KR20200065961A - 서방형 리포좀 제제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중 소포성 리포좀 (MVL)을 적용한 서방성 주사제에 관한 것으로서, 큰 수술을 포함하여 모든 시술 부위에 적용이 가능하며, 1 일 1 회 주사로 장기간 진통효과가 지속되는 국소마취제에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 환자의 복약편리성이 향상될 수 있어 통증을 갖고 있는 환자들에게 큰 도움이 될 수 있다.

Description

서방형 리포좀 제제의 제조방법 {PREPARATION METHOD OF SUSTATINED RELEASE LIPOSOMAL FORMULATIONS}

본 발명은 서방성 주사제에 관한 것이다. 구체적으로 리포좀을 이용한 부피바카인, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 및 로피바카인으로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 서방성 주사제에 관한 것이다.

수술후의 통증은 인체의 회복과정에 있어서의 필수 과정으로, 현재 수술 후 가장 해결할 필요가 있는 문제 중의 한가지이다. 통증을 제어하기 위해 투여되는 아편계 마취제는 1979년 발표된 M. Behar의 임상효과 연구논문 (Lancet 1979 Mar. 10 313 (8115) 527-529)이 나온 이 후 수술 후 통증 제어에 있어서 일반적으로 사용되고 있다. 이러한 주사용 아편계 마취제는 활성 지속기간이 비교적 짧은 단점을 가지고 있어 통증 제어를 위해 연속적인 주입 또는 반복투여가 필요할 뿐만 아니라, 의존성, 호흡억제, 착란, 건망 등의 부작용을 가지고 있어 비아편성 마취제의 연구가 지속되고 있다.

부피바카인은 1957년에 경막외 마취제로 처음 개발된 아미드 계열의 비아편성 마취제이다. 이는 같은 계열의 마취제인 리도카인, 메피바카인과 비교했을 때 마취작용이 보다 강력하며, 마취 지속효과가 2-3배 더 긴 장점이 있다. 부피바카인은 체내 주입 후 15분내에 작용이 시작되어 2-8시간의 지속효과를 지닌다. 그러나 짧은 지속시간으로 인해 수술 후 수 일간 유지되는 통증을 조절하기 위해서는 반복투여가 요구되는 단점을 지닌다. 따라서 수술 후 통증에 의한 환자의 불안감 및 합병증을 예방하고 기존 통증 관리의 미 충족 수요를 개선하기 위해서 서방형 국소마취제 개발이 요구되고 있다.

리포좀은 세포막과 가장 유사한 형태의 단층 또는 다층의 지질-이중막으로 된 구조물로서, 양쪽 친매성 인지질의 특성을 이용하여 약물전달시스템에 적용되고 있다. 리포좀은 소수성 이중막과 친수성의 내부 속 때문에 소수성 또는 친수성 약물의 용해나 캡슐화가 가능하고, 약물의 서방형 방출 조절이 가능하다. 리포좀은 일반적으로 크기 및 형태에 따라 작은 단층 박막 소포 (Single Unilamellar Vesicles, SUV), 큰 단층 박막 소포 (Large Unilamellar Vesicles, LUV), 거대 단층 박막 소포 (Giant Unilamellar Vesicles, GUV), 다중 박막 소포 (Multi Lamellar Vesicle, MLV) 그리고 다중 소포성 리포좀 (Multi-Vesicular Liposome, MVL)으로 분류된다.

이 중 MVL은 단층 및 다중 박막 소포와는 매우 다른 독특한 형태를 지니고 있다. 즉 비 동심구조를 가지며, 다수의 독립된 공간을 지니고 있고, 내부에 수용성물질의 포집이 가능하다. MVL 구조는 박막 소포 구조의 리포좀과 비교했을 때, 주입된 부위의 경막 외 부위에 장기간 존재하며, 흡수가 느리고, 약물이 리포좀으로부터 서서히 방출되는 이점이 있다. 예컨대 대한민국 공개특허공보 제 10-2006-0012027호, 미국 등록특허공보 제 8,182,835호 등에서 MVL 구조를 이용한 서방성 마취제를 예시한다.

