KR20200068144A

KR20200068144A - 디카르복시산 생합성 관련 효소 및 이를 이용한 디카르복시산 생산방법

Info

Publication number: KR20200068144A
Application number: KR1020180154373A
Authority: KR
Inventors: 김경헌; 바브 티루말라이자나; 김도형; 안정오
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-06-15
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: KR102173101B1; WO2020116932A2; WO2020116932A3; CN113383073A; US20220049231A1

Abstract

본 발명은 디카르복시산 생합성 관련 효소, 이를 코딩하는 유전자 및 이들를 이용한 디카르복시산의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 효소는 기존의 화학적 디카르복시산 생산이 아닌 디카르복시산의 효소적, 생물학적 생산공정에 적용이 가능하여 산업적 활용도가 높을 것으로 예상된다.

Description

디카르복시산 생합성 관련 효소 및 이를 이용한 디카르복시산 생산방법{Microorganism for production of decarboxylic acid and method of producing decarboxylic acid using the Same}

본 발명은 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생산에 관여하는 효소, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 디카르복시산의 생산 방법에 관한 것이다.

디카르복시산(dicarboxylic acid, DCA)은 두 개의 카르복시기 (-COOH)를 함유한 유기화합물이다. 디카르복시산의 일반 분자식은 HO₂C-R-CO₂H (여기서 R은 지방족 또는 방향족이 될 수 있음)으로 쓸 수 있다. 일반적으로 디카르복시산은 모노카르복시산과 유사한 화학 반응 및 반응성을 나타낸다. 디카르복시산은 또한 폴리아미드 및 폴리에스테르와 같은 공중합체의 제조에 사용된다. 업계에서 가장 널리 사용되는 디카르복시산은 아디핀산(adipic acid)으로 나일론 생산의 전구체이다. 디카르복시산의 다른 예로는 인체의 두 가지 아미노산인 아스파르트산과 글루타민산이 있다. 이 외의 다른 카르복시산들도 다양한 산업분야에서 활용되고 있다.

이와 같은 디카르복시산들은 화학적 공정 또는 생물학적인 방법에 의해 제조되고 있다. 디카르복시산 제조와 관련한 일 예로, 디카르복시산 중 하나인 세바식산의 합성은 phenol과 cresol에 의해서도 가능하지만 castor oil oxidation이 가장 친환경적이고 가격 경쟁력이 있는 방법으로 알려져 있다. castor oil은 steam cracking을 통해 transesterification이 일어나며 이를 통해 ricinoleic acid를 생산하게 된다. 이렇게 생산된 ricinoleic acid를 250℃에서 가열 후 molten caustic soda 등과 같은 alkali와 혼합하면 caustic digestion에 의해 capryl alcohol (2-octanol)과 세바식산으로 분리된다. 이렇게 생산된 생산물을 정제하면 높은 순도의 세바식산을 얻게 된다 (미국특허 제 5,952,517호, 미국특허 제 6,392,074호). 하지만 이를 위해서는 300℃ 이상의 고온 공정이 필요하고 황산과 같은 강산이 사용되며 중금속, 독성 유기용매 등과 같은 물질들을 사용함에 따라 환경오염 물질들을 대량으로 발생 시킨다는 문제점이 있다. 세바식산의 제조를 위한 화학적인 방법으로는 이 외에도 아디프산 모노에틸칼륨염을 전해함으로써 생산이 가능하다.

이전 연구를 통해 ω-oxidation capacity가 우수하고 β-oxidation이 차단된 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis)균주를 사용하여 생물학적으로 디카르복시산을 생산하는 사례가 보고되었으나, 명확한 디카르복시산 생합성 경로에 대한 연구는 보고되어진 바 없다. 따라서 디카르복시산의 생합성 경로를 밝혀 디카르복시산을 대량 생산할 수 있는 유용한 균주의 개발이 중요하다.

