KR20200067158A - 인간 혈청 알부민 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

(i) 위치 (522)에서 글루타민 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 치환; (ii) 위치 (552)에서 알라닌이 발린으로 치환; 및 (iii) 위치 (572)에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 치환;으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편.

Description

인간 혈청 알부민 변이체 및 이의 용도
본 발명은 인간 혈청 알부민 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
혈청 알부민은 인간 혈장에서 가장 풍부하고 자연적으로 발생하는 단백질이며, 혈액의 삼투압을 유지하고 혈류의 다양한 물질을 운반하는 데 주요한 역할을 한다.
혈청 알부민은 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor; FcRn)를 포함하는 in vivo 다수의 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 상호 작용은 알부민의 혈장 반감기에 중요한 것으로 알려져 있다. FcRn은 많은 세포 및 조직 유형(예를 들어, 내피 세포)에서 발현되는 막 결합 단백질이며, 지속적으로 내재화되고 재순환된다. 알부민은 중성 pH에서 FcRn에 결합하지 않지만, 일단 엔도사이토스된(endocytosed) 알부민은 엔도좀의 산성 조건 하에서 FcRn에 결합한다. FcRn-결합 알부민은 분해되지 않고, FcRn으로부터 분리되는 생리적 pH에서 FcRn과 함께 세포 표면으로 다시 재순환된다.
알부민은 약 19일의 긴 혈장 반감기를 갖는다. 이러한 긴 반감기로 인하여 약학적 화합물의 반감기를 연장시키기 위해 알부민을 사용하게 되었다. 예를 들면, 알부민은 인간 응고 인자 IX(FIX)에 융합되어 FIX의 반감기가 연장되었다(IDELVION®). 알부민은 또한 약물 반감기 및 약물 축적을 증가시키기 위해 화학요법 화합물(예: 파클리탁셀)에 접합되었다(예를 들어, Abraxane®).
천연 혈청 알부민과 비교하여 FcRn에 대한 개선된 결합 또는 친화도를 나타내는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 인간 혈청 알부민 변이체는 이전에 기술된 바 있다(예를 들어, WO2011051489).
그러나, 당업자에게는 FcRn에 대한 친화도 증가, 혈장 반감기 증가 및/또는 제거율 감소와 같은 개선된 약동학적 특성을 갖는 혈청 알부민 변이체가 당업계에서 계속 요구되고 있음이 명백할 것이다. 또한, 약물 투여 및 축적을 최적화하기 위해 혈장에서 약물의 혈장 반감기를 제어하는 방법을 개발할 필요가 있다.
요약
본 발명은 혈청 알부민에서 특정 아미노산 치환이 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 개선 또는 증가시킨다는 발명자들의 확인에 기초한다. 특정 아미노산 치환을 갖는 혈청 알부민 변이체는 혈장 반감기를 향상시킬 수 있다.
본 발명자들은 서열번호 1의 522, 552 및 572 잔기가 FcRn에 결합하기 위해 중요하다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 이들 잔기에서 특정 아미노산으로의 치환이 산성 pH에서 FcRn에 대한 결합을 증가 또는 향상시킨다는 것을 확인하였다.
본 발명자들에 의한 발견은 서열번호 1의 522, 552 또는 572번째 아미노산에 상응하는 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 혈청 알부민 변이체에 대한 기초를 제공한다. 또한, 대상체에서 출혈 장애와 같은 장애를 치료하기 위한 방법에 대한 기초를 제공한다.
본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다:
(i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환;
(ii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환;
(iii) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환; 및
(iv) 이들의 조합.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 이소류신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 리신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 메티오닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 페닐알라닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 트립토판으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 발린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 알라닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 알라닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 글루탐산으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 히스티딘으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 세린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 리신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 발린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산, 서열번호 1의 552번째 아미노산 및 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 상기 제시된 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 선택적으로 서열번호 1의 522번째 아미노산, 서열번호 1의 552번째 아미노산 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 상기 제시된 아미노산 치환 이외에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 본 개시 내용에 이용하기에 적합한 추가의 아미노산 치환은 당업자에게 명백할 것이며, 자연 발생 치환 및 조작 된 치환을 포함하고, 이는 예를 들면 WO 2011051489에 기술된 것을 참조할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 개선된 약동학적 성질을 갖는다. 혈청 알부민의 약동학적 성질은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, FcRn에 대한 결합 친화도, 혈장 반감기 및/또는 혈장 제거율을 포함한다. 본 발명의 혈청 알부민 변이체의 약동학적 특성을 결정하는 방법은 당업자에게 명백하며, 또는 본원에 기술될 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 FcRn에 대해 증가된 친화도로 결합한다. 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn에 대한 친화도를 결정하는 방법은 당업자에게 명백하며, 또는 본원에 기술될 것이다. 일 실시예에서, FcRn에 대한 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 결합 친화도는 유세포 분석에 의해 결정된다. 예를 들면, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 안정적으로 발현하는 CHO 세포는 산성(pH 5.5) 및 중성(pH 7.4) pH에서 alexa-488 labeled FcRn/β2m(표적 결합 검출용) 및 anti-myc-alexa 647(발현 검출용)로 염색되고, 유세포 분석에 의해 분석된다. 일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn/β2m에 대한 친화도는 변형되지 않은 혈청 알부민(예를 들어, 서열번호 1에 제시된 바와 같이)에 대한 평균 형광 강도를 계산함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 친화도는 바이오센서 분석(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 사용)에 의해 결정된다. 예를 들면, 고정된 FcRn에 대한 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 결합 친화도(즉, 상호작용의 강도)는 pH 5.4 및/또는 pH 7.4 및 37℃에서 측정된다. 다른 실시예에서, FcRn에 대한 고정된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 결합 친화도(즉, 상호작용의 강도)는 pH 5.4 및/또는 pH 7.4 및 37℃에서 측정된다. 일 실시예에서, 친화상수(KD), 해리상수(Kd) 및 결합상수(Ka)가 결정된다. 예를 들면, 친화상수(KD)는 해리상수(Kd)와 결합상수(Ka)의 비(즉, KD = Kd/Ka)이다.
일 실시예에서, 결합 친화도는 산성 pH에서 측정된다. 예를 들면, 산성 pH는 약 pH 6.0 미만, 예컨대 약 pH 5.9, 또는 약 pH 5.8, 또는 약 pH 5.7, 또는 약 pH 5.6, 또는 약 pH 5.5, 또는 약 pH 5.4 또는 약 pH 5.3, 또는 약 pH 5.2, 또는 약 pH 5.1 또는 약 pH 5.0이다. 일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민에 비해 산성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화도로 결합한다. 예를 들면, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 엔도좀에서의 결합을 용이하게 하기 위해 보다 낮은 pH, 예를 들어 약 pH 6.0에서 FcRn에 대해 증가된 친화도로 결합한다. 일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 약 pH 7.4에서의 친화도와 비교하여 약 pH 6.0에서 FcRn에 대한 친화도가 증가하여 세포 재순환 후 혈청 알부민 변이체의 혈액으로의 재방출을 촉진한다. 본 발명의 아미노산 치환은 FcRn-매개 재순환을 증가시킴으로써 단백질의 반감기를 연장시키는 데 유용하며, 이에 따라 혈액으로부터의 제거를 감소시킨다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn에 대한 결합 수준은 세포 결합 연구로 결정된 바에 의하면 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 pH 5.4에서 증가된다. 일 실시예에서, 세포 결합 연구로 결정된 바에 의하면, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn에 대한 결합 수준은 pH 7.4에서의 친화도와 비교하여 pH 5.4에서 증가된다. 일 실시예에서, SPR 분석에 의해 결정된 바에 따르면, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn에 대한 결합 수준은 pH 7.4에서의 친화도와 비교하여 pH 5.4에서 증가된다. 일 실시예에서, 유세포 분석에 의해 측정된 바에 따르면, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn에 대한 결합 수준은 pH 7.4에서의 친화도와 비교하여 pH 5.4에서 증가된다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 적어도 약 2배 이상, 또는 약 4배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상, 또는 약 15배 이상 증가된다. 일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민에 비해 약 2배 내지 약 5배 증가된다. 예를 들면, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 약 2배, 또는 약 2.25배, 또는 약 2.5배, 또는 약 2.75배, 또는 약 3배, 또는 약 3.25배, 또는 약 3.5배, 또는 약 3.75배, 또는 약 4배, 또는 약 4.25배, 또는 약 4.5배, 또는 약 4.75배, 또는 약 5배 증가된다. 일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 약 2.4배, 또는 약 2.8배, 또는 약 3.1배, 또는 약 3.4배, 또는 약 3.7배, 또는 약 3.9배, 또는 약 4배, 또는 약 4.8배 증가된다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 약 5배 내지 약 15배 증가된다. 예를 들면, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 약 5배, 또는 약 5.5배, 또는 약 6배, 또는 약 6.5배, 또는 약 7배, 또는 약 7.5배, 또는 약 8배, 또는 약 8.5배, 또는 약 9배, 또는 약 9.5배, 또는 약 10배, 또는 약 10.5배, 또는 약 11배, 또는 약 11.5배, 또는 약 12배, 또는 약 12.5배, 또는 약 13배, 또는 약 13.5배, 또는 약 14배, 또는 약 14.5배, 또는 약 15배 증가된다. 일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민에 비해 약 7.6배, 또는 약 8.6배, 또는 약 13.8배 증가된다.
일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 15배 내지 약 50배 증가된다. 예를 들면, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 15배, 또는 약 20배, 또는 약 25배, 또는 약 30배, 또는 약 35배, 또는 약 40배, 또는 약 45배, 또는 약 50배 증가한다. 일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 42배, 또는 약 43배, 또는 약 47배, 또는 약 48배 증가한다.
다른 예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 50배 내지 약 100배 증가된다. 예를 들면, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 50배, 또는 약 55배, 또는 약 60배, 또는 약 65배, 또는 약 70배, 또는 약 75배, 또는 약 80배, 또는 약 85배, 또는 약 90배, 또는 약 95배, 또는 약 100배 증가된다. 일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민과 비교하여 약 57배, 또는 약 58배 증가된다.
추가의 예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 100배 내지 약 250배 증가된다. 예를 들면, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 약 100배, 또는 약 110배, 또는 약 120배, 또는 약 130배, 또는 약 140배, 또는 약 150배, 또는 약 160배, 또는 약 170배, 또는 약 180배, 또는 약 190배, 또는 약 200배, 또는 약 210배, 또는 약 220배, 또는 약 230배, 또는 약 240배 또는 약 250배 증가된다. 일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 180배 또는 약 240배 증가된다.
일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 250배 이상 증가된다. 예를 들면, 상기 혈청 알부민 변이체의 FcRn에 대한 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 200배, 또는 약 250배, 또는 약 300배, 또는 약 350배, 또는 약 400배, 또는 약 450배, 또는 약 500배 증가된다. 일 실시예에서, FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 변이체의 결합 수준은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 약 410배 증가된다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체의 혈청 반감기는 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민과 비교하여 증가된다. 예를 들면, 본 발명의 혈청 알부민 변이체의 혈청 반감기는 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민과 비교하여 약 1.5배 증가된다. 일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체의 혈청 반감기는 약 1.5배, 또는 약 2배, 또는 약 2.5배, 또는 약 3배, 또는 약 3.5배, 또는 약 4배, 또는 약 4.5배, 또는 약 5배, 또는 약 5.5배, 또는 약 6배, 또는 약 6.5배, 또는 약 7배, 또는 약 7.5배, 또는 약 8배, 또는 약 8.5배, 또는 약 9배, 또는 약 9.5배, 또는 약 10배 증가된다. 일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체의 혈청 반감기는 약 5일 내지 약 10일 이상 증가된다. 예를 들면, 본 발명의 혈청 알부민 변이체의 혈청 반감기는 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 25일, 또는 약 30일, 또는 약 35일, 또는 약 40일, 또는 약 45일 또는 약 50일 증가된다. 혈청 알부민 변이체의 반감기를 결정하는 방법은 당업자에게 명백하며, 또는 본원에 기술될 것이다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체의 반감기는 생체 내 분석을 사용하여 결정된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 농도는 인간 혈청 알부민 특이적 항체를 사용하여 ELISA(효소결합면역흡착측정법)로 측정된다. 예를 들면, ELISA는 시판되는 방법을 사용하여 수행된다. 다른 예에서, 혈청 알부민 변이체는 마우스 또는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkeys)에 정맥 내 주사되고, 혈장 농도는 시간의 함수로서 주기적으로 측정된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체의 혈장 농도는 주사 후 3분 내지 72시간에 측정된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체의 혈장 농도는 주사 후 60일까지 측정된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체는 방사성 표지된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 in vivo 반감기는 베타상(beta-phase)의 제거율을 계산함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 in vivo 반감기는 변형되지 않은 혈청 알부민(예를 들어, 서열번호 1로 제시된 바와 같이)의 in vivo 반감기와 비교된다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체의 제거율(즉, 재순환 및 흡수)은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 감소된다. 혈청 알부민 변이체의 제거율(즉, 재순환 및 흡수)을 결정하는 방법은 당업자에게 명백하며, 또는 본원에 기술될 것이다. 일 실시예에서, 공초점 형광 현미경은 혈청 알부민 변이체가 재순환되는지를 결정하기 위해 사용된다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체가 재순환되는지를 결정하기 위해, 형광 표지된 혈청 알부민 변이체는 세포 표면에서 인간 FcRn 수용체를 발현하는 세포와 배양되고 공초점 형광 현미경에 의해 가시화된다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산; 또는
(ii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산; 또는
(iii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산; 또는
(iv) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군에서 선택된 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 추가로 포함한다.
일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환; 및/또는
(ii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환; 및/또는
(iii) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환; 또는
(ii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 및 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환; 또는
(iii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환; 또는
(iv) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
(v) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
(vi) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
(vii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에 글리신이 아르기닌으로 치환; 또는
(viii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
(ix) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
(x) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민 류신으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환된 아미노산, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환, 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 포함한다.
본 개시 내용은 본 발명에 따른 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편 및 화합물을 포함하는 혈청 알부민 접합체(conjugate)를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체는 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 접합체와 비교하여 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 증가된 혈청 반감기의 예 및 혈청 반감기 측정을 위한 분석은 본원에 기재되어 있고, 본 개시 내용의 실시예에 준용되도록 적용되어야 한다.
다른 예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체는 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 접합체와 비교하여 FcRn에 대한 결합 친화도가 증가된다. 예를 들면, FcRn에 대한 혈청 알부민 접합체의 결합 수준은 적어도 약 2배 또는 4배 또는 5배 또는 10배 증가된다. 예를 들면, FcRn에 대한 결합 수준은 적어도 약 2배 또는 10배 또는 40배 또는 100배 또는 150배 증가된다. FcRn에 대한 증가된 결합 친화도의 예 및 이를 결정하기 위한 분석이 본원에 기재되어 있고, 본 개시 내용의 실시예에 준용되도록 적용되어야 한다.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 다른 화합물에 접합 및/또는 다른 화합물을 캡슐화한다. 본 개시 내용에 의해 고려되는 화합물은 천연 화합물, 화학적 소분자 화합물 또는 생물학적 화합물을 포함하는 임의의 다양한 형태를 취할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편에 직접 또는 간접적으로 결합된 화합물에 접합된다.
예시적인 화합물에는 단백질, 항체 가변 영역을 포함하는 단백질, 항체 모방체(mimetic), 도메인 항체, 독소, 방사성 동위원소, 검출 가능한 표지, 펩티드, 폴리펩티드, 콜로이드, 화학요법제, 핵산, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), siRNA, 간섭 RNA(RNAi), 리보자임, 마이크로 RNA, 마이크로 RNA 적합 shRNA(shRNAmir), DNAzyme 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일 실시예에서, 검출 가능한 표지는 이미징제이다.
일 실시예에서, 화합물은 단백질계 화합물, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다. 일 실시예에서, 단백질은 치료용 단백질이다.
다른 예에서, 화합물은 비-항체 항원 결합 도메인, 예컨대 아드넥틴(adnectin), 애피바디(affibody), 아트리머(atrimer), 이베이신(evasin), 설계된 안키린-반복 단백질(designed ankyrin-repeat protein; DARPin) 또는 안티칼린(anticalin)을 포함하는 단백질이다(예를 들어, 치료용 단백질).
일 실시예에서, 화합물은 가변 영역 단편(Fv)을 포함하는 단백질(예를 들어, 치료용 단백질)이다. 예를 들면, 단백질은 다음으로 구성된 군에서 선택된다:
(i) 단일쇄 Fv 단편(single chain Fv fragment; scFv);
(ii) 이량체 scFv(dimeric scFv; di-scFv); 또는
(iii) 디아바디(diabody);
(iv) 트리아바디(triabody);
(v) 테트라바디(tetrabody);
(vi) Fab;
(vii) F(ab')2;
(viii) Fv; 또는
(ix) 항체, Fc 또는 중쇄 불변영역(CH) 2 및/또는 CH3에 연결된 (i) 내지 (viii) 중 하나.
일 실시예에서, 단백질은 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 재조합, 키메라(chimeric), CDR 이식(grafted), 인간화, 유사인간화(synhumanized), 영장류화(primatized), 탈면역화(deimmunized) 또는 인간 항체이다.
일 실시예에서, 본 발명은 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 또는 이의 변형된 형태에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 예를 들면, 상기 화합물은 폰 빌레브란트 인자 또는 그의 변형된 형태이다. 일 실시예에서, 폰 빌레브란트 인자는 D´D3 도메인을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명은 보체 억제제 또는 이의 변형된 형태에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 예를 들면, 상기 화합물은 보체 억제제 또는 그의 변형된 형태이다. 일 실시예에서, 보체 억제제는 인자 I(fI), 인자 H(fH), C4b-결합 단백질(C4bp), 가용성 CD55(분해가속인자(DAF)), C1-억제제(C1-INH 또는 C1 에스테라제 억제제); 가용성 CD35(sCR1); 가용성 CD46(막 보조인자 단백질(MCP)), 가용성 CD59(protectin), TT30(CR2-fH), 코브라독인자(CVF) 및 이의 기능성 단편 또는 변이체로 구성된 군에서 선택된다.