본 발명자는 수술 후 효과적인 통증 관리를 위해 부피바카인, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 및 로피바카인으로 이루어진 군에서 선택된 1 종을 MVL에 봉입하여 반복투여 없이 1회 주사만으로 장시간 동안 마취 효과가 유지될 수 있는 부피바카인 서방형 국소마취제를 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허공보 제 10-2006-0012027호

종래의 MVL을 이용한 부피바카인의 서방형 국소마취제 (미국 등록특허공보 제 8,182,835호)는 부피바카인의 낮은 봉입률 때문에 봉입률을 향상시킬 수 있는 방법에 대한 요구가 존재하였다. 본 발명은 포스트-주입 공정을 도입하여 부피바카인, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 및 로피바카인으로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 봉입률을 증가시키면서 서방형 방출을 할 수 있는 MVL 제조방법을 제공하는 것에 의하여 선행 기술의 한계를 해결하고자 하였다.

본 발명자는 아래의 수단으로써 전술한 과제를 해결했다.

1. (a) 1종 이상의 생물학적 활성물질을 pH조절을 통하여 수용액에 용해시켜 제 1 수상을 제조하는 단계; (b) 양친매성 지질성분 및 중성지질을 유기용매에 용해시켜 제 1 오일상을 제조하는 단계; (c) 포스트-주입을 진행할 이온성 지질을 유기용매에 용해시켜 제 2 오일상을 제조하는 단계; (d) (a)의 제 1 수상과 (b)의 제 1 오일상을 혼합하여 상기 생물학적 활성물질을 캡슐화시켜 유중-수 유액 (W/O emulsion)을 형성시키는 단계; (e) 이 유중-수 유액을 다시 부형제가 녹아있는 수상에 혼합하여 수-유-수 유액 (W/O/W emulsion)을 제조 (균질 혼합)하는 단계; (f) 상기 수-유-수 유액을 지질 이중막의 전이온도 이하에서 질소퍼지 과정을 통하여 유기용매를 제거하여 MVL을 형성하는 단계; (g) (f)단계에서 제조된 MVL에 (c)의 제 2 오일상을 천천히 적가하여 포스트-주입을 진행하고 질소퍼지 하는 단계; (h) 0.9% NaCl액을 가하여 리포좀을 수득하는 단계를 포함하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

2. 상기 1 에 있어서, 생물학적 활성물질은 부피바카인, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 및 로피바카인으로 이루어진 군에서 선택된 1 종인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

3. 상기 1 또는 2 에 있어서, 생물학적 활성물질이 부피바카인인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, (a) 단계에서 1 종 이상의 폴리하이드록시 유기산 및 1 종 이상의 무기산으로 pH 를 조절하는 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, (b) 단계에서 유기용매는 에탄올, 메탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

6. 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, (b) 단계에서 양친매성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고마이엘린, 대두레시틴, 난황레시틴, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산, 카디오리핀, 스테알린아민 및 에틸포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고, 중성지질은 글리세롤 에스터, 글리콜 에스터, 토코페롤 에스터, 스테롤 에스터, 탄화수소 및 스쿠알렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

7. 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, (b) 단계에서 콜레스테롤을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

8. 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, (c) 단계의 이온성 지질이 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산 및 스테알린아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.

9. 상기 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 제조방법으로 제조된 다중 소포성 리포좀.

10. 상기 9 에 따른 다중 소포성 리포좀을 포함하는 서방성 제제.

본 발명의 제조방법은 상기 1 의 (b)단계에서 이온성 지질을 사용하지 않으며, 상기 1 의 (c)단계에서 제조된 이온성 지질 용액을 상기 1 의 (f)단계에서 제조된 MVL에 포스트-주입으로 첨가하는 것이 특징이다. 각 제조 단계에서 사용하는 첨가제는 리포좀 제조에 통상적으로 허용되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명은 포스트-주입 공정을 도입함으로써 부피바카인의 봉입률이 종래 기술보다 월등히 개선되어, 서방성 약물 방출 성능이 우수하다.

또한 본 발명에 따라 제조된 MVL 은 외부 표면 전하를 증가시켜 MVL의 안정성을 유지할 수 있는 장점을 지닌다.

또한 본 발명에 따라 제조된 MVL 은 입도의 균일성이 종래보다 우수하다.

도 1은 실시예 1 의 MVL 과 비교예 1 의 MVL 의 리포좀의 입도를 분석한 결과이다.
도 2는 실시예 1의 MVL 과 비교예 1의 MVL 의 입자 형태를 관찰한 결과이다.
도 3은 실시예 1의 MVL 제제와 비교예 1의 MVL 제제의 용출시험결과이다.