이에 본 발명자들은 디카르복시산을 생산하는 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis)균주를 가지고 진화적인 방법을 통하여 디카르복시산 생합성과 관련된 유전자를 선별하고, 생합성 경로를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

출원번호 10-2015-0149253

David L. Craft, et al., Applied and Environmental Microbiology, 69(10): 5983-5991, 2003

본 발명의 목적은 리파아제(lipase, LIP1), 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1), NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1) 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1) 중 하나 이상을 포함하는, 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생합성에 관여하는 단백질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 디카르복시산을 생산을 위한 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 디카르복시산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

이전 연구에서, 디카르복시산의 생산은 화학적인 방법으로 이루어져 왔고, 디카르복시산을 생산하는 것으로 알려진 균주들은 대부분이 기질의 세포독성에 취약하여 사멸하므로 생물학적인 방법으로 디카르복시산을 생산하거나 디카르복시산 생산 경로를 파악하는 것이 용이하지 않았다. 이에 본 발명자들은 선행 연구로 진화적인 공법을 통하여 세포독성 기질에 대한 높은 내성을 가지고 디카르복시산을 생산하는 균주를 제조하였고, 상기 균주로부터 디카르복시산 생합성과 관련된 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 선별하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명은 리파아제(lipase, LIP1), 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1), NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1) 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1) 중 하나 이상을 포함하는, 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생합성에 관여하는 단백질을 제공한다.

상기 단백질들은 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

일 실시예에서, 디카르복시산 중 하나인 세바식산을 생산하는 균주로 알려진 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주를 세포독성을 나타내는 기질이 포함된 배지에서 배양함으로써 진화적으로 상기 기질에 대하여 생존능이 우수한 균주를 선별하였고, 상기 선별된 균주의 유전체 분석을 통하여 디카르복시산의 대사와 관련될 것으로 추정되는 균주의 내재유전자인 서열번호 1 내지 5의 염기서열로 각각 표시되는 리파아제(lipase) 유전자, 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1), NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase) 유전자 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase) 유전자를 선별하여, 상기 유전자로부터 발현된 효소들을 in vitro 상에서 기질과 함께 효소반응한 결과 디카르복시산을 생산함을 확인하였다.

상기 리파아제(lipase)는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 의해 발현되고, 상기 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1) 는 서열번호 2로 표시되는 유전자에 의해 발현되고, NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1) 는 서열번호 3으로 표시되는 유전자에 의해 발현되고, 상기 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase)는 서열번호 4로 표시되는 유전자에 의해 발현되고, 상기 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase)는 서열번호 5로 표시되는 유전자에 의해 발현되는 것일 수 있다.

또한, 상기 유전자는 상기 서열번호 1 내지 5의 염기서열로 표시되는 각각의 유전자에 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 돌연변이를 포함하는 유전자로서, 상기 유전자로부터 발현된 효소가 각각 리파아제(lipase), 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1), NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase) 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase)의 효소 활성을 가지는 유전자도 포함되며, 구체적으로 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 염기서열과 서열 상동성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 염기 서열을 포함한다.

상기 유전자 중 하나 이상은 벡터에 포함될 수 있다. 벡터는 상기 유전자들이 작동가능하게 연결된 형태일 수 있다. 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함할 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et.al. J. MoI . Biol . 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자를 과발현 시킬 수 있는 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 언급한 5종의 단백질 중 하나 이상을 포함하는 디카르복시산 생산을 위한 조성물을 제공하며, 또한, 상기 단백질을 암호화하는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 유전자 중 하나 이상을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 디카르복시산 생산을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 유전자 중 하나 이상이 포함된 재조합 벡터 및 이를 포함하는 조성물로 형질전환된 디카르복시산 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.

상기 미생물은 예를 들면, 조류, 바이러스, 박테리아, 효모 및 곰팡이 일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 미생물은 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주일 수 있다. 상기 캔디다 트로피칼리스 균주는 베타-산화(β-oxidation) 경로가 차단된 균주로, 구체적으로, 베타-산화 경로가 차단되어 기질을 이용하여 디카르복시산을 생산하는 균주일 수 있다.