일 실시예에서, 보체 억제제는 sCR1과 같은 가용성 보체 억제제, 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다. 일 실시예에서, 보체 억제제는 변이 또는 변형된 sCR1이다.
일 실시예에서, 보체 억제제는 C1-억제제(즉, C1-INH), 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체이다. 일 실시예에서, 보체 억제제는 변형된 C1-INH의 변이체이다.
일 실시예에서, 본 발명은 혈액 응고 인자에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
다른 예에서, 본 발명은 혈액 응고 인자에 결합하는 화합물에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 예를 들면, 상기 화합물은 혈액 응고 인자이거나 이에 결합한다.
일 실시예에서, 혈액 응고 인자는 인자 I, 인자 II(프로트롬빈)/트롬빈, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII 및 상기 중 임의의 것의 활성화된 형태로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 혈액 응고 인자는 인자 IX 및/또는 인자 IXa이다. 다른 예에서, 혈액 응고 인자는 인자 X 및/또는 인자 Xa이다. 추가의 예에서, 혈액 응고 인자는 인자 IX/IXa 및 인자 X/Xa이다. 일 실시예에서, 혈액 응고 인자는 인자 VII 및/또는 인자 VIIa이다. 다른 예에서, 혈액 응고 인자는 인자 VIII 및/또는 인자 VIIIa이다.
본 개시 내용은 또한, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 및 약학적 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 접합체를 포함하는 조성물과 비교하여 FcRn에 대한 결합 친화도가 증가하였다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 접합체를 포함하는 조성물과 비교하여 혈청 반감기가 증가되었다.
본 개시 내용은 또한, 대상체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 혈청 알부민 접합체, 또는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 대상체는 이를 필요로 한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용은 대상체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편, 또는 혈청 알부민 접합체, 또는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용은 대상체의 질병 또는 병태 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 본 발명의 혈청 알부민 접합체, 또는 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물의 사용을 제공한다.
일 실시예에서, 질병 또는 병태는 출혈 장애이다.
일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애를 앓고 있다. 일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애를 앓는 것으로 진단되었다. 일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애에 대한 치료를 받고 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애의 발병 전 또는 후에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애의 발병 전에 투여된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애의 발병 후에 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 사건의 시작 전 또는 후에 투여된다. 일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 사건의 시작 전에 투여된다. 다른 예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 사건의 시작 후에 투여된다.
출혈 사건은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면 경미한 및/또는 주요 출혈 사건을 포함한다. 일 실시에서, 출혈 사건은 주요 출혈 사건이다. 예를 들면, 주요 출혈 사건은 헤모글로빈의 ≥ 5 g/dL 감소 또는 헤마토크릿의 ≥ 15% 절대적 감소로 이어지는 출혈의 모든 에피소드이다. 일 실시예에서, 출혈 사건은 경미한 출혈 사건이다. 예를 들면, 경미한 출혈 사건은 헤모글로빈 ≤ 4g/dL로 감소 또는 헤마토크릿 ≥ 10% 절대적 감소로 이어지는 출혈의 모든 에피소드이다.
일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애가 발생할 위험이 있다. 예를 들면, 출혈 장애가 발생할 위험이 있는 대상체는 혈액 응고 인자, 예를 들어, 인자 VII 및/또는 인자 IX에서 돌연변이, 결실 또는 재배열을 갖는 대상체 또는 혈소판 장애를 갖는 대상체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애가 발생한 친척이 있다. 예를 들면, 출혈 장애가 유전된다. 일 실시예에서, 출혈 장애는 후천적이다.
일 실시예에서, 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애 증상의 시작 전 또는 후에 투여된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애 증상이 시작되기 전에 투여된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애 증상이 시작된 후에 투여된다. 일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 출혈 장애의 증상 중 하나 이상을 완화시키거나 감소시키는 용량으로 투여된다.
출혈 장애의 증상은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면:
Figure pct00001
멍 들기 쉬움;
Figure pct00002
잇몸 출혈;
Figure pct00003
작은 상처나 치과 치료로 인한 심한 출혈;
Figure pct00004
설명되지 않는 코피;
Figure pct00005
심한 월경 출혈;
Figure pct00006
관절에 출혈; 및/또는
Figure pct00007
수술 후 과도한 출혈.
일 실시예에서, 출혈 장애는 혈액 응고 장애에 의해 야기된다. 예를 들면, 혈액 응고 장애는 혈우병, 폰 빌레브란트 병, 인자 I 결핍, 인자 II 결핍, 인자 V 결핍, 결합된 인자 V/인자 VIII 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XI 결핍 또는 인자 XIII 결핍이다. 일 실시예에서, 혈우병은 혈우병 A 또는 혈우병 B이다. 일 실시예에서, 대상체는 예방적 치료가 필요한 상태를 갖는다.
일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈청 알부민 변이체를 포함하는 조성물은 대상체에서 출혈의 중증도를 감소시키는 양으로 대상체에 투여된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 한 예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들면 인간과 같은 영장류이다.
본원에 기재된 치료 방법은 출혈 장애의 영향을 감소, 치료 또는 예방하기 위해 추가의 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 또한, 출혈 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 혈액 응고 인자에 결합하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시 내용은 또한, 출혈 장애 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 혈액 응고 인자에 결합하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물의 사용을 제공한다.
본 개시 내용은 또한, 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 혈액 응고 인자에 결합하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 하나 이상 포함하는 키트를 제공하며, 이는 대상체에서 출혈 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 지침서와 함께 포장된다. 선택적으로, 키트는 추가로 치료적 활성 화합물 또는 약물을 포함한다.
본 개시 내용은 또한, 혈청 알부민 접합체 또는 혈액 응고 인자에 결합하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 조성물을 하나 이상 포함하는 키트를 제공하며, 이는 출혈 장애를 앓고 있거나 이를 앓을 위험이 있는 대상체에 상기 접합체 또는 조성물을 투여하기 위한 지침서와 함께 포장되고, 선택적으로, 치료적 활성 화합물 또는 약물과 함께 포장된다.
본 발명의 혈액 응고 인자에 결합하는 혈청 알부민 접합체 또는 조성물의 예시적인 효과가 본원에 기재되어 있으며, 앞선 5개 단락에 제시된 본 개시의 예에 준용되도록 적용된다.
도 1은 인간 FcRn 수용체를 발현하는 마우스에 주사된 HSA 변이체의 혈청 HSA 농도를 나타내는 그래프이다(μg/mL; 평균 ± SEM).
서열 목록의 내용
서열번호 1: 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열
서열번호 2: 인간 응고 인자 VIII의 아미노산 서열
서열번호 3: 인간 응고 인자 IX의 아미노산 서열
서열번호 4: 인간 응고 인자 X의 아미노산 서열
서열번호 5: 인간 응고 인자 VII의 아미노산 서열
서열번호 6: 인간 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)의 아미노산 서열
일반
본 명세서 전체에서, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성의 그룹에 대한 지시는 이들 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성의 그룹 중 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
당업자는 본 발명이 구체적으로 설명된 것 이외의 변형 및 수정에 영향을 받기 쉽다는 것을 이해할 것이다. 본 개시는 이러한 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시 내용은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 및 모든 조합 또는 상기 단계 또는 특징 중 임의의 둘 이상을 포함한다.
본 개시는 단지 예시의 목적으로 본 명세서에 기술된 특정 예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 범주 내에 명확하게 포함된다.
본 개시의 임의의 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 개시의 임의의 다른 예에 준용되도록 적용되어야 한다. 즉, 본 개시의 임의의 특정 예는 (상호 배타적인 경우를 제외하고) 본 개시의 임의의 다른 특정 예와 결합될 수 있다.
본 발명에서 개시하고 있는 특정 특징 또는 특징의 그룹 또는 방법 또는 방법 단계의 임의의 예는 특정 특징 또는 특징의 그룹 또는 방법 또는 방법 단계를 제외하는 명시적 지원을 제공하는 것으로 간주될 것이다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주된다(예를 들면, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학).
달리 지시되지 않는 한, 본 개시 내용에 사용된 재조합 단백질, 세포 배양 물 및 면역학적 기술은 당업자에게 공지된 표준 절차이다. 이러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984); J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991); D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996); 및 F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present); Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)과 같은 문헌 전체를 통하여 기술되고 설명된다.
본원의 가변 영역 및 이의 부분, 면역글로불린, 항체 및 이의 단편의 설명 및 정의는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991; Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994; Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 및/또는 Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997의 논의에 의해 추가로 명백해질 수 있다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 두 의미 또는 어느 하나의 의미에 대한 명시적 지원을 제공하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서, 단어 "포함하다", 또는 "포함하는" 또는 "포함된"과 같은 변형은 언급된 구성요소, 완전체 또는 단계, 또는 구성요소, 완전체 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 다른 구성요소, 완전체 또는 단계, 또는 구성요소, 완전체 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유래된"은 명시된 완전체가 특정한 출처로부터 얻어질 수 있기는 하나, 직접적으로 그 출처로부터 얻어져야만 하는 것은 아님을 나타내는 것으로 간주되어야 한다.
선택된 정의
혈청 알부민, 또는 혈액 알부민은 가장 풍부한 혈액 단백질이며 혈액 내 스테로이드, 지방산 및 갑상선 호르몬에 대한 운반체 단백질로서 기능하고, 또한 세포 외 체액량을 안정화시키는 데 중요한 역할을 한다. 한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 혈청 알부민의 예시적인 서열은 NCBI GenBank Accession ID: AEE60908 및 서열번호 1에 제시되어 있다. "혈청 알부민" 또는 "알부민"에 대한 언급은 N-말단 펩티드, 프로알부민(proalbumin) 및 분비된 알부민을 포함하는 프리프로알부민(preproalbumin)을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 아미노산의 위치는 585개의 아미노산으로 구성된 분비된 알부민 단백질(예를 들어, 서열번호 1에 제시)을 참조하여 본원에 언급된다. 알부민은 3개의 상동 도메인을 포함하고, 각 도메인은 공통 구조 모티프를 갖는 2개의 서브 도메인의 생성물이다. 도메인 I, II 및 III은 (서열번호 1에 제시된) 인간 혈청 알부민을 참조하여 정의될 수 있다. 예를 들면, 도메인 I은 서열번호 1의 아미노산 1(± 1 내지 15개 아미노산) 내지 194(± 1 내지 15개 아미노산)를 포함하고, 도메인 II는 서열번호 1의 아미노산 192(± 1 내지 15개 아미노산) 내지 387(± 1 내지 15개 아미노산)을 포함하며, 도메인 III은 서열번호 1의 아미노산 잔기 381(± 1 내지 15개 아미노산) 내지 585(± 1 내지 15개 아미노산)을 포함한다. 문구 "± 1 내지 15개 아미노산"은 제시된 아미노산 위치의 C-말단 및/또는 N-말단으로 아미노산 잔기가 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개 또는 7개 또는 8개 또는 9개 또는 10개 또는 11개 또는 12개 또는 13개 또는 14개 또는 15개 아미노산만큼 벗어날 수 있음을 의미한다. 예시적인 도메인 I, II 및 III은 Dockal et al(The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310) 및 Kjeldsen et al(Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169)에 기재되어 있다.
추가적인 다른 종들의 혈청 알부민의 서열(예를 들어, 영장류 혈청 알부민(예: 침팬지 혈청 알부민, 고릴라 혈청 알부민), 설치류 혈청 알부민(햄스터 혈청 알부민, 기니피그 혈청 알부민, 마우스 알부민 및 랫트 혈청 알부민), 소 혈청 알부민, 말 혈청 알부민, 당나귀 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민, 양 혈청 알부민, 개 혈청 알부민, 닭 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민)은 본원 및/또는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에 제공된 서열을 사용하여 결정될 수 있으며, 또는 표준 기술(Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)에 기재)을 이용하여 결정될 수 있다.
서열번호 1에서 아미노산의 위치와 관련하여 본원에서 사용되는 문구 "상응하는"은 알부민 서열 내의 아미노산 잔기 또는 위치를 지칭하는 것으로 이해되어야 하며, 반드시 서열번호 1을 포함하는 서열인 것은 아니다. 예를 들면,
10개 아미노산 N-말단 절단을 포함하는 알부민 서열에서 "서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치"에 대한 언급은 512번 위치의 아미노산을 지칭할 것이다. 일 실시예에서, 혈청 알부민은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함한다.
혈청 알부민의 "기능성 단편"에 대한 언급은 혈청 알부민 기능성(즉, FcRn에 결합하는 능력)을 보유하고 나타내는 혈청 알부민의 단편으로 이해되어야 한다. 단편은 하나 이상의 알부민 도메인, 이러한 도메인의 단편 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 "아미노산 치환(들)"은 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산이 다른 아미노산으로 교체되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "FcRn"은 브람벨 수용체(Brambell receptor)로도 알려진 신생아 Fc 수용체를 지칭하고, major histocompatibility complex class l-like Fc receptor(FCGRT) 및 beta-2-microglobulin의 절단된 중쇄의 이종이량체이다.
본원에 사용된 용어 "변이체" 또는 "돌연변이" 또는 "돌연변이된"은 위치지정돌연변이(site directed mutagenesis) 또는 임의의 다른 통상적인 방법에 대한 공지된 기술을 사용하여 하나 이상의 아미노산으로 치환된 혈청 알부민을 지칭한다.
본원에서, 혈청 알부민과 FcRn의 상호작용과 관련하여 사용된 용어 "결합"은 상호작용이 세포 또는 단백질에 대한 특정 구조(예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미한다.
본원에서, 혈청 알부민 변이체와 FcRn의 상호작용과 관련하여 사용된 문구 "친화도 증가" 또는 "결합 증가" 또는 "더 높은 수준의 결합"은 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편이 서열번호 1에 제시된 바와 같은 인간 혈청 알부민보다 더 큰 지속시간 및/또는 더 큰 친화도로 FcRn에 더 빈번하게, 더 신속하게(예를 들어, 1.5배 또는 2배 또는 5배 또는 10배 또는 20배 또는 40배 또는 60배 또는 80배 내지 100배 또는 150배 또는 200배) 결합하거나 연관되는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
설명을 위해 그리고 본원의 예시된 주제에 기초하여 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 명세서에서 "친화도"에 대한 언급은 혈청 알부민 변이체와 FcRn의 상호작용, 결합 또는 연관을 말한다.
설명을 위해 그리고 본원의 설명에 기초하여 당업자에게 명백한 바와 같이, "적어도 약의 친화도"에 대한 언급은 친화도가 인용된 값과 같거나 더 높은 것(즉, 친화도로서 인용된 값이 더 낮은 것)을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 즉 2nM의 친화도는 3nM의 친화도보다 크다. 다른 방식으로 말하면, 이 용어는 "X의 친화도 이하"일 수 있으며, 여기서 X는 본원에 인용된 값이다.
본원에 사용된 용어 "혈청 반감기" 또는 "혈장 반감기"는 체내 혈청 알부민의 농도 또는 양이 50% 감소(즉, 절반)하는 데 필요한 시간을 지칭한다. 예를 들면 자연적 메커니즘에 의한 분해 및/또는 제거 또는 격리로 인해 발생한다. 당업자는 대상체에서 혈청 알부민의 혈청 반감기가 다양한 생리학적 조건(예를 들어, 건강 상태, 신체 사이즈/체중)에 의존한다는 것을 알 수 있다. 건강한 인간 대상체에서, 혈청 알부민의 혈청 반감기는 19일이다. 혈청 알부민의 혈청 반감기를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 약동학적 분석을 포함한다. 본 발명의 목적상, "증가" 또는 "향상된" 혈청 반감기는 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민에 비해 혈청 알부민 변이체의 혈청 농도가 50% 감소하는 데 걸리는 시간의 향상 또는 증가를 지칭한다.
용어 "재조합"은 인공적 유전자 재조합의 생성물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질과 관련하여, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 발생하는 자연 재조합의 산물인 대상체 내에서 자연적으로 발생하는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 항체가 분리되면, 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 단백질로 간주되어야 한다. 이와 유사하게, 단백질을 코딩하는 핵산이 재조합 방법을 사용하여 분리되고 발현되는 경우, 생성된 단백질은 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질이다. 또한, 재조합 단백질은 예를 들어, 이를 발현하는 세포, 조직 또는 대상체 내에 있을 때 인공 재조합 방법에 의해 발현된 단백질을 포함한다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 사슬, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속적인 아미노산 또는 서로 공유 또는 비공유 연결된 일련의 폴리펩티드 사슬(즉, 폴리펩티드 복합체)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 일련의 폴리펩티드 사슬은 적합한 화학적 또는 이황화 결합을 사용하여 공유 결합될 수 있다. 비공유 결합의 예는 수소결합, 이온결합, 반데르발스 힘 및 소수성 상호작용을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 사슬"은 상기 단락에서 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속적인 아미노산을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 영역, 즉, VH 또는 VL 또는 VH 및 VL 를 모두 포함하는 Fv를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 항원 결합 도메인은 전체 항체와 관련하여 존재할 필요는 없으며, 예를 들어, 분리된 상태(예를 들어, 도메인 항체) 또는 다른 형태, 예를 들어, scFv와 같은 다른 형태일 수 있다.
본 개시의 목적을 위해, 용어 "항체"는 Fv 내에 포함된 항원 결합 도메인에 의해 하나 또는 몇몇 밀접하게 관련된 항원(예를 들어, 혈액 응고 인자)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 이 용어는 4쇄 항체(예를 들어, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄), 재조합 또는 변형된 항체(예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, CDR-이식 항체, 영장류화 항체, 탈면역화 항체, 유사인간화 항체, 반(half) 항체, 이중특이적 항체)를 포함한다. 항체는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 일 실시예에서, 항체는 쥐(마우스 또는 랫트) 항체 또는 영장류(예컨대, 인간) 항체이다. 일 실시예에서, 항체 중쇄에는 C-말단 리신 잔기가 없다. 일 실시예에서, 항체는 인간화, 유사인간화, 키메라, CDR-이식 또는 탈면역화된다.