종래 알려져 있는 MVL은 양친매성 지질과 중성지질로 이루어진 군에서 선택된 물질들의 혼합물로 이루어지며, 그 제조방법은 하나 이상의 유기 용매 중에 1 종 이상의 양극성 지질과 1 종의 중성 지질을 함유하는 지질 성분을 용해시켜 제 1 오일상을 준비하는 단계; 캡슐화되는 하나 이상의 생물학적 활성 물질을 함유하는 불혼화성 제 1 수상 성분을 준비하는 단계; 상기 지질 성분을 혼합시키는 단계; 두 개의 불혼화성 성분들로부터 유중수 (water-in-oil) 유액을 형성시키는 단계; 유중수 용액을 용매 소구체를 형성시키는 제 2 불혼화성 수성성분으로 전이시켜 침지시키는 단계; 및 증발에 의해서 용매 소구체로부터 유기용매를 제거시키는 단계를 포함한다.

구체적으로, 1983년 발표된 Sinil Kim의 연구 (Biochimica Biophysica Acta 1983 Mar. 9 728 (3) 339-348) 및 2002년 Mantripragada의 연구논문 (Progress of Lipids Research 41 (2002) 392-406), 2007년 Wafa의 연구논문 (International Journal of Pharmaceutics 331 (2007) 182-185) 에서 나타난 바와 같이, MVL의 구획된 미소 소포체가 한 덩어리의 마이크로 클러스터를 유지하는 원리는 개개 소포체의 지질막 사이에서 트리올레인 (triolein) 등의 중성지질이 접촉하는 지질막의 급격한 커브 변화에서도 이중막이 파괴되지 않고 흩어지지 않도록 고정하기 때문인 것으로 알려져 있다. 또한 지질 혼합물 중 포스파티딜글리세롤과 같은 이온성 지질을 혼합함으로써 MVL의 안정성을 높이는 역할을 한다. 그러나 포스파티딜글리세롤을 Pre-주입 하는 종래의 MVL의 경우 부피바카인의 봉입률이 최대 48%로 나오는 한계를 지닌다.

따라서 본 발명자는 종래의 MVL 제조방법이 갖는 한계점을 보완하여 보다 높은 약물 봉입률을 가지는 제조방법으로 MVL 제조 후 이온성 지질을 주입하는 포스트-주입 (post-insertion) 공정을 완성하기에 이르렀다. 본 발명은 종래의 MVL에 비해 부피바카인 또는 부형제의 함량을 줄이면서 서방형을 유지할 수 있는 장점을 지닌다. 본 발명에 따른 MVL을 적용한 부피바카인 주사제는 1회 주사로 장시간 동안 마취 효과가 유지되는 국소마취제로 적용 가능할 수 있다.

본 발명의 특징은 포스트-주입의 공정을 추가하는 것이 특징이다.

본 발명은 종래의 MVL 제조방법인 대한민국 공개특허공보 제 10-2006-0012027호, 미국 등록특허공보 제 8,182,835호와 리포좀 제조의 기본 공정은 유사하나, 리포좀 제조 이후에 포스트-주입으로 DPPG를 첨가하는 것이 특징이다. 리포좀 제조 이후 포스트-주입으로 DPPG를 첨가함으로써 본 발명은 부피바카인의 봉입률을 증가시킬 수 있었다. 실제로 미국 등록특허공보 제 8,182,835에서의 봉입률은 50% 내외이나, 본 발명에 따른 봉입률은 90% 이상에 달한다.

포스트-주입 기술은 보통 PEG-modified lipid를 리포좀에 포함시킬 때 사용되는 방법으로 알려진 기술이다. 그러나 MVL 제조방법에 있어서는 위 포스트-주입 기술을 적용한 사례가 없었다.

본 발명자의 실험결과에 따르면 MVL 제조시 포스트-주입 기술을 적용하는 시점이 매우 중요했다. 예컨대 MVL 제조 시 처음부터 DPPG (pre-insertion)를 첨가하여 제조하면 약물의 봉입률이 많이 떨어졌지만, DPPG를 제외한 MVL 형성 후 포스트-주입으로DPPG 를 첨가한 결과 약물의 봉입이 증가되는 결과를 확인했다.