또한, 본 발명은 리파아제(lipase, LIP1), 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1), NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1) 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1) 중 하나 이상의 단백질을 기질과 배양하는 단계를 포함하는 디카르복시산 생산방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서,

(1) 상기 리파아제(lipase, LIP1)를 C₆-C₂₀의 지방산 메틸 에스테르와 효소반응시키는 단계;

(2) 상기 단계 (1)의 생성물을 상기 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1)와 NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1)에 의해 생산되는 효소와 효소반응시키는 단계;

(3) 상기 단계 (2)의 생성물을 상기 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1)와 효소반응시키는 단계; 및

(4) 상기 단계 (3)의 생성물을 상기 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1)와 효소반응시키는 단계; 를 포함하는 디카르복시산 생산방법일 수 있다.

본 발명의 상기 디카르복시산의 효소적 생산방법은 in vitro 상에서 이루어질 수 있고, 상기 시계열적 효소반응 단계는 디카르복시산을 생합성하는 새로운 경로로 볼 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 기질과 함께 배양하는 것을 포함하는 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA)의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 디카르복시산 생산 방법은 상술한 리파아제(lipase, LIP1), 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1) 및 NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1) 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1) 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 그대로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상기 생산방법에 사용되는 기질은 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)일 수 있고, 구체적으로 상기 지방산 메틸 에스테르는 C₆-C₂₀의 알킬렌기를 포함하는 지방산 메틸 에스테르 중 하나일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 지방산 메틸 에스테르는 DAME (Decanoic acid methyl ester)일 수 있다.

상기 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물에 제한은 없으나, 바람직하게는 캔디다 트로피칼리스 균주로 베타-산화(β-oxidation) 경로가 차단된 균주일 수 있다.

본 발명을 통해 확보된 유전자들이 디카르복시산의 생산과 관련되어 있음을 확인하였고, 상기 유전자에 의해 발현된 효소가 디카르복시산의 전구체 물질을 생산하는 활성을 보임을 확인함으로써 기존의 화학적 디카르복시산 생산 공정의 단점을 극복하고 보다 친환경적이고 안전한 디카르복시산의 효소학적 또는 생물학적 생산공정에 적용이 가능하여 산업적 활용도가 높을 것으로 예상된다.

도 1은 디카르복시산 중 하나인 세바식산의 생합성 경로 및 이와 관련된 유전자를 도식한 것이다.
도 2는 Lip1p 효소의 in vitro 반응산물의 GC/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Cyp52B1p 및 Ncp1p의 in vitro 반응산물의 GC/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Fao1p 및 Ald1p 효소의 in vitro 반응산물의 GC/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 진화공학적 방법을 이용한 DAME 내성 균주의 개발

세포독성을 가지는 기질인 DAME에 내성을 가지는 균주를 개발하기 위해 C. tripicalis MYA_3404 균주를 10 g/L 농도의 DAME이 첨가된 YNB 배지(효모추출물 10 g/L, 펩톤 20 g/L)에 배양하였다. 이때 배지 내 DAME의 농도는 DAME 기질의 낮은 용해도로 인해 약 0.45 g/L (maximal solubility)를 유지하는 것으로 확인되었다(내부 실험 결과를 통해 확인 함). 접종한 균주의 성장곡선은 600nm 파장에서의 흡광도 값을 측정함으로서 확인하였다.

균주를 접종한 배지의 흡광도를 실시간으로 관찰하여 균주의 성장이 mid-exponential phase에 도달할 때 새로운 배지로 계대배양 하였다. 측정한 흡광도 값으로부터 specific growth rate를 구하고 specific growth rate이 크게 변화하는 단계의 균주를 각각 E1 (170 generation time), E2 (470 generation time), E3 (650 generation time), E4 (700 generation time), E5 (720 generation time)로 결정하였다. 또한 위와 같은 방법으로 얻은 E5 균주를 비독성 탄소원인 20 g/L glucose가 첨가된 YNB 배지(효모추출물 10 g/L, 펩톤 20 g/L)에 계대배양 한 후 DAME 기질에 재배양하여 탄소원의 교체 후에도 DAME에 대한 내성을 유지하는 균주를 선별하여 ES5로 명명하였다.