본원에 사용된 "가변 영역"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 상보성 결정 영역(CDR); 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에 정의 된 바와 같은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "Fv"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 갖는 복합체를 연결 및 형성하는 경쇄의 가변 영역(VL) 및 중쇄의 가변 영역(VH)을 포함하는 다수의 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로 구성되는 임의의 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 항원 결합 도메인을 형성하는 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 쇄 또는 상이한 폴리펩티드 쇄에 있을 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 Fv(본 개시 내용의 임의의 단백질뿐만 아니라)는 동일한 항원에 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 다수의 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접적으로 유래된 단편뿐만 아니라, 재조합 방법을 사용하여 생성된 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일부 예에서, VH는 중쇄 불변 도메인(CH) 1에 연결되지 않으며, 및/또는 VL은 경쇄 불변 도메인(CL)에 연결되지 않는다. 예시적인 Fv 함유 폴리펩티드 또는 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 복합체, 또는 전술한 것 중 임의의 것에 불변 영역 또는 이의 도메인(예를 들어, CH2 또는 CH3 도메인)이 연결된 것(예를 들어, 미니 바디)을 포함한다. "Fab 단편"은 면역글로불린의 1가 항원-결합 단편으로 구성되며, 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 단편을 생성하기 위해 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 생성되거나, 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 온전한 경쇄 및 VH와 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부로 이루어진 분자를 생성하기 위해 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시킴으로써 수득될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체 당 2개의 Fab' 단편이 수득된다. Fab' 단편은 또한 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편의 이량체로 이루어지고, 후속 환원 없이 전체 항체 분자를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득된다. "Fab2" 단편은 예를 들면 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 사용하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역이 적합하고 유연한 폴리펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 항체의 가변 영역 단편(Fv)을 함유하는 재조합 분자이다.
항체의 "항원 결합 단편"은 온전한 항체의 하나 이상의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 항체 단편으로부터 형성된 단일쇄 항체 분자, 반-항체 및 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "병태"는 정상적인 기능의 붕괴 또는 방해를 말하며, 어떤 특정한 상태로 제한되지 않으며, 질병 또는 장애를 포함할 것이다.
본원에 사용된 용어 "출혈 상태" 또는 "출혈 장애"는 비정상적인 혈액 응고, 예를 들어, 감소되거나 불충분한 혈액 응고 능력 및/또는 비정상적인 출혈(내부 및/또는 외부), 예를 들어, 과도한 출혈이 있는 상태를 포함한다.
본원에 사용된 "응고 인자"는 혈전의 형성, 즉 혈액 응고와 관련된 인자를 지칭한다. 일 실시예에서, 응고 인자는 응혈촉진성 활성을 갖는다. 응고 인자는 당 업계에 공지되어 있으며, 인자 I, 인자 II, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII 및 인자 XIII 또는 임의의 상기 기재된 것들의 활성화된 형태를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 용어는 또한 예를 들어, 당업계에 공지되고 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 형태의 응고 인자 및/또는 이의 변형된 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질병 또는 병태 또는 이의 재발 또는 재발의 "위험에 처한" 대상체는 검출 가능한 질병 또는 질병의 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본 개시에 따른 치료 전에 검출 가능한 질병 또는 질병의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. "위험"은 대상체가 하나 이상의 위험 인자를 가지며, 위험 인자는 당업계에 공지되고 및/또는 본원에 기술된 바와 같이, 질병 또는 병태의 발달과 관련이 있는 측정 가능한 파라미터를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 본원에 기술된 혈청 알부민 변이체 접합체를 투여하여 특정 질병 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 제거하거나 질병 또는 상태의 진행을 늦추는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 개체에서 출혈 질환의 발생 또는 재발, 또는 출혈 질환의 증상과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 개체는 질병 또는 질병 재발을 일으킬 위험이 있거나 그에 취약하지만, 아직 질병 또는 재발로 진단되지 않았다.
"유효량"은 원하는 결과를 달성하기 위해 필요로 하는 용량 및 시간 동안의 최소한의 유효량을 지칭한다. 예를 들면, 원하는 결과는 치료 또는 예방 결과일 수 있다. 한 번 이상의 투여에서 유효량을 제공할 수 있다. 본 개시 내용의 일부 실시예에서, 용어 "유효량"은 상기 기재된 바와 같이 질병 또는 병태의 치료에 영향을 미치는 데 필요한 양을 의미한다. 본 개시의 일부 실시예에서, 용어 "유효량"은 전술한 바와 같이 질병 또는 병태와 관련된 인자의 변화에 영향을 미치는 데 필요한 양을 의미한다. 예를 들면, 유효량은 응고 수준의 변화를 초래하기에 충분할 수 있다. 유효량은 치료될 질병 또는 병태 또는 변경될 인자에 따라, 또한 체중, 연령, 인종 배경, 성별, 건강 및/또는 신체 상태 및 치료되는 포유동물과 관련된 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 유효량은 의사의 일상적인 시험 및 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위(예를 들어, "투약량" 범위) 내에 속할 것이다. 따라서, 이 용어는 본 개시 내용을 특정 수량으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 유효량은 단일 용량으로 또는 치료 기간 동안 1회 또는 수회 반복된 용량으로 투여될 수 있다.
"치료적 유효량"은 특정 질병 또는 병태의 측정 가능한 개선에 영향을 미치기 위해 요구되는 최소한의 농도이다. 본원의 치료적 유효량은 환자의 질병 상태, 연령, 성별과 체중, 및 알부민 접합체가 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 알부민 접합체의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 훨씬 큰 양이다. 일 실시예에서, 치료적 유효량은 출혈 장애 또는 이의 합병증의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 억제하기에 충분한 알부민 접합체의 양을 의미하는 것으로 여겨질 것이다.
본원에 사용된 용어 "예방적 유효량"은 출혈 장애 또는 이의 합병증의 하나 이상의 검출 가능한 증상의 발병을 예방 또는 억제 또는 지연시키기에 충분한 알부민 접합체의 양을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간, 예를 들면 포유동물을 포함하는 임의의 동물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예시적인 대상체는 인간 및 비인간 영장류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 대상체는 인간이다.
혈청 알부민 변이체
본 발명은 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 정의된 아미노산 치환을 갖는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 일 실시예에서, 본 발명의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 단편은 본원에 개시된 서열과 적어도 약 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하며, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 단편은 임의의 실시예에 따라 본원에 기재된 FcRn에 결합한다.
본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 혈청 알부민 변이체 또는 그의 기능성 단편을 제공한다:
(i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환;
(ii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환;
(iii) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환; 및
(iv) 이들의 조합.
일 실시예에서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환된 아미노산을 추가로 포함한다.
예를 들면, 본 발명자들은 서열번호 1에 제시된 서열에서 기능 손실 없이 치환될 수 있거나, 개선된 기능을 나타내는 여러 아미노산 잔기를 확인하였다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 522, 552 및/또는 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 522, 552 및/또는 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 1 또는 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
임의적으로, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 1개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 522, 552 및/또는 572번째 아미노산에 상응하는 위치 및 선택적으로 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 1 내지 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열과 비교하여 522, 552 및/또는 572번째 아미노산에 상응하는 위치 및 선택적으로 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 1 또는 2 또는 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 이소류신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 메티오닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 페닐알라닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 트립토판을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 티로신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 발린을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 발린을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에 알라닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루탐산을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 히스티딘을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 세린을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 발린을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 아르기닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신 및 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 발린을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 티로신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 발린 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 티로신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 아르기닌 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 티로신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 해당하는 위치에서 발린 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 해당하는 위치에서 아르기닌을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 해당하는 위치에서 발린 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 해당하는 위치에서 티로신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 해당하는 위치에서 아르기닌 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 해당하는 위치에서 티로신을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 서열의 변이체를 포함하며, 상기 변이체 서열은 적어도 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 류신, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 해당하는 위치에서 발린, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 해당하는 위치에서 아르기닌 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 해당하는 위치에서 티로신을 포함한다.
변이체 형태의 혈청 알부민을 제조하는 예시적인 방법은 본원에 기술되거나 당업계에 공지되어 있으며, 하기를 포함한다:
Figure pct00008
DNA 돌연변이유발(mutagenesis)(Thie et al., Methods Mol. Biol. 525: 309-322, 2009) 또는 RNA 돌연변이유발(Kopsidas et al., Immunol. Lett. 107:163-168, 2006; Kopsidas et al. BMC Biotechnology, 7: 18, 2007; 및 WO1999/058661);
Figure pct00009
폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 돌연변이유발 세포(mutator cell), 예를 들어, XL-1Red, XL-mutS 및 XL-mutS-Kanr bacterial cells(Stratagene)에 도입;
Figure pct00010
DNA 섞음(shuffling), 예를 들어, Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994에 개시; 및
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위치지정돌연변이(site directed mutagenesis), 예를 들어, Dieffenbach(ed) and Dveksler(ed)(In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)에 개시.
본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 생물학적 활성을 결정하기 위한 예시적인 방법은 당업자에게 명백하고 및/또는 본원에 기술될 것이며, 예를 들어 FcRn 친화도이다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 친화도를 결정하는 방법은 친화도, 결합, 해리를 포함하며, 치료 효능이 본원에 개시된다.
예를 들면, 본 발명자들은 혈청 알부민의 반감기를 증가시키기 위해 치환될 수 있는 서열번호 1에 제시된 서열에서 여러 아미노산 잔기를 확인하였다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 알부민의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시예에서, 변이체 또는 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민과 비교하여 FcRn에 대한 증가된 친화도로 결합한다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 엔도좀에서 알부민/FcRn 결합을 촉진하기 위해 더 낮은 pH, 예를 들어 약 pH 6.0에서 FcRn에 대한 친화도가 증가된다. 일 실시예에서, 알부민은 약 pH 7.4에서의 친화도와 비교하여 약 pH 6에서 FcRn에 대한 친화도가 증가하여, 세포 재순환 후 알부민의 혈액으로의 재방출을 촉진한다. 이러한 아미노산 치환은 혈액으로부터의 제거를 감소시킴으로써 단백질의 반감기를 연장시키는 데 유용하다.
일 실시예에서, 예시적인 아미노산 치환은 Q522G, Q522I, Q522K, Q522M, Q522L, Q522F, Q522W, Q522Y, Q522V, A552V, G572A, G572E, G572H, G572S, G572K 및 G572R을 포함한다.
다른 예에서, 예시적인 아미노산 치환은 Q522G, Q522I, Q522K, Q522M, Q522L, Q522F, Q522W, Q522Y, Q522V, Q522A, A552V, G572A, G572E, G572H, G572S, G572K, G572V 및 G572R을 포함한다.
접합체
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 화합물에 접합되고 및/또는 다른 화합물을 캡슐화한다. 예를 들면, 화합물은 방사성 동위원소, 검출 가능한 표지, 치료용 화합물, 치료용 단백질, 이미징제, 콜로이드, 독소, 핵산, 펩티드, 단백질, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), siRNA, 간섭 RNA(RNAi), 리보자임, 마이크로 RNA, 마이크로 RNA 적합 shRNA(shRNAmir), DNAzyme 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된다.
화합물은 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다(예를 들어, 간접 결합의 경우 링커를 포함할 수 있음). 화합물의 예는 방사성 동위원소(예를 들어, 아이오딘-131, 이트륨-90 또는 인듐-111), 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단(fluorophore) 또는 형광 나노크리스탈(fluorescent nanocrystal) 또는 양자점(quantum dot)), 치료용 화합물 또는 치료용 단백질(예를 들어, 화학요법제 또는 항염증 또는 응고 인자), 콜로이드(예를 들어, 금), 독소(예를 들어, 리신 또는 파상풍톡소이드), 핵산, 단백질(예를 들어, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질), 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 응고 인자에 접합된다.
예를 들면, 화합물은 단백질이고, 아민 결합에 의해 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편에 접합된다.
일 실시예에서, 본 개시 내용은 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편 및 화합물(예를 들어, 응고 인자와 같은 치료용 단백질)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들면, 화합물은 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 N-말단, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 C-말단에 위치하고, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편 또는 이들의 임의의 조합의 루프에 삽입된다.
본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체에 접합될 수 있는 예시적인 화합물 및 이러한 접합 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다.
방사성 동위원소
일 실시예에서, 본 발명은 방사성 동위원소에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 방사성 동위원소는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 아이오딘-123(123I), 아이오딘-125(125I), 아이오딘-130(130I), 아이오딘-133(133I), 아이오딘-135(135I), 스칸듐-47(47Sc), 비소-72(72As), 스칸듐-72(72Sc), 이트륨-90(90Y), 이트륨-88(88Y), 루테늄-97(97Ru), 팔라듐-100(100Pd), 로듐-101m(101mRh), 안티모니-119(119Sb), 바륨-128(128Ba), 수은-197(197Hg), 아스타틴-211(211At), 비스무트-212(212Bi), 사마륨-153(153Sm), 유로퓸-169(169Eu), 납-212(212Pb), 팔라듐-109(109Pd), 인듐-111(111In), 67Gu, 68Gu, 구리-67(67Cu), 브로민-75(75Br), 브로민-76(76Br), 브로민-77(77Br), 테크네튬-99m(99mTc), 탄소-11(11C), 질소-13(13N), 산소-15(15O), 아이오딘-18(18I), 레늄-188(188Re), 납-203(203Pb), 구리-64(64Cu), 로듐-105(105Rh), 금-198(198Au), 아르곤-199(199Ag) 또는 루테튬-177(177Lu)을 포함한다.
검출 가능한 표지
일 실시예에서, 본 개시 내용은 검출 가능한 표지에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 예를 들면, 검출 가능한 표지는 형광단, 형광 나노크리스탈 또는 양자점이다.
용어 "형광단"은 특정 파장에서 빛을 흡수하고 더 긴 파장에서 형광을 내거나 빛을 재발광하는 화합물을 의미한다. 형광단은 자외선 스펙트럼(10nm 내지 400nm), 가시 스펙트럼(400nm 내지 700nm) 또는 근적외선 영역(680nm 내지 100,000nm)에서 형광을 발할 수 있다.
본 개시 내용에 사용하기에 적합한 형광단은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, indocyanine green, IRDye78, IRDye80, IRDye38, IRDye40, IRDye41, IRDye700, IRDye800, IRDye800CW, Cy5, Cy5.5, Cy7, IR-786, DRAQ5NO, Licor NIR, Alexa Fluor488, Alexa Fluor680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor750, La Jolla Blue, R-phycoerythrin(PE), hydroxycoumarin, methoxycoumarin, aminocoumarin, Fluorescein FITC, Rhodamine Red-X, Texas Red, Allophycocyanin(APC) 및 이들의 유사체를 포함한다.
일 실시예에서, 검출 가능한 표지는 양자점이다. 양자점은 크기 의존적 광학 및 전자 특성을 갖는 반도체 나노크리스탈이다. 양자점으로서 사용하기에 적합한 예시적인 물질은 ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, Ga
Figure pct00012
, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, Sb, A1S, A1P, AlAs, AlSb, PbS, PbSe, Ge, 및 Si와 이들의 3원 및 4원 혼합물을 포함한다.
일 실시예에서, 검출 가능한 표지는 형광 단백질이다. 본 개시 내용에 사용하기에 적합한 형광 단백질은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, Renilla luciferase, green fluorescent protein(GFP), cyan fluorescent protein(CFP), red fluorescent protein(RFP), blue fluorescent protein(BFP), yellow fluorescent protein(YFB) 및 이들의 유도체를 포함한다.
생물학적 개체
응고 인자
본 개시 내용은 응고 인자에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
혈액 응고는 여러 응고 인자의 방출을 포함하는 일련의 단계를 통해 발생하여 궁극적으로 불용성 피브린을 함유하는 혈전을 형성한다. 예시적인 응고 인자는 이에 한정되는 것은 아니나, 인자 I(피브리노겐), 인자 II(프로트롬빈/트롬빈), 인자 III(조직 인자), 인자 V(불안정 인자), 인자 VII(프로콘버틴), 인자 VIII (항혈우병 인자), 인자 IX(크리스마스 인자), 인자 X(Stuart-Prower 인자), 인자 XI(혈장트롬보플라스틴전구물질), 인자 XII(Hageman (접촉) 인자) 및 인자 XIII(피브린안정인자/Prekallikrein (Fletcher) 인자/HMWK (Fitzgerald) 인자)를 포함한다.
예를 들면, 화합물은 응고 인자이고, 아민 결합에 의해 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편에 접합된다.
일 실시예에서, 본 개시 내용은 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편 및 응고 인자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예를 들면, 응고 인자는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 N-말단, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 C-말단에 위치하고, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편 또는 이들의 임의의 조합의 루프에 삽입된다.
일 실시예에서, 응고 인자는 인자 VIII이다. 한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 인자 VIII의 예시적인 서열은 NCBI Ref Seq ID NP_000123, protein accession number NM_000132.3 및 서열번호 2에 제시되어 있다.
일 실시예에서, 응고 인자는 인자 IX이다. 한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 인자 IX의 예시적인 서열은 GenBank ID AAA98726.1 및 서열번호 3에 제시되어 있다.
일 실시예에서, 응고 인자는 인자 X이다. 한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 인자 X의 예시적인 서열은 Gene ID: 2159 및 서열번호 4에 제시되어 있다.
일 실시예에서, 응고 인자는 인자 VII이다. 한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 인자 VII의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_00131 및 서열번호 5에 제시되어 있다.
한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 인자 I의 예시적인 서열은 NCBI Ref Seq ID NM_000508(alpha chain) 및 NM_005141(beta chain)에, 인간 인자 II의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_000506에, 인간 인자 III의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_001993에, 인간 인자 V의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_000130에, 인간 인자 XI의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_000128에, 인간 인자 XII의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_000505에, 인간 인자 XIII의 예시적인 서열은 Ref Seq ID NM_000129 (A chain) 및 NM_001994 (B chain)에 제시되어 있다.
응고 인자의 추가적인 서열은 본원에 및/또는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에 제공된 서열 및/또는 표준 기술(예를 들어, Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988, including all updates until present) 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 개시)을 사용하여 결정될 수 있다.
