KR20200071065A - 막 단백질을 사용한 치료용 엑소좀의 제조 - Google Patents

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레니 에이. 하리손
러셀 이. 매코널
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케 o
다미안 하우드
니키 로스
소냐 하우트
존 디. 쿨만
더글라스 이. 윌리엄스
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코디악 바이오사이언시즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 엑소좀의 표면 상에 풍부한 것으로 새로 식별된 단백질을 사용하여 치료용 엑소좀을 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 엑소좀의 친화성 정제를 위해서 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 엑소좀 상에 치료 단백질을 국지화시키는 방법 및 단백질을 사용함으로써 특정 기관, 조직 또는 세포에 엑소좀을 표적화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 엑소좀 단백질, 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편 중 1종 이상을 더 높은 밀도로 포함하는 표면-조작된 엑소좀을 생성시키는 것을 포함한다.

Description

막 단백질을 사용한 치료용 엑소좀의 제조
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되고, 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 서열 목록을 포함한다. 2018년 8월 22일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 파일명이 40714PCT_CRF_sequencelisting.txt이고, 크기가 175,092바이트이다.
엑소좀(exosome)은 세포간 의사소통의 중요한 매개인자이다. 이것은 또한 다수의 질환, 예컨대, 암의 진단 및 예후의 중요한 바이오마커이다. 약물 전달 비히클인 엑소좀은 다수의 치료 분야에서 새로운 치료 양상으로서 전통적인 약물 전달 방법보다 다수의 이점을 제공한다.
치료 목적을 위한 엑소좀의 사용은, 엑소좀이 오염 단백질, DNA, 탄수화물 및 지질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 불순물이 존재하지 않거나 거의 존재하지 않을 것이 요구된다. 현재 정제 방법은 상당한 양의 이러한 불순물을 제거하기에 충분한 선택성을 제공하지 않아서 순도를 개선시키기 위해서 추가 공정이 필요하다.
추가로, 엑소좀이 인간 질환의 치료에 보다 빈번하게 사용됨에 따라서, 임상적 예측을 충족시키기 위해서 노력하고 있는데, 그 이유는 분자 표적화, 면역 회피 및 제어된 약물 방출을 부여하는 이의 물리화학적 파라미터의 이질성(heterogeneity) 때문이다. 이는 주로 엑소좀 특성(예를 들어, 조성, 크기, 형상, 강성(rigidity), 표면 전하, 친수성, 안정성 및 리간드 유형 및 밀도), 페이로드 특성(payload property)(예를 들어, 약물 유형, 용해도, 로딩, 효력, 투여량, 면역반응 및 방출 동력학), 및 엑소좀 통과에 대한 생체내의 생리학적 장벽(예를 들어, 면역 감시, 입자 유출(extravasation), 조직 표적화, 조직 관통, 및 세포 흡수)의 이질성 및 복잡성으로 인한 것이다. 상당히 노력하였지만, 목적하는 특성을 갖는 치료용 엑소좀, 예를 들어, 치료용 페이로드를 함유하고, 적절한 표적화 모이어티를 갖는 엑소좀의 별개의 하위 집단을 얻기 위한 효과적인 방법은 아직 쉽게 입수 가능하지 않다.
엑소좀 기반 기술의 치료 용도 및 다른 응용을 보다 양호하게 가능하게 하기 위해서 엑소좀의 별개의 하위 집단을 생성, 단리 및 정제시키기 위한 적합한 방법이 필요하다.
본 발명의 양상은 치료 용도를 위한 엑소좀의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 방법은 엑소좀의 표면 상에 풍부한 것으로 새로 식별된 표면 마커를 사용한다. 특히, 단백질(예를 들어, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(prostaglandin F2 receptor negative regulator: PTGFRN); basigin(BSG); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2(immunoglobulin superfamily member 2: IGSF2); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3(IGSF3); 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8(IGSF8); 인테그린 베타-1(ITGB1); 인테그린 알파-4(ITGA4); 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2); 및 ATP 수송체(transporter) 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4))의 군이 엑소좀의 표면 상에 상당히 풍부한 것으로 식별되었다.
새로-식별된 단백질은 본 발명의 다양한 실시형태에서 사용될 수 있다. 본 발명의 일 양상은 새로-식별된 엑소좀 단백질 및 치료 단백질을 접합시킴으로써 융합 단백질을 생성시키고, 표면 상에 융합 단백질을 함유하는 조작된 엑소좀을 제조하는 것에 관한 것이다. 치료 단백질의 네이티브 전장 또는 생물학적 활성 단편은 엑소좀-풍부 단백질에 접합됨으로써 엑소좀의 표면에 이송될 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 새로-식별된 엑소좀 단백질을 사용하는 방법은, 관련 기술분야에 공지된 일부 다른 엑소좀 스캐폴드 단백질(예를 들어, Lamp2B, PDGFR, 락타드헤린(lactadherin) CD9, CD63 및/또는 CD81 또는 이의 단편)을 사용하는 방법보다, 표면 조작된 엑소좀의 생산에 있어서 더 양호하다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 새로-식별된 단백질은 보다 양호하다고 여겨지는데, 그 이유는 관련 기술 분야에 공지된 몇몇 엑소좀 스캐폴드 단백질, 즉, 테트라스파닌(tetraspannin) 단백질, 예컨대, CD9, CD63 및 CD81이 엑소좀 내강(lumen)에서 이의 C-말단 및 N- 말단 둘 모두를 갖기 때문이다.
본 발명의 또 다른 양상은 모든 엑소좀에 공통적이거나 또는 단세포 유형으로부터 유래된 모든 엑소좀에 공통적인 엑소좀 단백질을 사용하여 불균질 용액, 예컨대, 세포 배양 배지 또는 플라즈마로부터의 친화성 정제에 의해서 엑소좀을 정제시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태는 엑소좀의 하위 집단에 특이적인 표면 마커를 사용함으로써 전체 엑소좀으로부터 엑소좀의 하위 집단을 단리시키는 것에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 엑소좀이 오염 생성물일 때 샘플로부터 엑소좀을 제거하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 자연 또는 조작된 바이러스는 오염 엑소좀으로부터 정제될 수 있다. 따라서 본 명세서에 기재된 엑소좀 단백질은, 유사한 크기, 형상 및/또는 전하의 다른 입자가 목적하는 생성물인 생물학적 공정으로부터 엑소좀을 선택적으로 제거하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 보다 효율적인 친화성 정제를 위해서 또는 표면 상의 표적화 모이어티 또는 치료적으로 관련된 단백질의 제시를 위해서 설계된 표면-조작된 엑소좀의 생성 또는 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 엑소좀 표면은 표면 상에 네이티브 전장 엑소좀 단백질 및/또는 네이티브 엑소좀 단백질의 단편 또는 변형된 단백질을 더 높은 밀도로 함유하도록 변형될 수 있다.
본 발명 추가로 이러한 표면-조작된 엑소좀을 생산하기 위한 생산자(producer) 세포 또는 생산자 세포의 생성 방법에 관한 것이다. 외인성 폴리뉴클레오타이드를 생산자 세포에 일시적으로 또는 안정적으로 도입하여 생산자 세포가 표면-조작된 엑소좀을 생성시키도록 할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 양상은 엑소좀을 단리시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은, (1) 엑소좀을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (2) 샘플을 표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 결합제와 접촉시키는 단계로서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 (3) 표적 단백질과 결합제 간의 결합에 기초하여 상기 엑소좀을 단리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 시험관내에서 성장된 세포로부터 획득되고, 선택적으로 여기서 세포는 HEK293 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포 또는 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 대상체의 체액으로부터 획득된다.
일부 실시형태에서, 세포는 표적 단백질을 발현하도록 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, 세포는 표적 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 결합제에 대한 친화성을 갖는 태그를 발현하는 외인성 서열을 포함하도록 유전자 변형되고, 여기서 외인성 서열은 세포의 게놈에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 TGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 내인성 서열의 3' 또는 5' 단부에 위치된 게놈 부위에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 IGSF8을 암호화하지 않는다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 내인성 서열 내에 위치된 게놈 부위에 삽입된다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 태그, 및 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 표적 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편 또는 변형이 아니다. 일부 실시형태에서, 세포는 ADAM10의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변형된다.
일부 실시형태에서, 엑소좀은 표적 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 및 ATP 수송체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이고, 여기 친화성 태그는 결합제에 대한 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편 또는 변형을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 결합제는 면역글로불린, 단백질, 펩타이드 또는 소분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합제는 고체 지지체에 부착되고, 선택적으로 여기서 고체 지지체는 다공성 아가로스 비드, 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드, 또는 막을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피 칼럼을 형성한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 결합제와 접촉시키는 단계는 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 적용함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은, (1) 샘플의 하위세트를 상이한 표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 상이한 결합제와 접촉시키는 단계; 및 (2) 상이한 표적 단백질과 상이한 결합제 간의 결합에 기초하여 엑소좀을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 명세서에 제공된 방법에 의해서 생산된 엑소좀에 관한 것이다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 엑소좀 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 엑소좀 공급원을 포함하는 샘플보다 더 낮은 농도의 거대분자를 포함하고, 여기서 거대분자는 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 거대분자가 실질적으로 존재하지 않는다.
본 발명의 또 다른 양상은 표적 단백질을 포함하는 엑소좀에 관한 것이며, 여기서 표적 단백질의 적어도 일부는 외인성 서열로부터 발현되고, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 엑소좀은 표적 단백질과 결합제 간의 결합에 기초하여 단리된다.
일부 실시형태에서, 엑소좀은 외인성 서열을 포함하도록 유전자 변형된 세포로부터 생산되고, 선택적으로 여기서 세포는 HEK293 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 간엽 줄기세포(MSC)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 ADAM10의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변형된다.
일부 실시형태에서, 세포는 외인성 서열을 포함하는 플라스미드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포의 게놈 내에 삽입된 외인성 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화화는 게놈 서열의 3' 또는 5' 단부에 위치된 게놈 부위 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 게놈 서열 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 외인성 서열은 IGSF8을 암호화하지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이고, 여기 친화성 태그는 결합제에 대한 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 치료용 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편을 포함하지 않는다.
치료용 펩타이드는 자연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 치료 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 치료 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치료용 펩타이드는 항체 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 치료용 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 치료용 펩타이드는 항미생물성 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 표적화 모이어티는 기관, 조직 또는 세포에 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 엑소좀은 제2의 상이한 표적 단백질을 추가로 포함하고, 여기서 상이한 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 상이한 표적 단백질과 상이한 결합제 간의 결합에 기초하여 단리된다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편을 포함하지 않는다.
일 양상에서, 본 발명은 본 발명의 엑소좀 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 거대분자가 실질적으로 존재하지 않고, 여기서 거대분자는 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물 및 이들의 조합물로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 엑소좀을 생산하기 위한 세포에 관한 것이다.
구체적으로, 일부 실시형태는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 게놈 서열 내에 삽입된 외인성 서열을 포함하는, 엑소좀을 생산하기 위한 세포에 관한 것이며, 여기서 외인성 서열 및 게놈 서열은 융합 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 게놈 서열은 IGSF8을 암호화하지 않는다.
외인성 서열은 친화성 태그를 암호화할 수 있다.
외인성 서열은 치료용 펩타이드를 암호화할 수 있다. 치료용 펩타이드는 자연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 치료 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 치료 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 치료용 펩타이드는 항체 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 치료용 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 치료용 펩타이드는 항미생물성 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
외인성 서열은 표적화 모이어티를 암호화할 수 있다. 표적화 모이어티는 기관, 조직 또는 세포에 특이적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포주는 ADAM10의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변형된다.
일 양상에서, 본 발명은 본 발명의 세포주로부터 생산된 엑소좀을 제공한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 상이한 엑소좀의 표면 상의 상이한 융합 단백질보다 더 높은 밀도로 표면 상에 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상이한 엑소좀은 종래의 엑소좀 단백질을 암호화하는 상이한 게놈 서열 내에 삽입된 외인성 서열을 포함하는 상이한 세포주로부터 생산되고, 여기서 외인성 서열 및 상이한 게놈 서열은 상이한 융합 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 종래의 엑소좀 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, LAMP2, LAMP2B 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 비-엑소좀성 물질(non-exosomal material)을 단리시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은, 엑소좀 및 비-엑소좀 물질을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 샘플을 표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 결합제와 접촉시킴으로써 엑소좀이 결합제에 결합하는 것을 유도하는 단계로서, 여기서 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 상기 유도하는 단계; 및 비-엑소좀 물질을 단리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-엑소좀성 물질은 바이러스 또는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 비-엑소좀성 물질은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 다른 외피 보유(enveloped) 또는 외피 비보유(non-enveloped) 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 비-엑소좀성 물질은 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 단리된 비-엑소좀성 물질은 엑소좀이 실질적으로 존재하지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적 단백질은 친화성 태그를 더 포함하고, 상기 친화성 태그는 상기 결합제에 대한 친화성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합제는 면역글로불린, 단백질, 펩타이드 또는 소분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합제는 고체 지지체에 부착되고, 선택적으로 여기서 고체 지지체는 다공성 아가로스 비드, 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드, 또는 막을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피 칼럼을 형성한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 결합제와 접촉시키는 단계는 샘플을 크로마토그래피 칼럼에 적용함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 정제 방법은 나노소포(nanovesicle)의 정제를 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 나노소포에 관한 것이다.
도면은 단지 예시의 목적을 위해서 본 발명의 다양한 실시형태를 도시한다. 당업자는 본 명세서에 예시된 구조 및 방법의 대안적인 실시형태가 본 명세서에 기재된 본 발명의 원칙으로부터 벗어나지 않으면서 사용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
도 1은 초원심분리 후 샘플-함유 Optiprep(상표명) 밀도 구배의 영상을 제공한 도면. 엑소좀을 함유하는 상부 분획("상부"), 세포 부스러기를 함유하는 중간 분획("중간") 및 고밀도 응집물 및 세포 부스러기를 함유하는 하부 분획("하부")을 괄호로 표시한다.
도 2는 Optiprep(상표명) 초원심분리의 상부 분획으로부터 식별된 단백질(Y축) 및 하부 분획(X축)으로부터 식별된 단백질을 나타내는 점-그래프. 점선 위에 플로팅된 단백질은 엑소좀-풍부 단백질을 나타내는 반면, 점선 아래의 단백질은 엑소좀에 특이적이지 않은 단백질을 나타낸다.
도 3은 PTGFRN(서열번호 1)의 트립신 처리(tryptic) 펩타이드 커버리지 맵을 제공한, 도면.
도 4는 IGSF8(서열번호 14)의 트립신 처리 펩타이드 커버리지 맵을 제공한 도면.
도 5는 Basigin(BSG)(서열번호 9)의 트립신 처리 펩타이드 커버리지 맵을 제공한 도면.
도 6A는 HEK293 세포로부터 수집된 전체 세포 용해물(좌측) 및 정제된 엑소좀 집단(우측)의 단백질 블로팅으로부터의 사진을 나타낸 도면. 도 6B는 PTGFRN에 대한 항체를 사용한 도 6A에 제공된 겔의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 도면. 우측 칼럼 상에서 검출된 밴드는 도 6A의 약 110kDa에서의 밴드에 상응한다.
도 7A는 자가-형성 Optiprep(상표명) 구배를 사용한 정제로부터 수집된 12개의 분획의 단백질 블로팅을 나타낸 도면. 도 7B는 ITGA4, ITGB1, PTGFRN, IGSF3, IGSF8, Basigin, Alix 또는 Syntenin에 대한 항체를 사용한 도 7A에 제시된 겔의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸 도면. 신규 엑소좀 표면 단백질(ITGA4, ITGB1, PTGFRN, IGSF8, Basigin) 각각은 널리 공지된 엑소좀 마커 단백질(Alix, Syntenin)과 동일한 분획에서 검출된다.
도 8은 예를 들어, 엑소좀의 표면 상의 융합 단백질의 표적화를 위해서 또는 엑소좀의 친화성 정제를 위한 표적으로서, 본 발명의 다양한 실시형태를 위해서 사용되는 엑소좀 표면 단백질(ITGA4, ITGB1, PTGFRN, IGSF8, BSG)을 도시한 도면.
도 9A는 PTGFRN의 IgV 도메인의 경계(화살표) 및 C 말단에 융합된 GFP의 식별과 함께 PTGFRN의 구조를 도시한 도면. 도 9B는 다양한 GFP-PTGFRN 융합 단백질을 과발현하는 세포 배양물로부터 단리된 엑소좀의 웨스턴 블로팅으로부터의 겔 사진을 제공한 도면. GFP-PTGFRN 융합 단백질은 GFP에 대한 항체를 사용하여 검출되었다.
도 10은 다양한 GFP-PTGFRN 융합 단백질을 과발현하는 세포로부터 단리된 정제된 엑소좀의 전체 단백질을 전개시킨 겔 사진을 제공한 도면.
도 11A는 PTGFRN의 IgV 도메인의 경계(화살표) 및 N 말단에 융합된 FLAG의 식별과 함께 PTGFRN의 구조를 도시한 도면. 도 11B는 다양한 FLAG-PTGFRN 융합 단백질을 과발현하는 세포 배양물로부터 단리된 엑소좀의 웨스턴 블로팅으로부터의 겔 사진을 제공한 도면. GFP-PTGFRN 융합 단백질은 FLAG 태그에 대한 항체를 사용하여 검출되었다.
도 12A는 야생형 세포(ADAM10+) 또는 ADAM10 넉아웃 세포(knockout cell)(ADAM10-)로부터 단리된 정제된 엑소좀의 전체 단백질을 전개시킨 겔 사진을 제공한 도면(각각의 세포는 전장 PTGFRN(PTGFRN-GFP) 또는 절두된 PTGFRN(PTGFRN_IgV3-GFP)을 함유하는 GFP 융합 단백질을 발현함). 도 12B는 ADAM10에 대한 항체를 사용하여 도 12A의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면. 도 12C는 GFP에 대한 항체를 사용하여 도 12A의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 13은 6개의 IgV 도메인 중 5개가 결핍된 PTGFRN을 함유하는 융합 단백질(PTGFRN_IgV6), FLAG 태그, 및 융합 파트너 단백질의 구조를 도시한 도면.
도 14A는 PTGFRN_IgV6의 서열(#451)(서열번호 42) 및 4개의 추가 아미노산이 결핍된(#452)(서열번호 43), 8개의 추가 아미노산이 결핍된(#453)(서열번호 44) 또는 12개의 추가 아미노산이 결핍된 PTGFRN_IgV6(#454)(서열번호 45)의 연속 절두 돌연변이의 서열을 제공한 도면. 도 14B는 융합 단백질 #451, 452, 453 또는 454를 과발현하는 세포로부터 단리된 정제된 엑소좀의 전체 단백질을 전개시킨 겔 사진을 제공한 도면. 도 14C는 FLAG에 대한 항체를 사용하여 도 14B의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 도면을 제공한 도면.
도 15는 다양한 GFP 융합 단백질을 과별현하는 세포로부터 단리된 엑소좀으로부터 검출된 GFP 형광 신호를 제공한 도면(GFP 융합 단백질은 빈번하게 사용되는 pDisplay 스캐폴드(PDGF 수용체), PalmPalm(팔미토일화(palmitoylation) 서열), CD81, 또는 전장 PTGFRN(FL) 또는 PTGFRN_454(sIgV) 중 어느 하나의 내강 면에 융합된 GFP를 함유함).
도 16A는 IGSF8 및 IGSF8의 C 말단에 융합된 GFP를 함유하는 융합 단백질의 구조를 도시한 도면. 도 16B는 형질주입되지 않은 HEK293 세포(네이티브) 또는 IGFS8-GFP 융합 단백질을 암호화하는 작제물이 안정적으로 형질주입된 HEK 세포로부터 단리된 엑소좀으로부터의 전체 단백질을 전개시킨 겔 사진을 제공한 도면. 도 16B는 하단에 GFP에 대한 항체를 사용하여 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 도면을 또한 제공한다.
도 17은 다양한 GFP 융합 단백질을 과별현하는 세포로부터 단리된 엑소좀으로부터 검출된 GFP 형광 신호를 제공한 도면(GFP 융합 단백질은 빈번하게 사용되는 pDisplay 스캐폴드(PDGF 수용체), CD81, 전장 IGSF8, 또는 전장 PTGFRN(FL) 또는 PTGFRN_454(sIgV) 중 어느 하나의 내강 면에 융합된 GFP를 함유함).
도 18은 PTGFRN의 세포외 도메인(세포외 도메인: ECD), N 말단에서의 내인성 신호 펩타이드(SP), PAR1 절단 부위, 및 C-말단에서의 Fc 도메인을 함유하는 융합 단백질의 구조를 제공한 도면. 도 18은 서열번호 46을 개시한다.
도 19A는 280㎚의 UV 형광에서 Superdex 200 칼럼(밀포어 시그마사(Millpore Sigma))을 사용하여 PBS pH 7.4 중에서 PTGFRN의 정제된 ECD의 겔 여과 크로마토그래피 결과를 제공한 도면. 도 19B는 PTGFRN의 정제된 ECD를 함유하는 용해물의 겔 여과 크로마토그래피로부터의 SDS-PAGE 겔 사진을 제공한 도면.
도 20A는 PTGFRN ECD, 항-VLA4 항체 및 BSA의 크기 배제 크로마토그래피/다각 광산란(size exclusion chromatography/multiangle light scattering: SEC-MALS) 결과를 제공한 도면. 도 20B는 구아니디늄 클로라이드(GuHCl)의 부재 또는 1M 또는 2M의 구아니디늄 클로라이드(GuHCl)의 존재 하에서의 PTGFRN ECD의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 결과를 제공한 도면. PTGFRN의 단량체 또는 이량체를 나타낸 피크가 제시된다.
도 21은 pH 7.4에서 결합 검정으로부터의 PTGFRN 엑토도메인 결합 파트너로서 식별된 상위 3개의 히트(상단), 및 pH 5.6에서 결합 검정으로부터 식별된 상위 5개의 히트(하부)를 제공한 도면.
도 22는 증가하는 농도의 LGALS1의 존재 하에서 PTGFRN과 LGALS1 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(bio-layer interferometry: BLI) 결과를 제공한 도면.
도 23은 증가하는 농도의 락토스의 존재 하에서 PTGFRN과 LGALS1 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 24는 증가하는 농도의 항-CD315 항체의 존재 하에서 PTGFRN과 항-CD315 항체 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 25는 증가하는 농도의 HEK293로부터 단리된 네이티브 엑소좀의 존재 하에서 항-CD315 항체와 네이티브 엑소좀 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 26은 증가하는 농도의 변형된 엑소좀의 존재 하에서 항-CD315 항체와 PTGFRN을 과발현하도록 변형된 엑소좀(PTGFRN++ 엑소좀) 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 27은 항-CD315 항체와 네이티브 엑소좀 간의 상호작용 또는 항-CD315 항체와 PTGFRN을 과발현하도록 변형된 엑소좀(PTGFRN++) 간의 상호작용을 비교하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 28은 항-CD315 항체와 전장 PTGFRN 간의 상호작용 또는 항-CD315 항체와 PTGFRN의 일련의 절두된 돌연변이체 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 29A는 형질주입된 HEK 세포로부터 단리된 재조합 PTGFRN의 절두된 돌연변이체, 및 HEK293 세포로부터의 정제된 엑소좀을 포함하는 생체내 바이오틴일화된 단백질을 전개시킨 겔 사진을 제공한 도면. 도 29B는 풀링된 다클론성 PTGFRN 항체를 사용하여 도 29A의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 30은 다클론성 PTGFRN 항체와 PTGFRN의 다양한 절두 돌연변이체 간의 상호작용을 연구하기 위한 생물층 간섭계법(BLI) 결과를 제공한 도면.