본 발명의 MVL 제조방법은 (a) 1종 이상의 생물학적 활성물질을 pH조절을 통하여 수용액에 용해시켜 제 1 수상을 제조하는 단계; (b) 양친매성 지질성분 및 중성지질을 유기용매에 용해시켜 제 1 오일상을 제조하는 단계; (c) 포스트-주입을 진행할 이온성 지질을 유기용매에 용해시켜 제 2 오일상을 제조하는 단계; (d) (a)의 제 1 수상과 (b)의 제 1 오일상을 혼합하여 상기 생물학적 활성물질을 캡슐화시켜 유중-수 유액 (W/O emulsion)을 형성시키는 단계; (e) 이 유중-수 유액을 다시 부형제가 녹아있는 수상에 혼합하여 수-유-수 유액 (W/O/W emulsion)을 제조 (균질 혼합)하는 단계; (f) 상기 수-유-수 유액을 지질 이중막의 전이온도 이하에서 질소퍼지 과정을 통하여 유기용매를 제거하여 MVL을 형성하는 단계; (g) (f)단계에서 제조된 MVL에 (c)의 제 2 오일상을 천천히 적가하여 포스트-주입을 진행하고 질소퍼지 하는 단계; (h) 0.9% NaCl액을 가하여 리포좀을 수득하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서 사용된, 1종 이상의 생물학적 활성물질은 국소마취제로 사용되는 부피바카인, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 그리고 로피바카인 중에서 선택된 1 종일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하기로, 부피바카인 (Bupivacaine free-base)이다. 본 발명의 MVL 제조시 사용되는 국소마취제의 함량은 0.01% 에서 10% w/v이나, 바람직하기로는 0.5% 에서 2% w/v 이다.

본 발명에서 사용된 제 1수상의 pH를 조절하기 위하여 사용되는 산은 적어도 1종의 폴리하이드록시 유기산과 적어도 1종 이상의 무기산이다. 바람직하기로는, 폴리하이드록시 유기산 중 글루코닉 또는 글루쿠로닉 산과 무기산인 인산과 염산의 혼합물이다. 본 발명의 MVL 제조시 사용되는 폴리하이드록시 유기산 함량은 0.01 에서 1000 mM이나, 바람직하기로는 10 에서 500 mM이다. 무기산인 인산의 함량은 1 에서 1000 mM 이나 바람직하기로는 10 에서 250 mM이다. 무기산인 염산의 함량은 0.1 에서 50 mM이나, 바람직하기로는 0.5 에서 25mM이다.

상기 지질 혼합물을 용해시키는 유기용매는 휘발성 유기용매로서 에탄올, 메탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 그리고 에테르 중에서 선택된 1종이나 2 종 이상의 조합의 사용이 가능하다.

본 발명에서 사용된 지질혼합물은 적어도 1종 이상의 양친매성 지질과 적어도 1종 이상의 중성지질의 혼합물로서, 여기서 상기 양친매성 지질성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고마이엘린, 대두레시틴, 난황레시틴, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산, 카디오리핀, 스테알린아민, 에틸포스파티딜콜린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종의 군 이상인 것을 사용하며, 더 상세하게는 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디베헤노일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-스파티딜콜린, 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 1,2-디유루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 중 1종 이상이다. 바람직하기로는 포스파티딜 콜린 중 1종이다. 본 발명의 MVL 제조시 사용되는 양친성 지질의 함량은 0.1 에서 100 mM이나, 바람직하기로는 10 에서 20 mM 이다.

본 발명에서 상기 중성지질 성분은 글리세롤 에스터, 글리콜 에스터, 토코페롤 에스터, 스테롤 에스터, 탄화수소 그리고 스쿠알렌으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종의 군 이상인 것이 바람직하고, 더 상세하게는 트리올레인, 트리팔미토올레인, 트리미리스트올레인, 트리리노올레인, 트리부틸린, 트리카프릴린, 트리카프로인 및 트리카프린 중 1 종 이상인 것이 바람직하다. 본 발명의 MVL 제조시 사용되는 중성지질의 함량은 0.1 에서 100 mM이나, 바람직하기로는 10 에서 20 mM 이다.

본 발명에서 사용된 지질혼합물에 추가적으로 MVL의 안정성을 확보하기 위하여 콜레스테롤을 첨가할 수 있으며, 본 발명의 MVL 제조시 콜레스테론의 함량은 10 에서 100 mM 이나, 바람직하기로는 20 에서 40 mM이다.