예시적인 응고 인자는 공여자 또는 재조합 단백질로부터 유래된 혈장일 수 있다. 예를 들면, 응고 인자는 혈장 유래 또는 재조합 응고 인자 단백질이다. 예를 들면, 치료용 단백질은 인자 I(피브리노겐), 인자 II((프로트롬빈)/트롬빈), 인자 III(조직 인자), 인자 V(불안정 인자), 인자 VII(프로콘버틴), 인자 VIIa(예를 들어, NovoSeven®), 인자 VIII(단일쇄 재조합 인자 VIII와 같은 항혈우병 인자, 예를 들어, Zollner et al., Thromb Res. 132:280-287, 2013에 개시; 또는 FEIBA®, Monoclate-P® 또는 Biostate®와 같은 혈장 유래 인자 VIII 생성물; 또는 Advate®, Eloctate®, Recombinate®, Kogenate Fs®, Helixate® Fs, Helixate®, Xyntha®/Refacto Ab®, Hemofil-M®, Monarc-M®, Alphanate®, Koate-Dvi®, Nuwiq® 또는 Hyate:C®와 같은 재조합 인자 VIII 생성물), 인자 IX(크리스마스 인자, 예를 들어, Berinin® P, MonoFIX® 또는 Mononine®와 같은 혈장 유래 인자 IX 생성물; 또는 Alphanine SD®, Alprolix®, Bebulin®, Bebulin VH®, Benefix®, Ixinity®, Profilnine SD®, Proplex T®, 또는 Rixubis®와 같은 재조합 인자 IX 생성물), 인자 X(Stuart-Prower 인자), 인자 XI(혈장트롬보플라스틴전구물질), 인자 XII(Hageman (접촉) 인자) 및 인자 XIII((피브린안정인자/Prekallikrein (Fletcher) 인자/HMWK (Fitzgerald) 인자; 예를 들어, Fibrogammin® P, Corifact®, Cluvot® 또는 Cluviat®)로 구성된 군에서 선택된다. 일 실시예에서, 치료용 단백질은 폰 빌레브란트 인자/FVIII 복합체(예를 들어, Humate-P®, Haemate®-P, Biostate® 또는 Voncento®)이다. 다른 예에서, 치료용 단백질은 프로트롬빈 복합체(예를 들어, Beriplex® P/N, Confidex® 또는 Kcentra®)이다. 다른 예에서, 치료용 단백질은 피브리노겐(예를 들어, RiaSTAP®, Haemocomplettan® P)이다.
폰 빌레브란트 인자
본 발명은 폰 빌레브란트 인자에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "폰 빌레브란트 인자"(vWF)는 자연적으로 발생하는(천연) VWF뿐만 아니라, 이의 변이체, 예를 들어 단편, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 자연 발생 vWF의 생물학적 활성을 유지하는 하나 이상의 잔기가 삽입, 결실 또는 치환된 서열 변이체를 포함한다. 한정이 아닌 명명의 목적으로, 인간 천연 vWF의 예시적인 서열은 NCBI Ref Seq ID: NP_000543.2 및 서열번호 6에 제시되어 있다. 당업자는 천연 vWF가 다중 도메인을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본 개시의 목적을 위해, 다음의 주석이 규정되었다: D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK, 여기서 D' 도메인은 서열번호 6의 아미노산 764 내지 865로 구성되고; D3 도메인은 서열번호 6의 아미노산 866 내지 1242로 구성되며; C1 도메인은 서열번호 6의 아미노산 2255 내지 2328로 구성된다.
일 실시예에서, vWF는 변형된 또는 돌연변이된 또는 변이된 vWF이다. 예를 들면, 본 개시 내용에 사용하기 위한 변형된 vWF는 D'D3 도메인 및 이의 변형된 형태, 예컨대 이의 절단된 또는 돌연변이된 형태를 포함한다. 예를 들면, 변형된 vWF는 서열번호 6의 아미노산 764 내지 1242를 포함한다.
일 실시예에서, 폰 빌레브란트 인자는 재조합 폰 빌레브란트 인자이다.
가용성 보체 억제제
본 개시 내용은 가용성 보체 억제제에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
보체 시스템은 숙주를 보체 관련 손상으로부터 보호하면서 외래 미생물을 제거하는 역할을 하는 다수의 세포 표면 및 가용성 단백질로 구성된다. 보체 시스템의 3가지 경로는 고전 경로(C1q, C1r, C1s, C4, C2 및 C3 보체 포함), 렉틴 경로 및 대체 경로를 포함한다. CR1(CD35), CR2(CD21), CR3(CD11b/CD18) 및 CR4(CD11c/CD18)의 4가지 보체 수용체가 설명된다. CR1은 혈장 단백질의 보체 시스템의 활성화에 대한 주요 조절자이다.
일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 가용성 보체 억제제, 또는 그의 변형된(즉, 변이된) 형태에 접합된다.
본 개시 내용에 사용하기에 적합한 보체 억제제는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 인자 I(fI), 인자 H(fH), C4b-결합 단백질(C4bp), 가용성 CD55(분해가속인자(DAF)), C1-억제제(C1-INH 또는 C1 에스테라제 억제제); 가용성 CD35(sCR1); 가용성 CD46(막 보조인자 단백질(MCP)), 가용성 CD59(protectin), TT30(CR2-fH), 코브라독인자(CVF) 및 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함한다.
일 실시예에서, 보체 억제제는 보체 수용체 타입 1로도 알려진 가용성 보체 수용체 1(sCR1); CD35; C3BR; C3b/C4b 수용체 및 TP10이다. 예를 들면, 본 개시 내용에 사용하기 위한 가용성 보체 억제제는 변형 또는 변이 sCR1이다. sCR1 및 변이 sCR1 분자는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면 WO1991016437, WO1994000571 및 WO1997031944에 기재되어 있다.
일 실시예에서, 보체 억제제는 C1 에스테라제 억제제, serpin family G member 1 (SERPING1), HAE1, HAE2, C1NH 및 C1IN으로도 알려진 C1-억제제(C1-INH)다. 예를 들면, 본 발명에 사용하기 위한 보체 억제제는 변형 또는 변이 C1-INH이다. 일 실시예에서, C1-INH는 혈장 유래 C1-INH이다. 다른 예에서, C1-INH는 재조합 C1-INH이다. C1-INH 및 변이 C1-INH 분자는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, Berinert®를 포함한다. 다른 적합한 C1-INH 및 변이 C1-INH 분자는 예를 들면 WO2016070156에 기재되어있다.
독소
본 발명은 독소에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
본 개시 내용에 사용하기에 적합한 독소는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 리신(ricin), 아브린(abrin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 파상풍톡소이드(tetanus toxoid), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin) A(PE), 및 젤로닌(gelonin), pokeweed antiviral protein 및 사포린과 같은 리보솜 불활성화 단백질(ribosomal inactivating proteins)을 포함한다.
화학요법 화합물
본 개시 내용은 화학요법 화합물에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
본 개시 내용에 사용하기에 적합한 화학요법 화합물은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면 caboplatin, cisplatin, cyclophosphamide, docetaxal, doxorubicin, erlotinib, etoposide, fluorouracil, irinotecan, methotrexate, paclitaxel, topotecan, vincristine, vinblastine, methotrexate, l-asparaginase, vincristine, doxorubicin, danorubicin, cytarabine, idarubicin, mitoxantrone, cyclophosphamide, fludarabine, chlorambucil 및 이들의 유도체를 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편
일 실시예에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
본 개시 내용에 사용하기 위한 예시적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 기술되거나 당업계에 공지되어 있고, 다음을 포함한다:
Figure pct00013
인간화 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 인간-유사 가변 영역을 포함하는 단백질로서, 인간 항체 유래 FR에 이식되거나 삽입된 비인간 종(예를 들어, 마우스 또는 랫트 또는 비인간 영장류)의 항체 유래 CDR이 포함됨(예를 들어, US5225539, US6054297, US7566771 또는 US5585089에 기재된 방법에 의해 생성됨).
Figure pct00014
인간 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 인간 생식선 또는 체세포와 같은 인간에서 발견되는 가변 영역을 포함하고, 선택적으로 불변 영역을 갖는 항체, 또는 이러한 영역을 사용하여 생성된 라이브러리 유래 항체. "인간" 항체는 예를 들어 in vitro 무작위 또는 위치지정돌연변이에 의해 도입된 돌연변이(예를 들어, US5565332에 기재된 방법에 의해 생성됨) 및 이러한 항체의 친화도 성숙 형태와 같은 인간 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
Figure pct00015
유사인간화 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, New World primate 항체 가변 영역 유래 FR 및 비-New World primate 항체 가변 영역 유래 CDR을 포함하는 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들어, WO2007019620에 기재된 방법에 의해 생성됨).
Figure pct00016
영장류화 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 비인간 영장류(예를 들어, cynomolgus macaque)의 면역화 후 생성된 항체 유래 가변 영역(들)을 포함하는 항체(예를 들어, US6113898에 기술된 방법에 의해 생성됨).
Figure pct00017
키메라 항체 또는 키메라 항원 결합 단편, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인이 특정 종(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 쥐)으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 한편, 항체 또는 단편의 나머지는 다른 종(예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류와 같은)으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 단편(예를 들어, US6331415; US5807715; US4816567 및 US4816397에 기술된 방법에 의해 생성됨).
Figure pct00018
탈면역화 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 하나 이상의 에피토프, 예를 들어, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프가 제거되어(즉, 돌연변이), 대상체가 항체 또는 단백질에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성을 감소시킨 항체 및 단편(예를 들어, WO2000034317 및 WO2004108158에 기재됨).
Figure pct00019
이중특이적 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 특이성을 갖는 2가지 타입 항체 또는 단편(예를 들어, 2개의 반-항체)을 포함하는 항체(예를 들어, US5731168에 기술됨).
본 개시 내용에 사용하기 위한 추가의 예시적인 항체 단편은 본원에 기재되거나 당업계에 공지되어 있으며, 다음을 포함한다:
Figure pct00020
단일 도메인 항체(도메인 항체 또는 dAb), 예를 들어, 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄.
Figure pct00021
디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 단백질 복합체(예를 들어, WO98/044001 및/또는 WO94/007921에 기재됨).
Figure pct00022
단일쇄 Fv(scFv) 단편, 예를 들어, 단일 폴리펩티드 쇄의 VH 및 VL 영역과 scFv가 항원 결합을 위한 구조를 형성할 수 있게 하는(즉, 단일 폴리펩티드 쇄의 VH 및 VL이 서로 연결되어 Fv를 형성하기 위한) VH 및 VL 사이의 폴리펩티드 링커를 포함하는 단편.
Figure pct00023
반-항체 또는 반-분자, 예를 들어, 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 단백질.
본 개시 내용은 또한 다음과 같은 다른 항체 및 항체 단편을 고려한다:
(i) 예를 들어, US5837821에 기재된 미니바디;
(ii) 예를 들어, US4676980에 기재된 이종접합 단백질;
(iii) 예를 들어, US4676980에 기재된 화학적 가교제를 사용하여 생성된 이종접합 단백질; 및
(iv) Fab3(예를 들어, EP19930302894에 기술됨).
단백질 스캐폴드(scaffold)
일 실시예에서, 본 발명은 단백질 스캐폴드에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 예를 들면, 단백질 스캐폴드는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편이다.
본 개시 내용에 사용하기에 적합한 단백질 스캐폴드는 본원에 기술되거나 당업자에게 명백할 것이며, 다음을 포함한다:
Figure pct00024
중쇄 면역글로불린, 예를 들어, 경쇄를 포함하지 않는 면역글로불린(예를 들어, 항체) (예를 들어, WO9404678, WO9749805 및 WO 9749805에 기술됨).
Figure pct00025
V-형 단백질, 예를 들어, 항체의 Fv 모듈과 유사한 구조로 결합되는 2개의 V-도메인을 포함하는 T-세포 수용체(예를 들어, Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991, WO1999045110 또는 WO2011107595에 기재됨).
Figure pct00026
아드넥틴, 예를 들어, 루프 영역이 항원 결합을 부여하도록 변경되는 인간 피브로넥틴의 제10 피브로넥틴 III 형(10Fn3) 도메인에 기초한 면역글로불린(예를 들어, US20080139791 또는 WO2005056764에 기재됨).
Figure pct00027
안티칼린, 예를 들어, 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원추형 구조의 개방 말단에 복수의 루프와 함께 단단한 β-시트 이차 구조를 갖는 리포칼린으로부터 유래된 면역글로불린(예를 들어, US7250297 또는 US20070224633에 기재됨).
Figure pct00028
애피바디, 예를 들어, 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 Staphylococcus aureus의 단백질 A의 Z 도메인(항원 결합 도메인)으로부터 유래된 스캐폴드(예를 들어, EP1641818에 기재됨).
Figure pct00029
avimer, 예를 들어, A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 멀티도메인 단백질(예를 들어, WO2002088171에 기재됨).
Figure pct00030
설계된 안키린-반복 단백질(DARPin), 예를 들어, 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 세포질 골격에 통합 막 단백질의 부착을 매개하는 Ankyrin 단백질 패밀리로부터 유래됨(예를 들어, US20040132028에 기재됨).
소분자
일 실시예에서, 본 발명은 소분자에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 이러한 소분자는 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 화학적 소분자 라이브러리는 상업적으로 이용가능 하거나, 예를 들어 US5463564에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
유기 소분자 화합물을 합성하는 기술은 화합물에 따라 상당히 달라질 수 있지만, 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
일 실시예에서, 정보학은 조합 라이브러리를 생성하기 위해 공지된 화합물로부터 적합한 화학적 빌딩 블록을 선택하는 데 사용된다. 예를 들면, QSAR(Quantitative Structure Activity Relationship) 모델링 접근법은 화합물 구조의 선형 회귀 또는 회귀 트리를 사용하여 적합성을 결정한다. Chemical Computing Group, Inc.(Montreal, Canada)의 소프트웨어는 활성 화합물과 비활성 화합물에 대한 고효율 스크리닝 실험 데이터를 사용하여 확률적 QSAR 모델을 생성하고, 이후에 선도물질을 선택하는 데 사용된다. 이진(Binary) QSAR 방법은 특정 화합물이 필요한 기능을 수행하거나 수행하지 않을 가능성의 "descriptor"를 형성하는 화합물의 세 가지 특유의 특성에 기초한다: 부분 전하, 몰 굴절률(결합 상호작용) 및 logP(분자 친유성). 각 원자는 분자의 표면적을 가지고 있으며, 이와 관련된 세 가지 특성을 갖는다. 특정 범위의 부분 전하를 갖는 화합물의 모든 원자가 결정되고, 표면적(Van der Walls Surface Area descriptor)이 합산된다. 이진 QSAR 모델은 활성 모델 또는 ADMET 모델을 만드는 데 사용되며, 이들은 조합 라이브러리를 생성하는 데 사용된다. 따라서, 초기 스크린에서 식별된 선도물질을 사용하여 스크리닝되는 화합물의 목록을 확장시켜, 고 활성 화합물을 식별할 수 있다.
핵산-기반 제제
일 실시예에서, 본 발명은 핵산-기반 제제에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 적합한 제제는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), siRNA, 간섭 RNA(RNAi), 리보자임, 마이크로 RNA 및 DNAzyme을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
일 실시예에서, 핵산-기반 제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 핵산이다.
용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 핵산"은 본 개시 내용의 임의의 예에서 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적이며, mRNA 번역과 같은 전사 후 사건을 방해할 수 있는 DNA 또는 RNA 또는 이의 유도체(예를 들어, LNA 또는 PNA), 또는 이들의 조합을 의미하는 것으로 간주된다. 안티센스 방법의 사용은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Hartmann and Endres (editors), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)) 참조).
본 개시 내용의 안티센스 핵산은 생리학적 조건 하에서 표적 핵산에 혼성화될 것이다. 안티센스 핵산은 구조적 유전자 또는 코딩 영역에 상응하거나, 유전자 발현 또는 스플라이싱에 대한 제어에 영향을 미치는 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 안티센스 핵산은 핵산의 표적화된 코딩 영역, 또는 5'-비번역 영역(UTR) 또는 3'-UTR 또는 이들의 조합에 상응할 수 있다. 인트론 서열에 부분적으로 상보적일 수 있으며, 예를 들면 표적 유전자의 엑손 서열에 대해서만 전사 동안 또는 이후에 스플라이싱될 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 적어도 19개의 연속된 뉴클레오티드이고, 예를 들면, 적어도 50개의 뉴클레오티드, 예컨대 핵산의 100, 200, 500 또는 1000개의 뉴클레오티드이다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100-2000 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 안티센스 서열의 동일성 정도는 90% 이상, 예를 들면, 95-100%이어야 한다.
촉매 핵산
일 실시예에서, 핵산-기반 제제는 촉매 핵산이다.
용어 "촉매 핵산은" 별개의 기질을 특이적으로 인식하고, 이 기질의 화학적 변형을 촉매하는 DNA 분자 또는 DNA-함유 분자(당업계에서 "deoxyribozyme" 또는 "DNAzyme"으로도 알려짐) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자("ribozyme" 또는 "RNAzyme"으로도 알려짐)를 지칭한다. 촉매 핵산의 핵산 염기는 염기 A, C, G, T(및 RNA의 경우 U)일 수 있다.
RNA 간섭
일 실시예에서, 핵산-기반 제제는 작은 간섭 RNA("siRNA") 분자이다.
RNA 간섭(RNAi)은 특정 단백질의 생성을 특이적으로 억제하는 데 유용하다. 이론에 의해 제한되지 않고, 이 기술은 관심있는 유전자의 mRNA 또는 그의 일부와 본질적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 알맞게, dsRNA는 재조합 벡터 숙주 세포에서 단일 프로모터로부터 생산될 수 있으며, 여기서 센스 및 안티센스 서열은 센스 및 안티센스 서열이 혼성화되고 루프 구조를 형성하는 관련되지 않은 서열과 함께 dsRNA 분자를 형성할 수 있게 하는 관련되지 않은 서열에 의해 플랭킹된다. 본 개시 내용에 적합한 dsRNA 분자의 디자인 및 생산은 당업자에게 자명하다.
혼성화하는 센스 및 안티센스 서열의 길이는 각각 적어도 19개의 연속된 뉴클레오티드이어야 하며, 예컨대 적어도 30 또는 50 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 100, 200, 500 또는 1000 뉴클레오티드이다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100-2000 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 센스 및 안티센스 서열의 동일성 정도는 85% 이상, 예를 들면, 90% 이상, 예컨대 95-100%이어야 한다.