도 31은 상이한 기원(HEK293SF, 신장; HT1080, 결합 조직; K562, 골수; MDA-MB-231, 유방; Raji, 림프아구; 간엽 줄기세포(MSC), 골수)의 다양한 세포주로부터 정제된 엑소좀에 대한 표면 단백질(PTGFRN, IGSF8, IGSF3, BSG, SLC3A2, ITGB1, CD81 및 CD9)의 펩타이드 스펙트럼 매치(peptide spectrum matche: PSM)의 수를 제공한 도면.
도 32A는 네이티브 엑소좀 및 PTGFRN 넉아웃(KO) 엑소좀을 전개시킨 겔 사진을 제공한 도면. 도 32B는 풀링된 다클론성 PTGFRN 항체를 사용하여 도 32A의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 33은 정제된 네이티브(y축) 및 PTGRN KO(x축) 엑소좀으로부터의 펩타이드 스펙트럼 매치(PSM)의 산포도를 제공한 도면.
도 34는 단클론성 항-CD315 항체와 네이티브, PTGFRN++, 및 PTGFRN KO 엑소좀 간의 상호작용을 연구하기 위한 BLI 결과를 제공한 도면.
도 35A는 고정된 단클론성 항-PTGFRN 항체를 사용한 네이티브 엑소좀 및 PTGFRN 넉아웃(KO) 엑소좀의 시험관내 엑소좀 정제로부터의 폴리아크릴아마이드 겔의 사진을 제공한 도면. 도 35B는 항-PTGFRN 항체를 사용하여 도 35A의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 도면을 제공한 도면.
도 36A는 네이티브 엑소좀 또는 PTGFRN-BDDFIII을 발현하도록 조작된 변형된 엑소좀을 전개시킨 폴리아크릴아마이드 겔의 사진을 제공한 도면. 도 36B는 CD81 항체(상단) 또는 FVIII 항체(하단)을 사용하여 도 36A로부터의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 37A는 네이티브 엑소좀 또는 XTEN-PTGFRN-GFP를 발현하도록 조작된 변형된 엑소좀을 전개시킨 폴리아크릴아마이드 겔의 사진을 제공한 도면. 도 37B는 ALIX 항체(상단) 또는 GFP 항체(하단)을 사용하여 도 37A로부터의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 38은 4개의 상이한 엑소좀의 군 - (i) CD9-GFP, (ii) CD81-GFP 또는 (iii) PTGFRN-GFP를 발현하도록 조작된 변형된 엑소좀 또는 (iv) 비변형된 네이티브 엑소좀에서 GFP-양성 입자의 백분율(흑색 막대, 좌측 y축) 및 평균 형광 강도(회색 막대, 우측 y축)를 제공한 그래프.
도 39는 네이티브 PTGFRN(PTGFRN-GFP), 그 자신의 신호 펩타이드를 갖는 절두된 PTGFRN(454-PTGFRN-GFP) 또는 DsbA11로부터의 합성 신호 펩타이드를 갖는 절두된 PTGFRN(454-PTGFRN-GFP)을 함유하는 GFP 융합 단백질을 발현하는 변형된 엑소좀의 GFP 형광 강도(FU)를 제공한 도면.
도 40A는 렉틴 CLEC9A를 인식하는 단일 쇄 Fab, 전장 PTGFRN, GFP, 및 FLAG 태그로 이루어진 융합 단백질의 구조를 나타낸 도면. 도 40B는 항-ALIX 항체(상단) 또는 GFP 항체(하단)를 사용한 Optiprep(상표명) 정제된 엑소좀의 웨스턴 블로팅으로부터의 겔 사진을 제공한 도면.
도 41은 렉틴 CLEC9A를 인식하는 단일 쇄 Fab, 전장 PTGFRN, GFP 및 FLAG 태그로 이루어진 융합 단백질("αCLEC9A-PTGFRN")을 발현하도록 변형된 엑소좀과 CLEC9A-Fc 간의 상호작용을 연구하기 위한 BLI 결과를 제공한 도면.
도 42는 PTGFRN, ALIX, TSG101, CD63, CD9 또는 CD81에 대한 항체를 사용하여 HEK293SF 세포("HEK") 또는 MSC("MSC")로부터 정제된 엑소좀을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 43A는 형질주입되지 않은 HEK 세포, FLAG 태그에 융합된 전장 PTGFRN을 발현하는 플라스미드("PTGFRN-FLAG 플라스미드")가 형질주입된 HEK 세포, 형질주입되지 않은 CHO 세포 또는 PTGFRN-FLAG 플라스미드가 형질주입된 CHO 세포로부터 정제된 엑소좀을 전개시킨 폴리아크릴아마이드 겔의 사진을 제공한 도면. 도 43B는 PTGRN에 대한 항체를 사용하여 도 43A로부터의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면. 도 43C는 FLAG 태그에 대한 항체를 사용하여 도 43A로부터의 샘플을 웨스턴 블로팅한 겔 사진을 제공한 도면.
도 44A 및 도 44B는 CD9(도 44A) 또는 PTGFRN(도 44B)을 사용하여 엑소좀 내강에 카고 단백질(cargo protein)을 로딩하는 것을 시험하기 위한 실험 시스템을 도시한 도면. 도 44A는 라파마이신의 존재 하에서 V5 태그 및 FKBP에 융합된 mCherry와 상호작용할 수 있는, GFP, FLAG 태그 및 FKBP에 융합된 CD9를 발현하는 세포를 도시한 도면. 도 44B는 라파마이신의 존재 하에서 V5 태그 및 FKBP에 융합된 mCherry와 상호작용할 수 있는, GFP, FLAG 태그 및 FKBP에 융합된 PTGFRN를 발현하는 세포를 도시한 도면.
도 45A는 도 44A(CD9) 또는 도 44B(PTGFRN)(상단)에 도시된 세포 배양 샘플로부터 정제된 엑소좀을 전개시킨 폴리아크릴아마이드 겔의 사진을 제공한 도면. 이 도면은 또한 FLAG(αFlag) 또는 V5(αV5)(하단)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 결과를 제공한다. 도 45B는 농도계에 의해서 측정되고, 수집된 엑소좀의 양에 대해서 정규화된, 도 45A에서의 웨스턴 블로팅으로부터의 FLAG 및 V5에 대한 밴드 강도를 제공한 도면.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해서 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어는 하기에 주어진 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외 소포" 또는 "EV"는 내부 공간을 둘러싼 막을 포함하는 세포-유래된 소포를 지칭한다. 세포외 소포는 그것이 유래된 세포보다 더 작은 직경을 갖는 모든 막-결합된 소포를 포함한다. 일반적으로 세포외 소포는 직경이 20㎚ 내지 1000㎚의 범위이며, 내부 공간 내에, 세포외 소포의 외부 표면 상에 디스플레이된 그리고/또는 막을 지나는 다양한 거대분자 카고를 포함할 수 있다. 상기 카고는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예의 방식으로 그리고 비제한적으로, 세포외 소포는 세포사멸체, 세포의 단편, 직접 또는 간접적 조작(예를 들어, 연속 압출 또는 알칼리성 용액으로의 처리)에 의해 세포로부터 유래된 소포, 소포형성된(vesiculated) 소기관, 및 살아있는 세포에 의해서 (예를 들어 직접적인 원형질막 버딩(budding) 또는 후기 엔도솜과 원형질막의 융합에 의해서) 생산된 소포를 포함한다. 세포외 소포는 살아있거나 죽은 유기체, 체외이식 조직 또는 기관 및/또는 배양된 세포로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "엑소좀"은 세포-유래된 작은 (20 내지 300㎚ 직경, 보다 바람직하게는 40 내지 200㎚ 직경) 소포이며, 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하고, 직접적인 원형질막 버딩 또는 후기 엔도솜과 원형질 막의 융합에 의해서 상기 세포로부터 생성되는 소포를 지칭한다. 엑소좀은 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하고, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 리시버(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA), 당(예를 들어, 단순당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 엑소좀은 생산자 세포로부터 유래되고, 그것의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이들의 조합을 기초로 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 엑소좀은 세포외 소포의 종이다. 일반적으로, 엑소좀 생산/생물발생은 생산자 세포의 파괴를 초래하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노소포"는 세포-유래된 작은 (20 내지 250㎚ 직경, 보다 바람직하게는 30 내지 150㎚ 직경) 소포이며, 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하고, 상기 나노소포가 직접 또는 간접적 조작 없이 상기 생산자 세포에 의해서 생산되지 않도록 상기 조작에 의해 상기 세포로부터 생성되는 소포를 지칭한다. 상기 생산자 세포의 적절한 조작은 연속 압출, 알칼리성 용액으로의 처리, 초음파처리 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 나노소포의 생산은 일부 예에서 상기 생산자 세포의 파괴를 초래하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 나노소포의 집단은 원형질막으로부터의 직접적인 버딩 또는 후기 엔도좀과 원형질막의 융합에 의해서 생산자 세포로부터 유래된 소포가 실질적으로 존재하지 않는다. 나노소포는 지질 또는 지방산 및 폴리펩타이드를 포함하고, 선택적으로 페이로드(예를 들어, 치료제), 리시버(예를 들어, 표적화 모이어티), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산, RNA, 또는 DNA), 당(예를 들어, 단순당, 다당류, 또는 글리칸) 또는 다른 분자를 포함한다. 나노소포는, 그것이 상기 조작에 따라서 생산자 세포로부터 유래되면, 그것의 크기, 밀도, 생화학적 파라미터, 또는 이들의 조합을 기초로 생산자 세포로부터 단리될 수 있다. 나노소포는 세포외 소포의 종이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "표면-조작된 엑소좀"은 조성이 변형된 막 변형된 엑소좀을 지칭한다. 예를 들어, 막은 단백질, 지질, 소분자, 탄수화물 등의 조성이 변형된다. 조성은 화학적, 물리학적 또는 생물학적 방법에 의해서 변화될 수 있거나 또는 화학적, 물리학적 또는 생물학적 방법에 의해서 이전에 변형되거나 또는 동시에 변형되는 세포로부터의 생산에 의해서 변화될 수 있다. 구체적으로, 조성은 유전자 조작에 의해서 변화되거나 또는 유전자 조작에 의해서 이미 변형된 세포로부터의 생산에 의해서 변화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 단백질의 "변형"은 단백질의 비-돌연변이체 아미노산 서열과 적어도 15% 동일성을 갖는 단백질을 지칭한다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체를 포함한다. 단백질의 변형은 단백질의 단편 또는 변이체에 대한 화학적 또는 물리학적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 단백질의 "단편"은 자연 발생 단백질에 비해서 N- 및/또는 C-말단이 결실된 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체의 단편은 엑소좀에 대해서 특이적으로 표적화될 능력을 보유한다. 이러한 단편은 또한 "기능성 단편"이라고 지칭된다. 단편이 이러한 의미로 기능성 단편인지의 여부는, 웨스턴 블롯, FACS 분석 및 단편과 자가형광 단백질 등, 예를 들어, GFP의 융합을 비롯한 엑소좀의 단백질 함량을 결정하기 위한 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해서 평가될 수 있다. 특정 실시형태에서 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체의 단편은, 엑소좀에 대해서 특이적으로 표적화될 자연 발생 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체의 능력의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 단백질의 "변이체"는 당업계에 공지된 방법에 의한 정렬 시에 또 다른 단백질과 특정 아미노산 서열 동일성을 공유하는 단백질을 지칭한다. 단백질의 변이체는 또 다른 단백질에서 치환, 삽입, 결실, 프레임시프트(frameshift) 또는 재배열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변이체는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체의 단편에 대해서 적어도 70% 동일성을 갖는 변이체이다. 일부 실시형태에서 PTGFRN의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 1에 따른 PTGFRN 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 BSG의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 9에 따른 BSG 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 IGSF2의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 34에 따른 IGSF2 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 IGSF3의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 20에 따른 IGSF3 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 IGSF8의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 14에 따른 IGSF8 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ITGB1의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 21에 따른 ITGB1 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ITGA4의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 22에 따른 ITGA4 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 SLC3A2의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 23에 따른 SLC3A2 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP1A1의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 24에 따른 ATP1A1 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP1A2의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 25에 따른 ATP1A2 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP1A3의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 26에 따른 ATP1A3 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP1A4의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 27에 따른 ATP1A4 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP1B3의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 28에 따른 ATP1B3 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP2B1의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 29에 따른 ATP2B1 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP2B2의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 30에 따른 ATP2B2 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP2B3의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 31에 따른 ATP2B3 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서 ATP2B4의 변이체 또는 이의 단편의 변이체는 서열번호 32에 따른 ATP2B4 또는 이의 기능성 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 상기 경우 각각에서, 변이체 또는 단편의 변이체는 엑소좀에 대해서 특이적으로 표적화되는 능력을 보유하는 것이 바람직하다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 15 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989) Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992); 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994)]에 기재되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)[Altschul 20 et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) J]은 서열 분석 프로그램 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해서 국립 생물정보 센터(National Center for Biological Information)(NBCl, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)를 비롯한 몇몇 공급원으로부터 그리고 인터넷 상에서 입수 가능하다. BLAST 및 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명은 NIH(National Institute of Health) 하의 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 공식 웹사이트에서 접근될 수 있다.
본 명세서에 제공된 임의의 단백질의 언급은 단백질의 기능성 변이체를 포함한다. 용어 단백질의 "기능성 변이체"는 엑소좀에 대해서 특이적으로 표적화되는 능력을 보유하는 단백질의 변이체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "생산자 세포"는 엑소좀을 생성시키기 위해서 사용되는 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 시험관내에서 배양된 세포이거나 또는 생체내 세포일 수 있다. 생산자 세포는 엑소좀을 생성시키는 데 효과적이라고 공지된 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 및 간엽 줄기세포(MSC)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "표적 단백질"은 엑소좀의 표면에 표적화될 수 있는 단백질을 지칭한다. 표적 단백질은 엑소좀 막에 자연적으로 표적화되는 비-돌연변이체 단백질, 또는 비-돌연변이체 단백질의 단편 또는 변이체일 수 있다. 표적 단백질은 flag 태그, 치료용 펩타이드, 표적화 모이어티 또는 비-돌연변이체 단백질 또는 비-돌연변이체 단백질의 변이체 또는 단편에 부착된 다른 펩타이드를 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 표적 단백질은 막관통 단백질, 내재 단백질(integral protein), 주변 단백질(peripheral protein) 또는 링커에 의해서 막에 부착된 가용성 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "오염 단백질"은 엑소좀과 회합되지 않은 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 오염 단백질은 엑소좀 내에 포함되지 않고, 엑소좀의 막에 부착되지 않거나 혼입되지 않은 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리시키다", "단리된", 및 "단리시키는" 또는 "순도", "정제된", 및 "정제시키는"뿐만 아니라 "추출된" 및 "추출시키는"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 하나 이상의 정제 공정, 예를 들어, 목적하는 엑소좀 제제의 선택 또는 풍부화를 겪은 목적하는 EV의 제제(예를 들어, 복수의 기지 또는 미지의 양 및/또는 농도)의 상태를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단리시키는 또는 정제시키는은 샘플 함유 생산자 세포로부터 엑소좀(분획)을 제거, 부분적으로 제거시키는 공정이다. 일부 실시형태에서, 단리된 엑소좀 조성물은 검출 가능한 목적하지 않은 활성도를 갖지 않거나 또는, 대안적으로, 목적하지 않은 활성도의 수준 또는 양은 허용 가능한 수준 또는 양 또는 그 미만이다. 다른 실시형태에서, 단리된 엑소좀 조성물은 허용 가능한 양 및/또는 농도 또는 그 초과의 양 및 농도의 목적하는 엑소좀을 갖는다. 다른 실시형태에서, 단리된 엑소좀 조성물은, 조성물이 획득된 출발 물질(예를 들어, 생산자 세포 제제)에 비해서 풍부화된다. 이러한 풍부화는 출발 물질과 비교할 때 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 99.9999% 또는 99.9999% 초과만큼일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 엑소좀 제제는 잔류하는 생물학적 생성물이 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 단리된 엑소좀 제조는 임의의 오염 생물학적 물질이 100% 존재하지 않거나, 99% 존재하지 않거나, 98% 존재하지 않거나, 97% 존재하지 않거나, 96% 존재하지 않거나, 95% 존재하지 않거나, 94% 존재하지 않거나, 93% 존재하지 않거나, 92% 존재하지 않거나, 91% 존재하지 않거나 또는 90% 존재하지 않는다. 잔류하는 생물학적 생성물은 무생물 물질(화학물질 포함) 또는 원치않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물을 포함할 수 있다. 잔류하는 생물학적 생성물이 실질적으로 존재하지 않는은 또한 엑소좀 조성물이 검출 가능한 생산자 세포를 함유하지 않고, 엑소좀 만이 검출 가능하다는 것을 의미할 수 있다.
용어 "부형제" 또는 "담체"는 화합물의 투여를 추가로 가능하게 하기 위해서 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 용어 "약제학적으로-허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로-허용 가능한 부형제"는 인간을 비롯한 동물에서의 사용을 위해서 미국 약전에 열거되거나 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해서 승인된 작용제 중 임의의 것뿐만 아니라 대상체에게 유의한 자극을 유발하지 않고 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다. 약제학적 조성물의 제조에 유용하고, 일반적으로 안전하고, 비독성이고, 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "페이로드"는 EV와 접촉되는 표적(예를 들어, 표적 세포)에 대해서 작용하는 치료제를 지칭한다. 엑소좀 및/또는 생산자 세포 내에 도입될 수 있는 페이로드는 치료제, 예컨대, 뉴클레오타이드(예를 들어, 검출 가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 전사를 방해하는 뉴클레오타이드), 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드, 예컨대, 효소를 암호화하는 DNA 또는 mRNA 분자 또는 조절 기능을 갖는 RNA 분자, 예컨대, miRNA, dsDNA, lncRNA 및 siRNA), 아미노산(예를 들어, 검출 가능한 모이어티 또는 독소를 포함하거나 또는 전사를 방해하는 아미노산), 폴리펩타이드(예를 들어, 효소), 지질, 탄수화물 및 소분자(예를 들어, 소분자 약물 및 독소)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "포유동물 대상체"는 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그 등)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 모든 포유동물을 포함한다.
용어 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 진단, 치료 또는 요법이 필요한 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의학적 응용 둘 모두에 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이고, 다른 실시형태에서 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 존재하지 않는"은 엑소좀을 포함하는 샘플이 질량/부피(m/v) 백분율 농도를 기준으로 10% 미만의 거대분자를 포함한다는 것을 의미한다. 일부 분획은 0.001% 미만, 0.01% 미만, 0.05% 미만, 0.1% 미만, 0.2% 미만, 0.3% 미만, 0.4% 미만, 0.5% 미만, 0.6% 미만, 0.7% 미만, 0.8% 미만, 0.9% 미만, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만 또는 10%(m/v) 미만의 거대분자를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "거대분자"는 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물 또는 이들의 조합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종래의 엑소좀 단백질"은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린 LAMP2, 및 LAMP2B, 이들의 단편 또는 이들에 결합하는 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 엑소좀에서 풍부하다고 이전에 공지된 단백질을 의미한다.
2. 다른 해석 관습
본 명세서에 언급된 범위는 언급된 종점을 포함하여, 범위 내의 값 모두에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하도록 이해된다.
3. 엑소좀 단백질
본 발명의 양상은 엑소좀 막 상에 고도로 풍부한, 엑소좀 단백질의 식별, 사용 및 변형에 관한 것이다. 이러한 엑소좀 단백질은 질량 분광분석법 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 고도로 정제된 엑소좀을 분석함으로써 식별될 수 있다.
엑소좀 단백질은 엑소좀 막 상에 풍부한 다양한 막 단백질, 예컨대, 막관통 단백질, 내재 단백질 및 주변 단백질을 포함한다. 이것은 다양한 CD 단백질, 수송체, 인테그린, 렉틴 및 카드헤린을 포함한다. 구체적으로, 이러한 단백질은 (1) 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), (2) basigin(BSG), (3) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3(IGSF3), (4) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8(IGSF8), (5) 인테그린 베타-1(ITGB1), (6) 인테그린 알파-4(ITGA4), (7) 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2), (8) ATP 수송체 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), 및 (9) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2(IGSF2)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
생산자 세포, 생산 조건, 정제 방법 또는 엑소좀의 의도된 응용에 따라서 본 명세서에서 식별된 1종 이상의 엑소좀 단백질이 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 특정 집단 상에 풍부한 엑솜(exome) 단백질을 사용하여 엑소좀의 특정 집단을 정제시킬 수 있다. 특정 크기 범위, 표적화 모이어티, 전하 밀도, 페이로드 등을 갖는 특정 엑소좀의 표면 상에 풍부한 엑소좀 단백질이 식별되고, 본 발명의 일부 실시형태에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1종 초과의 엑소좀 단백질이 치료용 엑소좀의 생성, 정제, 및 단리를 위해서 동시에 또는 이어서 사용될 수 있다.
4. 표면-조작된 엑소좀
본 발명의 또 다른 양상은 표면-조작된 엑소좀의 생성 및 사용에 관한 것이다. 표면-조작된 엑소좀은 조성이 변형된 막을 갖는다. 예를 들어, 이의 막 조성은 막의 단백질, 지질 또는 글리칸 함량을 변화시킴으로써 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표면-조작된 엑소좀은 화학적 및/또는 물리적 방법, 예컨대, PEG-유도된 융합 및/또는 초음파 융합에 의해서 생성된다.
다른 실시형태에서, 표면-조작된 엑소좀은 유전자 조작에 의해서 생성된다. 유전자적으로-변형된 생산자 세포 또는 유전자적으로-변형된 세포의 자손으로부터 생산된 엑소좀은 변형된 막 조성물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면-조작된 엑소좀은 더 높은 밀도 또는 더 낮은 밀도로 엑소좀 단백질을 갖거나 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 포함한다.
예를 들어, 표면-조작된 엑소좀은 엑소좀 단백질 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하는 외인성 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 외인성 서열로부터 발현된 단백질을 포함하는 엑소좀은 변형된 막 단백질 조성물을 포함할 수 있다.