본 발명에서 유중-수 유액(W/O emulsion)은 제 1수상과 제 1 오일상을 혼합시켜 제조하는 단계로, 균질화기는 2000 내지 20000 rpm (분당 회전수)의 속도에서 수행된다. 바람직하게로는 8000에서 16000 rpm의 속도로 수행되며, 보다 더 바람직하게로는 2000 에서 6000 rpm의 속도에서 수행된다. 유중-수 유액의 제조시간은 5에서 100분이다. 바람직하게로는 10에서 60분이다. 유중-수 유액의 온도는 약 15에서 40°C이다. 바람직하게로는 20에서 32°C이다.

본 발명에서 수-유-수 유액은 유중-수 유액을 부형제가 녹아있는 수상에 적가하여 혼합시켜 제조하는 단계로, 부형제로서는 pH 조절용 버퍼, 삼투압 조절용 시약, 전해질, 안정화제 (Sugar 등), 보존제, 반고형 제형으로 알려진 다른 부형제 등이 사용될 수 있다. 예를 들어 라이신, 덱스트로즈, 글루코즈등이 사용될 수 있다. 균질화 시간은 약 10초에서 10 분이며, 바람직하기로는 10초에서 5분이다. 수-유-수 유액의 온도는 약 20에서 50°C이다.

본 발명에서 수-유-수 유액을 지질 이중막의 전이온도 이하에서 질소퍼지 과정을 통하여 유기용매를 제거하여 MVL을 형성하는 단계에서, 질소의 유량은 10에서 100 L/분이다.

본 발명에서 생성된 MVL에 포스트-주입을 하는 단계에서 사용되는 양친매성 이온성 지질은, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산, 스테알린아민 중 1종이다. 바람직하기로는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤이다. 상기 지질 혼합물을 용해시키는 유기용매는 휘발성 유기용매로서 에탄올, 메탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 그리고 에테르 중에서 선택된 1종이나 2 종 이상의 조합의 사용이 가능하다. 본 발명의 포스트 주입에 사용되는 이온성 지질의 함량은 0.1 에서 100 mM이나, 바람직하기로는 0.1 에서 10 mM 이다.

포스트-주입으로 제조된 MVL을 수득하는 단계에 사용되는 용액은 0.9% NaCl을 사용하며, 원심분리기 및 필터를 이용하여 MVL을 수득한다. 원심분리기는 100에서 1000 x g로 사용되며, 바람직하기로는 200 에서 600 x g 이다. 필터의 예로는 다이아필트레이션 (diafiltration)이 있다.

종래 이온성 지질의 pre-insertion으로 제조된 MVL의 경우 부피바카인 봉입률은 최대 50% 내외이고 제조 후 입자간의 합일이나 안정성에 대한 문제점을 가질 수 있다. 그러나, 본 발명의 DPPG 포스트-주입 공정을 적용하여 제조된 MVL의 부피바카인 봉입률은 90% 이상으로 증대되며, MVL 외부 표면 전하를 증가시켜 MVL의 안정성을 유지할 수 있는 장점을 지닌다.

또한 본 발명의 제조방법은 부피바카인뿐 아니라, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 및 로피바카인에도 적합하다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 설명한다. 다만 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 예시하기 위해 소개하는 내용일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이로써 제한되어서는 안 될 것이다.

실시예 1: 포스트-주입 공정을 이용한 MVL 제조

제 1 오일상은 82 mg 1,2-디유루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DEPC), 47 mg 콜레스테롤, 20mg 트리카프릴린을 클로로포름 3 mL에 분산시키고 50°C에서 교반하여 완전히 용해 후 실온으로 식혀 준비하였다. 제 1 수상은 부피바카인 (bupivacaine-freebase) 135 mg, 100 mM 인산, 100 mM 글루코닉산, 1M 염산 40 μL을 혼합 후 삼차증류수로 3mL을 채워 교반하여 준비하였다. 제 1 수상을 제 1 오일상에 적가하여 균질화기로 2분간 10,000 rpm으로 균질화하여 유중-수 유액 (W/O emulsion)을 제조하였다. 유중-수 유액을 20 mL의 3.2% 글루코스, 40 mM 라이신 수용액에 적가하여 균질화기로 30초간 10,000 rpm으로 균질화하여 수-유-수 유액 (W/O/W emulsion)을 제조하였다. 33°C로 유지되고 있는 275 mL의 3.2% 글루코스, 10 mM 라이신 수용액을 250 rpm으로 교반하면서 제조된 수-유-수 유액을 적가한 후 20L/min의 속도로 질소를 불어 넣어주어 클로로포름을 모두 증발시켜 MVL 용액을 제조한다. 포스트-주입을 위하여 16 mL 에탄올에 9 mg 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤을 가열하여 녹인 후 실온으로 식힌다. 33°C로 유지되고 있는 MVL 용액을 250 rpm으로 교반하면서 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 용액을 한 방울씩 적가한 후 20L/min의 속도로 질소를 불어 넣어주어 에탄올을 모두 증발시킨다. 포스트-주입이 끝난 MVL 용액에 0.9% 염화나트륨 용액을 가하여 부피를 800 mL로 맞춘 후 냉장보관하여 입자의 자연침강을 유도한 후 리포좀을 수득한다.