예시적인 작은 간섭 RNA("siRNA") 분자는 표적 mRNA의 약 19-21개의 연속된 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, siRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작하고, 약 30-70%(예를 들면, 30-60%, 예컨대 40-60%, 예를 들면 약 45%-55%)의 GC content를 포함하며, 예를 들면, standard BLAST search에 의해 결정된 바와 같이, 도입될 대상의 게놈에서 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열과 높은 백분율 동일성을 갖지 않는다.
혈청 알부민 변이체의 활성 분석
본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체는 생물학적 활성, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이 용이하게 스크리닝된다.
친화도 결정
임의로, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 해리 상수(Kd) 또는 결합 상수(Ka) 또는 친화도 상수(KD)가 결정된다.
친화도 측정은 표준 방법론, 예를 들면, 면역분석, 표면 플라즈몬 공명(SPR; 예를 들어, BIAcore 표면 플라즈몬 공명(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) (Rich and Myszka Curr. Opin. Biotechnol 11: 54, 2000; Englebienne Analyst. 123: 1599, 1998), 등온적정형열량계(ITC) 또는 당업계에 공지된 다른 동역학적 상호작용 분석법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민과 유사한 KD 또는 개선된 KD(즉, 보다 낮은 KD 값)를 갖는다.
FcRn에 대한 결합 친화도는 유세포 분석을 사용하여 비정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 안정적으로 발현하는 CHO 세포는 산성(pH 5.5) 및 중성(pH 7.4) pH에서 alexa-488 labeled FcRn/β2m(표적 결합 검출용) 및 anti-myc-alexa 647(발현 검출용)로 염색되고, 유세포 분석에 의해 분석된다. FcRn/β2m에 대한 상대적 결합은 예를 들면, 비변형 혈청 알부민(예를 들어, 서열번호 1에 제시된 바와 같은)에 대한 평균 형광 강도를 계산함으로써 결정된다.
반감기 결정
본 개시 내용에 포함되는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 개선 된 반감기를 가지며, 예를 들어, 서열번호 1에 제시된 혈청 알부민(즉, 변형되지 않은 혈청 알부민)과 비교하여 반감기가 연장되도록 변형되었다. 반감기가 증가된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들면, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 능력이 평가된다. 이와 관련하여, FcRn에 대한 증가된 결합 친화도는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 혈청 반감기를 증가시킨다(예를 들면, Kim et al., Eur J Immunol., 24:2429, 1994 참조).
본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 반감기는 또한 약동학적 연구, 예를 들어, Kim et al, Eur J of Immunol 24:542, 1994에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다. 이 방법에 따르면, 단백질을 마우스에 정맥 내 주사하고, 혈장 농도를 시간의 함수로서, 예를 들면 주사 후 3분 내지 72시간에 주기적으로 측정한다. 이렇게 얻어진 제거 곡선은 2상(biphasic), 즉 알파상 및 베타상이어야 한다. 단백질의 in vivo 반감기를 결정하기 위해, 베타상의 제거율을 계산하여 야생형 또는 비변형 단백질(즉, 서열번호 1에 제시된 바와 같은)의 제거율과 비교한다.
In vitro 세포 분석
혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 본원에 기재된 질병 또는 병태를 치료하는 능력을 평가하기 위해 다양한 in vitro 분석을 이용할 수 있다.
일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 흡수 및 재순환은 in vitro 세포 분석에서 시험된다.
세포 흡수 및 재순환을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 및/또는 본원에 예시되어 있다. 예를 들면, 형광 표지된 혈청 알부민 변이체는 세포 표면에 인간 FcRn 수용체를 발현하는 세포와 함께 배양된다. 표지된 혈청 알부민 변이체의 첨가 후, 단백질 재순환의 진행을 추적하고, 유세포 분석 및 형광 현미경(예를 들면, 공초점 형광 현미경)을 포함하는 방법에 의해 비변형 혈청 알부민 단백질과 비교할 수 있다. 특정 혈청 알부민 변이체에 대한 정상적인 재순환 경로의 변화가 확인되고 특성화될 수 있다.
효과적으로 재순환되는 것으로 밝혀지는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 본 발명의 변이체로서 식별된다.
약동학적 분석
일 실시예에서, 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편의 약동학적(PK) 특성이 평가될 것이다.
PK 특성을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 및/또는 본원에 예시되어 있다. 예를 들면, 혈청 알부민 변이체는 인간 FcRn 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 다른 적합한 포유 동물 숙주(예를 들어, 랫트, 필리핀 원숭이)에 주사된다. 일 실시예에서, 인간 FcRn 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스는 "hFcRn Tg32" 동형접합 마우스(즉, B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ; The Jackson Laboratory stock number 014565; 또는 Roopenian et al., J. Immunol 2003; 170:3528-3533에 기술됨)이다. 혈청 알부민의 혈장 수준은 상업적으로 이용 가능한 방법을 이용하여 ELISA를 사용하여 평가될 것이다.
약학적 조성물
적합하게는, 본 개시 내용의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편을 대상체에게 투여하기 위한 조성물 또는 방법에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체(즉, 화합물에 접합된 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편)는 당업계에서 이해되는 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된다. 따라서, 본 개시 내용의 일 예는 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)을 제공한다.
일반적으로, "담체"는 고체 또는 액체 충전제, 결합제, 희석제, 캡슐화 물질, 유화제, 습윤제, 용매, 현탁제, 코팅제 또는 윤활제를 의미하며, 이는 임의의 대상체, 예를 들어, 인간에게 안전하게 투여될 수 있다. 특정 투여 경로에 따라, 당업계에 공지된 다양한 허용 가능한 담체, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)에 기술된 바와 같은 담체가 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체는 예방 또는 치료적 처리를 위해 비경구, 국소, 경구 또는 국소적 투여, 에어로졸 투여 또는 경피 투여에 유용하다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 접합체는 피하 또는 정맥 투여와 같이 비경구 투여된다. 예를 들면, 혈청 알부민 접합체는 정맥 내 투여된다.
투여될 혈청 알부민 접합체의 제형은 선택된 투여 경로 및 제형(예를 들어, 용액, 에멀젼, 캡슐)에 따라 달라질 것이다. 투여될 혈청 알부민 접합체를 포함하는 적절한 약학적 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체에서 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀젼의 경우, 적합한 담체는 예를 들면, 수성 또는 알콜/수성 용액, 식염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 운반체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 링거 젖산 또는 유지를 포함할 수 있다. 물, 완충수, 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로오스 용액 및 글리신을 포함하는 다양한 적절한 수성 담체가 당업자에게 공지되어 있다. 정맥 내 운반체는 다양한 첨가제, 방부제 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다(일반적으로 Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980를 참조). 상기 조성물은 pH 조절제 및 완충제 및 독성 조절제, 예를 들면 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 젖산나트륨과 같은 생리학적 조건을 근사하는 데 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질을 추가로 함유할 수 있다. 혈청 알부민 접합체는 액체 단계에 저장될 수 있거나, 공지된 동결건조 및 재형성 기술에 따라 사용하기 전에 적합한 담체에서 저장 및 재형성을 위해 동결건조될 수 있다.
치료되는 병태
본원에 논의된 바와 같이, 본 개시 내용은 대상체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체 또는 본 개시 내용의 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 본 개시 내용은 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 또한 본 발명의 혈청 알부민 접합체 또는 본 발명의 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체의 용도를 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시 내용은 본 발명의 혈청 알부민 접합체를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하기 위한 혈청 알부민 접합체의 용도를 제공한다.
일 실시예에서, 질병 또는 병태는 출혈 장애이다.
일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애를 앓고 있다. 출혈 장애는 유전되거나 후천적일 수 있다. 예를 들면, 출혈 장애를 앓고 있는 대상체는 다음과 같은 출혈 장애의 증상을 겪었다:
Figure pct00031
멍 들기 쉬움;
Figure pct00032
잇몸 출혈;
Figure pct00033
작은 상처나 치과 치료로 인한 심한 출혈;
Figure pct00034
설명되지 않는 코피;
Figure pct00035
심한 월경 출혈;
Figure pct00036
관절에 출혈; 및/또는
Figure pct00037
수술 후 과도한 출혈.
일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애가 발생할 위험이 있다. 대상체는 대조군 집단보다 출혈 장애가 발생할 위험이 더 높은 위험에 처해 있다. 대조군 집단은 협심증, 뇌졸중 및/또는 심장 마비의 가족력이 없거나, 겪은 바 없는 일반 집단(예를 들어, 연령, 성별, 인종 및/또는 민족에 의해 매칭됨)으로부터 무작위로 선택된 하나 이상의 대상체를 포함할 수 있다. 출혈 장애와 관련된 "위험 요소"가 해당 대상체와 관련된 것으로 밝혀지면, 대상체는 출혈 장애의 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 위험 요소는 예를 들면, 대상체 집단에 대한 통계적 또는 역학적 연구를 통해 주어진 장애와 관련된 모든 활동, 특성, 사건 또는 특징을 포함할 수 있다. 따라서 기본적인 위험 요소를 식별하는 연구에 대상체가 구체적으로 포함되지 않은 경우에도, 대상체는 출혈 장애의 위험이 있는 것으로 분류될 수 있다. 예를 들면, 출혈이 없는 대상체 집단에 비해 과다 출혈이 있는 대상체 집단에서 출혈 장애의 빈도가 증가하기 때문에, 과다 출혈이 있는 피험자는 출혈 장애가 발생할 위험이 있다.
일 실시예에서, 대상체는 출혈 장애가 발생할 위험이 있고, 혈청 알부민 접합체는 출혈 장애의 증상이 시작되기 전 또는 후에 투여된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 접합체는 출혈 장애의 증상이 시작되기 전에 투여된다. 일 실시예에서, 혈청 알부민 접합체는 출혈 장애의 증상이 시작된 후에 투여된다. 일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체는 위험이 있는 대상체에서 출혈 장애의 증상 중 하나 이상을 완화시키거나 감소시키는 용량으로 투여된다.
본 개시 내용의 방법은 대상체에서 임의의 형태의 출혈 장애에 쉽게 적용될 수 있다.
본 개시 내용의 방법은 또한 출혈 장애의 예방 또는 치료를 위한 또 다른 치료적으로 유효한 제제의 투여와 함께 본 개시 내용에 따른 혈청 알부민 접합체의 병용 투여를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체는 출혈 장애를 예방 또는 치료하기 위해, 현재 사용되고 있거나 개발 중인 하나 이상의 추가의 공지된 화합물 또는 치료용 단백질과 조합하여 사용된다. 출혈 장애의 치료에 현재 사용되는 화합물은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 치료용 단백질은 공여체 또는 재조합 단백질로부터 유래된 혈장일 수 있다. 예를 들면, 치료용 단백질은 혈장 유래 또는 재조합 응고 인자 단백질이다. 예를 들면, 치료용 단백질은 인자 I, 인자 II((프로트롬빈)/트롬빈), 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa(예를 들어, NovoSeven®), 인자 VIII(단일쇄 재조합 인자 VIII, 예를 들어, Zollner et al., Thromb Res. 132:280-287, 2013에 개시; 또는 FEIBA®, Monoclate-P® 또는 Biostate®와 같은 혈장 유래 인자 VIII 생성물; 또는 Advate®, Eloctate®, Recombinate®, Kogenate Fs®, Helixate® Fs, Helixate®, Xyntha®/Refacto Ab®, Hemofil-M®, Monarc-M®, Alphanate®, Koate-Dvi®, Nuwiq® 또는 Hyate:C®와 같은 재조합 인자 VIII 생성물), 인자 IX(예를 들어, Berinin® P, MonoFIX® 또는 Mononine®와 같은 혈장 유래 인자 IX 생성물; 또는 Alphanine SD®, Alprolix®, Bebulin®, Bebulin VH®, Benefix®, Ixinity®, Profilnine SD®, Proplex T®, 또는 Rixubis®와 같은 재조합 인자 IX 생성물), 인자 X, 인자 XI, 인자 XII 및 인자 XIII(예를 들어, Fibrogammin® P, Corifact®, Cluvot® 또는 Cluviat®)로 구성된 군에서 선택된다. 일 실시예에서, 치료용 단백질은 폰 빌레브란트 인자/FVIII 복합체(예를 들어, Humate-P®, Haemate®-P, Biostate® 또는 Voncento®)이다. 다른 예에서, 치료용 단백질은 프로트롬빈 복합체(예를 들어, Beriplex® P/N, Confidex® 또는 Kcentra®)이다. 다른 예에서, 치료용 단백질은 피브리노겐(예를 들어, RiaSTAP®, Haemocomplettan® P)이다. 일 실시예에서, 치료용 단백질은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 응고 인자의 변형된 형태이다.
상기 기재로부터 명백하게, 본 개시 내용은 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1 제제 및 제2 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 부수적 치료 방법을 제공하며, 여기서 제1 제제는 본 발명의 혈청 알부민 접합체이고, 제2 제제 역시 출혈 장애의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 문구 "부수적 치료 방법"에서와 같이 용어 "부수적(concomitant)"은 제2 제제의 존재 하에 제1 제제를 투여하는 것을 포함한다. 부수적 치료 방법은 제1, 제2, 제3 또는 추가적인 제제가 병용-투여되는 방법을 포함한다. 부수적 치료 방법은 또한 제1 또는 추가적인 제제가 제2 또는 추가적인 제제의 존재 하에 투여되는 방법을 포함하며, 여기서 제2 또는 추가적인 제제는 예를 들면, 미리 투여되었을 수 있다. 부수적 치료법은 상이한 행위자에 의해 단계적으로 실행될 수 있다. 예를 들면, 하나의 행위자는 대상체에게 제1 제제를 투여할 수 있고, 제2 행위자가 대상체에게 제2 제제를 투여할 수 있으며, 투여 단계는 동시에 또는 거의 동시에 또는 긴 시간 간격에 실행될 수 있으며, 제1 제제(및/또는 추가적인 제제)가 제2 제제(및/또는 추가적인 제제)의 존재 하에 투여될 수 있다. 행위자와 대상체는 같은 개체(예: 인간)일 수 있다.
선택된 매질 중 활성 성분(들)의 최적 농도는 당업자에게 공지된 절차에 따라 실험적으로 결정될 수 있으며, 원하는 최종 약학적 제형에 따라 달라질 것이다.
본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것이다. 예를 들면, 조성물은 유효량의 혈청 알부민 접합체를 포함한다. 일 실시예에서, 조성물은 치료적 유효량의 혈청 알부민 접합체를 포함한다. 다른 실시예에서, 조성물은 예방적 유효량의 혈청 알부민 접합체를 포함한다.
투여량은 역설적인 출혈 및 억제제의 발달과 같은 부작용을 유발할 정도로 커서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병의 정도에 따라 변할 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 합병증이 발생한 경우 의사가 투여량을 조정할 수 있다.
투여량은 1일 또는 수일 동안 매일 1회 이상의 투여에서, 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 예를 들어, 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 예컨대 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 변경될 수 있다.
일부 실시예에서, 혈청 알부민 접합체는 후속(유지 용량)보다 높은 초기(또는 로딩) 용량으로 투여된다. 예를 들면, v는 약 10mg/kg 내지 약 30mg/kg의 초기 용량으로 투여된다. 결합 단백질을 약 0.0001mg/kg 내지 약 10mg/kg의 유지 용량으로 투여한다. 유지 용량은 7-35일마다, 예컨대 7일 또는 14일 또는 28일마다 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 혈청 알부민 접합체가 후속 용량에서 사용되는 것보다 더 낮은 용량으로 초기에 투여되는 용량 증가 요법이 사용된다. 이 투여량 요법은 대상체가 초기에 부작용을 겪는 경우에 유용하다.
치료에 적절하게 반응하지 않는 대상체의 경우, 일주일에 여러 번 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
1회 노출 또는 결합 단백질의 적어도 약 2회 노출, 예를 들면, 약 2 내지 60회 노출, 보다 상세하게는 2 내지 40 회 노출, 특히 약 2 내지 20회 노출과 같은 용량 세트를 제공함으로써 대상체는 혈청 알부민 접합체로 재처리 될 수 있다.
일 실시예에서, 질병의 징후 또는 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드가 나타날 때 임의의 재처리가 제공될 수 있다.
다른 예에서, 임의의 재처리가 정의된 간격으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 후속 노출은 다양한 간격, 예컨대, 약 24-28주 또는 48-56주 또는 그 이상 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 이러한 노출은 각각 약 24-26주 또는 약 38-42주, 또는 약 50-54주 간격으로 투여된다.
치료에 적절하게 반응하지 않는 대상체의 경우, 일주일에 여러 번 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
다른 예에서, 부작용이 발생하는 대상체의 경우, 초기(또는 로딩) 용량은 일주일에 수일에 걸쳐 또는 연속적으로 수일에 걸쳐 분할될 수 있다.
본 개시 내용의 방법에 따른 혈청 알부민 접합체의 투여는, 예를 들면, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적 또는 예방적인지 여부, 및 숙련된 전문가에게 공지된 다른 요인에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 투여는 미리 선택된 기간 동안 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 예를 들어, 병태의 발생 동안 또는 후에 일련의 이격된 용량으로 투여될 수 있다.
키트 및 기타 물질의 구성
본 개시 내용의 다른 예는 상기 기재된 바와 같은 출혈 장애의 치료 또는 예방에 유용한 본 개시 내용의 혈청 알부민 접합체를 함유하는 키트를 제공한다.
일 실시예에서, 키트는 (a) 임의적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 중에 혈청 알부민 접합체를 포함하는 용기; 및 (b) 대상체에서 출혈 장애를 치료 또는 예방하기 위한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한다.
일 실시예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 혈청 알부민 접합체; (b) 대상체에서 출혈 장애를 치료 또는 예방하는 데 키트를 사용하기 위한 지침서; 및 (c) 임의적으로, 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 화합물 또는 약물을 포함한다.