엑소좀 단백질의 다양한 변형 또는 단편이 본 발명의 실시형태를 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합제를 사용하여 정제될 수 있는 표면-조작된 엑소좀을 생성시키기 위해서 결합제에 대해서 향상된 친화성을 갖도록 변형된 단백질이 사용될 수 있다. 엑소좀 및/또는 막에 대해서 보다 효과적으로 표적화되도록 변형된 단백질이 사용될 수 있다. 엑소좀 막에 대한 특이적이고 효과적인 표적화를 위해서 필요한 최소 단편을 포함하도록 변형된 단백질이 또한 사용될 수 있다.
융합 단백질이 사용될 수 있고, 예를 들어, 친화성 태그(예를 들어, His 태그, GST 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, S-펩타이드, HA, Myc, FLAG(상표명)(시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Co.)), MBP, SUMO 및 단백질 A)에 융합된 엑소좀 단백질 또는 이의 단편이 친화성 태그에 특이적인 결합제를 사용한 표면-조작된 엑소좀의 정제 또는 제거를 위해서 사용될 수 있다.
치료 활성을 갖는 융합 단백질이 또한 표면-조작된 엑소좀을 생성시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 치료용 펩타이드를 포함할 수 있다. 치료용 펩타이드는 자연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 치료 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 치료 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자일 수 있다. 치료용 펩타이드는 항체, 효소, 리간드, 수용체, 항미생물성 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 펩타이드는 핵산 결합 단백질이다. 핵산 결합 단백질은 다이서(Dicer), 알고너트(Argonaute) 단백질, TRBP 또는 MS2 박테리오파지 코트 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 결합 단백질은 1종 이상의 RNA 또는 DNA 분자를 추가로 포함한다. 1종 이상의 RNA는 miRNA, siRNA, 가이드 RNA, lincRNA, mRNA, 안티센스 RNA, dsRNA 또는 이들의 조합물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료용 펩타이드는 단백질-단백질 상호작용 시스템의 부분이다. 일부 실시형태에서, 단백질-단백질 상호작용 시스템은 FRB-FKBP 상호작용 시스템, 예를 들어, 문헌[Banaszynski et al., J Am Chem Soc. 2005 Apr 6;127(13):4715-21]에 기재된 바와 같은 FRB-FKBP 상호작용 시스템을 포함한다.
융합 단백질은 엑소좀의 표면에 표적화될 수 있고, 엑소좀에 치료 활성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편 또는 변형을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적화 모이어티를 갖는 융합 단백질이 사용된다. 예를 들어, 융합 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 엑소좀을 사용한 치료를 위해서 특이적 기관, 조직 또는 세포에 대해서 엑소좀을 표적화하기 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 항체 및 이의 항원-결합 단편은 전체 항체, 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체, 이의 단편을 포함하고, 추가로 단일-쇄 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체, 항-이디오타입 항체, 항체 단편, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편, 다이아바디 및 항체-관련 폴리펩타이드를 포함한다. 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한, 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체가 목적하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 IGSF8 또는 이의 단편 또는 변형을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 표면-조작된 엑소좀은 당업계에 공지된 표면-조작된 엑소좀에 비해서 우수한 특징을 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 새로-식별된 엑소좀 단백질을 사용함으로써 생산된 표면-조작된 엑소좀은 선행 기술에서의 엑소좀, 예를 들어, 종래의 엑소좀 단백질을 사용하여 생산된 것보다 표면 상에 보다 상당히 풍부한 변형된 단백질을 함유한다. 추가로, 본 발명의 표면-조작된 엑소좀은 당업계에 공지된 표면-조작된 엑소좀에 비해서 더 크거나, 보다 특이적이거나 보다 제어된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 엑소좀 표면 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, PTGFRN 또는 이의 단편)에 융합된 치료 또는 생물학적으로 관련된 외인성 서열을 포함하는 표면 조작된 엑소좀은 당업계에 공지된 스캐폴드에 대한 융합보다 더 목적하는 조작된 특징을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 스캐폴드 단백질은 테트라스파닌 분자(예를 들어, CD63, CD81, CD9 등), 라이소좀-연관 막 단백질 2(LAMP2 및 LAMP2B), 혈소판-유래된 성장 인자 수용체(PDGFR), GPI 앵커 단백질, 락타드헤린 및 이들의 단편 및 이들 단백질 또는 이들의 단편 중 임의의 것에 친화성을 갖는 펩타이드를 포함한다. 이전에, 외인성 단백질의 과발현은 표면-조작된 엑소좀을 생산하기 위한 엑소좀 상의 외인성 단백질의 확률론적 또는 무작위 배치에 좌우되었다. 이것은 엑소좀 상의 외인성 단백질의 낮은 수준의 예측 가능하지 않은 밀도를 초래하였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 표면 단백질 및 이의 단편은 신규 엑소좀 조성물 및 이의 제조 방법에서 중요한 발전을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 새로-식별된 엑소좀 표면 단백질 및 외인성 서열을 함유하는 융합 단백질을 포함하는 표면-조작된 엑소좀은, 당업계에 공지된 종래의 엑소좀 단백질에 접합된 외인성 서열을 포함하는 유사하게 조작된 엑소좀보다 더 높은 밀도의 융합 단백질(예를 들어, CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린 LAMP2 및 LAMP2B, 이의 단편 또는 이에 결합된 펩타이드)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 새로-식별된 엑소좀 단백질을 함유하는 상기 융합 단백질은 종래의 엑소좀 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 엑소좀 표면 상에 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 새로-식별된 엑소좀 단백질을 함유하는 상기 융합 단백질은 종래의 엑소좀 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 엑소좀 표면 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 CD9를 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 CD63을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 CD81을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 PDGFR을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 GPI 앵커 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 락타드헤린을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 LAMP2를 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 LAMP2B를 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질의 단편을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질의 변이체를 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
특정 실시형태에서, PTGFRN의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, BSG의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, IGSF2의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, IGSF3의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, IGSF8의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, ITGB1의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, ITGA4의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, SLC3A2의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, ATP 수송체의 융합 단백질, 이의 변이체, 단편, 단편의 변이체 또는 변형은 종래의 엑소좀 단백질(예를 들어, 테트라스파닌 분자, 예컨대, CD63)을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 새로-식별된 엑소좀 단백질을 함유하는 상기 융합 단백질은 종래의 엑소좀 단백질을 사용하여 유사하게 변형된 다른 엑소좀 표면 상의 융합 단백질보다 엑소좀 표면 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
본 명세서에 제공된 융합 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 추가 펩타이드를 포함할 수 있다. 추가 펩타이드는 엑소좀 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체의 N 말단 또는 C 말단 중 어느 하나에 부착될 수 있다. 추가 펩타이드는 엑소좀 단백질에 부착된 엑소좀의 내부에(내강 면에) 또는 외부에 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 융합 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 2종의 추가 펩타이드를 포함한다. 2종의 추가 펩타이드 둘 다는 엑소좀 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체의 N 말단 또는 C 말단 중 어느 하나에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2종의 추가 펩타이드 중 하나는 N 말단에 부착되고, 2종의 추가 펩타이드 중 나머지는 엑소좀 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체의 C 말단에 부착된다. 추가 펩타이드는 엑소좀 단백질에 부착된 엑소좀의 내부에(내강 면에) 또는 외부에 또는 둘 다에 배치될 수 있다.
5. 표면-조작된 엑소좀의 생산을 위한 생산자 세포
본 발명의 엑소좀은 시험관내에서 성장된 세포 또는 대상체의 체액으로부터 생산될 수 있다. 엑소좀이 시험관내 세포 배양물로부터 생산된 경우, 다양한 생산자 세포, 예를 들어, HEK293 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 간엽 줄기세포(MSC)가 본 발명을 위해서 사용될 수 있다.
생산자 세포는 1종 이상의 외인성 서열을 포함하여 표면-조작된 엑소좀을 생산하도록 유전자 변형될 수 있다. 유전자적으로-변형된 생산자 세포는 일시적인 형질전환 또는 안정적인 형질전환에 의해서 도입된 외인성 서열을 함유할 수 있다. 외인성 서열은 플라스미드로서 생산자 세포에 도입될 수 있다. 외인성 서열은 표적화된 부위에서 또는 무작위 부위에서, 생산자 세포의 게놈 서열 내에 안정적으로 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정적인 세포주는 표면-조작된 엑소좀의 생산을 위해서 생성된다.
외인성 서열은 엑소좀 단백질을 암호화하는 내인성 서열의 상류(5'-단부) 또는 하류(3'-단부) 내에 배치된, 생산자 세포의 게놈 서열 내에 삽입될 수 있다. 생산자 세포 내에 외인성 서열을 도입하기 위해서 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 유전자 편집 방법(예를 들어, 상동 재조합, 트랜스포존-매개된 시스템, loxP-Cre 시스템, CRISPR/Cas9 또는 TALEN)을 사용하여 변형된 세포가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
외인성 서열은 엑소좀 단백질 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 엑소좀 단백질을 암호화하는 서열의 추가 카피를 도입시켜 더 높은 밀도로 엑소좀 단백질을 갖는 표면-조작된 엑소좀을 생산할 수 있다. 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하는 외인성 서열을 도입시켜 엑소좀 단백질의 변형 또는 단편을 함유하는 표면-조작된 엑소좀을 생성시킬 수 있다. 친화성 태그를 암호화하는 외인성 서열을 도입시켜 엑소좀 단백질에 부착된 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질을 함유하는 표면-조작된 엑소좀을 생성시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 표면-조작된 엑소좀은 동일하거나 또는 유사한 생산자 세포 유형으로부터 단리된 네이티브 엑소좀보다 더 높은 밀도의 엑소좀 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀 단백질은 상기 네이티브 엑소좀보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 엑소좀 단백질은 상기 네이티브 엑소좀보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 단백질을 포함하는 융합 단백질은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 엑소좀 단백질보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 단백질의 단편 또는 변이체는 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 엑소좀 단백질보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
특정 실시형태에서, PTGFRN, PTGFRN의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 PTGFRN보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, BSG, BSG의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 BSG보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, IGSF2, IGSF2의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 IGSF2보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, IGSF3, IGSF3의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 IGSF3보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, ITGB1, ITGB1의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 ITGB1보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, ITGA4, ITGA4의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 ITGA4보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, SLC3A2, SLC3A2의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 SLC3A2보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다. 특정 실시형태에서, ATP 수송체, ATP 수송체의 단편 또는 변이체, 또는 이의 변형은 상기 네이티브 엑소좀 상의 비변형된 ATP 수송체보다 상기 표면-조작된 엑소좀 상에 2 내지 4배, 4 내지 8배, 8 내지 16배, 16 내지 32배, 32 내지 64배, 64 내지 100배, 100 내지 200배, 200 내지 400배, 400 내지 800배, 800 내지 1,000배 또는 더 높은 밀도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 생산자 세포는 추가 외인성 서열을 포함하도록 추가로 변형된다. 예를 들어, 추가 외인성 서열을 도입시켜 내인성 유전자 발현을 조절하고, 페이로드로서 특정 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포는 2개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되는데, 하나는 엑소좀 단백질 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하고, 나머지는 페이로드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포는 엑소좀에 추가 기능, 예를 들어, 생체내에서의 특이적 표적화 능력, 전달 기능, 효소 기능, 증가 또는 감소된 반감기를 부여하는 추가 외인성 서열을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포는 2개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되는데, 하나는 엑소좀 단백질 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하고, 나머지는 엑소좀에 추가 기능을 부여하는 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 생산자 세포는 2개의 외인성 서열을 포함하도록 변형되는데, 2개의 외인성 서열 각각은 엑소좀 표면 상의 융합 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포로부터의 표면-조작된 엑소좀은 동일하거나 또는 유사한 세포 유형의 비변형된 세포로부터 단리된 네이티브 엑소좀에 비해서 더 높은 밀도의 엑소좀 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표면-조작된 엑소좀은 동일하거나 또는 유사한 세포 유형의 비변형된 세포로부터 단리된 네이티브 엑소좀보다 2-, 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 100-, 200-, 400-, 800-, 1,000배 또는 더 높은 밀도로 엑소좀 단백질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 추가 외인성 서열을 포함하도록 추가로 변형된다.
보다 구체적으로, 표면-조작된 엑소좀은 (1) 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), (2) basigin(BSG), (3) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3(IGSF3), (4) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8(IGSF8), (5) 인테그린 베타-1(ITGB1), (6) 인테그린 알파-4(ITGA4), (7) 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2), (8) ATP 수송체 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), 및 (9) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2(IGSF2)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 엑소좀 표면 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 1종 이상의 엑소좀 표면 단백질 중 임의의 것은 플라스미드, 게놈에 삽입된 외인성 서열 또는 다른 외인성 핵산, 예컨대, 합성 메신저 RNA(mRNA)로부터 생산자 세포에서 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 엑소좀 표면 단백질은 이의 전장, 내인성 형태를 암호화하는 외인성 서열로 형질전환된 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 1의 PTGFRN 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 9의 BSG 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 14의 IGSF8 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 20의 IGSF3 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 21의 ITGB1 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 22의 ITGA4 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 23의 SLC3A2 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 24의 ATP1A1 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 25의 ATP1A2 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 26의 ATP1A3 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 27의 ATP1A4 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 28의 ATP1B3 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 29의 ATP2B1 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 30의 ATP2B2 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 31의 ATP2B3 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 32의 ATP2B4 단백질 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 이러한 외인성 서열은 서열번호 34의 IGSF2 단백질 단백질을 암호화한다.
표면-조작된 엑소좀은 (1) 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), (2) basigin(BSG), (3) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3(IGSF3), (4) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8(IGSF8), (5) 인테그린 베타-1(ITGB1), (6) 인테그린 알파-4(ITGA4), (7) 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2), (8) ATP 수송체 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), 및 (9) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2(IGSF2)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 엑소좀 표면 단백질의 단편을 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열은 네이티브 단백질의 N-말단으로부터 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개의 아미노산이 결핍된 엑소좀 표면 단백질의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 서열은 네이티브 단백질의 C-말단으로부터 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개의 아미노산이 결핍된 엑소좀 표면 단백질의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 서열은 네이티브 단백질의 N-말단 및 C-말단 둘 다로부터 적어도 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개의 아미노산이 결핍된 엑소좀 표면 단백질의 단편을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 서열은 네이티브 단백질의 하나 이상의 기능성 또는 구조 도메인이 결핍된 엑소좀 표면 단백질의 단편을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 엑소좀 표면 단백질의 단편은 1종 이상의 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 단편의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 단편의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 단편의 N-말단 및 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 인간 단백질이다.
표면 조작된 엑소좀은 PTGFRN의 단편을 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 단편은 하나 이상의 기능성 또는 구조 도메인, 예컨대, IgV가 결핍되어 있다. 예를 들어, PTGFRN의 단편은 서열번호 2 내지 7 또는 33의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, PTGFRN의 단편은 1종 이상의 이종 단백질에 융합된다. 1종 이상의 이종 단백질은 상기 PTGFRN 단편의 N-말단에 융합될 수 있다. 1종 이상의 이종 단백질은 상기 PTGFRN 단편의 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 PTGFRN 단편의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 인간 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 PTGFRN 단편에 융합된 상기 이종 단백질은 신호 서열 펩타이드를 추가로 함유한다. 신호 서열 펩타이드는 서열번호 8의 폴리펩타이드일 수 있다.
표면 조작된 엑소좀은 Basigin의 단편을 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, Basigin의 단편은 하나 이상의 기능성 또는 구조 도메인, 예컨대, IgV가 결핍되어 있다. 예를 들어, Basigin의 단편은 서열번호 10 내지 12의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Basigin의 단편은 1종 이상의 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 Basigin 단편의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 Basigin 단편의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 Basigin 단편의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 인간 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 Basigin 단편에 융합된 상기 이종 단백질은 신호 서열 펩타이드를 추가로 함유한다. 신호 서열 펩타이드는 서열번호 13의 폴리펩타이드일 수 있다.
표면 조작된 엑소좀은 IGSF8의 단편을 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, IGSF8의 단편은 하나 이상의 기능성 또는 구조 도메인, 예컨대, IgV가 결핍되어 있다. 예를 들어, IGSF8의 단편은 서열번호 15 내지 18의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IGSF8의 단편은 1종 이상의 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 IGSF8 단편의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 IGSF8 단편의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 IGSF8 단편의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 인간 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 IGSF8 단편에 융합된 상기 이종 단백질은 신호 서열 펩타이드를 추가로 함유한다. 신호 서열 펩타이드는 서열번호 19의 폴리펩타이드일 수 있다.
표면 조작된 엑소좀은 IGSF2의 단편을 암호화하는 서열로 형질전환된 세포로부터 생산될 수 있다. 일부 실시형태에서, IGSF2의 단편은 하나 이상의 기능성 또는 구조 도메인, 예컨대, IgV가 결핍되어 있다. 일부 실시형태에서, IGSF2의 단편은 1종 이상의 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 IGSF2 단편의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 IGSF2 단편의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 이종 단백질은 상기 IGSF2 단편의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 포유동물 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 인간 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 IGSF2 단편에 융합된 상기 이종 단백질은 신호 서열 펩타이드를 추가로 함유한다. 신호 서열 펩타이드는 서열번호 35의 폴리펩타이드일 수 있다.
일부 실시형태에서 표면-조작된 엑소좀은 (1) 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), (2) basigin(BSG), (3) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3(IGSF3), (4) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8(IGSF8), (5) 인테그린 베타-1(ITGB1), (6) 인테그린 알파-4(ITGA4), (7) 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2), (8) ATP 수송체 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4), 및 (9) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 2(IGSF2)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 동일하거나 유사한 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 50% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 50% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 60% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 60% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 70% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 70% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 80% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 80% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 90% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 90% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 95% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 99% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 99% 동일하다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 네이티브 엑소좀 표면 단백질의 전장 또는 단편과 99.9% 동일하고, 예를 들어, 서열번호 1 내지 34와 99.9% 동일하다.
6. 친화성 정제
본 발명의 일부 실시형태는 엑소좀 막 상에 풍부한 단백질과 고정된 결합제 간의 특이적 결합 상호작용을 사용한 엑소좀의 단리, 정제 및 하위 분별(sub-fractionation)에 관한 것이다. 이러한 방법은 일반적으로 (1) 엑소좀을 포함하는 샘플을 적용 또는 로딩하는 단계, (2) 선택적으로 엑소좀의 표적 단백질과 결합제 간의 결합 상호작용을 유지시키는 적절한 완충제를 사용하여 미결합 샘플 성분을 세척하는 단계 및 (3) 결합 상호작용이 더이상 일어나지 않도록 완충제 조건을 변경시킴으로써 고정된 결합제로부터 엑소좀을 용리(해리 및 회수)시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 엑소좀 막 상에 풍부한 단백질과 고정된 결합제 간의 특이적 결합 상호작용을 사용하여 샘플로부터 엑소좀을 제거하는 방법에 관한 것이다. 이 경우, 결합제에 결합된 엑소좀은 결합제로부터 용리되지 않고, 결합제에 결합하지 않은 분획이 수집될 수 있다. 방법을 사용하여 샘플을 엑소좀 및 비-엑소좀성 물질, 예컨대, 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 임의의 다른 외피 보유 또는 외피 비보유 바이러스) 또는 재조합 단백질(예를 들어, 항체, 효소 또는 다른 폴리펩타이드)을 포함하는 샘플을 정제시킬 수 있고, 여기서 엑소좀은 오염 입자이다. 결합된 엑소좀은 결합제에 결합되어 유지될 수 있고, 엑소좀이 실질적으로 존재하지 않은 비-엑소좀성 물질이 수집된다.
이러한 단리, 정제, 하위 분별 또는 제거 공정을 위해서 사용되는 표적 단백질은 생산자 세포의 게놈으로부터 생산된 내인성 단백질, 유전자 변형에 의해서 생산자 세포에 도입된 단백질 또는 화학적, 물리적 또는 다른 생물학적 방법에 의해서 변형된 단백질일 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 비-돌연변이체 단백질 또는 돌연변이체 단백질, 예를 들어, 내인성 단백질의 변이체 또는 단편이다. 일부 경우에, 단백질은 융합 단백질이다.
표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 다양한 결합제가 본 발명의 실시형태를 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 단백질, 펩타이드, 및 소분자가 결합제로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합제는 유기 또는 무기 공급원으로부터 획득된다. 유기 공급원으로부터의 결합제의 예는 혈청 단백질, 렉틴 또는 항체를 포함한다. 무기 공급원으로부터의 결합제의 예는 붕산, 금속 킬레이트 및 트라이아진 염료를 포함한다.
결합제는 고체 지지체에 화학적으로 고정되거나 커플링될 수 있어서 결합제에 대해서 특이적 친화성을 갖는 엑소좀이 결합된다. 고체 지지체의 다양한 형태, 예를 들어, 다공성 아가로스 비드, 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드 또는 막이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피 칼럼을 형성하고, 엑소좀의 친화성 크로마토그래피를 위해서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 엑소좀의 단리, 정제, 하위 분별 및 제거는 결합제 및 고체 지지체가 패킹된 칼럼을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해서 수행된다. 일부 실시형태에서, 엑소좀을 함유하는 샘플을 칼럼을 통해 전개시켜 정지시키고, 세척 완충액을 칼럼을 통해서 전개시키고, 그 다음 용리 완충액을 칼럼에 적용하여, 수집한다. 이러한 단계는 주변 압력에서 또는 추가 압력을 적용하여 수행될 수 있다.
일부 경우에, 엑소좀의 단리, 정제, 하위 분별 및 제거는 배취 처리를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 샘플을 용기에서 고체 지지체에 부착된 결합제에 첨가하고, 혼합하고, 고체 지지체를 분리하고, 액체 상을 제거하고, 세척하고, 원심분리시키고, 용리 완충액을 첨가하고, 재원심분리시키고, 용리물을 제거한다.
일부 경우에, 복합 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 용기에서 고체 지지체 부착된 결합제에 첨가하고, 그 다음 엑소좀에 결합된 고체 지지체를 칼럼 상에 패킹하고, 세척 및 용리를 칼럼 상에서 수행한다.
일부 경우에, 엑소좀의 단리, 정제, 하위 분별 및 제거는 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드 또는 막에 부착된 결합제를 사용하여 수행된다. 이러한 경우에, 샘플을 고체 지지체에 부착된 결합제에 첨가하고, 그 다음 혼합하고, 고체 지지체를 분리하고, 액체 상을 제거하고, 세척하고, 세척 완충액을 제거하고, 용리 완충액을 첨가하고, 용리물을 제거하는 단계가 이어진다.
결합제와 엑소좀 상의 표적 단백질 간의 결합은 결합제와 엑소좀 상의 표적 단백질 간의 특이적 상호작용을 위한 최상의 다양한 생리학적 조건에서 수행된다. 결합된 엑소좀의 용리는 염 농도, pH, pI, 전하 및 이온 강도를 변화시킴으로써 직접적으로 또는 구배를 통해서 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나의 결합제를 사용하여 단리, 정제 또는 하위 분별된 샘플은 그 다음 상이한 결합제를 사용하여 가공된다.
일부 실시형태에서, 하나 초과의 칼럼이 연속적으로 사용되는데, 여기서 다수의 칼럼 각각은 상이한 표적 단백질에 특이적인 상이한 결합제를 함유한다.
