밀도로 세포를 옮겼다. 모든 세포 배양은 5 % CO2 배양기에서 37℃로 유지하였다.
(2) 세포 생존능 분석(MTT 분석) 방법
상기 배양된 BV2 및 HT22 세포는 3-(4,5-디메틸-2-티아조일)-2,5-디페닐테트라조리움 브로마이드 (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 분석을 이용하여 세포 생존력을 분석하였다.
실험은 기아 배지(starvation medium), 2 % FBS가 보충된 DMEM으로 수행하였다.
BV2, HT22 세포 (5 × 103 cells/well) 및 주요 성상세포 (2 × 104 cells/well)를 96-웰 플레이트에 배양하였다. 각 웰에 MTT 시약 (15 μM)을 첨가한 후 Aβ40, Aβ42, P101(0117)을 처리하였다. 4 시간 동안 인큐베이션 한 후, 100 ㎕의 가용화 용액을 첨가하고 실온에서 16 시간 동안 방치하였다. 상기 포르마잔 생성물은 570 nm 파장에서 EnSpire®Multimode Plate Reader를 사용하여 측정하였다. 또한, 신경 세포 사멸은 Live/Dead®Viability/Cytotoxicity kit (Molecular Probes)를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 시각화하였다. 그 결과는 도 15a내지 도 15d에 나타낸 바와 같다.
(3) 웨스턴 블롯 분석(Western blot Assay) 방법
웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 위해 상기 준비된 세포의 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 1차 항체를 이용하여 4℃에서 밤새 처리하였고, Horseradish Peroxidase(HRP)가 결합된(conjugated) 2 차 항체를 이용하여 검출하였다. 상기 blot의 전개는 제조업체의 지시에 따라 Clarity Western ECL substrate(Bio-Rad)로 수행하였다.
(4) 결과
상기 MTT 분석은 Aβ40(도 15a) 또는 Aβ42(도 15b) 단독으로 처리 후, 그리고 해마 신경 세포주 HT22, 미세아교세포주(microglial cell line) BV2, 그리고 주요 성상 세포에서 P101(0117)과 조합하여 세포 증식을 정량화하기 위해 수행하였다. 도 15a와 15b에 나타난 바와 같이, Aβ40으로 유도된 신경 세포 사멸은 3 개의 모든 세포주에서 P101(0117)과 함께 처리한 후 유의하게 감소하였다.
상기 결과에 대해 추가적으로 생존 실험, 세포 사멸을 시각적으로 검출하기 위한 LIVE/DEAD®Viability/Cytotoxicity Assay에 의해 확인하였다. 아무것도 처리되지 않은 세포가 최소한의 내인성 세포 사멸 정도만을 나타낸 반면, Aβ40이 처리된 세포는 거의 50% 세포 사멸을 보였다. 신경 세포 사멸은 세포가 Aβ40과 함께 P101(0117)로 처리되었을 때 크게 회복되는 것을 확인하였다(도 15c). 따라서, P101(0117) 이 Aβ40 및 Aβ42에 의해 유도된 신경 세포 사멸을 in vitro(시험관내)에서 차단할 수 있음을 확인하였다.
도 15d에서 보는 바와 같이, 데이터에서 상이한 단백질이 확인되었다(Bcl-2 단백질 군인 Bax는 세포사멸을 유도하는 단백질(pro-apoptotic protein)임; 절단된 카스파제-3(Cleaved caspase-3)는 세포 사멸(apoptosis)에서 기본적인 것임; 카스파제에 의해 단백질 분해된 후 DNA 손상 및 기타 유전독성 응력 인자에 대한 반응으로 세포 사멸(apoptotic cell death)을 유도하는 폴리(ADP-리보스) 중합 효소-1(Poly (ADP-ribose) polymerase-1, PARP1); 사이토크롬-C는 미토콘드리아에서 세포질로 세포 사멸하는 동안 방출됨; 그리고, 조직 변성에서 뉴런을 보호하고 염증을 제한하기 위해 성상 세포에서 발현되는 신경 아교 섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP). Aβ40 및 P101(0117)로 처리된 BV2 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 Aβ40 단독 처리에 비해 Bax, 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3), 및 절단된-PARP-1(cleaved PARP-1)의 수준 감소를 나타내었다. 주요 성상 세포의 분석은 Aβ40과 P101(0117)의 조합 처리가 Bax, 절단된 카스파제-3, 절단된 PARP-1, 및 시토크롬-c의 수준 감소를 나타냈다. P101(0117)을 포함하는 Aβ40의 조합은 GFAP의 증가를 나타냈다.
P101(0117) 처리된 세포가 Aβ유도된 세포 사멸 단백질을 감소시켰으며 세포사멸(apoptotic cell death)이 감소시키는 것임을 확인하였다.
P101(0117)의 공간적 작업 기억 손상(Spatial working memory impairment) 억제 효과 확인
본 발명자들은 P101(0117)이 Aβ42 응집체에 직접 결합하고 신경 세포주 및 주요 성상 세포에서 Aβ유도 세포 독성을 낮춘다는 것을 앞서 확인하였다.
P101(0117)이 in vivo(생체 내)에서 Aβ유도 기억 손상을 개선시킬 수 있는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 Aβ42가 투여된 AD 마우스 모델을 이용한 행동 테스트를 수행하기 전에 P101(0117)과 Aβ42 사이의 적절한 비율을 확인하였다. 상기 행동 테스트는 후술한다.