본 개시의 이러한 예에 따르면, 패키지 삽입물은 용기 상에 있거나 용기와 결합된다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 출혈 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥 내 용액 가방 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 중 하나 이상의 활성 제제는 혈청 알부민 접합체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 혈청 알부민 접합체의 투여량 및 간격과 제공되는 임의의 다른 약제에 관한 구체적인 지침과 함께, 조성물이 치료에 적합한 대상체, 예를 들어, 출혈 장애를 앓고 있거나 발병할 것으로 예상되는 대상체를 치료하는 데 사용됨을 지시한다. 키트는 약학적으로 허용 가능한 희석 완충제, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및/또는 덱스트로오스 용액을 포함하는 추가적인 용기를 더 포함할 수 있다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기(syringe)를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하며, 여기서 혈청 알부민 접합체는 제1 의약이고, 이 물품은 제2 의약으로 대상체를 치료하기 위해 패키지 삽입물에 대한 유효량의 지침서를 추가로 포함한다. 제2 의약은 상기 제시된 치료용 단백질일 수 있다.
본 개시 내용은 하기 비제한적 실시예를 포함한다.
실시예
실시예 1: 인간 혈청 알부민 변이체 생성
인간 혈청 알부민(HSA)의 무작위로 돌연변이된 변이체의 라이브러리는 인간 혈청 알부민의 standard error-prone PCR을 사용하여 생성되었다. 절단 및 프레임시프트 변이체는 Gerth et al.(Protein Eng Des Sel 2004 17 (7):595-602)에 기술 된 바와 같이 인테인(intein)-기반 오픈리딩프레임(ORF) 선택을 사용하여 제거되었다.
이어서, HSA 변이체 클론을 서브클로닝하고 Flp-InTM CHO 세포(Invitrogen) 내로 형질감염시켜 각각 돌연변이 알부민 융합 단백질의 단일 카피를 함유하는 형질감염된 안정한 세포주의 라이브러리를 생성하였다. 간략하게, 통합된 Flp 재조합 표적(FRT) 부위를 함유하는 Flp-InTM CHO 숙주 세포주를 수득하였다. HSA 변이체의 라이브러리를 인간 CMV 프로모터의 제어 하에 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 막관통 도메인 및 Myc tag와 함께 프레임에서 pcDNA5/FRT 발현 플라스미드에 클로닝하였다. HSA 라이브러리 및 인간 CMV 프로모터의 제어 하에 Flp 재조합 효소를 본질적으로 발현하는 pOG44 플라스미드를 함유하는 pcDNA5/FRT 벡터를 Flp-InTM 숙주 세포주에 공동 형질감염시켜, 모든 형질감염된 세포가 성공적으로 돌연변이된 알부민 융합 단백질의 하나의 카피를 보유하는 Flp-촉매 재조합되도록 하였다. PDGFR 막관통 영역을 갖는 융합 단백질로서 HSA 변이체의 발현은 포유동물 세포의 표면 상에 막-결박 변이체의 세포 외 노출을 허용하였다. 선택 배지에서 약 14일 동안 안정적으로 형질감염된 세포를 성장시켜 형질감염되지 않은 세포를 제거하였다.
실시예 2: FcRn/β2m에 대한 친화도 증가와 관련된 잔기의 식별
신생아 Fc 수용체(FcRn/β2m)에 대한 HSA 변이체의 결합 친화도를 결정하기 위해, HSA 변이체를 안정적으로 발현하는 CHO 세포의 개별 풀을 alexa-488 labeled FcRn/β2m(10 μg/ml at pH 5.4 및 100 μg/ml at pH 7.3; 표적 결합 검출용) 및 pH 5.4 및 pH 7.3에서 anti-myc-alexa 647(구조물 발현 검출용)로 염색하였으며, 유세포 분석으로 분석하였다. 각각의 HSA 변이체를 발현하는 세포에 결합된 labelled FcRn의 양을 염색된 세포의 기하 평균 형광 강도(geoMFI) 데이터로서 정량화하였고, labelled FcRn의 세포에 대한 비특이적 결합으로 인한 배경 형광을 차감하였으며, FcRn/β2m에 대한 상대적 결합은 야생형 HSA 및 HSA 변이체 K573Y(Anderson et al,. (2014) J Biol Chem, 289:13492에 기술됨)와 비교하여 결정되었다.
친화도에 기초한 추가 분석을 위해 2개의 클론(clone 3.9 및 clone 5.6)을 선택하였고, 각 클론 내의 개별 돌연변이를 상세히 분석하여 모 클론의 전체 친화도에 대한 각 돌연변이의 기여를 결정하였다.
각각의 HSA 변이체에 대한 FcRn 결합은 2번의 독립적인 실험에서 유세포 분석에 의해 측정되었다. HSA 변이체를 발현하는 세포에 결합된 labelled FcRn의 양을 염색된 세포의 기하 평균 형광 강도(geoMFI)로서 정량화하였다. 세포에 대해 labelled FcRn의 비특이적 결합으로 인한 배경 형광은 수득된 값으로부터 차감하였다. pH 5.4에서 FcRn/β2m에 대하여 야생형에 비해 개선된 결합은 양성 대조군 HSA 변이체 K573Y뿐만 아니라, 단일 치환 Q522L, G572R 및 A552V를 갖는 HSA 변이체에서도 관찰되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, T133I, K162N, K317E, F377I, I388T, F157L, P282S 및 Y452S를 포함하는 다수의 클론은 야생형에 비해 개선된 결합을 나타내지 않았다. pH 7.3에서 클론 중 어느 것도 FcRn/β2m에 대해 주목할 만한 결합을 나타내지 않았다.
실시예 3: 단일 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체의 생성
아미노산 잔기 Q522, G572 및 A552가 주목할 만한 잔기로 선택되었다. 잔기 Q522 또는 G572에서 시스테인을 제외한 모든 아미노산의 단일 치환으로 HSA 변이체의 패널을 생성하고, CHO 세포에서 안정적으로 발현시켰다. FcRn/β2m에 대한 HSA 변이체의 결합은 4번의 독립적인 실험에서 유세포 분석에 의해 상기 기재된 바와 같이 결정되었다. 각각의 HSA 변이체를 발현하는 세포에 결합된 labelled FcRn의 양을 염색된 세포의 기하 평균 형광 강도(geoMFI) 데이터로서 정량화하였다. 세포에 대해 labelled FcRn의 비특이적 결합으로 인한 배경 형광을 뺀 후, 각각의 실험적으로 결정된 평균값에 대한 상한 및 하한 신뢰 구간(95% CI)을 계산하였다.
pH 5.5 및 pH 7.4 둘 다에서 모든 HSA 변이체의 FcRn 결합 강도(geoMFI)를 개별적으로 정규화하여 실험 사이의 측정된 강도의 체계적인 차이에 대해 조정하였다. 두 pH 조건 모두에 대해 주어진 HSA 변이체의 결합의 복제 측정 값을 반복 실험에 걸친 평균값으로 조정하였다(Dudoit et al. 2002 Statistica Sinica 12, 111-139에 기술된 바와 같이 마이크로어레이 데이터의 강도 정규화와 유사함). pH 5.5에서 FcRn 결합에 있어서, 복제물은 모든 시험된 변이체에 대해 측정된 geoMFI 값의 범위에 걸쳐 명확한 비선형 차이를 가졌다. 이차 함수는 log2 scale에서 모든 geoMFI 값을 갖는 각 복제물의 결합 강도 대 평균(4회 반복) 결합 강도에 대한 강력한 회귀에 의해 적합하였다. 조정을 통해, 각각의 예측된 실험-특이적 결합 강도는 실험 전체의 평균 결합 강도로 대체되었으며, 각각의 변이체의 나머지는 동일하게 유지되었다. pH 7.4에서 FcRn 결합을 측정하기 위해, 일차 함수가 적합하였다(즉, 조정 단계는 실험 특이적 (작은) 절편 상수를 빼고 실험 특이적 scaling 상수로 나누는 것과 동일하다).
9개의 Q522 변이체는 산성 pH 5.5에서 통계적으로 유의하게 증가된 FcRn/β2m 결합을 보여주었다: 야생형 HSA에 비해 Q522G, Q522I, Q522K, Q522M, Q522F, Q522W, Q522Y, Q522V 및 Q522L에서 증가(표 2). 6개의 G572 변이체는 산성 pH 5.5에서 통계적으로 유의미하게 증가된 FcRn/β2m 결합을 나타내었다: 야생형 HSA에 비해 G572A, G572E, G572H, G572S, G572K 및 G572R 에서 증가(표 3). pH 7.4에서 FcRn/β2m에 대해 어떠한 HSA 변이체도 유의한 결합이 관찰되지 않았다. Q522L, A552V, G572R 및 K573Y 치환은 야생형 HSA에 비해 산성 pH 5.5에서 FcRn/β2m에 대한 결합에서 가장 유의한 증가를 나타냈다(표 4).
실시예 4: 다수의 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체의 생성
FcRn/β2m 결합에 대한 돌연변이의 부가적 또는 상승적 효과를 시험하기 위해, 이중, 삼중 및 사중 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체를 전술한 바와 같이 생성시켰다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 이중 HSA 변이체 Q522L/A552V, Q522L/G572R 및 A552V/G572R은 야생형 HSA 및 상응하는 단일 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체에 비해 pH 5.5에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 향상되었다.
K573Y 돌연변이를 보유한 이중 HSA 변이체(Q522L/K573Y, A552V/K573Y 및 G572R/K573Y)는 야생형 HSA 및 단일 HSA 변이체 Q522L A552V, G572R에 비해 pH 5.5에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 향상되었다. G572R/K573Y를 제외한 이중 HSA 변이체 Q552L/K573Y 및 A552V/K573Y는 HSA 변이체 K573Y에 비해 pH 5.5에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 향상되었다.
삼중 HSA 변이체 Q522L/A522V/G572R은 야생형 HSA 및 상응하는 단일 및 이중 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체에 비해 pH 5.5에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 향상되었을 뿐만 아니라, HSA 변이체 K573Y에 비해 결합 수준이 약 2배 증가하였다(표 5).
삼중 HSA 변이체 Q522L/A552V/K573Y 및 Q522L/G572R/K573Y 는 야생형 HSA 및 상응하는 단일 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체에 비해 pH 5.5에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 향상되었으며, HSA 변이체 K573Y에 비해 결합이 유의하게 향상되었다.
사중 HSA 변이체 Q522L/A552V/G572R/K573Y는 야생형 HSA 및 상응하는 단일 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체에 비해 pH 5.5에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 향상되었다. 그러나, 사중 변이체는 또한 야생형 HSA에 비해 pH 7.4에서 FcRn/β2m 결합이 유의하게 증가되었다.
실시예 5: 단일, 이중 및 삼중 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체의 결합 동역학
FcRn/β2m 결합에 대한 돌연변이의 효과를 시험하기 위해, 단일, 이중 및 삼중 HSA 변이체를 전술한 바와 같이 생성시켰다. 결합 동역학을 BIAcoreTM 4000(GE Healthcare Life Sciences)과 함께 SPR을 사용하여 측정하였다. 재조합 hFcRn/β2M을 화학적으로 비오티닐화하고, GE 스트렙타비딘 센서 칩(GE Healthcare Life Sciences)에 테더링하였다. 간단히 말하면, 인간 FcRn/β2M은 얼음상에서 2시간 동안 1:0.25 몰비로 제조된 연장된 비오틴 링커(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin)를 사용하여 PBS에서 낮은 단백질:비오틴 비(즉, 최소 비오틴화)에서 화학적으로 변형되었다. 제조사의 지시에 따라 반응 혼합물을 스핀 컬럼(10000 NMW)을 사용하여 탈염시켰다.
HSA 변이체는 5, 1.7, 0.6 및 0 μM의 농도로 주입되었다. 분석은 10mM HEPES에서 수행되었다; 37℃, 150mM NaCl pH 6.0에서 4회. 결합 및 해리 단계를 100초 동안 모니터링하고, 각 사이클을 90초 동안 pH 7.4의 중성에서 재생 단계로 종료시켰다. Sensograms은 각 실행 내 기준(스폿 3) 및 블랭크 버퍼 주입으로부터 이중-감산되었다.
pH 6에서 최소 비오티닐화된 인간 FcRn에 대해 스크리닝된 모든 HSA 변이체에 대해 속도 상수 및 전체 친화도 비율을 구했다. 1.7 μM 및 0.6 μM 주입으로부터 수득된 데이터는 1:1 결합 모델에 잘 맞는 반면, 5 μM 주입으로부터 수득된 데이터는 포화 반응으로 인한 모델 피팅에 사용되었다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 8개의 Q522 변이체는 산성 pH 6.0에서 증가된 FcRn/β2m 결합을 나타냈다: 야생형 HSA에 비해 Q522F, Q522G, Q522M, Q522K, Q522Y, Q522I, Q522A 및 Q522L에서 증가. 6개의 G572 변이체는 산성 pH 6.0에서 증가된 FcRn/β2m 결합을 나타냈다: 야생형 HSA에 비해 G572R, G572K, G572V, G572A, G572S 및 G572H에서 증가(표 6). 이중 HSA 변이체 A522V/G572R, Q522L/A552V 및 삼중 HSA 변이체 Q522L/A552V/G572R은 모두 야생형 HSA에 비해 산성 pH 6.0에서 증가된 FcRn/β2m 결합을 나타냈다(표 6).
실시예 6: 단일, 이중 및 삼중 아미노산 치환을 갖는 HSA 변이체의 결합 동역학
FcRn/β2m 결합에서 단일, 이중 및 삼중 HSA 변이체의 결합 동역학을 BIAcoreTM 8000(GE Healthcare Life Sciences)과 함께 SPR을 사용하여 측정하였다. 음성 대조군으로 [H464Q]를 사용하였다.
재조합 hFcRn/β2M을 화학적으로 비오티닐화하고 상기 기재한 바와 같이 GE의 스트렙타비딘 센서 칩에 테더링하였다. HSA 변이체는 2 내지 0.015 μM 범위의 농도로 주사되었다. 분석은 10mM HEPES에서 수행되었다; 37℃, 150mM NaCl(pH 6.0)에서 3회. 결합 상을 120초 동안 모니터하고 해리를 240초 동안 모니터했다. 각 사이클은 90초 동안 기본 조건(즉, pH 8.0)에서 재생 단계로 종결되었다. Sensograms은 각 실행 내의 기준 및 블랭크 버퍼 주입으로부터 이중-감산되었다.
산성 조건에서 얻은 데이터는 1:1 결합 모델에 잘 맞았다. 속도 상수 및 결합 친화도는 전술한 바와 같이 확립되었다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 대부분의 HSA 돌연변이체는 야생형 HSA에 비해 결합 친화도(KD)에서 향상(최대 3배)을 나타냈다. 이중 HSA 변이체 [Q522L/A552V], [Q522L/G572R] 및 [A552V/G572R]은 재조합 야생형 HSA와 비교하여 hFcRn/β2m에 대한 결합 친화도가 10배까지 향상되었다. 삼중 HSA 변이체 [Q522L/A552V/G572R]는 대략 25 nM에서 가장 강한 결합을 가졌다. 음성 대조군 HSA [H464Q]는 hFcRn/β2m에 결합하지 않았다.
실시예 7: 산성 및 중성 pH에서 선택된 HSA 변이체의 포유동물 FcRn/β2m에 대한 결합 친화도
단일 HSA 변이체 G572R 및 K573Y, 이중 HSA 변이체 Q522L/A552V, Q522L/G572R 및 A552V/G572R 및 삼중 HSA 변이체 Q522L/A552V/G572R은 상기 기재된 바와 같이 생성되었으며, BIAcoreTM 4000(GE Healthcare Life Sciences)과 함께 SPR을 사용하여 결합 동역학을 측정했다.
HSA 변이체를 1 μg/mL로 희석하고, amine-coupling chemistry(NHS/EDC)를 사용하여 carboxymethyl dextran(CM-5) sensor chip(GE Healthcare Life Sciences)의 두 표면 부위에 직접적으로 고정시켰다. HSA 변이체는 각각의 flow cell의 외부 스팟(1 및 5)에서 100 내지 500RU 및 내부 스팟(2 및 4)에서 200 내지 1000RU의 값으로 고정되었다. 각각의 flow cell의 스팟 3을 활성화/비활성화하고, 기준 감산에 사용하였다. FcRn/β2m의 유속을 30 μL/min으로 일정하게 유지하였다.
고정화된 HSA 변이체에 대한 가용성 재조합 인간, 필리핀 원숭이('cyno'), 랫트 및 마우스 FcRn/β2m의 결합을 산성 pH(pH 6.0) 및 중성 pH(pH 7.3)에서 시험하였다. 2 내지 0.007 μM(pH 6.0) 및 20 내지 0.078 μM(pH 7.3)의 농도 범위를 사용하였고, 결합 및 해리 상을 각각 180초 및 600초 동안 모니터링하였다.
표면의 재생은 전술한 바와 같이 수행되었다. 산성 조건에서 얻은 sensogram 데이터는 1:1 결합 모델에 잘 맞았다. 그러나, pH 7.3에서 얻은 sensograms은 기기의 검출 한계 근처에서 off-rates을 보였으며, 분석을 위한 steady-state 결합 모델을 필요로 했다.
표 8에 나타낸 바와 같이, pH 6.0에서 인간 및 cyno FcRn/β2m은 나노몰 결합 친화도를 나타냈다. 인간 및 cyno FcRn/β2m은 pH 6에서 야생형 HSA에 비해 HSA K573Y에 대해 거의 20배 향상된 친화도를 나타냈고, HSA G572R에 대해 5배 향상된 친화도를 나타냈다. 이중 HSA 변이체 Q522L/A552V, Q522L/G572R 및 A552V/G572R의 친화도는 인간 FcRn/β2m에 대해 각각 약 50nM, 약 27nM 및 약 27nM였고, cyno FcRn/β2m에 대해 각각 약 84nM, 49nM 및 48nM였다.
이와 비교하여, 랫트와 쥐 FcRn/β2m은 같은 조건에서 약하거나 결합이 없는 것으로 나타났다. 랫트 FcRn/β2m은 HSA 변이체에 대해 100배 약한 친화도를 나타내었고, 야생형 HSA, HSA 변이체 Q522L/A552V 및 HSA 변이체 G572R에 결합하지 않았다. 이러한 조건 하에서 대략 1 μM에서 랫트 FcRn/β2m는 HSA K573Y에 결합되었지만, HSA G572R에 대한 결합은 검출되지 않았다. 마우스 FcRn/β2m은 테스트된 HSA 변이체 중 어느 것에도 결합하지 않았다.