일부 실시형태에서, 단일 칼럼이 다수의 결합제를 함유하고, 각각이 상이한 표적 단백질에 대해서 특이적이다.
일부 경우에, 결합제 및 고체 지지체는 주기적인 위생처리 단계의 도입에 의해서 재사용된다. 예를 들어, 이것은 프로필렌 글리콜, 아이소프로판올, 고 이온 농도 및/또는 수산화나트륨의 조합물로 위생처리될 수 있다.
6.1 샘플 제조
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 엑소좀을 포함하는 다양한 샘플로부터 엑소좀을 정제, 단리, 하위 분별 또는 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 엑소좀을 함유하는 정화된 수거 물질이다. 일부 경우에, 샘플은 당업계에 널리 공지된 정제 방법에 의해서 부분적으로 정제된 엑소좀을 포함한다. 예를 들어, 한외여과/투석여과, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 딥(deep) 여과 또는 이온 교환 결합/용리 크로마토그래피를 사용하여 친화성 정제를 위한 결합제를 적용하기 이전에 엑소좀을 부분적으로 정제시킬 수 있다.
일부 경우에, 부분적으로 정제된 물질은 결합제와의 목적하는 상호작용을 위한 특정 생리학적 조건(예를 들어, pH, 온도, 염 농도, 염 유형, 극성도)을 갖도록 추가로 가공된다. 샘플은 희석 또는 농축에 의해서 특정 엑소좀 농도를 얻음으로써 또는 부형제를 첨가하여 엑소좀의 구조를 변화시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 경우에, 부분적으로 정제된 물질은 임의의 조작 없이 결합제에 적용된다.
6.2. 결합
본 명세서에 기재된 방법은 엑소좀의 표적 단백질과 결합제 간의 특이적 상호작용이 필요하다. 고-처리량 스크리닝을 수행하여 염 농도, pH를 변화시키고/거나 유기 변형제, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 유레아를 사용하여 극성을 감소시킴으로써 특이적 결합을 위한 이상적인 완충제 조건을 식별할 수 있다. 표적 단백질과 결합제 간의 상호작용은 또한 샘플 조건(예를 들어, 크로마토그래피 수지의 부피당 로딩되는 샘플량, 엑소좀의 농도, 불순물의 농도), 로딩 완충액(예를 들어, pH, 염 농도, 염 유형, 극성), 및 다른 물리적 조건(예를 들어, 온도)에 따라서 변화될 수 있다. 추가로, 엑소좀의 구조를 변경시키는 부형제를 첨가하는 것이 또한 이들의 상호작용을 변화시킬 수 있다. 또한, 불순물과 엑소좀 간의 차동 흡수 속도를 기초로 체류 시간을 조정할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 다양한 정제 조건을 시험하여 이러한 단계를 위한 이상적인 조건을 식별할 수 있다.
유사한 접근법을 사용하여 순도 및 수율을 개선시키고, 엑소좀의 하위집단을 풍부화, 결핍 또는 단리시키는 것을 도울 수 있다. 로딩 도전(load challenge)을 최대화하고, 보다 엄격한 용리 조건을 적용하는 것과 함께, 이러한 특성을 사용하여 엑소좀의 농도를 추가로 향상시킬 수 있다.
6.2.1. 용리
엑소좀의 용리는 유기 변형제, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 유레아를 사용하여 염 농도, pH 및/또는 극성을 변경시킴으로써 달성될 수 있다.
엑소좀의 선택적인 용리는 고정된 pH에서, 1가 양이온성 할라이드 염(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 브로민화나트륨, 염화리튬, 아이오딘화나트륨, 브로민화칼륨, 브로민화리튬, 플루오린화나트륨, 플루오린화칼륨, 플루오린화리튬, 아이오딘화리튬, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 및 아이오딘화칼륨), 2가 또는 3가 염(예를 들어, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산칼슘, 황산나트륨, 황산마그네슘, 크롬 트라이클로라이드, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 인산칼륨, 황산칼륨, 인산나트륨, 염화제1철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 및 염화제2철) 또는 이들의 조합물의 증가 구배(단계적 또는 선형)의 사용을 통해서, 용리 완충액 중에서, 1가 양이온성 할라이드 염(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 브로민화나트륨, 염화리튬, 아이오딘화나트륨, 브로민화칼륨, 브로민화리튬, 플루오린화나트륨, 플루오린화칼륨, 플루오린화리튬, 아이오딘화리튬, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산리튬 및 아이오딘화 칼륨), 2가 또는 3가 염(예를 들어, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산칼슘, 황산나트륨, 황산마그네슘, 크롬 트라이클로라이드, 황산크롬, 시트르산나트륨, 염화철(III), 염화이트륨(III), 인산칼륨, 황산칼륨, 인산나트륨, 염화제1철, 시트르산칼슘, 인산마그네슘, 염화제2철) 또는 이들의 조합물의 농도를 증가사킴으로써 달성될 수 있다.
칼럼 로딩 단계 동안 불순물을 통해서 유동시키고, 선택적인 부형제 세척 동안 불순물을 용리시키고, 칼럼에 결합된 추가 불순물을 남겨두면서 용리 동안 생성물을 선택적으로 용리시킴으로써 상당한 엑소좀 순도가 달성될 수 있다. 칼럼 용해물로부터 측정된 흡광도는 이러한 방법에 의해서 획득된 엑소좀의 정제를 나타낼 수 있다.
용리는 또한 pH 범위, 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 쯔비터이온, 아미노산, 중합체, 온도 및 이들 중 임의의 조합을 조정함으로써 달성될 수 있다. 유사한 용리제를 사용하여 순도를 개선시키고, 수율을 개선시키고, 엑소좀의 하위 집단을 단리시킬 수 있다.
용리는 또한 상이한 특성, 예컨대, pH, 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 쯔비터이온, 아미노산, 중합체, 온도 및 이들 중 임의의 조합을 갖는 다수의 용리 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. 복수의 용리된 분획을 수집할 수 있는데, 여기서 각각의 분획에서 수집된 엑소좀은 상이한 특성을 갖는다. 예를 들어, 하나의 분획에서 수집된 엑소좀은 다른 분획 중의 엑소좀보다 더 높은 순도, 더 작거나 큰 평균 크기, 바람직한 조성 등을 갖는다.
복수의 용리된 분획이 수집되는 동안 상이한 특성을 갖는 용리 완충액이 연속식 유동으로서 적용될 수 있다. 등용매(isocratic) 용리 또는 구배 용리 동안 용리된 분획이 수집될 수 있다. 적어도 하나의 용리된 분획이 수집된 후, 용리된 분획의 조성을 분석할 수 있다. 예를 들어, 각각의 용리된 분획에서 엑소좀, 숙주 세포 단백질, 오염 단백질, DNA, 탄수화물 또는 지질의 농도를 측정할 수 있다. 각각의 용리된 분획 중의 엑소좀의 다른 특성을 또한 측정할 수 있다. 특성은 평균 크기, 평균 전하 밀도, 및 생체 분포와 관련된 다른 생리학적 특성, 세포 흡수, 반감기, 약력학, 효력, 투여, 면역 반응, 로딩 효율, 안정성 또는 다른 화합물에 대한 반응성을 포함한다.
6.2.2. 세척
선택적으로, 엑소좀의 순도는 용리 이전에 샘플을 세척함으로써 추가로 개선될 수 있다. 일부 실시형태에서, 부형제는 세척 완충제일 수 있다. 부형제 특정 pH 범위를 갖는 용액, 염, 유기 용매, 소분자, 세제, 쯔비터이온, 아미노산, 중합체 및 이들 중 임의의 조합물일 수 있다.
보다 구체적으로, 부형제는 아르기닌, 라이신, 글리신, 히스티딘, 칼슘, 나트륨, 리튬, 칼륨, 아이오다이드, 마그네슘, 철, 아연, 망간, 유레아, 프로필렌 글리콜, 알루미늄, 암모늄, 구아니디늄 폴리에틸렌 글리콜, EDTA, EGTA, 세제, 클로라이드, 설페이트, 카복실산, 시알산, 포스페이트, 아세테이트, 글리신, 보레이트, 폼에이트, 퍼클로레이트, 브로민, 나이트레이트, 다이티오트레이톨, 베타 머캅토에탄올 또는 트라이-n-부틸 포스페이트를 포함할 수 있다.
부형제는 또한 세틸 트라이메틸암모늄 클로라이드, 옥톡시놀-9, TRITON(상표명) X-100(즉, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에터) 및 시그마-알드리치사로부터 입수 가능한 TRITON(상표명) CG-110; 소듐 도데실 설페이트; 소듐 라우릴 설페이트; 데옥시콜산; 폴리솔베이트 80(즉, 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레에이트); 폴리솔베이트 20(즉, 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노라우레이트); 알코올 에톡실레이트; 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에터; 데실 글루코사이드; 옥토글루코사이드; SafeCare; 다우 케미컬사(DOW Chemical)로부터 입수 가능한 ECOSURF(상표명) EH9, ECOSURF(상표명) EH6, ECOSURF(상표명) EH3, ECOSURF(상표명) SA7, 및 ECOSURF(상표명) SA9; 바스프사(BASF)로부터 입수 가능한 LUTENSOL(상표명) M5, LUTENSOL(상표명) XL, LUTENSOL(상표명) XP 및 APG(상표명) 325N; 에어 프로덕츠사(AIR PRODUCTS)로부터 입수 가능한 TOMADOL(상표명) 900; 크로다사(CRODA)로부터 입수 가능한 NATSURF(상표명) 265; 베스트켐사(Bestchem)로부터 입수 가능한 SAFECARE(상표명)1000, 다우사(DOW)로부터 입수 가능한 TERGITOL(상표명) L64; 카프릴산; 루브리졸사(Lubrizol)로부터 입수 가능한 CHEMBETAINE(상표명) LEC; 및 Mackol DG로 이루어진 군으로부터 선택된 세제를 포함할 수 있다.
6.3. 결과를 개선시키기 위한 다른 방법
크로마토그래피 수지의 부피당 로딩될 수 있는 엑소좀의 양은 공급 물질을 조정함으로써, 예를 들어, 엑소좀의 농도를 증가시키거나, 불순물의 농도를 감소시키거나, pH를 변경시키거나, 염 농도를 감소시키거나, 이온 강도를 감소시키거나 또는 엑소좀의 특정 하위 집단을 변경시킴으로써 개선될 수 있다. 질량 전달 제약 및 수지 상의 엑소좀의 느린 흡착 및 탈착으로 인해서, 크로마토그래피 수지의 부피당 로딩될 수 있는 엑소좀의 양은 칼럼 로딩 동안 유량을 느리게 함으로써, 더 긴 칼럼을 사용하여 체류 시간을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
7. 응용
7.1. 엑소좀의 정제
의학 용도를 위한 엑소좀의 사용은, 엑소좀이 거대분자, 예컨대, 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물, 소분자, 금속 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 불순물이 존재하지 않거나 거의 존재하지 않을 것이 요구된다. 본 발명은 오염 거대분자로부터 엑소좀을 정제시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 정제된 엑소좀은 오염 거대분자가 실질적으로 존재하지 않는다.
7.2. 엑소좀의 하위 분별
본 발명의 실시형태는 막 단백질, 크기, 전하 밀도, 리간드 유형(예를 들어, 테트라스파닌) 및 헤파린 또는 다른 설페이트화된 탄수화물 결합 부위를 기초로 엑소좀의 집단을 하위 분별시키는 방법을 추가로 제공한다. 친화성 태그, 로딩 및 용리 완충액 조성물 및 프로토콜의 선택이 엑소좀의 상이한 하위 집단의 용리를 초래할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 실시형태는 더 작거나 더 큰 크기를 갖는 엑소좀의 집단을 정제시키는 방법을 제공한다. 엑소좀의 크기는 당업계에 입수 가능한 방법에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, 크기는 나노입자 트래킹(tracking) 분석, 다각 광산란, 단일각 광산란, 크기 배제 크로마토그래피, 분석용 초원심분리, 장 흐름 분별법(field flow fractionation), 레이저 회절, 조정 가능한 저항성 펄스 감지(tunable resistive pulse sensing) 또는 동적 광산란에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명의 실시형태는 추가로 전하 밀도에 기초하여 엑소좀을 하위 분별시키는 방법에 관한 것이다. 엑소좀의 전하 밀도는 전위차 적정, 음이온 교환, 양이온 교환, 등전점 전기영동(isoelectric focusing), 제타 전위(zeta potential), 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), 모세관 영역 전기 영동(capillary zone electrophoresis), 겔 전기영동에 의해서 결정될 수 있다.
본 발명의 실시형태는 또한 다른 생리학적 특성, 예컨대, 생체 분포, 세포 흡수, 반감기, 약력학, 효력, 투여, 면역 반응, 로딩 효율, 안정성 또는 다른 화합물에 대한 반응성에 기초하여 엑소좀을 하위 분별시키는 것에 관한 것이다. 방법은 특정 응용에 적절한 엑소좀의 집단의 단리를 가능하게 한다.
8. 엑소좀의 특징규명
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 각각의 수집된 분획 내에 함유된 엑소좀을 특징규명하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀의 함량은 연구 및 특징규명을 위해서 추출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 크기, 형상, 모폴로지 또는 분자 조성, 예컨대, 핵산, 단백질, 대사산물 및 지질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 지표에 의해서 단리 및 특징규명된다.
8.1. 엑소좀의 함량의 측정
엑소좀은 단백질, 펩타이드, RNA, DNA 및 지질을 포함할 수 있다. 전체 RNA는 산-페놀:클로로폼 추출을 사용하여 추출될 수 있다. 이어서, RNA는 전체 RNA를 함유하는 작은-RNA를 회수하거나 또는 더 긴 RNA 종, 예컨대 mRNA로부터 200개 미만의 뉴클레오타이드의 작은 RAN 종을 분리하는 조건 하에서 유리-섬유 필터를 사용하여 정제될 수 있다. RNA는 작은 부피로 용리되기 때문에, RNA의 단리를 위해서 알코올 침전 단계가 필요하지 않을 수 있다.
엑솜 조성물은 전사체학(transcriptomics), 서열분석(sequencing), 프로테오믹스(proteomics), 질량 분광분석법 또는 HP-LC를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법에 의해서 평가될 수 있다.
단리된 엑소좀(RNA 및 DNA 포함)과 회합된 뉴클레오타이드의 조성물은 당업자에게 널리 공지된 다양한 기술(예를 들어, 정량 또는 반정량 RT-PCR, 노던 블롯 분석, 용액 혼성화 검출)을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 RNA의 수준은 엑소좀 조성물로부터 RNA를 역전사시켜 표적 올리고데옥시뉴클레오타이드의 세트를 제공하고, 표적 올리고데옥시뉴클레오타이드를 하나 이상의 RNA-특이적 프로브 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, RNA-특이적 프로브 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 마이크로어레이)에 혼성화시켜 엑소좀 조성물에 혼성화 프로파일을 제공하고, 엑소좀 조성물 혼성화 프로파일을 대조군 샘플로부터 생성된 혼성화 프로파일과 비교함으로써 측정된다. 대조군 샘플에 대한 시험 샘플 중의 적어도 하나의 RNA의 신호의 변경이 RNA 조성을 나타낸다.
또한, 마이크로어레이는 공지된 RNA 서열로부터 생성된 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브로부터 제조될 수 있다. 어레이는 각각의 RNA에 대해서 2개의 상이한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 함유할 수 있는데, 하나는 활성 성숙 서열을 함유하고, 나머지는 RNA(예를 들어 miRNA 및 프리(pre)-miRNA)에 대해서 특이적이다. 어레이는 또한 대조군, 예컨대, 몇몇 염기만 인간 오쏘로그와 상이한 하나 이상의 마우스 서열을 함유할 수 있는데, 이것은 혼성화 엄격성 조건에 대한 대조군으로서 제공될 수 있다. 두 종 모두로부터의 tRNA 및 다른 RNA(예를 들어, rRNA, mRNA)가 또한 마이크로칩 상에 인쇄되어, 특이적 혼성화에 대한 내부의 비교적 안정한 양성 대조군을 제공할 수 있다. 비-특이적 혼성화를 위한 하나 이상의 적절한 대조군이 또한 마이크로칩 상에 포함될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 서열은 임의의 공지된 RNA와의 임의의 상동성의 부재를 기초로 선택된다.
마이크로어레이는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 적절한 길이, 예를 들어, 40개의 뉴클레오타이드의 프로브 올리고뉴클레오타이드는 위치 C6에서 변형된 5'-아민이고, 상업적으로 입수 가능한 마이크로어레이 시스템, 예를 들어, GeneMachine OmniGrid.(상표명).100 Microarrayer 및 Amersham CodeLink.(상표명)를 사용하여 활성화된 슬라이드 상에 인쇄된다. 표적 RNA에 상응하는 표지된 cDNA 올리고머는 표지된 프라이머를 갖는 표적 RNA를 역전사시킴으로써 제조된다. 첫 번째 가닥의 합성 후에, RNA/DNA 혼성체는 변성되어 RNA 주형을 절단한다. 이어서, 이렇게 제조된 표지된 표적 cDNA는 혼성화 조건 하에서, 예를 들어, 25℃에서 6배의 SSPE/30% 폼아마이드 중에서 18시간 동안, 그 다음 0.75배의 TNT 중에서 37℃에서 40분 동안 세척함으로써 마이크로어레이에 혼성화된다. 고정된 프로브 DNA가 샘플 중의 상보성 표적 cDNA를 인식하는 어레이 상의 위치에서, 혼성화가 일어난다. 표지된 표적 cDNA는 결합이 일어나는 어레이 상의 정확한 위치를 표시하여, 자동 검출 및 정량이 가능하다. 결과는 혼성화 사건의 목록으로 이루어지는데, 이것은 특정 cDNA 서열의 상대적인 존재비(abundance)을 나타내고, 따라서 엑소좀 제제 중의 상응하는 상보성 RNA의 상대적인 존재비를 나타낸다. 일 실시형태에 따라서, 표지된 cDNA 올리고머는 바이오틴-표지된 프라이머로부터 제조된 바이오틴-표지된 cDNA이다. 이어서, 마이크로어레이는 예를 들어, 스트렙타비딘-알렉사647 접합체를 사용하여 바이오틴 함유 전사체를 직접 검출하고, 종래의 스캐닝 방법을 사용하여 스캐닝함으로써 가공된다. 어레이 상의 각각의 스팟의 영상 강도는 엑소좀 중의 상응하는 RNA의 존재비에 비례한다.
데이터 마이닝(data mining) 작업은 스캐닝 칩, 신호 획득, 영상 처리, 정규화, 통계학적 처리 및 데이터 비교뿐만 아니라 경로 분석을 비롯한, 바이오인포매틱스에 의해서 완결된다. 이와 같이, 마이크로어레이는 수 백 및 수 천개의 폴리뉴클레오타이드를 고 처리율 성능으로 동시에 프로파일링할 수 있다. mRNA 발현의 마이크로어레이 프로파일링 분석은 기본적인 연구에서 유전자 발현 연구를 위한 가치있는 데이터를 성공적으로 제공하였다. 그리고 이러한 기술은 약제학적 산업 및 임상 진단에서 추가로 실행되었다. 사용 가능해지는 miRNA 데이터의 양의 증가 및 유전자 조절에서의 miRNA의 중요성의 증거가 축적됨에 따라서, 마이크로어레이는 고 처리율 miRNA 연구를 위한 유용한 기술이 된다. 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용한 miRNA 수준의 분석이 마찬가지로 다양한 물리적 포맷으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트 또는 자동화의 사용은 상당한 수의 시험 샘플의 가공을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다.
8.2. 엑소좀의 크기 측정
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 정제된 분획 중에 포함된 엑소좀 및/또는 엑소좀의 집단의 크기를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 크기는 가장 긴 측정 가능한 치수로서 측정된다. 일반적으로, 엑소좀의 가장 긴 일반적인 치수는 또한 이의 직경이라고 지칭된다.
엑소좀 크기는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 나노입자 트래킹 분석, 다각 광산란, 단일각 광산란, 크기 배제 크로마토그래피, 분석용 초원심분리, 장 흐름 분별법, 레이저 회절, 조정 가능한 저항성 펄스 감지 또는 동적 광산란을 사용함으로써 측정될 수 있다.
엑소좀 크기는 동적 광산란(DLS) 및/또는 다각 광산란(MALS)을 사용하여 측정될 수 있다. 엑소좀의 크기를 측정하기 위한 DLS 및/또는 MALS의 사용 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 나노입자 트래킹 검정(예를 들어, Malvern Nanosight NS300 나노입자 트래킹 장치를 사용한 NTA)을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 엑소좀 크기는 Malvern Nanosight NS300을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 (예를 들어, Malvern NanosightNS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 (예를 들어, Malvern NanosightNS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 90%는 (예를 들어, Malvern Nanosight NS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 95%는 (예를 들어, Malvern Nanosight NS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 99%는 (예를 들어, Malvern Nanosight NS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 90%는 (예를 들어, Malvern Nanosight NS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 95%는 (예를 들어, Malvern Nanosight NS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 99%는 (예를 들어, Malvern Nanosight NS300을 사용하여) NTA에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다.
엑소좀 크기는 조정 가능한 저항성 펄스 감지(TRPS)를 사용하여 측정될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, TRPS에 의해서 측정되는 경우 엑소좀 크기는 iZON qNANO Gold를 사용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 TRPS(예를 들어, iZON qNano Gold)에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 90%는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 95%는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 99%는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 90%는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 95%는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 99%는 (예를 들어, iZON qNano Gold를 사용하여) TRPS에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다.
엑소좀 크기는 전자 현미경을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀 크기를 측정하는 데 사용되는 전자 현미경 방법은 투과 전자 현미경이다. 구체적인 실시형태에서, 엑소좀 크기를 측정하는 데 사용되는 투과 전자 현미경은 Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN이다. 전자 현미경을 사용하여 엑소좀 크기를 측정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 임의의 이러한 방법이 엑소좀 크기를 측정하는 데 적절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 90%는 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 95%는 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 99%는 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 20 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 90%는 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 95%는 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀 집단은 집단을 포함하는데, 여기서 상기 엑소좀의 99%는 주사 전자 현미경(예를 들어, Tecnai(상표명) G2 Spirit BioTWIN 주사 전자 현미경)에 의해서 측정되는 경우 약 40 내지 1000㎚의 가장 긴 치수를 갖는다.
8.3. 엑소좀의 전하 밀도의 측정
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 정제된 분획 중에 포함된 엑소좀 및/또는 엑소좀의 집단의 전하 밀도를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전하 밀도는 전위차 적정, 음이온 교환, 양이온 교환, 등전점 전기영동, 제타 전위, 모세관 전기영동, 모세관 영역 전기 영동 또는 겔 전기영동에 의해서 결정된다.