또한, 행동 테스트 후에 마우스를 희생시키고 뇌를 해부하였다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯으로 해마 영역의 세포 사멸 시그널링 인자의 수준 변화를 확인하였고, 그 결과는 도 16g에 나타내었고, 상기 뇌 해부 방법 및 웨스턴 블롯 분석은 각각 앞에서 설명한 실험예들에 나타난 방법과 같다.
(1) 행동 테스트 방법
Y-미로 테스트는 마우스 모델에 ICV 투여 4 일 후 수행하였다. Y-미로 장치는 A, B 및 C로 표시된 3 개의 통로형태의 팔(arms)을 갖는 플라스틱 검정색 미로이다. 각 팔의 길이는 40 cm, 높이는 12 cm, 상단에는 10 cm, 하단에는 3cm 폭이었다. 상기 팔은 가운데로 수렴하여 가장 긴 축에서 4 cm의 정삼각형을 만들었다. 마우스는 한 팔 끝 부분에 배치시키고 상기 미로를 통해 12 분 동안 자유롭게 움직일 수 있도록 했다. 상기 일련의 팔 움직임은 수동으로 기록하였다. 상기 마우스의 모든 4 개의 팔다리가 팔 중 하나 내에 있을 때 진입(entry)으로 간주하였다. 한 마우스가 연속적으로 3 개의 상이한 팔에 들어왔을 때, 교대(alternation)가 카운트하였다. 상기 충동적 교대 행동(impulsive alternation behavior)은 하기 방정식을 기반으로 계산하였다.
각각의 시험 전에, 상기 미로 내부는 향기 신호(scent cues)를 제거하기 위해 70% 에탄올 용액으로 세정하였다.
새로운 대상 인지 테스트를 수행하기 위해 습관화 단계(habituation phase)에서, 마우스는 10 분 동안 새로운 대상 인식 테스트 상자를 탐색할 수 있었다. 친화 단계(familiarization phase)에서, 마우스는 상자에 놓여지고 벽에서 5cm 떨어진 검정색 플라스틱 피라미드 모양의 물체인 두 개의 동일한 물체와 10 분 동안 상호 작용 하였다. 테스트 단계에서, 대상 중 하나가 세라믹 양 모양의 인형(ceramic sheep-shaped doll)인 새로운 대상으로 대체되고 마우스는 10 분 동안 테스트하였다. 모든 세션은 EthoVision 소프트웨어로 기록하였고, 각각의 대상과 상호작용하는 데 소요된 시간은 수동으로 분석을 진행하였다.
(2) 결과
본 발명자들은 8 주령의 C57Bl/6 마우스(수컷, n = Group당 7 ~ 11)에 뇌실내(ICV) 투여에 의한 AD 유사 행동을 유도하기 위해 하나의 vehicle과 4개의 Aβ42응집체 샘플을 제조하였다(도 16a). 그 중 P101(0117)의 Aβ42 응집체 독성 억제 및 치료 효과를 각각 확인하기 위해 사전에 미리 두 물질을 섞어서 인큐베이션하거나(Group D)과 ICV 투여 직전 (Group E)에 섞어서 투여하였다. 본 발명자들은 ICV 투여 후 4 일째에 Y-미로 테스트와 새로운 대상 인식 테스트를 시행하였다(도 16b).
Y-미로는 공간적 작업 기억을 측정하는 테스트로, Y-미로에서 실험대상 마우스는 자유롭게 움직일 수 있으며, 진입의 순서(sequences of entries)을 기록하고 분석하였다. 도 16c에 나타난 바와 같이, Group D과 Group E의 투여 결과, Group A와 거의 동일한 수준으로 교대 비율이 교대 비율이 증가했으며, 이는 P101(0117)의 응집 전 혹은 응집 후 투여 경우 모두에서 공간인지기능이 정상수준으로 개선됨을 말한다. 전체 진입(entries)의 차이는 미미함을 관찰함으로써 실험의 통제가 잘 수행되었을 확인하였다.
도 16d에 나타난 바와 같이, NOR 테스트는 인지 인식 기억(cognitive recognition memory)을 평가하기 위해 수행하였다. 모든 마우스군은 친화 트레일에서 두 개의 대상을 거의 동일한 시간 동안 탐구했다. 새로운 대상이 제시되었을 때, Group B 마우스는 새롭고 친숙한 대상을 구별하지 못했다. 그러나 Aβ42 응집체에 P101(0117)을 함께 투여한 Group D와 Group E는 Group B에 비교하여 신규한 대상을 탐구하는데 소비된 시간이 현저하게 증가한 것을 나타내었다.
도 16e에 나타난 결과와 같이, 행동 테스트에서 개선된 기억 손상을 나타내는 Group D군 및 Group E군에서, Bax 및 절단된 카스파제-3의 단백질 수준의 감소가 나타났다. 시토크롬-c 발현의 변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 결과적으로 P101(0117)이 Aβ42 투여로 유도된 AD 마우스 모델에서 인지기능 손상을 회복시킨다는 것을 시사한다.
안정성 실험(KR1198047)
단백질 가수분해 저하에 대한 방사성 표지된 펩타이드의 저항성을 평가하고, 그것의 생체내 안정성을 예측하기 위해 인간 혈청에서 안정성 평가가 수행되었다. 방사성표지된 펩타이드 10 μCi를 인간 혈청에 넣고 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다.
방사성 표지된 펩타이드의 안정성을 측정하기 위해 적당한 시간 간격에서 부분 표본 샘플을 얻었다. RP-HPLC 분석을 통해 오로지 원하는 방사성 표지된 펩타이드만이 관측된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 72시간 이상의 기간동안 98% 이상의 높은 안정성을 유지한 것을 알 수 있다. 이러한 인간 혈청에서의 안정성 실험 결과는 제조된 펩타이드가 가수분해 및 신진대사 저항에 대해 높은 안정성이 있음을 나타낸다. 상기에서는 실험예에 대하여 설명하였지만, 권리범위는 이에 의해 한정되는 것이 아니다. 구현되는 형태는 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 권리 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (26)