[실시예 2] DAME 내성 돌연변이 균주(ES5)의 전사체 분석

배지 내 DAME 유무에 따른 전사체 변화를 확인하기 위해 DAME이 첨가된 배지에서 키운 ES5 균주와 DAME이 첨가되지 않은 배지에서 키운 ES5 균주의 전사체 분석을 실시하였다.

ES5 균주를 DAME이 첨가되지 않은 YNB 배지와 10g/L의 DAME이 첨가된 YNB 배지에서 30℃, 24시간동안 배양하였다. 배양한 균체는 회수하여 물로 세척한 후 이후 전체 RNA 추출을 위한 시료로 사용하였다. RNA 추출은 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 실시하였으며 추출된 RNA의 농도와 순도는 각각 NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)과 Agilent Bioanalyzer 2100 (Santa Clara, Ca, USA)를 사용하여 측정하였다.

돌연변이 ES5 균주의 전사체를 분석하여 모균주와 비교한 결과 총 453개의 유전자가 ES5 균주에서 모균주에 비해 upregulation 되었으며, 147개의 유전자가 ES5 균주에서 모균쥬에 비해 downregulation 되었음이 확인되었다. 상세한 유전자의 수와 cluster는 표 1에 명시되어 있다. 전사체 분석을 통해 upregulation 되었음이 확인된 453개의유전자 중 디카르복시산 중 하나인 세바식산의 대사와 관련되었을 것이라 예상되는 5개의 유전자(LIP1 , CYP52B1 , NCP1 , FAO1 및 ALD1)를 선정하였다 (도 1).

모균주와 DAME 내성 돌연변이 균주(ES5)의 전사체 비교/분석 결과

No	Pathway	No of Upregulated Gene	No of Downregulated Gene
1	Alanine, aspartate and glutamate metabolism	12
2	alpha-Linolenic acid metabolism	9
3	Arginine and proline metabolism	12
4	Arginine biosynthesis	9
5	Ascorbate and aldarate metabolism	6
6	Beta-Alanine metabolism	15	6
7	Biosynthesis of antibiotics	51
8	Biosynthesis of unsaturated fatty acids	12
9	Biotin metabolism	6
10	Butanoate metabolism	9	6
11	Cell cycle - yeast		12
12	Cysteine and methionine metabolism	12
13	DNA replication		15
14	Fatty acid degradation		6
15	Fatty acid metabolism	18	6
16	Galactose metabolism		6
17	Glycerolipid metabolism	12
18	Histidine metabolism	12
19	Homologous recombination		9
20	Lysine biosynthesis	9
21	Lysine degradation	12
22	Meiosis - yeast		15
23	Metabolic pathways	120	27
24	Mismatch repair		6
25	Monobactam biosynthesis	6
26	Nucleotide excision repair		6
27	Pantothenate and CoA biosynthesis	12
28	Pentose and glucuronate interconversions		6
29	Peroxisome	27	6
30	Pyruvate metabolism	18
31	Starch and sucrose metabolism		9
32	Steroid biosynthesis	9
33	Tryptophan metabolism	9
34	Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis	9
35	Valine, leucine and isoleucine biosynthesis	12
36	Valine, leucine and isoleucine degradation	15	6
	Total	453	147