8.4. 엑소좀 단백질의 밀도의 측정
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 엑소좀 표면 상의 엑소좀 단백질의 밀도를 측정하는 것을 포함한다. 표면 밀도는 단위면적당 질량, 면적당 단백질의 수, 엑소좀당 분자의 수 또는 분자 신호의 강도, 단백질의 몰량 등으로서 계산되거나 제공될 수 있다. 표면 밀도는 당업계에 공지된 방법에 의해서, 예를 들어, 생물층 간섭계법(BLI), FACS, 웨스턴 블로팅, 형광(예를 들어, GFP-융합 단백질) 검출, 나노-유세포 분석법, ELISA, 알파LISA를 사용함으로써 그리고/또는 단백질 겔 상의 밴드를 측정함으로써 농도계에 의해서 실험에 의해서 측정될 수 있다.
9. 실시예
하기 실시예는 본 발명을 제조 및 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하도록 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하도록 의도되지 않고, 하기 실험이 수행되는 전부이거나 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해서 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 제시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다. 표준 약어, 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); nt, 뉴클레오타이드(들) 등이 사용될 수 있다.
달리 제시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 기술 내의 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술, 약리학의 종래의 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); AL. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 21th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 2005); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)] 참고).
9.1. 실시예 1: 엑소좀 단백질의 식별
9.1.1. 엑소좀의 수집
엑소좀을 9일 후에 HEK293 SF 세포의 고밀도 현탁 배양물의 상청액으로부터 수집하였다. 상청액을 여과시키고, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해서 분별시키고, 염화나트륨의 단계적 구배로 용리시켰다. 최고 단백질 농도를 갖는 피크 분획은 엑소좀 및 오염 세포 성분을 함유하였다. 피크 분획을 단리시키고, 초원심분리에 의해서 Optiprep(상표명)(60% 아이오딕산올 w/v) 밀도 구배 상에서 추가로 분별시켰다.
엑소좀 분획을 초원심분리에 의해서 SW 32 Ti 로터용의 38.5㎖ Ultra-Clear(344058) 튜브 내에서 133,900×g로 4℃에서 3시간 동안 농축시켰다. 펠릿화된 물질을 1㎖의 PBS 및 3㎖의 Optiprep(상표명) 중에 재현탁시켜, 45%의 최종 아이오딕산올 농도를 만들었다. Optiprep(상표명) 구배를 위해서, SW 41 Ti 로터용의 12㎖ Ultra-Clear(344059) 튜브 내에서 재현탁된 물질을 함유하는 4㎖의 45% 아이오딕산올, 3㎖의 30% 아이오딕산올, 2㎖의 22.5% 아이오딕산올, 2㎖의 17.5% 아이오딕산올, 및 1㎖의 PBS를 사용하여 4-역가 멸균 구배를 제조하였다. Optiprep(상표명) 구배를 150,000×g로 4℃에서 16시간 동안 초원심분리시켜 엑소좀 분획을 분리하였다. 초원심분리는 엑소좀을 함유한다고 알려진 상부 분획, 중간 밀도의 세포 부스러기를 함유하는 중간 분획, 및 고밀도 응집물 및 세포 부스러기를 함유하는 하부 분획을 초래하였다(도 1). 이어서, 엑소좀 층을 튜브의 상부 약 3㎖로부터 조심스럽게 수집하였다.
엑소좀 분획을 38.5㎖ Ultra-Clear(344058) 튜브 내에서 약 32㎖의 PBS 중에 희석시키고, 133,900×g로 4℃에서 3시간 동안 초원심분리시켜 정제된 엑소좀을 펠릿화시켰다. 이어서 펠릿화된 엑소좀을 최소 부피의 PBS(약 200㎕) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 저장하였다.
9.1.2. LC-MS/MS 분석을 위한 샘플 제조
엑소좀에 대해서 특이적인 단백질을 결정하기 위해서, Optiprep(상표명) 구배의 상부 분획 및 하부 분획을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석법에 의해서 분석하였다. 모든 샘플을 인산염 완충 염수(PBS) 완충액 또는 PBS 및 5% 수크로스 중에서 제공받았다. 분석 전에, 각각의 샘플의 전체 단백질 농도를 바이신코닌산(bicinchoninic acid: BCA) 검정에 의해서 결정하고, 그 후 각각의 샘플을 PBS 완충액 중에서 125㎍/㎖로 적절하게 희석시켰다. 다음으로, 50.0㎕의 각각의 샘플을 동일 부피의 엑소좀 용해 완충액(60mM Tris, 400mM GdmCl, 100mM EDTA, 20mM TCEP, 1.0% Triton X-100)을 함유하는 별도의 1.5㎖의 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 그 다음 2.0㎕의 1.0% Triton X-100 용액을 전달하였다. 이어서, 모든 샘플을 55℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다.
1250㎕의 에탄올을 -20℃에서 첨가함으로써 단백질 침전을 수행하였다. 효율을 개선시키기 위해서, 샘플을 대략 10분 동안 격렬하게 보텍싱시키고, 이어서 -20℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 5분 동안 수욕 중에서 초음파처리하였다. 5분 동안 15,000g로 4℃에서 원심분리시킴으로써 침전된 물질을 펠릿화시켰다. 상청액을 경사분리시키고, 펠릿화된 물질을 질소 기체를 사용하여 완전히 건조시켰다. 펠릿을 30.0㎕의 소화 완충액(30mM Tris, 1.0M GdmCl, 100mM EDTA, 50mM TCEP, pH 8.5) 중에 재현탁시켰는데, 이것은 또한 다이설파이드 결합을 환원시켰다. 5.0㎕의 알킬화 용액(375mM 아이오도아세트아마이드, 50mM Tris, pH 8.5)을 첨가함으로써 유리 시스테인 잔기를 알킬화시키고, 생성된 용액을 실온 암실에서 적어도 30분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 각각의 샘플을 30.0㎕의 50mM Tris pH 8.5를 사용하여 희석시키고, 2.0㎍의 트립신을 첨가함으로써 단백질분해 소화를 개시시켰다. 모든 샘플을 혼합하고, 이어서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 5.0㎕의 10% 폼산을 첨가함으로써 트립신 활성을 중단시켰다. LC-MS/MS에 의한 분석 전에, 각각의 샘플을 Pierce C18 스핀 칼럼을 사용하여 탈염시켰다. 이 과정 이후에, 각각의 샘플을 건조시키고, 0.1% 폼산을 함유하는 50.0㎕의 물 중에 재구성시키고, 분석용 HPLC 바이알로 옮겼다.
9.1.3. LC-MS/MS 분석
샘플을 UltiMate 3000 RSCLnano(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific)) 저 유동 크로마토그래피 시스템에 주입시키고, 1.000㎕/min의 유량에서 로딩 이동상(MPL: 물질, 0.1% 폼산)을 사용하여 트립신 처리 펩타이드를 Acclaim PepMap 100 C18 트랩핑 칼럼(75㎛×2㎝, 3㎛ 입자 크기, 100Å 공극 크기, 써모 피셔 사이언티픽사) 상에 로딩하였다. 펩타이드를 용리시키고, 이동상 A(MPA: 물질, 0.1% 폼산) 및 이동상 B(MPB: 아세토나이트릴, 0.1% 폼산)의 구배를 사용하여 EASY-Spray C18 분석용 칼럼(75㎛×25㎝, 2㎛ 입자 크기, 100Å 공극 크기, 써모 피셔 사이언티픽사)을 통해서 300nL/min의 유량에서 분리시켰다. 용리를 위해서 사용되는 단계식 구배는 2% MPB에서 시작하였으며, 여기서 그것을 로딩 동안 8분 동안 유지시켰다. 이어서, MPB의 백분율을 35분에 걸쳐서 2에서 17%로, 다시 45분에 걸쳐서 17에서 25%로, 마지막으로 10분에 걸쳐서 25에서 40%로 증가시켰다. 5분에 걸쳐서 MPB를 98%로 증가시키고, 10분 동안 유지시킴으로써 대부분의 소수성 종을 제거하였다. 방법에 대한 총 실시 시간은 135분이었고, 이러한 시간은 칼럼 재평형화에 충분한 시간을 허용하였다. 동일하지 않은 분석용 주입 사이에 세척 사이클을 수행하여 캐리오버(carry-over)를 최소화하였다.
Q Exactive Basic(써모 피셔 사이언티픽사) 질량 분석계를 사용하여 질량 분석을 수행하였다. 70,000의 분해능에서 400 내지 1600Da의 m/z 범위에 걸쳐서 전구체 이온 질량 스펙트럼을 측정하였다. 10개의 가장 강력한 전구체 이온을 선택하고, 27의 충돌 에너지를 사용하여 HCD 세포에서 단편화시키고, 35,000의 분해능에서 MS/MS 스펙트럼을 200 내지 2000Da의 m/z 범위에 걸쳐서 측정하였다. 2 내지 4의 전하 상태를 갖는 이온을 단편화를 위해서 선택하고, 동적 제외 시간을 30초로 설정하였다. 14개의 일반적인 폴리실록산을 함유하는 제외 목록을 사용하여 공지된 오염물의 식별오류를 최소화하였다.
9.1.4. 데이터 처리
단백질을 Proteome Discoverer 소프트웨어(버전 2.1.1.21, 써모 피셔 사이언티픽사)를 사용하여 먼저 식별 및 정량(라벨 없음)하고, Sequest HT 알고리즘을 Target Decoy PSM Validator와 조합하였다. 완전 Swiss-Prot 호모 사피엔스(full Swiss-Prot Homo sapiens)(분류학 9606 버전 2017-05-10: 42,153 엔트리) 참고 데이터베이스, 뿐만 아니라 E1a 단백질(7 엔트리)을 함유하는 통상의 Uniprot 데이터베이스에 대해서 검색을 수행하였다. 하기 검색 파라미터를 사용하였다: 효소, 트립신; 최대 2개의 누락된 절단; 6개 잔기의 최소 펩타이드 길이; 10ppm의 전구체 질량 오차; 및 0.02Da의 단편 질량 오차. 검색은 또한 특정 동적 변형(M의 산화; N 또는 Q의 탈아마이드화; S, T 또는 Y의 인산화; 펩타이드-말단 E의 파이로-글루타메이트화(pyro-glutamation); 및 단백질 N 말단의 아세틸화) 및 고정 변형(C의 카바마이도메틸화)을 포함하였다.
Target Decoy PSM Validator에서, 최대 델타 Cn 및 엄격 및 관대한 표적 오류 발견율(false discovery rate: FDR)을 1로 설정하였는데, 그 이유는 데이터가 스캐폴드 소프트웨어(버전 4.8.2, 프로테옴 소프트웨어사(Proteome Software Inc.))를 사용하여 다시 검색되었기 때문이었다. 스캐폴드에서, 또한 X! 탠덤 오픈 소스 알고리즘(X! Tandem open source algorithm)을 사용하여 데이터를 검색하여 99.0%의 단백질 역치, 최소 2개의 펩타이드, 및 95%의 펩타이드 역치를 사용하여 단백질을 식별하였다.
신규 엑소좀-특이적 단백질의 동일성을 결정하기 위해서, 전체 펩타이드 스펙트럼 매치(PSM)를, Optiprep(상표명) 구배의 상부 엑소좀 분획에서 발견된 단백질과 더 아래 분획에서 발견된 단백질에 대해서 비교하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상부-분획 단백질(Y축) 및 하부 분획 단백질(X축) 사이에 약한 상관관계가 존재하였다. 점선 위에 플로팅된 단백질은 엑소좀-풍부 단백질을 나타내는 반면, 점선 아래의 단백질은 오염물-풍부 단백질을 나타낸다. 중요하게는, (1) 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), (2) basigin(BSG), (3) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 3(IGSF3), (4) 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 8(IGSF8), (5) 인테그린 베타-1(ITGB1), (6) 인테그린 알파-4(ITGA4), (7) 4F2 세포-표면 항원 중쇄(SLC3A2) 및 (8) ATP 수송체 단백질의 부류(ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3, ATP1A4, ATP1B3, ATP2B1, ATP2B2, ATP2B3, ATP2B4)를 비롯한, 엑소좀 분획에 상당히 풍부하다고 식별된 다수의 막-연관 단백질이 존재하였다. 도 3 내지 도 5에서 트립신 처리 펩타이드 커버리지 맵에 도시된 바와 같이, 질량 분광분석법 연구는 PTGFRN(도 3), IGSF8(도 4), 및 Basigin(도 5)의 넓은 커버리지를 초래하였다. 함께, 이러한 결과는, 이질(heterogeneous) 집단으로부터 엑소좀을 정제하는 데 유용할 수 있거나 또는 조작된 엑소좀의 생성에 있어서 스캐폴드로서 사용하는 데 유용할 수 있는 정제된 엑소좀 집단에 풍부한 다수의 막관통 단백질이 존재함을 입증한다.
9.2. 실시예 2: 표면 단백질 발현의 검증
질량 분광분석법 연구에서 식별된 엑소좀-특이적 단백질이 엑소좀의 표면 상에 상당히 풍부하다는 것을 확인하기 위해서, HEK293 세포로부터의 전체 세포 용해물 및 정제된 엑소좀 집단 상에서 단백질 블로팅을 수행하였다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 전체 단백질 패턴은 전체 세포 용해물(좌측)과 엑소좀 용해물(우측) 사이에 상당히 상이하였다. 구체적으로, 엑소좀 용해물에서 약 110kDa에서 강한 밴드가 존재하였는데, 이것은 전체 세포 용해물에 존재하지 않는 것이었다. PTGFRN에 대한 웨스턴 블롯은, 엑소좀 용해물에서의 110kDa의 예측된 크기에서의 밴드를 나타내었고, 이 밴드는 세포 용해물에는 존재하지 않았는데(도 6B), 이는, PTGFRN이 엑소좀에 상당히 풍부하며, 전체 엑소좀 용해물에서 육안으로 검출 가능할 수 있음을 나타낸다.
질량 분광분석법 연구는 몇몇 신규 엑소좀-연관 막 단백질의 존재를 나타내었다. 이러한 연관을 추가로 확인하기 위해서, 엑소좀 분획을 자가 형성 Optiprep(상표명) 구배 상에서 정제시키고, 웨스턴 블롯에 의해서 분석하였다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, 전체 단백질은 구배의 모든 분획에서 검출되며, 엑소좀 마커 단백질 Alix 및 Syntenin은 분획 2 내지 6에서 풍부하다. 중요하게는, 분석된 신규 표면 마커 단백질 각각은 이러한 동일한 분획에서 풍부하였는데, 이는 엑소좀과 강하고 특이적으로 연관됨을 나타낸다(도 7B). 이러한 막관통 단백질이 엑소좀에서 높게 발현되고, 풍부하다는 입증은, 이러한 단백질 중 임의의 것에 대해서 지향되는 결합제를 사용함으로써 엑소좀을 정제시킬 기회를 제공할 뿐만 아니라 이러한 신규 단백질 중 임의의 것에 접합되는 이질 단백질을 함유하는 고 발현 표면-변형된 엑소좀을 생성시킬 기회를 제공한다(도 8).
9.3. 실시예 3: PTGFRN의 도메인 특징규명
PTGFRN, BSG, IGSF3 및 IGSF8은 세포외/소포외(extravesicular) 환경에 대면하는 N-말단 및 C-말단을 갖는 모든 타입 I 싱글-패스(single-pass) 막관통 단백질이고, 이것은 도 8에 도시된 바와 같이 적어도 2개의 면역글로불린 V(IgV) 반복부를 함유한다. PTGFRN은 도 2에 도시된 질량 분광분석법에서 검출된 가장 고도로 풍부한 표면 단백질이었다. GFP와 전장 PTGFRN 또는 도 9A 및 도 9B에 기재된 PTGFRN의 다양한 IgV 절두 변이체 간의 융합 단백질을 암호화하는 발현 작제물은 HEK293 세포에서 안정적으로 발현되었다. 엑소좀을 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 HEK293 세포 배양물로부터 단리시키고, 항-GFP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해서 분석하였다. 도 9B에 도시된 바와 같이, GFP와 전장 또는 절두된 PTGFRN 간의 융합 단백질의 발현은 정제된 엑소좀에서 검출되었다. 흥미롭게도, 제1 IgV 도메인의 결실은 전장 단백질의 과발현으로 검출 가능하지 않은 더 낮은 분자량 밴드("절단된 생성물"이라고 표시됨)를 초래하였다. 이러한 더 작은 생성물은 모든 절두 변이체에서 일관되게 검출되었는데, 이는 그것이 프로테아제 절단의 결과로서 생성되었음을 시사한다. 다양한 GFP-PTGFRN 융합 단백질을 함유하는 엑소좀을 SDS-PAGE mini-PROTEAN(등록상표) TGX Stain-Free Gel(바이오라드사(Bio-Rad, Inc.)) 상에서 분석하여 전체 엑소좀 단백질을 측정하였다. 결과를 도 10에 제공한다. GFP 및 전장 PTGFRN의 융합 단백질의 발현은 쉽게 검출 가능하였고, 정제된 엑소좀에서 전체 단백질의 약 50%만큼 높은 수준으로 매우 풍부하였다(레인 2). 더 낮은 분자량의 절단 생성물("절단된 생성물"이라고 표시)은 명확하게 보이지 않았기 때문에, 네이티브 엑소좀 또는 전장 PTGFRN을 과발현하는 엑소좀(레인 1 및 레인 2)에 존재하지 않았는데, 이는 단백질의 N-말단에서의 제1 IgV 도메인(IgV 1)이 PTGFRN의 절단을 예방할 수 있다는 것을 시사한다.
이어서 전장 PTGFRN 및 다양한 절두된 PTGFRN 돌연변이체는 HEK293 세포에서 N-말단 FLAG 태그와 함께 안정적으로 발현되었다(도 11A). 세포 배양물로부터의 엑소좀을 수집하고, 웨스턴 블롯에 의해서 항-FLAG 항체를 사용하여 분석하였다. 결과를 도 11B에 제공한다. C-말단에 GFP를 함유하는 융합 단백질과 대조적으로(도 9 및 도 10), N-말단에 FLAG 태그를 함유하는 융합 단백질은 저분자량 밴드(도 11B에서 "절단 생성물 없음"이라고 표시)를 생성시키지 않았고, 더 짧은 절두체가 낮은 수준으로 검출되었다. 이러한 결과는, 절단 사건이 웨스턴 블롯을 위해서 사용되는 FLAG 에피토프에 연결된 단백질의 N-말단을 제거할 가능성이 있음을 시사한다(도 11B).
도 6A 및 도 6B에 제공된 웨스턴 블롯 결과에 의해서 시사된 바와 같이, PTGFRN은 세포 용해물에서 불량하게 검출되고, 무손상 PTGFRN과 절단된 PTGFRN의 혼합물이 정제된 엑소좀에서 검출된다. 이는, PTGFRN은 엑소좀막에 국지화 및 통합되는 동안 또는 엑소좀의 형성 동안 절단된다는 것을 시사한다. ADAM10(A Disintegrin And Metalloproteinase Domain 10)은 종래의 엑소좀 단백질 및 막-연관 메탈로프로테아제이다. HEK293 세포에 Cas9 및 ADAM10 유전자좌를 표적으로 하는 4종의 가이드 RNA(CRISPR32174_SG, CRISPR726928_SG, CRISPR726931_SG 및 CRISPR726933_SG, 써모 피셔 사이언티픽사)를 형질주입시켜 ADAM10 넉아웃 세포를 생성시켰다. 이어서 ADAM10 넉아웃 세포(ADAM 10 -) 또는 야생형 세포(ADAM10 +)에 GFP에 융합된 전장 PTGFRN을 함유하는 융합 단백질 또는 GFP에 융합된 첫 번째 3개의 IgV 도메인이 결핍된 절두된 PTGFRN을 함유하는 상이한 융합 단백질(PTGFRN_IgV3-GFP)을 암호화하는 작제물을 안정적으로 형질주입시켰다. 엑소좀을 이러한 세포로부터 단리시키고, 항-GFP 항체를 사용하여 전체 단백질 PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해서 융합 단백질의 발현을 측정하였다. 도 12A는 전체 단백질의 대등한 양을 각각의 레인에 로딩한 것을 나타낸다. 항-ADAM10 항체(ab124695; 압캄사)를 사용한 웨스턴 블롯은 넉아웃 세포에서 ADAM 10의 효율적인 결실을 나타내었다(도 12B). 항-GFP 항체를 사용한 웨스턴 블롯은, 도 12C(레인 1 및 레인 2)에 제공된 바와 같이 야생형(ADAM10 +) 및 ADAM10 넉아웃 세포(ADAM10 -) 둘 다에서 전장 PTGFRN 및 GFP를 함유하는 융합 단백질의 높은 수준 발현을 나타내었다. 이러한 결과는, 전장 PTGFRN을 함유하는 융합 단백질의 절단이 검출되지 않은 도 9B의 결과와 일치한다. 흥미롭게도, PTGFRN_IgV3-GFP에 대해서 이미 검출된 절단 생성물은 야생형 세포에서 검출되었지만, ADAM10 넉아웃 세포에는 존재하지 않았다(도 12C, 레인 3 및 레인 4). 이는, ADAM10이 엑소좀성 PTGFRN 단편의 절단을 매개한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 또한, 절두된 PTGFRN 단편을 함유하는 융합 단백질은 ADAM10이 결핍된(ADAM10 -) 세포로부터의 엑소좀 상에서 보다 성공적으로 발현될 것이라는 것을 시사한다.
PTGFRN은 고밀도 엑소좀 데코레이션(decoration)/로딩을 위한 매력적인 융합 파트너로서 사용될 수 있지만, 크기(약 100kDa)로 인해서, 큰 생물학적 활성 분자의 공동 발현을 허용하기 위해서 더 작은 절두된 버전이 바람직할 것이다. IgV 절두 돌연변이체 각각에서 검출된 ADAM10-의존적 절단은 고밀도 로딩을 위한 문제를 제시하는데, 그 이유는 임의의 융합 단백질의 특정 백분율이 엑소좀 표면으로부터 절단되어, 로딩/디스플레이 정도를 감소시킬 것이기 때문이다. 프로테아제 절단을 겪지 않고 고밀도 엑소좀 표면 디스플레이를 가능하게 하는 최소 PTGFRN 단편을 식별하기 위해서, 6개의 IgV 도메인 중 5개가 결핍된 PTGFRN(PTGFRN_IgV6)을 FLAG 태그에 대한 융합부 및 융합 파트너 단백질로서 발현시켰다(도 13). PTGFRN_IgV6을 함유하는 융합 단백질의 발현은 이미 식별된 예측된 절단 생성물을 산출하였다(도 14B, #451). 한 번에 4개의 추가 아미노산이 결핍된 PTGFRN_IgV6의 연속 절두 돌연변이체를 또한 시험하였고, 12개의 아미노산의 제거는 PTGFRN의 절단을 겪지 않은 엑소좀을 산출하였다(도 14A, 도 14B, #454). PTGFRN #454는 서열번호 33의 폴리펩타이드이다. 추가로, FLAG 태그는 절단 부위에 대해서 N-말단이기 때문에, PTGFRN_IgV6의 더 짧은 절두체는 융합 단백질의 더 높은 발현을 초래하였는데, 이는 절단이 이러한 절두체로 일어나지 않음을 시사한다(도 14C).