비교예 1: Pre-insertion 공정을 이용한 MVL 제제의 제조

제 1 오일상은 82 mg 1,2-디유루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DEPC), 9 mg 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤, 47 mg 콜레스테롤, 20mg 트리카프릴린을 클로로포름 3 mL에 분산시키고 50°C에서 교반하여 완전히 용해 후 실온으로 식혀 준비하였다. 제 1 수상은 부피바카인 (bupivacaine-freebase) 135 mg, 1M 인산 768 μL, 글로코닉산 95 μL, 1M 염산 40 μL 그리고 삼차증류수 2.137 mL을 교반하여 준비하였다. 제 1 수상을 제 1 오일상에 적가하여 균질화기로 2분간 10,000 rpm으로 균질화 하여 유중-수 유액 (W/O emulsion)을 제조하였다. 유중-수 유액을 20 mL의 3.2% 글루코스, 40 mM 라이신 수용액에 적가하여 균질화기로 30초간 10,000 rpm으로 균질화 하여 수-유-수 유액 (W/O/W emulsion)을 제조하였다. 33°C로 유지되고 있는 275 mL의 3.2% 글루코스, 10 mM 라이신 수용액을 250 rpm으로 교반하면서 제조된 수-유-수 유액 (W/O/W emulsion)을 적가한 후 20L/min의 속도로 질소를 불어 넣어주어 클로로포름을 모두 증발시켜 MVL 용액을 제조한다. MVL 용액에 0.9% 염화나트륨 용액을 가하여 부피를 800 mL로 맞춘 후 냉장보관하여 입자의 자연침강을 유도한 후 리포좀을 수득한다.

실험예 1: MVL 제제의 물리화학적 특성 분석

실시예 1에서 제조된 MVL의 물리화학적 특성을 평가하기 위하여, 입도, 삼투압, 성상 및 봉입률을 분석하였다. 본 실험예에서 대조제제로는 비교예를 사용하였다.

(1) 입도 분석

리포좀의 입도는 입도 분석기 (APA5001SR, Malvern)를 이용하여 실시예 1 및 비교예 1의 입도를 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 입도 분석 결과, 평균 입자 크기 (D₅₀)는 실시예 1의 제제 25.7μm, 비교예 1의 제제 30.86 μm으로 측정되었다. 스팬 (span)값은 실시예 1은 0.78, 비교예 1은 1.26으로 측정되었다. 이로부터, 본 발명의 실시예 1에 의하여 제조된 MVL은 종래의 MVL에 비하여 입도의 균일성 측면에서 더욱 우수함을 확인할 수 있다

(2) 삼투압 분석

삼투압 측정기 (Model 210, Fiske)를 이용하여 실시예 1과 비교예 1의 MVL의 삼투압을 측정한 결과 평균 310 mOsmol/kg로 유사한 값을 나타내었다.

(3) MVL 성상 관찰

실시예 1과 비교예 1의 샘플을 각각 20 μL를 취하여 생리 식염수 (0.9% NaCl) 40 μL로 희석하여 샘플을 slide glass위에 떨어뜨린 후 cover glass로 덮고 광학현미경 (Olympus)으로 입자의 형태를 관찰하여 도 2에 나타내었다. 실시예 1과 비교예 1의 두 샘플 모두 MVL 특징인 입자 내부에 소포가 관찰되어 MVL로 제조됨을 확인하였다.

(4) 봉입률 측정

MVL 봉입된 부피바카인 함량을 측정하기 위하여 HPLC 분석을 수행하였다. 분석 조건은 다음과 같다.