  1. 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로,
    상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 기능적 펩타이드 단편인 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 아밀로이드성 질병의 치료용 약학적 조성물.
  2. 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로,
    상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편인 펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 아밀로이드성 질병의 예방용 약학적 조성물.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 아밀로이드성 질병은 알츠하이머병, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 또는 니만-픽병인 약학적 조성물.
  4. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 아밀로이드성 질병은 알츠하이머병인 약학적 조성물.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체 분해 활성을 가지는 약학적 조성물.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 집적을 억제하는 활성을 가지는 약학적 조성물.
  7. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 링크 코어는 적어도 2개 이상의 아미노기를 가지는 아미노산 또는 두 개 이상의 카르복실기를 가지는 아미노산인 약학적 조성물.
  8. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 링크 코어와 상기 기능적 단편은 펩타이드 아암에 의해 간접적으로 결합된 약학적 조성물.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 펩타이드 아암은 알짜 전하가 없고 플렉서블한 펩타이드인 약학적 조성물.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 펩타이드 아암은 GGGS의 반복단위를 포함하는 약학적 조성물.
  11. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 링크 코어는 C 말단이고, 상기 각각의 자유 말단은 N 말단인 약학적 조성물.
  12. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 링크 코어는 상기 펩타이드의 중간에 위치하고, 상기 자유 말단 중 적어도 하는 N 말단이고, 적어도 다른 하나는 C 말단인 약학적 조성물.
  13. 제1 항 또는 제2 항에 있어서
    상기 적어도 10개 이상의 아미노산은 인접 서열을 구성하는 약학적 조성물.
  14. 제1 항에 있어서
    상기 적어도 10개 이상의 아미노산은 비인접 서열을 구성하는 약학적 조성물.
  15. 링크 코어에 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각의 자유 말단을 가지고 결합된 펩타이드로,
    상기 기능적 펩타이드 단편은 최대 17개의 아미노산으로 이루어지며 천연 Aβ1~17의 17개의 아미노산 중 적어도 10개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단편인 펩타이드.
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체에 결합하여 분해하는 활성을 가지는 펩타이드.
  17. 제15 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 집적을 억제하는 활성을 가지는 펩타이드.
  18. 제15 항에 있어서,
    상기 링크 코어와 상기 기능적 단편은 펩타이드 아암에 의해 간접적으로 결합된 펩타이드.
  19. 제15 항에 있어서,
    상기 펩타이드 아암은 알짜 전하가 없고 플렉서블한 펩타이드.
  20. 제19 항에 있어서,
    상기 펩타이드 아암은 GGGS의 반복단위를 포함하는 펩타이드.
  21. 제15 항에 있어서,
    상기 링크 코어는 C 말단이고, 상기 각각의 자유 말단은 N 말단인 펩타이드.
  22. 제15 항에 있어서,
    상기 링크 코어는 상기 펩타이드의 중간에 위치하고, 상기 자유 말단 중 적어도 하는 N 말단이고, 적어도 다른 하나는 C 말단인 펩타이드.
  23. 제15 항에 있어서
    상기 적어도 10개 이상의 아미노산은 인접 서열을 구성하는 펩타이드.
  24. 제15 항에 있어서
    상기 적어도 10개 이상의 아미노산은 비인접 서열을 구성하는 펩타이드.
  25. 제15항, 제16항, 및 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 사용하여 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 응집을 분해하는 방법으로,
    상기 펩타이드의 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체와 결합하여 분해하는 것인 방법.
  26. 제15항, 및 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 사용하여 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체의 응집을 억제하는 방법으로,
    상기 펩타이드의 두 개 이상의 기능적 펩타이드 단편이 각각 상기 수용성 Aβ 응집체 및/또는 불수용성 Aβ 응집체와 결합하여 응집을 억제하는 것인 방법.
KR1020180147036A 2018-11-26 2018-11-26 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 Ceased KR20200061573A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180147036A KR20200061573A (ko) 2018-11-26 2018-11-26 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180147036A KR20200061573A (ko) 2018-11-26 2018-11-26 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200061573A true KR20200061573A (ko) 2020-06-03