도 15에 제공된 결과는, 전장 PTGFRN(FL) 및 PTGFRN_454(sIgV)가 엑소좀 상에서 그리고/또는 엑소좀 내에서 내강(C-말단 융합) 또는 표면(N-말단) 단백질의 고밀도 발현을 위한 이상적인 융합 파트너라는 것을 추가로 시사한다. 이러한 가설을 시험하기 위해서, 몇몇 스캐폴드 단백질을, 고밀도 디스플레이 엑소좀을 생산하는 능력에 대해서 시험하였다. 스캐폴드 단백질 및 GFP를 포함하는 융합 단백질, 구체적으로 빈번하게 사용되는 pDisplay 스캐폴드(PDGF 수용체), PalmPalm(팔미토일화 서열), CD81, 또는 전장 PTGFRN(FL) 또는 PTGFRN_454(sIgV) 중 어느 하나의 내강 면에 융합된 GFP를 함유하는 융합 단백질을 세포 배양물에서 발현시켰다. 각각의 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 세포로부터 정제된 엑소좀의 용량 적정은, PTGFRN 융합 단백질이 널리 공지된 엑소좀 단백질 CD81을 비롯한 임의의 다른 스캐폴드보다 훨씬 더 큰 GFP 형광을 초래하였다는 것을 입증하였다. pDisplay 스캐폴드에 비해서, 전장 PTGFRN 및 sIgV는 로딩 효율에 있어서 25배 초과의 향상을 초래하였다(도 15). 이러한 결과는, 융합 파트너로서, 전장 PTGFRN 또는 절단 부위를 제거하기에 충분히 짧은 절두된 PTGFRN(sIgV)을 사용하는 것이 고밀도 디스플레이 또는 엑소좀 로딩을 허용한다는 것을 시사한다.
9.4. 실시예 4: IGSF8 과발현은 고밀도 엑소좀 디스플레이로 이어지지 않는다
PTGFRN의 발현 수준은, 그것이 조작된 엑소좀을 생산하기 위한 이상적인 융합 파트너일 것이라는 것을 시사한다. 면역글로불린-함유 단백질 패밀리의 다른 구성원이 엑소좀 조작에 적합한지를 결정하기 위해서, HEK293 세포에 IGFS8-GFP 융합 단백질을 안정적으로 형질주입시키고, 생성된 엑소좀을 정제시켰다(도 16A). 네이티브 엑소좀 및 IGSF8-GFP 엑소좀을 SDS-PAGE mini-PROTEAN(등록상표) TGX Stain-Free Gel(바이오라드사) 상에서 분석하였는데, 이것은 도 16B에 제공된 바와 같이 트립토판-결합 염료를 사용하여 단백질을 검출한다. IGSF8은 10개의 트립토판 잔기를 함유하여, 이의 용이한 검출을 가능하게 한다. 항-GFP 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 과발현 엑소좀 상에서의 IGSF8-GFP의 발현을 확인해주었다(도 16B, 하단). 흥미롭게도, IGSF8-GFP 엑소좀을 pDisplay 스캐폴드(PDGF 수용체)에 대한 GFP 융합체와 비교하여 GFP 형광에 대해서 시험하는 경우, CD81, 또는 전장 PTGFRN(FL) 또는 PTGFRN_454(sIgV), IGSF8(FL IGSF8)는 pDisplay에서 관찰된 낮은 수준의 확률론적 디스플레이에 비해서 GFP 풍부화를 나타내지 않았다(도 17). 이러한 결과는, 모든 IgV 패밀리 구성원이 고밀도 엑소좀 표면 디스플레이/내강 로딩을 조작하기 위한 융합 단백질로서 사용될 수 있는 것은 아니며, PTGFRN 및 다른 패밀리 구성원이 이와 관련하여 IGSF8보다 더 우수함을 시사한다. 그러나, IGSF8 발현은 비변형된 엑소좀의 표면 상에서 더 높은 수준으로 검출되었는데, 이는 IGSF8가 엑소좀 친화성 정제를 위한 표적으로서 사용되는 것을 허용할 것이다.
9.5. 실시예 5: 포유동물 세포에서 PTGFRN의 세포외 도메인의 발현 및 특징규명
PTGFRN의 세포외 도메인(ECD)은 98kDa이고, 6개의 탠덤 IgV 반복부를 함유한다. PTGFRN의 ECD는, 크기 및 높은 발현 수준으로 인해서 엑소좀 친화성 정제 시약을 위한 바람직한 표적일 수 있다. PTGFRN의 이러한 분절을 특징규명하기 위해서, PTGFRN ECD를, N-말단의 내인성 신호 펩타이드(SP), PAR1 절단 부위 및 C-말단의 Fc 도메인을 갖는 융합 단백질로서 발현시켰다(도 18). PAR1은 트롬빈에 대한 기질이고, 단백질 A 수지를 사용하여 Fc 융합 단백질을 용리시키는 데 사용될 수 있다. PTGFRN은 9개의 예측된 N-연결된 글리코실화 부위 및 6개의 예측된 다이설파이드 결합을 갖는데, 이것이 내인성 당단백질의 생산을 위한 박테리아 발현 시스템의 사용을 불가능하게 한다. PTGFRN ECD를, 고 수율 포유동물 재조합 단백질을 생산하는 데 사용되는 Expi293 발현 시스템(써모 피셔 사이언티픽사)을 사용하여 과발현시켰다. 형질주입된 Expi293 세포로부터의 컨디셔닝된 세포 배양물 배지를 0.2㎛ 필터로 여과시키고, 단백질 A 상에서 정제시키고, 그 다음 낮은 pH 글리신으로 용리시키고, 즉시 중화시켰다. Fc 태그를 트롬빈 처리로 제거하고, 절단된 단백질 풀을 단백질 A에 대해서 재전개시켰다. 통과액을 수집하고, 농축시키고, 정제용 SEC 상에서 폴리싱(polishing)시켰다. 정제된 PTGFRN ECD를 PBS pH 7.4 중에서 Superdex 200 칼럼(지이 헬쓰케어사(GE Healthcare))을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해서 분석하고, 280㎚ UV 형광으로 검출하였다. 도 19A는 약 55㎖에서의 단일 용리 피크를 나타내고, 도 19B는 용리액 피크를 변성 SDS-PAGE mini-PROTEAN(등록상표) TGX Stain-Free Gel(바이오라드사) 상에서 분석한 경우 PTGFRN ECD의 예측된 크기에서 단일 단백질 생성물을 나타내는데, 이는 PTGFRN ECD가 포유동물 세포로부터 정제될 수 있음을 나타낸다.
PTGFRN ECD의 적절한 발현을 확인하기 위해서, 비교를 위한 표준품으로서 BSA 및 항-VLA4 항체를 사용하여, 정제된 단백질을 크기 배제 크로마토그래피/다각 광 산란(SEC-MALS)에 의해서 분석하였다. 재조합 PTGFRN ECD를 예측된 분자량의 약 2×로 용리시켰다(예측된 분자량, 98kDa과 비교할 때 198kDa; 도 20A). PTGFRN ECD가 용액 중에서 동종이량체를 형성하는지를 결정하기 위해서, 재조합 PTGFRN ECD를 PBS 중에서 구아니디늄 클로라이드(GuHCl)의 부재 하에서 또는 1M 또는 2M의 구아니디늄 클로라이드(GuHCl)의 존재 하에서, 분석용 SEC 칼럼(토소사(Tosoh), 7.8×30㎝, G3000SW xl) 상에서 전개시켰다. 도 20B는 증가하는 GuHCl(GuHCl 없음("PTGFRN"이라고 표시된 곡선), 1M GuHCl("PTGFRN + 1M GuHCl"이라고 표시된 곡선), 또는 2M GuHCl("PTGFRN + 2M GuHCl"이라고 표시된 곡선)) 하에서의 PTGFRN ECD의 용리 프로파일 및 예측된 이량체 피크의 단량체 피크로의 전환을 나타낸다. 이러한 결과는, PTGFRN ECD가 동종이량체를 형성하고, PTGFRN 이량체화는 엑소좀 표면 상에서 자연 발생할 수 있음을 시사한다.
9.6. 실시예 6: PTGFRN 단백질 어레이
PTGFRN은 문헌에서 저조하게 특징규명되어 있고, 엑소좀성 단백질로서의 이의 역할은 광범위하게 검토되어 있지 않다. PTGFRN은 엑소좀의 표면 상에서 또한 발견되는 CD9와의 상호작용으로 인해서 CD9 파트너 1(CD9P-1)라고도 공지되어 있다. PTGFRN이 어느 단백질에 결합하는지를 추가로 이해하기 위해서, 재조합 모노-바이오틴일화된 인간 PTGFRN ECD를 생성시키고, 81%의 인간 프로테옴을 포함하는 20,000종 초과의 단백질을 함유하는 단백질 마이크로어레이(CDI 래보러토리즈사(CDI Laboratories)) 상에서 프로빙하였다. pH 5.6 및 7.4에서 결합 분석을 수행하여 각각 산성화 엔도좀 및 사이토졸의 pH를 나타내었다. 9종의 양성 히트가 pH 7.4에서 식별되었고, 16종이 pH 5.6에서 식별되었다. 3종의 단백질(LGALS1, galectin-1; FCN1, ficolin-1; MGAT4B, 알파-1,3-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라제 B)이 pH 5.6 및 pH 7.4 둘 다에서 식별되었다(도 21). LGALS1은 단량체 탄수화물 및 복합체 글리칸에 결합한다고 공지되어 있지만, PTGFRN 결합 파트너로서 관련되지 않았다. PTGFRN과 LGALS1 간의 상호작용을 확인하기 위해서, 바이오틴일화된 재조합 PTGFRN ECD를 스트렙타비딘 광학 프로브에 결합시키고, Octet(등록상표) RED96(폴사(Pall))을 사용하여 생물층 간섭계법(BLI)에 의해서 분석하였다. PTGFRN에 대한 galectin-1의 용량-의존적 결합을 BLI에 의해서 확인하였다(도 22). LGALS1과 PTGFRN 간의 상호작용은 가역적이었고, 용량-의존적 방식으로 락토스와 경쟁하였는데(도 23), 이는 이러한 상호작용의 특이성을 입증한다. 이러한 결과는, 또한 엑소좀이 친화성 시약으로서 PTGFRN 결합 파트너를 사용함으로써 정제될 수 있다는 것을 시사한다.
9.7. 실시예 7: PTGFRN 또는 엑소좀에 대한 항-PTGFRN 항체의 결합
바이오틴일화된 PTGFRN을 Octet(등록상표) RED96(폴사)의 스트렙타비딘 프로브에 결합시키고, PTGFRN(MABT883, 밀리포어 시그마사(Millipore Sigma))에 대한 다른 명칭인 CD315에 대한 단클론성 래트 항체의 농도를 증가시키면서 PBS+0.1% Tween 20 중에서 인큐베이션시켰다. 용량-의존적 결합이 검출되었고, 이는 항체에 의한 PTGFRN의 특이적 인식을 시사한다(도 24). 항-CD315 항체가 엑소좀에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해서, 항-CD315 항체를 단백질 L 프로브에 결합시키고, Optiprep(상표명) 정제된 HEK293 엑소좀의 양을 증가시키면서 인큐베이션시켰다(도 25). 도 25에 도시된 바와 같이, 정제된 엑소좀과의 인큐베이션 후 용량-의존적 굴절은 항-CD315 항체가 엑소좀 표면 상의 내인성 PTGFRN을 인식할 수 있다는 것을 나타낸다. PTGFRN 과발현 엑소좀(PTGFRN++ 엑소좀)을 생성시키도록 전장 PTGFRN이 안정적으로 형질주입된 HEK293 세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 과발현 엑소좀을 고정된 항-CD315 항체와 함께 인큐베이션시켰고, 용량-의존적 굴절이 초래하였는데, 이는 항체와 엑소좀 간의 특이적 결합을 나타낸다(도 26). 네이티브 또는 PTGFRN 과발현 엑소좀에 대한 항체 결합의 정도를 비교하기 위해서, 각각의 종의 1.1E11 엑소좀을 항-CD315 항체의 존재 하에서 인큐베이션시키고, BLI에 의해서 측정하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, PTGFRN 과발현 엑소좀은 네이티브 엑소좀보다 훨씬 더 큰 굴절로 이어졌는데, 이는 증가된 수준의 PTGFRN이 더 큰 결합으로 이어지고, 따라서 PTGFRN 결합이 엑소좀 정제를 위해서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
9.8. 실시예 8: 항-PTGFRN 항체에 의한 도메인 인식
실시예 6 및 7의 결과는, 엑소좀이 PTGFRN과의 친화성 상호작용에 기초하여 정제될 수 있음을 시사한다. 전장 PTGFRN 및 일련의 절두 돌연변이체를 상기에 기재된 Expi293 시스템을 사용하여 모노-바이오틴일화된 재조합 단백질로서 발현시켰다(도 28, 좌측). 절두체 각각을 항-CD315 항체와 함께 인큐베이션시키고, 결합을 BLI에 의해서 측정하였다. 전장 PTGFRN 만 항-CD315 항체에 결합하였는데, 이는 에피토프가 제1 IgV 도메인 내의 단백질의 N-말단에 존재한다는 것을 나타낸다.
토끼에게 도 28의 작제물 1과 유사하지만 바이오틴일화 서열이 결핍된 PTGFRN의 재조합 전장 엑토-도메인을 주입함으로써 다클론성 항체 풀을 생성시켰다. 다클론성 항체 풀을 단백질 A에 의해서 최종 혈액으로부터 정제시키고, PTGFRN 절두 단편에 대한 반응성에 대해서 시험하였다. 단편 각각을 변성 SDS-PAGE mini-PROTEAN(등록상표) TGX Stain-Free Gel(바이오라드사) 상에서 분석하여 적절한 길이의 단백질의 발현을 확인하였다(도 29A). 이어서 웨스턴 블롯을 풀링된 다클론성 토끼 항체를 사용하여 샘플 상에서 수행하였고, 적절한 크기의 밴드를 각각의 레인에서 그리고 대조군 네이티브 엑소좀에 대해서 검출하였고, 이는 다클론성 PTGFRN 항체와의 특이적 반응성을 확인해주었다(도 29B). 이러한 결과를 확인하기 위해서, 바이오틴일화된 PTGFRN 단편 각각을 BLI에 의해서 분석하였고, 그 결과를 도 30에 제공한다. 다클론성 항체 풀과의 인큐베이션은 모든 조건에서 결합을 나타내었는데, 이는 PTGFRN의 IgV 도메인 각각에 대한 항체와의 광범위한 반응성을 입증한다.
9.9. 실시예 9: 다양한 세포주로부터의 엑소좀은 IgV 패밀리 구성원 및 다른 신규 표면 단백질을 발현한다
상이한 기원의 조직의 세포주(HEK293SF, 신장; HT1080, 결합 조직; K562, 골수; MDA-MB-231, 유방; Raji, 림프아구)를 지수기까지 성장시키고, 엑소좀-고갈 혈청이 보충된 배지로 약 6일 동안 옮겼다. 골수-유래된 간엽 줄기세포(MSC)를 3D 마이크로캐리어 상에서 5일 동안 성장시키고, 3일 동안 무혈청 배지를 보충하였다. 상청액을 단리시키고, 엑소좀을 상기에 기재된 Optiprep(상표명) 밀도-구배 초원심분리 방법을 사용하여 정제시켰다. 정제된 엑소좀 각각을 상기에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS에 의해서 분석하였고, 몇몇 엑소좀 표면 단백질에 대한 펩타이드 스펙트럼 매치(PSM)의 수를 정량하고(PTGFRN, IGSF8, IGSF3, BSG, SLC3A2, ITGB1, CD81 및 CD9), 결과를 도 31에 제공한다. 테트라스파닌(tetraspanin) CD81 및 CD9는 대부분의 정제된 엑소좀 집단에서 검출 가능하지만, 일부 경우에는 다른 표면 마커와 동일하거나 더 낮았다(예를 들어, 모든 세포주에서 CD9를 PTGFRN, BSG, 및 SLC3A2과 비교함). 이러한 발견은, IgV 단백질 패밀리 구성원을 비롯한 새로 식별된 표면 마커가 상이한 조직으로부터 유래된 몇몇 관련되지 않은 세포주를 위한 엑소좀 친화성 정제 방법을 개발하기에 적합한 표적이라는 것을 나타낸다.
9.10. 실시예 10: PTGFRN 넉아웃 세포 및 엑소좀
PTGFRN 넉아웃 세포를 생성시키기 위해서, HEK293SF 세포에 재조합 Cas9, 및 PTGFRN의 엑손 2 및 막관통 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA를 형질주입시켰다. 써모피셔사에 의해서 생성된 엑손2를 표적으로 하는 가이드 RNA는 하기를 포함하였다: (1) CGTTGGCAGTCCGCCTTAAC, CRISPR926045_CR(서열번호 36); (2) CATAGTCACTGACGTTGCAG, CRISPR926054_CR(서열번호 37); (3) TTGTGGAGCTTGCAAGCACC, CRISPR926055_CR(서열번호 38); 및 (4) GTTCTTTATGTGGAGCTCCA, CRISPR926071_CR(서열번호 39). 써모피셔사에 의해서 생성된 막관통 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA는 (1) TATCCCTTGCTGATCGGCGT, TMgRNA5.1.97(서열번호 40); (2) GCTGCAGTACCCGATGAGAC, TMgRNA3.7.87(서열번호 41)을 포함하였다.
PTGFRN의 엑손 2 및 막관통 영역의 표적화된 유전자 편집 및 결실을 PCR 및 서열분석에 의해서 확인하였다. 5종의 클론성 PTGFRN 넉아웃(PTGFRN KO) 세포주로부터의 엑소좀을 상기에 기재된 바와 같이 정제시키고, 실시예 8에 기재된 다클론성 토끼 항체 풀을 사용하여 웨스턴 블롯 및 PAGE에 의해서 분석하였다. 도 32B에 도시된 바와 같이, PTGFRN에 상응하는 밴드는 5종의 넉아웃 클론 중 어느 것에서도 검출되지 않았는데, 이는 생산자 세포 및 정제된 엑소좀에서 PTGFRN의 표적화된 결실을 입증한다. 중요하게는, 엑소좀 생산 수율 및 전체 단백질 밴딩 패턴(도 32A)은 PTGFRN 결실에 의해서 영향을 받지 않았는데, 이는 PTGFRN KO 엑소좀이 실험 목적을 위해서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
PTGFRN 결실이 정제된 엑소좀의 프로테오믹 프로파일을 변경하였는지를 결정하기 위해서, 비교 질량 분광분석법에 의해서 네이티브 엑소좀 및 PTGFRN KO 엑소좀을 분석하였다. 도 33에 도시된 바와 같이, 네이티브 엑소좀 및 PTGFRN KO 엑소좀의 단백질 함량은 PTGFRN(이것은 PTGFRN KO 엑소좀에서는 검출 가능하지 않았음) 만을 제외하고는 매우 유사하였다. 엑소좀 마커 Alix, CD81, TSG101, 및 CD9는 군 간에 상당히 상이하지는 않았다. 이러한 데이터는, PTGFRN은 엑소좀의 프로테오믹 프로파일을 변경시키지 않으면서 엑소좀으로부터 제거될 수 있다는 것을 입증한다.
PTGFRN 결실이 PTGFRN의 완전한 기능성 제거를 초래하였는지를 검증하기 위해서, 그리고 실시예 7에 기재된 항-PTGFRN(항-CD315) 항체가 PTGFRN에 대해서 특이적인지를 입증하기 위해서, BLI를 사용한 엑소좀 결합 실험을 네이티브 엑소좀, PTGFRN 과발현 엑소좀(PTGFRN++) 및 PTGFRN KO 엑소좀을 사용하여 수행하였다. 도 27 및 실시예 7에 기재된 실험 결과와 유사하게, PTGFRN++ 엑소좀은 네이티브 엑소좀보다 더 높은 친화성으로 고정된 항-CD315 항체에 결합하였다(도 34). 이에 반해서, 동일한 수의 PTGFRN KO 엑소좀은 고정된 항체에 결합하지 않았는데(도 34), 이는 PTGFRN 결실이 PTGFRN KO 엑소좀과 항-PTGFRN 친화성 시약의 상호작용을 제거하였다는 것을 입증하였다.
9.11. 실시예 11: 엑소좀은 PTGFRN을 인식하는 친화성 시약으로 정제될 수 있다
PTGFRN에 대한 통상의 단클론성 항체를 실시예 8에 기재된 바와 같은 면역화된 토끼로부터 생성시켰다. PTGFRN을 사용함으로써 엑소좀이 단리될 수 있는지를 결정하기 위해서, 5×1010개의 네이티브 또는 PTGFRN KO 엑소좀을 자성 단백질 A 비드(카탈로그 #10001D; 인비트로젠사(Invitrogen)) 또는 10㎍의 통상의 항-PTGFRN 단클론성 항체로 작용화된 단백질 A 비드에 첨가하였다. 각각의 엑소좀-비드 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션시키고, PBS+0.1% v/v TWEEN(등록상표) 20으로 3회 세척하였다. 세척된 비드를 용리 완충액(20mM 글리신 pH 3.6, 2× Laemmli 샘플 완충액(카탈로그 #1610737, 바이오라드사), 10% β-머캅토에탄올) 중에서 95℃에서 10분 동안 인큐베이션시킴으로써 용리시키고, 비등시킨 상청액을 PAGE에 의해서 분석하고, 상이한 통상의 항-PTGFRN 단클론성 항체를 사용하여 항-PTGFRN 웨스턴 블로팅하였다. PAGE에 의해서 분석된 전체 단백질은 항-PTGFRN 항체의 존재 하에서 네이티브 엑소좀 조건에서만 PTGFRN의 분자량에 상응하는 밴드를 나타내었다(도 35A). 이러한 밴드는 웨스턴 블롯에 의해서 PTGFRN로서 검증되었다(도 35B). HC 및 LC는 각각 정제를 위해서 사용된 항-PTGFRN 항체의 중쇄 및 경쇄에 상응하였다. 이러한 데이터는, PTGFRN-함유 엑소좀이 엑소좀 표면 상의 PTGFRN을 사용함으로써 용액으로부터 정제될 수 있음을 입증한다.