표 8에 나타낸 바와 같이, pH 7.3에서 인간 및 cyno FcRn/β2m은 야생형 HSA에 결합하지 않았고, pH 7.3에서 HSA K573Y에 약하게 결합(> 50 μM) 하였다. 다른 HSA 변이체에 대한 결합 친화도는 7 내지 63 μM 범위였다. 랫트 및 쥐 FcRn/β2m은 pH 7.3에서 테스트된 HSA 변이체 중 어느 것에도 결합하지 않았다.
실시예 8: 인간 FcRn을 발현하는 마우스에서 HSA 변이체의 약동학적(PK) 특성
HSA 변이체의 PK 특성을 평가하기 위해, 인간 FcRn 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스("hFcRn Tg32" 동형접합 마우스(즉, B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ))가 사용되었다. 혼합 성별 및 연령의 동물(10-14주령; 각 시점 당 3마리)에 10mg/kg의 야생형 HSA, 단일 HSA 변이체 K573Y, 이중 HSA 변이체 Q522L/A552V 또는 삼중 HSA 변이체 Q522L/A552V/G572R를 정맥 주사 하였다.
혈액을 수집하고, 각각의 시험 물품을 사용하는 것을 제외하고는 제조사의 지시에 따라 인간 알부민 ELISA 키트(Bethyl Laboratories, cat no. E88-129)를 사용하여 인간 혈청 알부민의 혈장 수준을 평가하여, 개별 기준 곡선을 생성하였다. 분석 전에 각 시점에 대해 데이터를 평균화하고, 맞춤형 MATLAB 프로그램 NCAPKfit을 사용하여 비선형 (Marquandt-Levenberg) 최소화 피팅으로 데이터를 분석하였다. 최소 제곱을 사용하여1/Y^2 가중치 피팅으로 모델 피팅을 수행했으며, 사용된 식은 다음과 같다:
PK2(t) = A*exp(-log(2)*t/T1)+B*exp(-log(2)*t/T2).
평균 체류 시간(MRT), 곡선하면적(AUC) 및 제거율은 표준 통계 공식을 사용하여 계산되었다.
도 1, 표 9 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 야생형 HSA의 약동학적 특성은 3가지 모든 HSA 변이체와 현저하게 상이하였고, 야생형 HSA는 평균 체류 시간(MRT)이 더 짧고, 곡선하면적(AUC)이 더 작고, 빠른 제거를 갖는다. 단일 HSA 변이체 K573Y, 이중 HSA 변이체 Q522L/A552V 및 삼중 HSA 변이체 Q522L/A552V/G572R은 야생형 HSA와 비교하여 세 가지 기준(즉, MRT, AUC 및 제거) 모두의 측면에서 약동학이 상당히 우수했다.
pH 5.4(10 μg/mL FcRn-alexa488) 및 pH 7.3(100 μg/mL FcRn-alexa488)에서 HSA 변이체에 대한 FcRn-alexa488의 결합
HSA variant pH 5.4 pH 7.3
geoMFI Fold change to WT geoMFI Fold change to WT
Clone 5.6
HSA[T133I/K162N/N295I/Q522L] (clone 5.6) 15931.6 9.5 24.6 1.5
HSA [T133I/K162N/Q522L] 15090.6 9.0 23 1.4
HSA [T133I/Q522L] 10839.6 6.5 20.1 1.2
HSA [T133I] 1265.6 0.8 18.9 1.2
HSA [K162N] 1437.6 0.9 17.4 1.1
HSA [Q522L] 16468.6 9.8 17.4 1.1
HSA [WT] 1674.6 1.0 16.3 1.0
HSA [K573Y] 45011.6 26.9 15.6 1.0
Clone 3.9
HSA [K317E/M329V/K372E/F377I/I388T/A552V/G572R] (clone 3.9) 34796.6 20.8 28.8 1.8
HSA [K317E/K372E/A552V/G572R] 29479.6 17.6 29.6 1.8
HSA [T133I/Q522L/A552V/G572R] 37814.6 22.6 53.8 3.3
HSA [K317E] 1374.6 0.8 23.9 1.5
HSA [M329V] 1329.6 0.8 18.7 1.1
HSA [K372E] 1469.6 0.9 21.7 1.3
HSA [F377I] 1483.6 0.9 9.5 0.6
HSA [I388T] 3444.6 2.1 13.9 0.9
HSA [A552V] 8082.6 4.8 17.5 1.1
HSA [G572R] 11924.6 7.1 21.6 1.3
HSA [A552V/G572R] 30527.6 18.2 32 2.0
HSA [WT] 1674.6 1.0 16.3 1.0
HSA [K573Y] 45011.6 26.9 15.6 1.0
pH 5.5 및 pH 7.4에서 HSA 변이체에 대한 FcRn-alexa488의 결합의 평균 및 범위(95% 신뢰구간)
HSA variant pH 5.5 pH 7.4
Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT (95% CI) Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI)
HSA[Q522A] 170.9 (133.5 - 218.8) ns 1.07 (0.8 - 1.4) 17.8 (5.8 - 54.7) ns 0.45 (0.1 - 1.4)
HSA[Q522R] 386.3 (253.2 - 589.4) ns 2.42 (1.6 - 3.7) 17.8 (4.0 - 78.7) ns 0.45 (0.1 - 2.0)
HSA[Q522N] 153.8 (131.3 - 180.3) ns 0.97 (0.8 - 1.1) 31.4 (18.4 - 53.6) ns 0.79 (0.5 - 1.3)
HSA[Q522D] 316.6 (262.3 - 382.1) ns 1.99 (1.6 - 2.4) 22.4 (14.7 - 34.2) ns 0.56 (0.4 - 0.9)
HSA[Q522E] 127.9 (92.6 - 176.6) ns 0.8 (0.6 - 1.1) 29.2 (15.5 - 55.0) ns 0.73 (0.4 - 1.4)
HSA[Q522G] 383.9 (317.9 - 463.6) (1) 2.41 (2.0 - 2.9) 26.4 (7.5 - 92.8) ns 0.66 (0.2 - 2.3)
HSA[Q522H] 147.7 (132.5 - 164.8) ns 0.93 (0.8 - 1.0) 27.2 (11.7 - 62.9) ns 0.68 (0.3 - 1.6)
HSA[Q522I] 666.3 (544.3 - 815.6) (1) 4.18 (3.4 - 5.1) 26.3 (4.8 - 144.7) ns 0.66 (0.1 - 3.6)
HSA[Q522K] 452 (356.2 - 573.6) (1) 2.84 (2.2 - 3.6) 30.4 (9.9 - 93.8) ns 0.77 (0.2 - 2.4)
HSA[Q522M] 586.3 (511.7 - 671.8) (1) 3.68 (3.2 - 4.2) 38 (20.8 - 69.5) ns 0.96 (0.5 - 1.7)
HSA[Q522F] 1379.6 (1069.9 - 1779.1) (2) 8.66 (6.7 - 11.2) 27.9 (8.4 - 93.0) ns 0.7 (0.2 - 2.3)
HSA[Q522P] 169.4 (144.9 - 198.1) ns 1.06 (0.9 - 1.2) 29.4 (10.2 - 85.4) ns 0.74 (0.3 - 2.1)
HSA[Q522S] 257.6 (218.9 - 303.1) ns 1.62 (1.4 - 1.9) 32.7 (10.9 - 98.0) ns 0.82 (0.3 - 2.5)
HSA[Q522T] 290.3 (239.0 - 352.6) ns 1.82 (1.5 - 2.2) 28.3 (10.3 - 77.7) ns 0.71 (0.3 - 2.0)
HSA[Q522W] 596.2 (406.4 - 874.6) (1) 3.74 (2.5 - 5.5) 20.2 (6.5 - 62.3) ns 0.51 (0.2 - 1.6)
HSA[Q522Y] 1213.6 (1074.5 - 1370.7) (2) 7.61 (6.7 - 8.6) 18.6 (4.9 - 71.3) ns 0.47 (0.1 - 1.8)
HSA[Q522V] 617 (477.6 - 797.0) (1) 3.87 (3.0 - 5.0) 32.8 (14.0 - 76.9) ns 0.82 (0.4 - 1.9)
HSA[Q522L] 2203.6 (1689.9 - 2873.3) (2) 13.83 (10.6 - 18.0) 30.3 (10.8 - 85.1) ns 0.76 (0.3 - 2.1)
HSA WT 159.4 (85.6 - 296.7) n/a 1.0 39.8 (16.9 - 93.3) n/a 1.0
HSA [K573Y] 29147.9 (20225.5 - 42006.2) (2) 182.89 (126.9 - 263.6) 27.6 (12.8 - 59.7) ns 0.7 (0.3 - 1.5)
(1) Significant difference (p<0.01) from HSA WT; (2) Significant difference (p<0.001) from HSA WT; ns = not significantly greater than wild-type HSA. n/a = not applicable
pH 5.5 및 pH 7.4에서 HSA 변이체에 대한 FcRn-alexa488의 결합의 평균 및 범위(95% 신뢰구간)
HSA variant pH 5.5 pH 7.4
Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI) 		Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI)
HSA[G572A] 536.4 (419.3 - 686.3) (1) 3.37 (2.6 - 4.3) 29.8 (16.0 - 55.7) ns 0.75 (0.4 - 1.4)
HSA[G572N] 85.8 (42.0 - 175.6) ns 0.54 (0.3 - 1.1) 36.4 (19.9 - 66.7) ns 0.92 (0.5 - 1.7)
HSA[G572D] 304.9 (235.1 - 395.5) ns 1.91 (1.5 - 2.5) 32.7 (16.8 - 63.9) ns 0.82 (0.4 - 1.6)
HSA[G572Q] 200.8 (108.3 - 372.3) ns 1.26 (0.7 - 2.3) 40.2 (23.5 - 68.7) ns 1.01 (0.6 - 1.7)
HSA[G572E] 378.7 (298.2 - 480.8) (1) 2.38 (1.9 - 3.0) 28.8 (12.5 - 66.6) ns 0.72 (0.3 - 1.7)
HSA[G572H] 495.1 (356.3 - 687.9) (1) 3.11 (2.2 - 4.3) 33.5 (13.5 - 83.4) ns 0.84 (0.3 - 2.1)
HSA[G572I] 35.2 (13.7 - 90.5) ns 0.22 (0.1 - 0.6) 28.9 (11.2 - 74.7) ns 0.73 (0.3 - 1.9)
HSA[G572L] 31.2 (7.4 - 131.1) ns 0.2 (0.05 - 0.8) 20.3 (11.4 - 36.0) ns 0.51 (0.3 - 0.9)
HSA[G572K] 9200.8 (5674.0 - 14919.5) (2) 57.73 (35.6 - 93.6) 22.7 (12.9 - 39.7) ns 0.57 (0.3 - 1.0)
HSA[G572M] 38.2 (6.7 - 218.8) ns 0.24 (0.04 - 1.4) 24 (13.1 - 44.1) ns 0.6 (0.3 - 1.1)
HSA[G572F] 25.7 (6.4 - 103.5) ns 0.16 (0.04 - 0.6) 20.6 (10.3 - 41.2) ns 0.52 (0.3 - 1.0)
HSA[G572P] 215.9 (20.5 - 2276.5) ns 1.35 (0.1 - 14.3) 30.6 (18.9 - 49.7) ns 0.77 (0.5 - 1.2)
HSA[G572S] 445.1 (390.5 - 507.3) (1) 2.79 (2.5 - 3.2) 18.4 (8.4 - 40.6) ns 0.46 (0.2 - 1.0)
HSA[G572T] 38 (18.1 - 79.8) ns 0.24 (0.1 - 0.5) 18.1 (4.4 - 74.4) ns 0.46 (0.1 - 1.9)
HSA[G572W] 34.4 (16.4 - 71.9) ns 0.22 (0.1 - 0.5) 21.2 (8.4 - 53.6) ns 0.53 (0.2 - 1.3)
HSA[G572Y] 39 (15.9 - 95.5) ns 0.24 (0.1 - 0.6) 29.9 (14.4 - 62.1) ns 0.75 (0.4 - 1.6)
HSA[G572V] 58.2 (47.3 - 71.6) ns 0.37 (0.3 - 0.4) 20.7 (8.3 - 51.3) ns 0.52 (0.2 - 1.3)
HSA[G572R] 6814.2 (4453.0 - 10427.3) (2) 42.76 (27.9 - 65.4) 31.7 (12.0 - 84.3) ns 0.8 (0.3 - 2.1)
HSA WT 159.4 (85.6 - 296.7) n/a 1.0 39.8 (16.9 - 93.3) n/a 1.0
HSA [K573Y] 29147.9 (20225.5 - 42006.2) (2) 182.89 (126.9 - 263.6) 27.6 (12.8 - 59.7) ns 0.7 (0.3 - 1.5)
(1) Significant difference (p<0.01) from HSA WT; (2) Significant difference (p<0.001) from HSA WT; ns = not significantly greater than wild-type HSA. n/a = not applicable
pH 5.5 및 pH 7.4에서 HSA 변이체에 대한 FcRn-alexa488의 결합의 평균 및 범위(95% 신뢰구간)
HSA variant pH 5.5 pH 7.4
Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI) 		Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI)
HSA WT 159.4 (85.6 - 296.7) n/a 1.0 39.8 (16.9 - 93.3) n/a 1.0
HSA [K573Y] 29147.9 (20225.5 - 42006.2) (2,3,4,5) 182.89 (126.9 - 263.6) 27.6 (12.8 - 59.7) ns 0.7 (0.3 - 1.5)
HSA[Q522L] 2203.6 (1689.9 - 2873.3) (2,4) 13.83 (10.6 - 18.0) 30.3 (10.8 - 85.1) ns 0.76 (0.3 - 2.1)
HSA[A552V] 644 (464.3 - 893.4) (1) 4.04 (2.9 - 5.6) 46.1 (36.2 - 58.7) ns 1.16 (0.9 - 1.5)
HSA[G572R] 6814.2 (4453.0 - 10427.3) (2,3,4) 42.76 (27.9 - 65.4) 31.7 (12.0 - 84.3) ns 0.8 (0.3 - 2.1)
HSA[Q522L,A552V] 7572.3 (6586.9 - 8705.1) (2,3,4) 47.51 (41.3 - 54.6) 28.8 (12.5 - 66.4) ns 0.73 (0.3 - 1.7)
HSA[Q522L,G572R] 28723.1 (19498.2 - 42312.3) (2,3,4,5) 180.23 (122.3 - 265.5) 37.6 (19.8 - 71.4) ns 0.95 (0.5 - 1.8)
HSA[A552V,G572R] 37739.5 (35785.0 - 39800.7) (2,3,4,5) 236.8 (224.5 - 249.7) 37.9 (24.3 - 59.1) ns 0.95 (0.6 - 1.5)
HSA[Q522L,A552V,G572R] 65180.1 (54138.9 - 78473.1) (2,3,4,5,6) 408.98 (339.7 - 492.4) 46.8 (33.6 - 65.3) ns 1.18 (0.8 - 1.6)
(1) Significant difference (p<0.01) from HSA WT
(2) Significant difference (p<0.001) from HSA WT
(3) Significant difference (p<0.001) from HSA[Q522L]
(4) Significant difference (p<0.001) from HSA[A552V]
(5) Significant difference (p<0.001) from HSA[G572R]
(6) Significant difference (p<0.001) from HSA[K573Y]
ns = not significantly greater than wild-type HSA
n/a = not applicable
pH 5.5 및 pH 7.4에서 HSA 변이체에 대한 FcRn-alexa488의 결합의 평균 및 범위(95% 신뢰구간)
HSA variant pH 5.5 pH 7.4
Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI) 		Mean geoMFI
(95% CI) 		P value Fold change to WT
(95% CI)
HSA WT 159.4
(85.6 - 296.7)		 n/a 1.0 39.8 (16.9 - 93.3) ns 1.0
HSA [K573Y] 29147.9 (20225.5 - 42006.2) (2,3,4,5) 182.89
(126.9 - 263.6)		 27.6 (12.8 - 59.7) ns 0.7 (0.3 - 1.5)
HSA[Q522L] 2203.6 (1689.9 - 2873.3) (2,4) 13.83
(10.6 - 18.0)		 30.3 (10.8 - 85.1) ns 0.76 (0.3 - 2.1)
HSA[A552V] 644 (464.3 - 893.4) (1) 4.04
(2.9 - 5.6)		 46.1 (36.2 - 58.7) ns 1.16 (0.9 - 1.5)
HSA[G572R] 6814.2 (4453.0 - 10427.3) (2,3,4) 42.76
(27.9 - 65.4)		 31.7 (12.0 - 84.3) ns 0.8 (0.3 - 2.1)
HSA[Q522L,A552V] 7572.3 (6586.9 - 8705.1) (2,3,4) 47.51
(41.3 - 54.6)		 28.8 (12.5 - 66.4) ns 0.73 (0.3 - 1.7)
HSA[Q522L,G572R] 28723.1 (19498.2 - 42312.3) (2,3,4,5) 180.23
(122.3 - 265.5)		 37.6 (19.8 - 71.4) ns 0.95 (0.5 - 1.8)
HSA[A552V,G572R] 37739.5 (35785.0 - 39800.7) (2,3,4,5) 236.8
(224.5 - 249.7)		 37.9 (24.3 - 59.1) ns 0.95 (0.6 - 1.5)
HSA[Q522L,A552V,G572R] 65180.1 (54138.9 - 78473.1) (2,3,4,5,7,8,9,10) 408.98
(339.7 - 492.4)		 46.8 (33.6 - 65.3) ns 1.18 (0.8 - 1.6)
HSA[Q522L,K573Y] 85950.7
(56455.2 - 130856.3)		 (2,3,7) 539.3
(354.2 - 821.1)		 28.3 (12.6 - 63.5) ns 0.7 (0.3 - 1.6)
HSA[A552V,K573Y] 92717.2 (58348.7 - 147329.4) (2,4,7) 581.8
(366.1 - 924.4)		 36.5 (22.3 - 59.7) ns 0.9 (0.6 - 1.5)
HSA[G572R,K573Y] 42587.6 (28709.3 - 63174.8) (2,5) 267.2
(180.1 - 396.4)		 30.4 (13.7 - 67.4) ns 0.8 (0.3 - 1.7)
HSA[Q522L,A552V,K573Y] 103807.3 (92277.2 - 116778.1) (2,3,4,7) 651.4
(579.0 - 732.7)		 31.9 (16.6 - 61.2) ns 0.8 (0.4 - 1.5)
HSA[Q522L,G572R,K573Y] 62796.1 (40576.1 - 97184.1) (2,3,5,6) 394.0
(254.6 - 609.8)		 193.9 (166.5 - 225.7) ns 4.9 (4.2 - 5.7)
HSA[Q522L,A552V,G572R,K573Y] 70142.8
(58098.7 - 84683.9)		 (2,3,4,5,7) 440.1
(364.6 - 531.4)		 328.9 (303.0 - 357.0) (1) 8.3 (7.6 - 9.0)
(1) Significant difference (p<0.01) from HSA WT; (2) Significant difference (p<0.001) from HSA WT; (3) Significant difference (p<0.001) from HSA[Q522L];
(4) Significant difference (p<0.001) from HSA[A552V]; (5) Significant difference (p<0.001) from HSA[G572R]; (6) Significant difference (p<0.01) from HSA[K573Y];
(7) Significant difference (p<0.001) from HSA[K573Y]; (8) Significant difference (p<0.001) from HSA[Q522L,A552V]; (9) Significant difference (p<0.001) from HSA[Q522L,G572R]; (10) Significant difference (p<0.001) from HSA[A552V,G572R]; ns = not significantly greater than wild-type HSA; n/a = not applicable
산성 pH(pH 6)에서 스트렙타비딘 센서 칩에 테더링된 비오티닐화 hFcRn/β2M에 대한 가용성 HSA 돌연변이체의 속도 상수 및 친화도
HSA variant k a (1/Ms) k d (1/s) K D (nM)
HSA WT 7.42 x 104 3.10 x 10-2 427 ± 31
HSA [Q522L,A552V,G572R] 3.42 x 104 1.40 x 10-3 41 ± 1
HSA [K573Y] 2.72 x 104 1.24 x 10-3 46 ± 1
HSA [A552V/G572R] 4.66 x 104 2.58 x 10-3 55± 2
HSA [G572R] 4.66 x 104 6.21 x 10-3 133 ± 1
HSA [Q522L, A552V] 3.73 x 104 5.00 x 10-3 134 ± 3
HSA [G572K] 4.32 x 104 6.64 x 10-3 154 ± 4
HSA [Q522F] 3.93 x 104 8.19 x 10-3 209 ± 8
HSA [G572V] 4.98 x 104 1.14 x 10-2 230 ± 3
HSA [Q522G] 4.81 x 104 1.27 x 10-2 264 ± 10
HSA [Q522M] 1.07 x 104 3.27 x 10-2 305 ± 8
HSA [Q522K] 6.07 x 104 1.82 x 10-2 307 ± 24
HSA [G572A] 4.91 x 104 1.50 x 10-2 308 ± 17
HSA [Q522Y] 4.66 x 104 1.46 x 10-2 321 ±32
HSA [A552V] 3.67 x 104 1.18 x 10-2 322 ± 3
HSA [G572S] 7.24 x 104 2.29 x 10-2 334 ± 39
HSA [Q522I] 5.07 x 104 1.69 x 10-2 338 ± 23
HSA [Q522A] 5.23 x 104 1.80 x 10-2 348 ± 22
HSA [G572H] 6.79 x 104 2.39 x 10-2 356 ± 44
HSA [Q522L] 4.07 x 104 1.26 x 10-2 389 ± 194
HSA [Q522V] 1.14 x 104 1.00 x 10-2 880 ± 44
HSA [Q522W] 2.04 x 104 3.02 x 10-2 1506 ± 197
산성 pH(pH 6)에서 스트렙타비딘 센서 칩에 테더링된 비오티닐화 hFcRn/β2M에 대한 가용성 HSA 돌연변이체의 속도 상수 및 친화도
HSA variant k a (1/Ms) k d (1/s) K D (nM) ± SEM
HSA WT 7.70E+04 3.71E-02 479.4 ± 64.3
HSA [Q522L/A552V/G572R] 7.01E+04 1.76E-03 25.0 ± 0.6
HSA [Q522L/A552V] 6.92E+04 6.78E-03 97.9 ± 4.8
HSA [Q522L/G572R] 8.19E+04 4.12E-03 50.2 ± 1.1
HSA [A552V/G572R] 7.63E+04 3.18E-03 41.7 ± 0.5
HSA [K573Y] 4.79E+04 1.63E-03 33.9 ± 0.6
HSA [G572H] 1.07E+05 4.83E-02 452.8 ± 36.7
HSA [G572R] 1.05E+05 1.08E-02 103.1 0.3
HSA [G572K] 1.09E+05 1.68E-02 154.4 ± 9.0
HSA [Q522F] 6.37E+04 1.33E-02 208.3 ± 3.2
HSA [A552V] 4.38E+04 1.26E-02 286.9 ± 0.3
HSA [Q522I] 7.61E+04 2.52E-02 332.1 ± 6.0
HSA [Q522L] 5.78E+04 1.16E-02 201.0 ± 1.2
HSA [Q522A] 7.53E+04 3.39E-02 465.0 ± 35.2
HSA [H464Q] NB NB NB
NB: No Binding detected
산성 pH(pH 6.0) 및 중성 pH(pH 7.3)에서 고정된 인간 HSA 변이체에 대한 가용성 포유동물 FcRn/β2m 결합의 결합 친화도
Ligand Analyte
HSA variant pH 6.0 (1) pH 7.3 (2)
hsFcRn*
(K D nM, N=6) 		cynoFcRn
(K D nM, N=4) 		ratFcRn
(K D nM, N=4) 		murineFcRn
(K D nM, N=4) 		hsFcRn f
(K D μM, N=4) 		cynoFcRn
(K D μM, N=2) 		ratFcRn
(K D μM, N=2) 		murineFcRn
(K D μM, N=2)
HSA WT 343.9 ± 36.4 593.6 ± 11.9 NB NB NB NB NB NB
HSA [K573Y] 18.1 ± 1.2 34.7 ± 0.7 989.2 ± 196.2 NB >50 45.2 NB NB
HSA[G572R] 58.3 ± 2.7 109.1 ± 9.5 NB NB 32.7 ± 3.9 21.1 NB NB
HSA[Q522L,A552V] 50.1 ± 1.6 84.6 ± 5.1 NB NB >50 33.0 NB NB
HSA[Q522L,G572R] 27.8 ± 0.6 49.5 ± 0.7 4754.1 ± 354.7 NB 18.0 ± 1.0 10.7 NB NB
HSA[A552V,G572R] 27.1 ± 0.7 48.4 ± 0.8 4823.3 ± 307.3 NB 20.5 ± 0.4 13.2 NB NB
HSA[Q522L,A552V,G572R] 16.9 ± 0.5 24.5 ± 0.2 2245.5 ± 119.1 NB 16.1 ± 1.6 7.6 NB NB
(1) Mean ± SEM values indicated in nanomolar calculated from 1:1 binding model.
(2) Human FcRn-β2m data (hsFcRn) are indicated as Mean ± SEM; cyno FcRn-β2m represent the average of two experimental replicates. KD values were calculated from sensogram data fit to a 1:1 steady-state model
* Human soluble FcRns (hsFcRn); NB, Non-binder.
인간 FcRn 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 HSA 변이체의 혈청 농도(μg/mL; mean ± SEM)
Days HSA WT HSA [Q522L, A552V] HSA [Q522L, A552V, G572R] HSA [573Y]
0 218.7 ± 4.3 340.4 ± 20.6 337.0 ± 11.4 335.7 42.6
0.042 186.6 ± 14.9 224.4 ± 8.7 290.9 ± 2.0 251.3 ± 8.2
0.25 114.4 ± 1.5 147.4 ± 3.1 129.9 ± 4.6 146.6 ± 2.7