[ 실시예 3] 클로닝 기법을 통한 SA 생합성 경로 관련 유전자의 확보

실시예 2의 전사체 분석 결과로부터 세바식산 생합성 경로와 관련이 있을 것이라 예상되는 5개의 유전자(LIP1 , CYP52B1 , NCP1 , FAO1 및 ALD1)를 선정하였고 이들로부터 유래한 효소(lipase, cytochrome P450 52B1, long chain alcohol oxidase, Aldehyde dehydrogenase)의 활성을 확인하기 위해 LIP1 (Uniprot.ID:C5MD87), CYP52B1 (Uniprot.ID:C5MAM3), NCP1 Uniprot.ID: C5M346), NADPH-cytochrome P450 reductase, FAO1 (Uniprot.ID:Q6QIR6), ALD1 (Uniprot.ID: C5MEH8) 유전자를 클로닝을 통해 확보하였다. CYP450 유전자의 경우 각각 CYP1 , NCP1 2개의 subunit을 가지는 것으로 알려졌다.

클로닝에 사용할 template DNA는 C. tropicalis MYA_3404 균주를 YPD배지(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 20 g/L glucose)에 30℃, 48시간동안 배양한 후 yeast DNA isolation kit (Epicentre, Madison, WI, USA)을 이용해 추출하였다. 후보 유전자는 Q5 High-Fidelity Master mix (BioLabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 증폭하였으며 후보 유전자의 증폭에 사용된 프라이머는 표 2(프라이머 1-10; 서열번호 6-15)와 같다. 이 후 유전자 재조합을 위한 모든 실험에서 동일한 효소를 사용해 PCR을 수행하였다. HisTrap 컬럼의 친화도를 높이기 위해 히스티딘을 코딩하고 있는 유전자의 염기서열을 추가하였다. CYP450 유전자를 제외한 나머지 PCR 산물과 pAUR123 벡터는 XhoI, XbaI 제한효소로 이중절단 하였고 최종 DNA 단편을 동일한 제한효소 위치에 T4 DNA ligase (New England Biolabs)를 사용해 ligation 하였다. CYP450 유전자를 코딩하고 있는 두 개의 subunit인 CYP52B1 (Uniprot.ID:C5MAM3), NCP1 (Uniprot.ID: C5M346) 유전자의 경우 각각 SmaI/SalI, SalI/XhoI를 이용해 절단하여 순차적으로 ligation 하였다, 이후 ligation한 4개의 plasmid (plasmid 1-4)를 모두 E. coli DH5α (Novagen, Cambridge, MA, USA)에 개별적으로 형질전환 하였다. 위 과정을 통해 확보한 유전자의 단백질 과발현을 위해, 추출한 4개의 plasmid (plasmid 1-4)를 C. tropicalis 균주에 다시 transformation하였다. 효모로의 stransformation은 MP Biomedicals사(Solon, OH, USA)의 yeast transformation kit를 사용하였으며 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법을 따랐다. 유전자 도입을 위해 사용한 벡터인 pAUR123 vector의 auto induction system에 의해 별도의 inducer 없이 자동적으로 발현되었다.

[실시예 4] 세바식산 생합성 경로 관련 효소의 과발현 및 정제

실시예 3을 통해 확보한 재조합 균주의 세바식산 생합성 관련 효소의 과발현을 위해 0.2 mg/L의 aureobasidanA이 첨가된 YPD 배지(10 g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 20 g/L glucose)를 사용하여 30°C에서 24시간 배양하였다. 발현시킨 단백질을 분리하기 위하여, 세포를 초음파로 분쇄하고 원심분리 후 그 상등액을 HisTrap column (GE Healthcare, Piscataway, USA)을 이용해 정제하였다. 그 정제된 단백질을 Amicon Ultra Centrifugal filter (millipore, Billerica, MA, USA)로 농축하였다. 그 발현된 효소의 분자량은 SDS-PAGE에 의해, Lip1p (50.6 kDa), Cyp450p (Cyp1_59.3 kDa and Ncp1_76.7 kDa), Fao1p (77.8 kDa), Ald1p (61.3 kDa)로 확인되었다. 단백질의 농도는 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정하였다.