9.12. 실시예 12: 다양한 이종 단백질을 PTGFRN에 융합시켜 엑소좀 상에서 과발현을 가능하게 할 수 있다
도 11, 도 13, 도 14 및 도 15에 제공된 실험 데이터는, 몇몇 단백질이 과발현 스캐폴드로서 PTGFRN을 사용함으로써 극적으로 과발현될 수 있다는 것을 입증한다. PTGFRN을 사용한 과발현은 다른 엑소좀 과발현 스캐폴드를 사용한 발현보다 상당히 더 양호하였다. PTGFRN에 융합됨으로써 성공적으로 과발현될 수 있는 단백질의 범위를 결정하기 위해서, 몇몇 조작된 엑소좀을 생성시켰다. 인자 VIII(FVIII)은 응고 캐스케이드에 관여된 큰 효소이다. B 도메인이 결핍된 FVIII의 단편(BDDFVIII)을 PTGFRN의 N-말단(외부에 대면하는 면)에 융합시켰고, HEK293SF 세포에서 발현시켰다. 정제된 엑소좀을 PAGE(도 36A) 및 웨스턴 블롯(도 36B)에 의해서 분석하였다. 세포 배양물 중에서 전장 FVIII의 가공에 의해서 생성된 FVIII의 경쇄는 FVIII(도 36B; 카탈로그 #GMA-8025, 그린 마운틴 안티바디즈사(Green Mountain Antibodies))에 대한 항체를 사용하여, 조작된 엑소좀에서 쉽게 검출되었지만, 네이티브 엑소좀에서는 쉽게 검출되지 않았다. 전장 FVIII은 165kDa의 분자량을 갖고, 이것은 PTGFRN(약 120kDa)의 분자량보다 상당히 더 큰 것인데, 이는 효소를 비롯한 매우 큰 단백질이 엑소좀의 표면 상에서 PTGFRN 융합체로서 성공적으로 발현될 수 있음을 입증한다.
상기에 기재된 PTGFRN 융합 파트너는 정렬된 3차원 구조를 갖는 모든 단백질이다. XTEN(등록상표) 펩타이드(Amunix; 마운틴 뷰사(Mountain View), 미국 캘리포니아주 소재)는 이의 일차 서열에 비해서 극적으로 증가된 겉보기 분자량을 갖는 긴 비정렬된 반복적인 서열을 갖는다. XTEN(8%의 Ala, 12%의 Glu, 18%의 Gly, 17%의 Pro, 28%의 Ser 및 17%의 Thr을 포함하는 무작위 288-아미노산을 포함하는 단백질)을 암호화하는 융합 작제물, PTGFRN의 단편(서열번호 33) 및 GFP는 HEK293SF 세포에서 안정적으로 발현되었다. 정제된 엑소좀을 단리시키고, PAGE(도 37A) 및 웨스턴 블로팅(도 37B)에 의해서 분석하였다. 도 37B에 도시된 바와 같이, 융합 단백질의 C-말단 GFP는 웨스턴 블롯에 의해서 검출되었는데, 이는 정제된 엑소좀 상의 융합 단백질의 인-프레임 번역을 입증하였다. 이러한 결과는, 비구조화된 단백질이 또한 PTGFRN에 대한 융합체로서 안정적으로 발현될 수 있음을 입증한다. 추가로, 이러한 결과는, 이종 단백질이 PTGFRN의 N-말단 및 C-말단에 동시에 융합될 수 있고, 각각 엑소좀 표면 및 내강 상에 디스플레이되는 무손상 단백질을 초래한다는 것을 나타낸다. 따라서, PTGFRN은 N-말단 또는 C-말단 중 하나 또는 둘 다 상에서 몇몇 아미노산(예를 들어, FLAG 태그)으로부터 다양한 구조 또는 부류의 150kDa(BDDFVIII)을 초과하는 크기 범위까지의 단백질 융합체에 적용되는 강력한 스캐폴드이다.
9.13. 실시예 13: PTGFRN 서열은 다른 엑소좀성 과발현 시스템보다 엑소좀 상에서 이종 단백질의 발현에 있어서 더 양호하다
실시예 3 및 도 15의 데이터는, PTGFRN이 엑소좀의 벌크 집단에서 이종 단백질의 발현에 있어서 다른 엑소좀 스캐폴드보다 더 우수함을 입증한다. 그러나, 이러한 결과는 엑소좀의 하위세트에서의 증가된 발현 대 정제된 집단에서 모든 엑소좀에 걸친 일관되게 증가되는 발현 사이에서 구별될 수 없었다. 일관된 엑소좀 치료제를 개발하려는 목적을 위해서, 고도로 과발현되는 엑소좀 및 비변형된 엑소좀을 포함하는 이질 엑소좀 집단보다 일관되게 증가되는 발현을 갖는 동질(homogenous) 엑소좀 집단을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 문제를 다루기 위해서, 본 발명자들은 Flow NanoAnalyzer(나노에프씨엠사(NanoFCM, Inc.); 중국 샤먼 소재)를 사용한 나노-유세포 분석법에 의해서 입자별 기준으로 엑소좀 집단에서 개별 엑소좀을 특징규명하였다. Flow NanoAnalyzer는 직경이 10㎚만큼 작은 개별 나노입자의 광 산란 및 형광 방출을 측정할 수 있다. CD9, CD81, 또는 PTGFRN에 대한 내강 GFP 융합체를 암호화하는 변형된 엑소좀 및 네이티브 엑소좀을 안정적으로 형질주입된 HEK293SF 세포로부터 단리시키고, 상기에 기재된 바와 같이 Optiprep(등록상표) 밀도 구배 초원심분리에 의해서 정제시켰다. 여기 488/방출 509로 설정된 Flow NanoAnalyzer에 의한 분석은, 입자별 분석에서 GFP 발현에 대해서 CD9-GFP 엑소좀이 약 48% 양성이었고, CD81-GFP 엑소좀이 약 80% 양성이었고, PTGFRN-GFP 엑소좀이 약 97% 양성이었음을 입증하였다(도 38, 좌측). 추가로, 평균 형광 강도(MFI)는 유사한 경향을 따랐고, PTGFRN-GFP 엑소좀은 전체적으로 CD81-GFP 엑소좀보다 약 2배 더 밝았다(도 38, 우측). 이러한 데이터는, PTGFRN-GFP 융합 단백질을 발현하도록 변형된 엑소좀이 융합 단백질을 높게 발현하는 동질 엑소좀 집단이며, 전체 발현 수준은 다른 엑소좀 스캐폴드에 융합된 GFP를 발현하는 변형된 엑소좀 또는 네이티브 엑소좀보다 훨씬 더 높았음을 입증한다.
PTGFRN의 N-말단은 예측된 신호 펩타이드 서열(아미노산 1-21; 서열번호 8)로 이루어진다. 이러한 서열이 정제된 엑소좀 상에서 트랜스젠의 발현을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해서, PTGFRN 신호 펩타이드를 이종 단백질, DsbA11의 신호 펩타이드와 비교하였다. HEK293SF 세포에 (i) GFP에 융합된 전장 야생형 PTGFRN; (ii) GFP에 융합된 내인성 PTGFRN 신호 펩타이드를 함유하는 PTGFRN의 짧은 단편(454-PTGFRN; 서열번호 33); 또는 (iii) GFP에 융합된, 박테리아 유전자 DsbA11(Koerber et al., Journal of molecular biology, 427.2 (2015): 576-586)로부터의 신호 펩타이드로 대체된 내인성 PTGFRN 신호 펩타이드를 갖는 PTGFRN의 짧은 단편(454-PTGFRN; 서열번호 33)을 암호화하는 발현 작제물을 안정적으로 형질주입시켰다. 도 39에 도시된 바와 같이, 내인성 PTGFRN 신호 펩타이드를 함유하는 전장 또는 절두된 PTGFRN-GFP를 함유하는 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포는 GFP를 포함하는 엑소좀을 유사하게 높은 수준으로 생산하였다. 그러나, DsbA11 신호 펩타이드를 갖는 절두된 PTGFRN을 함유하는 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포는 GFP를 발현하는 엑소좀을 훨씬 더 낮은 수준으로 생성시켰다. 이러한 결과는, PTGFRN 신호 펩타이드가 조작된 엑소좀의 고밀도 데코레이션을 촉진시킨다는 것을 입증한다.
9.14. 실시예 14: 항체 단편은 스캐폴드로서 PTGFRN을 사용하여 엑소좀 표면 상에서 기능적으로 발현될 수 있다
상기에 기재된 실험 데이터는, PTGFRN이 다수의 부류의 단백질의 과발현에 적용되는 강력한 스캐폴드임을 입증한다. 항체 및 항체의 항원-결합 단편은 다수의 질환 치료 분야에서 다양한 응용을 갖는 중요한 부류의 치료용 펩타이드이다. 기능성 항원-결합 단편이 스캐폴드로서 PTGFRN을 사용하여 엑소좀 상에서 발현될 수 있는지를 결정하기 위해서, 렉틴 CLEC9A를 인식하는 단일 쇄 Fab(클론 10B4, 밀리포어 시그마사, 카탈로그 # 04-148; 및 문헌[Caminschi et al., Blood, 112: 8 (2008)]에 기술된 바와 같음), 전장 PTGFRN, GFP, 및 FLAG 태그로 이루어진 융합 단백질을 발현하도록 HEK29SF 세포를 안정적으로 형질주입시켰다(도 40A). Optiprep(상표명) 정제된 엑소좀을 무-염색(stain-free) 단백질 겔 상에서 전개시키고, FLAG 태그에 대한 항체로 블로팅하였는데, 이는 전장 융합 단백질의 상당한 과발현을 나타낸다(도 40B).
정제된 항-CLEC9A 엑소좀을, 고정된 CLEC9A-Fc(알앤디 시스템즈사(R&D Systems), 카탈로그 # 6049-CL-050; 및 문헌[Uto et al., Nature Communications 7: 11273(2016)]에 기재된 바와 같음)에 대한 결합에 대해서 BLI에 의해서 시험하였다. CLEC9A-Fc를 PBS + 0.1%(v/v) Tween20 중의 0.5㎍/㎖의 최종 농도로 단백질 A 프로브에 결합시켰고, 1×1011개의 비변형된 엑소좀 또는 도 40A에 도시된 바와 같은 렉틴 CLEC9A를 인식하는 단일 쇄 Fab, 전장 PTGFRN, GFP, 및 FLAG 태그로 이루어진 융합 단백질("αCLEC9A-PTGFRN")을 발현하도록 변형된 엑소좀과 함께 인큐베이션시켰다. 도 41에 도시된 바와 같이, 항-CLEC9A-PTGFRN 엑소좀 만 CLEC9A-Fc 프로브에 결합하였는데, 이는 세포 표면 마커와 항원-결합 단편을 과발현하도록 조작된 엑소좀 간의 기능성 인식을 입증한다.
9.15. 실시예 15: 간엽 줄기세포는 PTGFRN을 발현한다
몇몇 세포 유형으로부터의 치료용 엑소좀은 연구 및 임상 목적을 위해서 사용되어 왔다. 중성 전구체 줄기세포 및 간엽 줄기세포를 비롯한 몇몇 종의 줄기세포는 치료 이익을 갖는 것으로 밝혀져 있지만, 이러한 세포를 사용한 대부분의 연구는 자연의 비변형된 엑소좀에 좌우된다. 따라서, 이러한 세포주를 특이적 리간드 또는 다른 표적 단백질을 과발현하도록 조작하는 것이 바람직할 것이다. 골수-유래된 간엽 줄기세포를 1.1L의 마이크로캐리어-기반 3D 생물반응기 시스템에서 성장시켰다. 세포 확장 5일 후, 성장 배지를 폐기하고, 세포를 무혈청 배지 중에서 추가로 3일 동안 배양시켰다. 무혈청 배지를 100㎛ 필터를 통해서 여과시켜 마이크로캐리어를 제거하고, 저속으로 원심분리시켜 세포 부스러기 및 오염물을 제거하였다. 이어서 정화된 배지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 Optiprep(상표명) 밀도-구배 초원심분리에 의해서 정제시켰다. HEK293SF 세포 및 MSC로부터의 정제된 엑소좀을 PTGFRN, 및 확립된 엑소좀 단백질 ALIX, TSG101, CD63, CD9 및 CD81에 대해서 웨스턴 블롯에 의해서 분석하였다. 도 42에 도시된 바와 같이, 이러한 단백질 모두는 HEK293SF 세포 및 MSC 둘 다에서 발현되었는데, 이는 엑소좀 단백질, 예를 들어, PTGFRN이 표면-조작된 MSC 엑소좀을 생성시키기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있음을 시사한다.
9.16. 실시예 16: PTGFRN은 비-인간 세포로부터의 엑소좀 상에서 과발현될 수 있다
실시예 9 및 실시예 15의 결과는, 다수의 인간-유래된 세포가 PTGFRN 및 실시예 1에서 식별된 다른 신규 엑소좀 단백질을 자연적으로 발현한다는 것을 입증한다. PTGFRN이 범용 엑소좀 스캐폴드 단백질로서 사용될 수 있는지를 결정하기 위해서, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에, FLAG 태그에 융합된 전장 PTGFRN을 발현하는 플라스미드("PTGFRN-FLAG 플라스미드")를 안정적으로 형질주입시켰다. 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 야생형 HEK293SF 세포, PTGFRN-FLAG 플라스미드가 형질주입된 HEK293SF 세포, CHO 세포, 및 PTGFRN-FLAG 플라스미드가 형질주입된 CHO 세포로부터 엑소좀을 정제시켰다. 도 43A 내지 도 43C에 도시된 바와 같이, PTGFRN-FLAG는, 무염색 PAGE(도 43A)에 의해서 그리고 PTGFRN(도 43B) 및 FLAG(도 43C)에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해서 검출되는 바와 같이 HEK293SF 세포 및 CHO 세포 둘 다에서 성공적으로 과발현되었다. 이러한 결과는, 인간 세포(예를 들어, HEK 세포)뿐만 아니라 비-인간 세포(예를 들어, CHO 세포)가 인간 PTGFRN을 과발현하는 엑소좀을 생산할 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 결과는, PTGFRN이 다수의 상이한 유형 및 종으로부터 조작된 엑소좀을 생성시키기 위한 범용 스캐폴드 단백질이라는 것을 나타낸다.
9.17. 실시예 17: PTGFRN은 종래의 엑소좀 단백질에 비해서 내강 카고의 개선된 로딩을 제공한다
이전 실시예는, PTGFRN 과발현이 종래의 엑소좀 단백질에 비해서 더 많은 단백질 수 및/또는 활성도를 갖는 엑소좀을 초래한다는 것을 입증하였다(예를 들어, 실시예 13; 도 15). PTGFRN은 막관통 단백질이고, 소포외 면 상에 N-말단을 갖고, 엑소좀 내강에 C-말단을 갖기 때문에, PTGFRN은 엑소좀의 내강에 카고 단백질을 로딩하기에 적합한 스캐폴드 단백질일 수 있다. 이러한 가능성을 연구하기 위해서, HEK293SF 세포를 소분자 라파마이신을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 용이하게 하는 이분(bipartite) 리포터 시스템을 안정적으로 발현하도록 조작하였다. CD9(도 44A) 또는 PTGFRN(도 44B)을 GFP, FLAG 태그, 및 FKBP에 융합시켰다. 세포를 또한 V5 태그 및 FRB에 융합된 mCherry를 안정적으로 발현하도록 조작하였다. 소분자 라파마이신의 존재 하에서, 단백질 FRB 및 FKBP는 이량체화되어 안정적인 복합체를 형성한다. 따라서 라파마이신의 존재 하에서 세포를 배양하는 것은 엑소좀 생물발생 동안 mCherry 카고 단백질과 CD9 또는 PTGFRN 중 어느 하나 간의 회합을 허용할 수 있다. 이러한 세포로부터 정제된 엑소좀을 세척하여 라파마이신을 제거하여, 엑소좀 내강 내의 가용성 카고로서의 mCherry의 방출을 허용할 것이다(도 44A 및 도 44B).
CD9 로딩 리포터 세포를 라파마이신의 존재 하에서 0, 1 또는 2일 동안 성장시켰다. PTGFRN 로딩 리포터 세포를 라파마이신의 존재 하에서 5일 동안 성장시켰다. 엑소좀을 라파마이신의 부재 하에서 세포 배양물로부터 정제시켜 엑소좀 내강에서 카고 방출을 허용하였다. 정제된 엑소좀 샘플을 변성 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전개시키고, 전체 단백질의 존재에 대해서 분석하고, 스캐폴드 단백질(항-FLAG) 또는 mCherry 카고(항-V5)에 대해서 웨스턴 블로팅하였다. PTGFRN 샘플은 CD9 샘플에 비해서 훨씬 더 적은 물질이 폴리아크릴아마이드 겔 상에 로딩되었지만, PTGFRN은 FLAG 웨스턴 블롯에 의해서 쉽게 검출 가능하였다. 카고 mCherry가 또한 PTGFRN과 CD9 스캐폴드 샘플 사이에서 대등한 수준으로 검출되었다(도 45A). 스캐폴드 및 카고 단백질 밴드를 농도계에 의해서 측정하고, 수집된 엑소좀의 양에 대해서 정규화시키는 경우, PTGFRN 스캐폴드는 더 높은 수준으로 발현되었고, CD9 스캐폴드 단백질에 함유된 훨씬 더 많은 mCherry 카고를 로딩할 수 있었다(도 45B). 이러한 데이터는, PTGFRN이 종래의 엑소좀 단백질 CD9보다 더 높은 정도로 내강 로딩 펩타이드에 대한 융합 단백질로서 발현될 수 있고, PTGFRN의 사용이 종래의 엑소좀 단백질에 비해서 더 높은 유도된 카고 로딩을 초래한다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는, 복합체, 다중-부분 조작된 시스템이 PTGFRN 스캐폴드의 맥락으로 사용될 수 있고, 엑소좀 내강에서 강력한 카고 로딩을 초래한다는 것을 나타낸다.
9.18. 실시예 18: 변형된 엑소좀 단백질의 생성
변형된 엑소좀 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전체 엑소좀 단백질 또는 절두된 엑소좀 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 생성시킨다. 다양한 절두된 엑소좀 단백질을 스크리닝하고, 엑소좀 막 내에 혼입하는 최적의 능력 및 결합제와 상호작용하는 최적의 능력을 갖는 절두된 단백질을 선택함으로써 특정 절두된 엑소좀 단백질을 선택한다. 엑소좀 막에 대한 절두된 단백질의 표적화를 나노-유세포 분석법에 의해서 시험한다.
친화성 태그(글루타티온-S-트랜스퍼라제, S-펩타이드, FLAG 태그, GFP 등)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전체 또는 절두된 엑소좀 단백질(예를 들어, PTGFRN, BSG, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 및 ATP 수송체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 첨가함으로써 변형된 엑소좀 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생성시킨다. 변형된 폴리뉴클레오타이드는 융합 단백질을 발현한다. 엑소좀 막 내로의 표적화 및/또는 결합제에 대한 친화성을 개선시키기 위해서 폴리뉴클레오타이드를 추가로 변형시킨다.
치료용 펩타이드(예를 들어, 항체, 효소, 리간드, 수용체, 항미생물 펩타이드, 이의 변이체 또는 단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전체 또는 절두된 엑소좀 단백질(예를 들어, PTGFRN, BSG, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 및 ATP 수송체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 첨가함으로써 변형된 엑소좀 단백질을 암호화하는 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드를 생성시킨다. 변형된 폴리뉴클레오타이드는 엑소좀의 표면 상에 제시되는 융합 단백질을 발현한다. 융합 단백질은 치료용 펩타이드의 치료 활성도를 유지시킨다.
표적화 모이어티(예를 들어, 특정 기관, 조직 또는 세포에 특이적인 표적화 모이어티)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전체 또는 절두된 엑소좀 단백질(예를 들어, PTGFRN, BSG, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, 및 ATP 수송체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 첨가함으로써 변형된 엑소좀 단백질을 암호화하는 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드를 생성시킨다. 변형된 폴리뉴클레오타이드는 엑소좀의 표면 상에 제시되는 융합 단백질을 발현한다. 융합 단백질은 엑소좀이 특정 기관, 조직 또는 세포에 대해서 표적화되는 것을 가능하게 한다.
엑소좀 표면 상의 변형된 엑소좀 단백질의 국지화를 또한 나노 유세포 분석법에 의해서 시험한다.
9.19. 실시예 19: 표면-조작된 엑소좀의 생성
엑소좀 단백질 또는 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하는 외인성 서열을 도입함으로써 표면-조작된 엑소좀을 생성시키는 생산자 세포를 제조한다. 엑소좀 단백질을 암호화하는 플라스미드를 일시적으로 형질주입시켜 엑소좀 표면 상에서 엑소좀 단백질의 높은 수준 발현을 유도한다. 변형된 엑소좀 단백질을 암호화하는 플라스미드를 일시적으로 형질주입시켜 표면 상에 변형된 엑소좀 단백질을 갖는 엑소좀을 생성시킨다.
엑소좀 단백질, 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 친화성 태그, 치료용 펩타이드 또는 표적화 모이어티를 암호화하는 외인성 서열을 생산자 세포 내에서 형질전환시켜 표면-조작된 엑소좀을 생산한다. 친화성 태그, 치료용 펩타이드 또는 표적화 모이어티를 암호화하는 외인성 서열을 엑소좀 단백질을 암호화하는 게놈 부위 내에 삽입하여 엑소좀 단백질에 부착된 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질을 생성시킨다. 변형된 엑소좀 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 엑소좀 단백질을 암호화하는 게놈 부위에 넉인시킨다(knock in).
적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드(각각 엑소좀 단백질, 엑소좀 단백질의 변이체 또는 단편, 또는 외인성 펩타이드(예를 들어, 친화성 태그, 표적화 모이어티, 치료용 펩타이드)를 암호화함)를 안정적으로 형질주입시킴으로써 생산자 세포주를 생성시킨다. 2개 이상의 외인성 서열(예를 들어, 친화성 태그, 마커, 표적 펩타이드, 치료용 펩타이드 등을 암호화하는 외인성 서열)을 다수의 게놈 부위에, 엑소좀 단백질을 암호화하는 게놈 서열 내에 또는 그것과 인접하게 삽입시킴으로써 상이한 생산자 세포주를 생성시켜서 다수의 변형된 엑소좀 단백질을 포함하는 표면-조작된 엑소좀을 생성시킨다. 복수의 변형된 엑소좀 단백질 각각은 엑소좀의 표면에 표적화된다. 엑소좀은 2개의 상이한 결합제에 대한 친화성을 갖고, 결합제 중 어느 하나 또는 둘 다에 의해서 정제된다.
9.20. 실시예 20: 친화성 정제에 의한 엑소좀의 단리, 정제 및 하위 분별
온화한 조건 하에서 용리시키는 바이오패닝(biopanning)/유도 진화(directed evolution)에 의해서 엑소좀의 친화성 정제를 위한 결합제를 개발한다.
결합제를 고체 지지체(예를 들어, 다공성 아가로스 비드)에 부착시키고, 종래의 크로마토그래피 시스템(예를 들어, GE AKTA)으로 형성시킨다. 엑소좀을 함유하는 샘플을 친화성 정제용 칼럼에 적용한다.