1 74.9 ± 5.3 112.0 ± 6.4 101.3 ± 3.1 104.9 ± 6.7
2 52.1 ± 3.4 71.2 ± 2.8 76.5 ± 3.8 74.6 ± 4.6
3 41.7 ± 3.0 61.7 ± 2.7 73.3 ± 1.4 66.0 ± 4.9
4 27.5 ± 4.0 49.1 ± 5.8 49.5 ±4.1 49.0 ± 2.9
5 21.0 ± 3.0 36.8 ± 1.6 41.6 ± 2.0 37.1 ± 1.0
7 16.9± 1. 27.6 ± 1.5 33.8 ± 0.4 25.4 ± 1.8
16 0.8 ± 0.4 6.2 ± 1.4 4.4 ± 0.4 3.7 ± 0.4
21 0.2 ± 0.0 2.0 ± 0.6 2.4 ± 0.3 2.2 ± 0.3
29 0.03 ± 0.0 0.5 ± 0.2 0.6 ± 0.1 0.5 ± 0.1
인간 FcRn 수용체를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 HSA 변이체의 혈청 농도의 약동학적 분석
Area Under the Curve
HSA variant AUC (μg/mL*d) SD N p value
HSA WT 344.6 18.2 3
HSA [K573Y] 574.8 30 3 <0.0001
HSA[Q522L,A552V] 597 26.2 3 <0.0001
HSA[Q522L,A552V,G572R] 618 29 3 <0.0001
Mean Residence Time
HSA variant MRT (days) SD N p value
HSA WT 3.31 0.08 3
HSA [K573Y] 4.83 0.15 3 <0.0001
HSA[Q522L,A552V] 5.06 0.12 3 <0.0001
HSA[Q522L,A552V,G572R] 5.02 0.12 3 <0.0001
Clearance
HSA variant Cl (ml/kg*d) SD N p value
HSA WT 29.1 1.5 3
HSA [K573Y] 17.4 0.9 3 <0.0001
HSA[Q522L,A552V] 16.8 0.7 3 <0.0001
HSA[Q522L,A552V,G572R] 16.2 0.8 3 <0.0001
p values represent ANOVA analysis of difference between the selected HSA variant and WT
<110> CSL Limited <120> HUMAN SERUM ALBUMIN VARIANTS AND USES THEREOF <130> Pi20-B030 <150> AU 2017904211 <151> 2017-10-18 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 2 <211> 2340 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro 755 760 765 Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp 770 775 780 Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys 785 790 795 800 Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser 805 810 815 Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr 820 825 830 Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn 835 840 845 Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly 850 855 860 Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu 865 870 875 880 Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys 885 890 895 Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn 900 905 910 Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met 915 920 925 Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys 930 935 940 Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu 945 950 955 960 Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu 965 970 975 Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe 980 985 990 Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala 995 1000 1005 Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn 1010 1015 1020 Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu 1025 1030 1035 1040 Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr 1045 1050 1055 Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp 1060 1065 1070 Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr 1075 1080 1085 Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile 1090 1095 1100 Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe 1105 1110 1115 1120 Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser 1125 1130 1135 Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly 1140 1145 1150 Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys 1155 1160 1165 Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu 1170 1175 1180 Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn 1185 1190 1195 1200 Leu His Glu Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu 1205 1210 1215 Ile Glu Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln 1220 1225 1230 Ile His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu 1235 1240 1245 Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala 1250 1255 1260 Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr 1265 1270 1275 1280 Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu 1285 1290 1295 Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys 1300 1305 1310 Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln 1315 1320 1325 Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr 1330 1335 1340 Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser 1345 1350 1355 1360 Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr 1365 1370 1375 Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys 1380 1385 1390 Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro 1395 1400 1405 Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr 1410 1415 1420 Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr 1425 1430 1435 1440 Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly 1445 1450 1455 Ala Lys Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr 1460 1465 1470 Gly Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser 1475 1480 1485 Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu 1490 1495 1500 Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr 1505 1510 1515 1520 Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His 1525 1530 1535 Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1540 1545 1550 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val 1555 1560 1565 Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu 1570 1575 1580 Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys 1585 1590 1595 1600 Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr 1605 1610 1615 Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile 1620 1625 1630 Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln 1635 1640 1645 Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg 1650 1655 1660 His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu 1665 1670 1675 1680 Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe 1685 1690 1695 Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys 1700 1705 1710 Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr 1715 1720 1725 Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly 1730 1735 1740 Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly 1745 1750 1755 1760 Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly 1765 1770 1775 Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1780 1785 1790 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu 1795 1800 1805 Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn 1810 1815 1820 Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr 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Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly 2340 2345 2350 Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys 2355 2360 2365 Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg 2370 2375 2380 Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn 2385 2390 2395 2400 Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn 2405 2410 2415 Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val 2420 2425 2430 His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys 2435 2440 2445 Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu Arg 2450 2455 2460 Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly 2465 2470 2475 2480 Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro 2485 2490 2495 Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser 2500 2505 2510 Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys 2515 2520 2525 Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln 2530 2535 2540 Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly 2545 2550 2555 2560 Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys 2565 2570 2575 Glu Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly 2580 2585 2590 Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln 2595 2600 2605 Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys 2610 2615 2620 Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys 2625 2630 2635 2640 Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly 2645 2650 2655 Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp 2660 2665 2670 Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala Glu 2690 2695 2700 Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr Cys Glu 2705 2710 2715 2720 Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val 2725 2730 2735 Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly 2740 2745 2750 Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln 2755 2760 2765 Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val 2770 2775 2780 Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn 2785 2790 2795 2800 Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2805 2810

Claims (28)

  1. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편:
    (i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환;
    (ii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환;
    (iii) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환; 및
    (iv) 이들의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 FcRn에 대해 증가된 친화도로 결합하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합 친화도는 산성 pH에서 측정되는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편은 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민과 비교하여 증가된 혈청 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편:
    (i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산 및 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산; 또는
    (ii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산; 또는
    (iii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산; 또는
    (iv) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 글리신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산, 서열번호 1의 552번째 위치에서 알라닌이 발린으로 치환된 아미노산 및 서열번호 1의 572번째 위치에서 글리신이 알라닌, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환된 아미노산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 치환된 티로신을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편:
    (i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환; 및/또는
    (ii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환; 및/또는
    (iii) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편:
    (i) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환; 또는
    (ii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환 및 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환; 또는
    (iii) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환; 또는
    (iv) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
    (v) 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
    (vi) 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
    (vii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환 및 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에 글리신이 아르기닌으로 치환; 또는
    (viii) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
    (ix) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환; 또는
    (x) 서열번호 1의 522번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글루타민이 류신으로 치환, 서열번호 1의 552번째 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌이 발린으로 치환, 서열번호 1의 572번째 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신이 아르기닌으로 치환 및 서열번호 1의 573번째 아미노산에 상응하는 위치에서 리신이 티로신으로 치환.
  9. 제1항 내지 제8항의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편 및 화합물을 포함하는 혈청 알부민 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈청 알부민 접합체는 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 접합체와 비교하여 더 긴 혈청 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 혈청 알부민 접합체는 서열번호 1로 표시되는 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 접합체와 비교하여 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  12. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 단백질, 항체 가변 영역을 포함하는 단백질, 항체 모방체(mimetic), 도메인 항체, 독소, 방사성 동위원소, 검출 가능한 표지, 펩티드, 폴리펩티드, 콜로이드, 화학요법제, 핵산, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), siRNA, 간섭 RNA(RNAi), 리보자임, 마이크로 RNA, 마이크로 RNA 적합 shRNA(shRNAmir), DNAzyme 및 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화합물은 Fv를 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단백질은 하기로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체:
    (i) 단일쇄 Fv 단편(scFv);
    (ii) 이량체 scFv(di-scFv); 또는
    (iii) 디아바디(diabody);
    (iv) 트리아바디(triabody);
    (v) 테트라바디(tetrabody);
    (vi) Fab;
    (vii) F(ab')2;
    (viii) Fv; 또는
    (ix) 항체, Fc 또는 중쇄 불변영역(CH) 2 및/또는 CH3에 연결된 상기 (i) 내지 (viii) 중 하나.
  15. 제12항에 있어서, 상기 단백질은 치료용 단백질인 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 변형된 형태인 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 폰 빌레브란트 인자는 D´D3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  18. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 보체 억제제 또는 이의 변형된 형태인 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  19. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 혈액 응고 인자이거나 혈액 응고 인자에 결합하는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 혈액 응고 인자는 인자 I, 인자 II(프로트롬빈)/트롬빈, 인자 III, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII 및 상기 중 어느 하나의 활성화된 형태로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈청 알부민 접합체.
  21. 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항의 혈청 알부민 접합체 및 약학적 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물.
  22. 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 혈청 알부민 변이체 또는 이의 기능성 단편, 또는 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항의 혈청 알부민 접합체, 또는 제21항의 조성물.
  23. 대상체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항의 혈청 알부민 접합체, 또는 제21항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 대상체의 질병 또는 병태 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항의 혈청 알부민 접합체, 또는 제21항의 조성물의 사용.
  25. 제22항, 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 질병 또는 병태는 출혈 장애인 것을 특징으로 하는 사용하기 위한 혈청 알부민 변이체, 접합체 또는 조성물, 방법 또는 사용.
  26. 제22항 또는 제25항, 제23항 또는 제25항, 또는 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 대상체는 출혈 장애 또는 증상이 발생할 위험이 있는 것을 특징으로 하는 사용하기 위한 혈청 알부민 변이체, 접합체 또는 조성물, 방법 또는 사용.
  27. 제22항, 제25항 또는 제26항, 제23항, 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출혈 장애는 혈우병 A, 혈우병 B, 폰 빌레브란트 병, 인자 I 결핍, 인자 II 결핍, 인자 V 결핍, 결합된 인자 V/인자 VIII 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XI 결핍 또는 인자 XIII 결핍인 것을 특징으로 하는 사용하기 위한 혈청 알부민 변이체, 접합체 또는 조성물, 방법 또는 사용.
  28. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체에서 출혈 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 키트:
    (a) 하나 이상의 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항의 혈청 알부민 접합체 또는 제21항의 조성물;
    (b) 대상체에서 출혈 장애를 치료 또는 예방하는 데 키트를 사용하기 위한 지침서; 및
    (c) 선택적으로, 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 화합물 또는 약물.
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