[실시예 5] 세바식산 생합성 경로 관련 효소의 in vitro 활성 확인

실시예 4로부터 획득한 Lip1p, Cyp52B1p 및 Ncp1, Fao1p, Ald1p의 활성을 확인하기 위해 각각의 기질에 해당하는 표준물질을 이용하여 in vitro enzyme assay를 실시하였다.

Lip1p의 활성을 확인하기 위해 50 ul의 100 mM DAME 기질과 250 ul 효소(효소 농도 5 mg/ml), 200 ul의 20 mM Tris-HCl과 함께 반응 하여 총 500 ul의 반응시료를 30°C에서 1시간동안 반응하였다. 대조군으로는 DAME와 비활성화 시킨 Lip1p 효소를 함께 반응하여 사용하였다. GC/MS 결과 아래 도 2과 같이 기질과 Lip1p 효소를 반응시킨 반응 산물에서 DAME의 피크가 감소하며 새로운 피크가 생성되는 것을 확인하였다. 이 피크의 mass spectrum을 표준물질의 spectrum과 비교한 결과 생성된 피크가 DA에 의한 것임을 확인하였다.

위와 동일한 방법으로 Cyp52B1p 및 Ncp1p의 활성을 확인하기 위해 50 ul의 100 mM DA 기질과 100 ul 효소(효소 농도 2.99 mg/ml), 50 ul의 20 mM Tris-HCl과 함께 반응 하여 총 200 ul의 반응시료를 30°C에서 1시간동안 반응하였다. 대조군으로는 DA와 비활성화 시킨 Cyp52B1p 및 Ncp1p 효소를 함께 반응하여 사용하였다. GC/MS 결과 아래 도면 9과 같이 기질과 Cyp52B1p 및 Ncp1p 효소를 반응시킨 반응 산물에서 DA의 피크가 감소하며 새로운 피크가 생성되는 것을 확인하였고 이 피크의 mass spectrum을 확인한 결과 10-hydroxydecanoic acid인 것을 확인하였다(도 3).

Fao1p 효소의 활성은 생성물로 예상되는 10-oxodecanoic acid의 표준물질이 판매하지 않는 관계로 기질인 100 mM 10-HDA 10 ul와 100 ul Fao1p(효소 농도 2.7 mg/ml), 마지막 생합성 관련 효소인 Adh1p(효소농도 2.0 mg/ml) 100 ul를 연속적으로 반응하여 산물을 분석한 결과 SA가 생겨남을 확인하였다(도 4).