참고에 의한 포함
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해서 참고로 포함된 것으로 개별적으로 제시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
등가물
본 개시내용은 특히 카나비노이드의 조성물 및 주변물질(entourage) 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 카나비노이드 및 주변물질 조성물을 투여함으로써 신경변성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 구체적인 실시형태가 예시되어 있지만, 상기 명세서는 제한이 아니다. 본 발명(들)의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 수행될 수 있음이 인지될 것이다. 다양한 변경은 본 개시내용을 읽은 당업자에게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CODIAK BIOSCIENCES, INC. <120> PREPARATION OF THERAPEUTIC EXOSOMES USING MEMBRANE PROTEINS <130> WO/2019/040920 <140> PCT/US2018/048026 <141> 2018-08-24 <150> US 62/656,956 <151> 2018-04-12 <150> US 62/550,543 <151> 2017-08-25 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 879 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val 20 25 30 Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr 35 40 45 Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly 50 55 60 Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg 85 90 95 Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser 100 105 110 Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val 115 120 125 Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 cgttggcagt ccgccttaac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 catagtcact gacgttgcag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ttgtggagct tgcaagcacc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 gttctttatg tggagctcca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 tatcccttgc tgatcggcgt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gctgcagtac ccgatgagac 20 <210> 42 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln 20 25 30 Thr Ser Gly Pro Ile Phe 35 <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro 20 25 30 Ile Phe <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe 20 25 30 <210> 45 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Glu His Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Gly Gly Gly Gly 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Claims (77)

  1. 엑소좀(exosome)을 단리시키는 방법으로서,
    상기 엑소좀을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 샘플을 표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 결합제와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체(transporter) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및
    상기 표적 단백질과 상기 결합제 간의 결합에 기초하여 상기 엑소좀을 단리시키는 단계를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 시험관내에서 성장된 세포로부터 획득되고, 선택적으로 상기 세포는 HEK293 세포인, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 대상체의 체액으로부터 획득되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 세포는 상기 표적 단백질을 발현하도록 유전자 변형되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 세포는 상기 표적 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 세포는 상기 결합제에 대한 친화성을 갖는 태그를 발현하는 외인성 서열을 포함하도록 유전자 변형되고, 상기 외인성 서열은 상기 세포의 게놈에 삽입되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 내인성 서열의 3' 또는 5' 단부에 위치된 게놈 부위에 삽입되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 내인성 서열 내에 위치된 게놈 부위에 삽입되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 표적 단백질은 상기 태그, 및 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질인, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 ADAM10의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변형되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 표적 단백질을 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 및 ATP 수송체로부터 선택되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체의 단편 또는 변이체를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이되, 상기 친화성 태그는 결합제에 대한 친화성을 갖는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 결합제는 면역글로불린, 단백질, 펩타이드 또는 소분자를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 고체 지지체에 부착되되, 선택적으로 상기 고체 지지체는 다공성 아가로스 비드, 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드, 또는 막을 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 고체 지지체는 크로마토그래피 칼럼을 형성하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 샘플을 상기 결합제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 크로마토그래피 칼럼에 적용함으로써 수행되는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플의 하위세트를 상이한 표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 상이한 결합제와 접촉시키는 단계; 및
    상기 상이한 표적 단백질과 상기 상이한 결합제 간의 결합에 기초하여 상기 엑소좀을 단리시키는 단계를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상이한 표적 단백질은 PTGFRN 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 상이한 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함하는, 엑소좀을 단리시키는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, 엑소좀.
  25. 제24항의 엑소좀 및 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 샘플보다 더 낮은 농도의 거대분자를 포함하되, 상기 거대분자는 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물 또는 이들의 조합물인, 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 거대분자가 실질적으로 존재하지 않는, 약제학적 조성물.
  28. 표적 단백질을 포함하는 엑소좀으로서, 상기 표적 단백질의 적어도 일부는 외인성 서열로부터 발현되고, 그리고 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF8, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 엑소좀.
  29. 제28항에 있어서, 상기 표적 단백질은 상이한 엑소좀의 상이한 표적 단백질보다 더 높은 밀도로 상기 엑소좀의 상기 표면 상에 존재하고, 상기 상이한 표적 단백질은 종래의 엑소좀 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는, 엑소좀.
  30. 제29항에 있어서, 상기 종래의 엑소좀 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커(anchor) 단백질, 락타드헤린(lactadherin), LAMP2, LAMP2B 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 엑소좀.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항항에 있어서, 상기 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함하는, 엑소좀.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질과 결합제 간의 결합에 기초하여 단리되는, 엑소좀.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 서열을 포함하도록 유전자 변형된 세포로부터 생산되되, 선택적으로 상기 세포는 HEK293 세포인, 엑소좀.
  34. 제33항에 있어서, 상기 세포는 ADAM10의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변형되는, 엑소좀.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 세포는 상기 외인성 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는, 엑소좀.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상기 세포의 게놈 내에 삽입된 상기 외인성 서열을 포함하는, 엑소좀.
  37. 제36항에 있어서, 상기 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화화는 게놈 서열의 3' 또는 5' 단부에 위치된 게놈 부위 내에 삽입되는, 엑소좀.
  38. 제36항에 있어서, 상기 외인성 서열은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화화는 게놈 서열 내에 삽입되는, 엑소좀.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이되, 상기 친화성 태그는 결합제에 대한 친화성을 갖는, 엑소좀.
  40. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 치료용 펩타이드를 포함하는 융합 단백질인, 엑소좀.
  41. 제40항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 자연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 치료 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 엑소좀.
  42. 제40항에 있어서, 상기 치료 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 엑소좀.
  43. 제40항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 항체 또는 이의 단편 또는 변이체인, 엑소좀.
  44. 제40항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 또는 이의 단편 또는 변이체인, 엑소좀.
  45. 제40항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 항미생물성 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체인, 엑소좀.
  46. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 표적화 모이어티를 포함하는 포함하는 융합 단백질인, 엑소좀.
  47. 제46항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 기관, 조직 또는 세포에 대해서 특이적인, 엑소좀.
  48. 제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 표적 단백질을 더 포함하되, 상기 상이한 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 엑소좀.
  49. 제48항에 있어서, 상기 상이한 표적 단백질과 상이한 결합제 간의 결합에 기초하여 단리되는, 엑소좀.
  50. 제28항 내지 제49항 중 어느 한 항의 엑소좀 및 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 거대분자가 실질적으로 존재하지 않되, 상기 거대분자는 핵산, 오염 단백질, 지질, 탄수화물, 대사산물 및 이들의 조합물로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  52. 제28항 내지 제49항 중 어느 한 항의 엑소좀을 생산하기 위한 세포주.
  53. 엑소좀을 생산하기 위한 세포주로서, PTGFRN, BSG, IGSF3, IGSF2, ITGB1, ITGA4, SLC3A2 또는 ATP 수송체를 암호화하는 게놈 서열 내에 삽입된 외인성 서열을 포함하되, 상기 외인성 서열 및 상기 게놈 서열은 융합 단백질을 암호화하는, 세포주.
  54. 제53항에 있어서, 상기 외인성 서열은 친화성 태그를 암호화하는, 세포주.
  55. 제53항에 있어서, 상기 외인성 서열은 치료용 펩타이드를 암호화하는, 세포주.
  56. 제55항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 자연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 치료 화합물에 대한 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포주.
  57. 제55항에 있어서, 상기 치료 화합물은 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질, 탄수화물 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포주.
  58. 제55항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 항체 또는 이의 단편 또는 변이체인, 세포주.
  59. 제55항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 또는 이의 단편 또는 변이체인, 세포주.
  60. 제55항에 있어서, 상기 치료용 펩타이드는 항미생물성 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체인, 세포주.
  61. 제53항에 있어서, 상기 외인성 서열은 표적화 모이어티를 암호화하는, 세포주.
  62. 제61항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 기관, 조직 또는 세포에 대해서 특이적인, 세포주.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 ADAM10의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변형된, 세포주.
  64. 제53항 내지 제63항 중 어느 한 항의 세포주로부터 생산된 엑소좀.
  65. 제64항에 있어서, 상기 엑소좀은 상이한 엑소좀의 표면 상의 상이한 융합 단백질보다 더 높은 밀도로 표면 상에 상기 융합 단백질을 포함하되, 상기 상이한 엑소좀은 종래의 엑소좀 단백질을 암호화하는 상이한 게놈 서열 내에 삽입된 상기 외인성 서열을 포함하는 상이한 세포주로부터 생산되고, 상기 외인성 서열 및 상기 상이한 게놈 서열은 상기 상이한 융합 단백질을 암호화하는, 엑소좀.
  66. 제65항에 있어서, 상기 종래의 엑소좀 단백질은 CD9, CD63, CD81, PDGFR, GPI 앵커 단백질, 락타드헤린(lactadherin), LAMP2, LAMP2B 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 엑소좀.
  67. 비-엑소좀성 물질(non-exosomal material)을 단리시키는 방법으로서,
    엑소좀 및 비-엑소좀 물질을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 샘플을 표적 단백질에 대해서 친화성을 갖는 결합제와 접촉시킴으로써 상기 엑소좀이 상기 결합제에 결합하는 것을 유도하는 단계로서, 상기 표적 단백질은 PTGFRN, BSG, IGSF2, IGSF3, IGSF8, ITGB1, ITGA4, SLC3A2, ATP 수송체 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 상기 유도하는 단계; 및
    상기 비-엑소좀 물질을 단리시키는 단계를 포함하는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 비-엑소좀성 물질은 바이러스 또는 단백질인, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 비-엑소좀성 물질은 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 다른 외피 보유(enveloped) 또는 외피 비보유(non-enveloped) 바이러스인, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 비-엑소좀성 물질은 재조합 단백질인, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 비-엑소좀성 물질은 엑소좀이 실질적으로 존재하지 않는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 친화성 태그를 더 포함하되, 상기 친화성 태그는 상기 결합제에 대한 친화성을 갖는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항항에 있어서, 상기 표적 단백질은 서열번호 33의 폴리펩타이드를 포함하는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 면역글로불린, 단백질, 펩타이드 또는 소분자를 포함하는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 고체 지지체에 부착되되, 선택적으로 상기 고체 지지체는 다공성 아가로스 비드, 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드, 또는 막을 포함하는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 고체 지지체는 크로마토그래피 칼럼을 형성하는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 샘플을 상기 결합제와 접촉시키는 상기 단계는 상기 샘플을 상기 크로마토그래피 칼럼에 적용함으로써 수행되는, 비-엑소좀성 물질을 단리시키는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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MX2020001790A (es) 2017-08-25 2020-07-22 Codiak Biosciences Inc Preparacion de exosomas terapeuticos mediante el uso de proteinas de membrana.
US20220017907A1 (en) * 2017-11-17 2022-01-20 Codiak Biosciences, Inc. Engineered extracellular vesicles and uses thereof
KR20200108275A (ko) 2017-12-28 2020-09-17 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 면역-종양학 및 항-염증 요법을 위한 엑소좀
AU2019218991A1 (en) 2018-02-12 2020-07-09 Lonza Sales Ag Methods and compositions for macrophage polarization
WO2019183578A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles comprising sting-agonist
US12066382B2 (en) * 2018-06-21 2024-08-20 Lonza Sales Ag Methods of measuring extracellular vesicles and nanoparticles in complex matrices by light scattering
WO2020041720A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles targeting dendritic cells and uses thereof
US12312584B2 (en) * 2018-10-02 2025-05-27 Exosome Therapeutics, Inc. cGMP exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease
US20200102563A1 (en) * 2018-10-02 2020-04-02 Exosome Therapeutics, Inc. Exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease
CN113286603B (zh) 2018-11-16 2025-07-22 隆萨销售股份公司 工程化的细胞外囊泡及其用途
EP3921432A1 (en) * 2019-02-04 2021-12-15 Codiak BioSciences, Inc. Membrane protein scaffolds for exosome engineering
WO2020163366A1 (en) 2019-02-04 2020-08-13 Codiak Biosciences, Inc. Treatment of cancer metastasis by targeting exosome proteins
US12233356B2 (en) 2019-03-21 2025-02-25 Lonza Sales Ag Process for preparing extracellular vesicles
US12502427B2 (en) * 2019-03-21 2025-12-23 Lonza Sales Ag Extracellular vesicles for vaccine delivery
US20220195531A1 (en) * 2019-03-21 2022-06-23 Applied Stemcell, Inc. Exosomes containing rna with specific mutation
CA3133314A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle conjugates and uses thereof
US20220323519A1 (en) 2019-04-17 2022-10-13 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2020214961A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating tuberculosis
JP7581193B2 (ja) * 2019-05-21 2024-11-12 合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所 細胞外小胞の洗浄方法
US20220251200A1 (en) 2019-07-03 2022-08-11 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles targeting t cells and uses thereof
WO2021003425A1 (en) 2019-07-03 2021-01-07 Codiak Biosciences, Inc. Methods of inducing hematopoiesis
EP4009989A4 (en) * 2019-08-06 2023-08-23 Ohio State Innovation Foundation Therapeutic extracellular vesicles
WO2021030773A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-nlrp3 antagonist
JP2022544289A (ja) 2019-08-14 2022-10-17 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｓｔａｔ６を標的とする細胞外小胞－ａｓｏ構築物
CN114641570A (zh) * 2019-08-14 2022-06-17 科迪亚克生物科学公司 具有靶向kras的反义寡核苷酸的细胞外囊泡
KR20220078565A (ko) * 2019-08-14 2022-06-10 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 분자에 연결된 세포외 소포 및 이의 용도
WO2021030769A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles with nras antisense oligonucleotides
BR112022002690A2 (pt) * 2019-08-14 2022-08-23 Codiak Biosciences Inc Construtos de vesícula-aso extracelular tendo como alvo cebp/beta
EP4022074A4 (en) * 2019-08-27 2023-11-15 The Trustees of Columbia University in the City of New York Engineered exosomes for targeted delivery
US12616712B2 (en) 2019-09-25 2026-05-05 Lonza Sales Ag Sting agonist comprising exosomes for treating neuroimmunological disorders
WO2021062057A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Exogenous loading of exosomes via lyophilization
WO2021062290A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Codiak Biosciences, Inc. Methods of producing extracellular vesicles
KR20220094221A (ko) 2019-09-25 2022-07-05 코디악 바이오사이언시즈, 인크. 종양의 치료를 위한 il-12 디스플레잉 엑소좀과 조합된 sting 효능제 포함 엑소좀
JP2022549328A (ja) * 2019-09-25 2022-11-24 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 細胞外小胞組成物
JP7402491B2 (ja) * 2019-10-24 2023-12-21 国立大学法人広島大学 エクソソームの単離方法、エクソソームの単離キット、およびエクソソームの除去方法
WO2021092193A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Codiak Biosciences, Inc. High-throughput chromatography screening for extracellular vesicles
TWI787697B (zh) * 2019-12-30 2022-12-21 財團法人工業技術研究院 外泌體的分離方法、膠體粒子及其製備方法
EP4090974A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Codiak BioSciences, Inc. Cholesterol assays for quantifying extracellular vesicles
US20230097907A1 (en) 2020-01-27 2023-03-30 Mantra Bio, Inc. Non-naturally occurring vesicles comprising a chimeric vesicle localization moiety, methods of making and uses thereof
CA3169228A1 (en) 2020-02-05 2021-08-12 Diadem Biotherapeutics Inc. Artificial synapses
US20230114434A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles for treating neurological disorders
WO2021184021A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting pmp22
WO2021184022A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Targeted delivery of extracellular vesicles
WO2021184020A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Codiak Biosciences, Inc. Methods of treating neuroinflammation
JP2023518414A (ja) 2020-03-20 2023-05-01 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療のための細胞外小胞
US20230143893A1 (en) * 2020-03-23 2023-05-11 Avem Holdings Llc Isolation and purification of exosomes for regenerative medicine
CN115768877A (zh) 2020-05-11 2023-03-07 斯特姆生物公司 与巨核细胞来源的细胞外囊泡相关的组合物和方法
WO2021237100A1 (en) * 2020-05-21 2021-11-25 Codiak Biosciences, Inc. Methods of targeting extracellular vesicles to lung
WO2021248133A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Codiak Biosciences, Inc. Anti-transferrin extracellular vesicles
EP4196144A1 (en) 2020-08-17 2023-06-21 Codiak BioSciences, Inc. Methods of treating cancer
US20240082389A1 (en) 2020-09-23 2024-03-14 Lonza Sales Ag Methods of producing extracellular vesicles
US20240241020A1 (en) 2020-09-23 2024-07-18 Lonza Sales Ag Process for preparing extracellular vesicles
WO2022066934A2 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Process for preparing extracellular vesicles
WO2022066883A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles comprising kras antigens and uses thereof
WO2022076596A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle-aso constructs targeting stat6
CN113252616B (zh) * 2021-01-29 2022-05-03 厦门大学 一种外泌体的糖基化研究方法
US20240167036A1 (en) 2021-02-17 2024-05-23 Lonza Sales Ag Extracellular vesicle-nlrp3 antagonist
EP4294456A1 (en) 2021-02-17 2023-12-27 Lonza Sales AG Extracellular vesicle linked to a biologically active molecule via an optimized linker and an anchoring moiety
EP4294375B1 (en) 2021-02-17 2026-04-01 Lonza Sales AG Methods of loading extracellular vesicles
KR20230166101A (ko) 2021-04-01 2023-12-06 론자 세일즈 아게 세포외 소포 조성물
AU2022259546A1 (en) * 2021-04-14 2023-11-16 Anjarium Biosciences Ag Fc-derived polypeptides
US12521449B2 (en) 2021-04-26 2026-01-13 Strm.Bio Incorporated Compositions and methods related to megakaryocyte-derived extracellular vesicles for Fanconi Anemia
CN115505599A (zh) * 2021-06-23 2022-12-23 艾威亚(广州)医药科技有限公司 Gpi诱导的胰岛素靶向型外泌体的制备及其在递送重组生物药物中的应用
CA3226019A1 (en) 2021-07-20 2023-01-26 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses
EP4393957A4 (en) * 2021-08-23 2026-04-22 Sekisui Chemical Co Ltd Peptide-bound liposome-exosome hybrid, peptide-bound exosome, composition, container, and process for their formation
WO2023056468A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicle comprising cholesterol tagged sting-agonist
IL311962A (en) 2021-10-14 2024-06-01 Lonza Sales Ag Modified producer cells for extracellular vesicle production
CN113832003A (zh) * 2021-10-20 2021-12-24 上海芙普瑞生物科技有限公司 一种便于提取制备脂肪干细胞外泌体的设备及提取工艺
WO2023091497A1 (en) * 2021-11-16 2023-05-25 Mayo Foundation For Medical Education And Research Compositions and methods for tendon repair
US20250057776A1 (en) * 2021-12-28 2025-02-20 Sekisui Chemical Co., Ltd. Exosome, method of forming same, and composition containing same
CN114112867A (zh) * 2022-01-26 2022-03-01 天九再生医学(天津)科技有限公司 外泌体纯度分析方法
WO2023144127A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses
EP4532514A1 (en) * 2022-05-24 2025-04-09 Shiftbio Inc. Surface-engineered extracellular vesicles and therapeutic uses thereof
WO2023232976A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses
US20260102356A1 (en) * 2022-09-30 2026-04-16 Exocure Sweden Ab Method for loading dimeric cd24 into hek293 cell extracellular vesicles with adam10 gene knocked out
CN117802045A (zh) 2022-09-30 2024-04-02 北京恩康医药有限公司 一种工程化细胞外囊泡的构建及其应用
CN116334001B (zh) * 2022-10-08 2025-05-16 武汉科技大学 一种展示cd47纳米抗体的外泌体及其制备方法和应用
EP4608424A1 (en) 2022-10-24 2025-09-03 AGS Therapeutics SAS Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon intranasal administration, and uses thereof
WO2024112359A1 (en) * 2022-11-21 2024-05-30 The Johns Hopkins University Genetic enhancement of exosome production
WO2024194423A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their use for vaccines and for immunomodulation
CN118772248A (zh) * 2023-04-10 2024-10-15 国典(北京)医药科技有限公司 一种外泌体富集多肽及其基因工程化外泌体和其制备方法和应用
CN116769718A (zh) * 2023-04-21 2023-09-19 南京逸微健华生物科技有限公司 一种工程化细胞外囊泡及用途
WO2025176847A1 (en) 2024-02-21 2025-08-28 Ags Therapeutics Sas Ocular delivery of active agents via microalgae extracellular vesicles
WO2025184851A1 (zh) * 2024-03-07 2025-09-12 深圳先进技术研究院 一种靶向卵巢相关组织的细胞外囊泡及其制备方法和应用
WO2025189142A1 (en) 2024-03-08 2025-09-12 Vyriad Membraned vesicles and purification methods thereof
WO2025217533A2 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Vyriad Recombinant rhabdoviral g glycoproteins and uses thereof
EP4644537A1 (en) 2024-04-30 2025-11-05 ConvEyXo Targeted extracellular vesicle
WO2025260074A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Vyriad Multiplexing functional polypeptides and recombinant rhabdoviral g glycoproteins on enveloped delivery vehicles
WO2025260073A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Vyriad Receptor detargeting by amino acid deletion scanning of rhabdoviral g proteins and uses thereof
WO2026022863A1 (en) * 2024-07-25 2026-01-29 Christian Medical College Extracellular vesicles and uses thereof for targeted delivery

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747660A (en) 1995-11-06 1998-05-05 The University Of Colorado Nucleic acid encoding prostaglandin F2α receptor regulatory protein
CN1254234C (zh) 2000-06-09 2006-05-03 莱古伦公司 质粒dna(lipogenestm)和含细胞核定位信号/促融合肽缀合物的治疗剂包封到定向脂质体复合体中
US20040049010A1 (en) 2001-10-26 2004-03-11 Warren Bridget A Transmembrane proteins
US7803906B2 (en) * 2002-03-22 2010-09-28 Gene Signal International Sa Composition comprising an angiogenesis related protein
US7723112B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US9085778B2 (en) * 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
WO2012048372A1 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Medsaic Pty Ltd Assay for disease detection
US9777042B2 (en) * 2011-12-15 2017-10-03 Morehouse School Of Medicine Method of purifying HIV/SIV Nef from exosomal fusion proteins
US20150301058A1 (en) * 2012-11-26 2015-10-22 Caris Science, Inc. Biomarker compositions and methods
CN114634950A (zh) 2012-12-12 2022-06-17 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
JP6571537B2 (ja) 2013-03-13 2019-09-04 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド 療法および予防のための細胞を単離する方法
KR20150043937A (ko) 2013-10-15 2015-04-23 삼성전자주식회사 개체의 간암 진단용 조성물, 개체의 간암 진단하는 방법 및 개체의 간암 진단에 필요한 정보를 얻는 방법
US20170252379A1 (en) 2014-10-09 2017-09-07 Anthrogenesis Corporation Placenta-derived adherent cell exosomes and uses thereof
WO2016077639A2 (en) * 2014-11-12 2016-05-19 VL27, Inc. Nanovesicular therapies
WO2017075708A1 (en) * 2015-11-05 2017-05-11 Exerkine Corporation Exosomes useful to treat cystic fibrosis
JP2019501179A (ja) 2015-12-30 2019-01-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 細胞由来ベシクルの向上された生成および単離のための方法
SG10202008883SA (en) * 2016-03-15 2020-10-29 Codiak Biosciences Inc Therapeutic membrane vesicles
US20200113943A1 (en) 2017-06-05 2020-04-16 The Regents Of The University Of California Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles and treatment of inflammation and neurological damage
MX2020001790A (es) 2017-08-25 2020-07-22 Codiak Biosciences Inc Preparacion de exosomas terapeuticos mediante el uso de proteinas de membrana.

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