Family

ID=71087951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180147036A Ceased KR20200061573A (ko) 2018-11-26 2018-11-26 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 약제학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20200061573A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235905A1 (ko) 2020-05-22 2021-11-25 주식회사 엘지에너지솔루션 이차전지의 활성화 방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235905A1 (ko) 2020-05-22 2021-11-25 주식회사 엘지에너지솔루션 이차전지의 활성화 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107921085B (zh) 用于治疗衰老相关病症的方法和组合物
JP6084207B2 (ja) 虚血性脳損傷及び疼痛治療用の効率的な神経保護剤としてのｐｓｄ−９５の高親和性二量体阻害剤
CN109513010B (zh) 肿瘤细胞特异性响应的自组装药物纳米缀合物
US9359405B2 (en) Antagonists of the interleukin-1 receptor
EP3393496B1 (en) Long-acting glp-1r agonist as a therapy of neurological and neurodegenerative conditions
JP6666899B2 (ja) Ａｎｇ−（１−７）誘導体オリゴペプチド、ならびにそれを使用および作製するための方法
US12590130B2 (en) Bipartite molecules and uses thereof in treating diseases associated with abnormal protein aggregates
EP3503924B1 (en) Bcl-w polypeptides and mimetics for treating or preventing chemotherapy-induced peripheral neuropathy and hearing loss
US20180170983A1 (en) New Use of Cell-Permeable Peptide Inhibitors of the JNK Signal Transduction Pathway for the Treatment of Mild Cognitive Impairment
ES2247329T3 (es) Prevencion de muerte celular utilizando segmentos de proteinas fibrilares neurales.
TW202003015A (zh) Ｃ端腦部多巴胺神經滋養因子（ｃｄｎｆ）及中腦星狀細胞－衍生之神經滋養因子（ｍａｎｆ）片段、包含彼之醫藥組成物及其用途
KR102084341B1 (ko) 짧은 합성 펩티드 및 그의 용도
ES3023183T3 (en) Compositions and methods for treating neurological and other disorders
JP2020524132A (ja) アルツハイマー病を治療するための組成物および方法
WO2007142381A1 (en) Human short helical peptide-1 which has antimicrobial, antitumor, and immune stimulating activity and uses thereof
WO2025049979A1 (en) Hydrophobically interspaced charged peptides for preventing or treating apoe and/or amyloid beta pathologic interaction in alzheimer's disease and related dementias
Class et al. Patent application title: Antagonists of the Interleukin-1 Receptor Inventors: Vladimir Berezin (Copenhagen N, DK) Vladimir Berezin (Copenhagen N, DK) Elisabeth Bock (Charlottenlund, DK) Assignees: SERODUS ASA
HK1247102B (en) Methods and compositions for treating aging-associated conditions
NZ615710B2 (en) Antagonists of the interleukin- 1 receptor

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20181126

PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20190225

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20211119

Comment text: Request for Examination of Application

Patent event code: PA02011R01I

Patent event date: 20181126

Comment text: Patent Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20240516

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20250121

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D