위 결과들로부터 디카르복시산 중 하나인 세바식산 생합성에 관련된 효소들의 활성을 확인하였으며 이를 통해 새로운 디카르복시산의 생합성 경로를 예측할 수 있었다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Microorganism for production of decarboxylic acid and method of producing decarboxylic acid using the Same <130> P18U13C0366 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1398 <212> DNA <213> Candida tropicalis <400> 1 atgcaattgt caattgtttg cttctttctt ttaacatatg ttaatgctgc tgtcatcaca 60 ttgacaaaac catcggatga tgatttctac attccacaag atggttttga agatgctgaa 120 ccaggtgaga ttttgaagat ccgaaagacc cccaacaagc ttagtggttt atttttccca 180 atagatgtca aaaatagttg gcaattgtta gtacgctcta ctgattcctt tggaaatgcc 240 actgctattg ttgctactat catagaacca ttcaattctg atccttccaa agtggtatcc 300 tatcaaactt ttgaagattc ggccaatatt aactgttcac cttcctatgg gatgcaatgg 360 ggtgcttcta tttccactgt tgcgacacag attgatatgt catttatggt cccattgtta 420 aacaatggtt actttttggt atctccagat tatgaaggtc ctaaatcaac tttcactgtg 480 ggtagacaat cgggacatgg tactttggac tcaatcagag ccattttaca atctggaaat 540 tttactggtg ttgatgaaga tgcacaggtt gctatgtggg gttattctgg tggttctttg 600 gcatcaggtt gggctgctgc 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tatccaagag tcaaagagtt ggttgaaagc tcggacttgg tcttgtcctt 600 gggtgctgtc ttgtctgatt tcaacactgg ttcgttctca tactctttgg acaatgccaa 660 ggttgttgaa ttccactccg actacactca aatcaagagc gctcagtacc caggtatcag 720 aatgaaggaa ttgttgggca agttggttga ggagccagaa ttggtcaaga cgtgttccaa 780 gatcccagca aagaagttgg tcactgacaa ctttgaacca ttggtcttgc caccggacca 840 caagctcacc caatcctggt tgtggagtaa cttgggtaat tggttgaaag aaggtgatgt 900 gattgttacc gaaaccggta cttccaattt cggtattgtc cagaccaaat tcccaaagaa 960 tgctgtcggt atctcgcaag tcttgtgggg ttccattggc tactcggtcg gttctgccgc 1020 tggtgccgtt atcgccgccg aggagcttga tcccagccgt agagtcatct tgtttgttgg 1080 tgacggttct ttgcagttga ccgtgcagga aatctccacc atggccagac acaagaacaa 1140 catctacatc tttgtcttga acaacaacgg tttcaccatt gaaagattga ttcacggtcc 1200 agaagctggt tacaacagta ttcaagaatg ggagaacgct gagttattga agactttcaa 1260 ggctaccaac tacgagagtt tcaccgtcaa gactgtcggc gaacttgaca aggtgttcaa 1320 ggatgaaaag tttgccgtca acgacaagat tagattggtt gagatcatgt tagacacttt 1380 cgatgctcca gagaacttgg ttaagcaagc tgagagatct gccaacacca acaagtagag 1440 tttgtctatg ttttccgttt gccttttctt tctagtacga gacgttattg aacgaagttt 1500 ttatatatct agatctaata catattccat gtctgttcat ttttgacgga gtttcataag 1560 gtggcagttt ctaatcaaag gtccgtcatt ggcgtcgtgg cattggcggc tcgcatcaac 1620 tcgtatgtca atattttctg ttaactccgc cagacatacg atcaaaacct acaagcaaaa 1680 aaattccaca tgctttgttt gagatctcca caaacaacaa cggggtaaga aaatcatggg 1740 gcgattaatc atgccatctt tgtaaatttc tttgtttcaa catcaccctc tttagtcaaa 1800 ccttcacagg actgtctgct ctactttgcc acccagttca tatataaatt accaacttcc 1860 accgagcacc accaacacct caccccactc tctccccccc cctttttttt ccagcttaga 1920 cacacacttc aaactcgaca tggctccatt tttgcccgac caggtcgact acaaacacgt 1980 cgacaccctt atgttattat gtgacgggat catccacgaa accaccgtgg acgaaatcaa 2040 agacgtcatt gcccctgact tccccgccga caaatacgag gagtacgtca ggacattcac 2100 caaaccctcc gaaaccccag ggttcaggga aaccgtctac aacaccgtca acgcaaacac 2160 catggatgca atccaccagt tcattatctt gaccaatgtt ttgggatcaa gggtcttggc 2220 accagctttg accaactcgt tgactcctat caaggacatg agcttggaag accgtgaaaa 2280 gttgttagcc tcgtggcgtg actcccctat tgctgctaaa aggaagttgt tcaggttggt 2340 ttctacgctt accttggtca cgttcacgag attggccaat gagttgcatt tgaaagccat 2400 tcattatcca ggaagagaag accgtgaaaa ggcttatgaa acccaggaga ttgacccttt 2460 taagtaccag tttttggaaa aaccgaagtt ttacggcgct gagttgtact tgccagatat 2520 tgatgtgatc attattggat ctggggccgg tgctggtgtc gtggcccaca ctttgaccaa 2580 cgacggcttc aagagtttgg ttttggaaaa gggcagatac tttagcaact ccgagttgaa 2640 ctttgatgac aaggacgggg ttcaagaatt ataccaaagt ggaggtactt tgaccaccgt 2700 caaccagcag ttgtttgttc ttgctggttc cacttttggt ggtggtacca ctgtcaattg 2760 gtcggcctgt cttaaaacgc cattcaaggt gcgtaaggaa tggtatgatg agtttggcgt 2820 tgactttgct gccgatgaag cctacgacaa agcacaggat tatgtttggc agcaaatggg 2880 agcttctacc gaaggcatca cccactcttt ggctaacgag attattattg aaggtggcaa 2940 gaaattaggt tacaaggcca aggtattaga ccaaaacagc ggtggtcatc ctcatcacag 3000 atgcggtttc tgttatttgg gttgtaagca cggtatcaag cagggctctg ttaataactg 3060 gtttagagac gcagctgccc 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Claims