- 컬 럼: 안지름 4.6 mm, 길이 150mm인 스테인레스 강관에 5μm의 옥타데실 실리카겔 충전

- 컬럼온도: 30°C

- 이동상: 10 mM 인산 완충액 350mL에 아세토니트릴 650mL을 넣은 혼합액

- 유 속: 1mL/min

- 검출기: 자외부 흡광 광도계 (측정파장 : 209 nm)

HPLC 분석 결과, 비교예 1의 봉입률은 50%로 미국 등록특허공보 제 8,182,835호 결과와 유사한 것을 확인하였다. 그러나 실시예 1의 봉입률은 93.1%로 비교예 1과 비교하여 80% 이상의 봉입률이 증가됨을 확인되었다. 이로부터, 본 발명의 포스트-주입 공정으로 제조된 실시예 1의 MVL 제조방법은 종래의 MVL 제조방법에 비하여 봉입률을 획기적으로 향상시킬 수 있는 제조방법임을 확인할 수 있다.

실험예 2: 용출 시험

실시예 1에서 제조된 MVL의 시험관 내 (in vitro) 방출 특성을 확인하기 위하여, 투석막을 이용하여 용출 시험을 진행하였다. 상기 용출 시험은 pH 7.4의 10 mM 인산 완충액에 리포좀이 담긴 투석막을 담지하여 교반 배양기 (BF-60 SIR, Biofree) 37°C 90 rpm조건 하에서 26일간 용출량을 측정하는 방식으로 수행되었다.

도 3은 상기 용출시험의 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3에 나타난 바와 같이 실시예 1의 포스트-주입 MVL은 비교예 1의 MVL에 비해 서방형 방출특성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 실시예 1의 MVL은 부피바카인을 26일간 지속적으로 방출할 수 있는 서방형 제제로서, 체내에서의 방출 특성 역시 유사할 것으로 예측할 수 있다.

Claims (8)

1. (a) 1종 이상의 생물학적 활성물질을 pH조절을 통하여 수용액에 용해시켜 제 1 수상을 제조하는 단계; (b) 양친매성 지질성분 및 중성지질을 유기용매에 용해시켜 제 1 오일상을 제조하는 단계; (c) 포스트-주입을 진행할 이온성 지질을 유기용매에 용해시켜 제 2 오일상을 제조하는 단계; (d) (a)의 제 1 수상과 (b)의 제 1 오일상을 혼합하여 상기 생물학적 활성물질을 캡슐화시켜 유중-수 유액 (W/O emulsion)을 형성시키는 단계; (e) 이 유중-수 유액을 다시 부형제가 녹아있는 수상에 혼합하여 수-유-수 유액 (W/O/W emulsion)을 제조 (균질 혼합)하는 단계; (f) 상기 수-유-수 유액을 지질 이중막의 전이온도 이하에서 질소퍼지 과정을 통하여 유기용매를 제거하여 MVL을 형성하는 단계; (g) (f)단계에서 제조된 MVL에 (c)의 제 2 오일상을 천천히 적가하여 포스트-주입을 진행하고 질소퍼지 하는 단계; (h) 0.9% NaCl액을 가하여 리포좀을 수득하는 단계를 포함하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활성물질은 부피바카인, 레보-부피바카인, 메피바카인, 리도카인, 피로카인, 프리로카인 및 로피바카인으로 이루어진 군에서 선택된 1 종인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, (a) 단계에서 1 종 이상의 폴리하이드록시 유기산 및 1 종 이상의 무기산으로 pH 를 조절하는 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, (b) 단계에서 유기용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
5. 제 1 항에 있어서, (b) 단계에서 양친매성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핑고마이엘린, 대두레시틴, 난황레시틴, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산, 카디오리핀, 스테알린아민 및 에틸포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고, 중성지질은 글리세롤 에스터, 글리콜 에스터, 토코페롤 에스터, 스테롤 에스터, 탄화수소 및 스쿠알렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
6. 제 1 항에 있어서, (b) 단계에서 콜레스테롤을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
7. 제 1 항에 있어서, (c) 단계의 이온성 지질이 포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딕산 및 스테알린아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 다중 소포성 리포좀의 제조방법.
8. 제 1 항에 따른 제조방법으로 제조된 다중 소포성 리포좀.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   

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