리파아제(lipase, LIP1), 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1), NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1), 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1) 및 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1) 중 하나 이상을 포함하는, 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생합성에 관여하는 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 단백질들은 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis) 균주로부터 유래된 것인, 디카르복시산 생합성에 관여하는 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 디카르복시산은 C₆-C₂₀의 디카르복시산인 것인, 디카르복시산 생합성에 관여하는 단백질.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제(lipase, LIP1)는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 의해 발현되고; 상기 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1)는 서열번호 2로 표시되는 유전자에 의해 발현되고; 상기 NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1)는 사열번호 3으로 표시되는 유전자에 의해 발현되고, 상기 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1)는 서열번호 4으로 표시되는 유전자에 의해 발현되고; 및 상기 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1)는 서열번호 5로 표시되는 유전자에 의해 발현되는 것인, 디카르복시산 생합성에 관여하는 단백질.
서열번호 1로 표시되는 유전자; 서열번호 2로 표시되는 유전자; 서열번호 3으로 표시되는 유전자; 서열번호 4로 표시되는 유전자; 및 서열번호 5로 표시되는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 디카르복시산 생합성 조성물.
제 5항의 조성물로 형질전환된, 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생산능력을 갖는 미생물.
제 6항에 있어서, 상기 미생물은 베타-산화(β-oxidation) 경로가 차단된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주인, 디카르복시산 생산능력을 갖는 미생물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 단백질을 기질과 함께 배양하는 단계를 포함하는, 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생산방법.
제 8항에 있어서, 상기 기질은 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)인, 디카르복시산 생산방법.
제 9항에 있어서, 상기 지방산 메틸 에스테르 기질은 C₆-C₂₀의 지방산 메틸 에스테르 중 어느 하나 이상인 것인, 디카르복시산 생산방법.
제 8항에 있어서,
(1) 상기 리파아제(lipase, LIP1)를 C₆-C₂₀의 지방산 메틸 에스테르와 효소반응시키는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 생성물을 상기 사이토크롬 P450 52B1 (cytochrome P450 52B1, CYP52B1)와 상기 NADPH 사이토크롬 P450 리덕테이즈 (NADPH-cytochrome P450 reductase, NCP1)로부터 생산한 효소로 반응시키는 단계;
(3) 상기 단계 (2)의 생성물을 상기 긴 사슬 알코올 옥시다아제(long chain alcohol oxidase, FAO1)와 효소반응시키는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3)의 생성물을 상기 알데하이드 디하이르도제나아제(aldehyde dehydrogenase, ALD1)와 효소반응시키는 단계; 를 포함하는 디카르복시산 생산방법.
제 6항의 미생물을 기질과 함께 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 디카르복시산(decarboxylic acid, DCA) 생산방법.
제 12항에 있어서, 상기 미생물은 베타-산화(β-oxidation) 경로가 차단된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 균주인, 디카르복시산 생산방법.
제 12항에 있어서, 상기 기질은 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)인, 디카르복시산 생산방법.
제 14항에 있어서, 상기 지방산 메틸 에스테르는 C₆-C₂₀의 지방산 메틸 에스테르 중 어느 하나 이상인 것인, 디카르복시산 생산방법.